MARCIA HIROMI TANAKA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA DO FLUIDO GENGIVAL E PROTEOMA SALIVAR DE INDIVÍDUOS COM SÍNDROME DE DOWN COM DOENÇA PERIODONTAL Orientadora: Profa. Dra. Elisa Maria Aparecida Giro Araraquara 2014 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara MARCIA HIROMI TANAKA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA DO FLUIDO GENGIVAL E PROTEOMA SALIVAR DE INDIVÍDUOS COM SÍNDROME DE DOWN COM DOENÇA PERIODONTAL Araraquara 2014 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara MARCIA HIROMI TANAKA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA DO FLUIDO GENGIVAL E PROTEOMA SALIVAR DE INDIVÍDUOS COM SINDROME DE DOWN COM DOENÇA PERIODONTAL Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas - Área de Odontopediatria, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para a obtenção do título de Doutor em Ciências Odontológicas. Orientadora: Profa. Dra. Elisa Maria Aparecida Giro Araraquara 2014 Tanaka, Marcia Hiromi Análise microbiológica e imunológica do fluído gengival e proteoma salivar de indivíduos com Síndrome de Down com doença periodontal / Márcia Hiromi Tanaka.-- Araraquara: [s.n.], 2014. 110 f. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientadora: Profa. Dra. Elisa Maria Aparecida Giro 1. Síndrome de Down 2. Periodontite 3. Proteínas e peptídeos salivares 4. Microbiologia I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646 Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP ! ! ! ! MARCIA!HIROMI!TANAKA! ANÁLISE MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA DO FLUIDO GENGIVAL E PROTEOMA SALIVAR DE INDIVÍDUOS COM SINDROME DE DOWN COM DOENÇA PERIODONTAL COMISSÃO'JULGADORA' DEFESA DE TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR Presidente e Orientadora: Profa. Dra. Elisa Maria Aparecida Giro 2º Examinador: Prof. Dr. Walter Luiz Siqueira 3º Examinador: Profa. Dra. Cristiane Yumi Koga-Ito 4º Examinador: Profa. Dra. Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga 5º Examinador: Prof. Dr. Cyneu Aguiar Pansani Araraquara, 28 de março de 2014. DADOS CURRICULARES Marcia Hiromi Tanaka NASCIMENTO 09 de julho de 1978 – Mogi das Cruzes/SP FILIAÇÃO Yukiu Tanaka Alice Yoshiko Tanaka 1999/2003 Curso de graduação em Odontologia Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho”- UNESP 2003/2004 Estágio de Atualização na disciplina de Odontopediatria Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP 2005/2005 Curso de Residência na Associação de Assistência à Criança Deficiente - AACD 2007/2008 Curso de Pós-Graduação em Periodontia. Nível de Especialização, Associação Paulista dos Cirurgiões Dentistas (APCD) - regional de Araraquara 2008/2010 Curso de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Área de concentração Odontopediatria. Nível Mestrado, Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP 2008/2010 Curso de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Área de concentração Odontopediatria. Nível de Especialização, Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP 2009/2010 Curso de Pós-Graduação em Odontologia Legal. Nível de Especialização, Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP 2010/2014 Curso de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Área de concentração Odontopediatria. Nível Doutorado, Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP 2013/2013 Estágio de Doutorado Sanduíche no Exterior (PDSE) no Departamento de Bioquímica, Schulich School of Medicine & Dentistry, The University of Western Ontario, London, Ontario, Canada Todo mundo tem seu jeito singular De ser feliz, de viver e de enxergar Se os olhos são maiores ou são orientais E daí, que diferença faz? Todo mundo tem que ser especial Em oportunidades, em direitos, coisa e tal Seja branco, preto, verde, azul ou lilás E daí, que diferença faz? Já pensou, tudo sempre igual? Ser mais do mesmo o tempo todo não é tão legal Já pensou, sempre tão igual? Tá na hora de ir em frente: Ser diferente é normal! Todo mundo tem seu jeito singular De crescer, aparecer e se manifestar Se o peso na balança é de uns quilinhos a mais E daí, que diferença faz? Todo mundo tem que ser especial Em seu sorriso, sua fé e no seu visual Se curte tatuagens ou pinturas naturais E daí, que diferença faz? Já pensou, tudo sempre igual? Ser mais do mesmo o tempo todo não é tão legal Já pensou, sempre tão igual? Tá na hora de ir em frente: Ser diferente é normal! Vinícius Castro DEDICATÓRIA Dedico este trabalho… Aos meus queridos pais, Yukiu e Alice Vocês são a minha fonte de energia, força e amor. Faltam-me palavras para expressar todo o amor e gratidão, por tanta demonstrações de carinho, compreensão, renúncia, dedicação e incentivo que me dispensaram durante toda esta jornada, sempre respeitando as minhas decisões. Eu sei q não foi fácil apoiar as minhas decisões durante esta jornada mas reconheço o sacrifício e agradeço enormemente. Obrigada por sempre compreenderem a minha necessidade, persistência e até mesmo a minha ausência. AMO MUITO VOCÊS! A Profa. Dra. Elisa Maria Ap. Giro Tia Elisa!!! Não é só minha orientadora mas é uma grande amiga! Não tenho palavras para agradecer todo o carinho, apoio e dedicação que recebi não só durante esta jornada mas nesses muitos, muitos e muitos anos de convivência (...rs). Você é uma pessoa única, com o coração ENORME!!!!!! Sempre prestativa não importando quem seja e sempre recebendo todos de braços abertos. Aprendi muito com você! Sua dedicação e seu profissionalismo me inspiram até hoje. Ah...um ensinamento que me marcou e levarei comigo é seu amor incondicional pelos NOSSOS queridos pacientes com necessidades especiais. Sim, esse bichinho me picou também...rs. Amo você, Tia Elisa! Aos meus querido avós Takeru e Toko Tanaka (in memoriam) Que saudades de vocês! Ditiam, você se foi tão cedo mas me lembro de todas as brincadeiras que fazíamos juntos, principalmente quando você me colocava pra fazer odori...rs. Batiam, guerreira, estudiosa e teimosa também (característica que definitivamente herdei de você). É assim que me lembro com carinho de você...rs. Com vocês aprendi que devo perseguir meus sonhos e nunca desistir! Tenho certeza que estão no céu sempre torcendo por mim. Amo vocês! Aos meus padrinhos, Hideki (in memoriam) e Nilza Padrinho, saudades de você! Você faz e fará uma falta enorme mas tenho certeza que está ao meu lado me incentivando em todos os momentos da minha vida. Assim como você, Madrinha. Só tenho que me desculpar pela minha enorme ausência mas saiba que te amo! Agradeço a Deus por ter vocês como meus padrinhos! Ao meu namorado Rogério =* ...rs. Obrigada por fazer minha vida tão animada e FELIZ. Por ter compreendido e respeitado minha dedicação aos estudos, acima de tudo me apoiando e sempre me estimulando a buscar o MELHOR. Sou eternamente grata pelo seu carinho e compreensão em todos os momentos estressantes (no mestrado e agora no doutorado). Por ter respeitado os momentos que estava ausente para realização deste trabalho, nós sabemos que não foi fácil mas no final foi recompensador. Só tenho a agradecer à Deus por ter te colocado na minha vida! Amo muito você! Aos meus queridos irmãos Yooiti e Yassushi Obrigada pela paciência e compreensão durante todos esses anos. Agradeço também a disposição, carinho e por terem me ajudado muito durante esta jornada. Saibam que sem vocês este sonho não teria acontecido. Muito obrigada! Amo vocês! Aos meus sobrinhos Vitinho e Jun Esses dois já cresceram e estão quase uns adolescentes. Mas como sempre dizem, aos olhos da tia serão eternas crianças...rs. Espero curtir mais vezes como nós curtimos as férias de vocês no Canadá, principalmente, com a família reunida. Tia, ama muito vocês! ESSA CONQUISTA É DE TODOS AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À Deus Obrigada Meu Deus pela presença constante, por ter me abençoada com uma família e amigos maravilhosos, pelos ensinamentos diários e por me dar saúde e forças para lutar e seguir meu caminho. Obrigada Senhor. Aos pacientes desta pesquisa Agradeço com enorme carinho à TODOS os pacientes que participaram desta pesquisa, principalmente, aos pacientes com Síndrome de Down e seus responsáveis. Obrigada por confiarem no meu trabalho e me ajudarem a realizar esta pesquisa. A Profa. Dra. Raquel M. Scarel Caminaga Exemplo de professora, educadora e pesquisadora, sempre disposta a ajudar a todos. Agradeço por ter acreditado no meu trabalho e ter me incentivado a continuá-lo no doutorado. Com você aprendi que devemos ser humildes para dizer que não sabemos mas com certeza possuímos a perseverança e a persistência para aprender. Obrigada por ter me ajudado nas situações de incertezas. Agradeço profundamente! Ao Prof. Dr. Walter Luiz Siqueira Exemplo de determinação e profissionalismo. Obrigada pela disponibilidade e confiança durante meu estágio em London, na Universidade de Western Ontario, CA. Apesar de ficar nervosa com os seus questionamentos quero agradecer por tê-los e, principalmente, por dividi-los comigo. Com você aprendi que devemos sempre questionar independente dos resultados. Agradeço a enorme contribuição à minha formação profissional e crescimento pessoal, e pela oportunidade de trabalhar sob a sua supervisão, ampliando meus conhecimentos! Agradeço a sua esposa Michele e seus filhos Joseph e Thomas, por terem sempre me recebido com carinho e com um sorriso enorme! Thank you very much! À Thamiris Orrico Rodrigues Tha!!!Minha amiga e companheira em TODOS os momentos da pesquisa, desde as estradas que percorremos até os momentos engraçados dos atendimentos clínicos. Sempre ajudando e me acalmando nos momentos difíceis do desenvolvimento desse trabalho. Só você sabe todos os momentos de incertezas, dúvidas e conquista que passamos sempre juntas. Muito obrigada!!!! À Lívia Sertori Finoti Lí!!!!!! A Parceira de pesquisa!!!!! Só tenho que agradecer por tudo que você me ajudou nesta pesquisa. Me socorreu de vários apuros, sempre com muita calma e humildade! Te admiro muito viu! Você tem um coração do tamanho do mundo e sempre está de braços abertos. Tenho orgulho da profissional que você se tornou e da amiga que você continua sendo até hoje! Espero poder retribuir todo carinho e dedicação que você teve comigo. Obrigada parceira! Às minhas queridas amigas “irmãs de coração” Cármen, Dulce, Emi e Michele, agradeço por todos os momentos compartilhados nas alegrias e nas dificuldades. Apesar da distância nossa amizade continua a mesma! Obrigada pelas risadas e pelas broncas, seja pessoalmente ou pelo whatsapp. Sempre me divirto com vocês! Deus não me deu irmãs de sangue mas me deu vocês! Obrigada frenéticas! Esse time agora tem um mascote, o João Victor! Bem vindo querido sobrinho!!!! =D Abençoados os que possuem amigos, os