Douglas de Castro Agostinho Revisão da seção Virescentia do gênero Batrachospermum (Rhodophyta, Batrachospermales) São José do Rio Preto 2017 2 Douglas de Castro Agostinho Revisão da seção Virescentia do gênero Batrachospermum (Rhodophyta, Batrachospermales) São José do Rio Preto 2017 Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, área de Biologia e Sistemática de Microrganismos junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Prof. Dr. Orlando Necchi Junior 3 Revisão da seção Virescentia do gênero Batrachospermum (Rhodophyta, Batrachospermales) Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós- Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Prof. Dr. Orlando Necchi Júnior UNESP – São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Luis Henrique Zanini Branco UNESP – São José do Rio Preto Profª. Drª. Inessa Lacativa Bagatini UFSCAR – São Carlos Profª. Drª. Mariana Cabral de Oliveira USP – São Paulo Profª. Drª. Valéria Cassano USP – São Paulo São José do Rio Preto 14 de fevereiro de 2017 4 RESUMO A seção Virescentia do gênero Batrachospermum corresponde a espécies com aparência esverdeada e verticilos bem desenvolvidos, carposporófitos grandes produzidos isoladamente ou em pares e inseridos no eixo principal, ramos carpogoniais retos e curtos originados das células pericentrais ou células fasciculares proximais, e carpogônio com tricogínios alongados e pedicelados. O presente estudo teve como objetivo inferir as relações filogenéticas, bem como os limites de variação intra e interespecífico das espécies da seção Virescentia com base na análise morfológica e molecular, utilizando caracteres diagnósticos atualmente aceitos e dois marcadores moleculares: gene plastidial que codifica a subunidade grande da RUBISCO (rbcL – 1.282 pares de base, pb) e as regiões de “barcode” (664 pb) e “mini-barcode” (246 pb) do gene mitocondrial que codifica a subunidade 1 da citocromo c oxidase (cox1). Foram analisadas amostras provenientes das regiões biogeográficas neotropical, neártica e paleártica, além de exsicatas dos espécimes-tipo da seção provenientes do Herbário PC (Paris, França) e exsicatas de espécimes do Brasil e Japão. Análises baseadas nas sequências de rbcL, cox1 e “mini-barcode” foram congruentes, indicando níveis de divergência suficientes para distinguir espécies dentro da seção. Análises moleculares revelaram a seção Virescentia como monofilética e evidenciaram clados bem definidos, com nítida repartição biogeográfica e associados a uma divergência relativamente alta nas sequências entre estes grupos, o que sugere que as amostras das diferentes regiões do globo correspondem a, pelo menos, cinco espécies distintas: B. viride-brasiliense, B. vogesiacum, B. helminthosum, Batrachospermum sp.1 e Batrachospermum sp.2. O exame dos tipos nomenclaturais, bem como de amostras críticas na história do grupo, permitiu reconhecer dez espécies para a seção Virescentia com base em caracteres morfológicos diagnósticos e 5 distribuição biogeográfica: B. bakarense, B. crispatum, B. gombakense, B. gulbenkianum, B. transtaganum, B. helminthosum, B. viride-brasiliense, B. vogesiacum, Batrachospermum sp.1 e Batrachospermum sp.2. Palavras-chave: Batrachospermales, Batrachospermum, cox1, rbcL, sistemática, Virescentia 6 ABSTRACT Section Virescentia of genre Batrachospermum comprises species with a greenish appearance and well-developed whorls, carposporophytes are produced singly or in pairs along the main axis, carpogonial branches are straight and short, arise from pericentral cells or proximal fascicle cells and carpogonia are elongate with cylindrical and pedicellate trichogynes. The goals of this study were to infer the phylogenetic relationships, as well as the limits of intra and interspecific variation among the species of Virescentia section, based on morphological and molecular analyses, using the diagnostic characters currently accepted and two molecular markers: the plastidial gene that encodes the RUBISCO large subunit (rbcL – 1282 bp) and the “barcode” (664 bp) and “mini-barcode” (246 bp) regions of the mitochondrial gene cox1 that encodes the cytochrome c oxidase sub-unity 1. We analyzed samples from the neotropical, neartic and paleartic biogeographic realms and dried archival samples (type specimens) from PC Herbarium (Paris, France) and dried archival samples from Brazil and Japan. Analyses based on rbcL, cox1 and mini-barcode sequences were congruent and showed section Virescentia as a clear monophyletic group, with enough divergence to distinguish species among the section. Molecular analyses revealed the Virescentia section as monophyletic and showed well-defined clades, with distinct biogeographical distribution and associated with a relatively high divergence in sequences between these groups, suggesting that the samples of the different parts of the world correspond to at least five distinct species: B. viride-brasiliense, B. vogesiacum, B. helminthosum, Batrachospermum sp.1 and Batrachospermum sp.2. The examination of types, as well as critical samples in the history of the group, allowed to recognize ten species for the Virescentia section based on diagnostics morphological characters and biogeographic distribution: B. bakarense, B. crispatum, B. gombakense, B. gulbenkianum, B. transtaganum, B. 7 helminthosum, B. viride-brasiliense, B. vogesiacum, Batrachospermum sp.1 and Batrachospermum sp.2. Key index words: Batrachospermales, Batrachospermum, cox1, rbcL, Rhodophyta, systematics, Virescentia 8 Agradecimentos Agradeço à CAPES pela bolsa concedida. Ao Professor Orlando Necchi Junior pela orientação e apoio durante os anos de desenvolvimento do projeto e todos os anos de trabalho juntos. À Coordenação do PPG Microbiologia e aos funcionários da Seção de Pós-graduação, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas UNESP pelo encaminhamento dos expedientes nas várias etapas do Doutorado. Aos técnicos, alunos e funcionários do Departamento de Zoologia e Botânica pela ajuda e amizade durante o desenvolvimento da pesquisa. Ciro, Monica e Rogério pelas coletas realizadas para que este trabalho pudesse se concretizar e à professora Morgan Vis por disponibilizar amostras e tipos nomenclaturais. Aos amigos do Laboratório BETA pelo apoio e momentos de descontração. À meu pai Nivaldo, minha mãe Rosália, meus irmãos Maila e Túlio por todo apoio e incentivo. Muito obrigado! 9 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................... 10 1.1. Gênero Batrachospermum ................................................................................... 15 1.2. Conceitos de espécie e delimitação de espécie ................................................... 18 1.3. Hipóteses ............................................................................................................. 20 1.4. Objetivos gerais ................................................................................................... 20 2. Referências ................................................................................................................. 21 CAPÍTULO 1: Sistemática molecular da seção Virescentia do gênero Batrachospermum (Rhodophyta, Batrachospermales) ....................................................................................... 28 1. Introdução ................................................................................................................... 29 1.1. Análises moleculares em Batrachospermales...................................................... 29 1.2. DNA “barcoding” ................................................................................................ 31 1.3. “Mini-barcode” .................................................................................................... 33 1.4. Objetivos ............................................................................................................. 34 2. Materiais e Métodos ................................................................................................... 34 2.1. Preservação .......................................................................................................... 38 2.2. Análises Moleculares .......................................................................................... 38 2.2.1. Extração de DNA ....................................................................................... 38 2.2.2. Amplificação de DNA ............................................................................... 39 2.2.3. Eletroforese em gel de agarose .................................................................. 41 2.2.4. Purificação e quantificação dos produtos de PCR ..................................... 41 2.2.5. Sequenciamento e alinhamento ................................................................. 42 3. Resultados................................................................................................................... 48 3.1. Análises das sequências de rbcL ......................................................................... 48 3.2. Análises das sequências de cox1 ......................................................................... 54 3.3. Análises das sequências de “mini-barcode” ........................................................ 56 3.4. Análise combinada .............................................................................................. 58 4. Discussão .................................................................................................................... 59 5. Referências ................................................................................................................. 64 CAPÍTULO 2: Taxonomia da seção Virescentia do gênero Batrachospermum (Rhodophyta, Batrachospermales) .............................................................................................................. 70 1. Introdução ................................................................................................................... 71 1.1. Objetivos ............................................................................................................. 74 2. Materiais e Métodos ................................................................................................... 74 2.1. Preservação .......................................................................................................... 76 2.2. Análises Morfológicas ......................................................................................... 76 3. Resultados................................................................................................................... 78 3.1. Tratamento taxonômico ....................................................................................... 78 4. Discussão .................................................................................................................. 110 5. Referências ............................................................................................................... 114 CONCLUSÕES GERAIS .................................................................................................. 