UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E ULTRAESTRUTURAIS DA LÍNGUA DE CAMUNDONGOS MDX ANDRÉ NERI TOMIATE Rio Claro – SP 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E ULTRAESTRUTURAIS DA LÍNGUA DE CAMUNDONGOS MDX ANDRÉ NERI TOMIATE Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia). . Rio Claro – SP 2022 T657c Tomiate, André Neri Características estruturais e ultraestruturais da língua de camundongos mdx / André Neri Tomiate. -- Rio Claro, 2022 64 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, Rio Claro Orientador: Adriano Polican Ciena 1. Morfologia. 2. Distrofia Muscular de Duchenne. 3. Língua. 4. Papilas Linguais. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências, Rio Claro. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Rio Claro CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E ULTRAESTRUTURAIS DA LÍNGUA DE CAMUNDONGOS MDX TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTOR: ANDRÉ NERI TOMIATE ORIENTADOR: ADRIANO POLICAN CIENA Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA), área: Estrutura, Função e produção de Biomoléculas pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. ADRIANO POLICAN CIENA (Participaçao Virtual) Departamento de Educacao Fisica / UNESP Instituto de Biociencias de Rio Claro Prof. Dr. BRUNO CESAR SCHIMMING (Participaçao Virtual) Departamento de Anatomia / Unesp - Instituto de Biociências de Botucatu Prof. Dr. AMILTON CESAR DOS SANTOS (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências Morfológicas / Centro Universitário Funcação de Ensino Octávio Bastos Rio Claro, 26 de maio de 2022 Instituto de Biociências - Câmpus de Rio Claro - Avenida 24 A, 1515, 13506900 https://ib.rc.unesp.br/#!/pos-graduacao/secao-tecnica-de-pos/programas/biologia-celular-e-molecular/CNPJ: 48.031.918/0018-72. Computador Carimbo Computador Carimbo Agradecimentos Agradeço minha mãe, pai e irmão por todo o auxílio direto e indireto. Sei que os esforços para me ajudar de todas as formas possíveis não foram simples, na graduação e durante o mestrado. Das bolas de isopor a até mesmo evitar grandes barulhos durante as inúmeras videoconferências realizadas durante a pandemia. Agradeço o Laboratório de Morfologia e Atividade Física e seus integrantes. Ao meu orientador Prof. Dr. Adriano Polican Ciena, por toda a paciência, revisões de artigos (inclusive as de finais de semana) e cobrança por uma “visão artística” para a organização dos resultados. Jurandyr, Lara, Carolina e Gabriela pela incrível receptividade de cada um de vocês e auxílios em ótimas discussões acadêmicas. Em um período pandêmico e de grandes distâncias, guardo com todo o carinho pelos que me apoiaram das mais diversas formas. Tenho enorme apreço e gratidão por aqueles que sempre me possibilitaram momentos de risadas em um período tão tenebroso. Esther (maior nome do transporte alternativo), Gabi (microbióloga e microbiologista), Amanda (sempre indecisa), Felipe (que ficará sem descrição por falta de características marcantes), além é claro do Emygdio, saudoso técnico do departamento de Biodiversidade (não mais Zoologia, infelizmente) que em 1996 tinha 10 anos, Emygdio. Com vocês vislumbro um futuro melhor e faço do presente um momento de resiliência. Agradeço a Beatriz Garcia Gonçalves e ao Bestiário Brasileiro pela ilustração. Agradeço aos animais que cederam a vida para que essa pesquisa pudesse ocorrer. O respeito à vida é fundamental em todas as práticas. Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia) pela formação. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001 Agradeço também a todos aqueles que possibilitaram o enfrentamento na maior crise sanitária que minha geração viu até o momento. Há esperança porque muitos não se resignaram em meio as adversidades. Portanto, agradeço todos aqueles que resistem em meio a desertificação dos investimentos em pesquisa. Novamente não citei todos aqueles que estiveram comigo ou que de alguma forma me auxiliaram. Ressalto o que também escrevi nos agradecimentos do TCC: para todos aqueles que me ajudaram, não se sintam ofendidos por não terem sido citados, pois lembro de todos vocês e tenho plena convicção que todos possibilitam para que eu siga me esforçando cada vez mais para me tornar uma pessoa e profissional melhor. Muito obrigado. “Nada na vida deve ser temido, somente compreendido. Agora é hora de compreender mais para temer menos. ” Marie Skłodowska-Curie RESUMO A distrofia muscular de Duchenne (DMD) consiste em uma patologia ligada ao cromossomo X que acomete humanos e caracteriza-se por ciclo de degeneração e regeneração das fibras musculares, ocasionando na deposição de tecido conjuntivo e adiposo na musculatura. Nos estágios iniciais, o comprometimento motor é característico, entretanto outras regiões também apresentam alterações, como as musculaturas da cavidade oral. Associadas na deglutição alimentar, os diferentes músculos mastigatórios apresentam alterações que causam dificuldades na deglutição. Para o estudo da DMD, o modelo animal mais utilizado é o camundongo mdx, apesar de existir a caracterização da musculatura da língua, as repercussões na mucosa lingual ainda não foram evidenciadas. O objetivo do presente estudo consistiu em descrever as alterações morfológicas estruturais e ultraestruturais do epitélio, lamina própria e musculatura da língua de camundongos mdx. Foram utilizados 40 camundongos com 6 meses de idade organizados em dois grupos: Grupo Controle: n = 20 (C57bl/10) e mdx: n = 20 (C57bl/10mdx). As amostras foram processadas para análises estruturais, tridimensionais e ultraestruturais sob técnicas de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão. Estavam presentes papilas filiformes cônicas e triangulares, fungiformes, folhadas e valadas, e seus respectivos tecidos conjuntivos associados. As papilas triangulares filiformes apresentaram múltiplas pontas devido a maior desgaste. O epitélio foi caracterizado estratificado em camadas: córnea, granulosa, espinhosa e basal, o grupo mdx apresentou maior espessura nas diferentes regiões do corpo da língua. A lâmina própria possui composição de fibras de colágeno de coloração avermelhada e esverdeada, no grupo mdx, houve maior densidade de fibras colágenas. A região da submucosa apresentou glândulas mucosas e serosas com a presença de colágeno adjacente, aumento da área das glândulas mucosas e diminuição das serosas no grupo mdx. A musculatura dos camundongos mdx foi caracterizada pela grande deposição de colágeno entre as fibras, miocitólise e foco inflamatório. Em conclusão, a língua de camundongos mdx com 6 meses de idade teve os aspectos morfológicos, estruturais e ultraestruturais evidenciados, a distrofia proporcionou alterações indiretas na morfologia na espessura epitelial e desgaste das papilas, e direta na composição da lâmina própria, submucosa e musculatura dos camundongos mdx. Palavras-chave: língua; epitélio; papilas linguais; Distrofia Muscular de Duchenne. ABSTRACT Duchenne muscular dystrophy (DMD) consists of a pathology related to the X chromosome that affects humans and characterized by a cycle of degeneration and regeneration of muscular fiber, causing deposition of connective and adipose tissue on the musculature. In the early stages, the motor commitment is very characteristic; however in other regions also have alterations, as the oral cavity musculature. Associated with food swallowing, the different masticatory muscles present changes that provide difficulties during feeding. For the study of DMD, animal models are used and the mdx mouse is the more common, although there is a characterization of the tongue musculature, aspects of the lingual mucosa have not yet been evidenced. The aim of the study was describe changes in structural and ultrastructural morphological characteristics of the epithelium, lamina propria and tongue musculature of mdx mice. Forty mice with 6 months-old were used, organized into two groups: Control Group: n = 20 (C57bl/10) and mdx: n = 20 (C57bl/10mdx). Samples were processed for structural, tridimensional and ultrastructural analysis under light microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Our results showed conical and triangular filiform, fungiform, foliate, and vallate papillae, and its connective tissue cores. The filiform triangular papillae showed multiple tips due to increased wear. The epithelium was characterized stratified into layers: keratinized, granular, spinous and basal, and different regions of the tongue’s body had thicker epithelium in the mdx group. The lamina propria has a composition of reddish and greenish collagen fibers, in the mdx there was a higher density of collagen fibers. The region of submucosa had mucous and serous glands with the presence of adjacent collagen, higher area of mucous glands and lower area of serous glands in mdx group. The musculature of mdx mice was characterized by large collagen deposition between fibers, myocytolysis and inflammatory focus. In conclusion, the tongue of mdx mice with 6 months-age had the morphological, structural and ultrastructural aspects evidenced; dystrophy provided indirect changes in the epithelium thickness and wear of papillae and direct changes in the composition of the lamina propria, submucosa, and musculature of the mdx mice. Keywords: tongue; epithelium; lingual papillae, Duchenne Muscular Dystrophy. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Posição característica da marcha miopática ................................................ 14 Figura 2. Camundongo mdx ....................................................................................... 15 Figura 3. Ilustração da superfície da língua de humanos ............................................ 17 Figura 4. Músculos extrínsecos e intrínsecos da língua ............................................... 19 Figura 5. Microscopia de luz das papilas filiformes na língua da cutia (Dasyprocta leporina). .................................................................................................... 21 Figura 6. Microscopia de luz da papila fungiforme da cutia ....................................... 22 Figura 7. Microscopia de luz da papila folhada da cutia ............................................. 22 Figura 8. Microscopia de luz da papila valada da cutia .............................................. 23 Figura 9. Ilustração da língua de camundongos. ........................................................ 28 Figura 10. Microscopia de luz das papilas do corpo da língua de camundongos. ............................................................................................. 30 Figura 11. Microscopia de luz da lâmina própria da língua de camundongos. ............................................................................................. 31 Figura 12. Microscopia de luz do músculo estriado esquelético da língua de camundongos .............................................................................................. 32 Figura 13. Microscopia de luz das papilas folhadas e valadas da língua de camundongos. ............................................................................................. 33 Figura 14. Microscopia de luz das glândulas da língua de camundongos .............................................................................................. 35 Figura 15. Microscopia eletrônica de varredura das papilas do corpo da língua de camundongos. ............................................................................................. 37 Figura 16. Microscopia eletrônica de varredura das papilas da proeminência da língua de camundongos ......................................................................................... 38 Figura 17. Microscopia eletrônica de varredura das papilas folhadas da língua de camundongos. ............................................................................................. 39 Figura 18. Microscopia eletrônica de varredura das papilas valadas de camundongos. ............................................................................................. 40 Figura 19. Microscopia eletrônica de transmissão da mucosa de camundongos .............................................................................................. 41 Figura 20. Microscopia eletrônica de transmissão do tecido muscular da língua de camundongos .............................................................................................. 43 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CADI Centro Avançado de Diagnóstico por Imagem CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais. DMD Distrofia Muscular de Duchenne. FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia HE Hematoxilina e Eosina. IB Instituto de Biociências. MEV Microscopia Eletrônica de Varredura MET Microscopia Eletrônica de Transmissão mdx Muscular Dystrophy linked to X chromosome (Distrofia muscular ligada ao cromossomo X). NaOH Hidróxido de Sódio. PS Picro-sírius red. SP São Paulo. TCA Tecido Conjuntivo Associado. UNESP Universidade Estadual Paulista. Sumário 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 12 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 13 2.1 Distrofina Muscular de Duchenne ..................................................................... 13 2.2 Modelos Experimentais para DMD ................................................................... 14 2.3 Língua ................................................................................................................ 16 2.3.1 Papilas linguais ................................................................................... 20 3. OBJETIVO ............................................................................................................ 24 3.1 Objetivos específicos ......................................................................................... 24 4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 25 4.1 Animais .............................................................................................................. 25 4.2 Microscopia de Luz ........................................................................................... 25 4.3 Microscopia Eletrônica de Varredura ............................................................... 26 4.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão ............................................................ 26 5. RESULTADOS ...................................................................................................... 28 5.1 Análises Macroscópicas ..................................................................................... 28 5.2 Microscopia de Luz ........................................................................................... 29 5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura ................................................................ 36 5.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão ........................................................... 40 6. DISCUSSÃO .......................................................................................................... 44 7. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 48 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 49 ANEXO I ................................................................................................................ 55 12 1. INTRODUÇÃO A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) consiste em um distúrbio ligado ao cromossomo X, ou seja, é uma herança genética ligada ao sexo e por conta disso acomete majoritariamente indivíduos com genótipo XY (EMERY; MUNTONI; QUINLIVAN, 2015). Essa alteração ocorre no gene responsável por codificar a proteína denominada de distrofina, fundamental na membrana das células musculares, e sua ausência causa progressiva degeneração muscular (HOFFMAN et al., 1987). A alteração genética proporciona degeneração muscular, modificações no diâmetro e comprimento das fibras e necrose tecidual, além da deposição de tecido conjuntivo fibroso intersticial e tecido adiposo intramuscular que resultam em comprometimento motor (CROS et al., 1989; DECONINCK; DAN, 2007; ALLEN et al., 2016). O quadro clínico da DMD apresenta diferentes estágios e características, inicia-se durante a infância e manifesta-se pelo acometimento motor que ocasiona quedas, além da pseudo-hipertrofia do músculo gastrocnêmio (HOFFMAN et al., 1987). Na idade adulta, a DMD proporciona alterações no músculo diafragma que causa comprometimento cardiorrespiratório (EMERY; MUNTONI; QUINLIVAN, 2015). A DMD também afeta os músculos associados a mastigação, estes apresentam modificações que causam dificuldade com a deglutição alimentar que se agravam com o envelhecimento (PANE et al., 2006; ALOYSIUS et al., 2008; ENGEL-HOEK et al., 2016). A redução da força da musculatura da língua proporciona uma menor pressão da mesma contra o palato, e assim dificulta a ingestão de alimentos sólidos (ENGEL-HOEK et al., 2013). Para a compreensão da patologia, utiliza-se como modelo animal a linhagem isogênica de camundongo mdx (Muscular Dystrophy linked to X chromosome, distrofia muscular ligada ao cromossomo X) (BULFIELD et al., 1984; VAINZOF et al., 2008). Embora existam estudos em modelo animal que abordem a degeneração dos músculos envolvidos na mastigação como: masseter, temporal e língua aos 100 dias de idade (SPASSOV et al. 2010), as repercussões da distrofia na mucosa especializada da língua ainda não foram elucidadas. O objetivo do presente estudo consistiu em descrever as alterações morfológicas estruturais e ultraestruturais do epitélio, lâmina própria e tecido muscular da língua de camundongos mdx. 13 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Distrofia Muscular de Duchenne As distrofias musculares consistem em um grupo de doenças genéticas caracterizadas pela progressiva degeneração muscular e consequente perda da capacidade motora (EMERY; MUNTONI; QUINLIVAN, 2015). Descrições e ilustrações em registros demonstraram a presença das distrofias musculares ao longo da história da