Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Pesquisa e Desenvolvimento: Biotecnologia Médica, curso de Mestrado Profissionalizante do Hemocentro/Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, para obtenção de título de Mestre em Biotecnologia Médica. ������������������������������������ �� ���� ���� ���� �� ���� ���� ���� ���� LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA: ANÁLISE CLÍNICO-MORFOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA E CORRELAÇÃO COM FATORES PROGNÓSTICOS CLÍNICOS Botucatu 2009 ���������� � ���� �� ��� LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA: ANÁLISE CLÍNICO- MORFOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA E CORRELAÇÃO COM FATORES PROGNÓSTICOS CLÍNICOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Pesquisa e Desenvolvimento: Biotecnologia Médica, curso de Mestrado Profissionalizante do Hemocentro/Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, para obtenção de título de Mestre em Biotecnologia Médica. ORIENTADORA: PROFA. DRA. LÍGIA NIÉRO-MELO CO-ORIENTADORA: PROFA. DRA. MARIA APARECIDA CUSTÓDIO DOMINGUES Botucatu 2009 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus Duarte Pollyanna Domeny. Leucemia linfóide crônica: análise clinico-morfológica e imuno- histoquimica e correlação com fatores prognósticos clínicos / Pollyanna Domeny Duarte. – Botucatu : [s.n.], 2009. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu, 2009. Orientadora: Ligia Niero-Melo Co-orientadora: Maria Aparecida Custódio Assunto CAPES: 40101053 1. Leucemia linfóide - Prognóstico 2. Biotecnologia médica CDD 616.99243 Palavras-chave: AMO; Estádio clínico; LLC/LL; Reticulina; ZAP-70 Dedico esta dissertação a cada paciente que passou e passará por minha vida, por seus ensinamentos, especialmente de que é preciso fazer tudo que é possível, sem hesitar, a cada momento. Agradecimentos especiais À minha orientadora, querida Professora Lígia, pelos ensinamentos profissionais, onde é tão profunda e rigorosamente dedicada; pela preciosa semente do gosto pela morfologia, plantada e regada a cada dia e, principalmente, pelos ensinamentos pessoais, de forte guerreira, de coração materno e pulso firme – muito obrigada! À minha co-orientadora, Dra. Maria, pela dedicação e precioso auxílio, muito obrigada! Aos professores da Escola de Medicina da Universidade Federal de Sergipe, especialmente o Professor Dr. Ricardo Scher – pelo zelo em minha iniciação científica – e a Professora Dra. Rosana Cipolotti – pelo incentivo constante, muito obrigada! Aos meus pais, Domingos e Eny, alicerces firmes da minha formação, que dentro de sua preciosa simplicidade, abriram-me as portas do saber e me ensinaram como é importante lutar por aquilo que sonhamos, minha eterna gratidão! Aos meus irmãos, Sellyanna e Adriano, por todos os momentos partilhados e tão significativos em minha vida, minha especial admiração. Ao meu marido, Ívison, fiel companheiro, mesmo nos momentos mais difíceis, todo meu amor. Agradecimentos Aos docentes, residentes e internos que assistiram os pacientes deste trabalho, especialmente a aluna Ludmilla, por tão grande auxílio na revisão dos prontuários; Aos colegas médicos de outras instituições que participaram dos cuidados de pacientes deste trabalho; Aos Hematologistas das duas Instituições, pela assistência a muitos destes pacientes, e pessoalmente, aos amigos Lucilene e Rafael pela importante contribuição na minha vida profissional – seus ensinamentos valem diamante! Aos Residentes de Hematologia, responsáveis pelas coletas de medula óssea; Aos Docentes e Residentes do Departamento de Patologia, pela contribuição no diagnóstico destes doentes; Aos funcionários do Hemocentro, que me tratam com tanto carinho; Aos técnicos do Departamento de Patologia, que viabilizaram este estudo; À Dra. Maura Moscardi Bacchi, pelos preciosos ensinamentos em Hematopatologia e, especialmente, pela singular e preciosa oportunidade. Para ser grande, sê inteiro: nada Teu exagera ou exclui. Sê todo em cada coisa. Põe quanto és No mínimo que fazes. Assim em cada lago a lua toda Brilha, porque alta vive. Fernando Pessoa Resumo Leucemia Linfóide Crônica (LLC) é uma neoplasia maligna de linfócitos B maduros com aspecto monomórfico, que se acumulam em tecidos linfóides secundários, medula óssea e sangue periférico. O diagnóstico é realizado com base em achados clínico-morfológicos e imunofenotípicos. Os pacientes com LLC são estratificados conforme o estadiamento clínico para definição de terapêutica; atualmente a descoberta de marcadores prognósticos, como ZAP-70, trouxe novas perspectivas ao tratamento, principalmente no estádio precoce. Os objetivos deste estudo foram: avaliar a eficácia da pesquisa da ZAP-70 em biópsia de medula óssea (BMO) e em inclusão do coágulo, utilizando-se a técnica de imuno-histoquímica; avaliar possíveis correlações deste marcador na BMO com evolução clínica e risco de progressão; correlacionar a imuno-expressão da ZAP- 70 com o arcabouço reticulinico das BMO; avaliar se este arcabouço possui correlação com o prognostico da doença e, por fim, traçar um perfil epidemiológico dos pacientes com LLC atendidos no Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB). Foram selecionados 153 pacientes com LLC, atendidos no ambulatório do Serviço de Hematologia da FMB-UNESP, de 1980 a 2008, e 9 pacientes assistidos no Serviço de Onco-Hematologia do Hospital Amaral Carvalho-Jaú, no período de 2000 a 2008, com o mesmo diagnóstico, perfazendo 162 casos. Destes, 79 possuíam prontuários que foram revisados, bem como dados morfológicos da BMO e AMO. Foi realizada a pesquisa da ZAP- 70 pela técnica de imuno-histoquímica nas amostras parafinadas de BMO e inclusão do coágulo. Observou-se que 55,7% dos pacientes eram do sexo masculino; 86,1% de etnia branca; a mediana de idade foi 65 anos; relação homem:mulher de 1,2:1. 40,5% dos pacientes tiveram diagnóstico por achado incidental e 73,4%, já com adenopatia secundária à admissão. 