RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 03/09/2022. CAIO CÉSAR GONÇALVES SILVA SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE ELETRODOS DE W/WO3 MODI- FICADOS COM FILMES DE POLIDOPAMINA PARA A IMOBILIZAÇÃO DE CLOROPLASTOS VISANDO APLICAÇÕES EM SISTEMAS FOTOBIOELE- TROQUIMICOS Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obten- ção do título de Mestre em Biotecno- logia. Orientador: prof. Dr. Saulo Santesso Garrido Co-Orientadora: profa. Dra. Maria Valnice Boldrin Araraquara-SP 2021 DADOS CURRICULARES 1. DADOS PESSOAIS Nome: Caio César Gonçalves Silva Nascimento: 31/01/1995 Nacionalidade: Brasileiro Naturalidade: Taguatinga Do Norte- DF- Brasil Estado Civil: Solteiro Filiação: Nelson Pereira da Silva e Vanilde Pereira Gonçalves Silva E-mail: ccg.silva@unesp.br / caiocesarsilva201473@gmail.com Endereço: Rua Prof. Francisco Degni, 55 Bairro: Quitandinha. CEP: 14800-060 Araraquara/SP. 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA Mestrado em Biotecnologia UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Arara- quara/SP. Período: 04/2019 – 09/2021 Título da dissertação: SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE ELETRODOS DE W/WO3 MODIFICADOS COM FILME DE POLIDOPAMINA PARA A IMOBILI- ZAÇÃO DE CLOROPLASTOS VISANDO APLICAÇÕES EM SISTEMAS FO- TOBIOELETROQUIMICOS Orientador: Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Valnice Boldrin Bolsa: CAPES Graduação em Biotecnologia UFU - Universidade Federal de Uberlândia, Campus - Patos de Minas, Patos de Minas/MG Período: 2013-2 / 2018-2 Título do trabalho de conclusão de curso: Polished silver solid amalgam electro- des in eletroanalytical determination of carbamates pesticides: The methomyl case. Orientadora: Djenaine De Souza. 3. TRABALHOS PUBLICADOS SILVA, C. C. G., SOUZA, Djenaine de. Polished silver solid amalgam electrode and cationic surfactant as tool in electroanalytical determination of methomyl pes- ticide. Talanta, v. 189, p. 389-396, nov. 2018. FILHO, D. G.; SILVA, C. C. G.; SOUZA, D. D. Pesticides determination in foods and natural waters using solid amalgam-based electrodes: challenges and trends. Talanta, v. 212, p. 120756, maio 2020. SILVA, C.C.G., SILVA, L.M., SILVA, B.C., GARRIDO, S.S, ZANONI, M.V.B e SOUZA, D. D. Cathodic stripping voltammetric determination of β-cyfluthrin, a py- rethroid insecticide, using polished silver solid amalgam electrode. Journal of Solid State Electrochem v 24, p. 1819–1826, março 2020. 4. Participação em eventos científicos: SILVA, C.C.G.; GARRIDO, S.S e ZANONI, M.V.B “Construção de biossensor fotoeletroquímico baseados em fotossistema 1, enzima fotossintética, visando o monitoramento e a conversão de CO2 em produtos economicamente viáveis. ” In: III Workshop INCT DATREM,2020, Araraquara-SP. SILVA, C.C.G.; SILVA, L.M.; ZANONI, M.V.B. e SOUZA, D. D “Electrochemical sensor for β-cyfluthrin, a pyrethroid insecticide, by cathodic stripping voltammetry at p-AgSAE electrode”. In: XXII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroa- nalítica - XXII SIBEE, 2019, Ribeirão Preto-SP. SILVA, C. C. G.; MARTINS, F.C.O.L. e SOUZA, D. D. “ Estudo do mecanismo redox e determinação eletroanalitica do pesticida metomil em alimentos in-na- tura. ” In: 19º Encontro Nacional de Quimica Analitica e 7º Congresso Iberoame- ricano de Química Analítica,2018, Caldas Novas-GO. GONÇALVES, L. M.; SILVA, C. C. G. e SOUZA, D. D. “Electroanalytical meth- odology for the simultaneous analysis of Pb+2 and Cd+2 ions using p-AgSAE”. In: XXXII Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química- XXXI ERSBQ, 2018, Juiz de Fora-MG. SILVA, C.C.G.; e SOUZA, D. D “Metodologia eletroanalítica para a quantificação do pesticida metomil em amostras ambientais”. In: XXI Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica - XXI SIBEE, 2017, Natal-RN. PAULA, M. Jr.; SILVA, C. C. G. e SOUZA, D. D. “ Determinação eletroanalítica de bht, antioxidante sintético, em amostras alimentícias”. In: 1º Workshop em Engenharia de Alimentos- “Ciência e Tecnologia de alimentos: um benefício para a região do Alto Paranaíba”,2017, Patos de Minas-MG. GONÇALVES, L. M.; SOARES, M. G.; SILVA, C. C. G. e SOUZA, D. D. “Uso de p-AgSAE para a detecção de metais pesados: o caso do Pb+2”. In: 1º Workshop em Engenharia de Alimentos- “Ciência e Tecnologia de alimentos: um benefício para a região do Alto Paranaíba”,2017, Patos de Minas-MG. SILVA, C.C.G.; e SOUZA, D. D “Determinação Eletroanalítica de metomil em amostras complexas”. In: 2º Encontro Nacional de Química Biotecnológica e Agroindustrial- 2º ENQ-BIOTEC, 2017, Ribeirão Preto-SP. SILVA, C.C.G.; e SOUZA, D. D “Avaliação do mecanismo redox e determinação eletroanalítica do pesticida metomil”. In: XXXI Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química- XXXI ERSBQ, 2017, Itajubá-MG. GONÇALVES, L. M.; SOARES, M. G.; SILVA, C. C. G. e SOUZA, D. D. “Meto- dologia eletroanalítica para detecção de Pb+2 empregando-se p-AgSAE”. In: XXXI Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química- XXXI ERSBQ, 2017, Itajubá-MG. SOARES, M. G.; GONÇALVES, L. M.; SILVA, C. C. G. e SOUZA, D. D. “ O uso do eletrodo sólido de amálgama de prata na quantificação de íons metálicos: O caso do íon Cd+2”. In: XXXI Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Quí- mica- XXXI ERSBQ, 2017, Itajubá-MG. PAULA, M. Jr.; SILVA, C. C. G. e SOUZA, D. D. “Uso de eletrodo sólido de amál- gama de prata na determinação analítica de antioxidante em alimentos. ” In: XXXI Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química- XXXI ERSBQ, 2017, Itajubá-MG. SILVA, C. C. G. e SOUZA, D. D. “Detecção e quantificação do pesticida metomil em amostras de sistemas ambientais e alimentícios”. In: 2º Simpósio de Tecno- logia e Ciência ,2016, Patos de Minas-MG. SILVA, C. C. G. e SOUZA, D. D. “Identificação e quantificaçãodo pesticida fen- propimorfe, desregulador endócrino, em amostras de alimentos e águas natu- rais”. In: 2º Simpósio de Tecnologia e Ciência, 2016, Patos de Minas-MG. SILVA, C.C.G.; FILHO, D. G. e SOUZA, D. D “Detecção voltamétrica de pestici- das morfolínicos”. In: XXXI Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Quí- mica- XXX ERSBQ, 2016, Uberlândia-MG. 5. Outros: 2016 – 2017: Bolsista de Iniciação científica: Instituo de Química; Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Brasil; Orientadora: Prof.