humanidade, entretanto, apenas em 1868 houve a caracterização do quadro clínico da DMD por Guillaume-Benjamin-Armand Duchenne, a mais comum das distrofias (MARANHÃO-FILHO; VINCENT, 2019). No século seguinte, a causa da distrofia foi elucidada: uma mutação no lócus Xp21 do cromossomo X que inibe a produção da distrofina (BULFIELD et al., 1984). A distrofina é uma proteína responsável por ligar o sarcolema ao citoesqueleto e em sua ausência ocorrem pequenos rompimentos no sarcolema (ALLEN et al., 2016). Em decorrência disso, ocasiona o aumento da concentração de íons de cálcio no meio intracelular, e dessa forma, causa a ativação da enzima proteolítica denominada de Calpaína e consequente digestão de proteínas contráteis do próprio músculo estriado esquelético (BULFIELD et al., 1984; HOFFMAN et al., 1987). A DMD é caracterizada por ciclos de degeneração-regeneração das fibras musculares (EMERY; MUNTONI; QUINLIVAN, 2015). Gradativamente ocorre a substituição do tecido muscular por tecido conjuntivo e deposição de tecido adiposo intramuscular que resulta em pseudo-hipertrofia e fraqueza muscular (SEIXAS et al., 1997; VAINZOF et al., 2008; GOMES et al., 2011). Em decorrência de sua herança ligada ao cromossomo X, a DMD acomete majoritariamente indivíduos do sexo masculino (BULFIELD et al., 1984). As manifestações clínicas ocorrem durante os três primeiros anos, período em que se inicia as fases da marcha e locomoção, e é caracterizada pelas frequentes quedas, fraqueza dos músculos dos membros inferiores e pélvicos, além do atraso no desenvolvimento psicomotor (ALLEN et al., 2016). Como consequência da fraqueza muscular apresentam marcha miopática, descrita por uma maior rotação da pelve em contraposição ao corpo, hiperlordose (Fig. 1) e realizam a “manobra de Gowers” (EMERY; MUNTONI; QUINLIVAN, 2015). 14 Figura 1. Posição característica da marcha miopática. Fonte: Adaptado de Moraes et al. (2011). Legenda: Principais alterações causadas pela DMD durante os estágios iniciais do processo de degeneração muscular. A degeneração muscular progressiva geralmente causa perda de funções motoras entre os 9 e 16 anos de idade (BULFIELD et al., 1984; EMERY; MUNTONI; QUINLIVAN, 2015). Posteriormente, dos 18 aos 25 anos, as complicações cardiorrespiratórias são frequentemente relatadas na literatura (BUSHBY et al., 2010). Nos estágios mais avançados da DMD, a degeneração muscular passa afetar com maior intensidade os músculos da região oral (PANE et al., 2006; ALOYSIUS et al., 2008; ENGEL- HOEK et al., 2016). Os efeitos na língua proporcionam menor pressão da mesma contra o palato e acarretam em dificuldades de comunicação e deglutição (ENGEL-HOEK et al., 2013). 2.2 Modelos experimentais para DMD Os modelos animais são fundamentais para a compreensão de patologias, bem como, para a testagem de eficiência e toxicidade de terapias em desenvolvimento (SANTOS, 2002; VAINZOF et al., 2008). Para a DMD existem modelos experimentais adequados para diferentes práticas, como roedores, felinos e caninos (NAKAMURA; TAKEDA, 2010). 15 Dentre os roedores, destacam-se os camundongos mdx, estes têm origem na linhagem C57bl/10 ou C57bl/6, porém apresentam uma mutação espontânea no exon 23 em relação a linhagem original (Fig. 2) (VAINZOF et al., 2008). Essa alteração gera a ausência da distrofina no sarcolema muscular e proporciona início do ciclo de degeneração-regeneração da musculatura após o 1º mês de idade e que persiste por toda a vida do animal (NAKAMURA; TAKEDA, 2010). Os músculos possuem duas proteínas do sarcolema muscular que proporcionam a integridade das fibras, sendo a distrofina encontrada preferencialmente na região do ventre muscular, enquanto a utrofina é caracterizada pela presença nas regiões de junção miotendínea e neuromuscular. Devido à ausência da distrofina, a utrofina passa a apresentar maior expressão e ser encontrada na região do ventre muscular (BLAKE; TINSLEY: DAVIES, 1996). Figura 2. Camundongo mdx. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Camundongo da linhagem C57bl/10mdx em caixa de polipropileno na sala do Biotério do Laboratório de Anatomia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – Campus de Rio Claro/São Paulo. A idade consiste em um fator importante que influencia no grau das alterações promovidas pela ausência da proteína distrofina, até os 13 meses de idade, os camundongos mdx possuem um ciclo de degeneração-regeneração muscular equilibrado (BULFIELD et al., 1984; VAINZOF et al., 2008). Entretanto, após esse período a capacidade regenerativa apresenta declínio enquanto a de degeneração se mantém, inclusive proporcionando diminuição da expectativa de vida quando comparada a linhagem de origem (PASTORET; SEBILLE, 1995). Os ciclos de degeneração-regeneração muscular são caracterizados por afetarem de forma não uniformes os músculos, sendo assim, alguns músculos tendem a apresentar uma 16 alteração mais tardia (PASTORET; SEBILLE, 1995). Os músculos associados à mastigação possuem diferentes graus de comprometimento em camundongos mdx. Aos 100 dias de idade, o masseter e o temporal apresentam alterações com a deposição de colágeno, enquanto que a musculatura da língua permanece inalterada (SPASSOV et al., 2010). Em idades mais avançadas, aos 26 meses, a língua é caracterizada pela presença de focos de fibrose muscular (CHAMBERLAIN et al., 2007), todavia não foram descritos possíveis reflexos na mucosa lingual. 2.3 Língua Localizado na cavidade oral, a língua consiste em um órgão muscular complexo revestido por mucosa especializada com projeções denominadas de papilas, anatomicamente apresenta: ápice, corpo e raiz (HIATT; GARTNET, 2011). Suas principais funções consistem na: comunicação/vocalização, deglutição alimentar, somatossensação e nos roedores possui também a função de “grooming” (comportamento relacionado a limpeza) (IWASAKI, 2002; HIEMAE; PALMER, 2003; HAEBERLE; LUMPKIN, 2008; SANDERS; MU, 2013). Em humanos, a língua caracteriza-se pela presença de um sulco terminal. Anteriormente a este sulco está localizado o sulco mediano superficial e posteriormente, o forame cego (estrutura vestigial do desenvolvimento embrionário associada a formação do ducto tireoglosso) e tonsila lingual (agregado de nódulos linfóides) (Fig. 3) (COSTACURTA, 1979; ALVES; CÂNDIDO, 2009; MOORE; DALLEY; AGUR, 2018). 17 Figura 3. Ilustração da superfície da língua de humanos. Fonte: Netter (2018). Legenda: Ápice, corpo e raiz, a língua possui sulco mediano e papilas: filiformes, fungiformes, folhadas e circunvaladas. Nos animais não humanos existem variações no comprimento, formato, presença ou ausência de sulco mediano e da proeminência, além das distintas morfologias das papilas linguais (KUMAR; BATE, 2004; CIENA et al., 2013; CIENA et al., 2019; ARO et al., 2019). Essas características estão estritamente relacionadas aos hábitos alimentares, habitats e desenvolvimento evolutivo das espécies (KOBAYASHI et al., 1994; IWASAKI, 2002). Em roedores, a língua apresenta um formato alongado e na subordem Hystricomorpha o sulco mediano está ausente (CIENA et al., 2013; CIENA et al., 2019). A proeminência lingual pode estar ausente como na capivara (Hydrochoerus hydrochaeris) (WATANABE et al., 2013), entretanto quando presente, possui variações e é caracterizada como diminuta no esquilo da Manchúria (Tamias sibiricus asiaticus) (KOBAYASHI et al., 1992) e da paca (Cuniculus paca) (BERALDO-MASSOLI et al., 2013), ou protuberante como na lebre-patagônica (Dolichotis patagonum) (EMURA; OKUMURA; CHEN, 2011b) e degu (Octodon degus) (CIZEK et al., 2017). De acordo com Shindo, Yoshimura e Kobayashi (2006), a proeminência consiste em 18 uma estrutura relacionada com a herbivoria e também é visualizada com destaque em ruminantes (ADNYANE et al., 2011; EL-BAKARY; ABUMANDOUR, 2017). A superfície dorsal da língua é revestida pelo epitélio estratificado pavimentoso queratinizado composto pelas camadas: córnea, granular, espinhosa e basal (CIENA et al., 2013). Superficialmente, a camada córnea é formada por células cornificadas, ou seja, citoplasma repleto de queratina que se caracteriza pela constante esfoliação e substituição de células (WATANABE et al., 2013). Subsequentemente, encontra-se a camada granular composta por queratinócitos achatados e citoplasma com grânulos de querato-hialina (CIENA et al., 2019). A camada espinhosa é composta de células planas com projeções semelhantes a espinhos e unidas por meio de desmossomos (CIENA et al., 2013). E a mais profunda, a camada basal é composta por células de morfologia cilíndrica, e esta região é fundamental para a renovação das células das camadas superiores, por apresentar células em constante processo mitótico (WATANABE et al., 2013). Inferiormente às camadas epiteliais está localizada a lâmina própria, que por sua vez, consiste em uma região predominantemente composta por fibroblastos e tecido conjuntivo denso (REGINATO et al., 2020). Estão presentes também mecanorreceptores que funcionalmente possibilitam a somatossensação oral e dentre essas estruturas destacam-se