RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 27/01/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU BLOQUEIO MEIÓTICO EM OÓCITOS DE EQUINOS COMO ALTERNATIVA PARA MELHORA DA VIABILIDADE MARIANA LEMOS NAGIB JORGE Botucatu, SP Janeiro - 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU BLOQUEIO MEIÓTICO EM OÓCITOS DE EQUINOS COMO ALTERNATIVA PARA MELHORA DA VIABILIDADE Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Animal para obtenção do título de MESTRE Mariana Lemos Nagib Jorge Orientadora: Prof.a Dr.a Fernanda da Cruz Landim Coorientadora: Prof.a Dr.a Elisa Sant’Anna Monteiro da Silva Botucatu, SP Janeiro - 2023 ii Nome da autora: Mariana Lemos Nagib Jorge Título: BLOQUEIO MEIÓTICO EM OÓCITOS DE EQUINOS COMO ALTERNATIVA PARA MELHORA DA VIABILIDADE BANCA EXAMINADORA Prof.a Dr.a Fernanda da Cruz Landim Presidente e Orientadora Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal FMVZ, UNESP Botucatu – SP Prof.a Dr.a Fernanda Saules Ignácio Membro Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal FMVZ, UNESP Botucatu – SP Prof. Dr. Gabriel Augusto Monteiro Membro Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária UFMG, Belo Horizonte – MG Data da Defesa: 27 de janeiro de 2023. iii Dedico aos meus pais, Renata e Renato, e ao meu marido, João Vitor, por todo incentivo e apoio na minha caminhada. iv AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus e à Nossa Senhora por me permitirem chegar até aqui e por terem me presenteado com uma família que sempre acreditou em mim e me apoiou. Agradeço aos meus pais, Renato e Renata, meu marido João Vitor e minha irmã Gabriela por todo amor e carinho que me dão. Agradeço à Prof.a Fernanda por ter aceitado me orientar e por acreditar que eu seria capaz de desenvolver este trabalho. Agradeço a FMVZ - Unesp Botucatu, docentes, funcionários e colegas de jornada por toda formação proporcionada a mim durante a Residência e o Mestrado. Agradeço à Prof.a Elisa por ter aceitado me coorientar e por abrir as portas da UFU para mim. Agradeço às docentes do Departamento de Reprodução Animal, da UFU, por me receberem lá. Agradeço ao Frigofava e à M.V. Andressa por me cederem os ovários utilizados nesta pesquisa. Agradeço às técnicas da UFU Graciele e Mariani pelo suporte durante a manipulação dos oócitos e análise no microscópio confocal. Agradeço à pós-graduanda Thaisy pela ajuda, mesmo que a distância, para a realização deste trabalho e pela análise da expressão gênica. Agradeço à Dra. Carmen por ceder os instrumentos para curetagem dos ovários e pela amizade de longos anos. Agradeço à Juliana pela análise estatística e por sanar minhas dúvidas sobre o assunto. Agradeço à Omics Biotecnologia Animal por ceder os materiais utilizados nesta pesquisa. Agradeço ao CNPq pela concessão da bolsa no início do Mestrado. Agradeço à Fapesp (processo 2020/01646-5) pela concessão da bolsa e dos recursos para viabilizar a execução do trabalho. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. v “É preciso que eu suporte duas ou três lagartas, se eu quiser conhecer as borboletas…” Antoine de Saint-Exupéry vi RESUMO JORGE, M.L.N. BLOQUEIO MEIÓTICO EM OÓCITOS DE EQUINOS COMO ALTERNATIVA PARA MELHORA DA VIABILIDADE. Botucatu – SP. 2023. 69 p. Defesa (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. A manutenção dos oócitos equinos em bloqueio meiótico, seja através do uso de inibidores de meiose ou manutenção deles em temperatura ambiente, é benéfica para o posterior desenvolvimento embrionário. Com o objetivo de testar a viabilidade da manutenção de oócitos em meio de cultivo embrionário comercial disponível no Brasil (Botuembryo), comparando ao meio de cultivo acrescido de inibidor de meiose (Butirolactona), antes da maturação in vitro (MIV), concebeu- se este ensaio. Foram utilizados 149 oócitos equinos, separados em 3 grupos: Controle, Botuembryo e Butirolactona. O grupo Controle seguiu direto para a MIV por 24 horas, os grupos Botuembryo e Butirolactona passaram por um processo de pré-maturação (PM) por 20 horas com os respectivos produtos, e depois seguiram para a MIV por mais 24 horas. No grupo Controle, o momento 1 (M1) corresponde ao momento da obtenção dos oócitos, já nos grupos Botuembryo e Butirolactona, o M1 corresponde ao final da PM. O momento 2 (M2), nos 3 grupos, foi após a MIV. Após a coloração, a maturação nuclear e citoplasmática foi avaliada pela microscopia confocal. A investigação da expressão gênica foi realizada por RT-qPCR. Nos oócitos foram analisados os genes: Proteína Morfogenética Óssea 15 (BMP15), Conexina 37 (Cx37), Fator de Crescimento e Diferenciação 9 (GDF9) e Metaloproteinase de Matriz 2 (MMP2); já nas células do cumulus (CCs) foram avaliados os