ª Drª. Djenaine de Souza; Bolsista da: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FA- PEMIG); Projeto: “Construção, caracterização e aplicação de eletrodos sólidos de amal- gamas para estudos mecanísticos e determinação analítica de pesticidas pro- motores de desregulação endócrina. Aplicação em amostras de interesse ambi- ental”. 2017 – 2018: Bolsista de Iniciação científica: Instituo de Química; Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Brasil; Orientador: Prof. Dr. Diego Leoni Franco; Bolsista do: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Projeto: “Modificação de eletrodos com ácido 4-mercaptofenilpropiônico para de- senvolvimento de biossensores enzimáticos aplicados na área alimentícia”. 2018 - 2019: Bolsista de Iniciação científica: Instituto de Química; Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Brasil; Orientadora: Profª. Drª. Djenaine De Souza; Bolsista do: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Projeto: “Utilização de eletrodos sólidos de amalgama de prata (p-AgSAE) na determinação eletroanalítica de contaminantes em hortifrutigranjeiros: Insetici- das piretróides”. • Monitor da disciplina de Química Analítica nos cursos de graduação em Biotecnologia e Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Uberlândia - Campus Patos de Minas, no período de 10/10/2014 a 24/02/2015, perfazendo 12 horas semanais, sob a orientação da Professora Drª. Djenaine de Souza; • Participou da organização, colaborou e ministrou um mini-curso no evento “Métodos eletroanalíticos para identificação e quantificação de moléculas de interesse ambiental, biológico e industrial”, na Universidade Federal de Uberlâdia- Campus de Patos de Minas, sob a coordenação da professora Drª. Djenaine De Souza, no período de 08/08/2018 a 10/08/2018. • Bolsista no projeto “Caminhando pela Bioquímica: Desenvolvimento e aplicação de metodologias pedagógicas para ensino de Bioquímica”, coordenado pelo professor Dr. Robson José de Oliveira Junior, promovido pelo Instituto de Biotecnologia (IBTEC) da Universidade Federal de Uberlândia, vinculado ao programa 'PROSSIGA/PROCOR - Programa de Combate à Retenção e Evasão', realizado no período de 08/08/2016 a 30/11/2016; • Participou como ouvinte do 1º Simpósio de Tecnologia e Ciência (SimTeCi), UFU, 2014, Patos de Minas-MG. • Participou do minicurso “METODOS ELETROANALÍTICOS APLICADO A ANALISE EM SISTEMAS ALIMENTÍCIOS, BIOLÓGICOS E AMBIENTAIS”, Universidade Federal de Uberlândia- Campus de Patos de Minas, no período de 18 a 20 de março de 2015. (Carga horária12h) • Realizou estágio extracurricular no Grupo De Eletroanalítica de Araraquara (GEAR), no Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” campus de Araraquara, sob a orientação da professora Drª. Maria Del Pilar Taboada Sotomayor no período de 20/03/2017 até 31/03/2017, com carga horária total de 80 horas de atividade. • Realizou estágio extracurricular no Laboratório de Eletroanalítica Aplicado a Biotecnologia e a Engenharia de Alimentos (LEABE), Universidade Federal de Uberlâdia- Campus de Patos de Minas, sob a orientação da professora Drª. Djenaine De Souza no período de 01/08/2014 até 31/12/2014, com carga horária total de 240 horas de atividade. • Participou curso de extensão universitária na modalidade difusão: 1ª Escola de Inverno em Química Analítica na Agricultura e no Ambiente, ocorrido no Centro de Energia Nuclear na Agricultura- CENA/USP, na cidade de Piracicaba- SP, período do curso 12/07/2016 a 15/07/2016. • Participou como membro da coordenadoria administrativa do Diretório Acadêmico “César Mansueto Giulio Lattes”, inscrito sob CNPJ de número 20.894.951/0001-69, no período de junho de 2014 a julho de 2015. • Participou como voluntário do “Treinamento de discentes para atividades do Programa Pomar”, promovido pela Faculdade de Engenharia Química (FEQUI) da Universidade Federal de Uberlândia, vinculado ao programa “Propostas de Desenvolvimento da Fruticultura e da Olericultura no Alto Paranaíba – POMAR”, realizado no período de 09/04/2018 a 09/10/2018, sob a coordenação de Rodrigo Aparecido Moraes de Souza, com carga horária de 240 horas. • Participou do curso de extensão online “Competências Profissionais, Emocionais e Tecnológicas para Tempos de Mudança”, no período de 24/08/2020 e 30/08/2020 com carga horária total de 4 horas. DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a Deus pelo dom da vida, aos meus pais Nelson e Vanilde, aos meus irmãos Marcos e Fabíola e a minha tia Lúcia por todos os sacrifícios e apoio sempre. “A persistência é o caminho do êxito.” (Charles Chaplin) “O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhada. Cami- nhando e semeando, no fim terás o que colher.” (Cora Coralina) “Escrevo. E pronto. Escrevo porque preciso, preciso