os corpúsculos lamelares (TEÓFILO et al. 2019). Estes consistem em mecanorreceptores de adaptação rápida que detectam pressão e vibrações de formato esférico e compostos de um axônio mielinizado central e lamelas concêntricas de células de Schwann (MUNGER; IDE, 1988; HAEBERLE; LUMPKIN, 2008). A lâmina própria apresenta projeções no epitélio que configuram estabilidade à região (MARTINEZ et al., 1997; TOMIATE et al., 2021a, 2021b) e proporcionam maior proximidade de vasos sanguíneos a camadas epiteliais mais superficiais (BERALDO-MASSOLI et al., 2013; ERDOGAN; SAGSÖZ, 2018). As projeções possuem aspecto tridimensional denominado de tecido conjuntivo associado (TCA) que é caracterizado sob análise de microscopia eletrônica de varredura combinada a tratamento em solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH) para a remoção da superfície epitelial (NAKANO, 1992; 1995). Em região mais profunda está presente a musculatura estriada esquelética que compõe a língua, esta possui fibras musculares multinucleadas, longas e cilíndricas, distribuídas em múltiplos eixos, e dessa forma possibilitam grande amplitude de movimentos (CIENA et al., 2013; CIENA et al., 2019; ARO et al., 2019). Dois diferentes grupos de músculos compõem a língua: extrínsecos e intrínsecos (COSTACURTA, 1979). Os músculos, a vascularização e a 19 inervação da língua são separados por um septo fibroso mediano (MOORE; DALLEY; AGUR, 2018). Os músculos extrínsecos são: genioglosso, hioglosso, estiloglosso, palatoglosso, estes apresentam como principal ação a movimentação da língua, entretanto também podem alterar seu formato (BECKER et al., 2018). Enquanto os músculos intrínsecos da língua são: longitudinal superior, longitudinal inferior, transverso e vertical (Fig. 4) (DRAKE; VOGL; MITCHELL, 2021). A função dos dois primeiros consiste em retrair a língua protrusa e tornar a língua mais curta e espessa, enquanto os dois últimos músculos possuem as ações de tornar a língua longa e estreita, assim como protrair a língua (HIATT; GARTNET, 2011). Figura 4. Músculos extrínsecos e intrínsecos da língua. Fonte: Drake, Vogl e Mitchell (2021). Legenda: Indicação dos músculos extrínsecos: palatoglosso, estiloglosso, hioglosso e genioglosso; e intrínsecos: longitudinal superior e inferior, vertical e transverso. O septo lingual separa os músculos intrínsecos e extrínsecos. A inervação dos músculos da língua é realizada pelo nervo hipoglosso (Nervo Craniano XII), a exceção consiste no músculo palatoglosso que é inervado pelo plexo faríngeo. A mucosa lingual é suprida pelo nervo lingual (ramo do V par de Nervo Craniano) para as funções de tato e temperatura, enquanto que para o paladar, a inervação é feita pelo nervo da corda do tímpano (ramo do VII par de Nervo Craniano), entretanto, as papilas circunvaladas são supridas pelo ramo lingual do nervo glossofaríngeo (IX par de Nervo craniano) (MOORE; DALLEY; AGUR, 2018). Em relação à vascularização, a artéria carótida externa origina a artéria lingual, esta se localiza profundamente no músculo hioglosso e ascende na parte posterior da língua para suprir 20 o arco palatoglosso (DRAKE; VOGL; MITCHELL, 2021). A artéria dorsal da língua irriga o dorso e as bordas da língua (HIATT; GARTNET, 2011). A artéria profunda da língua (ramo terminal da artéria lingual) se projeta profundamente na face ventral da língua e acompanha o nervo lingual, até o ápice lingual (onde se anastomosa com a do lado oposto). A artéria sublingual emerge na margem do músculo hioglosso e segue entre o genioglosso e milo-hióideo até suprir as glândulas sublinguais (ALVES; CANDIDO, 2009). A veia lingual recebe as veias tributárias: sublingual, dorsal da língua e profunda da língua, estas veias seguem o mesmo trajeto das artérias correspondentes (COSTACURTA, 1979). Na região da raiz da língua, a submucosa caracteriza-se pela presença de glândulas salivares dos tipos: mucosa e serosa (COSTACURTA, 1979). Envoltas por músculos, as glândulas secretam muco fluido espesso e viscoso de composição glicoproteica e apresentam fundamental importância associadas com as papilas folhadas e valadas para a percepção gustativa (CIZEK et al., 2017). 2.3.1 Papilas linguais A mucosa especializada da superfície dorsolateral da língua caracteriza-se fundamentalmente pela presença de quatro tipos de papilas: filiforme, folhada, fungiforme, e circunvalada para humanos e valada para animais não humanos (KOBAYASHI et al., 1989; KOBAYASHI et al., 1994). As papilas filiformes apresentam alta densidade e estão presentes por toda a extensão da superfície dorsal da língua, com formato triangular e alongado, sem associação a botões gustativos, com funcionalidade mecânica e direcionadas à região caudal (KOBAYASHI et al., 1994). As papilas filiformes caracterizam-se por ampla variação morfológica entre as espécies de roedores e mesmo em diferentes regiões da língua (Fig. 5) (CIENA et al., 2013; CIENA et al., 2019; IGBOKWE; MBAJIORGU, 2019). 21 Figura 5. Microscopia de luz das papilas filiformes na língua da cutia (Dasyprocta leporina). Fonte: Adaptado de Ciena et al. (2013). Legenda: Epitélio (E), papilas filiformes (setas pretas) e inferiormente lâmina própria (*) com vasos sanguíneos (cabeça de seta). Coloração: Hematoxilina-eosina (HE). Barra: 100 μm. O tecido conjuntivo associado (TCA), ou seja, o aspecto tridimensional da lâmina própria da papila filiforme possui ampla variação morfológica e está diretamente associada às características das papilas linguais (ZHENG; KOBAYASHI, 2006). Em algumas espécies de roedores, são caracterizadas pelo aspecto cônico como no rato Sprague Dawley (REGINATO et al., 2014) ou mesmo para camundongos que possuem variações, um tipo com morfologia cônica (KOBAYASHI et al., 1989) e outro semelhante à “pá” (“shovel-like”) (KOBAYASHI; IWASAKI, 1989). A papila fungiforme assemelha-se ao píleo do corpo de frutificação de um fungo, ou seja, com base estreita e ápice largo, e botões gustativos geralmente são encontrados na região superior da papila (Fig. 6) (KOBAYASHI et al., 1989; CIENA et al., 2013), todavia estes podem estar ausentes (KOBAYASHI et al., 1994; KUMAR; BATE, 2004). O TCA de papilas fungiformes assemelha-se a um “botão de flor” (“flower-bud”) (EMURA; OKUMURA; CHEN, 2011b), “vulcão” (“volcano-like”) (REGINATO et al. 2014), ou apresenta formato cilíndrico e semelhante à “craca” (“barnacle-like”) (KOBAYASHI et al., 1989). 22 Figura 6. Microscopia de luz da papila fungiforme da cutia. Fonte: Adaptado de Ciena et al. (2013). Legenda: Epitélio (E), papila fungiforme (seta), inferiormente a lâmina própria (*) com vaso sanguíneo na região (cabeça de seta). Coloração: HE. Barra: 100 μm. As papilas folhadas (Fig. 7) possuem formato semelhante à folha e consistem em rugas paralelas intercaladas por sulcos e associadas a botões gustativos (EMURA et al., 2002). Localizadas bilateralmente na língua são desenvolvidas em roedores (EMURA; OKUMURA; CHEN et al., 2011b), apesar de não necessariamente estarem presentes em todas as espécies, a exemplo do rato-africano-da-grama (Arvicanthis niloticus) (NASR et al., 2012) e o rato- toupeira-cego do Oriente Médio (Spalax ehrenbergi) (KILINC et al., 2010). Após a remoção da superfície epitelial, o TCA caracteriza-se por projeções de aspecto laminar circundando sulcos ovais largos (REGINATO et al., 2014). Figura 7. Microscopia de luz da papila folhada da cutia. Fonte: Adaptado de Ciena et al. (2013). Legenda: Epitélio (E), papila folhada (seta) e botões gustativos associados (cabeça de seta), inferiormente a lâmina própria (*) e glândulas associadas (G). Coloração: HE. Barra: 100 μm. As papilas valadas (Fig. 8) estão localizadas na região caudal da língua e apresentam dois principais aspectos morfológicos: semelhante a um domo circundado por um sulco (KOBAYASHI et al., 1989) ou composta por sulcos paralelos (CIENA et al., 2013), também 23 ocorrem variações na quantidade (CIENA et al., 2013; REGINATO et al., 2014; CIENA et al., 2019; IGBOKWE; MBAJIORGU, 2019). O TCA da papila valada caracteriza-se por variações morfológicas em diferentes espécies, dessa maneira, pode apresentar aspecto liso como na girafa (EMURA; OKUMURA; CHEN, 2013) ou espinhos curtos no ápice (EMURA; OKUMURA; CHEN, 2011a; EMURA; OKUMURA; CHEN, 2011c). Figura 8. Microscopia de luz da papila valada da cutia. Fonte: Adaptado de Ciena et al. (2013). Legenda: Epitélio (E), papila valada (seta) e botões gustativos associados (cabeça de seta), inferiormente glândulas (G) adjacentes. Coloração: HE. Barra: 200 μm. 24 3. OBJETIVO O objetivo do presente estudo consistiu em descrever as repercussões do processo degenerativo nas características morfológicas estruturais e ultraestruturais do epitélio, lâmina própria e tecido muscular da língua de camundongos mdx. 3.1 Objetivos específicos • Descrever os aspectos estruturais do epitélio, lâmina própria e músculos da língua sob microscopia de luz; • Realizar análises morfométricas da espessura epitelial e área glandular; • Revelar o aspecto tridimensional do epitélio lingual através da técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV); • Evidenciar o TCA das papilas linguais por meio da MEV mediante a técnica de maceração epitelial; • Descrever as características ultraestruturais do epitélio e lâmina própria da língua através da microscopia eletrônica de transmissão (MET); • Caracterizar as alterações ultraestruturais das células musculares através da MET. 25 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Animais Foram utilizados 40 camundongos com 6 meses de idade de duas linhagens: Grupo controle - C57bl/10 (n=20) e Grupo mdx - C57bl/10mdx (n=20). Oriundos do Centro de Criação e Experimentação em Biomodelos da Universidade Federal do ABC e foram alocados no Biotério do Laboratório de Anatomia, Instituto de Biociências (IB), Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Campus de Rio Claro – São Paulo (SP). As atividades foram aprovadas pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) do IB, UNESP – Rio Claro (protocolo nº 2381/2021). Os animais foram eutanasiados com overdose de Ketamina (50 mg/kg) e Xilazina (10 mg/kg) via intraperitoneal pela responsável técnica (CRMV-SP Nº26257). Posteriormente as línguas foram dissecadas por incisão ventral e removidas. 