17,2% apresentaram-se em estádio precoce e 15% da casuística teve remissão prolongada. Na morfologia de BMO e AMO, observou-se que 94,8% dos pacientes tinham celularidade aumentada; 36,4% tinham padrão de infiltração difuso e 28,4% crescimento pseudo-folicular e presença de prolinfócitos. Na avaliação do arcabouço reticulínico, observou-se que 70,4% das BMOs apresentavam-se com graus II ou III.143 pacientes foram avaliados segundo imuno-expressão da ZAP- 70, e destes 18,2% foram positivos. Concluiu-se que a pesquisa da ZAP-70 pela técnica de imuno-histoquímica é adequada; a citoinclusão do coágulo de medula óssea é uma técnica de amostragem eficaz, reproduzindo os dados observados à BMO, bem como possibilitando a pesquisa de marcadores e avaliação reticulinica. Os demais dados observados foram concordantes com a literatura e inovaram ao mostrar o perfil epidemiológico da LLC na população atendida pelo HC da FMB- UNESP. Palavras-chave: LLC, ZAP-70, reticulina, AMO, BMO. Abstract Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a malignant neoplasm consisting of mature monomorphic B lymphocytes that accumulate in secondary lymphoid tissues, bone marrow and peripheral blood. Diagnosis is based on clinical, morphological and immunophenotypic findings. CLL patients are categorized according to clinical aspects for treatment management and currently, certain tools, such as prognostic marker ZAP- 70, have determined new treatment perspectives, especially for patients in early stages. The study aimed to evaluate the efficiency of ZAP-70 investigation in bone marrow biopsies (BMBs) and inclusion coagulate using immunohistochemistry; identify possible correlations of this marker in clinical evolution and risk of progression; correlate the immunoexpression of ZAP-70 with BMB reticulin network; evaluate whether this network correlates with disease prognosis and; outline an epidemiological profile of patients with CLL attended in the Clinics Hospital of Botucatu Faculty of Medicine (FMB). The sample consisted of 153 CLL patients attended at hematology outpatient clinic of the FMB-UNESP, from 1980 to 2008, and 9 CLL patients attended at the oncohematology service of the Amaral Carvalho Hospital, Jaú, from 2000 to 2008, totaling 162 cases. In 79 cases, medical records including BMB and bone marrow aspirate (BMA) morphological data were reviewed. Immunohistochemistry for ZAP-70 was conducted on paraffinated samples of BMB and inclusion coagulate. Observation revealed that: 55.7% were male, 86.1% white, with a median age of 65 years-old; 40.5% of cases were diagnosed by incidental findings in routine blood smears; 73.4% were diagnosed with peripheral adenomegaly on admission. 17.2% were diagnosed in the early stages and 15% of cases showed prolonged remission. BMB and BMA morphology revealed that 94.8% of patients presented increased cellularity; 36.4% presented a pattern of diffuse infiltration and 28.4% presented pseudofollicular growth and prolymphocytes. Evaluation of the reticulin network showed that 70.4% of BMBs presented grade II or III. 143 patients were evaluated for ZAP-70 immunoexpression and 18.2% were positive. In conclusion, the study of ZAP- 70 expression by immunohistochemistry was adequate; BMA cytoinclusion is an efficient sample analysis technique that reproduced data observed in the BMB and permitted the investigation of markers and reticulin evaluation. The remaining data observed were in agreement with the literature and innovated by outlining an epidemiological profile of CLL in the population attended at FMB-UNESP. Keywords: CLL, ZAP-70, reticulin, BMA, BMB. Lista de Ilustrações Figura 1. Distribuição de pacientes de acordo com Estadiamento Clínico (Rai, Binet modificados). Figura 2. Distribuição de pacientes de acordo com Evolução Clínica. Figura 3. Distribuição de pacientes de acordo com Celularidade e Padrão de Infiltração da Medula Óssea. Figura 4 – a: medula óssea hipocelular. BMO, HE, 200x; b: medula óssea normocelular. BMO, HE, 400x; c: medula óssea hipercelular. BMO, HE, 400x. Figura 5 – a: infiltração de medula óssea, padrão intersticial e nodular. BMO, HE, 400x. Figura 5 – b: infiltração de medula óssea, padrão difuso/maciço. BMO, HE, 400x. Figura 6 – formação de pseudofolículos na medula óssea. BMO, HE, 400x. Figura 7 – Estudo histoquímico de impregnação argêntica de fibras de reticulina; a: grau I, BMO, 400x; b: grau I, AMO do caso anterior, 400x; c: grau II, BMO, 400x; d: grau II, AMO correspondente ao caso anterior, 400x; e: grau III, BMO, 400x; f: grau III, AMO correspondente ao caso e, 400x; g: detalhe de grande vaso, BMO, 400x; h: detalhe de fibras reticulínicas pericapilares, AMO, 400x. Figura 8 – a: infiltração de medula óssea, padrão difuso/maciço. AMO, HE, 400x. Figura 8 – b: infiltração de medula óssea, padrão difuso/maciço. BMO, HE, 400x. Figura 9 – Estudo imuno-histoquímico de expressão da proteína ZAP-70; a: ZAP-70 positivo, infiltração intersticial, em caso arquivado há 11 anos, BMO, 400x; b: ZAP- 70 positivo, infiltração padrão difuso/maciço, BMO, 400x; c: ZAP-70 positivo, BMO, 400x; d: ZAP-70 positivo, AMO correspondente ao caso anterior, 400x; e: ZAP-70 negativo, controle interno de reação IHQ em linfócitos T, AMO, 400x. Lista de Tabelas Tabela 1. Estratificação de risco clínico segundo Rai e Binet Tabela 2. Escala de Bauermeister modificada para grau de impregnação argêntica de fibras de reticulina Tabela 3. Medidas descritivas dos participantes segundo variáveis quantitativas Tabela 4. Distribuição do grau do retículo segundo motivo do diagnóstico Tabela 5a. Distribuição de estratificação de risco segundo padrão de infiltração ao diagnóstico Tabela 5b. Distribuição do padrão de infiltração da medula óssea ao diagnóstico segundo estratificação de risco Tabela 6. Distribuição da presença de pseudofolículos e prolinfócitos (P/P) segundo estratificação de risco Tabela 7. Distribuição da evolução clínica segundo risco ao diagnóstico Tabela 8. Distribuição do grau do retículo de AMO segundo BMO Tabela 9. Distribuição de celularidade da medula óssea segundo grau do retículo Tabela 10. Distribuição do padrão de infiltração segundo grau do retículo Tabela 11. Distribuição do ZAP-70 segundo celularidade da BMO Tabela 12. Distribuição do ZAP-70 segundo padrão de infiltração à BMO Tabela 13. Distribuição do ZAP-70 segundo formação de pseudofolículos e prolinfócitos à BMO Tabela 14. Distribuição do ZAP-70 segundo graus de retículo à BMO Tabela 15. Distribuição do ZAP-70 segundo graus de retículo à AMO Tabela 16. Medidas descritivas da idade segundo os graus de retículo Tabela 17. Medidas descritivas de DHL segundo os graus de retículo Tabela 18. Medidas descritivas de ß2microglobulina segundo os graus de retículo Tabela 19. Medidas descritivas de linfocitose segundo evolução clínica Tabela 20. Medidas descritivas de creatinina sérica segundo evolução clínica Tabela 21. Mediana e valores mínimo e máximo das variáveis (Grau de retículo e Risco) segundo óbitos Tabela 22. Distribuição do grau de retículo segundo gênero Tabela 23. Distribuição do grau de retículo segundo sintomas B Tabela 24. Distribuição do grau de retículo segundo comprometimento de órgãos linfóides secundários Tabela 25. Distribuição de presença de infecção ao diagnóstico segundo grau de retículo Tabela 26. Distribuição do grau de retículo segundo estratificação de risco de Rai e Binet, modificados Tabela 27. Distribuição de pico monoclonal, na eletroforese de proteínas séricas, segundo grau de retículo Tabela 28. Distribuição da estratificação de risco segundo padrão de infiltração grau de retículo segundo celularidade da medula óssea SUMÁRIO Lista de Ilustrações Lista de Tabelas Resumo Abstract Introdução 21 Objetivos Casuística e Métodos Procedimentos para coleta de medula óssea Processamento do material citológico Processamento do material histológico 29 31 32 34 35 Revisão