porque estou tonto...Eu escrevo apenas. Tem que ter por quê?” (Razão de ser, Paulo Leminski) AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus pelo cuidado, pela proteção, e por me abençoar todos os dias com um novo amanhecer dando-me força nos momentos difíceis, coragem e sabedoria. Aos meus pais, Vanilde e Nelson, aos meus irmãos Marcos e Fabíola, minha sobrinha Anna Clara e minha tia Lúcia sou infinitamente grato por todo sacrifício, apoio e cuidado que têm comigo. Vocês são minha força e fonte de inspiração. Amo vocês. À minha família, pelo apoio, e por entender os momentos que eu não pude estar com vocês. Ao Vitor, mais que amigo, sempre me apoiando em minhas escolhas. Obrigado pelo seu amor e carinho. Te amo. Obrigado também, a sua família por todo apoio e acolhimento. Aos meus queridos amigos Daniele Freitas, Amanda Brandão, Octavio Augusto, Ailton Pereira, Carol Brasil e Leticia Schiavon, que apesar da distância física, sempre estão presentes, prontos para ouvir, me fazer sorrir e ajudar nos dias difíceis. Aos amigos feitos no power jump que estarão sempre em meu coração, Iara, Renata, Juliana, Raquel, Fernanda, Nádia e Gabi. Ao professor Doutor Saulo Santesso Garrido, pela paciência e pela disposição e incentivo que tornaram possível a conclusão desta dissertação. À professora Doutora Maria Valnice Boldrin, pela paciência na coorientação, co- laboração, ensinamentos e discussões sempre pertinentes e instigantes, que le- varam a execução deste trabalho. Á professora Dra. Hideko Yamanaka e a Dra. Lilian Danielle de Moura Torquato pela avaliação e contribuições para o desenvolvimento deste trabalho no Exame Geral de Qualificação. A minha amiga e professora Dra. Djenaine de Souza por todo o apoio. minha grande tutora, obrigado por todas oportunidades, dedicação e ensinamentos, profissionais e pessoais, que levarei comigo por toda a minha vida. Aos meus amigos do apartamento 81 Dara Baldi, Gustavo Oliveira, Vitor Becaro e Silvio Pereira que levarei eternamente em meu coração. Aos meus amigos, Lucas Silva, Barbara Camila, Rafael Fonseca, Fabiana Sayão, Lilian Danielle e Kallyni Irikura Obrigado pela amizade construída, por todos os momentos de descontração, pelo suporte, e por toda a parceria. E a todos os colegas do GEAr pelas discussões científicas e momentos de descon- tração durante os cafés. Agradeço aos funcionários da seção de Pós-Graduação do Instituto de Química por todo suporte dado durante o desenvolvimento do mestrado. A todos os técnicos pelas análises realizadas e discussões dos resultados, bem como aos funcionários e servidores do Instituto de Química. O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoa- mento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES)- Código de Financiamento 001. Ao INCT-Datrem, processo 2014/50945-4, pelo suporte técnico proporcionado. Meus sinceros agradecimentos a todos que de alguma forma doaram um pouco de si para que a conclusão deste trabalho se tornasse possível. Muito obrigada! RESUMO As reações de transferência de elétrons impulsionadas pela luz na fotossíntese usualmente envolvem um complexo clorofila-proteína presente na membrana ti- lacóide, que apresentam várias aplicabilidades em processos eletrocatalíticos. Este projeto investigou a extração, caracterização e aplicação de uma solução rica em material fotossintético de folhas de espinafres para desenvolver sistemas de detecção fotobioeletroquímico. Inicialmente, investigou-se o comportamento eletroquímico do composto 2,6-diclorofenolindofenol (DCFI) usado como sonda redox sobre a superfície do eletrodo de carbono vítreo. Este estudo permitiu o desenvolvimento de uma metodologia eletroquímica simples e rápida para a re- ação de Hill. Para isto, monitorou-se a diminuição do sinal voltamétrico de onda quadrada por meio da oxidação da sonda sobre eletrodo de carbono vítreo usando uma suspensão rica em material fotossintético na ausência e na pre- sença de luz. Além disso, na segunda parte do projeto foi realizado os testes iniciais para a construção de um biossensor fotoeletroquimico utilizando a imobi- lização de material fotossintético extraídos de folhas de espinafre, Spinacia ole- racea, sobre substrato semicondutor de trióxido de tungstênio (W/WO3) como transdutor eletroquímico e como agente ancorante do material biológico, a poli- dopamina (PDA). ABSTRACT The light-driven electron transfer reactions in photosynthesis usually involve a chlorophyll-protein complex present in the thylakoid membrane, which has sev- eral applicability in electrocatalytic processes. This project investigated the ex- traction, characterization and application of a solution rich in photosynthetic ma- terial obtained from spinach leaves to develop photobioelectrochemical detection systems. Initially, he investigated the electrochemical behavior of the compound 2,6-dichlorophenolindophenol (DCFI) was investigated, using it as a redox probe on the surface of the glassy carbon electrode. From this study, a simple and fast methodology for the Hill reaction was developed, in which the square wave volt- ammetric signal was monitored from the oxidation of the DCFI redox probe im- mobilized on the surface of glassy carbon, in the absence and in the presence of light, using a suspension rich in photosynthetic material as electrolyte. For this, the decrease of the square wave voltametric signal was monitored through the oxidation of the probe on a glassy carbon electrode using a suspension rich in photosynthetic material in the absence and presence of light. In addition, in the second part of the project, tests were carried out for the construction of a photo- electrochemical biosensor using the immobilization of photosynthetic material ex- tracted from spinach leaves, Spinacia oleracea, using the substrate of tungsten trioxide (W/WO3) as an electrochemical transducer and polidopamine as anchor- ing agent. LISTA DE FIGURAS Figura 1: Ilustração do organismo fotossintético oxigênico, uma planta (A), a célula vegetal com suas respectivas organelas (B), com o enfoque no cloroplasto (C), mostrando a sua estrutura, onde em (D) membranas tilacóides em (E) o estroma ........................................................................................................... 