4.2 Microscopia de Luz As amostras (n = 5 por grupo) foram fixadas por imersão em solução de formalina 10% à 4ºC, durante 48h e após este período substituída por álcool 70%. Posteriormente, as amostras foram submetidas à desidratação em séries crescentes de álcoois (de 70% ao absoluto) e incluídas em parafina histológica. Foram realizadas secções sagitais e transversais de 6 µm de espessura e coradas com as técnicas de Hematoxilina-Eosina (HE) e Picro-sírius red (PS). As amostras em coloração de PS foram analisadas sob luz polarizada, e todas as imagens foram obtidas através do microscópio de luz (Axioskop 40, Carl Zeiss Microimaging, Göttingen, Alemanha) no IB da UNESP, Rio Claro, SP, Brasil. A análise morfométrica foi realizada para a mensuração da espessura epitelial em duas regiões. Na região medial do corpo da língua foram realizadas 5 mensurações por secção em região medial da língua totalizando um n = 125 por grupo. Na região da proeminência lingual foram realizadas 5 mensurações em região medial da língua totalizando um n = 125 por grupo. Foi empregado o teste de D’Agostino e Pearson para verificar a normalidade. As amostras apresentaram distribuição não-normal e por isso foi aplicado o teste de Mann-Whitney, foi adotado como nível de significância p< 0,05. Para a análise da área das glândulas serosas e mucosas foram realizadas medidas independentemente (n=25 por grupo). Foi utilizado o teste de Shapiro-Wilk para verificação da normalidade amostral e as amostras foram consideradas não-normais. Posteriormente, foi aplicado o teste de Mann-Whitney, e foi adotado como nível de significância p< 0,05. 26 Todas as mensurações foram realizadas com o auxílio do Software ImageJ™ (Bethesda, Maryland, EUA) e as análises estatísticas com o auxílio do Software GraphPad Prism 9.3.0. 4.3 Microscopia Eletrônica de Varredura Após a dissecação, as amostras (n = 10 por grupo) foram perfundidos em solução de Karnovsky modificada (glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 2%, em solução de Cacodilato de sódio a 0,1M), pH 7,4, durante 24h, a 4ºC (WATANABE et al., 2013). As amostras (n = 5 por grupo) foram destinadas a análise do aspecto tridimensional da superfície dorsolateral do epitélio da língua. As demais amostras (n = 5 por grupo) foram destinadas ao processo de maceração por imersão em solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH) a 10% em temperatura ambiente, durante 4 dias, com trocas diárias para observação dos elementos da matriz extracelular em “situ” (CIENA et al., 2019). Posteriormente, todas as amostras foram lavadas entre 12 a 24h em água destilada. As amostras foram alocadas em frascos individuais com água destilada para tratamento no ultrassom para eliminação de possível resíduo tecidual ou externo que permaneça em contato com a superfície de análise. Após as lavagens, todas as amostras foram desidratadas em séries crescentes de álcoois (de 70% ao absoluto), imersas em solução de acetato de isoamila por 3h, a 4 ºC e secadas no aparelho de ponto-crítico (Balzers CPD-30) utilizando CO2 líquido (BARBOSA et al., 2020). As amostras secas foram montadas em bases metálicas de alumínio (1 cm2), cobertas com íons de ouro em aparelho Balzers SCD-040, e examinadas em microscópio eletrônico de varredura (LEO 435 VP, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) no Centro Avançado em Diagnóstico por Imagem (CADI), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil. 4.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão Para análise ultraestrutural do epitélio, lâmina própria e musculatura (n = 5 por grupo), após a dissecação, as línguas foram fixadas por imersão em solução Karnovsky modificada (glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 2%, em solução de Cacodilato de sódio a 0,1M) pH 7,4, durante 48h, a 4ºC (WATANABE et al., 2013). Em seguida, as línguas foram seccionadas em amostras menores (2 mm3), lavadas com a solução de tampão fosfato de sódio e pós-fixadas com a solução de tetróxido de ósmio à 1% durante 2h a 4ºC. Novamente, as amostras foram lavadas em água destilada e contrastadas em “bloco” com a solução aquosa de acetato de uranila à 5% durante 1h a temperatura ambiente. Posteriormente, as amostras foram submetidas à desidratação em série crescente de álcoois, a 27 partir do 70% até o álcool absoluto com banhos de 15 minutos cada, e 2 banhos de óxido de propileno por 15 minutos para a infiltração da resina (Spurr® 1:1 óxido de propileno por 4h) em misturador rotativo. Após esta etapa, a resina foi retirada e colocada resina pura durante 6h. Na etapa final, a resina pura foi substituída por uma nova resina, colocada na estufa a 37º C com o frasco aberto por 1h, sendo realizada a inclusão do material em moldes de borracha e polimerização na estufa a 60ºC, durante 5 dias. Obtidos os blocos de resina, foi realizada a triagem para a obtenção das secções de 0,5 μm a 1 μm, corados com a solução de azul de toluidina a 1% para a verificação da área em microscópio de luz. Posteriormente, foram obtidas as secções de 90 nm, coletados em telas de cobre de 200-mesh (EMSTM), contrastados com a solução de acetato de uranila a 4%, por 3 minutos e com a solução aquosa de citrato de chumbo a 0,4% por 3 minutos, lavando em seguida com água destilada (CIENA et al. 2019). As telas com os respectivos cortes foram examinadas através do microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1010 (JEOL Ltda., Tóquio, Japão), Instituto de Ciências Biomédicas - III, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil. 28 5. RESULTADOS 5.1 Análises Macroscópicas A língua dos camundongos possui um aspecto alongado e anatomicamente dividida em: ápice, corpo e raiz. Um sulco está presente medialmente na região rostral do corpo da língua e a proeminência lingual está localizada na região caudal do corpo da língua. Foram encontradas papilas filiformes e fungiformes no ápice e no corpo da língua, papilas filiformes na proeminência lingual, bilateralmente papilas folhadas e medialmente na raiz uma papila valada (Fig. 9). Figura 9. Ilustração da língua de camundongos. Fonte: Garcia, 2022. Legenda: Anatomia geral da língua de camundongos. Foram identificadas papilas dos tipos: filiforme, fungiforme, folhada e valada. Ápice (A), corpo (C) com sulco mediano (S) e proeminência (P), e raiz (R). Barra: 0,5 cm. 29 5.2 Microscopia de Luz Na superfície epitelial dorsal da língua de ambos os grupos foram encontradas papilas: filiformes, fungiformes, folhadas e valada. Abaixo do epitélio foi localizada a lâmina própria e na região caudal da língua, na submucosa foi evidenciado conglomerados de glândulas serosas e mucosas. Profundamente, foi evidenciada a musculatura da língua. As regiões do corpo da língua caracterizam-se pela presença de diferentes papilas: rostral e medial com papilas filiformes e fungiformes; e caudal com papilas filiformes. Existem variações na espessura epitelial por toda a extensão da língua, a lâmina própria é delgada e projeta-se no epitélio. No grupo controle, as regiões rostral e medial do corpo da língua apresentaram papilas filiformes curtas e com a ponta direcionada para a região caudal; também estavam presentes papilas fungiformes com morfologia de cúpula e botão gustativo localizado no topo. Inferiormente foi localizada a lâmina própria com projeções no epitélio nas regiões papilares com aspectos diferentes nas papilas filiformes e fungiformes, e subjacentes fibras musculares. O epitélio é queratinizado e apresentou espessura de 89,25 ± 18,50 μm no grupo controle (Fig. 10.a). No grupo mdx, a mesma região foi caracterizada de forma essencialmente semelhante, entretanto o epitélio apresentou maior espessura, 97,61 ± 21,62 μm (Fig. 10.b). O epitélio das regiões rostral e medial apresentou, entre os grupos, diferença estatisticamente significante (p < 0.05) na espessura. A região da proeminência lingual foi caracterizada, em ambos os grupos, pela presença de papilas filiformes, direcionadas para a região caudal e pela ausência de papilas fungiformes. Subjacente ao epitélio, a lâmina própria apresentou aspecto delgado e com projeções no epitélio abaixo das papilas filiformes, inferiormente estavam presentes fibras musculares. O epitélio é queratinizado, a lamina própria delgada e também estão presentes projeções da mesma no epitélio. No grupo controle, a espessura epitelial apresentou 80,13 ± 18,15 μm (Fig. 10.c). Enquanto o grupo mdx, possui 99,41 ± 27,83 μm (Fig. 10.d). A diferença da espessura do epitélio da proeminência entre os grupos apresentou significância estatística (p < 0.05). 