119 10 1. INTRODUÇÃO GERAL As algas vermelhas (Rhodophyta) representam um grupo antigo, sendo que seu mais antigo registro fóssil é datado de um período situado entre 1,267 bilhões de anos a 723 milhões de anos. A maioria das rodófitas habita ambientes marinhos (98%), mas muitos táxons bem conhecidos são de hábitats de água doce e nascentes de água quente e ácida. Certas algas vermelhas marinhas podem viver em profundidades onde a luz quase não penetra, como as algas crostosas calcificadas observadas a 268 metros de profundidade nas Bahamas (FRANCESCHINI et al., 2010). Também foram relatadas em florestas tropicais como membros de comunidades subaéreas (GURGEL & LOPEZ-BAUTISTA, 2007). Em regiões tropicais e subtropicais dos ecossistemas marinhos costeiros, Rhodophyta representa mais de 60% das espécies de macroalgas (NORTON et al., 1996). No Brasil, mais de 640 espécies de macroalgas marinhas são conhecidas ao longo da costa do país, sendo que as rodófitas somam mais de 390 espécies, correspondendo a cerca de 60% da diversidade de macroalgas (HORTA et al., 2001). As rodófitas continentais ocorrem geralmente em águas correntes e estão amplamente distribuídas em bacias de drenagem de regiões árticas a tropicais (NECCHI et al.,1999). No Brasil foram registradas aproximadamente 50 espécies de rodófitas continentais (NECCHI, 1989, 1990a; NECCHI et al., 1999). Rhodophyta é considerado grupo irmão das algas verdes (Chlorophyta) e também das glaucófitas (LOPEZ- BAUTISTA, 2010). Segundo Graham & Wilcox (2009), são estimados de 500 a 600 gêneros e pouco mais de 6.000 espécies de algas vermelhas e acredita-se que o número de espécies possa chegar a 20.000 (NORTON et al., 1996), devido às recentes descobertas de espécies crípticas. As algas vermelhas têm geralmente tamanho médio (alguns milímetros a algumas dezenas de centímetros). Elas raramente são unicelulares, quase sempre filamentosas, com os 11 filamentos se agregando muitas vezes em pseudoparênquima para formar lâminas ou tiras. São as únicas macroalgas que possuem representantes parasitas obrigatórios heterótrofos e, entre estes últimos, mais de 85% são adelfoparasitas, isto é, parasitas estreitamente aparentados a seu hospedeiro (FRANCESCHINI et al., 2010). As algas desempenham um papel fundamental nos ecossistemas aquáticos como produtores primários e, portanto, como fonte de alimento, produção de oxigênio e ciclagem de nutrientes (BLANCK et al., 1984). Além de sua importância evolutiva e ecológica, as rodófitas apresentam grande importância econômica, movimentando mais de dois bilhões de US dólares por ano, principalmente como alimento humano ou para a extração de substâncias químicas de natureza diversa, como os ficocoloides (ARMISEN, 1995). Rodófitas não possuem clorofilas b e c, mas contêm ficobiliproteínas (aloficocianina, ficocianina e ficoeritrina) na forma de ficobilissomos em tilacoides não empilhados (GRAHAM & WILCOX, 2009). Os membros desse grupo não apresentam flagelos e centríolos em nenhum estágio de vida (GABRIELSON et al., 1990; GRAHAM & WILCOX, 2009). O cloroplasto é envolto por duas membranas e produz amido das florídeas, que é armazenado no citoplasma. Há evidências que o cloroplasto das algas vermelhas originou-se através da endossimbiose primária de uma cianobactéria, sendo que essa organela compartilha um ancestral comum com as algas verdes e glaucófitas (BHATTACHARYA & MEDLIN, 1995; DELWICHE et al., 1995; CAVALIER-SMITH, 1998; MCFADDEN, 1999; BHATTACHARYA et al., 2004; RODRIGUEZ-EZPELETA et al., 2005). Tradicionalmente, o filo Rhodophyta era dividido em duas classes ou subclasses, Bangiophyceae (Bangiophycidae) e Florideophyceae (Florideophycidae), baseado nas características morfológicas e histórico de vida (GARBARY & GABRIELSON, 1990). No entanto, estudos recentes baseados em filogenia molecular concluíram que Florideophyceae forma um grupo monofilético com a ordem Bangiales, que pertence à classe Bangiophyceae 12 (OLIVEIRA & BHATTACHARYA, 2000; MULLER et al., 2001; YOON et al., 2002; SAUNDERS & HOMMERSAND, 2004). Bangiophyceae, que no passado foi divida em seis ordens (Bangiales, Cyanidiales, Compsopogonales, Erythropeltidales, Porphyridiales, e Rhodochaetales), atualmente é formada por uma série de grupos pequenos que definem as linhagens ancestrais das algas vermelhas (GABRIELSON et al., 1985; FRESHWATER et al., 1994; RAGAN et al., 1994). É composta pelo grupo ancestral que deu origem às Florideophyceae e ao cloroplasto das algas cromófitas através de endossimbiose secundária (BHATTACHARYA & MEDLIN, 1995; OLIVEIRA & BHATTACHARYA, 2000) e constitui um grupo parafilético (FRESHWATER et al., 1994; RAGAN et al., 1994; MULLER et al., 2001). Florideophyceae é monofilética e inclui 99% dos gêneros de algas vermelhas. Apresenta uma maior complexidade morfológica e de histórico de vida e é claramente definida por uma dupla sinapomorfia: a presença de filamentos gonimoblásticos e de tetrásporos no ciclo de reprodução (FRESHWATER et al., 1994; RAGAN et al., 1994; FRANCESCHINI et al., 2010). Muller et al. (2001) compararam sequências do gene nuclear que codifica a subunidade ribossômica pequena (SSU rDNA) para vinte membros de Bangiophycidae e de dois membros de Florideophycidae para obter informações sobre a evolução do grupo. Com base em suas análises eles mostraram que o filo Rhodophyta é formado por duas classes, Florideophyceae e Bangiophyceae, sendo este ultimo composto por oito ordens: Bangiales, Porphyridiales (1, 2 e 3), Compsopogonales, Erythropeltidales, Rhodochaetales e Cyanidiales (Figura 1). Saunders & Hommersand (2004) utilizaram informações sobre filogenia molecular (marcadores SSU, rDNA e gene plastidial que codifica a subunidade grande da RuBisCO – rbcL), diversidade morfológica e registro fóssil das algas vermelhas para revisar a taxonomia do grupo, propondo a criação do sub-reino Rhodoplantae com dois filos, Cyanidiophyta e Rhodophyta, sendo o último subdividido nos subfilos Rhodellophytina 13 (classe Rhodellophyceae), Metarhodophytina (classe Compsopogonophyceae) e Eurhodophytina (classes Bangiophyceae e Florideophyceae) (Figura 1). No entanto, segundo Yoon et al. (2006), as Cyanidiophyta compartilham muitas características com Rhodophyta, e a criação de um sub-reino e dois filos não é necessária. Com base em resultados de múltiplos marcadores moleculares, Yoon et al. (2006) propuseram sete linhagens de Rhodophyta que devem ser reconhecidas como classes. Como as Cyanidiophyceae divergiram primeiro na evolução das rodófitas e são separadas das outras linhagens, foi proposto a criação dos subfilos Cyanidiophytina e Rhodophytina. Este último agrupa todas as demais linhagens de algas vermelhas e está subdividida nas classes Bangiophyceae, Florideophyceae, Compsopogonophyceae, Porphyridiophyceae, Rhodellophyceae e Stylonematophyceae, sendo que as duas primeiras formam um grupo monofilético (YOON et al., 2006) (Figura 1). Figura 1. Filogenia das algas vermelhas segundo autores recentes (YOON et al, 2006). Três esquemas da classificação das algas vermelhas para subfilos (caixas) e classes/ordens (sombreado) são representados. Florideophyceae apresenta 99% das espécies conhecidas, o equivalente a aproximadamente 6.000 espécies (GRAHAM & WILCOX, 2009) ou 6.805 segundo Guiry & 14 Guiry (2017). O número de ordens reconhecidas varia de 16 (YOON et al., 2006) a 23 (LE GALL & SAUNDERS, 2007) e tende a crescer com a realização de estudos de grupos específicos baseados em dados moleculares. A classificação das ordens e famílias de Florideophyceae é feita, em grande parte, com base nas características dos ciclos de vida e tipos de reprodução sexuada. Tais organismos crescem por meio de células apicais e consistem de filamentos ramificados nos quais as células estão ligadas através de “pit- connections” (conexões intercelulares entre células adjacentes), as quais, em nível ultraestrutural, formam os chamados “pit plugs” (GRAHAM & WILCOX, 2009). Caracteres ultraestruturais dos “pit plugs” são importantes para delimitação das ordens, tais como número e arranjo das camadas. Outra característica que também complementa a caracterização das ordens de rodófitas é a composição química da parede celular: ágar ou carragenana (FRESHWATER et al., 1994). Vários tipos de “pit-plugs” foram identificados por diferirem no número de “caplayers” (zero, um ou dois) e pela presença ou ausência de uma “capmembrane”. Nove ordens (Hildenbrandiales, Corallinales, Acrochaetiales, Palmariales, Batrachospermales, Ahnfeltiales, Bonnemaisoniales, Gracilariales e Rhodogorgonales) foram estabelecidas principalmente pelas características ultraestruturais dos “pit-plugs” (FRESHWATER et al., 1994). Dentre as ordens de Florideophyceae, Batrachospermales é distinta das demais com base em seu ciclo de vida heteromórfico (com presença da fase alternante denominada estágio ‘Chantransia’), ausência de tetrasporângio e ocorrência de meiose somática, “pit plug” com duas camadas (com a camada externa expandida e abaulada), e por ser estritamente de água doce (PUESCHEL & COLE, 1982; SHEATH, 1984). Segundo Saunders & Hommersand (2004), Batrachospermales é composta por três famílias: Batrachospermaceae, Lemaneaceae e Psilosiphonaceae. Entwisle et al. (2009) adotaram 15 apenas uma família (Batrachospermaceae) com circunscrição expandida (incluindo Lemaneaceae e Psilosiphonaceae). A estrutura básica dentro da ordem parecia bem estabelecida até Necchi & Entwisle (1990) questionarem se a classificação de vários táxons era informativa, consistente, e filogeneticamente coerente, e proporem uma revisão radical na classificação. Entwisle & Foard (1997) descreveram um grupo de espécies da Austrália e Nova Zelândia que não se encaixavam bem em nenhuma das seções de Batrachospermum descritas para o Hemisfério Norte, tornando claro que algumas mudanças seriam necessárias. Vis et al. (1998) publicaram a primeira árvore filogenética baseada em dados moleculares, indicando que uma nova reestruturação, com base nos dados morfológicos e citológicos, deveria ser proposta à luz dos novos dados moleculares. A proposta de Entwisle et al. (2009) representa o esquema taxonômico mais recente e atualizado para a ordem como um todo. A principal novidade, além do reconhecimento de uma única família (Batrachospermaceae com nove gêneros), foi o reconhecimento do gênero Kumanoa, resultado da elevação das antigas seções Contorta e Hybrida do gênero Batrachospermum. A elevação de grupos monofiléticos menores (geralmente reconhecidos como seções de Batrachospermum) para o nível gênero será a tendência na taxonomia do grupo nos próximos anos e o exemplo mais recente foi a proposição do gênero Sheathia (antiga seção Helminthoidea) (SALOMAKI et al., 2014). Seguindo essa mesma linha, a seção Setacea foi recentemente elevada para gênero (ROSSIGNOLO & NECCHI, 2016). 1.1. Gênero Batrachospermum Dentre as rodófitas continentais da ordem Batrachospermales, o gênero Batrachospermum (família Batrachospermaceae) é o mais especioso, com pelo menos 112 16 espécies reconhecidas mundialmente segundo Kumano (2002) e 98 segundo Guiry & Guiry (2016). O gênero é bastante diverso morfologicamente e distinto dos outros da ordem com base nas seguintes características: talo geralmente flácido, mais ou menos mucilaginoso e composto por distintos filamentos axiais com verticilos regulares e de ramos laterais de crescimento definido; carposporófitos (ausentes em B. brasiliense Necchi) esféricos ou semiesféricos, diretamente resultantes do carpogônio fecundado; e ramo carpogonial mais ou menos reto e radialmente simétrico (não torcido espiralmente ou fortemente curvado) (PUESCHEL & COLE, 1982; SHEATH, 1984; KUMANO, 2002; ENTWISLE et al., 2009). O gametófito macroscópico é dominante no histórico de vida e suas características são frequentemente utilizadas na discriminação taxonômica em nível específico. Batrachospermum apresenta reprodução oogâmica, onde o espermácio não-flagelado fecunda o carpogônio. Diferente de outras algas vermelhas de Florideophyceae, Batrachospermum e gêneros relacionados não apresentam tetrasporângio, mas possuem dois estágios esporofíticos (carposporófito e fase ‘Chantransia’) e um estágio gametofítico (SHEATH, 1984; KUMANO, 2002; SHEATH, 2003). A fase ‘Chantansia’ corresponde à fase tetrasporofítica do histórico de vida dos membros de Batrachospermales e Thoreales (NECCHI & ZUCCHI, 1997; PUESCHEL et al. 2000; ZUCCHI & NECCHI, 2003). Esta fase é morfologicamente indistinguível das Audouinella (Acrochaetiales). As algas vermelhas de águas continentais pertencentes ao gênero Batrachospermum podem ter importância como fonte de alimento e abrigo para invertebrados e