que os têm sem pedir. Porque amigo não se pede, não se compra, nem se vende. Amigo a gente sente! Benditos os que sofrem por amigos, os que falam com o olhar. Porque amigo não se cala, não questiona, nem se rende. Amigo a gente entende! Benditos os que guardam amigos, os que entregam o ombro pra chorar. Porque amigo sofre e chora. Amigo não tem hora pra consolar! Benditos sejam os amigos que acreditam na tua verdade ou te apontam a realidade. Porque amigo é a direção. Amigo é a base quando falta o chão! Benditos sejam todos os amigos de raízes, verdadeiros. Porque amigos são herdeiros da real sagacidade. Ter amigos é a melhor cumplicidade! Há pessoas que choram por saber que as rosas têm espinho, Há outras que sorriem por saber que os espinhos têm rosas! Machado de Assis (Bons Amigos) AGRADECIMENTOS À Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, representados pela digníssima Diretora Profa. Dra. Andréia Afonsso Barretto Montandon e Vice-Diretora Profa. Dra. Elaine Maria Sgavioli Massucato. Aos professores da banca examinadora Prof. Dr. Walter Luiz Siqueira, Profa. Dra. Cristiane Yumi Koga-Ito, Prof. Dr. Cyneu Aguiar Pansani, Profa. Dra. Raquel Mantuaneli Scarel-Caminaga por aceitarem prontamente meu convite e me darem a honra de fazerem parte da minha defesa de doutorado. Aos professores da Disciplina de Odontopediatria Profa. Dra. Ângela Cristina Cilense Zuanon, Prof. Dr. Cyneu Aguiar Pansani, Profa. Dra. Elisa Maria Aparecida Giro, Prof. Dr. Fábio de Abreu-e-Lima, Profa. Dra. Fernanda Lourenção Brigenti, Profa. Dra. Josimeri Hebling, Profa. Dra. Lourdes Aparecida Martins dos Santos-Pinto e Profa. Dra. Rita de Cássia Loiola Cordeiro, pela convivência diária contribuição à minha vida pessoal e profissional. Obrigada por me mostrarem o caminho maravilhoso da Odontopediatria! Ao Prof. Dr. Carlos Rossa Junior pelos sábios conselhos sempre vindos nos momentos de dúvidas. Obrigada pela amizade e conhecimentos transmitidos. Ao Prof. Dr. Niels Olsen Câmara (Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo- USP) por ter me recebido em seu laboratório para as análises de marcadores inflamatórios e à Meire Hiyane, uma pessoa incrível que com dedicação e paciência me ensinou e ajudou muito durante a realização destas analises. Muito obrigada à vocês dois! À Profa. Dra. Márcia Mayer (Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo- USP), por toda atenção, acolhimento e disponibilidade dispensada para a análise microbiológica. E à todos do seu Laboratório de Microbiologia, principalmente a Didi (minha irmã gêmea), Ellen, Maike, Lucas e Leo, pessoas maravilhosas que tive a oportunidade de conhecer e aprender! Muito obrigada à todos!!!! Aos professores Prof. Dr. Sílvio Issao Myake, Profa. Dra. Mônica Fernandes Gomes, Profa. Dra. Cristiane Yumi Koga-Ito, Prof. Dr. Antônio Olavo Cardoso Jorge, Prof. Dr. Jose Benedito Oliveira Amorim, Prof. Dr. João Carlos da Rocha, Prof. Dr. Mauro Pedrini Santamaria e Profa. Dra. Maria das Graças Goulart, Obrigada por terem me acolhido na fase de coleta das amostras. Obrigada professores! Aos meus amigos de curso de Doutorado Débora, Fabiano, Juliana, Letícia e Marília pelo apoio e ajuda durante todo o curso. Muito obrigada a todos. Aos amigos da Pós-graduação Thamiris, Carol, Manoel, Luana, Renata, Juliana, Diego, Camila, Thalita, Popis, Liege e Luciana pela convivência e pelo carinho compartilhados durante todo o curso. Aos amigos do laboratório de genética Lí Finoti, Profa. Dra. Ticiana Sidorenko Capote, Suzane, Sâmia, Giovana, Rafael, Guilherme e Fabrício pela ajuda, pelas risadas, pelas conversas fornecida sempre que precisei. Acima de tudo, pela amizade e pelo carinho de todos vocês! Obrigada à todos!!!! Aos amigos “canadenses” (Saliva Buddies 4life!!!!) Carolina Rayo, Eduardo Moffa, Carolina Mussi, Cindy, Heide, Tayebeh, Alina, “Forever” Young, Ali “Veleshi Baba”, “Bixo” Jonatas, Rajesh, Little Cindy, Adja, Nicole e Shaw. Ai que saudades do Canadá! Obrigada a todos vocês! O laboratório não ia ser igual sem vocês. Algumas frases já me remetem à vocês: Top model, “encher as caixinhas”, Elisa, Western Blot, praia, farofa, alugar carro, DELAY, “Veleshi baba”, cookie run, Forever Young, slave, Tim Hortons, entre outras. Dú e Carols, Obrigada por tudo! Thank you for your kindness and support!!! Aos funcionários da Odontopediatria Soninha, Dona Odete, Dulce, Tânia, Totó, Pedrinho, Diego, Cristina e Marcia pela convivência, disponibilidade e ajuda durante as clínicas. Obrigada a todos! Aos funcionários da esterilização e urgência, em especialmente a Ângela, Marquinho, Paulo pela amizade, disponibilidade e ajuda sempre que precisei. Muito obrigada! A todos os funcionários da Secção de Pós-Graduação Mara, Alexandre e Sérgio vocês são especiais e essenciais na vida de um pós- graduando. Agradeço a constante ajuda, atenção e organização em todos os momentos. Obrigada por tudo! Aos funcionários da biblioteca Ceres, Adriano e Marley pela convivência agradável e ajuda durante as pesquisas bibliográficas e confecção da ficha catalográfica. À todos os funcionários das APAEs e ASIN que me receberam de forma tão carinhosa e sempre acreditaram no meu trabalho. À CAPES –Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Pela concessão de bolsa de estudo que possibilitou a cobertura financeira desta pesquisa durante o curso de Doutorado no Brasil e pela concessão de bolsa de estudo Doutorado sanduíche no exterior – PDSE (Processo: BEX 0225/13-4), que possibilitou a realização deste trabalho no Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine & Dentistry, The University of Western Ontario, London, Ontario, Canada. À FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pela concessão de Auxílio Regular para o desenvolvimento desta pesquisa À Universidade de Western Ontario, London, Canadá Por terem me recebido prontamente para a realização de estágio no exterior À família Cassiano Costa Em especial, a Reneide, Milena, Bianca, Celi, Rejane, Flávia e Juliano que me ajudaram e me apoiaram durante esta jornada. Mathias, você é muito especial na minha vida! Obrigada pelo carinho, dedicação e compreensão!!! À Dulce e Sílvio Por terem não só me acolhido durante a fase final desta jornada mas por tudo que fizeram por mim. Obrigada pelas conversas, pelas risadas, pelos jantares, pela compreensão, enfim Meu Muito OBRIGADA!! Amei meu cantinho na casa de vocês! ...rs. Às minhas queridas amigas Katinha, Camila Merida, Nilce, Alyne, Paty Melo e Shinobu Obrigada pela amizade, compreensão e carinho!!!! Apesar da distância, vocês moram no meu coração! Obrigada a todos! Aos meus familiares e amigos e a todos que, direta e indiretamente, colaboraram para a execução desta pesquisa. Sonhe com aquilo que você quer ser, porque você possui apenas uma vida e nela só se tem uma chance de fazer aquilo que quer. Tenha felicidade bastante para fazê-la doce. Dificuldades para fazê-la forte. Tristeza para fazê-la humana. E esperança suficiente para fazê-la feliz. As pessoas mais felizes não tem as melhores coisas. Elas sabem fazer o melhor das oportunidades que aparecem em seus caminhos. A felicidade aparece para aqueles que choram. Para aqueles que se machucam Para aqueles que buscam e tentam sempre. E para aqueles que reconhecem a importância das pessoas que passaram por suas vidas. Clarice Lispector RESUMO Tanaka MH. Análise microbiológica e imunológica do fluido gengival e proteoma salivar de indivíduos com Síndrome de Down com doença periodontal [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2014. RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar a quantidade de periodontopatógenos e de citocinas inflamatórias no fluido gengival, bem como as proteínas salivares em indivíduos com Síndrome de Down (SD) com Doença Periodontal (DP), comparando-os com indivíduos cromossomicamente normais, antes e 45 dias após o tratamento periodontal não-cirúrgico. Para detectar e quantificar as bactérias (Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola), o fluido gengival foi coletado de 35 indivíduos com DP, sendo 23 indivíduos com SD e 12 não-sindrômicos (controle). Para quantificar as citocinas inflamatórias e as proteínas salivares foram coletados fluido gengival e saliva de 30 indivíduos com DP, sendo 20 indivíduos com SD e 10 não-sindrômicos (controle). Os efeitos do tratamento nos parâmetros clínicos foram positivos para o índice de placa, sangramento à sondagem, profundidade de sondagem e nível de inserção, em ambos os grupos. Porém, a contagem dos periodontopatógenos foi maior nos indivíduos com SD comparados com o grupo controle, antes e 45 dias após o tratamento periodontal. As citocinas Th1, Th2 e Th17 também foram encontradas em maiores quantidades nos indivíduos com SD do que nos controle, mesmo depois do tratamento periodontal. Adicionalmente, maiores quantidades de proteínas salivares com propriedades antimicrobianas, lubrificação, metabolismo, organização celular, resposta imune e transporte foram encontradas em indivíduos com SD depois do tratamento periodontal. Conclui-se que os resultados desta pesquisa podem contribuir para uma compreensão mais aprofundada do comportamento microbiológico, imunológico e do proteoma salivar de indivíduos com SD, e, consequentemente, explicar a alta prevalência e severidade da doença periodontal nesses indivíduos. Palavras-chave: Síndrome de Down, Periodontite, Microbiologia, Citocinas, Proteínas e peptídeos salivares ABSTRACT Tanaka MH. Microbiological and immunological analysis in the gingival crevicular fluid and salivary proteome analysis in individuals with Down syndrome with periodontal disease [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2014. ABSTRACT The aim of this study was to quantify the periodontopathogens, inflammatory cytokines and salivary proteins in subjects with Down syndrome (DS) and normal subjects, both with periodontal disease (PD), before and 45 days after non-surgical periodontal therapy. To detect and quantify bacteria (Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola), crevicular gingival fluid (CGF) was collected from 35 individuals with PD, 23 with DS and 12 non-syndromic (control). To quantify the inflammatory cytokines and salivary proteins, CGF and saliva of 30 individuals with PD, 20 with SD and 10 non-syndromic (control) were collected. The effects of the non-surgical periodontal therapy on clinical parameters were positive in both groups. However, the count of periodontopathogens was higher in individuals with DS compared with the control group, before and after periodontal therapy.Th1, Th2 and Th17 cytokines were also found in higher amounts in individuals with DS even after periodontal therapy compared with control patients. Furthermore, higher amounts of salivary proteins with antimicrobial properties, lubrication, metabolism, cellular organization, immune response and transport were quantified in individuals with DS after periodontal therapy. Despite of clinical parameters improvement after non-surgical periodontal therapy in subjects with DS, it is concluded that the results of this study may contribute to a more profound understanding of microbiological and immunological behavior, as well as knowledge of the salivary proteome in individuals with Down syndrome, and also might explain the high prevalence and severity of periodontal disease in these individuals. Key word: Down syndrome, Periodontitis, Microbiology, Cytokines, Salivary Proteins and Peptides SUMÁRIO 1 Introdução ....................................................................................................... 