genes: Ampiregulina (AREG), Conexina 43 (Cx43), Hialurona Sintetase 2 (HAS2), Receptor de FSH (FSHR) e Receptor de LH (LHR). Na avaliação da maturação nuclear foram encontrados resultados semelhantes entre os grupos tratados e na análise da maturação citoplasmática foi encontrado no grupo Butirolactona o maior percentual de oócitos imaturos no M1, maior percentual de oócitos maduros no M2, e menor percentual de degeneração. Por outro lado, os dados da expressão gênica, demonstraram que houve falha do bloqueio da maturação molecular no grupo Butirolactona, com aumento da abundância de AREG e HAS2 no M1, e diminuição no M2. Além vii disso, observou-se superioridade do grupo Botuembryo, entre os grupos tratados, no M1, em relação a menor abundância de AREG, LHR e HAS2 e maior abundância de FSHR; já no M2, apresentou maior abundância de GDF9, indicando melhor qualidade tanto dos oócitos como das CCs. Embora os resultados obtidos com o uso da Butirolactona ou do Botuembryo sejam semelhantes em relação a maturação nuclear e citoplasmática, os resultados de maturação molecular demonstraram a superioridade do Botuembryo para manter a qualidade de oócitos e CCs antes da realização de técnicas de fertilização assistida em equinos. Palavras-chave: reprodução assistida, fertilidade, ICSI, maturação oocitária viii ABSTRACT JORGE, M.L.N. MEIOTIC BLOCK IN EQUINE OOCYTES AS AN ALTERNATIVE FOR VIABILITY IMPROVEMENT. Botucatu – SP. 2023. 69 p. Defesa (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. The maintenance of equine oocytes in meiotic block, either using meiosis inhibitors or keeping them at room temperature, is beneficial for the later embryonic development. With the objective of testing the viability of maintaining oocytes in commercial embryonic culture medium available in Brazil (Botuembryo), comparing to the culture medium added with a meiosis inhibitor (Butyrolactone), before in vitro maturation (IVM), this assay was conceived. One hundred and forty-nine equine oocytes were used, separated into 3 groups: Control, Botuembryo and Butyrolactone. The Control group went straight to IVM for 24 hours, the Botuembryo and Butirolactone groups went through a pre- maturation (PM) process for 20 hours with the respective products, and then went to IVM for another 24 hours. In the Control group, moment 1 (M1) corresponds to the moment of obtaining the oocytes, while in the Botuembryo and Butyrolactone groups, M1 corresponds to the end of PM. Moment 2 (M2), in the 3 groups, was after IVM. After staining, nuclear and cytoplasmic maturation was assessed by confocal microscopy. The investigation of gene expression was performed by RT- qPCR. The following genes were analyzed in the oocytes: Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15), Connexin 37 (Cx37), Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) and Matrix Metalloproteinase 2 (MMP2); in the cumulus cells (CCs), the following genes were evaluated: Ampiregulin (AREG), Connexin 43 (Cx43), Hyalurone Synthetase 2 (HAS2), FSH Receptor (FSHR) and LH Receptor (LHR). In the evaluation of nuclear maturation, similar results were found between the treated groups and in the assessment of cytoplasmic maturation, the highest percentage of immature oocytes in M1, the highest percentage of mature oocytes in M2, and the lowest percentage of degeneration were found in the Butyrolactone group. On the other hand, gene expression data showed that there was a failure to block molecular maturation in the Butyrolactone group, with an increase in the abundance of AREG and HAS2 in M1, and a decrease in M2. In ix addition, superiority was observed for the Botuembryo group, between treated groups, in M1, in relation to the lower abundance of AREG, LHR and HAS2 and the higher abundance of FSHR, in M2, it presented a greater abundance of GDF9, indicating better quality of both oocytes and CCs. Although the results obtained with the use of Butyrolactone or Botuembryo are similar in relation to nuclear and cytoplasmic maturation, the molecular maturation results demonstrated the superiority of Botuembryo to maintain the quality of oocytes and cumulus cells before carrying out assisted fertilization techniques in horses. Keywords: assisted reproduction, fertility, ICSI, oocyte maturation x LISTA DE FIGURAS Capítulo 1 FIGURA 1. Na figura 1a observamos ovários equinos obtidos no mês de novembro de 2021, após a dissecção para evidenciar os folículos. Na figura 1b observamos ovários equinos obtidos no mês de maio de 2022, antes da dissecção, evidenciando a porção medular. Na figura 1c observamos a porção cortical dos ovários obtidos neste mesmo período..........