e Análise das Lâminas 36 Resultados Achados Clínico-Laboratoriais Achados de Análise de AMO e BMO 38 38 45 Discussão 51 Considerações Finais 72 Bibliografia 76 Apêndice Anexos 83 84 Introdução 21 INTRODUÇÃO A leucemia linfóide crônica (LLC) é neoplasia composta de pequenos linfócitos monomórficos, caracterizada pelo acúmulo de clone maligno em tecidos linfóides secundários, medula óssea e sangue periférico. As células neoplásicas imunoexpressam marcadores de tecido linfóide naive (que abandonou a medula óssea sem estímulo antigênico), CD5, um antígeno de ativação, e co-expressam marcadores de linfócitos B, na sua maioria CD19, CD23, baixos níveis de imunoglobulinas de superfície (IgM e IgD), CD21, CD22 e CD79b1. A célula B é assim definida ainda em sua origem medular óssea, quando ocorre inicialmente a síntese de cadeia pesada (em geral µ), que nesse momento lhe confere o fenótipo de linfócito pró-B, e adquire CD19, CD24, CD10 e CD79a2. A partir de então, há síntese de cadeia leve, formando a imunoglobulina completa, caracterizando-a como pré-B e passando a expressar CD20 e CD22. Quando da exposição desta imunoglobulina, anteriormente citoplasmática, para a superfície da célula como receptor de antígeno, adquire o fenótipo de célula B, caracterizada como B imatura e ganhando expressão de CD212. Daí depreende-se que a síntese de cadeia pesada, início da definição de linhagem, é marco fundamental na fisiomorfologia destas células1,2. LLC é morfológica e imunofenotipicamente indistiguível do linfoma linfocítico (LL), motivo pelo qual as duas entidades são categorizadas juntas, constituindo o diagnóstico LLC/LL (CID 9823/3, WHO 2008)3,4. A diferença indiscutível entre LLC e LL é que, no segundo, os linfócitos maduros apresentam-se sob forma tumoral infiltrando linfonodos e, ocasionalmente, o baço, e comprometem a medula óssea em apenas 30% dos casos3-7. A LLC ocupa o primeiro lugar dentre as leucemias do mundo ocidental e tem incidência de 2-6 casos por 100.000 habitantes por ano, nos Estados Unidos, o Introdução 22 que aumenta com a idade, chegando a 20,6/100.000 após os 65 anos1,3-6,8. A mediana de idade ao diagnóstico é de 60 anos, entretanto estudos identificaram vários casos em pacientes mais jovens3,9, alguns com diagnóstico de LLC familial, subtipo com características peculiares. Não há descrição de LLC em crianças. A sobrevida e o prognóstico são variáveis, desde evolução indolente com mediana de até dez anos de sobrevida, até rápida progressão e morte prematura. Aparentemente, tanto LLC quanto LL podem evoluir, de forma semelhante: um terço dos casos de forma agressiva, um terço intermediário e o restante de curso indolente7. A apresentação clínica pode ser desde pacientes assintomáticos, com descoberta fortuita em exames laboratoriais de avaliações médicas de rotina, até manifestação de espectro das doenças linfoproliferativas, ou seja, presença de massa tumoral e suas conseqüências, bem como disfunção imunológica, tais como fadiga, anemia hemolítica auto-imune, síndrome purpúrica, infecções, esplenomegalia, hepatomegalia, adenopatias ou infiltrados extra-nodais. O diagnóstico deve preencher critérios mínimos que incluem confirmação de linfocitose monoclonal sustentada (maior que 5000 a 10000/mm3, em duas tomadas com intervalo mínimo de um mês entre cada uma), em sangue periférico, mesmo em indivíduos assintomáticos, bem como confirmação de carga tumoral clínica ou em medula óssea10, visto que é doença essencialmente acumulativa. Diagnóstico diferencial entre as demais neoplasias linfóides B de pequenas células pode ser feito associando-se a morfologia dos linfócitos, o padrão de infiltração e a marcação imunofenotípica4,11 (anexo 1). Da diversidade de apresentação clínica surgem as controvérsias e opiniões acerca da conduta e orientação destes pacientes3, com opções terapêuticas que devem visar o controle da doença e prolongamento de Introdução 23 sobrevida, sem grandes anseios pela cura, uma vez que se trata de patologia prevalente em pacientes mais idosos, com menor reserva orgânica, e que muitos morrerão por outras causas não relacionadas a LLC/LL; ao que se soma a cinética de acúmulo predominante sobre a proliferação celulares. Por muito tempo, fatores clínicos eram os únicos critérios para indicar ou não o início de quimioterapia, com base essencialmente em quantidade de massa tumoral, conforme Rai et al (1977)12,13 e Binet et al (1982)12,13 que definiram estágios: a) precoce (Rai 0, Binet A); b) intermediário (Rai I/II, Binet B); c) avançado (Rai III/IV, Binet C), conforme visto na tabela 1. Contudo, estes sistemas falham em não considerar a idade do paciente ao estabelecer níveis de hemoglobina como preditor de envolvimento da medula óssea e não identificarem fatores de progressão da doença em estágios precoces, onde se encontra cerca de 60% dos pacientes ao diagnóstico. Nos últimos anos, estudos têm buscado identificar fatores prognósticos em LLC/LL8,14-19 e o estado mutacional do gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina (IgVH), como processo determinante de formação de receptor da célula B, é, sem dúvida, um marco definidor deste aspecto. Quando um antígeno de adequada afinidade é reconhecido pelo seu receptor, a célula entra no centro germinativo dos folículos linfóides, onde, como centroblasto, rapidamente se divide e os genes que codificam suas porções variáveis sofrem hipermutação somática. Esse processo determina mutações no segmento gênico rearranjado VHDJH e VLJL (cadeias pesada e leve, respectivamente) e conseqüente codificação do sítio receptor. Através dessas mutações, os receptores das células B descendentes, chamados centrócitos, adquirem novas propriedades, inclusive CD23 e negatividade ou fraca expressão de CD222, e aqueles que apresentam disfunção, normalmente são eliminados20. Este estímulo e a via Introdução 24 selecionada usualmente requerem ajuda de linfócitos T, especialmente via interleucinas, fato este ocorrendo em nível de centro germinativo; entretanto, pode acontecer sem estes auxílios, como, por exemplo, na zona marginal ao redor do folículo, principalmente em resposta a carboidratos de vírus ou bactérias encapsuladas. Ambos processos levam ao desenvolvimento de plasmócitos (com perda de HLA-DR, CD19, CD20, CD24, CD45 e aquisição de CD38, CD138 e da capacidade de produção de imunoglobulinas no seu citoplasma, com expressão em superfície das cadeias leves, kappa e lambda) ou células B de memória (expressando HLA-DR, FMC7, CD20, CD22, CD23, CD79, CD19 e perdendo CD5, CD10 e CD24)2,20,21. O antígeno CD38 é expresso em algumas células progenitoras, junto ao CD34 e costuma ser perdido durante a diferenciação dos linfócitos, podendo voltar a ser expresso na fase de plasmócito2,12,13. �������� � �� �������������� ��������������������������������������� ��������� �� ������ ����� � ��!