24 2 Proposição ...................................................................................................... 29 3 Capítulo 1 ....................................................................................................... 31 4 Capítulo 2 ....................................................................................................... 46 5 Capítulo 3 ....................................................................................................... 68 6 Considerações finais....................................................................................... 94 7 Referências ......................................................................................................97 8 Anexo ............................................................................................................ 107 INTRODUÇÃO 1 Introdução A Síndrome de Down (SD) é a mais freqüente desordem cromossômica, sendo caracterizada por um cromossomo 21 extra ou pela triplicação do braço longo do cromossomo 2112, 32, 64. Com base no censo populacional de 2000, há no Brasil cerca de 300 mil indivíduos com SD e, anualmente cerca de 8 mil brasileiros nascem com a síndrome 41. Nos indivíduos com SD, as características bucais observadas são palato ogival, “falsa” macroglossia, hipotonia muscular, língua fissurada, anomalias dentárias como a presença de dentes conóides, microdontia, fusão, geminação, hipocalcificação, oligodontia e atraso na erupção dentária. Além disso, estes indivíduos apresentam menor prevalência de lesões de cárie e maior de doença periodontal 24, 26, 27, 64. A doença periodontal (DP) é uma doença inflamatória que afeta as estruturas de suporte do dente, sendo considerada uma das formas patológicas mais comuns de destruição óssea no ser humano 15, 33, 66. Vários estudos tem relatado que os indivíduos com SD têm uma alta prevalência de DP em comparação com indivíduos cromossomicamente normais (euplóides) e com outros portadores de necessidades especiais, na mesma faixa etária7, 26, 27, 34, 59, 68, 80, 96, 114. Considerada como uma doença multifatorial, a DP pode estar associada a vários fatores previamente investigados nos indivíduos com SD, como má higiene bucal, composição da placa subgengival e deficiência na resposta imune frente ao processo inflamatório3, 21, 46, 51, 52, 61, 103, 110. A presença de bactérias periodontopatogênicas, como Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola, (bactérias do complexo vermelho)30, 31, 38, representa um fator fortemente associado à DP. Estudos mostram que esses periodontopatógenos estão presentes na placa subgengival de crianças com Síndrome de Down a partir de 2-4 anos, e aumentam em quantidade gradualmente com a idade, sempre mantendo uma prevalência significativamente maior do que nos indivíduos controle4, 81. Todavia, a evolução da DP não é definida apenas pelos agentes microbianos presentes. Para que ela ocorra é necessário um desequilíbrio entre 25 esses periodontopatógenos e o potencial imunológico do hospedeiro, bem como a associação de fatores ambientais e genéticos25, 31, 55. O mecanismo de defesa dos indivíduos com SD apresenta algumas alterações na resposta imune quando comparado com indivíduos cromossomicamente normais. Tais alterações compreendem um desbalanço nas subpopulações de linfócitos T, menor atividade de fagocitose por leucócitos, redução na quimiotaxia de neutrófilos, produção alterada de anticorpos e maiores quantidades de mediadores inflamatórios6, 9, 21, 46, 50, 56, 72, 87, 92, 94, 102. É interessante ressaltar que no braço longo do cromossomo 21 existe um agrupamento composto pelos genes IL10RB, IFNGR2 e genes dos dois receptores do IFN-α77. Alguns autores encontraram uma maior expressão gênica de IL10 mRNA em indivíduos com SD com DP do que em não sindrômicos, e isso tem sido associado à presença do cromossomo 21 extra nesses indivíduos19, 98. Porém, não foram detectadas diferenças na expressão do IFNγ mRNA entre indivíduos SD e controle, ambos com DP19, 98. Os SD mostram também, uma super expressão de citocinas como TNFα e IFNγ mRNA no timo, o que pode explicar o reduzido número de linfócitos T maduros nesses indivíduos, e provavelmente está relacionado com a resposta imune deficiente 63. Os linfócitos T helper (Th) podem se diferenciar em Th1, Th2, Th17 e Treg que irão mediar na inflamação, destruição tecidual e autoimunidade62. Algumas das citocinas dos linfócitos Th1 (IL-1β, IL-6, IL12, IFN-γ, GM-CSF e TNF-α) e Th17 (IL-17) são conhecidas como citocinas pro-inflamatórias, e as citocinas dos linfócitos Th2 (IL-4, IL-6 e IL-10) são conhecidas como citocinas anti inflamatórias45, 76, 88, 97, 111. Assim, como em qualquer doença inflamatória crônica, as citocinas tem um papel importante no início, na progressão e na modulação da resposta imune do hospedeiro na doença periodontal10, 111. Desse modo, o desbalanço das quantidades dessas citocinas Th1, Th2 e Th17 no tecido gengival e no fluido gengival crevicular pode causar reabsorção óssea e destruição do colágeno durante a evolução da inflamação periodontal42. Vários estudos analisaram a quantidade destas citocinas Th usando o fluido gengival de pacientes com doença periodontal11, 37, 41, 54, 67, 69, 73, 88, 97, 99-101, 111. Porém, poucos são os estudos com as células Th e suas citocinas no fluido gengival 26 de indivíduos com SD79, 103. Estes estudos demonstraram que há um desequilíbrio entre Th1 e Th2, indicando uma possível causa para o aparecimento precoce e rápida progressão da DP encontradas nesta população79, 103. A saliva, assim como o fluido gengival crevicular, também pode ser utilizada para o diagnóstico da doença periodontal. A saliva é um fluido constituído de proteínas de fontes local e sistêmica, e pode ser obtida usando métodos de fácil execução e não invasivos 43, 93, 113. Muitos de seus componentes tem sido pesquisados e estão contribuindo no diagnóstico de doenças sistêmicas, como o câncer de mama14, 95, 104, Diabetes Mellitus17, 75, Síndrome de SJögren5, 112 e Fibrose Cística57, bem como de algumas patologias bucais, como líquen plano109, câncer bucal71, 108, 112, incluindo a cárie dentária58, 60 e a doença periodontal13, 35, 39, 47, 74, 90, 107. Os biomarcadores da doença periodontal presentes na saliva podem ser produzidos tanto local quanto sistemicamente20, 35, 36, 39, 74, 82, 113. Vários estudos avaliaram alguns biomarcadores da DP na saliva em pacientes cromossomicamente normais com doença periodontal44, 90, 93, 107. Entre esses marcadores estão as cistatins que são importantes para a proteção contra a degradação tecidual em locais com inflamação ou infecção bacteriana 49. Sua quantidade em pacientes cromossomicamente normais com DP é controverso, alguns estudos mostram serem menos abundante35, 40, 44 e outros não mostram nenhuma diferença na quantidade em comparação com os pacientes periodontalmente saudáveis 2. Já a Haptoglobin é encontrada em maior quantidade na fase aguda da DP sendo correlacionada com a severidade da DP 28, 39. Comumente encontradas na saliva, as proteínas Alpha amylase 1 e serum albumin, segundo alguns estudos, estão presentes em maiores quantidades (ou: são mais abundantes) em pacientes com DP comparados com os periodontalmente saudáveis 29, 35, 36, 84, 107. Entretanto, outros, mostram que independente da DP a quantidade destas proteínas é igual em pacientes cromossomicamente normais 40, 74, 83. Nos indivíduos com SD, uma das proteínas relacionada com o sistema imune são as immunoglobulins porém os dados são controversos7, 8, 21, 22 A proteína Alpha amylase, muito comum na cavidade bucal, é encontrada em quantidades menores 91 ou iguais106 em indivíduos com SD em comparação com aqueles cromossomicamente normais e periodontalmente saudáveis. Recentemente, Cabras 27 et al. 16 identificaram 30 proteínas na saliva de pacientes com SD e controle. Observaram que a proteína Cystatin B tem uma maior quantidade e a Cystatin S tem uma menor quantidade em indivíduos com SD. Vale ressaltar que este estudo observou maiores quantidades de proteínas relacionadas com a doença de Alzheimer 16, cujo risco de os indivíduos com SD desenvolverem é de quase 100% dos casos105. As proteínas Apolipoprotein 1 e Alpha enolase, estudadas no cérebro de pacientes com Alzheimer e no líquido amniótico de mães portadores de fetos com SD, mostraram resultados bastante controversos18, 48, 53, 65, 70, 86 em comparação com pacientes saudáveis. Na saliva, as quantidades de Apoliprotein são maiores e para a Alpha enolase são menores, no único estudo encontrado, em pacientes com DP comparados com pacientes periodontalmente saudáveis44. Desta forma, podemos observar que as quantidades de bactérias do complexo vermelho, as quantidades de citocinas Th1, Th2 e Th17 e as alterações na composição da saliva e suas influências sobre os altos índices de doença periodontal nos indivíduos SD não são bem conhecidos. Adicionalmente, até o momento não foi encontrada na literatura nenhuma pesquisa investigando estes parâmetros em indivíduos SD com DP com as metodologias empregadas neste estudo, e nem estudos longitudinais que avaliassem os efeitos do tratamento periodontal não-cirúrgico nos mesmos. PROPOSIÇÃO 2 Proposição Geral Avaliar a microbiota e a resposta imune adaptativa em indivíduos com Síndrome de Down com Doença Periodontal, antes e 45 dias após o tratamento periodontal não-cirúrgico. 