27 Figura 2: Cadeia transportadora de elétrons e prótons que ocorre na fotossíntese durante a fase clara. ................................................................... 28 Figura 3: Esquema do processo transferência de elétrons na superfície do eletrodo, por mecanismos de transferência direta de elétrons (TDE) e por meio de transferência mediada de elétrons (TME)................................................... 31 Figura 4: Ilustração do processo de isolamento de cloroplastos por meio de gradiente de percoll 40%................................................................................. 35 Figura 5: Formula estrutural do DCFI. ............................................................ 38 Figura 6: Ilustração de uma célula eletroquímica de três eletrodos. ............... 39 Figura 7: (A) Espectro de absorção UV-visível do extrato contendo material fotossintético, mostrando a presença das bandas de absorção dos pigmentos fotossintéticos, em meio de acetona 80%. (B) SDS-PAGE do material fotossintético extraído de folhas de espinafre.................................................. 44 Figura 8: Imagem de microscopia confocal de fluorescência dos cloroplastos intactos em solução com uma objetiva de 40x. ............................................... 45 Figura 9: Curva de decaimento da absorbância do DCFI na presença do extrato contendo o material fotossintético na presença e na ausência da luz. ............ 46 Figura 10: Voltamogramas cíclicos obtidos para redução (A) e oxidação (B) de 1,0x10-4 mol L-1 de DCFI em tampão BR pH=7,0 sobre GCE, v=100 mV s-1. .. 47 Figura 11: (A) Voltamogramas cíclicos de 1,0x10-4 mol L-1 de DCFI em 0,04 mol L- 1 tampão BR pH 7,0 em diferentes velocidades de varredura de 25, 50, 100, 150, 200, 250 e 300 mV.s-1. (B) Relação entre a v e Ip com r: 0,9976. ........... 48 Figura 12: Efeito do pH sobre os voltamogramas cíclico obtidos para oxidação 1x10-4 mol L-1 de DCFI em 0,04 mol L-1 de tampão BR pH 2 a 10 sobre GCE, v=100 mV s-1. .................................................................................................. 49 Figura 13: Gráficos do efeito do pH sobre o potencial de pico anódico (A) e da corrente de pico (B) correspondentes aos voltamogramas da Figura 10. ....... 50 Figura 14: Voltamogramas de VOQ 0,25 até 8,00 µmol L-1 de DCFI em 0,1 mol L-1 PBS pH 7.2, os parâmetros utilizados foram a: 50mV, ∆Es: 2mV e f: 150 s-1 (A). Curva de calibração construída com os dados da Figura 11A bem como a respectiva equação da reta (B), com r=0,998. ................................................ 52 Figura 15: Voltamogramas de onda quadrada na presença de 0,59 mmol L- 1 de DCFI em 0,1 mol L- 1 PBS pH 7.2 e material fotossintético, onde em (A) reação acontecendo no escuro e em (B) reação acontecendo no claro, onde em (a) medida realizada no momento em que adiciona o DCFI, (b) a medida após 1minuto de exposição a luz, (c) a medida após 2 minutos de exposição a luz, (d) a medida após 3minutos de exposição a luz, (e) a medida após 4 minutos de exposição a luz, (f) a medida após 5minutos de exposição a luz e (g) branco. Branco é a solução de 0,1mol L-1 de PBS + material fotossintético. ............... 53 Figura 16:(A) Esquema proposto para o mecanismo de transferência de elétrons das membranas tilacóides (suspensas em solução) para o GCE por meio dos complexos proteicos diferentes, por exemplo, FTI, PQ, Citb6f, Ptc, FTI e Fdx. Para simplificação, outros componentes das membranas tilacóides não são mostrados. (B) Reação de redução química do DCFI na presença dos complexos fotossintéticos e luz. ........................................................................................ 55 Figura 17: Difratogramas de Raios-X obtidos para a placa de W e após a formação do filme de WO3 em meio de NH4F 0,7% com Na2SO4 0,1 mol L-1, aplicando-se 40 V por um período de 15 minutos. .......................................... 56 Figura 18: Imagens de microscopia eletrônica de alta resolução (FEG-MEV) da placa de W, com magnificação de 25,000x (A), eletrodos de W/WO3 preparados por anodização em meio de NH4F 0,7% e Na2SO4 0,1 mol L-1, 40 V, 15 minutos 25,000x (B), filme de WO3 com magnificação de 50,000x (C) e histograma de distribuição de tamanho dos poros (D). ........................................................... 57 Figura 19:Imagem de microscopia eletrônica de alta eficiência com o respectivo resultado das análises de EDS da região escolhida da placa de W (A) e do eletrodo após a formação do filme de WO3 (B). .............................................. 58 Figura 20: Curva de reflectância difusa obtida para o eletrodo de W/WO3 (A). Gráfico de Tauc construído para o cálculo do band gap do eletrodo de W/WO3 obtido (B). ....................................................................................................... 59 Figura 21: Espectros de emissão dos dispositivos (A) LED-1 e (B) LED-2. ... 