� ���� ����"##� �� �����"$�� %����&� �� ' ������ � (�������������������� ������������)�����*�� ���� +� � �� � ,�+������ � -��� ����� ��� � (��������)�����.,�� ���/� 0�)�����1�����)������������ -� --� �� 23������� � ��������� 0��*��+3���1��� ---� 4� �3������� � '5��*��+++++1���� -6� � � Concomitantemente à ativação da célula B, há mudanças em sua superfície que a ajudam a interagir com outras células e mediadores solúveis, resultando em aumento do número ou maturação em plasmócitos produtores de anticorpos. Uma dessas moléculas de superfície é o CD38, com atividade adenosina difosfato-ribose ciclase e função de melhoria da sinalização dos receptores de célula B, desencadeando os sinais que regulam sua apoptose. Sinais recebidos através dela são transferidos ao núcleo através de uma cascata de interação entre moléculas, cujas estruturas são modificadas temporariamente durante este Introdução 25 processo20,21 e que freqüentemente envolvem ação de enzimas específicas, como Syk e Lyn, membros da família Src de proteínas “tirosino-kinases”. Nos linfócitos T, a proteína kinase associada à cadeia zeta, de 70kDa – ZAP-70 – faz este papel, sinalizando o início da ativação subseqüente da célula T, além de envolver-se com apoptose e migração celular22. Células de LLC que possuem genes IgVH não-mutados podem ser distintas daquelas que expressam genes IgVH mutados, sendo isto sinal de diferenciação e transcrição de um pequeno número, embora fundamental, de genes. Um desses genes codifica a proteína ZAP-70, que é uma proteína kinase (PTK) predominantemente envolvida com o receptor de célula T (TCR); apesar de antes acreditar-se ser exclusiva destas células; recentemente, tem se mostrado estar envolvida com receptor de célula B (BCR) sinalizando pior prognóstico em LLC/LL22- 26 e, ainda, em fases mais precoces de desenvolvimento de linfócitos B, provavelmente entre a transição de célula pró-B para pré-B27-29. O gene ZAP-70 localiza-se no cromossomo 2q11.2 e é composto de 14 éxons, que codificam uma proteína de mesmo nome, a qual compreende três domínios, dois Scr homólogos (SH2) na posição amino-terminal e um tirosino-kinase, carboxi-terminal. Os dois domínios SH2 são separados pelo interdomínio A, e o interdomínio B os conecta à porção tirosino-kinase. A proteína ZAP-70 pode estar normalmente expressa, assim como CD513, em células B tonsilares e esplênicas, com fenótipo ativado, em células pró-B da medula óssea, pulmão e células epiteliais, além das células B tumorais de LLC/LL, leucemia linfoblástica aguda, linfoma das células do manto, linfoma de Burkitt e linfoma da zona marginal nodal30. ZAP-70 foi o primeiro marcador reconhecido como potencial preditor do estado mutacional IgVH, uma vez que o comportamento clínico de progressão da doença é bem distinto entre Introdução 26 pacientes com e sem sua expressão. As células ZAP-70 positivas são mais responsivas a sinais derivados do seu próprio microambiente, o que poderia promover fácil acesso e grande proliferação em centros pseudo-germinativos30, explicando em parte a natureza mais agressiva das LLC/LL ZAP-70 positivas; contudo, tais evidências ainda não podem ser provadas. Além disso, é sugerido que a proteína ZAP-70 não é restrita à sinalização do receptor de célula B e pode estar envolvida em outros mecanismos de sinalização, em alguns casos de LLC/LL29. Em relação ao estado de hipermutação somática do gene IgVH, outro fator prognóstico já identificado é o encurtamento de telômero; que, capaz de predizer a história replicativa da célula tumoral, ao traduzir maior atividade proliferativa, mostra- se mais curto nas células com estado não mutado de IgVH, resultante de maior atividade da telomerase1. LLC/LL deriva de uma maior predisposição genética dentre as neoplasias hematológicas, sendo a predisposição familiar documentada em 5-10% dos pacientes, baseada em achados em dois ou mais casos na mesma família. O risco é 2-7 vezes maior em parentes de primeiro grau e a idade ao diagnóstico costuma ser menor que 40 anos. Cerca de 80% dos casos tem anormalidades genéticas detectadas por FISH (devido à sua maior sensibilidade em relação à citogenética convencional)4. Até 50% dos pacientes têm del 13q14.3, 20% apresentam trissomia do cromossomo 12 e, menos comumente, deleções de 11q22-23, 17p13 e 6q21, variando de acordo com o estado mutacional. Além dos fatores associados à própria célula tumoral e suas interações, o microambiente também parece ter importante papel na fisiopatogenia da LLC/LL. Após a fixação de biópsias de medula óssea, antes e depois do procedimento de descalcificação, estudos estruturais notaram desorganização celular, ativação de Introdução 27 fibroblastos, transformação de miofibroblastos, acúmulo de colágeno e matriz amorfa extracelular, como ocorre em várias outras neoplasias hematopoéticas31,32, sugerindo que proliferação policlonal de fibroblastos e acúmulo de matriz extracelular podem estar relacionados à inflamação resultante de excessiva morte celular. Alterações estromais da medula óssea foram estudadas em 96 pacientes com leucemia33, evidenciando variações de apresentação das fibras reticulínicas (escala de Bauermeister modificada, tabela 2), de colágeno tipo III, relacionadas à proliferação intramedular, abundância de capilares hiperplásticos e arteríolas, frequentemente vistos em leucemias linfóides, além de aumento focal de impregnação argêntica em leucemias agudas indiferenciadas. Nas neoplasias mieloproliferativas, sobretudo na Mielofibrose Primária, a fibrose representa um processo reativo mediado por citocinas produzidas pelos componentes celulares da proliferação clonal34. A angiogênese tem significado fisiopatológico na biologia das células de LLC/LL, inclusive com implicações prognósticas35-37, e até certa redução do número de neovasos já foi observada em pacientes com LLC/LL tratados com fludarabina37. ������� � � ������ ��� ���� ������ � ����������� )� �� � ��� ��� ��) �������� � �7������ ��� ��� ��� ��� ����������.�������������++�/��� 8� ��� � �� ��� � ��� ����� ������������ � +� ������� ��� �������������������� ������ �� 9�� ������������������������������ �� 9�� ����������� �������������� �)� ���������� ����������������� �:��� �� ;� 9�� ��������������)���������������������������� �� 9�� ����������������� ����������������:����� Nem todos os serviços de diagnóstico têm acesso a metodologias de alto custo, como citometria de fluxo, FISH, cariótipos, entre outros; entretanto, muitos Introdução 28 protocolos diagnósticos e prognósticos em doenças onco-hematológicas são descritos com estas tecnologias. Uma vez que em LLC/LL tem-se admitido melhor evolução clínica de pacientes tratados em estadiamento precoce, desde que, apesar de assintomáticos, tenham fatores de pior prognóstico13,17,39, fazem-se necessários estudos de metodologias já utilizadas na rotina diagnóstica, como impregnação argêntica de Gomori em BMO e análise imuno-histoquímica, como ferramentas alternativas na determinação de fatores evolutivos e prognósticos nas doenças linfoproliferativas. Em nosso Serviço, a inclusão do coágulo proveniente do aspirado de medula óssea é usada, de longa data, como fonte de material para avaliação morfológica. Assim, objetivamos avaliar a importância da expressão de ZAP-70 por imuno-histoquímica em biópsia de medula óssea, comparado à técnica de citometria de fluxo, e identificar possíveis correlações com evolução clínica, risco de progressão ao diagnóstico e alterações do arcabouço reticulínico; além da magnitude dos dados que podem ser extraídos de amostras histológicas da citoinclusão do coágulo de medula óssea. Objetivos 29 OBJETIVOS GERAIS Avaliar pacientes com diagnóstico de leucemia linfóide crônica quanto a dados clínicos admissionais, evolução clínica, achados laboratoriais de aspirado e biópsia de medula óssea, bem como estabelecer possíveis correlações clínico- morfológica, histoquímica e imuno-histoquímica, nestes doentes, baseando-se em fatores prognósticos estudados na literatura. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1) Caracterizar, clínica e laboratorialmente, através de estudo retrospectivo, os achados admissionais de pacientes com LLC/LL, assistidos por estas Instituições nos últimos 28 anos; 2) Correlacionar evolução clínica com fatores prognósticos, descritos na literatura, identificados nestes pacientes; 3) Identificar possível relação entre variações da coloração argêntica, evolução clínica e prognóstico dos pacientes com diagnóstico de LLC/LL; 4) Estabelecer a importância do arcabouço reticulínico como possível marcador prognóstico; 5) Estudar a correlação entre pesquisa de ZAP-70 por imuno-histoquímica e citometria de fluxo, nos pacientes atendidos no Hospital Amaral Carvalho; 6) Estabelecer o valor da impregnação argêntica nos cortes histológicos de coágulo e BMO como possível preditor da imunoexpressão do ZAP-70; Objetivos 30 7) Correlacionar a imunoexpressão do marcador ZAP-70 com os graus de reticulina (colágeno III), nos fragmentos de biópsia de medula óssea (BMO) e coágulo de MO; 8) Avaliar a eficácia da imunoexpressão do ZAP-70 pesquisado em coágulo de MO; 9) Avaliar a importância da pesquisa do ZAP-70 por imuno-histoquímica, no coágulo de medula óssea (MO) e correlacionar com evolução clínica (prognóstico). Casuística e Métodos 31 CASUÍSTICA E MÉTODOS Inicialmente, foram identificados os registros de 225 pacientes com diagnóstico de LLC/LL, de acordo com os critérios diagnósticos clínicos e morfológicos admitidos na literatura, sendo 216 atendidos pelo Serviço de Hematologia da Universidade Estadual Paulista e nove pelo Departamento de Hematologia/Oncologia do Hospital Amaral Carvalho – Jaú, entre maio de 1980 e maio de 2008. Deste total, eram disponíveis para análise prontuários completos de 87 pacientes, dos quais 79 amostras de medula óssea eram avaliáveis e oito, material insuficiente; 138 pacientes tinham apenas os dados clínicos da admissão, dos quais 83 amostras de medula óssea eram analisáveis e 55, material insuficiente (figura 1). �� 9��� ��� �4�������������� ������ HAC: Hospital Amaral Carvalho – Jaú; UNESP: Universidade Estadual Paulista; MI: material insuficiente. De 79 pacientes, foram revisados prontuários médicos, para obtenção de dados clínicos (idade, gênero, etnia, presença de sintomas constitucionais – definidos como febre, sudorese noturna e/ou perda ponderal maior que 10% do peso usual em seis meses – além de dados do exame físico), laboratoriais de admissão (hemograma, marcadores de carga tumoral e síndrome de lise tumoral), evolução 225 pacientes 9 HAC 216 UNESP 138 dados clínicos iniciais 87 prontuários completos NN == 116622 55 MI 79 MO avaliáveis 8 MI 83 MO avaliáveis Casuística e Métodos 32 clínica e terapêutica, conforme ficha de avaliação (apêndice 1), desenhada a partir de revisão da literatura. De 162 pacientes, dos quais eram disponíveis os blocos de parafina de citoinclusão do coágulo de aspirado de medula óssea (AMO) e/ou biópsia de medula óssea (BMO) ao diagnóstico, foram revistas, em caráter duplo-cego, por dois observadores, simultânea ou separadamente, as lâminas de AMO e BMO, para avaliação de celularidade/gordura – hipo (< 20% de celularidade), normo (20 – 50%) ou hipercelular (> 50%); grau (percentual relativo à celularidade) e padrão de infiltração (nodular/intersticial ou difuso maciço); presença de formação de pseudofolículos e prolinfócitos; grau de impregnação argêntica (tabela 2) e estudo imuno-histoquímico do marcador ZAP-70 (positividade requerendo 20% ou mais das células neoplásicas coradas, padrão nuclear). Nove destes pacientes tinham pesquisa de ZAP-70 também por citometria de fluxo (cujo critério de positividade é semelhante ao adotado na técnica de imuno-histoquímica). Procedimentos para Coleta de Medula Óssea (MO)40 A coleta de MO foi realizada de acordo com os seguintes procedimentos: Escolha da Topografia de coleta: - Esternal: na linha longitudinal mediana do manúbrio esternal, um centímetro abaixo da fúrcula, com paciente em decúbito dorsal horizontal (para AMO de adultos); - Crista ilíaca póstero-superior: paciente posicionado em um dos decúbitos laterais, com coxas e pernas fletidas (para BMO em qualquer idade). Casuística e Métodos 33 Antissepsia e anestesia: - Desnudamento da área escolhida; - Antissepsia local com álcool iodado/cloroexidina e gaze estéril, colocação de campo oftálmico, também estéril, sobre a área; - Anestesia local com injeção de 1 ml de cloridrato de lidocaína, utilizando-se seringa plástica e agulha de insulina descartáveis. Realização de AMO: - Utilização de agulha de aço inoxidável hipodérmica com mandril, tamanho 40 x 12, estéril, introduzida perpendicularmente ao esterno ou na crista ilíaca póstero-superior, através de movimentos rotatórios, atingindo- se a MO; - Retirada do mandril da agulha, com conexão de seringa plástica descartável ao canhão da mesma. Aspiração de aproximadamente 1ml de MO; - Realização de 6 a 8 esfregaços de MO em lâminas de vidro para microscopia óptica, secos em ar ambiente; - Colocação do coágulo de MO, excedente aos esfregaços, em frasco de vidro identificado, contendo formol tamponado. Encaminhamento dos respectivos materiais: - Os materiais citológicos (lâminas de esfregaços e imprints), juntamente com o pedido de mielograma, foram entregues no Laboratório de Citologia Casuística e Métodos 34 e Citoquímica da Disciplina de Hematologia, para os procedimentos de rotina; - Os materiais histológicos (coágulo e fragmento de BMO), juntamente com o pedido de exame anátomo-patológico, foram entregues no Departamento de Patologia para o mesmo fim. Processamento do material citológico (esfregaços e imprints) no Laboratório de Citologia e Citoquímica da disciplina de Hematologia Depois de secas, duas lâminas de esfregaço e duas de imprints de cada caso foram coradas pelo Leishman. As lâminas foram analisadas, sob aspectos qualitativos e quantitativos, quanto à celularidade global, compartimentos celulares (eritróide, granulocítico, megacariocítico e imune-estromal) e presença de elementos estranhos à MO, seguindo normas de rotina hematológica, com elaboração de laudo de mielograma. Os parâmetros normais de MO seguiram o estabelecido por Perkins41 para pacientes da faixa etária em estudo. Em cada laudo foram registrados dados de identificação do doente, incluindo nome, registro hospitalar, idade, diagnóstico e código do arquivo (inicial do último sobrenome do doente seguido de número arábico, em ordem crescente, único para cada paciente). Após análise, as lâminas citológicas foram arquivadas em cartelas de cartolina contendo os respectivos códigos de arquivo de cada caso. Lâminas histológicas correspondentes aos esfregaços e imprints (coágulos de AMO e fragmentos de BMO, respectivamente) foram fornecidas pelo Departamento de Patologia e também arquivadas nas mesmas cartelas. Lâminas citológicas Casuística e Métodos 35 excedentes, não coradas, foram acondicionadas em papel alumínio e guardadas para eventuais estudos adicionais. Os laudos elaborados, também codificados, de todos os casos, tiveram uma via encadernada em livros de laudos de mielogramas, na exata cronologia em que as respectivas MO foram colhidas e outra via encaminhada para o prontuário do paciente. Os arquivos de laudos e de lâminas de MO, da disciplina de Hematologia, permitiram a identificação e estudo cito-histológico dos pacientes desse estudo. Processamento do material histológico pelo Departamento de Patologia Os coágulos de AMO e fragmentos de BMO, colhidos dos pacientes, foram recebidos na sala de macroscopia do Departamento de Patologia, sendo colocadas em solução fixadora contendo mistura de álcool etílico a 80%, formol a 40%, ácido pícrico e ácido acético glacial, por 12 horas. A seguir, os fragmentos de BMO foram descalcificados em ácido nítrico a 7% durante uma hora. Tanto os materiais descalcificados (BMO) quanto os coágulos de AMO, que não necessitam de descalcificação, foram incluídos em blocos de parafina, procedendo-se a cortes histológicos de três a cinco micrômetros de espessura, em micrótomos marca Microtome, modelo 820, ou marca Leica, modelo RM 2145. Montaram-se lâminas histológicas de vidro para microscopia óptica, coradas pela hematoxilina-eosina (HE), impregnação argêntica de Gomori (retículo, anexo 2) e imuno-histoquímica anti-ZAP-70 (anexo 3). Após, os materiais foram recobertos por lamínula de vidro e analisados em microscópios ópticos daquele Departamento. O laudo descritivo teve uma via arquivada em livros de biópsia até Casuística e Métodos 36 1997 (em ordem cronológica exata de coleta) e arquivo digital a partir de então, e outra via encaminhada ao prontuário do paciente. As lâminas foram arquivadas no Departamento de Patologia. Revisão e análise das lâminas citológicas e histológicas de MO Os materiais citológicos (esfregaços e/ou imprints), corados pelo Leishman, foram revisados e analisados quanto à representatividade do material, celularidade, grau de linfocitose, formação de agregados linfóides, presença de prolinfócitos e citologia das células neoplásicas. As lâminas histológicas correspondentes (coágulo e/ou fragmento de BMO), coradas pela HE, foram revisadas e estudadas conforme critérios já descritos. Aquelas coradas através de impregnação pela prata foram revisadas e analisadas segundo escala de Bauermeister modificada38 e aquelas coradas por técnica de imuno-histoquímica, quanto à positividade ou negatividade para marcação nuclear das células neoplásicas para ZAP-70. Como controle interno, de ocorrência da reação imuno-histoquímica, foram observados linfócitos T positivos, em todas as lâminas. Os campos de maior interesse de cada material, nas diferentes colorações, foram fotografados em fotomicroscópio marcas Jena-Zeiss e Olympus, com aumento final variando entre 100 a 1000 vezes. Para permitir o caráter cego do estudo, as lâminas histológicas de HE, retículo e imuno-histoquímica, do mesmo paciente, foram analisadas em momentos diferentes. Todos os dados clínicos e laboratoriais foram tabulados em planilha de Excel (Microsoft Excel 2008). Casuística e Métodos 37 A análise estatística utilizou os programas SigmaStat e MANAP, e baseou-se nos seguintes testes: a) Medidas descritivas de variáveis quantitativas; b) Teste de Kruskal-Wallis (SigmaStat) para análise de variância não paramétrica, usando intervalo de confiança de 95%; c) Teste de Goodman42,43 (MANAP) para estudo de contraste entre e dentro de populações multinomiais, utilizando-se letras minúsculas para indicar os resultados das comparações entre linhas, fixada a categoria de resposta; e letras maiúsculas, nas comparações das categorias de resposta, dentro da linha. Para a interpretação das letras, deve-se proceder da seguinte maneira: i) duas proporções seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula não diferem quanto às respectivas linhas, na categoria de resposta em consideração; ii) duas proporções seguidas de pelo menos uma mesma letra maiúscula não diferem quanto às respectivas categorias de resposta, dentro da linha em consideração. Todas as conclusões, no presente trabalho, foram discutidas em nível de 5% de significância. O presente estudo foi aprovado pelos comitês de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu (CEPFMB 92/08) e do Hospital Amaral Carvalho de Jaú (CEPFHAC 71/08). Resultados 38 RESULTADOS • Achados Clínico-Laboratoriais Dos 79 pacientes, 44/79 (55,7%) eram do sexo masculino, 68/79 (86,1%) de etnia branca, 32/79 (40,5%) foram identificados a partir de achado ocasional de linfocitose em hemograma de rotina; entretanto, 45/79 (57,1%) já apresentavam sintomas constitucionais e 58/79 (73,4%) tinham adenomegalias periféricas e/ou hepatoesplenomegalia ao diagnóstico. Segundo a classificação para estadiamento clínico de LLC/LL, modificada, de Rai (1977)12,13 e Binet (1982) 12,13, 15/79 (17,9%) tinham baixo risco para progressão de doença; 40/79 (51,3%), risco intermediário e 24/79 (30,8%), alto risco (figura 1). Com relação a comorbidades infecciosas à admissão, 18/79 (23,1%) chegaram com comprometimento infeccioso respiratório. Cinqüenta e um dos 79 pacientes (64,5%) tinham evidência de pico monoclonal em região de beta ou gamaglobulina, em eletroforese de proteínas séricas. A conduta clínica inicial foi de observação (“watch and wait”) em 17/79 (21,5%) casos e início de quimioterapia nos demais, sendo utilizados como esquemas terapêuticos: i) ciclofosfamida, vincristina e prednisona (CVP), a cada 21-28 dias, em 32/79 (40,5%) dos pacientes; ii), clorambucil em 27/79 (34,2%); e iii) corticoterapia em pulsos (dexametasona), em 3/79 (3,8%) dos casos. A evolução destes pacientes foi classificada em: a) remissão prolongada (sobrevida livre de doença em dois anos, sem necessidade de (re)introdução de quimioterapia); b) evolução para estádio de alto grau (Linfoma de Grandes Células/Leucemia Aguda, OMS); e c) refratariedade à terapêutica, com introdução