2.1 Proposição Específica 1) Detectar e quantificar as bactérias Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola no fluido gengival crevicular (FGC) de indivíduos com SD e não-sindrômicos (controle) , ambos com DP, antes e 45 dias após o tratamento periodontal não- cirúrgico 2) Determinar os níveis das citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 (p70), IFN-γ, GM- CSF, TNF-α, IL-17A e IL-10 no FGC de indivíduos com SD e controle, ambos com DP, antes e 45 dias após o tratamento periodontal não- cirúrgico 3) Identificar as proteínas salivares e comparar os níveis destas proteínas em indivíduos com SD e controle, ambos com DP, antes e 45 dias após o tratamento periodontal não-cirúrgico. CAPÍTULO 1 Capítulo 1 Red complex microorganisms in Down syndrome with periodontal disease* M. H. Tanaka1,2 T. O. Rodrigues1 L. S. Finoti2 S. R. L. Teixeira3 M.P. A. Mayer3 R. M. Scarel-Caminaga2 E. M. A. Giro1 1 Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, SP, São Paulo, Brazil 2 Department of Morphology, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo, SP, Brazil 3 Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, SP, Brazil O artigo foi formatado segundo as normas do periódico European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 32 Red complex microorganisms in Down syndrome with periodontal disease* M. H. Tanaka1,2; T. O. Rodrigues1; L. S. Finoti2; S. R. L. Teixeira3; M.P. A. Mayer3; R. M. Scarel-Caminaga2; E. M. A. Giro1 1 Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, SP, São Paulo, Brazil 2 Department of Morphology, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo, SP, Brazil 3 Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, SP, Brazil Corresponding Author: Elisa Maria Aparecida Giro Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, Araraquara School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista Rua Humaitá, 1680, Araraquara, SP, Brazil CEP- 14801-903 Tel.:+55 16 33016336 Fax: +55 16 33016329 e-mail: egiro@foar.unesp.br 33 Abstract Periodontitis is an inflammatory disease associated with microbial agents, such as Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola (together called the red complex). Although the clinical outcomes of the Periodontal Disease (PD) aren’t trigger only by microbial agents, but represent the interaction of host defense mechanisms, environmental and genetic factors. Down syndrome (DS) is one of the genetic factors that causes a high prevalence of periodontal disease compared with otherwise chromosomally normal (euploid), and other mentally handicapped patients of similar age distribution. This study investigated whether in individuals with Down syndrome with chronic periodontitis, the clinical parameters and levels of microbial red complex varied in response to non-surgical periodontal therapy. Twenty-three patients with Down syndrome and twelve euploid patients were submitted to non-surgical periodontal treatment. Levels of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola were determined in 140 subgingival plaque samples by qPCR. Demographic characteristics were analyzed by unpaired t-test, and site-based analysis by Mann-Whitney and Wilcoxon tests to assess differences between groups and periods, respectively (α=0.05). The clinical parameters after periodontal treatment were similar in diseased and healthy sites, independently of the Down syndrome. At baseline, diseased sites of Down syndrome patients show no significant difference in levels of Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythia, but reveal significantly higher levels of Treponema denticola compared with euploid individuals. However, the non-surgical periodontal therapy decreased the levels of red complex pathogens and the tested clinical parameters of diseased sites in both groups. The periodontal treatment improved clinical parameters and reduced levels of periodontopathogens, independent of Down syndrome. Nonetheless, individuals with Down syndrome often require maintenance therapy for maintaining oral health. Key words: Down syndrome, bacteria, microbiology, periodontitis Introduction Periodontal Disease (PD) is an inflammatory disease that affects supporting structures of the teeth, constituting one of the most prevalent forms of bone destructive pathology in humans 21, 53. One of the most important triggers for an intense inflammatory reaction that have been strongly associated with PD are periodontopathogenic bacteria, such as Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola (together called the red complex) 46, 48, 63, 161. Although the clinical outcomes of the PD aren’t triggered only by microbial agents but are results from the interaction of host defense mechanisms, and environmental and genetic factors 34, 47, 85. The genetic background may affect many functions, which in turn might affect inflammation and the expression of some of inflammatory cytokines such as IL10 mRNA and IFNγ mRNA in gingival tissue 25, 133, 149. Individuals with Down’s syndrome (DS) have an increased prevalence of PD compared with otherwise chromosomally normal (euploid), age-matched control and other mentally handicapped patients of similar age distribution32, 41, 58, 121. The imbalance between colonizing microorganisms and the immunological potential of the host can define the state of the periodontal diseases 47. Many studies have reported a prevalence of certain pathogens in subgingival plaque from individuals with DS compared with controls5, 65, 81, 90, 99, 124, 168. Some of these studies have 34 mainly noted that Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola, which are considered to be important pathogens of severe types of adult periodontitis, were significantly higher in the DS subjects in a very early colonization in their childhood compared with controls5. However, other researchers found no statistically significant differences related with red complex pathogens in Down syndrome individuals with periodontitis compared with a well-matched control group81, 120. Recently, a study about characterization of periodontal biofilm showed that periodontopathogens from red complex of periodontitis were more frequent in Down syndrome with periodontal disease 90. Because PD is a complex disease, factors such as immunological deficiency and genetics, may also influence the clinical outcomes of the periodontal treatment and host’s ability to reduce the pathogenic microbiota. Therefore, the aim of this study was to investigate whether in individuals with Down syndrome with chronic periodontitis, the clinical parameters and levels of microbial red complex change in response to non- surgical periodontal therapy. Materials and methods Subjects The human subject protocol was approved by the ethics committee at UNESP- Universidade Estadual Paulista (Protocol number 62/11). Between March 2012 and Feb 2013, all patients with DS and their parents as well as chromosomally normal (euploid) individuals were informed about the study and informed consent forms were signed. A total of 125 patients with DS and 150 chromosomally normal patients were initially recruited into the study. Their medical history was taken and they underwent a clinical periodontal examination in the School of Dentistry of Araraquara (UNESP), in 5 of the Associations of Parents and Friends of Disabled Patients (APAEs) of Araraquara and the surrounding cities (São Carlos, Catanduva, Matão and Taquaritinga) and another institution Down Syndrome Association of São José dos Campos (ASIN). To be enrolled in the study, the participants were selected on a two-step process: (1) non- institutionalized DS adult subjects (i.e., older than 19 years, according to WHO (2003) 163 with a karyotype of simple 21st trisomy (mosaics were excluded) and chromosomally normal (euploid) adult individuals. (2) None of the following exclusion criteria: diabetes mellitus or any other chronic inflammatory disease or infections; pregnancy or lactating; current smoker status or cessation of smoking for less than 5 years; use systemic and/or topical steroidal and non-steroidal anti-inflammatory drugs or antibiotics during the last 3 months before the experimental phase. Patients were considered as periodontally diseased when exhibiting more than eight sites in non- adjacent teeth exhibited probing pocket depths ≥4 mm, clinical attachment loss ≥3 mm and bleeding on probing152. Subjects were divided into the following groups based on their genetic condition: - DS: Down syndrome individuals with periodontal disease (n = 23). - C: chromosomally normal individuals with periodontal disease (n = 12). 35 Clinical measurements A single previously calibrated examiner (M.H.T./ Kappa = 0.80) recorded clinical measurements of the probing pocket depth (PPD: from the gingival margin to the base of the pocket), clinical attachment loss (CAL: from the cemento-enamel junction to the base of the pocket), and presence of bleeding on probing (BOP). The teeth were examined at six sites: mesio-buccal, mid-buccal, disto-buccal, mesio-lingual, mid-lingual and disto- lingual. All clinical measurements were performed with the use of a manual probe (Trinity-Campo Mourão, Brazil). Each patient’s clinical data were recorded at baseline and 45 days after the completion of non-surgical treatment. Periodontal treatment Both study groups underwent an initial evaluation consisting of clinical history and assessment of clinical periodontal parameters. The patients received non-surgical periodontal treatment, comprising oral hygiene instruction, scaling and root planing under local anesthesia. The treatment required, on average, four sessions using manual instruments (Hu-Friedy Manufacturing Inc., Chicago, IL, USA) performed by one periodontist (MHT). After the periodontal treatment, a professional plaque control program was carried out twice a month for 45 days, consisting of supra gingival plaque removal and reinstruction of oral hygiene procedures. Sites and sampling Subgingival samples were collected in two sites of non-adjacent teeth with PPD ≥ 4 mm and BOP (diseased sites) and from two proximal sites of non-adjacent teeth with PPD ≤ 2 mm (healthy sites), at baseline and 45 days after the completion of non-surgical treatment. Thus, 140 subgingival plaque samples, obtained from 70 diseased sites and 70 healthy sites (46/24 from Down syndrome and Control group, respectively), were evaluated. After the removal of supragingival plaque, subgingival plaque samples were gathered by inserting a sterile endodontic paper point for 30 s, placing the paper points in separate microtubes containing 100 µL of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.6), which were stored at -80°C until use. Absolute quantification of bacteria by qPCR Genomic DNA from bacteria and subgingival plaque samples was isolated and purified using kit Wizard® Genomic DNA Purification (PROMEGA, Madison, WI, USA) and was used as the template for real- time polymerase chain reaction (qPCR). To establish the quantitative assay, plasmids containing the target genes were used as standards. PCR amplicons for 16SrRNA gene of P. gingivalis, T. denticola and T. forsythia were obtained, individually cloned in PCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to