também como bioindicadores de poluição antropogênica relativamente baixa (SHEATH & HAMBROOK, 1990; SHEATH et al., 1995; SHEATH et al., 1996). Espécies de Batrachospermum e outros membros de Batrachospermales não possuem propágulos resistentes à dessecação, o que pode limitar a capacidade de dispersão (SHEATH & HAMBROOK, 1990). Por outro lado, espécies de Batrachospermum foram reportadas para todo o globo, do ártico aos trópicos, e 17 algumas espécies apresentam ampla distribuição, tendo sido coletadas em mais de um continente (KUMANO, 2002). Estes organismos são tipicamente encontrados em ambientes bem oxigenados, aderidos a rochas ou a troncos lenhosos submersos e macrófitas (SHEATH, 1984). A estrutura taxonômica do gênero Batrachospermum sofreu modificações desde a monografia de Sirodot (1884). Nas décadas recentes, algumas categorias infragenéricas foram adicionadas: o subgênero Acarposporophytum Necchi, a seção Gonimopropagulum Sheath et Whittick e várias subseções das seções Aristata Skuja e Contorta Skuja (KUMANO, 2002). Houve certa revisão e rearranjo nomenclatural entre esses grupos (NECCHI & ENTWISLE, 1990; COMPÈRE, 1991) e algumas modificações taxonômicas maiores envolvendo sinonímias (VIS et al., 1995). No entanto, as unidades taxonômicas chave e princípios permaneceram relativamente estáveis. O gênero Batrachospermum tem sido demonstrado como parafilético em todos os estudos filogenéticos moleculares realizados (VIS et al., 1998; VIS & ENTWISLE, 2000; VIS et al., 2005; ENTWISLE et al., 2009). Há evidências convincentes desse parafiletismo (KAPRAUN et al., 2007) e em um estágio que não se pode mais ser taxonomicamente corrigido com pequenos ajustes. Entwisle et al. (2009) propuseram uma revisão da ordem Batrachospermales, que resultou na aceitação provisória do gênero Batrachospermum e reconhecimento de oito seções – Acarposporophytum, Aristata, Batrachospermum, Helminthoidea, Macrospora Kumano, Setacea De Toni, Turfosa Sirodot e Virescentia Sirodot. A maioria das seções carece de análises mais amplas incluindo número representativo de espécies e de populações de cada espécie. Salomaki et al. (2014) propôs a elevação da seção Helminthoidea para o nível de gênero com nome Sheathia. A elevação de grupos monofiléticos menores para o nível gênero parece ser a tendência recente na taxonomia do grupo e o exemplo mais recente foi a elevação da seção Setacea para o nível 18 gênero (ROSSIGNOLO & NECCHI, 2016). Em contrapartida, Entwisle et al. (2016) adotaram posição diferente, propondo um gênero amplo Nothocladus, incluindo a seção Setacea e vários grupos de espécies da Australásia. Os trabalhos taxonômicos recentes mais relevantes sobre o gênero resumem o conhecimento atual no nível de espécie e são brevemente comentados a seguir: Necchi (1990b) realizou revisão das espécies do gênero para o Brasil, incluindo descrições detalhadas de 29 espécies, sendo duas delas descritas como espécies novas para a Ciência. Sheath e Vis realizaram trabalhos de revisão para os grupos (seções) representados na América do Norte, com base em análises morfológicas detalhadas (SHEATH et al., 1992, 1993; SHEATH et al., 1994a; SHEATH et al., 1994b, c; SHEATH & VIS, 1995; VIS et al., 1995; VIS & SHEATH, 1996; VIS et al., 1996a, b); Entwisle (1992; 1993) e Entwisle & Foard (1997; 1999a; b; 2007) conduziram análises semelhantes para os grupos representados na Austrália e Nova Zelândia. Necchi (1990b) reconheceu três da seção Virescentia do gênero Batrachospermum para o Brasil (B. helminthosum, B. sirodotii e B. vogesiacum) com base em características morfológicas (número de células dos fascículos primários e abundância dos fascículos secundários). No entanto, em estudo posterior baseado em dados moleculares, Agostinho & Necchi (2014) demonstraram que essas espécies não apresentam divergência genética e correspondem a uma única espécie, identificada como B. viride- brasiliense. 1.2. Conceitos de espécie e delimitação de espécie O conceito morfológico de espécie baseia-se nas descontinuidades na variação morfológica para distinguir espécies. Por razões práticas, este conceito tem dominado a sistemática de algas por muitas décadas (JOHN & MAGGS, 1997; MANN, 1999). Embora as 19 descontinuidades na variação morfológica correspondam, em muitos casos, aos limites das espécies, a evolução morfológica convergente, a estase morfológica, a plasticidade fenotípica e o polimorfismo são fenômenos comuns que limitam a correspondência entre como uma espécie seria definida com base no conceito morfológico versus os conceitos evolutivo ou biológico espécie (VERBRUGGEN et al., 2009). Sabe-se que muitas espécies de algas exibem uma substancial variação morfológica intraespecífica, quer como resultado de polimorfismo controlado geneticamente ou de plasticidade ambientalmente induzida (LURLING, 2003; LOGARES et al., 2007). Ignorar esta variação morfológica intraespecífica pode resultar em uma superestimação da diversidade de espécies (TRAINOR, 1998; MACAYA & ZUCCARELLO, 2010). Por outro lado, as diferenças morfológicas entre duas espécies muitas vezes só surgem após decorrer tempo suficiente desde a divergência da linhagem e, portanto, as espécies recentemente divergentes são susceptíveis a permanecerem não detectadas (LELIAERT et al., 2014). Os dados filogenéticos moleculares revelaram numerosos casos de espécies (estreitamente relacionadas) que são morfologicamente indistinguíveis (ZUCCARELLO & WEST, 2003; DE CLERCK et al., 2005; FRASER et al., 2009; FUCIKOVA et al., 2011; GUTNER-HOCH & FINE, 2011; DEGERLUND et al., 2012; KUCERA & SAUNDERS, 2012; MONIZ et al., 2012; SOEHNER et al., 2012; PAYO et al., 2013; SOUFFREAU et al., 2013). Além disso, antigas linhagens crípticas foram detectadas em grupos de algas que são morfologicamente depauperados, apresentam seleção estabilizadora, ou estão sujeitos a evolução convergente em direção a morfologias reduzidas, tais como planctônicos unicelulares (DE VARGAS et al., 1999; SAEZ et al., 2003; ŠLAPETA et al., 2006; KRIENITZ & BOCK, 2012; ŠKALOUD & RINDI, 2013) e macroalgas marinhas (VERBRUGGEN et al., 2009; SUTHERLAND et al., 2011). 20 1.3. Hipóteses Com base nas informações atualmente disponíveis (morfológicas e moleculares) de representantes da seção Virescentia do gênero Batrachospermum em âmbito mundial, as seguintes hipóteses gerais serão testadas: 1. A seção Virescentia do gênero Batrachospermum constitui um grupo monofilético dentro da ordem Batrachospermales. Se a hipótese for corroborada, o reconhecimento desse grupo associado ao fato de Batrachospermum ser parafilético resultará na elevação dessa seção para o nível gênero; 2. Espécies novas, particularmente espécies crípticas e com padrão biogeográfico bem definido, deverão ser encontradas e reconhecidas como espécies distintas dentro deste grupo. 1.4. Objetivos gerais 1) Inferir as relações filogenéticas das espécies dentro da seção Virescentia do gênero Batrachospermum e com as de outras seções do gênero, bem como definir os limites de variação intraespecíficos com base na análise das sequências do gene rbcL e das regiões de “barcode” e “mini-barcode” do gene cox1. 2) Avaliar quais caracteres morfológicos tem valor diagnóstico, inclusive à luz dos novos dados moleculares, para caracterização das espécies da seção Virescentia e circunscrever as espécies reconhecidas na seção em âmbito mundial. 21 2. Referências AGOSTINHO, D. C.; NECCHI, O. J. Systematics of the section Virescentia of the genus Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in Brazil. Phycologia, v. 53, n. 6, p. 561-570, 2014. ARMISEN, R. World-wide use and importance of Gracilaria. Journal of Applied Phycology, v. 7, n. 3, p. 231-243, 1995. BHATTACHARYA, D.; MEDLIN, L. The phylogeny of plastids: a review based on comparisons of small-subunit ribosomal RNA coding regions. J. Phycol., v. 31, p. 489–98, 1995. BHATTACHARYA, D.; YOON, H. S.; HACKETT, J. D. Photosynthetic eukaryotes unite: endosymbiosis connects the dots. BioEssays, v. 26, n. 1, p. 50-60, Jan 2004. BLANCK, H.; WALLIN, G.; WÄNGBERG, S. Species-dependent variation in algal sensitivity to chemical compounds. Ecotoxicology and Environmental Safety, v. 8, n. 4, p. 339-351, 1984. CAVALIER-SMITH, T. A revised six-kingdom system of life. Biol Rev Camb Philos Soc, v. 73, n. 3, p. 203-66, Aug 1998. COMPÈRE, P. Taxonomic and nomenclatural notes on some taxa of the genus Batrachospermum (Rhodophyceae). Belg. J. Bot., v. 124, p. 21–6, 1991. DE CLERCK, O.; GAVIO, B.; FREDERICQ, S.; BARBARA, I.; COPPEJANS, E. Systematics of Grateloupia filicina (Halymeniaceae, Rhodophyta), based on rbcL sequence analyses and morphological evidence, including the reinstatement of G. minima and the description of G. capensis sp. nov. J. Phycol. , v. 41, p. 391-410, 2005. DE VARGAS, C.; NORRIS, R.; ZANINETTI, L.; GIBB, S. W.; PAWLOWSKI, J. Molecular evidence of cryptic speciation in planktonic foraminifers and their relation to oceanic provinces. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., v. 96, p. 2864-2868, 1999. DEGERLUND, M.; HUSEBY, S.; ZINGONE, A.; SARNO, D.; LANDFALD, B. Functional diversity in cryptic species of Chaetoceros socialis Lauder (Bacillariophyceae). J. Plankton Res., v. 34, p. 416-431, 2012. DELWICHE, C. F.; KUHSEL, M.; PALMER, J. D. Phylogenetic analysis of tufA sequences indicates a cyanobacterial origin of all plastids. Mol. Phylogenet., v. 4:1, p. 10–28, 1995. ENTWISLE, T. J.; FOARD, H. J. Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in Australia and New Zealand: new taxa and emended circumscriptions in sections Aristata, Batrachosperum, Turfosa and Virescentia. Austr. Syst. Bot. , v. 10, p. 331-80, 1997. 22 ENTWISLE, T. J.; FOARD, H. J. Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in Australia and New Zealand: new taxa and records in sections Contorta and Hybrida. Austr. Syst. Bot., v. 12, p. 615-33, 1999. ENTWISLE, T. J.; JOHNSTON, E. T.; LAM, D. W.; STEWART, S. A.; VIS, M. L. Nocturama gen. nov., Nothocladus s. lat. and other taxonomic novelties resulting from the further resolution of paraphyly in Australasian members of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta). J Phycol, v. 52, n. 3, p. 384-96, Jun 2016. ENTWISLE, T. J.; VIS, M. L.; CHIASSON, W. B.; NECCHI, O. J.; SHERWOOD, A. R. Systematics of the Batrachospermales (Rhodophyta) - a synthesis. J. Phycol., v. 45, p. 704- 15, 2009. FRANCESCHINI, I. M.; BURLIGA, A. L.; REVIERS, B. D.; PRADO, J. F.; RÉZIG, S. H. Algas: Uma abordagem filogenética, taxonômica e ecológica. Artmed Editora, 2010. ISBN 9788536321561. Disponível em: < https://books.google.com.br/books?id=XgEluMvQDZIC >. FRASER, C. I.; HAY, C. H.; SPENCER, H. G.; WATERS, J. M. Genetic and morphological analyses of the southern bull kelp Durvillaea antarctica (Phaeophyceae: Durvillaeales) in New Zealand reveal cryptic species. J. Phycol., v. 45, p. 436-443, 2009. FRESHWATER, D. W.; FREDERICQ, S.; BUTLER, B. S.; HOMMERSAND, M. H.; CHASE, M. W. A gene phylogeny of the red algae (Rhodophyta) based on plastid rbcL. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 91, n. 15, p. 7281-5, Jul 19 1994. FUCIKOVA, K.; RADA, J. C.; LUKESOVA, A.; LEWIS, L. A. Cryptic diversity within the genus Pseudomuriella Hanagata (Chlorophyta, Chlorophyceae, Sphaeropleales) assessed using four barcode markers. Nova Hedwigia Beih, v. 93, p. 29-46, 2011. GABRIELSON, P. W.; GARBARY, D. J.; SCAGEL, R. F. The nature of the ancestral red alga: inferences from a cladistic analysis. Biosystems, v. 18, p. 335–46, 1985. GABRIELSON, P. W.; GARBARY, D. J.; SOMMERFELD, M. R.; TOWNSEND, R. A.; TYLER, P. L. Phylum Rhodophyta. In: Handbook of Protoctista: The Structure, Cultivation, Habitats and Life Histories of the Eukayotic Microorganisms and Their Descendants Exclusive of Animals, Plants and Fungi. Jones and Bartlett Pub., Boston, 1990. GARBARY, D. J.; GABRIELSON, P. W. Taxonomy and evolution. In Biology of the Red Algae. Cambridge University Press, New York,, 1990. GRAHAM, L. E.; WILCOX, L. W. Algae. Prentice-Hall, New Jersey, 2009. GUIRY, M. D.; GUIRY, G. M. AlgaeBase. World-wide electronic publication. http://www.algaebase.org, 2016. Acesso em: 28 December. GURGEL, C. F. D.; LOPEZ-BAUTISTA, J. Red algae, In: Encyclopedia of Life Sciences. Wiley, Chichester, UK, 2007. 