de múltiplos esquemas quimioterápicos, conforme figura 2. Doze (15,2%) pacientes morreram, sendo 8/79 (10,1%) por causa relacionada a Resultados 39 LLC/LL. Apenas 4 (5,1%) pacientes perderam seguimento, por abandono de tratamento. Em relação ao estudo histológico da medula óssea, 3/79 (4,2%) pacientes tinham celularidade baixa (normal para idade); 31/79 (38,9%), intermediária e 45/79 (56,9%), alta/hipercelular (figuras 3 e 4). Quanto ao padrão de infiltração, a amostra foi dividida entre intersticial e/ou nodular (45/79 pacientes, 62,5%) e difuso/maciço (figuras 3 e 5). Vinte dos 79 pacientes (25,3%) apresentavam formação de pseudofolículos, com prolinfócitos, nas áreas de infiltração neoplásica da medula óssea (figura 6). Com relação à distribuição segundo graus de retículo na BMO, 19/79 (24,5%) pacientes apresentaram grau I (figura 7a); 28/79 (35,1%), grau II (figura 7c) e 32/79 (40,4%) tinham reticulina grau III (figura 7e). As medidas descritivas quanto à idade, tempo de evolução, leucometria, linfometria, desidrogenase lática (DHL), beta2microglobulina, ácido úrico, creatinina, glicemia e percentual de infiltração da MO dos participantes segundo as variáveis quantitativas analisadas são apresentadas na tabela 3. Refratariedade à QT Remissão prolongada Evolução alto grau Figura 1. Distribuição de pacientes de acordo com Estadiamento Clínico (Rai, Binet modificados). Rai III/IV - Binet C 30,8% Rai 0 Binet A 17,9% Rai I/II Binet B 51,3% 48,1% 15,2 36,7 Figura 2. Distribuição de pacientes de acordo com Evolução Clínica. Resultados 40 b Figura 4 – a: medula óssea hipocelular. BMO, HE, 200x; b: medula óssea normocelular. BMO, HE, 400x; c: medula óssea hipercelular. BMO, HE, 400x. �� �� �� Figura 5 – a: infiltração de medula óssea, padrão intersticial e nodular. BMO, HE, 400x. Figura 5 – b: infiltração de medula óssea, padrão difuso/maciço. BMO, HE, 400x. Figura 6 – formação de pseudofolículos na medula óssea. BMO, HE, 400x. 41 �� �� ��� � � <� ��� �� ��� �� ��� �� ��� �� �)� ��� �)� ��� ��� �� �� �� ��� �� �� ��� 5� �� ���� ��� �� � � �� �� � �� =� � ��� �& � � � ��� �� � �� �� � � � � �� ��� �� � ��� �� �� �� �� �� � � �� �� �� ��� ��� ��� �� � � ��� ��� ��� ��� ��� �� � �� �� >� �� � �� �� �? �� � � β �� ��� !�� "� ��� �� �� !�� � � � @� ��� �A ��� �� �� !�� � � � #� �� ��� ��� � �� !�� � � � $� ��� �� �� �� !�� � � � ��� ���� �� �� � �B � � �� �� %& �� ! �� � �' � +�� +� C+ +� �' +� (+ � +�� )� ��� +� +�� +� 2� � �+ � *D �E � ��� �� 2( � ��+ +� �+ C+ +� 2� �2 � �C '� ��; �� ��C +� +�' �� 'C �2+ � C+ � %� �� � � C2 � ;�+ +� �; ++ +� �) �+ �� �( �� ��� �� ;�( +� ��+ +� �+ +� '+ � �D �E � ��� �� )� � (�+ +� C' 22 +� 2; ++ +� 2� +� ��� )� C�( +� ��� �� �� C�) 2� (+ � � �� �� %� F�! �� � ') � �; �++ � �� C( ;+ � �� ++ ++ � �( ++ � �; �2+ � �� �C+ � ��) )� ;� �� �+ +� %G �� � C; �'� C�2 +� 2) �; (�) +� �' '� )�2 +� ;� )�2 +� ��) 2� 2�; +� ��� +� �� ��; (� )� �C� � =� & �� � + �� � � �� ��� C�( ( � C' �' ;�' +� ;' +� ;�� +� 2� )� ��; �� ��; �� +�; ;� 2C ��' � �� �)+ � Resultados 42 Figura 7 – Estudo histoquímico de impregnação argêntica de fibras de reticulina; a: grau I, BMO, 400x; b: grau I, AMO do caso anterior, 400x; c: grau II, BMO, 400x; d: grau II, AMO correspondente ao caso anterior, 400x; e: grau III, BMO, 400x; f: grau III, AMO correspondente ao caso e, 400x; g: detalhe de grande vaso, BMO, 400x; h: detalhe de fibras reticulínicas pericapilares, AMO, 400x. �� �� �� �� �� �� �� ,� 43 Resultados A análise de variância não paramétrica pelo teste de Kruskal-Wallis não mostrou significância estatística ao comparar idade, níveis de DHL e beta2microglobulina entre os diferentes graus de retículo na BMO. Pelo mesmo teste, níveis de linfometria e creatinina não variaram estatisticamente nos pacientes para os diferentes tipos de evolução clínica (anexo 4). Os estudos de associação entre: a) grau de retículo em BMO segundo: * gênero, * motivo do diagnóstico, * presença de sintomas constitucionais, * compromentimento de órgãos linfóides secundários, Figura 3. Distribuição de pacientes de acordo com Celularidade e Padrão de Infiltração da Medula Óssea. 44 Resultados * classificação clínica de Rai e Binet modificados, * celularidade, * padrão de infiltração da medula óssea; b) presença de infecção ao diagnóstico e pico monoclonal sérico segundo graus de retículo; c) grau de retículo em citoinclusão de coágulo de AMO segundo BMO; d) evolução clínica, óbitos relacionados a LLC/LL, padrão de infiltração, presença de pseudofolículos e prolinfócitos segundo risco (Rai e Binet modificados); foram realizados utilizando o teste de Goodman42,43 para contrastes entre e dentro de populações multinomiais e as tabelas resultantes, cujo intervalo de confiança foi menor que 95%, estão demonstradas no anexo 4. Os resultados significativos estatisticamente (p<0,05), são apresentados conforme as tabelas 4 a 7, a seguir: � � �������; ����� ������������ ������ �������������������������������H������.)*+�+2/� %���&������� ��- ����� 8� ���� 8� ����� 8� ������ �� �� �� ���� ��� ���� �� )�.���'�./��/� �+�.;2�;2./��/� ��2�.���)�./��/� ��� % ���� � �I� �!�&��� � )�.�����./��/� ��(�.�)��)./��/� �)�.2��2�./���� ��� a (letra minúscula): compara motivo do diagnóstico em um mesmo grau de retículo; A, B (letras maiúsculas): compara graus de retículo, dentro do mesmo motivo de diagnóstico. � � � �������2� ����� �������������� �������������� �������������)�� ������������ �������������H������.)*+�+2/� + �� ������������ � �� �� ���� �F�� �� ��������!�������� �� ��� ���� �� �� ����� ���� �"J���� �� ���.�2�++./��/� ���.;)�)�./��/� ���.�)��)./��/� ;;� =��� ��! ����� �����.)�;�./��/� �2�.22�2C./���� �+�.�)�+;./��/�� �)� a,b (letras minúsculas): compara padrões de infiltração dentro de um mesmo risco; A,B (letras maiúsculas): compara tipos de risco, dentro de um mesmo padrão de infiltração. � � � � 45 Resultados �������2� ����� �����������)�� ������������ ���������������H�������������H����������������� ����������� ��� �����.)*+�+2/� � �� ����� � ������� ��� ����� ���� �"J���� �� =��� ��! ����� �� �� 0 �F�� ���.';�C�/���� ��.�2��'/��/� ��� �����!�������� ���.2'���/��/� �2�.;��C)/��/� �C� ����� ���.2;�22/��/� �+�.;2�;2/��/� ��� a (letra minúscula): compara tipos de risco em um mesmo padrão de infiltração; A,B (letras maiúsculas): compara padrões de infiltração, dentro do estrato de risco em consideração. ������� C ����� �������� ��� ) ������� ��� )��������������� �� ) �����H������ .'1'/� �������� ��� ����������� ��� �����.)*+�+2/� � �� ����� � ������� ��� +�� ��� �+"+� �� 1��� �+"+� �� �� 0 �F�� ��.���+'./��/� ��+�.)C�(�./���� ��� �����!�������� (�.�2�++./��/� ��)�.)2�++./���� �C� ����� )�.���'�./��/� ��2�.C'��'./��/� ��� a (letra minúscula): compara estratos de risco entre presença ou ausência de pseudofolículos e prolinfócitos; A,B (letras maiúsculas): compara categorias de resposta (pseudofolículos e prolinfócitos), dentro de um mesmo grupo de risco. �������) ����� ������������������������������������ �������������H������.)