59 Figura 22: Curvas de Fotocorrentes vs potencial geradas sobre eletrodo de W/WO3 em 0,1 mol L-1 de PBS pH 7,0 no escuro e irradiados pelo sistema de LEDS e. v= 10mV s-1....................................................................................... 60 Figura 23: Fotocorrentes obtidas pelo eletrodo de W/WO3 em diferentes eletrólitos de suporte (A) Na2SO4 0,1 mol L-1 (curva verde) e (B) PBS 0,1 mol L- 1 (curva azul) ambos em pH 7,0. Apli-cando potencial de +0,25V e +0,80V. ... 61 Figura 24: Reação de polimerização da dopamina. ....................................... 62 Figura 25: Imagens de microscopia eletrônica de alta resolução (FEG-MEV) do eletrodo de W/WO3 modificados com filmes de PDA em diversos tempos de polimerização (A) filme de 2 horas, (B) filme de 4 horas e (C) filme de 6 horas. Onde (A.1, B.1, C.1) são magnificações de 25,000x e (A.2, B.2, C.2) são magnificações de 50,000x............................................................................... 63 Figura 26: Diagramas de Nyquist obtidos (A) com eletrodo de W/WO3 sem modificação e modificado com a PDA em diferentes tempos, (B) 2 horas, (C) 4 horas e (D) 6 horas. Medidas realizadas em meio de ferricianeto de potássio 5,0x10-3mol L-1 preparada em 0,5 mol L-1 de KCl. ........................................... 64 Figura 27: Fotocorrentes geradas em (A) eletrodo de W/WO3 sem modificação, (B) W/WO3-PDA2h, (C) W/WO3-PDA4h e (D) W/WO3-PDA6h. Utilizando voltametria de varredura linear com v= 10mV s-1 em meio de 0,1 mol L-1 PBS pH 7,0. ............................................................................................................ 65 Figura 28: Mapeamento elementar do eletrodo de WO3/PDA-4h. .................. 66 Figura 29:Fotocorrentes obtidas em (A) eletrodo de W/WO3, (B) WO3-PDA4h em meio de 0,1 mol L-1 PBS pH 7,0. ............................................................... 67 Figura 30: Fotocorrentes obtidas em (A) eletrodo de W/WO3, (B) WO3/PDA e em (C) WO3/PDA/Cloroplastos em meio de 0,1 mol L-1 PBS pH 7,0 aplicando E=+0,25V. ....................................................................................................... 68 Figura 31: (A) A relação da fotocorrente em diferentes concentrações de cloroplastos. (B) E relação da fotocorrente em diferentes tempos de imobilização. As medidas foram realizadas em meio de PBS 0,1 mol L-1 em pH 7,0 aplicando E=+0,25V. ................................................................................. 69 Figura 32: Imagens de microscopia confocal de fluorescência, onde em (A) eletrodo de WO3, em (B) eletrodo de WO3/PDA e em (C) eletrodo de WO3/PDA/Cloroplastos. Utilizando uma objetiva de 40x com imersão em óleo. ........................................................................................................................ 71 Figura 33: Comparação da geração de fotocorrente mediada nas etapas de montagem do dispositivo fotobioeletroquímico, WO3 (preto), WO3/PDA (vermelho), WO3/PDA/Clp (verde) e WO3/PDA/Clp/ DCFI (azul) na presença de 60μM de DCFI dissolvido no eletrólito. Condições: eletrólito, 0,1mol L-1 PBS pH 7,0 e E= +0,25V. Onde Clp= cloroplastos e sob iluminação de LED-2 (395nm). ........................................................................................................................ 72 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS K3 [Fe(CN)₆]-3: Ferricianeto de Potássio ATP: Adenosina trifosfato CdTe: Telureto de cadmio CH2O: carboidratos Citb6f: Citocromo b6f CSSC: Células solares sensibilizadas por corante CuInSe\Ga: Seleneto de cobre, índio e gálio DCFI: 2,6-diclorofenolindofenol DRX: Difração de Raios-X e-: Elétron EDS: (do inglês Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy) EIS: Espectroscopia de impedância eletroquímica (do inglês Electrochemical Im- pedance Spectroscopy) Fdx: Ferredoxina Fe2O3: Hematita FEG-SEM: Microscópio eletrônico de varredura com campo de emissão FNR: Ferredoxina–NADP+ redutase FTI: Fotossistema 1 FTII: Fotossistema 2 GCE: Eletrodo de carbono vítreo (do inglês Gassy Carbono Electrode) H+: Próton LED: Diodo emissor de luz (do inglês Light-Emitting Diode) LHC: Complexo de coleta de luz (do inglês Light-Harvesting Complex) N2O: Óxido nitroso NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato O3: Ozônio OPV: Fotovoltaica orgânica (do inglês Organic Photovoltaic) PBS: tampão fosfato salino (do inglês Phosphate Buffer Solution) PDA: Polidopamina PQ: Plastoquinona na forma oxidada PQH2: Plastoquinona na forma reduzida Ptc: Plastocianina SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante TDE: Transferencia direta de elétrons TiO2: Dióxido de titânio TME: Transferencia mediada de elétrons TW: Terawatt UV: Ultravioleta UV-Vis: Ultravioleta- visível VOQ: Voltametria de onda quadrada W: Tungstênio WO3: Trióxido de tungstênio ZnO: Óxido de zinco Φ: Ângulo de Fase SUMÁRIO 1. Introdução .................................................................................. 25 2. Objetivos .................................................................................... 33 3. Material e Métodos .................................................................... 34 3.1. Obtenção do material fotossintético ................................. 34 3.2. Determinação da concentração de clorofila ..................... 35 3.3. Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS- PAGE) 36 3.3.1. Preparo do gel de resolução........................................... 36 3.3.2. Preparo do gel de empacotamento (stacking gel) 4,5% 36 3.3.3. Processo de eletroforese ................................................ 