the manufacturer’s recommendations, and transformed in Escherichia coli DH5-a. After the growth of transformants, plasmids were extracted using the PureLink Quick Plasmid Miniprep kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 150. The standard curve with diluted plasmids that harbored a cloned copy of template DNA for P. gingivalis W83, T. denticola ATCC 33520, and T. forsythia ATCC 43037 qPCR had a minimum R 2 value of 36 0.98, and the estimated amplification efficiency ranged from 97% to 102%. The seven standard dilutions (from 107 to 101 copies) were run in triplicate, and the subgingival samples were run in duplicate. The mean values of target molecule numbers were used for analysis. Quantitative PCR was carried out using the SYBR Green Power Kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). PCR reactions were set up in 96-well plates in a total volume of 22 µl, containing 11 µl of SYBR Green mix, 1 µl of DNA sample, and 100 nM of each primer for P. gingivalis, T. denticola, and T. forsythia 6, 98, 134, 150. The following thermal program was used: 95 °C for 10 min followed by 40 cycles of denaturation at 95 °C for 15 s, annealing at 60 °C for 1 min, and extension at 95 °C for 15 s. Melting curve analysis was carried out at 65– 95 °C to confirm that the PCR products from samples and reference plasmids had identical melting points. Data were analyzed using the SDS 7500 Applied Biosystems software. The levels of red complex bacteria for each site were expressed as the sum of the number of copies of 16SrRNA gene of each red complex microorganism (P. gingivalis + T. denticola + T. forsythia). The sensitivity range of bacterial detection and quantification of the qPCR technique used was 101–107 bacteria for each of the periodontopathogens tested. Statistical analysis The unit for the analyses was the subject for demographic analysis and the site for the microbiological analysis, and α was set on 0.05. The Shapiro-Wilk test was used to assess the distribution normality of quantitative data. Data were categorized as “baseline” and “45 days after treatment”. Because the demographic characteristics were distributed normally, Unpaired t-test was used to assess differences among the groups. The χ2 test was used to determine whether the groups were composed of the same proportion of males and females. For site-based analyses, due of the absence of a normal distribution, comparisons between the Down syndrome and control group were accomplished using Mann-Whitney U-Test. The Wilcoxon test was utilized to assess differences between study periods. Results Demographic characteristics The demographic characteristics and clinical data of the studied population are summarized in Table 1. The Control group presents a higher mean age compared to the DS group (Unpaired t-test; p=0.001). No statistically significant differences were observed among groups with regard to gender (χ2; p=0.689). For the full-mouth clinical parameters, probing depth, attachment level and bleeding on probing were similar (Unpaired t-test; p=0.001). However, the parameters plaque and gingival bleeding were more prevalent in Down syndrome patients than in the control group (Unpaired t-test; p<0.0001 and p=0.0090 respectively). Clinical outcomes in the evaluated periods The clinical parameters at sample-collected sites were similar in the Down syndrome and Control groups in diseased and healthy sites for both periods (Mann-Whitney U-test, p>0.05; Table 2). The effects of non-surgical periodontal therapy on the clinical parameters were evaluated in diseased sites and healthy sites through comparisons before and 45 days after treatment (Table 2). Non-surgical periodontal therapy resulted in a significant decrease in the clinical parameters of diseased sites for both groups (Down Syndrome and Control) 37 at 45 days (Wilcoxon test, p<0.05; Table 2). There were no differences in clinical parameters in healthy sites between baseline and 45 days after treatment for both groups. Therefore, the treatment was equally effective for the Down syndrome and Control groups. Periodontopathogens in Down syndrome and Control Group To investigate the relationship between Down syndrome and the colonization of the oral cavity by periodontopathogens, the quantitative P. gingivalis, T. forsythia, and T. denticola data were obtained from 70 diseased sites and 70 healthy sites (46/24 from Down Syndrome and Control Group, respectively), at baseline and after 45 days of treatment. In regarding to diseased sites, no statistically significant differences were observed among groups in the counts of P. gingivalis and T. forsythia at baseline. However, the levels of T. denticola were significantly higher in the Down syndrome than in Control Group (Mann-Whitney U-test, p=0.03; Table 3) at baseline. At 45 days after periodontal treatment, the levels of P. gingivalis, T. forsythia, and T. denticola were significantly higher in the Down syndrome than in Control group (Mann-Whitney U-test, p<0.0001, p=0.0003, and p=0.0007, respectively; Table 3). In regarding to healthy sites, no statistically significant differences were observed between groups in the counts of T. denticola and T. forsythia at baseline. However, the levels of P. gingivalis were significantly higher in the Down syndrome than in Control group (Mann-Whitney U-test, p=0.0201; Table 3) at baseline. At 45 days after periodontal treatment, the levels of P. gingivalis, T. forsythia, and T. denticola were significantly higher in the Down syndrome than in Control group (Mann-Whitney U-test, p<0.0001, p=0.0043, and p<0.0001; respectively; Table 3). Each intra-group comparison (among the study periods) revealed that the non-surgical periodontal therapy did not reduce significantly the counts of 16SrRNA gene copies of the three investigated microorganisms in the diseased sites of the Down syndrome group (Wilcoxon test, p>0.05; Table 3). Otherwise, the levels of P. gingivalis, T. forsythia, and T. denticola were significantly lower 45 days after periodontal treatment in the diseased sites of the Control Group (Wilcoxon test, p<0.05; Table 3). In regarding to healthy sites, it was observed a reduction of all microorganisms evaluated 45 days after periodontal treatment in both groups (Wilcoxon test, p<0.05; Table 3). Discussion Many studies have reported that DS individuals have an increased prevalence of periodontal disease (PD) compared with otherwise chromosomally normal (euploid), age-matched control and other mentally disabled patients of similar age distribution 38, 41, 106, 121. Various periodontal pathogens exhibited a very early colonization on the Down’s syndrome children compared to systemically healthy children with similar levels of gingival inflammation and plaque accumulation5. It has also been reported that the same amount of plaque accumulation gives rise to an earlier, more rapid and more extensive gingival inflammation in the deciduous dentition in DS children compared to normal control children 121. Thus, it was suspected that DS young adults would also have higher levels of complex microflora with causative pathogens than non-DS subjects with similar dental plaque levels4. In this study, the DS population has an earlier age and almost the same periodontal clinical data compared with the controls (Table 1). 38 The first report, in 1968, found that 71% out of 41 institutionalized DS children (5 to 12 years) harbored black-pigment Bacteroides (BPB) including P. gingivalis and P. intermedia 92. Two years later, another research found no significant difference in BPB counts between age-matched DS and non-DS subjects (9 to 24 years), but the BPB counts were significantly higher in institutionalized DS children than in DS children living at home38. Several periodontal pathogens were found colonizing the oral tissues of children, adolescents and young adults with Down syndrome, earlier and at higher levels, when compared to healthy individuals and subjects with cerebral palsy 5, 124. Recently, Martinez-Martinez et al. 90 (2013) reported that Tannerella forsythia was the most frequent bacteria detected in individuals with DS with and without periodontitis, followed by Treponema denticola and Porphyromonas gingivalis. In this study, diseased sites showed no statistically significant differences between the Down syndrome and control group in counts of P. gingivalis and T. forsythia at baseline. In agreement, Reuland-Bosma et al. 120 (2001) comparing seventeen Down syndrome adults with moderate periodontitis which received daily oral hygiene care performed by a caregiver and with a well-matched mentally disabled individuals (control group) did not found statistically significant differences in the subgingival prevalence and culturable proportions of P. gingivalis and T. forsythia. Even when the authors divided the Down syndrome group in “low- risk” group and a “high-risk” group, no differences in the prevalence of distinct periodontopathic bacteria and bacterial subgingival composition could be established. Another research using checkerboard DNA-DNA hybridization found that most of the 40 subgingival bacterial species including the major periodontal pathogens A. actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, P. intermedia, Parvimonas micra, F. nucleatum and Campylobacter rectus were present at similar levels in adult Down syndrome subjects compared with matched non-Down syndrome mentally disabled and mentally normal subjects81. Interesting fact, mainly because individuals with Down syndrome show no statistically significant differences in Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythia compared with individuals without Down syndrome, in agreement with this study. According to Amano et al. 5 even in early childhood (2 to 4 years) in individuals with Down syndrome, some periodontopathogens like Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia and Treponema denticola, were detected. The number of species gradually increased with age, and all were most often detected between 11 and 13 years of age. In addition, Porphyromonas gingivalis, and Treponema denticola were not found between 2 and 13 years old children in control group. These findings suggest that individuals with Down syndrome experience a very early colonization by periodontopathogens in their childhood and bacteria levels tend to increase over the years. So, these findings may support the higher level of Treponema denticola found in the Down syndrome than in Control group at baseline in the present study. Notably, this study is the first one that quantifies the levels of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia and Treponema denticola by qPCR and found significantly