30 Figura 10. Microscopia de luz das papilas do corpo da língua de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Região medial do corpo da língua. Grupo controle, corte sagital: (a) Epitélio (e) com papila filiforme (seta preta) adjacente a papila fungiforme com botão gustativo no topo (*), inferiormente lâmina própria (lp) e fibras musculares (m). Grupo mdx, corte sagital: (b) Epitélio (e), papila fungiforme com botão gustativo no topo (*) adjacente à papila filiforme (seta preta), subjacente a lâmina própria (lp) e fibras musculares (m). Região da proeminência lingual. Grupo controle, corte transversal: (c) Papilas filiformes (seta branca) no epitélio (e) e inferiormente lâmina própria (lp) e fibras musculares (m). Grupo mdx, corte transversal: (d) Epitélio (e) com papilas filiformes (seta branca), subjacente lâmina própria (lp) e fibras musculares (m). Coloração: HE. Barras: 100 μm. Localizada inferiormente ao epitélio, a lâmina própria apresenta composição de fibras colágenas. Analisada com a coloração de PS, a região no grupo controle apresentou destaque com a coloração avermelhada (Fig. 11.a). Enquanto no grupo mdx, houve maior intensidade na coloração avermelhada e também a presença de fibras de colágeno dispersas no tecido muscular localizado subjacente (Fig. 11.b). Sob a luz polarizada, no grupo controle foi revelada coloração essencialmente esverdeada com focos avermelhados de fibras de colágeno (Fig. 11.c). O grupo mdx caracterizou-se pelo aspecto majoritariamente avermelhado das fibras de colágeno dispersas entre fibras de coloração esverdeada, abaixo, na região do tecido muscular houve deposição de fibras de colágeno avermelhadas adjacentes às fibras musculares (Fig. 11.d). 31 Figura 11. Microscopia de luz da lâmina própria da língua de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Grupo controle, corte longitudinal: (a) Lâmina própria evidenciada essencialmente pela composição de colágeno (* pretos). Grupo mdx, corte longitudinal: (b) Lâmina própria composta por fibras de colágeno em intensa coloração vermelha (* pretos). Grupo controle, corte longitudinal sob luz polarizada: (c) Fibras de colágeno esverdeado e pontos avermelhados (* brancos). Grupo mdx, corte longitudinal sob luz polarizada: (d) lâmina própria com fibras colágenas de coloração essencialmente vermelhas e esverdeadas (* brancos) e presença de fibras de colágeno entre as fibras musculares (setas brancas). Coloração: PS. Barras: 100 μm (a e c) e 500 μm (b e d). Inferiormente à lâmina propria, os músculos estriados esqueléticos da língua apresentaram fibras multinucleadas dispostas paralelas e longitudinalmente. No grupo controle com núcleos periféricos majoritariamente (Fig. 12.a). Enquanto no grupo mdx, as fibras musculares também apresentaram núcleos periféricos, entretanto houve a presença de núcleos centralizados nas fibras e conglomerados de núcleos caracterizando foco inflamatório, início do processo da formação de fibrose tecidual. (Fig. 12.b). 32 Figura 12. Microscopia de luz do músculo estriado esquelético da língua de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Grupo controle, corte longitudinal: (a) destaque fibras musculares (m) e com núcleos de localização periférica (seta preta). Grupo mdx, corte longitudinal: (b) fibra muscular (m) com núcleos centralizados (seta preta) e foco inflamatório (fi). Coloração: HE. Barras: 50 μm. Localizadas bilateralmente à proeminência e próximas à raiz da língua, as papilas folhadas consistem em dobras epiteliais delimitadas por sulcos profundos, os grupos controle (Fig. 13.a) e mdx (Fig. 13.b) eram morfologicamente semelhantes. Na raiz da língua, a papila valada apresentou uma projeção central delimitada por fendas, botões gustativos foram localizados nas paredes laterais e na projeção papilar, as características são semelhantes para ambos os grupos (Fig. 13.c e 13.d). Destaca-se a associação dessas papilas a ductos conectados a glândulas mucosas e serosas localizadas inferiormente à lâmina própria, na região da submucosa. 33 Figura 13. Microscopia de luz das papilas folhadas e valadas da língua de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Grupo controle, corte transversal: (a) Epitélio (e), lâmina própria (lp), papila folhada (seta) com botão gustativo lateralmente (*), e adjacentes a ducto salivar (d) associados à glândulas mucosas (gm), inferiormente fibras musculares (m). Grupo mdx, corte transversal: (b) Epitélio (e), lâmina própria, papila folhada (seta) com botões gustativos nas paredes laterais (*) associada a ducto (d) adjacente a glândulas mucosas (gm). Grupo controle, corte sagital: (c) Epitélio (e), lâmina própria (lp), papila valada com botões gustativos (*) e ducto (d), inferiormente fibras musculares (m). Grupo mdx, corte sagital: (d) Epitélio (e), lâmina própria (lp), papila valada com botões gustativos (*) associada a ducto (d) e inferiormente fibras musculares (m). Coloração: HE. Barras: 200 μm. Na submucosa apenas da região caudal estavam presentes grupamentos de glândulas mucosas e serosas associadas por meio de ductos às papilas folhadas e valadas. As glândulas serosas estavam dispostas anteriormente e as mucosas posteriormente. No grupo controle, a área das glândulas serosas apresentou 35 ± 4 μm² e das mucosas 39 ± 7 μm² (Fig. 14.a). No grupo mdx, a disposição glandular foi semelhante (Fig. 14.b) e a área das glândulas serosas foi de 29 ± 11 μm² e das mucosas foi de 46 ± 12 μm². O grupo controle apresentou menor área das glândulas serosas e maior área de glândulas mucosas, houve diferença estatística entre os grupos para ambas as análises (p < 0.05). Com a coloração de PS foi evidenciada a presença de colágeno envolvendo as glândulas. No grupo controle, a deposição de colágeno revelou-se sutil e diretamente relacionada com as 34 glândulas (Fig. 14.c). No grupo mdx, a deposição de colágeno ao redor das glândulas também esteve presente associado às fibras musculares adjacentes (Fig. 14.d). Sob luz polarizada, as fibras de colágeno apresentaram coloração amarelada no grupo controle e restrita envolvendo as glândulas (Fig. 14.e), diferentemente do grupo mdx, que por sua vez, foi evidenciada grande deposição de fibras de colágeno de coloração esverdeada adjacentes às fibras musculares associadas aos grupamentos glandulares (Fig. 14.f). 35 Figura 14. Microscopia de luz das glândulas da língua de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Grupo controle, corte transversal: (a) glândulas serosas (s) e mucosas (m). Grupo mdx, corte transversal: (b) glândulas serosas (s) e mucosas (m). Grupo controle, corte sagital: (c) Glândula serosa (s) envolta por fibras de colágeno (* preto). Grupo mdx, corte transversal: (d) Glândulas mucosas (m) entre as fibras de colágeno (* preto). Grupo controle, corte sagital sob luz polarizada: (e) Glândula serosa (s) envolta por fibras de colágeno de coloração avermelhada (* branco). Grupo mdx, corte transversal sob luz polarizada: (f) Fibras de colágeno amarelado (* branco) adjacente às glândulas mucosas (m). Coloração: HE (a, b), PS (c, d, e, f). Barras: 50 μm (c, e) e 500 μm (a, b, d, f). 36 5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura Os aspectos tridimensionais das papilas filiformes, fungiformes, folhadas e valada e seus respectivos TCAs foram revelados. Nas regiões rostral e medial do corpo da língua, o grupo controle apresentou papilas filiformes de formato cônico com ponta única e adjacentes papilas fungiformes de morfologia semelhante a um “cogumelo” (Fig. 15.a). O grupo mdx foi caracterizado por papilas filiformes e fungiformes semelhantes (Fig. 15.b). A técnica de maceração epitelial revelou o TCA das papilas filiformes e fungiformes. Nas regiões rostral e medial do corpo da língua do grupo controle, as papilas filiformes apresentaram TCAs cônicos com ponta única, e as papilas fungiformes eram caracterizadas por uma protrusão cilíndrica com cavidade papilar do botão gustativo, também descrita como uma morfologia semelhante a “craca” no grupo controle (Fig. 15.c) e mdx (Fig. 15.d). 