37 3.3.4. Revelação do gel ............................................................. 37 3.4. Teste de atividade do material fotossintético (Reação de Hill) 37 3.5. Construção do biossensor fotoeletroquímico .................. 39 3.5.1. Preparo do eletrodo de W/WO3 ....................................... 39 3.5.2. Modificação do eletrodo de W/WO3 com filme polimérico de polidopamina .................................................................................... 40 3.5.3. Modificação do eletrodo de WO3/PDA com os cloroplastos 40 3.6. Medidas fotoeletroquímicas ............................................... 41 3.7. Caracterização do eletrodo ................................................ 41 3.8. Caracterização do eletrodo por meio da técnica de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) ................................ 41 4. Resultados e discussão ......................................................... 43 4.1. Caracterização do extrato contendo material fotossintético 43 4.2. Reação de Hill...................................................................... 45 4.3. Abordagem eletroquímica para Reação de Hill ................. 46 4.3.1. Comportamento eletroquímico do DCFI sobre o eletrodo de carbono vítreo ................................................................................... 47 4.4. Curva analítica para determinação de DCFI em meio aquoso 51 4.5. Abordagem eletroquímica para reação de Hill .................. 52 4.6. Etapas de construção do sistema foto-bioeletroquímico 55 4.6.1. Caracterização estrutural, morfológica e fotocatalítica do eletrodo W/WO3 ...................................................................................... 55 4.6.2. Modificação do eletrodo de W/WO3 com filmes de polidopamina.......................................................................................... 62 4.6.3. Imobilização dos cloroplastos intactos sobre a superfície do eletrodo de WO3-PDA ....................................................................... 67 5. Conclusão .................................................................................. 73 6. Perspectivas .............................................................................. 74 7. Referências ................................................................................ 75 25 1. Introdução Concomitante ao vertiginoso crescimento da população, o mundo mo- derno se depara com a crescente demanda por fontes de energia sustentáveis, ecologicamente corretas e economicamente viáveis como alternativas ao con- sumo de combustíveis fósseis (carvão mineral, petróleo e gás natural) (ORT et al., 2015), que tem sustentado a matriz energética desde longa data. Esta ne- cessidade se deve ao esgotamento das reservas de combustível fósseis além do fato que seu uso vem contribuindo acentuadamente para o aumento dos ní- veis de emissão de gases responsáveis pelo efeito estufa (CO2, CH4, N2O, O3, clorofluorcarbonetos e hidrofluorcarbonetos) que prejudicam o meio ambiente e alteram o ciclo de carbono vital para a proteção dos organismos vivos (FRIEDLINGSTEIN et al., 2020). Atualmente, diversos tipos de fontes renováveis são explorados como al- ternativa para sanar o problema da crise energética, como a luz solar, vento, chuva, marés e calor geotérmico, dentre outros. Dentre essas fontes de energia, a luz solar é a fonte de energia mais abundante no planeta. A Terra recebe apro- ximadamente cerca de 120.000 TW de energia solar, e tem sido bastante usada para a construção de sistemas fotovoltaicos (também chamados de células so- lares), os quais convertem a energia luminosa em energia elétrica (KALYANASUNDARAM; GRAETZEL, 2010). Atualmente, as células solares podem ser classificadas em três gerações: a) células convencionais à base de silício cristalino; b) células solares composta de um filme fino de silício amorfo, CdTe (telureto de cádmio) e CuInSe/Ga (seleneto de cobre, índio e gálio); c) emprego de várias arquiteturas, como fotovoltaica orgânica (OPV), células solares sensibilizadas por corante (CSSC) e células solares de pontos quânticos. Cada tipo de célula solar tem limites de eficiência, vantagens de design e limitações de recursos. Coletivamente, as tecnologias atuais têm várias desvan- tagens, tais como, limitação de recursos naturais e geopolíticos e toxicidade am- 26 biental de certos componentes usados em sua fabricação. Devido a esses desa- fios, diversas pesquisas vêm explorando abordagens mais naturais, como o pro- cesso de conversão de energia solar via fotossíntese (MUSAZADE et al., 2018). A fotossíntese é indiscutivelmente um dos processos naturais mais impor- tante e complexos que existe, transformando nosso planeta antes sem vida em um mundo vivo. Enquanto as bactérias fotossintéticas primitivas, como as bac- térias sulfurosas roxas e verdes, realizam fotossíntese anoxigênica, produzindo enxofre elementar a partir de sulfeto de hidrogênio com a ajuda da luz solar, já as cianobactérias, algas e plantas realizam fotossíntese oxigenada para conver- ter H2O e CO2 em açúcares, liberando gás oxigênio como um subproduto. Neste processo há conversão da energia luminosa em energia química com uma efici- ência quântica de 100%. A, fotossíntese resulta em energia armazenada em li- gações químicas produzindo biocombustíveis ou biomassa. Diante disto o pro- cesso fotossintético tem sido utilizado com sucesso para aplicações de conver- são de energia em uma variedade de maneiras (geração de H2, produção de eletricidade e produção de biocombustíveis) (KALYANASUNDARAM; GRAETZEL, 2010; SEKAR; RAMASAMY, 2015; MUSAZADE et al., 2018). O processo fotossintético ocorre nas membranas dos organismos em duas etapas, a fase dependente da luz (também chamada de fase clara ou etapa fotoquímica) e a fase independente da luz (chamada de fase escura ou etapa química) em estruturas celulares (organelas) denominadas cloroplastos. É im- portante ressaltar que as reações que ocorrem tanto na fase clara quanto na fase escura, acontecem em locais distintos no cloroplasto, onde a fase fotoquímica ocorre nas membranas tilacóides e fase química ocorre no estroma (JOHNSON, 2017), conforme ilustrado na Figura 1. 