23 GUTNER-HOCH, E.; FINE, M. Genotypic diversity and distribution of Ostreobium quekettii within scleractinian corals. Coral Reefs, v. 30, p. 643-650, 2011. HORTA, P. A.; AMANCIO, E.; COIMBRA, C. S.; OLIVEIRA, E. C. Considerações sobre a distribuição e origem da flora de macroalgas marinhas brasileiras. Hoehnea, v. 28, p. 243- 265, 2001. JOHN, D. M.; MAGGS, C. A. Species problems in eukaryotic algae: a modern perspective. In: CLARIDGE, M. F.;DAWAH, H. A., et al (Ed.). Species: The Units of Biodiversity London: Chapman & Hall, 1997. p.83-107. KAPRAUN, D. F.; BRALY, K. S.; FRESHWATER, D. W. Nuclear DNAcontent variation in the freshwater red algal orders Batrachospermales and Thoreales. Phycologia, v. 46, p. 54– 62, 2007. KRIENITZ, L.; BOCK, C. Present state of the systematics of planktonic coccoid green algae of inland waters. Hydrobiologia v. 698, p. 295-326, 2012. KUCERA, H.; SAUNDERS, G. W. A survey of Bangiales (Rhodophyta) based on multiple molecular markers reveals cryptic diversity. J. Phycol. , v. 48, p. 869-882, 2012. KUMANO, S. Freshwater red algae of the world. Bristol, Biopress Ltd, p. 375 p, 2002. LE GALL, L.; SAUNDERS, G. W. A nuclear phylogeny of the Florideophyceae (Rhodophyta) inferred from combined EF2, small subunit and large subunit ribosomal DNA: establishing the new red algal subclass Corallinophycidae. Mol Phylogenet Evol, v. 43, n. 3, p. 1118-30, Jun 2007. LELIAERT, F.; VERBRUGGEN, H.; VANORMELINGEN, P.; STEEN, F.; LO´ PEZBAUTISTA, J.; ZUCCARELLO, G. C.; DE CLERCK, O. DNA-based species delimitation in algae. European Journal of Phycology, v. 49, p. 179-196, 2014. LOGARES, R.; RENGEFORS, K.; KREMP, A.; SHALCHIAN-TABRIZI, K.; BOLTOVSKOY, A.; TENGS, T.; SHURTLEFF, A.; KLAVENESS, D. Phenotypically different microalgal morphospecies with identical ribosomal DNA: A case of rapid adaptive evolution? Microb. Ecol., v. 53, p. 549-561, 2007. LOPEZ-BAUTISTA, J. M. Red algal genomics: A synopsis. Cellular Origin, Life in Extreme Habitats and Astrobiology. Springer; 1st Edition, 2010. 526. LURLING, M. Phenotypic plasticity in the green algae Desmodesmus and Scenedesmus with special reference to the induction of defensive morphology. Ann. Limnol., v. 39, p. 85-101, 2003. MACAYA, E. C.; ZUCCARELLO, G. C. DNA barcoding and genetic divergence in the giant kelp macrocystis (Laminariales). J. Phycol., v. 46, p. 736-742, 2010. MANN, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia v. 38, p. 437-495, 1999. 24 MCFADDEN, G. I. Plastids and protein targeting. J Eukaryot Microbiol, v. 46, n. 4, p. 339- 46, Jul-Aug 1999. MONIZ, M. B. J.; RINDI, F.; NOVIS, P. M.; BROADY, P. A.; GUIRY, M. D. Molecular phylogeny of Antarctic Prasiola (Prasiolales, Trebouxiophyceae) reveals extensive cryptic diversity. J. Phycol. , v. 48, p. 940-955, 2012. MULLER, K. M.; OLIVEIRA, M. C.; SHEATH, R. G.; BHATTACHARYA, D. Ribosomal DNA phylogeny of the Bangiophycidae (Rhodophyta) and the origin of secondary plastids. Am J Bot, v. 88, n. 8, p. 1390-400, Aug 2001. NECCHI, O., JR.; ZUCCHI, M. R. Systematics and distribution of freshwater Audouinella (Acrochaetiaceae, Rhodophyta) in Brazil. Eur. J. Phycol., v. 30, p. 209-18, 1995. NECCHI, O. J. Rhodophyta de água doce do estado de São Paulo: levantamento taxonômico. Bolm. Botanica, Univ. S. Paulo., v. 11, p. 11-69, 1989. NECCHI, O. J. Revision of the genus Batrachospermum Roth (Rhodophyta, Batrachospermales) in Brazil. Berlin: J. Cramer, 1990a. 201 ISBN 978-3-443-60011-2. NECCHI, O. J. Revision of the genus Batrachospermum Roth (Rhodophyta, Batrachospermales) in Brazil. Berlin; J. Cramer, p. 201 p. (Bibliotheca Phycologica, 84). 1990b. NECCHI, O. J.; BRANCO, C. C. Z.; BRANCO, L. H. Z. Distribution of Rhodophyta in streams from São Paulo State, southeastern Brazil. Algol. Stud. , v. 97, p. 43-57, 1999. NECCHI, O. J.; ENTWISLE, T. J. A reappraisal of generic and subgeneric classification in the Batrachospermaceae (Rhodophyta). Phycologia, v. 29, p. 478–88, 1990. NORTON, T. A.; MELKONIAN, M.; ANDERSEN, R. A. Algal biodiversity. Phycologia p. 35: 308-326, 1996. OLIVEIRA, M. C.; BHATTACHARYA, D. Phylogeny of the Bangiophycidae (Rhodophyta) and the secondary endosymbiotic origin of algal plastids. Am J Bot, v. 87, n. 4, p. 482-92, Apr 2000. PAYO, D. A.; LELIAERT, F.; VERBRUGGEN, H.; D’HONDT, S.; CALUMPONG, H. P.; DE CLERCK, O. Extensive cryptic species diversity and fine-scale endemism in the marine red alga Portieria in the Philippines. Proc. R. Soc. B, v. 280, 2013. PUESCHEL, C. M.; COLE, K. M. Rhodophycean pit plugs: an ultrastructural survey with taxonomic implications. Am. J. Bot., v. 69, p. 703–20, 1982. PUESCHEL, C. M.; SAUNDERS, G. W.; WEST, J. A. Affinities of the freshwater red alga Audouinella macrospora (Florideophyceae, Rhodophyta) and related forms based on ssu rrna gene sequence analysis and pit plug ultrastructure. Journal of Phycology, v. 36, n. 2, p. 433- 440, 2000. 25 RAGAN, M. A.; BIRD, C. J.; RICE, E. L.; GUTELL, R. R.; MURPHY, C. A.; SINGH, R. K. A molecular phylogeny of the marine red algae (Rhodophyta) based on the nuclear small- subunit rRNA gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 91, p. 7276–80, 1994. RODRIGUEZ-EZPELETA, N.; BRINKMANN, H.; BUREY, S. C.; ROURE, B.; BURGER, G.; LOFFELHARDT, W.; BOHNERT, H. J.; PHILIPPE, H.; LANG, B. F. Monophyly of primary photosynthetic eukaryotes: green plants, red algae, and glaucophytes. Curr Biol, v. 15, n. 14, p. 1325-30, Jul 26 2005. ROSSIGNOLO, N. L.; NECCHI, O. J. Revision of section Setacea of the genus Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) with emphasis on specimens from Brazil. Phycologia, v. 55, n. 4, p. 337-346, 2016. SAEZ, A. G. P., I.; GEISEN, M.; QUINN, P.; YOUNG, J. R.; MEDLIN, L. K. Pseudo- cryptic speciation in coccolithophores. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A, v. 100, p. 7163-7168, 2003. SALOMAKI, E. D.; KWANDRANS, J.; ELORANTA, P.; VIS, M. L. Molecular and morphological evidence for Sheathia gen. nov. (Batrachospermales, Rhodophyta) and three new species. J Phycol, v. 50, n. 3, p. 526-42, Jun 2014. SAUNDERS, G. W.; HOMMERSAND, M. H. Assessing red algal supraordinal diversity and taxonomy in the context of contemporary systematic data. Am J Bot, v. 91, n. 10, p. 1494- 507, Oct 2004. SHEATH, R. G. The biology of freshwater red algae. In Progress in Phycological Research. Biopress, Bristol, 1984. SHEATH, R. G. Freshwater Algae of North America: Ecology and Classification. In: WEHR, J. D. e SHEATH, R. G. (Ed.). Red Algae: Elsevier Science, 2003. p.197–224. ISBN 9780127415505. SHEATH, R. G.; HAMBROOK, J. A. The biology of the red algae. In: COLE, K. M. e SHEATH, R. G. (Ed.). Freshwater ecology: Cambridge University Press, New York., 1990. p.455–476. SHEATH, R. G.; MÜLLER, K. M.; COLBO, M. H.; COLE, K. M. Incorporation of freshwater Rhodophyta into the cases of Chironomid larvae (Chironomidae, Diptera) from North America. Journal of Phycology, v. 32, n. 6, p. 949-952, 1996. SHEATH, R. G.; MÜLLER, K. M.; LARSON, D. J.; COLE, K. M. Incorporation of freshwater Rhodophyta into the cases of caddisflies (trichoptera) from North America. Journal of Phycology, v. 31, n. 6, p. 889-896, 1995. SHEATH, R. G.; VIS, M. L. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 7. Section Hybrida. Phycologia, v. 34, p. 431-38, 1995. 26 SHEATH, R. G.; VIS, M. L.; COLE, K. M. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 1. Section Contorta. . J. Phycol., v. 28, p. 237-46, 1992. SHEATH, R. G.; VIS, M. L.; COLE, K. M. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 3. Section Setacea. J. Phycol., v. 29, p. 719-25, 1993. SHEATH, R. G.; VIS, M. L.; COLE, K. M. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 4. Section Virescentia. J. Phycol., v. 30, p. 108-17, 1994a. SHEATH, R. G.; VIS, M. L.; COLE, K. M. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 5. Section Aristata. Phycologia, v. 33, p. 404-14, 1994b. SHEATH, R. G.; VIS, M. L.; COLE, K. M. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 6. Section Turfosa. J. Phycol., v. 30, p. 872-84, 1994c. SIRODOT, S. Les Batrachospermes, Organisation, functions, Développément, Classifications. Libraire de Acade´mie de Médicine, Paris, 1884. ŠKALOUD, P.; RINDI, F. Ecological differentiation of cryptic species within an asexual protist morphospecies: A case study of filamentous green alga Klebsormidium (Streptophyta). J. Eukaryot. Microbiol., v. 60, p. 350-362, 2013. ŠLAPETA, J.; LOPEZ-GARCIA, P.; MOREIRA, D. Global dispersal and ancient cryptic species in the smallest marine eukaryotes. Mol. Biol. Evol., v. 23, p. 23-29, 2006. SOEHNER, S.; ZINSSMEISTER, C.; KIRSCH, M.; GOTTSCHLING, M. Who am I - and if so, how many? Species diversity of calcareous dinophytes (Thoracosphaeraceae, Peridiniales) in the Mediterranean Sea. Org. Divers. Evol. , v. 12, p. 339-348, 2012. SOUFFREAU, C.; VANORMELINGEN, P.; VAN DE VIJVER, B.; ISHEVA, T.; VERLEYEN, E.; SABBE, K.; VYVERMAN, W. Molecular evidence for distinct Antarctic lineages in the cosmopolitan terrestrial diatoms Pinnularia borealis and Hantzschia amphioxys. Protist v. 164, p. 101-115, 2013. SUTHERLAND, J. E.; LINDSTROM, S. C.; NELSON, W. A.; BRODIE, J.; LYNCH, M. D. J.; HWANG, M. S.; CHOI, H.-G.; MIYATA, M.; KIKUCHI, N.; OLIVEIRA, M. C.; FARR, T.; NEEFUS, C.; MOLS-MORTENSEN, A.; MILSTEIN, D.; MÜLLER, K. M. A new look at an ancient order: generic revision of the Bangiales (Rhodophyta). J. Phycol., v. 47, p. 1131-1151, 2011. TRAINOR, F. R. Biological aspects of Scenedesmus (Chlorophyceae) phenotypic plasticity. Nova Hedwigia Beih, v. 117, p. 1-367, 1998. VERBRUGGEN, H.; VLAEMINCK, C.; SAUVAGE, T.; SHERWOOD, A. R.; LELIAERT, F.; DE CLERCK, O. Phylogenetic analysis of Pseudochlorodesmis strains reveals cryptic 27 diversity above the family level in the siphonous green algae (Bryopsidales, Chlorophyta). J. Phycol., v. 45, p. 726-731, 2009. VIS, M. L.; CHIASSON, W. B.; SHEATH, R. G. Phylogenetic relationships of Batrachospermum species (Batrachospermales, Rhodophyta) from coastal streams in French Guiana. Phycologia, v. 44, p. 441-46, 2005. VIS, M. L.; ENTWISLE, T. J. Insights into the phylogeny of the Batrachospermales (Rhodophyta) from rbcL sequence data of Australian taxa. J. Phycol., v. 36, p. 1175-182, 2000. VIS, M. L.; SAUNDERS, G. W.; SHEATH, R. G.; DUNSE, K.; ENTWISLE, T. J. Phylogeny of the Batrachospermales (Rhodophyta) inferred from rbcL and 18S ribosomal DNA gene sequences. J. Phycol., v. 34, p. 341-50, 1998. VIS, M. L.; SHEATH, R. G. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 9. Section Batrachospermum: description of five new species. Phycologia, v. 35, p. 124-34, 1996. VIS, M. L.; SHEATH, R. G.; COLE, K. M. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 8a. Section Batrachospermum: Batrachospermum gelatinosum. Eur. J. Phycol., v. 31, p. 31-40, 1996a. VIS, M. L.; SHEATH, R. G.; COLE, K. M. Distribution and systematics of Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in North America. 8b. Section Batrachospermum: previously described species. Eur. J. Phycol., v. 31, p. 31-40, 1996b. VIS, M. L.; SHEATH, R. G.; ENTWISLE, T. J. Morphometric analysis of Batrachospermum section Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) type specimens. Eur. J. Phycol., v. 30, p. 35-55, 1995. YOON, H. S.; HACKETT, J. D.; PINTO, G.; BHATTACHARYA, D. The single, ancient origin of chromist plastids. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 99, n. 24, p. 15507-12, Nov 26 2002. YOON, H. S.; MÜLLER, K. M.; SHEATH, R. G.; OTT, F. D.; BHATTACHARYA, D. Defining the Major Lineages of Red Algae (Rhodophyta). J. Phycol., v. 42, p. 482-492, 2006. ZUCCARELLO, G. C.; WEST, J. A. Multiple cryptic species: Molecular diversity and reproductive isolation in the Bostrychia radicans/B. moritziana complex (Rhodomelaceae, Rhodophyta) with focus on North American isolates. J. Phycol. , v. 39, p. 948-959, 2003. 0 ZUCCHI, M. R.; NECCHI, O. J. Blue-greenish acrochaetioid algae in freshwater habitats are 'Chantransia' stages of Batrachospermales sensu lato (Rhodophyta). Cryptogamie, Algologie, v. 24, p. 117-131, 2003. 28 CAPÍTULO 1: Sistemática molecular da seção Virescentia do gênero Batrachospermum (Rhodophyta, Batrachospermales) 29 1. Introdução 1.1. Análises moleculares em Batrachospermales Vis et al. (1998) efetuaram a primeira tentativa de análise filogenética molecular de membros da ordem Batrachospermales com base na análise de sequências de dois marcadores: gene plastidial que codifica a subunidade grande da RUBISCO (rbcL) e gene nuclear que codifica a subunidade pequena do ribossomo (SSU rDNA). A representação de espécies de cada grupo dentro do gênero foi relativamente pequena e somente investigações mais recentes conduzidas por Morgan L. Vis e colaboradores (VIS & ENTWISLE, 2000; VIS et al., 2012) têm incluído maior número de espécies do grupo em análises filogenéticas moleculares, e referem-se especialmente ao gene rbcL. Hanyuda et al. (2004) realizaram análises biogeográfica e taxonômica de B. helminthosum no Japão, com base em sequências de rbcL de 27 populações coletadas em várias localidades e concluíram que houve uma recente dispersão dessa alga nas ilhas daquele país. Múltiplos marcadores moleculares têm sido utilizados para examinar padrões biogeográficos de B. helminthosum na América do Norte, incluindo o ISSR (“intersimple sequence repeats”), espaçador transcrito interno (ITS), gene plastidial rbcL e a região espaçadora das subunidades 2-3 da citocromo oxidase (cox2-3) (VIS et al., 2001; HALL & VIS, 2002; CHIASSON et al., 2003). Os dados de ISSR apresentaram níveis de variação semelhantes entre 11 localidades analisadas ao longo da região leste da América do Norte, sugerindo que cada segmento de riacho é distinto e contribui para a diversidade genética dessa espécie (HALL & VIS, 2002). As sequências de rbcL, ITS e cox2-3 foram congruentes entre si e forneceram maior 30 evidência da dispersão entre riachos do que os dados de ISSR, mas os dados que forneceram maior resolução filogeográfica foram os de cox2-3 (VIS et al., 2001; CHIASSON et al., 2003). Estudos combinando dados moleculares e morfológicos enfocaram apenas as relações filogenéticas entre os grupos maiores de Batrachospermales (gêneros ou seções) (FRESHWATER et al., 1994; VIS et al., 1998; VIS et al., 2005). Abordagens visando avaliar o número de espécies foram iniciadas recentemente e são, ainda, escassas. Nesse aspecto, até o presente, foi publicado apenas o tratamento monográfico do gênero Kumanoa (NECCHI & VIS, 2012; VIS et al., 2012). Os resultados encontrados para Kumanoa, bem como dados preliminares para outros grupos em fase inicial de estudo (gênero Sirodotia, LAM et al., 2012; e seções Turfosa e Virescentia de Batrachospermum) têm evidenciado tendências muito interessantes: a diversidade genética no nível específico tem sido muito maior do que a inicialmente prevista, isto é, um número consideravelmente maior de espécies tem sido encontrado em relação aos estudos anteriores, bem como ocorrência de espécies crípticas. Essas últimas têm sido reconhecidas com alto nível de divergência genética, porém sem a correspondente distinção morfológica, mas em alguns casos, apenas geográfica, como a ocorrência de linhagens distintas geneticamente, mas não morfologicamente, entre continentes (LAM et al., 2012). Essa tendência certamente levará à proposição futura de espécies com base exclusivamente em dados genéticos e/ou geográficos. Outra tendência que parece inevitável é a separação do gênero Batrachospermum em vários gêneros distintos, conforme ocorreu com os gêneros Kumanoa (ENTWISLE et al., 2009), Sheathia (antiga seção Helminthoidea) (SALOMAKI et al., 2014) e Setacea (seção recentemente elevada para nível de gênero) (ROSSIGNOLO & NECCHI, 2016). Em contrapartida, Entwisle 31 et al. (2016) adotaram posição frontalmente oposta, aceitando um gênero amplo Nothocladus, incluindo a seção Setacea e vários grupos de espécies da Australásia. 1.2. DNA “barcoding” A identificação e delimitação de espécies de algas vermelhas (Rhodophyta) são notoriamente difíceis devido a uma morfologia e anatomia relativamente simples e em muitos casos convergentes, grande plasticidade fenotípica e alternância de gerações heteromórficas no ciclo de vida (ROBBA et al., 2006). Devido a essas dificuldades, pesquisadores têm utilizado de forma crescente ferramentas moleculares para auxílio na taxonomia e biogeografia de algas (SAUNDERS, 2005). DNA “barcoding” é um método de identificação e reconhecimento de espécies utilizando sequências de DNA (HEBERT et al., 2003; HEBERT et al., 2004a; HEBERT et al., 2004b). A técnica de DNA “barcoding” é baseada na amplificação por PCR (“Polymerase Chain Reaction”) de um segmento de DNA relativamente curto (~400- 700 pares de base – pb) que pode ser inteiramente sequenciado com os mesmos dois oligonucleotídeos iniciadores (“primers”) usados na PCR. O sistema de DNA “barcoding” é prático e uniforme para identificação de espécies; além disso, os dados gerados possuem ampla aplicação, com grande utilidade em levantamentos de biodiversidade e em estudos de conservação (COSTION et al., 2011; PAZ & CRAWFORD, 2012). O método de DNA “barcoding” pode ser aplicado mesmo quando as técnicas tradicionais não são viáveis, como organismos em estado juvenil, espécies com alta plasticidade fenotípica ou fragmentos de espécimes (FLOYD et al., 2002; NEIGEL et al., 2007; GONZALEZ et al., 2009; EATON et al., 2010; LUMBSCH & LEAVITT, 2011). No caso das algas vermelhas, a presença de estruturas reprodutivas é 32 muitas vezes necessária para a identificação, e na ausência dessas, a determinação da espécie e até mesmo do gênero é impossibilitada (SAUNDERS, 2005). O DNA “barcoding” permite ainda a detecção de espécies crípticas e fornece dados que ajudam a entender a diversidade biológica e os mecanismos envolvidos nos processos de especiação (HEBERT et al., 2004a; SMITH et al., 2006; SMITH et al., 2007; BURNS et al., 2008; SMITH et al., 2008; HUBERT et al., 2012). Diferentes marcadores ou protocolos podem ser necessários em certos grupos taxonômicos, mas aparentemente não existem barreiras para a aplicação dessa metodologia em nenhum grupo de ser vivo (DESALLE et al., 2005; SAUNDERS, 2005; SMITH et al., 2006). O genoma mitocondrial é caracterizado por apresentar ampla distribuição entre os eucariotos, ser de herança materna (haploide), e por permitir projetar “primers” universais em porções restritas do gene. Estudos envolvendo DNA “barcoding” têm demonstrado grande potencial para sistemática em níveis específicos de algas vermelhas (SAUNDERS, 2005; ROBBA et al., 2006; SAUNDERS & MCDEVITT, 2012) e recebido grande atenção recentemente. A região de “barcode” do gene cox1 apresenta 664 pb (pares de bases), poucas inserções e deleções, porém com uma variabilidade suficiente para distinguir espécies (apresenta uma taxa relativamente elevada de divergência) (HEBERT et al., 2003; SAUNDERS, 2005). De acordo com os estudos feitos por Saunders (2005) e Robba et al. (2006), a região de “barcode” do gene cox1 (codifica a subunidade 1 da citocromo c oxidase) é capaz de delimitar espécies de algas vermelhas, podendo ser também utilizada para identificar espécies crípticas ou eventos recentes de especiação. Esta região de “barcode” tem sido aplicada como marcador clássico para estudos desse tipo, com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores e termociclos específicos para diferentes grupos (SAUNDERS, 2005; SAUNDERS & 33 MCDEVITT, 2012), apresentando níveis de variação suficientes e apropriados para avaliação de variabilidade genética específica em representantes de Batrachospermales (SHERWOOD et al., 2008). Assim, a utilização da região de “barcode” do gene cox1 como marcador molecular para reconhecimento de espécies está sendo intensamente utilizada em estudos mais recentes. 1.3. “Mini-barcode” O “mini-barcode” é um fragmento dentro da região de “barcode” do gene cox1 que apresenta, neste estudo, 246 pb. DNA “barcoding” busca desenvolver uma compreensiva biblioteca de sequências espécie-específica para os eucariotos (MARSHALL, 2005). Os 664 pb da citocromo c oxidase 1 (CO1, cox1) são facilmente sequenciados e proporcionam especificidade a nível de espécie acima de 97%. No entanto, o DNA “barcoding” convencional encontra dois problemas. Primeiro, a degradação do DNA em espécimes para arquivamento e materiais biológicos processados (por exemplo alimentos) frequentemente impedem a recuperação de fragmentos de PCR maiores que 200 pb, impedindo a recuperação do “barcode” (GOLDSTEIN & DESALLE, 2003; HAJIBABAEI et al., 2006; WANDELER et al., 2007). Segundo, abordagens atuais não podem ser usadas para uma análise compreensiva de amostras ambientais, pois uma alta variabilidade nas sequências necessita do uso de distintos “primers” para cada grande grupo taxonômico. É geralmente difícil recuperar, rapidamente e a baixos custos, sequências de “barcode” de espécimes de museus com mais de uma década, sendo que o DNA está degradado (WHITFIELD, 1999; HAJIBABAEI et al., 2005). Como resultado, a construção da biblioteca de “barcode” atualmente se concentra na análise de espécimes 34 coletados recentemente ou em amostras que foram protegidas da degradação por congelamento, álcool ou outro método de preservação de DNA. No entanto, acabará por ser necessário comparar sequências de amostras frescas com sequências de espécimes antigos de museus. Por exemplo, tal comparação é crítica quando o “barcoding” revela várias espécies crípticas dentro do que era visto como uma única espécie, não sendo morfologicamente evidente qual delas combina com o holótipo (HEBERT et al., 2004a; JANZEN et al., 2005). Igualmente, a validação final para um registro de “barcode” moderno deve envolver sua comparação com o registro de “barcode” do holótipo para aquela espécie. Além da necessidade de tais comparações, é evidente que o “barcoding” de espécimes antigos de museus irá fornecer uma maneira custo-efetiva de construir bibliotecas de “barcode” com ampla cobertura geográfica de táxons individuais. Enquanto a recuperação do “barcode” completo de sequências de espécimes antigos atualmente requer protocolos caros e demorados, pequenas sequências podem ser regularmente obtidas de espécies centenárias de museus utilizando protocolos de rotina (GOLDSTEIN & DESALLE, 2003). 1.4. Objetivos Inferir as relações filogenéticas das espécies dentro da seção Virescentia do gênero Batrachospermum e com as de outras seções do gênero, bem como definir os limites de variação intraespecíficos com base na análise das sequências do gene rbcL e das regiões de “barcode” e “mini-barcode” do gene cox1. 2. Materiais e Métodos 35 Foram analisadas 13 amostras de B. viride-brasiliense (Tabela 1), provenientes da região sul e sudeste do Brasil e incorporados ao Herbário do Departamento de Zoologia e Botânica (SJRP) (THIERS, 2016). Também foram utilizadas três exsicatas de B. viride-brasiliense (provenientes do Herbário do Instituto de Botânica – IB e do Herbário SPF da USP; códigos SP176771, SP177080 e SPF28546) e uma exsicata de Batrachospermum sp. 2, proveniente do Japão (Herbário do Laboratório de Ficologia, Kobe University). 