higher levels of these red complex pathogens in the Down syndrome than in control group 45 days after non-surgical periodontal therapy. Regarding to healthy sites at baseline, no statistically significant differences were found between groups in the counts of T. denticola and T. forsythia. Although DS subjects generally develop an earlier and more 39 extensive periodontal breakdown than those presented by subjects with mental disabilities, Amano et al. 4 (2001) did not observe significant differences in the bacterial profiles comparing these two groups of patients. Yamazaki-Kubota et al. 168 (2010) found a rate of 42.9% for P. gingivalis, 64.3% for A. actinomycetemcomitans, 35.7% for C. rectus and T. denticola in DS patients. Nevertheless, the detection rate of periodontopathic bacteria in subgingival plaque in Down’s syndrome patients wasn’t statistically different compared to the control subjects. Porphyromonas gingivalis is frequently detected in periodontally healthy people, and this colonization of the oral cavity is necessary, but not sufficient, to induce periodontal disease61. However, the increase of P. gingivalis is gradual and the prevalence is significantly high in Down syndrome. Although the periodontal parameters in both groups were comparable in the present study, when we compared healthy sites in Down’s syndrome individuals and in control group it was observed a significantly higher count of this periodontal bacteria in the DS group (p=0.0201). This finding suggests that host factor(s) are important in the induction and progression of periodontal diseases, likely that gingival epithelial cells associated with DS are more sensitive to P. gingivalis than those of healthy individuals99, 128. Comparing findings at baseline and 45 days after non-surgical periodontal treatment, in diseased sites of the Down syndrome group, although there was a decrease in the count of T. denticola and T. forsythia, it was not statistically significant. These observations are in agreement with finding by Cichon et al. 32 who demonstrated no statistically significantly difference in percentage of P. gingivalis, T. denticola and T. forsythia in individuals with Down’s syndrome compared with control subjects at baseline, and at 1, 4, and 12 weeks post treatment. Otherwise, in this work, the levels of P. gingivalis, T. forsythia, and T. denticola were significantly lower at 45 days after periodontal treatment in the diseased sites of the Control group. Similar results were found by Finoti et al. 48 and Cugini et al. 36. Hanookai et al. 65 doing the counts of P. gingivalis and T. forsythia in samples obtained from subgingival debridement in the deep pockets (5mm or more) at baseline, 1 and 4 weeks did not show statistically significant difference. On the other hand, in one longitudinal study with five Down’s syndrome adult patients with periodontitis placed on a recall visit schedule at 1, 3 and 6 months after treatment, the percentages of detection of P. gingivalis and T. forsythia were reduced at 1 and 3 months after baseline (p<0.05). Six months after treatment the percentage of detection was increased only for T. forsythia (p<0.05) 124. Regarding to healthy sites, at 45 days after periodontal treatment, the levels of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia and Treponema denticola reduced significantly in both groups. Different findings were found by Hanookai et al. 65 who showed that the occurrence of P. gingivalis and T. Forsythia in shallow periodontal sites (1 to 3 mm) at baseline, 1 and 4 weeks had no statistically significant difference in Down syndrome patients. The results of the present investigation reinforced that patient collaboration with oral hygiene and with the non-surgical treatment are essential factors to obtain a greatest reduction in specific subgingival microbial species. Conclusion According to the data reported in this work, the maintenance phase of therapy might not have the major effect in the count of red complex pathogens in diseased sites difference but have improved effect in healthy sites, for Down syndrome patients. Nevertheless, the continual and effective oral hygiene can markedly delay 40 subgingival establishment of pathogenic bacteria. Although, higher prevalence of periodontal disease in Down syndrome subjects is, probably, related to the impaired host response and not to the occurrence of specific periodontal pathogens. Perhaps, other associated factors might be the inability of remove the biofilm and effectively control supragingival plaque. Further studies could determine a better protocol for monitoring and maintenance for improve periodontal health in Down syndrome with periodontal disease. References 1. Byrne SJ, Dashper SG, Darby IB, Adams GG, Hoffmann B, Reynolds EC (2009) Progression of chronic periodontitis can be predicted by the levels of Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola in subgingival plaque. Oral Microbiol Immunol 24 (6):469-477. doi:10.1111/j.1399-302X.2009.00544.x 2. Garlet GP (2010) Destructive and protective roles of cytokines in periodontitis: a re-appraisal from host defense and tissue destruction viewpoints. Journal of dental research 89 (12):1349-1363. doi:10.1177/0022034510376402 3. Feng Z, Weinberg A (2006) Role of bacteria in health and disease of periodontal tissues. Periodontol 2000 40:50-76. doi:10.1111/j.1600-0757.2005.00148.x 4. Haffajee AD, Socransky SS (1994) Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol 2000 5:78-111 5. 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Demographic characteristics and mean (±SD) of full-mouth clinical parameters of the study groups Characteristics (mean values ±SD) Groups Down Syndrome Control Group p-value n=23 n=12 Age (years) (±) 31.91 (±5.85) 41.25 (±6.17) 0.001 Gender (M/F) 15/8 7/5 NS Probing depth (mm) (±) Baseline 45 days 2.27 (±0.45) 1.82 (±0.44) 2.29 (±0.45) 1.57 (±0.21) NS NS p-value 0.0012 0.0001 Attachment level (mm) (±) Baseline 45 days 2.33 (± 0.51) 1.91 (±0.51) 2.47 (± 0.48) 1.74 (±0.34) NS NS p-value 0.0084 0.0007 Plaque (%faces) Baseline 45 days p-value 83.76 (±11.33) 27.73 (±13.33) < 0,0001 48.51 (±19.54) 15.57 (±10.15) 0,0001 <0.0001 0,0158 GB (%sites) Baseline 45 days p-value 44.20 (±21.45) 10.29(±11.80) < 0,0001 25.57 (±12.10) 6.85 (±7.40) 0,0004 0.0090 NS BOP (%sites) Baseline 45 days 39.16 (±20.75) 12.46 (±9.14) 40.46 (±21.10) 8.76 (±5.93) NS NS p-value < 0,0001 0,0002 GB: Gingival bleeding and BOP: Bleeding on probing p-value = Unpaired t-test for evaluation between Down Syndrome and Control Group for all variables, except for gender it was used the Chi-squared test. 43 Table 2. Clinical parameters (median; min-max) in both periodontal diseased groups (at baseline and 45 after treatment) at sample collected sites Clinical Parameters Groups p-value* Down syndrome Control D is ea se d Si te s PPD (mm) Baseline 4.0 (4.0-5.0) 4.0 (4.0-5.0) NS 45 days 3.0 (1.0-6.0) 2.0 (1.0-3.0) NS p-value** <0.0001 <0.0001 CAL (mm) Baseline 4.0 (4.0-6.0) 4.0 (4.0-8.0) NS 45 days 3.0 (1.0-6.0) 2.0 (1.0-5.0) NS p-value** <0.0001 <0.0001 BOP (Y/N) Baseline 41/5 18/6 NS 45 days 4/38 3/17 NS p-value** <0.0001 <0.0001 H ea lth y Si te s PPD (mm) Baseline 1.0 (1.0-2.0) 1.0 (1.0-2.0) NS 45 days 1.0 (1.0-2.0) 1.0 (1.0-2.0) NS p-value** NS NS CAL (mm) Baseline 1.0 (1.0-3.0) 1.0 (1.0-3.0) NS 45 days 1.0 (1.0-3.0) 1.0 (1.0-5.0) NS p-value** NS NS BOP (Y/N) Baseline 2/44 0/24 NS 45 days 0/42 0/20 NS p-value** NS NS PPD=Probing Pocket Depth; CAL=Clinical Attachment Loss; BOP=Bleeding on Probing; NS: no significance p-value* = Mann-Whitney for evaluation between the Down Syndrome and Control Group in each period p-value** = Wilcoxon test for evaluation of each group between the different periods 44 Table 3. Counts of 16SrRNA gene copies of microorganisms (median; min-max [x103]) in samples obtained from diseased and healthy sites in both periodontal diseased groups (at baseline and 45 after treatment) Counts of 16SrRNA Groups p-value* Down syndrome Control D is ea se d Si te s P. gingivalis Baseline 29.1 (0.9-65044.3) 18.5 (0.3-8635.8) NS 45 days 22.3 (0.4-15397.2) 2.3 (0.0-39.2) <0.0001 p-value** NS 0.0027 T. denticola Baseline 1358.2 (7.2-86392.2) 208.7 (2.95-62549.3) 0.03 45 days 441.4 (2.4-53255.7) 4.4 (0.1-8605.1) 0.0003 p-value** NS 0.0172 T. forsythia Baseline 235.4 (1.4-23178.3) 55.9 (1.5-20160) NS 45 days 46.81 (0.1-20963.1) 4.4 (0.0-4906.5) 0.0007 p-value** NS 0.0240 H ea lth y Si te s P. gingivalis Baseline 5.4 (0.3-7545,7) 1.3 (0.1-2407.9) 0.0201 45 days 2.2 (0.0-1849.9) 0.5 (0.0-48,2) <0.0001 p-value** 0.01 0.04 T. denticola Baseline 16.9 (1.2-18609.9) 7.3 (0.1-9489.6) NS 45 days 7.1 (0.2-11117.3) 2.3(0.0-21.9) 0.0043 p-value** 0.0267 0.0328 T. forsythia Baseline 7.6 (0.1-19742.9) 4.7 (0.0-769.9) NS 45 days 3.5 (0.1-16550.1) 0.2 (0.0-1.94) <0.0001 p-value** 0.0017 0.0014 p-value* = Mann-Whitney for evaluation between the Down Syndrome and Control Group in each period p-value** = Wilcoxon test for evaluation of each group between the different periods NS: no significance CAPÍTULO 2 Capítulo 2 Níveis das citocinas Th1/Th2 e Th17 em indivíduos com Síndrome de Down com doença periodontal antes e depois do tratamento periodontal não cirúrgico* Marcia H. Tanaka* Thamiris O. Rodrigues† Carlos Rossa Jr‡ Raquel M. Scarel-Caminaga§ Niels O. S. Câmara** Elisa M. A. Giro†† * Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, SP, São Paulo, Brazil † Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, SP, São Paulo, Brazil ‡ Department of Diagnosis and Surgery, School of Dentistry at Araraquara, UNESP-Univ Estadual Paulista, São Paulo, Brazil §Department of Morphology, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo, SP, Brazil **Department of Immunology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo (USP), São Paulo, Brazil ††Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, SP, São Paulo, Brazil O artigo foi formatado segundo as normas do periódico Journal of Periodontology 47 Níveis das citocinas Th1/Th2 e Th17 em indivíduos com Síndrome de Down com doença periodontal antes e depois do tratamento periodontal não cirúrgico* Marcia H. Tanaka, DDS, PhD student*; Thamiris O. Rodrigues DDS, MS†; Carlos Rossa Jr, DDS, PhD ‡, Raquel M. Scarel-Caminaga, BSc, MSc §, Niels O. S. Câmara, DDS, PhD **; Elisa M. A. Giro, DDS, PhD†† * Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, SP, São Paulo, Brazil † Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, SP, São Paulo, Brazil ‡ Department of Diagnosis and Surgery, School of Dentistry at Araraquara, UNESP-Univ Estadual Paulista, São Paulo, Brazil §Department of Morphology, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo, SP, Brazil **Department of