27 Figura 1: Ilustração do organismo fotossintético oxigênico, uma planta (A), a célula vegetal com suas respectivas organelas (B), com o enfoque no cloroplasto (C), mostrando a sua estrutura, onde em (D) membranas tilacóides em (E) o estroma Fonte: Próprio autor. As reações que ocorrem na etapa fotoquímica e a transferência de elé- tron/próton da fotossíntese ocorrem principalmente dentro das membranas. Em muitos organismos fotossintéticos, a fotossíntese ocorre em membranas especi- alizadas chamadas membranas tilacóides e em alguns organismos procarióticos, a membrana citoplasmática serve como membrana fotossintética. A unidade mí- nima, funcional e estrutural da fotossíntese é chamada de fotossistema. Inicial- mente a fotólise da água, que é impulsionada pela luz em gás oxigênio, prótons e elétrons todo esse processo ocorre pela cadeia transportadora de elétrons lo- calizadas nas membranas tilacóides. Já as reações que ocorrem na etapa quí- mica, os prótons e elétrons produzidos são usados para reduzir o CO2 a carboi- drato (CH2O), em um processo chamado Ciclo de Calvin (também chamado de Ciclo das Pentoses) (JOHNSON, 2017). Os dois processos podem ser resumi- dos assim: 1) Reações que ocorrem na etapa fotoquímica: 2𝐻2𝑂 + 𝑙𝑢𝑧 → 𝑂2 + 4𝑒− + 4𝐻+ 2) Reações que ocorrem na fase química: 𝐶𝑂2 + 4𝑒− + 4𝐻+ → 𝐶𝐻2𝑂 + 𝐻2𝑂 3) Reação geral: 𝐻2𝑂 + 𝑙𝑢𝑧 + 𝐶𝑂2 → 𝐶𝐻2𝑂 + 𝑂2 28 As reações de transferência de elétrons impulsionadas pela luz na fotos- síntese começam com a fotólise da água pelo Fotossistema II (FTII), o qual é um complexo clorofila-proteína presente na membrana tilacóide que usa luz para oxidar água em oxigênio e reduzir o aceptor de elétrons plastoquinona (PQ) em plastoquinol (PQH2). Em sequência, o PQH2, transporta os elétrons provenientes da fotólise da água para outros complexos proteicos embutidos na membrana tilacóide, denominado citocromo b6f (citb6f), que oxida o PQH2 a PQ e reduz uma pequena proteína transportadora de elétrons, plastocianina (Ptc). Uma segunda reação conduzida pela luz é então realizada por outro complexo de clorofila-pro- teína, Fotossistema I (FTI), que oxida a Ptc e reduz outra proteína transportadora de elétrons. A ferredoxina (Fdx), que reside no estroma. A Fdx, pode então ser usada pela enzima ferredoxina–NADP+ redutase (FNR) para reduzir NADP+ a NADPH (JOHNSON, 2017), esse processo é mostrado na Figura 2. Figura 2: Cadeia transportadora de elétrons e prótons que ocorre na fotossíntese durante a fase clara. O processo ilustrado acima ocorre com a liberação de oxigênio e a forma- ção de NADPH e ATP, o quais são dependentes de reações de oxidação-redu- ção catalisadas pela cadeia transportadora de elétrons. Neste contexto, a incor- poração dos componentes fotossintéticos na construção de dispositivos fotobio- eletroquímicos tem sido bastante explorados, como cloroplastos (HASAN et al., 2017a; DIACCI et al., 2020; WELIWATTE et al., 2021), membranas tilacóides FT II Cit b6f FT I ATP-sintase Ptc Fdx FNR Transferência de H+ Transferência de e- Estroma Lúmen Tilacóide Fonte: Adaptado de Johnson (2017). 29 (DEWI et al., 2015; PANKRATOV et al., 2017, 2019; PANKRATOVA et al., 2018a; BUNEA et al., 2018; TAKEUCHI et al., 2018), fotossistema 1 (FT I) (MERSHIN et al., 2012; FEIFEL, S. C. et al., 2015; BEAM et al., 2015; FEIFEL, SVEN C. et al., 2015; TAPIA et al., 2017; KILISZEK et al., 2018; ZHAO et al., 2019) e fotossistema 2 (FT II) (WANG et al., 2015; SOKOL et al., 2016; LI et al., 2016; STONES et al., 2017; RIEDEL et al., 2019; HARTMANN et al., 2020), nas últimas décadas tem sido uma alternativa interessante para a conversão de ener- gia. Neste universo, os usos de catalisadores e biocatalisadores versáteis e in- teligentes utilizados para aperfeiçoar estas reações são cada vez mais intrigan- tes (KIM; NAM; et al., 2014). Dentre as biomoléculas fotossintéticas citadas acima os cloroplastos são as estruturas menos estudadas em fotobioeletroquí- mica em comparação com suas contrapartes para conversão de energia fotos- sintética. Diante da deficiência de trabalhos na literatura, os cloroplastos foi a organela escolhida para o desenvolvimento do projeto. Na construção de uma plataforma fotobioeletroquímica, algumas etapas são cruciais, como a escolha do material utilizado como transdutor, a estratégia para a imobilização do material biológico e sua comunicação o eletrodo. Na lite- ratura estas estruturas fotossintéticas citadas acima têm sido incorporadas como um filme fino sobre diversos tipos de eletrodos, assim podendo ser exploradas como fotobiocatalisadores na transferência de elétrons entre o eletrodo e a fase da solução (mediadores com potenciais formais adequados) produzindo fotocor- rentes amplificadas. Os principais materiais explorados como substratos são os eletrodos de ouro (YEHEZKELI et al., 2012; HASAN et al., 2014; ZHAO; HARDT; et al., 2018) e materiais baseados em carbono como, eletrodo