36 Tabela 1. Relação das amostras de Batrachospermum viride-brasiliense, seção Virescentia utilizadas neste estudo. Espécie Código Local, coletor e data Acesso GenBank cox1 rbcL 1 – Batrachospermum viride- brasiliense CJ SP: Campos do Jordão, Ducha da Prata, 22º44’17’’S, 45º34’10’’W; M. Paiano, 15.xii. 2009 KM259993 KM078048 2 – Batrachospermum viride- brasiliense Prb SP: Paraibuna, Pousada Alto da Serra, Rio Negro, 23º33’48”W; 45º27’31”S; O. Necchi Jr., 03.ii.2006 KM259994 KM097031 3 – Batrachospermum viride- brasiliense Rpe PR: Guarapuava, Rio das Pedras, 25º15’00’’W; 51º20’00”S; R. A. Krupek, 26.x.2008 KM259996 KM097033 4 – Batrachospermum viride- brasiliense Mar PR: Guarapuava, Rio Lageado, Bacia do Rio Marrecas, 25º12’57,2’’W; 51º21’18,6”S; R. A. Krupek, 26.iii.2007 KM259995 KM097032 5 – Batrachospermum viride- brasiliense ES8 ES: Domingos Martins, Pedra Azul, Rio Tucú (Braço Norte) Rod. 165, Km 137, 20º19’15,7”W; 0,41º02’41,3”S; O. Necchi Jr., 19.vii.2006 KM259998 KM097035 6 – Batrachospermum viride- brasiliense FLI7 PR: Teixeira Soares, Floresta Nacional de Irati, próximo do viveiro; 25 o 24’16’’S, 50 o 35’28’’W, altitude 727m; O. Necchi Jr. & C.C.Z. Branco, 21.vii.2005 KM259999 KM097036 7 – Batrachospermum viride- brasiliense FLI9 PR: Teixeira Soares, Floresta Nacional de Irati, 400 m estr. principal, linha da Copel 1; 25 o 23’07’’S, 50 o 35’27’’W, altitude 806m; O. Necchi Jr. & C.C.Z. Branco, 19.vii.2005 KM260000 KM097037 8 – Batrachospermum viride- brasiliense SD2 SC: São Domingos, Parque Estadual das Araucárias, rio Jacutinga; 26 o 28’08’’S, 52 o 34’00’’W, altitude 698m; C.C.Z. Branco, 14.viii.2007 KM260001 KM097038 9 – Batrachospermum viride- brasiliense SD4 SC: São Domingos, Parque Estadual das Araucárias; 26 o 27’21’’S, 52 o 33’41’’W, altitude 687m; C.C.Z. Branco, 14.viii.2007 KM259997 KM097034 37 Tabela 1 (continuação). Relação das amostras de Batrachospermum viride-brasiliense, seção Virescentia utilizadas neste estudo. Espécie Código Local, coletor e data Acesso GenBank cox1 rbcL 10 – Batrachospermum viride- brasiliense SD8 SC: São Domingos, Parque Estadual das Araucárias; 26 o 28’48’’S, 52 o 34’32’’W, altitude 700m; C.C.Z. Branco, 15.viii.2007 KM260002 KM097039 11 – Batrachospermum viride- brasiliense Brt SP: Brotas, Parque dos Saltos; 22º17’30” S, 48º07’51W, D.C. Agostinho et al., 09.x.2012 KM260003 KM097040 12 – Batrachospermum viride- brasiliense PAS2 RS: Cambará do Sul, Parque Nacional de Aparados da Serra, Arroio Camisas, 29º10’44,5”W; 50º08’13,2”S, altitude 939 m; O. Necchi Jr., 10.vi.2009 KM260004 KM097041 13 – Batrachospermum viride- brasiliense PAS4 RS: Cambará do Sul, Parque Aparados da Serra, Arroio Perdizes; 29º09’29,4”W; 50º04’09,6”S, altitude 920 m; O. Necchi Jr., 10.vi.2009 KM260005 KM097042 38 2.1. Preservação As amostras destinadas às análises moleculares foram inicialmente secas com papel toalha para redução da umidade. Em seguida a secagem foi feita em sílica-gel, com troca por sílica seca após 24 horas, ou, em alguns casos, preservadas em etanol 100%. Após o acondicionamento em frascos devidamente marcados, as amostras foram armazenadas em freezer à temperatura de -20°C. 2.2. Análises Moleculares 2.2.1. Extração de DNA Cada amostra foi macerada com o uso de homogeneizador de tecidos marca Bertin (Bertin Technologies, Bordeaux, França), mod. Precellys®24 com duas microesferas de aço por tubo. As homogeneizações foram conduzidas em dois ciclos a 5.000 rpm durante 20s cada e intervalo entre os ciclos de 20s. O material obtido foi submetido à extração com uso dos kits de extração de DNA “Dneasy plant mini kit®” (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), “Nucleo Spin plant II mini kit” (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha), “Extract-N-AMP® Plant”, “Relia Prep®g DNA Tissue” (Promega, Madison, EUA) e “MO BIO” (Carlsbad, California), conforme os protocolos descritos pelos fabricantes. Após uso para as aplicações previstas, as amostras de DNA foram armazenadas em ultra-freezer “Sanyo” (Sanyo North American Corporation, San Diego, E.U.A.), VIP® SERIES (-86ºC), modelo MDF-U33V. 39 2.2.2. Amplificação de DNA As amplificações de segmentos específicos de DNA foram realizadas através da técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase). As reações de PCR para os marcadores moleculares rbcL, cox1 e cox1 “mini-barcode” foram conduzidas utilizando kits de PCR, todos para volume total de 25 μl e concentração de 40 ng/μL: “puReTaq Ready-to-go PCR beads” (GE HealthCare Life Sciences, Buckinghamshire, Reino Unido), “TopTaqTM Master Mix” (Qiagen, Hilden,Alemanha), “GoTaq® Colorless Master Mix” (Promega, Madison, EUA), PlatinumTM DNA Polimerase (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e “ThermoScientific” (Thermo Fisher Scientific, California, EUA). As misturas fornecidas nos kits contêm: dNTP (desoxinucleosídeos trifosfato), tampão de PCR e Taq polimerase. A essas misturas foram adicionados: água ultra-pura (bi- destilada e deionizada), oligonucleotídeos iniciadores (“primers”) 5’ e 3’ e DNA molde. Em cada reação de PCR foram feitos controles positivo e negativo. Foram utilizados os produtos de PCR do kit que apresentou os melhores resultados, verificados pela intensidade e clareza das bandas. As reações foram feitas em termocicladores “Techne Prime”, “Techgene TC-312” e “TC-512” (Techne, Burlington, Reino Unido). Todos os kits de extração e de amplificação de DNA citados anteriormente foram testados para as quatro amostras secas de herbário. Foram utilizados “primers” específicos para amplificar a região de “mini-barcode” do gene cox1. Os oligonucleotídeos iniciadores sintéticos 5’ e 3’ utilizados são descritos a seguir: - cox1 (SAUNDERS, 2005): GazF1 (5’ TCAACAAATCATAAAGATATTGG - 3’) e GazR1 (5’ ACTTCTGGATGTCCAAAAAAYCA – 3’) para amplificar um fragmento de 664 pb. 40 - cox1 “mini-barcode” (SAUNDERS & MCDEVITT, 2012): COIm174 (5‟- GAGCTAACACAACCAGGTAAC – 3‟) e RhoR (5‟ - AGGAAAAGCCATATC WGGAC – 3‟) para amplificar fragmentos de 174pb; COIm264 (5‟ - CAAAYCAYAARGATATYGGTAC – 3‟) e RhoR, para amplificar fragmentos de 246 pb. - rbcL (VIS et al., 1998): F160 (59-CCT CAA CCA GGA GTA GAT CC-39) e rbcL R (59-ACA TTT GCT GTT GGA GTC TC-39) para amplificar um fragmento de 1282 pb. Os programas de temperatura utilizados para os ciclos de PCR foram os seguintes: - cox1 conforme Saunders (2005) – 94ºC por 1 min (desnaturação inicial); 5 ciclos: 94°C por 1 min (desnaturação); 50ºC por 1 min e 30 s (anelamento dos “primers”); 72°C por 1 min e 30 s (extensão); 35 ciclos: 94°C por 1 min (desnaturação); 50°C por 1 min e 30 s (anelamento dos “primers”); 72°C por 1 min (extensão); 72°C por 5 min (extensão final) e 4°C (armazenamento). - cox1 “mini-barcode” conforme Saunders & Mcdevit (2012) – 94ºC por 4 min (desnaturação inicial); 38 ciclos: 94ºC por 1 min (desnaturação); 45ºC por 30 s (anelamento dos “primers”); 72ºC por 1 min (extensão); 72ºC por 7 min (extensão final) e 4ºC (armazenamento). - rbcL conforme Vis et al. (1998) – 95°C por 2 min (desnaturação inicial); 30 a 35 ciclos: 93°C por 1 min (desnaturação); 50°C por 1 min (anelamento dos “primers”); 72°C por 4 min (extensão); 72°C por 6 min (extensão final); 4°C (armazenamento). 41 2.2.3. Eletroforese em gel de agarose Os géis (0,7%) foram preparados com a diluição de 70 mg de agarose em 100 ml da solução-tampão TBE: tris-HCl 50 mM; borato 50 mM; EDTA 2 mM (SAMBROOK & RUSSELL, 2001). Os géis foram carregados com o produto amplificado e tampão de carregamento (azul de bromofenol 0,25%, EDTA 50 M, glicerol 30% e água destilada) na proporção de 4:1. As eletroforeses foram realizadas sob voltagem de 60 V, com tempo de 60 minutos para rbcL e 45 minutos para cox1. Utilizou-se marcador de tamanho “1 Kb DNA ladder” (Invitrogen, Gaithersburg, E.U.A.). A qualidade do DNA amplificado por PCR foi feita por estimativas visuais por comparação com o marcador. Os géis foram corados com “GelRed®” (Biotium, Hayward, E.U.A.) e observados em fotodocumentador “Mini Bis Pro” e software “Gel Capture®” (Micro Photonics, Allentown, E.U.A.). A qualidade e quantidade do DNA amplificado por PCR foi feita por estimativas visuais com base na intensidade e homogeneidade das bandas e por comparação com o marcador. 2.2.4. Purificação e quantificação dos produtos de PCR Os produtos de PCR foram purificados com uso dos kits de purificação: “QIAquick TM PCR” (QiagenGmbH, Hilden, Alemanha) e “NucleoSpin TM Geland PCR Clean-up” (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha), conforme os protocolos dos fabricantes. Após a purificação, os produtos de PCR foram quantificados no fluorômetro “Qubit®” com o uso do kit “Quant-it® ds DNA BR” (Invitrogen, Carlsbad, E.U.A.) e/ou em espectrofotômetro “Libra Biochrom S60 Double Beam” (Biochrom, 42 Cambridge, Reino Unido), com acessório de medidas microvolumétricas “BioDrop TM 500” (Biochrom, Reino Unido). 2.2.5. Sequenciamento e alinhamento As reações de sequenciamento foram feitas usando-se o kit “Cycle Sequencing, Big-DyeTerminator” (Applied Biosystems, Foster City, E.U.A.) e os mesmos “primers” de PCR. As reações de sequenciamento foram feitas no Laboratório de Biologia, Ecologia e Taxonomia de Algas e as amostras precipitadas foram enviadas para sequenciamento na empresa “Genomic Engenharia Molecular”. O sequenciamento dos marcadores moleculares, a partir de produto de PCR purificado e quantificado, foi realizado em sequenciador automático “ABI PRISM 3130xl” (Applied Biosystems, Foster City, California, EUA), utilizando o kit “Big Dye Terminator”, versão 3.0 (Applied Biosystems). Os marcadores moleculares utilizados neste estudo (rbcL, cox1 e “42ini-barcode”) foram sequenciados em ambas as direções 3‟ e 5‟. As sequências obtidas foram carregadas diretamente no software “Geneious Pro”, versão 6.1.7 (DRUMMOND et al., 2012). A qualidade das sequências foi verificada através da checagem dos cromatogramas utilizando os recursos do próprio software. Em casos de sequências de baixa qualidade, foram feitas novas reações de sequenciamento para as amostras. Quando a baixa qualidade persistia, o sequenciamento foi feito com novos produtos de PCR. As sequências obtidas nas direções direta e reversa de cada amostra para cada marcador foram alinhadas individualmente para se obter a sequência completa (consenso), usando o programa “Geneious Pro”. A estimativa da homologia entre as sequências consenso geradas com aquelas já identificadas e armazenadas no “GenBank” foram obtidas com uso da ferramenta 43 “search” (utilizando os critérios de busca do BLAST) do programa “Geneious” aplicando-se o critério arbitrário de 97,5% de identidade. Essa comparação permite o reconhecimento da sequência, a confirmação da sua autenticidade e o reconhecimento de possíveis contaminações. Os alinhamentos globais – sequências completas (consenso) de todas as amostras – foram construídos incluindo as sequências geradas e aquelas da seção disponíveis no “GenBank”. Finalmente, as sequências consenso de todas as amostras foram agrupadas em uma única matriz. Na construção das matrizes foram removidas as regiões correspondentes aos “primers” e de alinhamento ambíguo. A partir dessa matriz foram obtidos os níveis de identidade e divergência entre as sequências, com uso das ferramentas disponíveis no próprio programa “Geneious”. As análises filogenéticas foram conduzidas utilizando o software “PAUP 4.0b8” (“Phylogenetic Analysis Using Parsimony”) (SWOFFORD, 2003) dentro do programa “Geneious Pro”. Para análise baseada nas sequências de rbcL, foi construída uma matriz de alinhamento com as sequências geradas neste estudo e as obtidas do “GenBank” (Tabela 3). As árvores filogenéticas foram construídas pelos métodos de máxima verossimilhança (MV) e análise bayesiana (BA) (SCHNEIDER, 2003). Os grupos externos utilizados são de espécies das seções do gênero Batrachospermum, entre elas as seções Acarposporophytum, Aristata, Batrachospermum, Macrospora, Setacea e Turfosa, bem como outros gêneros de Batrachospermales (Kumanoa, Sirodotia, Sheathia, Paralemanea e Tuomeya). Para a análise das sequências de rbcL, foram apresentadas duas árvores que são essencialmente idênticas, apenas