Immunology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo (USP), São Paulo, Brazil ††Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista, Araraquara, SP, São Paulo, Brazil Corresponding Author: Elisa Maria Aparecida Giro Department of Orthodontics and Pediatric Dentistry, Araraquara School of Dentistry, UNESP – Univ Estadual Paulista Rua Humaitá, 1680, Araraquara, SP, Brazil CEP- 14801-903 Tel.: +55 16 33016336 Fax: +55 16 33016329 e-mail: egiro@foar.unesp.br 48 Resumo O objetivo deste estudo foi determinar se os níveis de algumas citocinas Th1, Th2 e Th17 no fluido gengival (GCF) foi diferente entre os indivíduos com Síndrome de Down (SD) e indivíduos normais, ambos com doença periodontal (DP), em resposta à tratamento periodontal não-cirúrgico. Foram selecionados um total de 30 indivíduos, os quais foram divididos nos seguintes grupos: Grupo 1- Síndrome de Down com Doença Periodontal (SD) (n=20) e Grupo 2- Não-sindrômicos com Doença Periodontal (Controle) (n=10), antes (I) e depois (F) do tratamento. Dependendo da normalidade dos dados, foram aplicados o teste-t de Student ou Mann-Whitney para analisar as diferenças entre os grupos, e os teste-t de Student ou Wilcoxon para dados pareados para analisar os diferentes períodos em ambos os grupos. O nível de significância adotado foi de 0,05. A interleucina (IL)-12 (p70) não foi detectada nos sítios (sadios e doentes) do grupo controle. Nos sítios doentes, foram observados maiores quantidades das citocinas IL-6, IFN-γ, GM-CSF, TNF-α, IL-10 e IL-17A nos indivíduos com SD em comparação com o grupo controle, antes e depois do tratamento. Nos sítios sadios, as citocinas IL-6, IFN-γ e IL-17A foram mais abundantes nos sindrômicos antes do tratamento, porém após o tratamento, somente a IL-17A foi maior nos indivíduos com SD. Concluindo, podemos sugerir que a resposta imune dos indivíduos com SD com DP possui maiores concentrações de Th1, Th2 e Th17 em sítios doentes do que os cromossomicamente normais e, embora o tratamento periodontal não cirúrgico determine uma redução das concentrações de várias citocinas pró-inflamatórias e melhora nos parâmetros clínicos, em ambos os grupos, a resposta frente ao processo inflamatório é mais intensa nos indivíduos com SD, explicando em parte, a alta prevalência e severidade da doença nesses indivíduos. Palavra-Chave: Síndrome de Down, Periodontite, Sistema Imunológico, Linfócitos T Auxiliares- Indutores, Citocinas Abstract The aim of this study was to determine if the levels of some cytokines of the Th1, Th2 and Th17 cells in gingival crevicular fluid (GCF) differed between subjects with Down syndrome (DS) and normal subjects, both with periodontal disease (PD), in response to non-surgical periodontal therapy. Thirty individuals were divided into the following groups: Group 1 - DS with PD (DS) (n=20) and Group 2 - Non-syndromic with PD (Control) (n=10), before (I) and after therapy (F). According to the normality of the data, were applied the Student's t-test or Mann-Whitney test to analyze differences between groups, and Student's t-test or Wilcoxon test for paired data to analyze the different periods in both groups (α=0.05). Interleukin (IL)-12 (p70) was not detected in healthy and diseased sites in the control group. In the diseased sites, increased levels of IL-6, IFN-γ, GM-CSF, TNF-α, IL-17A and IL-10 were detected in individuals with DS compared with the control group before and after the periodontal therapy. In healthy sites, IL-6, IFN-γ and IL-17A cytokines were more abundant in DS before the periodontal therapy. However, after the periodontal therapy, only IL-17A was higher in individuals with DS. The results confirm that periodontal therapy effectively reduces clinical parameters in the DS group and in the control group. Nevertheless, the levels of Th1, Th2 and Th17 cells at diseased sites were higher in DS group than in chromosomally normal group. So, increased inflammatory mediator levels in CGF in DS individuals, suggest that these patients might have a propensity to overproduce these cytokines, and may in part, explaining the higher prevalence of Down syndrome to periodontal diseases. 49 Key Words: Down syndrome, Periodontitis, Immune System, T-Lymphocytes, Helper-Inducer, Cytokines, Introdução A Doença Periodontal (DP) é uma doença inflamatória caracterizada pela destruição do periodonto e eventual perda dentária 104. Muitos estudos têm relatado que os indivíduos com Síndrome de Down (SD) têm um aumento da prevalência de doença periodontal (DP) em comparação com indivíduos cromossomicamente normais , pareados por idade, e com outros portadores de necessidades especiais 11, 37, 39, 41, 93, 106, 121. A DP é considerada como uma doença multifatorial, podendo, nos indivíduos com SD, estar associada a fatores como má higiene bucal, a composição da placa subgengival e a deficiência na resposta imune frente ao processo inflamatório 4, 29, 74, 79, 80, 96, 158. Deficiências no sistema imune nos indivíduos SD incluem o desbalanço nas subpopulações de linfócitos T, menor atividade de fagocitose por leucócitos, redução na quimiotaxia de neutrófilos, produção alterada de anticorpos , e maiores quantidades de mediadores inflamatórios na presença da DP 9, 14, 29, 73, 78, 88, 111, 141, 157. Interessante ressaltar que no braço longo do cromossomo 21 existe um agrupamento de genes (cluster) composto pelos genes IL10RB e IFNGR2 juntamente com os genes dos dois receptores do IFN-α, estando os quatro genes orientados um em seguida do outro (tandem)117. Pelo fato de possuírem um cromossomo 21 extra, na presença de DP, a expressão gênica de IL10RB mRNA é maior nesses indivíduos, porém a expressão do IFNγ mRNA tem se mostrado semelhante entre os grupos SD e Controle, ambos com DP 25, 149. Já no timo de indivíduos com Síndrome de Down, foi encontrada uma super expressão de citocinas como TNFα e IFNγ mRNA, o que poderia explicar uma anatomia anormal do timo e reduzido número de linfócitos T maduros, resultando em uma resposta imune deficiente nesses indivíduos sindrômicos100. Os linfócitos T helper (Th) são responsáveis pela resposta imune e podem se diferenciar em Th1, Th2, Th17 e Treg que irão mediar na inflamação, destruição tecidual e autoimunidade 97. Algumas das citocinas liberadas pelos linfócitos Th1 (IL-1β, IL-6, IL12, IFN-γ, GM-CSF e TNF-α) e Th17 (IL-17) são conhecidas como citocinas pro-inflamatórias, e as citocinas liberadas pelos linfócitos Th2 (IL-4, IL-6 e IL-10) são conhecidas como citocinas anti inflamatórias71, 116, 132, 148, 172. Assim, como em qualquer doença inflamatória crônica, as citocinas tem um papel importante no início, na progressão e na modulação da resposta imune do hospedeiro na doença periodontal15, 172. Desse modo, o desbalanço das quantidades dessas citocinas Th1, Th2 e Th17 no tecido gengival e no fluido gengival crevicular podem causar reabsorção óssea e destruição do colágeno durante a evolução da inflamação periodontal 68. A Interleucina 12 é produzida pelos macrófagos ativados e células dendríticas. Ela regula o balanço entre Th1 e Th2 pela diferenciação de células T naive em células Th1 que sintetizam múltiplas citocinas pro- inflamatórias como IL-1β, IFN-γ e TNF-α107, 172. O Interferon-gama (IFN-γ) é um potente ativador de macrófagos, neutrófilos e pode estimular o desenvolvimento de células Th1 sendo importante na reabsorção óssea86. As citocinas IL-1β e TNF-α também são potentes indutores da reabsorção óssea e inibidores da formação óssea 144, 145. Essas citocinas pró inflamatórias são liberadas principalmente por macrófagos após infecção bacteriana ou injúria no tecido 42. Altas concentrações dessas citocinas são capazes de estimular a produção e liberação de outros mediadores inflamatórios como a IL-6 que atua como citocina pro e anti 50 inflamatória sendo capaz de induzir a diferenciação de células B, proliferação de células T e síntese de proteínas de fase aguda 71, 116. Outra citocina pro-inflamatória é a IL-17 que estimula uma variedade de células a produzir mediadores inflamatórios como IL-1, IL-6 e TNF-α 17, 132. Adicionalmente, a via de sinalização da IL-17 também está associada na proteção contra bactérias via recrutamento de fagócitos, o que potencializa o processo de destruição periodontal 122, 132, 148. Pertencente as citocinas pro-inflamatórias, o Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos (GM-CSF) é produzido principalmente por monócitos/macrófagos, fibroblastos e células endoteliais e desempenha um papel essencial na sobrevida dos neutrófilos. Esta citocina atrasa a apoptose dos neutrófilos resultando num aumento da função fagocitária nos tecidos gengivais de indivíduos com DP, aumentando assim o potencial de inflamação na periodontite 35, 40, 51. Por outro lado, temos a IL-10 que é uma citocina anti-inflamatória produzida principalmente por células Th2, associada a baixa severidade da doença periodontal52, 54. Portanto, inibe principalmente a produção de IFN- γ pelas células Th1 além da síntese de outras citocinas como IL-1β, IL-6, e TNF-α. Adicionalmente, a IL-10 também é um estimulador de células B e pode inibir uma série de vias de sinalização pro-inflamatórias, suprimindo a produção de metaloproteinases e estimulando a produção de osteoprotegerina, que é um inibidor da reabsorção óssea53, 129. Portanto, podemos observar que o desbalanço nas populações de células Th1, Th2 e Th17 pode aumentar a severidade e estimular a progressão de doenças inflamatórias, como a doença periodontal. A associação do sistema imune deficiente com os fatores etiológicos da DP, nos indivíduos com SD, talvez possa explicar a evolução rápida e a maior severidade desta doença nesses pacientes. Desta forma, este estudo avalia algumas citocinas das células Th1, Th2 e Th17 relacionando suas quantidades nos sítios doentes e sadios, antes e depois do tratamento periodontal em indivíduos com Síndrome de Down com doença periodontal. Materias e Métodos Delineamento do estudo e seleção da casuística Os indivíduos com SD foram selecionados em Associações de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAEs) de Araraquara e região (São Carlos, Catanduva, Matão e Taquaritinga), Associação de Síndrome de Down de São José dos Campos (ASIN) e os não-sindrômicos, nas Clínicas de Periodontia e Cirurgia da Faculdade de Odontologia de Araraquara (FOAr –UNESP). Todos os indivíduos selecionados para compor a casuística deste estudo tiveram seu histórico médico e odontológico avaliados. Os indivíduos com Síndrome de Down e indivíduos não sindrômicos selecionados são de ambos os gêneros e qualquer etnia, apresentando DP. Foram excluídos indivíduos sem autorização do cardiologista para realização de procedimento odontológico invasivo, com história de antibioticoterapia, que fizeram uso de antiinflamatórios e/ ou de imunossupressores nos últimos 3 meses, com história de tratamento periodontal nos últimos 6 meses; alteração sistêmica ou alguma doença infecciosa, gestantes, lactantes e os fumantes. Foram excluídos também os indivíduos com SD do tipo mosaico. Após explicar de maneira acessível, os objetivos da pesquisa aos indivíduos selecionados e seus responsáveis, estes foram convidados a assinar o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) aprovado pelo Comitê de Ética em Humanos da FOAr (número do protocolo 62/11- Anexo). 