………...........................5 FIGURA 2. Materiais utilizados na recuperação de oócitos equinos pela técnica de “curetagem” …………......………………………………………………………….6 FIGURA 3. Nas figuras 3a e b observamos os COCs equinos antes da MIV. Na figura 3c vemos COCs equinos compactos e na figura 3d COCs equinos expandidos. Na figura 3e vemos oócitos equinos desnudados após sucessivas pipetagens em solução de Tripsina – EDTA. Todos os oócitos foram observados na lupa.....................……………...........................................................................7 FIGURA 4. COCs equinos após a maturação por 24 horas em placa 4 poços, observados na lupa…………............................…………………………………….9 FIGURA 5. Análise da expressão gênica de oócitos equinos. ……………...….17 Capítulo 2 FIGURA 1. Na figura 1a temos VG, na figura 1b QVG, ambas com o citoplasma imaturo. Na figura 1c e d observamos o núcleo em MI. Na figura 1e vemos o núcleo em MII, com extrusão do 1o CP. Nas figuras 1c, 1d e 1e o citoplasma está maduro. Na figura 1f temos um ócito degenerado, com núcleo picnótico. Na figura 1g temos um oócito não analisável, onde não observamos o material genético. As mitocôndrias foram coradas por MitoTracker Orange CMTMRos (coloração vermelha e indicadas pelo *) e o material genético por YO-PRO-1 Iodide (coloração verde, indicada pela seta) ......................................................42 xi FIGURA 2. Resultados de expressão gênica de diferentes genes expressos nas CCs de oócitos equinos, em grupos e momentos distintos..........................……48 FIGURA 3. Resultados de expressão gênica de diferentes genes expressos nos oócitos equinos, em grupos e momentos distintos…....……………….......…….49 xii LISTA DE TABELAS Capítulo 2 TABELA 1. Primers para CCs equinas……………………………….………...…44 TABELA 2. Primers para oócitos equinos. ………………………………........…44 TABELA 3. Foi realizado o Teste de Qui-quadrado (χ2) para comparação das proporções de maturação (P<0,05), nos diferentes grupos e momentos. O número entre parênteses corresponde ao valor total de oócitos………..............47 xiii LISTA DE ABREVIATURAS ACTB = β-actin AMPc = monofosfato de adenosina cíclica AREG = Ampirregulina ATP = adenosina trifosfato BMP15 = Proteína Morfogenética Óssea 15 Botu = Botuembryo Butiro = Butirolactona CC = célula do cumulus CDK = quinase dependente de ciclina cDNA = DNA complementar CEUA = comitê de ética no uso de animais Cit Im = citoplasma imaturo Cit Mad = citoplasma maduro CL = corpo lúteo CO2 = gás carbônico COC = complexo cumulus-oócito CONCEA = Conselho nacional de experimento animal CP = corpúsculo polar Ct = ciclo de threshold Cx37 = Conexina 37 Cx43 = Conexina 43 D = degenerado DMEM/F12 = Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 DNA = ácido desoxirribonucleico DNAse = desoxirribonuclease DP = desvio padrão da média EDTA = ácido etilenodiamino tetra-acético EPM = erro padrão da média ESD = extreme studentized deviate FIV = fertilização in vitro FSH = hormônio folículo estimulante FSHR = receptor de FSH xiv GDF9 = Fator de Crescimento e Diferenciação 9 HAS2 = Hialurona Sintetase 2 h = hora ICSI = injeção intracitoplasmática de espermatozoide LH = hormônio luteinizante LHR = receptor de LH M = média M1 = momento 1 M2 = momento 2 MAPK = proteína quinase ativada por mitógenos MB = meio com DMEM/F12, SFB e Penicilina-Estreptomicina Método 2-ΔΔCt = método Ct comparativo MI = metáfase I MII = metáfase II MIV = matução in vitro MMP1 = Metaloproteinase de Matriz 1 MMP2 = Metaloproteinase de Matriz 2 MPF = fator promotor de maturação NA = não analisável PBS = tampão fosfato-salino PCR = reação em cadeia da polimerase PDE3A = Fosfodiesterase 3A PIV = produção in vitro PKA = proteína quinase A PM = pré-maturação QVG = quebra da vesícula germinativa RNA = ácido ribonucleico RNAm = ácido ribonucleico mensageiro RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real SF = solução fisiológica 0,9% SFB = soro fetal bovino TO = transferência de oócitos VG = vesícula germinativa χ2 = teste do Qui-quadrado iii SUMÁRIO CAPÍTULO 1........................................................................................................1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA...........................................................2 2. REVISÃO DE LITERATURA....................................................................3 2.1 Aspectos da reprodução equina..........................................................3 2.2 Maturação oocitária.............................................................................7 2.2.1 Maturação nuclear.............................................................11 2.2.2 Maturação citoplasmática..................................................12 2.2.3 Maturação