37 Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Aspecto tridimensional da região medial do corpo da língua. Grupo controle: (a) Papilas filiformes cônicas (setas pretas) e papila fungiforme (*). Grupo mdx: (b) Papilas filiformes cônicas (setas pretas) e papila fungiforme (*). Aspecto tridimensional do TCA da região medial do corpo da língua. Grupo controle: (c) TCA da papila filiforme cônica (setas brancas) e TCA da papila fungiforme (* branco). Grupo mdx: (d) TCA da papila fungiforme (* branco) e TCA de papilas filiformes cônicas (setas brancas). Barras: 30 μm. Na região da proeminência lingual do corpo da língua, o grupo controle revelou papilas filiformes caracterizadas por formato triangular e de ponta única, enquanto que as papilas fungiformes estavam ausentes nessa região (Fig. 16.a). No grupo mdx, as papilas filiformes de morfologia triangular apresentaram pontas fimbriadas caracterizando desgaste papilar (Fig. 16.b). Após a maceração epitelial foi revelado o TCA das papilas da proeminência lingual. No grupo controle, o TCA foi caracterizado pelo aspecto semelhante à “pá” e de ponta única (Fig. 16.c). Enquanto no grupo mdx, a morfologia foi semelhante, entretanto, a presença de pontas duplas e triplas foi frequente (Fig. 16.d). Figura 15. Microscopia eletrônica de varredura das papilas do corpo língua de camundongos. 38 Figura 16. Microscopia eletrônica de varredura das papilas da proeminência da língua de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Aspecto tridimensional da região da proeminência lingual. Grupo controle: (a) Papila filiforme triangular (cabeças de seta). Grupo mdx: (b) Papila filiforme triangular com pontas fimbriadas (cabeças de seta). Aspecto tridimensional do TCA da região da proeminência lingual. Grupo controle: (c) TCA da papila filiforme triangular com aspecto cônico (cabeças de seta brancas). Grupo mdx: (d) TCA da papila filiforme triangular com aspecto cônico de ponta dupla (cabeças de seta brancas). Barras: 30 μm (c, d) e 100 μm (a, b). Na face lateral da proeminência lingual foram localizadas papilas folhadas. Estas são caracterizadas pelas dobras epiteliais delimitadas por sulcos paralelos e foram encontradas no grupo controle (Fig. 17.a) e mdx (Fig. 17.b) morfologicamente semelhantes. Sob a técnica de maceração da superfície epitelial, o TCA caracterizou-se por óstios com formatos irregulares delimitados por projeções laminares, no grupo controle (Fig. 17.c) e mdx (Fig. 17.d) os aspectos revelados foram semelhantes. 39 Figura 17. Microscopia eletrônica de varredura das papilas folhadas da língua de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Aspecto tridimensional da margem da proeminência lingual. Grupo controle: (a) Papila folhada, delimitada por sulcos (seta preta). Grupo mdx: (b) Sulco da papila folhada (seta preta). Após remoção da superfície epitelial, revelou-se o TCA. Grupo controle: (c) Óstios dos TCAs das papilas folhadas (setas brancas). Grupo mdx: (d) Óstios dos ductos do TCAs das papilas folhadas (setas brancas). Barras: 30 μm (d) 100 μm (a, b, c). Localizada medialmente na região caudal da língua, notou-se uma papila valada de morfologia semelhante a um domo rodeada por um fosso estreito a circundando, nos grupos controle (Fig. 18.a) e mdx (Fig. 18.b) as características foram semelhantes. E após a maceração do epitélio, o TCA da papila valada foi caracterizado por estar circundado por sulcos elípticos e por uma projeção central com múltiplas impressões de papilas gustativas com um aspecto “alveolar”. O grupo controle apresentou maior desgaste da projeção central por conta da técnica da maceração (Fig. 18.c) enquanto que no grupo mdx, a morfologia da projeção foi melhor evidenciada (Fig. 18.d). 40 Figura 18. Microscopia eletrônica de varredura das papilas valadas de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Aspecto tridimensional da região caudal da língua. Grupo controle: (a) Papila valada (* preto). Grupo mdx: (b) Papila valada (* preto). TCA revelado após remoção da superfície epitelial. Grupo controle: (c) Sulco elíptico (cabeça de seta branca) adjacente ao TCA da papila valada (* branco). Grupo mdx: (d) TCA da papila valada (* branco) envolto por sulco elíptico (cabeça de seta branca). Barras: 30 μm (b, d), 100 μm (a, c). 5.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão A língua dos camundongos de ambos os grupos foi caracterizada pela presença de epitélio escamosos estratificado, lâmina própria e músculo estriado esquelético. No grupo controle, a camada córnea (queratinizada) foi diferenciada por apresentar células epiteliais sobrepostas, anucleadas e com padrão serrilhado difuso nas interfaces intercelulares. Inferiormente, a camada granulosa apresentou células achatadas com grânulos no citoplasma, inúmeros tonofilamentos e adesão celular através dos desmossomos (Fig. 19.a). No grupo mdx foi observada estratificação semelhante, camada córnea com justaposição de queratinócitos e inferiormente a camada granulosa com numerosos granulosos no citoplasma das células (Fig. 19.b). Na camada espinhosa, do grupo controle, foi observada a presença de células planas e na camada basal, células com projeções citoplasmáticas e núcleos ovais 41 volumosos (Fig. 19.c). Enquanto no grupo mdx, a camada espinhosa também apresentou células planas e a camada basal revelou organização em células colunares paralelas com núcleos elípticos (Fig. 19.d). Figura 19. Microscopia eletrônica de transmissão da mucosa de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Grupo controle: (a) Camada queratinizada (q) com padrão serrilhado entre células (seta branca), abaixo camada granulosa (g), queratinócitos com grânulos no citoplasma (* branco). Grupo mdx: (b) (a) Camada queratinizada (q) com padrão serrilhado entre células (seta branca), camada granulosa (g) com querato-hialina no citoplasma (* branco) dos queratinócitos. Grupo controle: (c) Camada espinhosa (e) e núcleo (n) de célula da camada basal, abaixo lâmina própria (lp). Grupo mdx: (d) Camada espinhosa (e), inferiormente a camada basal, núcleo de célula da camada basal (n). Barras: 2 μm (a, b, d) e 5 μm (c). 42 Na região de interface entre a camada basal e lâmina própria observou-se uma área de tecido conjuntivo com inúmeros fibroblastos. Na transição da lâmina própria e da musculatura do grupo controle foram encontradas fibras nervosas não mielinizadas adjacentes a fibras musculares, disposição dos sarcômeros em séries e grupamentos mitocondriais subsarcolemais (Fig. 20.a). No grupo mdx, observou-se uma ampla área com depósito de tecido conjuntivo e miocitólise da fibra muscular (Fig. 20.b). Foram evidenciados invaginações sarcoplasmáticas (feixes de colágeno) (Fig. 20.c). Na lâmina própria e na interface do tecido conjuntivo com as células musculares foram observados extenso comprometimento com alterações na relação na região de junção, com redução das invaginações sarcoplasmáticas (Fig. 20.d). 43 Figura 20. Microscopia eletrônica de transmissão do tecido muscular da língua de camundongos. Fonte: Tomiate, 2022. Legenda: Grupo controle: (a) Fibra muscular (m) e grupamentos mitocondriais subsarcolemais (* preto) adjacentes a fibras nervosas amielínicas (cabeça de seta branca) e núcleo de célula de Schwann (n). Grupo mdx: (b) Miocitólise (* preto) de fibras musculares (m), fibroblastos (n) adjacentes. Grupo controle: (c) Invaginações sarcoplasmáticas (setas pretas). Grupo mdx: (d) Invaginação sarcoplasmática (seta preta). Barras: 2 μm. 44 6. DISCUSSÃO Os resultados demostraram a morfologia das papilas linguais e os aspectos tridimensionais do tecido conjuntivo associado das papilas. Além das descrições das características estruturais e ultraestruturais do epitélio, lâmina própria e tecido muscular da língua de camundongos mdx. A língua dos camundongos é essencialmente semelhante à caracterizada por Kobayashi et al. (1989) e apresenta: ápice, corpo e raiz. As regiões rostral e medial do corpo da língua apresentaram papilas fungiformes e filiformes de formato cônico. Na proeminência lingual, foram encontradas apenas papilas filiformes de morfologia triangular. Nas margens da proeminência observaram-se papilas folhadas e na região caudal uma papila valada. Distribuídas por toda a extensão do ápice e regiões rostral e medial do corpo da língua estavam as papilas filiformes de formato cônico, ou seja, apresentaram uma base maior do que o ápice e ponta arredondada, semelhantes às encontradas em ratos Sprague Dawley (REGINATO et al., 2014). Após a maceração epitelial sob MEV foram revelados TCAs de morfologia cônica, semelhante a descrição presente na literatura para camundongos (KOBAYASHI et al., 1989) e ratos Sprague Dawley (REGINATO et al., 2014). Entre o grupo controle e mdx não foram encontradas diferenças nas características morfológicas e estruturais para as papilas cônicas da superfície epitelial e TCA. As papilas fungiformes estavam localizadas adjacentes as papilas filiformes de formato cônico e distribuídas principalmente pelas regiões rostral e medial do corpo da língua e possuem morfologia semelhante à um “cogumelo” assim como em outros roedores (REGINATO et al., 2014; CIENA et al., 2019). No topo da papila fungiforme está presente um botão gustativo, como revelado pela microscopia de luz. Sob