que numa delas foram mostradas exclusivamente as sequências da seção Virescentia, permitindo uma melhor visualização da topologia da árvore dentro desse grupo. As análises de MV e BA com base nos dados de rbcL foram realizadas com uso do modelo de substituição nucleotídica GTR (“General Time Reversible”) + G + I 44 conforme determinado pelo software jModeltest (DARRIBA et al., 2012). Para análise de MV, as matrizes de dados foram exportadas para o formato PHYLIP e analisadas no software RAxML GUI (“graphical user interface”), versão 1.31 (STAMATAKIS, 2006; SILVESTRO & MICHALAK, 2012). Para BA, utilizou-se o software “MrBayes v.3.0b4” (RONQUIST & HUELSENBECK, 2003), onde foram definidas quatro cadeias de Markov e 5.000.000 de gerações, amostradas a cada 100 gerações, com probabilidades posteriores (PP) calculadas utilizando as 1.000 árvores finais. Para a análise das sequências de cox1 e “mini-barcode” também foram construídas matrizes de alinhamento com as sequências geradas neste estudo e as obtidas do “GenBank” (Tabela 2). Foram construídas árvores de distância (“neighbor joining”, SCHNEIDER, 2003) utilizando B. gelatinosum como grupo externo. Os limites de confiança dos grupos (clados) das árvores filogenéticas foram calculados como valores de suporte de “bootstrap” com 1.000 réplicas de buscas heurísticas, gerando árvores de consenso com o critério de > 70% de semelhança nos ramos das árvores. Para definição do modelo mais apropriado de evolução do DNA (substituição nucleotídica) na construção das árvores filogenéticas utilizou-se o programa “Modeltest 3.0” (POSADA & CRANDALL, 1998). Todas as análises foram conduzidas com uso do pacote “Macintosh Genetic Data Environment” (Mac GDE, Steven Smith) versão 2.4. As amostras que possuíam sequências tanto para rbcL quanto para cox1 tiveram suas sequências concatenadas para realização de uma análise combinada. Para concatenar as sequências de cada amostra foi utilizado o programa “Geneious Pro”. As análises de MV e BA com base nos dados concatenados foram realizadas com uso do modelo de GTR+I+G conforme determinado pelo software jModeltest (DARRIBA et al., 2012). Para análise de MV, as matrizes de dados foram exportadas para o formato PHYLIP e analisadas no software RAxML GUI (“graphical user interface”), versão 45 1.31 (STAMATAKIS, 2006; SILVESTRO & MICHALAK, 2012). Para BA, utilizou-se o software “MrBayes v.3.0b4” (RONQUIST & HUELSENBECK, 2003), onde foram definidas quatro cadeias de Markov e 5.000.000 de gerações, amostradas a cada 100 gerações, com probabilidades posteriores (PP) calculadas utilizando as 1.000 árvores finais. 46 Tabela 2. Sequências da seção Virescentia dos genes rbcL e cox1 obtidas do “GenBank” utilizadas nas análises. *Haplótipos encontrados em mais de uma localidade. Espécie Localidade 1 Acesso “GenBank” Referência rbcL cox1 B. viride-brasiliense Brasil, SP, Maringá, Rio Pavão FJ386460 --- Entwisle et al. (2009) Batrachospermum sp.1 E.U.A., MI, Spring Brook AF244109 *EU636727 *EU073847 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., MI, Flemming Creek AF244110 *EU636727 *EU636736 *EU073847 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., OH, Big Run AF244111 EU636733 *EU073833 *EU073838 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., OH, Browning Creek AF244112 *EU073834 EU073837 EU073848 *EU636732 EU636734 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., CT, Mill Brook AF244113 EU073834 *EU636732 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., LA, Unnamed stream AF244114 *EU636729 *EU073845 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., MA, Poquoy Brook AF244115 EU073839 EU636735 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., NC, Cedar Fork AF244116 *EU073834 *EU073836 *EU073838 *EU073840 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., TN, Scarboro Creek AF244117 EU073842 EU073843 EU073844 EU073846 EU636728 EU636730 EU636731 Vis et al. (2001) 47 Tabela 2 (Continuação). Sequências da seção Virescentia dos genes rbcL e cox1 obtidas do “GenBank” utilizadas nas análises. Espécie Localidade 1 Acesso “GenBank” Referência rbcL cox1 Batrachospermum sp.1 E.U.A., IN, Otter Creek AF244118 *EU073845 *EU636729 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., RI, Wood River Trib. AF244119 *EU073833 *EU073836 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., OH, Five Mile Creek AF244120 *EU073834 *EU073838 *EU636736 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., RI, Chipuxet River AF029142 --- Vis et al. (1998) Batrachospermum sp.1 E.U.A., OH, Yellow Springs AY198417 *EU073847 EU073848 *EU636727 Chiasson et al. (2003) Batrachospermum sp.1 E.U.A., OH, Big Run EU073833 Vis et al. (2001) Batrachospermum sp.1 E.U.A., VA, Carvin Creek --- *EU073833 EU073835 *EU073840 EU073843 Vis et al. (2008) Batrachospermum sp.1 E.U.A., OH, Sunfish Creek --- EU073841 Vis et al. (2008) Batrachospermum sp.2 Japão, Kagoshima, Oguchi AB114642 --- Hanyuda et al. (2004) Batrachospermum sp.2 Japão, Kyoto, Tanba AB114643 --- Hanyuda et al. (2004) Batrachospermum sp.2 Japão, Ehime, Komatsu AB114644 --- Hanyuda et al. (2004) Batrachospermum sp.2 Japão, Iwate, Takizawa AB114645 --- Hanyuda et al. (2004) Batrachospermum sp.2 Japão, Okinawa, Nago AB114646 --- Hanyuda et al. (2004) B. helminthosum Noruega, Askerelva, county of Akershus HQ412541 Rueness (2010) B. helminthosum Noruega, Askerelva, county of Akershus HQ412542 Rueness (2010) B. helminthosum França, Le Boulet Prioult, próximo a Le Petit Boulet KJ825955 --- Chiasson et al. (2014) B. vogesiacum França, Riacho em St. Jacques KJ825954 Chiasson et al. (2014) 1 CT = Connecticut, IN = Indiana, LA = Louisiana, MA = Massachusetts, MI = Michigan, NC = North Carolina, OH = Ohio, RI = Rhode Island, SP = São Paulo, TN = Tennessee 48 3. Resultados 3.1. Análises das sequências de rbcL Foram utilizadas 35 sequências com 1282 pb cada, abrangendo cinco espécies da seção Virescentia. O alinhamento das sequências não apresentou “indels”, como esperado para o gene rbcL. Para se examinar o monofiletismo da seção, foram utilizadas apenas sequências divergentes, sendo um total de 24 sequências para a seção Virescentia combinadas com 25 sequências que representam a diversidade conhecida para a ordem Batrachospermales. As análises para MV e BA produziram topologias semelhantes e, sendo assim, apenas a árvore MV foi apresentada (Figura 1). Foi observado alto suporte (1,0 de probabilidade posterior [PP] e 100% bootstrap [BS]) para o clado que representa a seção Virescentia (Figura 1). A seção Macrospora foi evidenciada como grupo com a maior proximidade filogenética. As análises filogenéticas realizadas somente com as sequências da seção Virescentia e um grupo externo, geraram árvores com topologias semelhantes e só a árvore MV foi apresentada (Figura 2). A seção Virescentia apresentou cinco clados principais, a maioria com altos suportes (Clados I, II, III, IV e V; Figura 2). Clado I foi composto por amostras exclusivamente da Região Neotropical (Brasil/América do Sul) e identificados como B. viride-brasiliense. Clado II foi composto por amostras exclusivamente da Região Paleártica (Japão/Ásia) e identificados como Batrachospermum sp.2. Clado III apresentou suporte moderado (PP = 0,70 e BS = 83%) e foi composto por duas amostras da Região Paleártica, sendo uma identificada como B. helminthosum (França/Europa) e outra denominada Batrachospermum sp.2 49 (Japão/Ásia). Clado IV foi composto por amostras exclusivamente da Região Neártica (E.U.A./América do Norte) e denominadas como Batrachospermum sp.1. Neste clado foram observadas duas linhagens com altos valores de suporte de PP e BS, sendo essas linhagens identificadas como “A” e “B”. Clado V foi composto por uma amostra da Região Paleártica (França/Europa) identificada como B. vogesiacum (Figura 2). 50 Figura 1: Árvore filogenética (máxima verossimilhança) gerada com base nas sequências do gene rbcL. Os números associados aos nós indicam os valores de “bootstrap” (BS) para MV e de probabilidade posterior (PP) para análise bayesiana; nós sem valores indicam BS ≤ que 70 BS ou PP ≤ 0,70. Círculos cheios nos nós indicam valores de BS > 95 e PP > 0,95. 51 Figura 2: Árvore filogenética (máxima verossimilhança) gerada com base nas sequências do gene rbcL, destacando a seção Virescentia com cinco clados principais contendo sequências do Brasil, E.U.A., Japão e França. Os números associados aos nós indicam os valores de “bootstrap” (BS) para MV e de probabilidade posterior (PP) para análise bayesiana; nós sem valores indicam BS ≤ que 65 BS ou PP ≤ 0,65. Círculos cheios nos nós indicam valores de BS > 95 e PP > 0,95. Dentre as sequências de rbcL, pode-se observar que as amostras de B. viride- brasiliense do Clado I apresentaram uma variação de 0 a 12 pb (0–0,9%) (Tabela 3). Batrachospermum sp.2 apresentou quatro sequências dispostas no Clado II com uma variação de 2 a 29 pb (0,2–2,3%) (Tabela 3). Uma sequência previamente identificada como Batrachospermum sp.2 (AB114646) agrupou-se com B. helminthosum no Clado III e foi tratada como tal. A amostra B. helminthosum da França e a amostra de B. 52 helminthosum do Japão apresentaram pequena variação entre as sequências, com uma diferença de 8 pb (0,7%) (Tabela 3). No clado IV, a linhagem A de Batrachospermum sp.1, representada por três sequências, apresentou variação de 8 a 19 pb (0,7–1,5%) (Figura 2). A linhagem B, com 11 sequências teve variação de 0 a 19 pb (0–1,5%), enquanto que a divergência entre as sequências das linhagens “A” e “B” foi maior, com valores de 15 a 30 pb (1,2–2,4%) (Tabela 3). A variação interespecífica foi consideravelmente superior à intraespecífica. Comparando-se as sequências de B. viride-brasiliense, Batrachospermum sp.1, Batrachospermum sp.2, B. helminthosum e B. vogesiacum a variação interespecífica foi de 22 a 142 pb (1,8–11,1%), enquanto a variação intraespecífica foi de 0 a 29 pb (0– 2,3%) (Tabela 3). 53 Tabela 3. Número de nucleotídeos divergentes e porcentagem de divergência entre as sequências do gene rbcL de espécimes da seção Virescentia do Brasil, dos E.U.A., do Japão e da França. 1 2 3 4 5 6 1) B. viride-brasiliense 0 a 12 pb (0–0,9%) 2) Batrachospermum sp.1 Linhagem“A” 36 a 51 pb (2,9–4,0%) 8 a 19 pb (0,7–1,5%) 3) Batrachospermum sp.1 Linhagem “B” 36 a 57 pb (2,9–4,5%) 15 a 30 pb (1,2–2,4%) 0 a 19 pb (0–1,5%) 4) Batrachospermum sp.2 39 a 53 pb (3,1–4,2%) 47 a 62 pb (3,7–4,9%) 45 a 66 pb (3,6–5,2%) 2 a 29 pb (0,2–2,3%) 5) B. helminthosum 22 a 30 pb (1,8–2,4%) 30 a 41 pb (2,4–3,2%) 29 a 45 pb (2,3–3,6%) 34 a 43 pb (2,7–3,4%) 0 6) B. vogesiacum 120 a 125 pb (9,4–9,8%) 123 a 134 pb (9,6–10,5%) 128 a 142 pb (10,0–11,1%) 128 a 142 pb (10,0–11,1%) 117 a 121 pb (9,2–9,5%) 0 54 3.2. Análises das sequências de cox1 As análises da região de “barcode” do gene cox1 foram essencialmente congruentes às do gene rbcL. A árvore de distância (“neighbor joining”) evidenciou três grupos bem suportados, com clara disjunção entre as sequências de Batrachospermum sp.1 da região Neártica (E.U.A./América do Norte), de B. viride-brasiliense da região Neotropical (Brasil/América do Sul) e de B. helminthosum da região Paleártica (Noruega/Europa) (Figura 3). As sequências de B. viride-brasiliense apresentaram uma variação de 0 a 15 pb (0–2,3%) (Tabela 4). A variação entre as sequências de Batrachospermum sp.1 foi de 0 a 46 pb (0– 7,0%), porém pode-se observar duas linhagens, identificadas como “A” e “B”, assim como para o gene rbcL, A distribuição destas linhagens nas árvores apresentaram congruência entre a maioria das amostras para ambos os marcadores. A linhagem A apresentou variação alta, de 0 a 28 pb (0–4,3%), ao passo que a linhagem B apresentou variação menor, de 0 a 11 pb (0– 1,7%). A divergência entre “A” e “B” foi superior à observada dentro de cada grupo, com uma variação de 36 a 46 pb (5,5–7,0%) (Tabela 4). A divergência entre as sequências de cada um desses três clados foi alta e maior do que dentro dos grupos: Brasil x EUA de 57 a 69 pb (8,6–10,4%); Brasil x Noruega com 45 a 51 pb (6,8–7,7%); e EUA x Noruega com 48 a 55 (7,3–8,3%) (Tabela 4). 