51 Parâmetro clínico Foram selecionados para este estudo um total de 30 indivíduos, os quais foram divididos nos seguintes grupos: Grupo 1- Síndrome de Down com Doença Periodontal (SD) (n=20) e Grupo 2- Não-sindrômicos com Doença Periodontal (Controle) (n=10). Foram considerados com doença periodontal aqueles pacientes com profundidade de sondagem (PS) ≥4mm, presença de sangramento à sondagem (SS) e nível de inserção (NI) >3mm em pelo menos oito sítios ou mais não adjacentes152. Os participantes desta pesquisa foram submetidos a um exame periodontal realizado por meio de secagem prévia da região com jato de ar, e uso de uma sonda periodontal milimetrada tipo Williams (Trinity-Campo Mourão, Brazil) espelho plano e pinça clínica, devidamente esterilizados. Este exame foi realizado por um único examinador previamente calibrado e consistiu das seguintes avaliações: Índice de placa visível (IPV)3, Profundidade de sondagem (PS)95, Sangramento marginal (SM), sangramento à sondagem (SS) e Nível de inserção (NI)95. As análises foram realizadas em 6 sítios por dente: disto-vestibular, vestibular, mesio-vestibular, disto- lingual, lingual e mesio-lingual nos parâmetros PS, NI e SS. Os outros parâmetros clínicos como IPV e SM foram realizadas em 4 faces por dente: vestibular, lingual, mesial e distal. Para evitar interferências devido à sondagem, a coleta inicial do fluido gengival crevicular foi realizada uma semana após o exame clínico periodontal por um único pesquisador com a finalidade de diminuir possíveis variações no método. Tratamento periodontal não-cirúrgico Todos os indivíduos participantes do estudo receberam tratamento periodontal não-cirúrgico (raspagem, alisamento e polimento supragengival), que foi realizado por um único cirurgião-dentista especialista em Periodontia, e receberam orientação de higiene bucal, sendo esta reforçada a cada consulta. Posteriormente à raspagem supragengival e contando com a colaboração quanto à higienização bucal, foram realizados a raspagem e alisamento radicular subgengival. Após o término do tratamento periodontal, a orientação de higiene bucal foi reforçado nas consultas de manutenção que foram agendadas a cada 15 dias, até totalizar 45 dias. Em seguida, foi realizada nova coleta de fluido gengival crevicular nos mesmos sítios determinados para a coleta inicial, e foi repetido o exame periodontal. Seleção dos sítios e coletas Para as coletas inicial e final do fluido gengival, para ambos os grupos (indivíduos com SD e controle), foram selecionados 3 sítios doentes com profundidade de sondagem entre 4 e 6 mm e perda de inserção entre 3 e 4 mm; e 3 sítios sadios com profundidade de sondagem menor que 3 mm e com ausência de perda de inserção, em dentes diferentes, não-adjacentes. Previamente à coleta, foi removido o biofilme supragengival com gaze esterilizado, a região foi isolada com rolos de algodão, e, cuidadosamente seca com suaves jatos de ar. O fluido gengival foi coletado com o auxílio de um filtro especial (Periopaper - ProFlow Inc., Amityville, NY, USA) que foi introduzido nos mesmos sítios selecionados para análise microbiológica onde permaneceu durante 30 segundos. 52 No caso de contaminação da amostra com sangue, esta foi descartada, o sangramento do sulco foi controlado por irrigação com solução fisiológica e nova coleta foi realizada após 10 minutos. O volume de fluido foi quantificado utilizando-se um equipamento especifico (Periotron 8000 - ProFlow Inc., Amityville, NY, USA), e, em seguida a amostra foi armazenada em microtubos à seco a uma temperatura de -80ºC para posterior análise. Análise Imunológica As amostras de fluido gengival foram utilizadas para avaliação da quantidade das proteínas IL-1β, IL-6, IL-12 (p70), IFN-γ, GM-CSF, TNF-α, IL-17A e IL-10. Para esta análise foi utilizada a tecnologia Luminex, utilizando um anticorpo e um recombinante protéico para as proteínas selecionadas do sistema Fluorokine MAP Multiplex Human Cytokine Panel A (Bio-Plex system, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Uma mistura das micropartículas diluídas (50 µL), a curva padrão (50 µL) e as amostras do fluido gengival diluídas 20 vezes (50 µL) foram pipetadas nos respectivos poços da placa e incubadas por 2 horas. Após a lavagem, um coquetel específico de anticorpos conjugado à biotina (50 µL) foi adicionado e incubado por mais uma hora à temperatura ambiente. Após nova lavagem, um conjugado estreptoavidina-ficoeritrina (50 µL) foi adicionado, incubado por 30 minutos e as micropartículas foram suspensas em solução tampão. Os resultados foram calculados por meio de um software analisador de imagens (Bio-Plex Manager Software®, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA). A concentração de citocinas foi expressa em pg/mL. Análise Estatística As condições de homogeneidade de variâncias e normalidade dos resíduos, antes e após o tratamento foram confirmadas pelos testes de Levene e Shapiro-Wilk, respectivamente. O programa utilizado para as análises os dados foi o GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Os dados demográficos e clínicos, e o volume do fluido gengival crevicular tiveram uma distribuição normal. Para as citocinas, quando necessário, os dados foram transformados em logaritmos decimais para a normalização. Além disso, uma correção dos graus de liberdade foi aplicada quando ocorreu heterogeneidade de variâncias com normalidade dos resíduos. Assim, para a variável gênero foi utilizado o teste Qui-quadrado e, para os dados clínicos, volume do fluido gengival e dosagens de citocinas foi utilizado o teste-t de Student para analisar as diferenças entre os grupos, e o teste-t de Student para dados pareados para analisar os diferentes períodos em ambos os grupos. Quando os dados clínicos foram separados de acordo com a condição dos sítios (sadios e doentes), a normalidade não pode ser provada mesmo com a transformação logarítmica. Neste caso, adotou-se o teste U de Mann-Whitney para a comparação entre os dois grupos antes e após o tratamento e o teste de Wilcoxon para dados pareados para avaliar o efeito do tratamento sobre cada grupo. Para estudar a correlação da concentração de cada citocina com a condição dos sítios (sadios e doentes) foram empregados os coeficientes de correlação de Pearson. O nível de significância adotado foi de 0,05. Resultados Características Demográficas As características demográficas e os dados clínicos estão presentes na tabela 1. O grupo Controle apresentou uma idade média maior do que o grupo Síndrome de Down (p=0,001). Em relação ao gênero, não foi 53 observada diferença estatística entre os grupos. Para profundidade de sondagem (PS) não foi observada diferença estatística entre os grupos nos momentos antes e 45 dias após o tratamento periodontal. Porém, houve uma redução da PS no grupo SD e controle depois do tratamento (p=0.0012 e p=0,001, respectivamente). O nível de inserção (NI) também não mostrou diferença estatística entre os grupos, mas houve diferença estatística entre os períodos tanto para o grupo SD quanto para o Controle (p=0,0084 e p=0,0007, respectivamente). O índice de placa visível foi maior para o grupo SD, tanto no início como após o tratamento p<0,0001 e p=0,0158, respectivamente) e, para ambos os grupos, o tratamento determinou uma redução significativa deste (p≤0,0001). Para a variável sangramento marginal, as análises demonstraram efeito significativo do período de avaliação, sugerindo que o tratamento diminuiu as médias dos dois grupos (SD e controle; p<0,0001 e p=0,0004, respectivamente), sem diferença entre eles após o tratamento. Para o sangramento à sondagem não houve diferença estatística entre os dois grupos , porém o tratamento determinou redução deste, tanto no grupo SD quanto no grupo Controle (p<0,0001 e p=0,0002, respectivamente). Avaliação dos sítios selecionados nos diferentes períodos Os parâmetros clínicos (PS, NI e SS) dos sítios coletados foram similares nos grupos SD e Controle tanto para os sítios doentes como para os sadios em ambos os períodos (teste de Mann-Whitney, p>0,05; Tabela 2). Nos sítios doentes, o tratamento periodontal não cirúrgico resultou numa diminuição significante nos parâmetros clínicos analisados em ambos os grupos (SD e Controle) (teste de Wilcoxon, p<0,05, Tabela 2). Para os sítios sadios, antes e 45 dias após o tratamento, não houve diferença para ambos os grupos. Assim, observamos que o tratamento foi eficiente nos sítios doentes e manteve a saúde periodontal nos sítios sadios, em ambos os grupos SD e controle. Volume do Fluido gengival crevicular e as Concentrações das citocinas estudadas Sítios doentes: antes e depois do tratamento A citocina IL-12 (p70) não foi detectada nos sítios doentes do grupo Controle. Os indivíduos com SD possuíam um maior volume de fluido gengival e maior concentração de citocinas (IL-6, GM-CSF, IFN-γ, TNF- α, IL-10 e IL-17A) em comparação com indivíduos do grupo Controle antes do tratamento periodontal (p<0,05; Tabela 3 e Figura 1). A IL- 1β foi a única citocina que não apresentou diferença na quantidade entre ambos os grupos antes do tratamento. Após o tratamento, todas as citocinas (IL-1β,IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-α, IL-10 e IFN-γ) tiveram uma maior quantidade no grupo sindrômico em relação ao grupo Controle (p<0,05). Porém, o volume do fluido não apresentou diferença nos grupos estudados. No grupo SD, o volume do fluido e as citocinas IL-1β e GM-CSF apresentaram uma diminuição significante depois do tratamento (p<0,05). As citocinas IFN-γ (r:0,65) e IL-10 (r:0,57) tiveram uma correlação positiva entre antes e depois do tratamento (Tabela 6). Para o grupo Controle, apenas as citocinas IL-1β e IFN-γ apresentaram uma menor concentração depois do tratamento (p<0,05). 54 Sítios sadios: antes e depois do tratamento A citocina IL-12 não foi detectada nos sítios sadios de pacientes do grupo Controle. Nos sítios sadios, não foram encontradas diferenças nos volumes do fluido e nem nas concentrações das citocinas (IL-1β, GM- CSF, TNF-α e IL-10) em ambos os grupos. Somente as citocinas IL-6, IL-17A e IFN-γ apresentaram concentrações maiores nos grupos com SD em comparação com os grupo