a técnica de maceração epitelial, o TCA apresentou um formato cilíndrico com uma cavidade no topo, essa característica morfológica corrobora com os resultados de Kobayashi et al. (1989) para camundongos, que a denomina de semelhante a craca e assemelha-se a outros roedores (KITAJIMA; KOBAYASHI, 1992; REGINATO et al., 2014). Os grupos controle e mdx não apresentaram diferenças morfológicas entre a papila fungiforme e respectivo TCA. Na região caudal do corpo da língua está presente a proeminência lingual, observaram- se papilas filiformes com aspecto triangular, ou seja, caracterizadas por uma morfologia diferente das filiformes das regiões rostral e medial. No grupo mdx, as papilas da proeminência 45 apresentaram pontas fimbriadas diferentemente do grupo controle, aspecto relacionado ao desgaste que essas papilas, de função mecânica, possuem. Outros roedores como os ratos Sprague Dawley (REGINATO et al., 2014) e o mocó (Kerodon rupestris) (ARO et al., 2019) também apresentaram papilas filiformes na região da proeminência lingual. Os TCAs das papilas filiformes da proeminência apresentam morfologia semelhante à “pá” como descritas por Kobayashi e Iwasaki (1989) para os camundongos. Na face lateral da proeminência lingual, as papilas folhadas foram localizadas bilateralmente, estas consistem em dobras epiteliais paralelas delimitadas por sulcos profundos. São morfologicamente semelhantes as descrições em cutia (CIENA et al., 2013), porquinho- da-Índia (CIENA et al., 2019) e camundongos (KOBAYASHI et al., 1989). Após a remoção da superfície epitelial foram reveladas inúmeras aberturas de ductos separados por projeções laminares como as descritas por Kobayashi et al. (1989). Os grupos apresentaram características semelhantes e as diferenças no número de aberturas de ductos podem estar relacionadas com variações individuais. Medialmente na raiz da língua, estava presente uma papila valada com morfologia de domo. A quantidade e forma é semelhante em camundongos (KOBAYASHI et al., 1989) e ratos Sprague Dawley (REGINATO et al., 2014). A maceração epitelial revelou a presença de um sulco elíptico que delimitou o suporte papilar; e na microscopia de luz, os botões gustativos foram localizados profundamente nas paredes laterais assim como na língua da cutia (CIENA et al., 2013). O TCA da papila valada apresentava morfologia “alveolar” devido à presença de múltiplos botões gustativos conforme descritos por Kobayashi et al. (1989), também denominados de TCA semelhante a um “favo” (beehive-like). A estratigrafia epitelial de ambas as linhagens de camundongos foi caracterizada pela composição das camadas: córnea, granulosa, espinhosa e basal. Estas são semelhantes ultraestruturalmente às descritas para a cutia (CIENA et al., 2013), capivara (WATANABE et al., 2013) e porquinho-da-Índia (CIENA et al., 2019). Entre os grupos, o mdx apresentou maior justaposição de células planas na camada córnea, ademais, as outras camadas epiteliais apresentaram características semelhantes. A análise morfométrica revelou maior espessura no epitélio do grupo mdx. Essa característica pode estar relacionada a uma maior frequência da renovação epitelial associada ao desgaste que o epitélio dos camundongos distróficos sofre em decorrência do comprometimento dos músculos associados à mastigação (MULLER et al., 2001; SPASSOV et al., 2010). A lâmina própria foi composta principalmente por tecido conjuntivo com espessura delgada em toda a extensão lingual. Os tons avermelhados e esverdeados de fibras de colágenos 46 apresentam composições semelhantes e estão presentes em outra região da cavidade oral como a lâmina própria da mucosa palatina (TOMIATE et al., 2021a; 2021b). Entretanto, o grupo mdx caracterizou-se pela maior intensidade da coloração das fibras, demonstrando maior deposição e característico aspecto de fibrose tecidual. O tecido muscular inferior a lâmina própria do corpo da língua apresentou diferenças entre os grupos controle e mdx. No modelo da DMD, observou-se que os músculos apresentam características heterogêneas em regiões do corpo da língua, como a presença de focos inflamatórios e intussuscepção de colágeno de coloração amarelada na musculatura, esses aspectos são algumas das múltiplas etapas do processo degenerativo muscular (PORTER et al., 2002; CHAMBERLAIN et al., 2007). Enquanto que, de acordo com Spassov et al. (2010), para camundongos mdx de 100 dias o tecido muscular permanece inalterado, denotando que a degeneração muscular progressiva afeta a língua em uma idade mais avançada. Próximo à raiz da língua, a lâmina própria estava intimamente associada a grupamentos glandulares de dois tipos: glândulas mucosas e serosas circundadas por colágeno e tecido muscular, em proximidade às papilas folhadas e valadas. A presença de colágeno próximo aos aglomerados de glândulas é comumente encontrada em outras regiões da cavidade oral, como no palato mole (TOMIATE et al., 2021a; 2021b). A disposição do tecido muscular próximo ao aglomerado de glândulas e a conexão com as papilas folhada e valada eram semelhantes às características encontradas na língua de outros mamíferos (CIENA et al., 2013; CIZEK et al., 2017; CIENA et al., 2019). Ao contrário do grupo controle, a linhagem mdx teve um comprometimento com depósito de colágeno no tecido muscular adjacente às glândulas, que pode resultar em pseudo- hipertrofia das glândulas mucosas, enquanto que as glândulas serosas apresentaram redução da área. Em outra patologia que também promove inflamação crônica, como na doença de Chagas, características semelhantes foram encontradas nas glândulas mucosas (BERTOLDO et al., 2019). O processo degenerativo muscular foi caracterizado na literatura como diferente em músculos distintos com a idade influenciando os estágios (ALLEN et al., 2016). A principal característica um processo cíclico de degeneração e regeneração, e a formação de fibroses (PASTORET; SEBILLE, 1995; MARTINEZ et al., 2021). Portanto, a língua de camundongos mdx com 6 meses de idade apresenta múltiplas alterações musculares pontuais com diferentes graus entre as regiões anatômicas como miocitólise, diminuição das invaginações sarcoplasmáticas e deposição de colágeno. Essas características também estiveram presentes com diferentes intensidades nos músculos mastigatórios como masseter e temporal de 100 dias 47 (SPASSOV et al., 2010), e em camundongos mdx de 12 meses com uma degeneração do tipo leve do músculo masseter (MULLER et al., 2001). As papilas linguais dos grupos controle e mdx não apresentaram grandes diferenças morfológicas, portanto a morfologia permanece inalterada mesmo em face do processo degenerativo da distrofia aos 6 meses de idade. Entretanto, na região rostral da língua do grupo mdx foi observado maior desgaste nas papilas filiformes triangulares e em decorrência disso apresentam aspecto de pontas fimbriadas. Essa característica pode estar relacionada ao comprometimento de músculos associados à mastigação conforme descrito por Spassov et al. (2010), consequentemente devido a menor força dessas musculaturas promovem indiretamente uma maior abrasão e desgaste das papilas filiformes triangulares. Na DMD, Engel-Hoek et al. (2013) descreveram um aumento da espessura da língua destacando a pseudo-hipertrofia desta musculatura, além da diminuição de força da mesma contra o palato, bem como o comprometimento de outros músculos associados à mastigação. A combinação desses fatores compromete a trituração de alimentos na cavidade bucal ocasionando em maior dificuldade na ingestão de alimentos sólidos e possivelmente refletindo em maior desgaste na mucosa especializada da língua promovendo maior abrasão nas papilas filiformes e frequência de renovação das células da camada córnea. 48 7. CONCLUSÃO Concluímos que as características do epitélio, lâmina própria e tecido muscular da língua de camundongos mdx aos 6 meses de idade foram evidenciadas. Como reflexo indireto do processo de degeneração na mucosa especializada, houve maior desgaste das papilas filiformes triangulares da proeminência e aumento da espessura epitelial de diferentes regiões da língua. Na lâmina própria, o grupo mdx apresentou maior intensidade da deposição de colágeno, inclusive adjacente às glândulas mucosas e serosas. Na região da submucosa, houve diminuição da área das glândulas serosas e aumento das glândulas mucosas. As fibras musculares da língua apresentaram extenso comprometimento em decorrência do processo de degeneração muscular causado pela ausência de distrofina. 49 REFERÊNCIAS ADNYANE, I. K. M.; ZUKI, A. B.; NOORDIN, M. M.; AGUNPRIYONO, S. Morphological study of the lingual papillae in the barking deer, Muntiacus muntjak. Anat Histol Embryol, v. 40, n. 1, p. 73–77. 2011. AGUNGPRIYONO, S.; YAMADA, J.; KITAMURA, N.; NISA, C.; SIGIT, K.; YAMAMOTO, Y. Morphology, of the dorsal lingual papillae in the lesser mouse deer, Tragulus javanicus. J. Anat.., Great Britain, p. 635-640. dez. 1995. ALLEN, D. G.; WHITEHEAD, N. P; FROEHNER, S. C. 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