de carbono vítreo(GCE) (LEE, J. et al., 2016), nanotubos de carbono (CALKINS et al., 2013; DEWI et al., 2015), óxido de grafeno (CAI et al., 2015; KILISZEK et al., 2018; PANKRATOVA et al., 2018b) e papel de carbono (Toray Carbon) (SJOHOLM et al., 2012; HASAN et al., 2017b; ZHOU et al., 2019; WELIWATTE et al., 2021). Porém, o uso de ma- teriais semicondutores também vêm sendo aplicados de forma satisfatória como substrato para ancorar estas biomoléculas como Fe2O3 (WANG et al., 2015), TiO2 (KAVADIYA et al., 2016; LI et al., 2016), ZnO (MERSHIN et al., 2012) e WO3 (PANG et al., 2018). Dentre os materiais semicondutores o trióxido de tungstênio 30 (WO3), semicondutor do tipo-n, tem sido muito utilizado para ancorar biomolécu- las, devido suas propriedades que o tornam um material favorável como subs- trato para ancorar estas biomoléculas, como: material de baixo custo, ecologica- mente correto, quimicamente estável, absorção na região do visível, baixa ener- gia de band-gap (2,5eV – 2,8eV) e biocompatibilidade (SANTOS et al., 2016), diante disto o WO3 foi escolhido como substrato para o desenvolvimento da pla- taforma fotobioeletroquímica. Na literatura os aparatos fotossintéticos estão sendo imobilizados e a co- municação com seus substratos tem sido feita de duas formas: por transferência direta de elétrons (TDE) e por transferência mediada de elétrons (TME), con- forme ilustrado na Figura 3, entre o biomaterial e o eletrodo (MILTON et al., 2016). Basicamente a TDE ocorre quando os elétrons produzidos no biocatali- sador são transferidos para um eletrodo sem a necessidade de um mediador de elétrons (SJOHOLM et al., 2012; DEWI et al., 2015; LEE, J. et al., 2016; PANKRATOVA et al., 2018b). Já para o método TME pequenas porções redox-ativas transportam elé- trons entre um biocatalisador e um eletrodo, os mediadores comumente usados são filmes poliméricos redox baseados em polivinilimidazol de ósmio (Os2+/3+) (ZHAO; HARTMANN; et al., 2018), poli(etilenimina) funcionalizada com naftoqui- nona (HASAN et al., 2017b), polihidroxianilina (WELIWATTE et al., 2021), entre outros. Como os cloroplastos são protegidos por complexos sistemas de mem- brana lipídica, a comunicação direta de elétrons torna o processo de TDE se torna mais difícil, então os trabalhos na literatura têm explorado o uso TME, A vantagem de se utilizar polímeros redox é que eles cumprem simultaneamente o papel de um mediador redox e uma matriz de imobilização tridimensional, au- mentando assim a taxa de transferência de elétrons e a quantidade de comple- xos que podem ser imobilizadas produtivamente na superfície do eletrodo. Po- rém este material polimérico tem algumas desvantagens como o seu elevado custo e a complexidade envolvida na síntese (HARTMANN et al., 2020; WANG et al., 2020). O uso de mediadores de elétrons em solução entre as biomoléculas fotossintéticas também é explorado na literatura, como o uso de 2,6-diclorofeno- 31 lindofenol e moléculas derivadas de quinonas (p-benzoquinona, diclorobenzo- quinona, duroquinona, tetracloro-benzoquinona entre outros) (HASAN et al., 2014). Figura 3: Esquema do processo transferência de elétrons na superfície do eletrodo, por meca- nismos de transferência direta de elétrons (TDE) e por meio de transferência mediada de elétrons (TME). Fonte: Próprio autor. Diante disto o grande desafio consiste no preparo dos eletrodos usando destas estruturas fotossintéticas, em configurações funcionais que permitem a comunicação de transferência de elétrons entre as espécies primárias de elé- trons (fotogeradas nas estruturas fotossintéticas) e a superfície do eletrodo. Deste modo, seria relevante para o trabalho investigar novas formas de imobili- zação de cloroplastos (material fotossintético) utilizando filmes de polidopamina depositados sobre o eletrodo de WO3. A escolha da polidopamina foi atribuída a suas características de ser facilmente depositadas em uma variedade de subs- tratos, a espessura do filme pode ser controlada, estabilidade, grupos funcionais (catecol, amina e imina) que permitem imobilizar biomoléculas além de melhorar 32 a absorção do material na região do visível (LIU et al., 2014). Além destas ca- racterísticas, na literatura o potencial da polidopamina de agir como agente an- corante e como mediador e elétrons já vem sendo explorados de forma satisfa- tória (KIM; LEE; et al., 2014; LEE, S. Y. et al., 2016). 73 5. Conclusão Por meio dos resultados obtidos, foi extraído e caracterizado uma solução rica em material fotossintético de folhas de espinafres. Investigou-se ainda o comportamento eletroquímico do composto DCFI sobre a superfície do eletrodo de carbono vítreo, bem como o desenvolvimento de uma metodologia eletroquí- mica simples e rápida visando a aplicação eletroquímica para a reação de Hill usando uma suspensão rica em material fotossintético em solução na ausência e na presença de luz utilizando-se da técnica de voltametria de onda quadrada utilizando o DCFI como mediador artificial de elétrons. Além disso, foi construído e caracterizado um eletrodo semicondutor de W/WO3 como substrato, onde foi imobilizado cloroplastos intactos a partir de filmes de polidopamina construídos previamente como agente ancorante e testou-se o comportamento fotoeletroca- talítico do material imobilizado sobre eletrodo de W/WO3. Também foi construído e caracterizado os sistemas de iluminação LED. 75 7. Referências ARNON, D. I. Copper Enzymes in Isolated Chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta Vulgaris. 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