*+�+2/� � �� ����� � �� ����� ��� ��!� ��� +������ � � �&���� ��� ������ �� ���� � ���� ���K� E � �� �� 0 �F�� ;�.�'�2)./��/� ��;�.�'�2)./��/� ��C�.;��'C./��/� �;� �����!�������� C�.�2�++./��/� �2�.�)�2+./��/�� �(�.;)�2+./���� ;+� ����� ��.'���./��/� ������+�.;��C)./���� ���.2+�++./���� ��;� a (letra minúscula): compara tipos de estratificação de risco em uma mesma forma de evolução clínica; A, B (letras maiúsculas): compara as formas de evolução clínica, dentro do mesmo risco. • Achados de Análise de AMO e BMO Dos 162 pacientes, em 101/162 (62,4%) foi possível análise da citoinclusão de coágulo de AMO em conjunto com a BMO (figura 8); 8/162 (5,2%) apresentaram celularidade baixa (normal para idade, figura 4a); 65/162 (40,0%), intermediária (figura 4b) e 89/162 (54,8%), alta/hipercelular (figura 4c); 103/162 Resultados 46 Figura 8 – a: infiltração de medula óssea, padrão difuso/maciço. AMO, HE, 400x. Figura 8 – b: infiltração de medula óssea, padrão difuso/maciço. BMO, HE, 400x. �� 47 Resultados (63,6%) tinham padrão de infiltração intersticial e/ou nodular (figura 5a) e 59/162 (36,4%), difuso/maciço (figura 5b), repetindo a mesma distribuição evidenciada quando a casuística era de 79 pacientes, na análise clínica conjunta. A presença de formação de pseudofolículos, com prolinfócitos (figura 6), nas áreas de infiltração neoplásica da medula óssea, ocorreu em 47/162 (28,9%). O estudo histoquímico de impregnação pela prata foi realizado em 115/162 (71,0%) pacientes e a distribuição, segundo graus de retículo na BMO, foi de 34/115 (29,6%) com grau I (figura 7a); 39/115 (33,9%), grau II (figura 7c) e 42/115 (36,5%, figura 7e) tinham reticulina grau III. 143/162 foram estudados quanto à expressão da proteína ZAP-70, pela técnica de imuno-histoquímica, tendo sido encontrados 26/143 (18,2%) positivos (figura 9). O estudo de associação entre: a) grau de retículo em BMO segundo: * celularidade, * padrão de infiltração da medula óssea; b) grau de retículo em citoinclusão de coágulo de AMO segundo BMO; c) estudo imuno-histoquímico de proteína ZAP-70 segundo: * grau de retículo em BMO; * grau de retículo em citoinclusão de coágulo de AMO; * presença de pseudofolículos e prolinfócitos; * padrão de infiltração de BMO; * celularidade; foi realizado utilizando teste de Goodman42,43 para contrastes entre e dentro de populações multinomiais e as tabelas resultantes, cujos resultados foram todos significativos estatisticamente (p<0,05), são apresentados conforme as tabelas 8 a 15, a seguir: Resultados 48 Figura 9 – Estudo imuno-histoquímico de expressão da proteína ZAP-70; a: ZAP-70 positivo, infiltração intersticial, em caso arquivado há 11 anos, BMO, 400x; b: ZAP-70 positivo, infiltração padrão difuso/maciço, BMO, 400x; c: ZAP-70 positivo, BMO, 400x; d: ZAP-70 positivo, AMO correspondente ao caso anterior, 400x; e: ZAP-70 negativo, controle interno de reação IHQ em linfócitos T, AMO, 400x. � � � �� � 49 Resultados �������' ����� ������������ ������ �����������/10% em 6 meses ( ) Adenomegalias ( ) Hepatomegalia ( )Esplenomegalia ( ) Infecções (Qual? ___________________________________________) ( ) Outros ____________________________________________________________ EXAMES COMPLEMENTARES INICIAIS Hb _____g/dl PQT _____/mm3 Glicemia _______mg/dl IgM ________ Ht _______% DHL _____UI/dl Ác. Úrico ______mg/dl IgG ________ GB ______/mm3 Beta2mic __ mg/dl Cdireto ( )+ ( )neg ( )NA IgE ________ Li ______/mm3 Creat ______mg/dl IgD __________ IgA ________ EPS ( )Pico monoclonal ( )alfa ( )beta1 ( )beta2 ( )gama Imagens (Rx tórax/ USG abdome/ TCs): _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ AMO/BMO (nº dos exames) – anexar cópias dos laudos CONDUTA INICIAL: ( ) Observar (“watch and wait”) ( ) Iniciar QT Esquema de quimioterapia (QT) utilizado e doses (mg/m2 ou em mg) 1º tratamento: ( )CVP; ( )Fludarabina; ( )Clorambucil; ( ) outros ____________________________________ POSOLOGIA: ()dose diária; ()altas doses em ciclos/cada 15 ou 21d; ()Outros _____________ EVOLUÇÃO: Tratamentos realizados (Siglas de esquemas de QT e doses (mg/m2 ou em mg); Nº de ciclos realizados; Intercorrências; Justificativas se troca de esquemas; Tempo fora de tratamento (FT); Data de reinício de tratamento; Causas de interrupção__________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ Infecções durante o tratamento ()Sim ()Não Sistemas acometidos_______________________ Causas de óbito ______________________________________________________________ Abandono de tratamento ( )Sim ( )Não COMORBIDADES ( ) HAS ( ) DM ( ) DPOC ( ) ICC ( ) Baixo nível sócio-econômico ( ) Etilismo ( ) Tabagismo Nome Registro UNESP Data de Admissão Data de Nascimento 84 An ex os /� �9 ��� �' � ���� �� �� ��� �� ��) ��� ��� �� �� �� �� �(� ��� ) ��� �� ��� �� ��� ��' �5 �� �� ��4 :�� ��� �� ;�� ��2 �� LL C : L eu ce m ia L in fo cí tic a C rô ni ca ; L L: L in fo m a Li nf oc íti co ; s Ig : I m un eg lo bu lin a de su pe rf íc ie ; c ic D 1: c ic lin a D 1; W : e xp re ss ão fr ac a, a lg um as v ez es n eg at iv a; V : e xp re ss ão va ri áv el ; K i6 7: ín di ce d e pr ol ife ra çã o m itó tic o. � � � � � � � � � � � � ��( '4 � �-� � 4� �( � 4� �+ � 4� �� � 4� )( � 4� �� � 4� �2 � 4� 2� 9< 4) � 4� �� �� 4� �+ � �� �C� �� ��� P� C) � �� /; ;� ��� �� �� 4� �' � (( 41 (( � Q � R� Q � Q � Q � R� 6� R� 6� Q � 3� 3� 6� *� +. � 3� 6� 6� (� �� �� ��� ' ��� ��� ��� ��� � R� R� R� R� R� 6� 3� 6� R� 3� 3� 3� 6� �+ 3; +. � 3� 6� 6� � ��� ��� �� �� �� R� R� R� R� Q � 6� R� 3� R� R� 6� 3� S� 23 �+ . � R� Q � 3� (�� ��� ��� ��M �� �� � )�7 ��� ��� �� � ��� �H� ��� ��� ��� �� �� � R� � R� � R� � R� � R� � 3� � 3� � 3� � R� � 6� � 3� � 3� � R� � 23 �+ . � � R� � 3� � 3� (�� ��� ��� ��< �� ��� R� R� R� R� R� 3� 3� R� R� 3� 3� 3� R� �+ 3; +. � 3� R� 3� (�� ��� ��9 ��� �� �� � R� R� R� R� R� 6� 3� 3� R� 3� R� R� R� 6� 3� 3� 3� (�� ��� �� (�� ��) ��� �� ��� ��� � � R� � R� � R� � R� � R� � 6� � 6� � 3� � 3� � 3� � 3� � 3� � R� � *2 . � � 3� � 6� � R� Anexos 85 /7 TL���O��:���������' �)� �����/���� ���0�����H������)� ��-�) ��������/ �7���������$��� �� � /)H�� �� ���)� �����:����� �� ,�� ������� ���� �U������ ��������� �� ����,�����H������� ������ �� ��� �������� ��� 8���� ���������� �� ����� ���� ��� )� ���������� ��� )��8����� +��.� )� � ��������� �/)H�� ���,�� ���� 8���� ����������� ��� ����� ��� �� ����� ���,����� ��� 8����� �98����� 2.� )� � ��������� ��� �����������������������,��)� ��������� �: ���������������.�)� ���������� � �� ������������ �U������ �� ��������������8��������� ��� ��)� �2������������)���� �� ����������,��������) ��������������)� � �����������������������8������������������ 7�����,�� �9� ���������������� ��������� �������� ��2.� )� �2�������������)H�����,������8�������������������� ������ ������������������������������� ������� �� ��+��.�)� ��2����������������������������H�����.�)� ���������� �/���U���������������� ����������� ���8�������