55 Figura 3: Árvore de distância (“neighbor joining”) gerada com base nas sequências da região de “barcode” do gene cox1. Os números associados aos nós indicam os valores de “bootstrap”. Círculos cheios nos nós indicam valores de BS > 95. 56 Tabela 4. Número de nucleotídeos divergentes e porcentagem de divergência entre as sequências do gene cox1 de espécimes da seção Virescentia do Brasil*, dos E.U.A.**, e da Noruega***. 1 2 3 4 5 1) *B. viride-brasiliense 0 a 15 pb (0–2,3%) 2) **Batrachospermum sp.1 (total) 57 a 69 pb (8,6–10,4%) 0 a 46 pb (0–7,0%) 3) **Batrachospermum sp.1 Linhagem “A” 57 a 63 pb (8,6–9,5%) --- 0 a 28 pb (0–4,3%) 4) **Batrachospermum sp.1 Linhagem “B” 58 a 69 pb (8,8–10,4%) --- 36 a 46 pb (5,5–7,0%) 0 a 11 pb (0–1,7%) 5) ***B. helminthosum HQ412541; HQ412542 45 a 51 pb (6.8–7.7%) 48 a 55 pb (7,3–8,3%) 53 a 55 pb (8,0–8,3%) 48 a 55 pb (7,3–8,3%) 0 3.3. Análises das sequências de “mini-barcode” Foram obtidas quatro sequências com 246 pb para a região de “mini-barcode” do gene cox1 a partir de exsicatas, sendo três provenientes do Brasil, identificadas como B. viride- brasiliense, e uma do Japão, identificada como Batrachospermum sp.2. As análises da região de “mini-barcode” do gene cox1 foram essencialmente congruentes ao observado nas análises dos genes rbcL e cox1. A árvore de distância (“Neighbor Joining”) evidenciou quatro grupos bem suportados, com clara disjunção entre as sequências da Região Neártica (E.U.A./América do Norte), Região Neotropical (Brasil/América do Sul), Europa (Noruega) e Paleártica (Japão/Ásia) (Figura 4). As sequências de B. viride-brasiliense do Brasil apresentaram variação de 0 a 6 pb (0–2,5%), enquanto que as sequências de Batrachospermum sp.1 dos E.U.A. variaram em 0 a 15 pb (0– 6,1%). A divergência nas sequências entre cada um desses quatro clados foi bem superior: Brasil x E.U.A. foi de 16 a 22 pb (6,6–9,0%); Brasil x Noruega foi 14 a 18 pb (5,7–7,0%); Brasil x Japão foi de 16 a 20 pb (6,6–8,2%); E.U.A. x Noruega foi de 11 a 14 pb (4,5–5,7%); 57 E.U.A. x Japão foi de 30 a 34 pb (12,2–13,9%); e Japão x Noruega foi de 29 pb (11,8%) (Tabela 5). Figura 4: Árvore de distância (“Neighbor Joining”) gerada com base nas sequências da região de “mini-barcode” do gene cox1. Os números associados aos nós indicam os valores de “bootstrap”. Círculos cheios nos nós indicam valores de BS > 95. Tabela 5. Número de nucleotídeos divergentes e porcentagem de divergência entre as sequências da região de “mini-barcode” do gene cox1 de espécimes da seção Virescentia do Brasil, dos Estados Unidos*, do Japão** e da Noruega***. 1 2 3 4 1) B. viride-brasiliense 0 a 6 pb (0-2,5%) 2) *Batrachospermum sp.1 16 a 22 pb (6,6-9,0%) 0 a 15 pb (0-6,1%) 3) **Batrachospermum sp.2 16 a 20 pb (6,6-8,2%) 30 a 34 pb (12,2-13,9%) 0 4) ***HQ412541; HQ412542 14 a 18 pb (5,7-7%) 11 a 14 pb (4,5-5,7%) 29 pb (11,8) 0 58 3.4. Análise combinada Foram utilizadas sequências de 25 amostras com 1946 pb cada, sendo 13 de B. viride- brasiliense e 12 de Batrachospermum sp.1. As análises para MV e BA produziram topologias semelhantes e, sendo assim, apenas a árvore MV foi apresentada (Figura 5). Foi observado alto suporte (1,0 PP e 100% BS) nos clados principais da árvore. Assim como observado na análise individual para os genes rbcL e cox1, a árvore concatenada apresentou clara disjunção entre as sequências de Batrachospermum sp.1 da região Neártica (E.U.A./América do Norte) e de B. viride-brasiliense da região Neotropical (Brasil/América do Sul). No clado com as amostras da região Neártica também pode ser diferenciada duas linhagens com altos valores de suporte, reforçando a existência de pelo menos duas espécies dentro de Batrachospermum sp. 1 (Figura 5). 59 Figura 5: Árvore filogenética (máxima verossimilhança) gerada com base nas sequências concatenadas dos genes rbcL e cox1, destacando a seção Virescentia com cinco clados principais contendo sequências do Brasil e E.U.A. Os números associados aos nós indicam os valores de “bootstrap” (BS) para MV e de probabilidade posterior (PP) para análise bayesiana; nós sem valores indicam BS ≤ que 65 BS ou PP ≤ 0,65. Círculos cheios nos nós indicam valores de BS > 95 e PP > 0,95. 4. Discussão O gene rbcL tem sido o marcador padrão para inferir filogenias para a ordem Batrachospermales (VIS et al., 1998; VIS & ENTWISLE, 2000; ENTWISLE et al., 2009). Mais recentemente, o gene cox1 tem sido amplamente aceito como um marcador confiável de “DNA barcode” para rodófitas (SAUNDERS, 2005; ROBBA et al., 2006; LE GALL & SAUNDERS, 2010; CLARKSTON & SAUNDERS, 2012). As análises filogenéticas em 60 estudos anteriormente realizados baseados em dados moleculares (VIS et al., 1998; VIS & ENTWISLE, 2000; HANYUDA et al., 2004; VIS et al., 2005; ENTWISLE et al., 2009) indicaram a seção Virescentia como um grupo monofilético com alto suporte, apesar da pouca representatividade de populações e regiões geográficas. Ampliamos a representatividade de populações, com a inclusão de amostras do Brasil (AGOSTINHO & NECCHI, 2014) e corroboramos a hipótese de monofiletismo da seção, sugerida em outros estudos (VIS et al., 2005; ENTWISLE et al., 2009). Investigações recentes têm sido direcionadas a resolver o parafiletismo do gênero Batrachospermum (ENTWISLE et al., 2009; SALOMAKI et al., 2014; ENTWISLE et al., 2016; ROSSIGNOLO & NECCHI, 2016). Há tendência recente de elevar grupos monofiléticos menores a gêneros distintos dentro da ordem Batrachospermales: Kumanoa (combinação das seções Contorta e Hybrida, ENTWISLE et al. 2009), Sheathia (antiga seção Helminthoidea, SALOMAKI et al., 2014) e Setacea (antiga seção de mesmo nome, ROSSIGNOLO et al., 2016). Por outro lado, Entwisle et al. (2016) adotaram posição contrastante, incluindo vários grupos seções menores com espécies da Australásia e a seção Setacea, dentro de Nothocladus senso lato. Com base nessas premissas e adotando a tendência mais universal de separar grupos monofiléticos menores da ordem Batrachospermales, justifica-se a elevação de Virescentia para a categoria de gênero. A variação das sequências para o gene rbcL observada entre as amostras brasileiras de B. viride-brasiliense (0 a 12 pb, 0–0,9%, AGOSTINHO & NECCHI, 2014) foi geralmente inferior a variação intraespecífica observada em outras rodófitas continentais da ordem Batrachospermales. Hanyuda et al. (2004) encontraram variação de 2 a 29 pb (0,2–2,3%) para quatro haplótipos de B. helminthosum mais estreitamente relacionados do Japão e 34 a 41 pb (2,7–3,2%) em relação a haplótipo atípico. Vis & Sheath (1997) observaram variação de 0 a 24 pb (0–1,9%) em B. gelatinosum (L.) De Candolle na América do Norte; Vis & Entwisle (2000) reportaram variação de 0 a 50 pb (0–3,9%) em B. pseudogelatinosum Entwisle et Vis 61 na Austrália; Vis et al. (2008) observaram uma variação de 0 a 76 pb (0–6,0%) entre espécimes de B. macrosporum das Américas do Sul e Norte; Vis et al. (2010) analisaram 107 espécimes de B. arcuatum coletados na América do Norte, Ásia e Europa e encontraram uma divergência de 0 a 82 pb (0–6,4%). Neste estudo, a sequência de B. vogesiacum da França apresentou uma alta divergência em relação às demais sequências analisadas, com variações de 117 a 142 pb (9,2-11,1%). Estes valores são muito superiores às divergências interespecíficas relatadas para Batrachospermales, chegando a um nível de divergência próxima à observada entre diferentes gêneros. Os limites de variação para a região de “barcode” do gene cox1 observados entre os espécimes brasileiros de B. viride-brasiliense (2 a 19 pb, 0,3–2,9%) foram geralmente superiores aos limites de variação reportados para rodófitas marinhas. Saunders (2005) observou uma variação intraespecífica para o gene cox1 de 0 a 2 pb (0–0,2%) e interespecífica de 30 a 90 pb (4,5–13,6%) entre 16 espécies das ordens Ceramiales, Gigartinales e Rhodymeniales. Do mesmo modo, Robba et al. (2006) encontraram variação intraespecífica muito inferior (0 a 4 pb, 0–0,7%) comparada com a variação interespecífica (28 a 148 pb, 5,2-27,4%) para representantes de seis ordens de algas vermelhas. Porém, comparando-se com dados de variação intraespecíficas para espécies de rodófitas continentais, nossos dados situaram-se dentro ou abaixo dos limites reportados. House et al. (2010) analisaram 193 indivíduos de B. gelatinosum provenientes de 16 localidades ao longo da região leste da América do Norte e observaram a ocorrência de cinco haplótipos com variação intraespecífica de 0 a 2 pb (0–0,2%). Em contraste, Sherwood et al. (2008) reportaram variação intraespecífica de 0 a 67 pb (0–10,1%) para B. macrosporum. Em estudo com 70 indivíduos de B. helminthosum coletados no leste da América do Norte, House et al. (2008) observaram uma variação de 0 a 44 pb (0–6,6%), mas não foram encontrados caracteres morfológicos que distinguissem os haplótipos divergentes. 62 Geralmente é difícil recuperar rapidamente e a baixos custos sequências de “barcode” de espécimes de museus com mais de uma década, especialmente porque o DNA está degradado e fragmentado (WHITFIELD, 1999; HAJIBABAEI et al., 2005). Tal comparação é crítica quando o “barcode” revela espécies crípticas dentro do que era visto como uma única espécie, não sendo morfologicamente evidente qual delas combina com o holótipo (HEBERT et al., 2004a; JANZEN et al., 2005). Meusnier et al. (2008) determinaram o quanto de informação é requerido para identificações utilizando sequências de “DNA barcode” com o gene cox1. Estes autores calcularam a probabilidade de se ter “barcodes” espécie- específicos para fragmentos de tamanhos variados. A análise demonstrou que enquanto fragmentos completos de “DNA barcode” apresentam a melhor resolução (97%), obtém-se um sucesso de 90% na identificação com regiões de 100 pb e 95% com “barcodes” com 250 pb. Neste estudo, as análises feitas a partir do “mini-barcode” foram congruentes com as realizadas a partir de fragmentos completos da região de “barcode” do gene cox1. As sequências geradas a partir das exsicatas de amostras brasileiras apresentaram grande similaridade com as demais sequências de B. viride-brasiliense e estão distribuídas dentro do clado com espécimes brasileiros. A sequência gerada a partir da exsicata de uma amostra proveniente do Japão demonstrou grande divergência com todas as demais sequências do Brasil, E.U.A. e Noruega, e a disposição dessa sequência na árvore em um clado com alto suporte, corroboram o reconhecimento de uma espécie distinta (denominada de Batrachospermum sp.2). A análise combinada de diferentes genes é uma opção para evitar a perda de dados e mesclar a história evolutiva dos genes para se aproximar mais da realidade evolutiva do grupo (DUCHENE et al., 2011). Os genes individuais são susceptíveis a variações causadas por diferentes taxas de substituição e as árvores resultantes de diferentes genes frequentemente resultam em topologias variadas. Um número mínimo de genes pode ser 63 usado para reproduzir resultados mitogenômicos e otimizar as análises de grandes conjuntos de dados ou com sequências mitogenômicas incompletas (GATESY et al., 2007; DUCHENE et al., 2011). Neste estudo, a árvore resultante da análise combinada foi congruente com as árvores individuais geradas para os genes rbcL e cox1. Em adição às distâncias genéticas, três outros critérios (LELIAERT et al., 2014) suportam a existência de múltiplas espécies: (1) clados com alto suporte para todos marcadores moleculares; (2) concordância entre esses marcadores; e (3) clara descontinuidade entre a divergência intra- e interespecífica. Com base nesses critérios, pudemos concluir que os resultados das sequências de rbcL, cox1 e “mini-barcode” revelaram que as amostras do Brasil, Japã