molecular.........................................................14 2.3 Bloqueio meiótico em oócitos............................................................17 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................20 4. OBJETIVOS............................................................................................21 4.1 Objetivo Geral....................................................................................21 4.2 Objetivos Específicos.........................................................................21 5. REFERÊNCIAS......................................................................................22 CAPÍTULO 2......................................................................................................31 ARTIGO CIENTÍFICO........................................................................................32 Resumo.............................................................................................................33 1. INTRODUÇÃO........................................................................................35 2. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................37 2.1 Aspectos éticos……………………………………………………….….37 2.2 Obtenção do material biológico.........................................................38 2.3 Delineamento experimental...............................................................39 2.4 Confecção das lâminas e avaliações................................................39 2.4.1 Maturação citoplasmática..................................................40 2.4.2 Maturação nuclear.............................................................41 2.5 Expressão gênica…….......................................................................43 2.6 Análise estatística..............................................................................45 3. RESULTADOS.......................................................................................45 4. DISCUSSÃO...........................................................................................49 5. CONCLUSÃO.........................................................................................62 AGRADECIMENTOS……………………………………………………………62 iv REFERÊNCIAS............................................................................................62 22 *Referências organizadas de acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) NBR 6023 informação e documentação – Referências – Elaboração. Rio de Janeiro, 2018. 74p. 5. REFERÊNCIAS* ACKERT, C. L.; GITTENS, J. E. I.; O´BRIEN, M. J.; EPPIG, J. J.; KIDDER, G. M. Intercellular communication via connexin43 gap junctions is required for ovarian folliculogenesis in the mouse. Developmental Biology, v. 233, n. 2, p. 258-270, 2001. AGUILAR, J.; MAS, C.; REYLEY, M.; LUDUEÑA, R.; MOUGUELAR, H.; LOSINNO, L. Nuclear maturation and mitochondrial distribution in equine oocytes matured in vitro. Animal Reproduction, v. 4, n. 3, p. 88-97, 2007. ALM, H.; TORNER, H.; KANITZ, W.; BECKER, F.; HINRICHS, K. 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Os grupos foram: Controle, Botuembryo e Butirolactona. No grupo 33 Controle, o momento 1 (M1) corresponde ao momento da obtenção dos oócitos. 34 Nos grupos tratados, o M1 corresponde ao final da pré-maturação (PM), por 20h, 35 com os respectivos produtos. O momento 2 (M2), nos 3 grupos foi ao final da 36 MIV. Foi realizado o Teste de Qui-quadrado (χ2) (P<0,05) para avaliação da 37 maturação nuclear e citoplasmática. Para avaliação da expressão gênica, os 38 dados obtidos entre os tratamentos de cada momento foram testados por 39 ANOVA, seguido de comparação dos grupos com o teste de Tukey Kramer 40 (quando dados paramétricos). Já a análise de cada tratamento entre os 41 momentos foi realizada pelo teste t-Student. As diferenças foram consideradas 42 significativas quando P < 0,05. 43 Métodos: Utilizaram-se 149 oócitos equinos, alguns foram avaliados quanto a 44 maturação nuclear e citoplasmática pela microscopia confocal e outros seguiram 45 para análise da expressão gênica, que foi realizada por RT-qPCR. Nos oócitos 46 foram analisados os genes: BMP15, Cx37, GDF9 e MMP2; e nas células do 47 cumulus (CCs): AREG, Cx43, HAS2, FSHR e LHR. 48 34 Resultados: Na avaliação da maturação nuclear e citoplasmática, foi 49 encontrado no grupo Butirolactona o maior percentual de oócitos imaturos no 50 M1, maior percentual de oócitos maduros no M2, com ausência de citoplasma 51 imaturo neste momento, e menor percentual de degeneração entre os grupos 52 que passaram pela PM. Na análise da expressão gênica, foi observado que o 53 grupo Butirolactona apresentou indícios de maturação molecular acelerada com 54 alta expressão de AREG e HAS2 no M1, e diminuição da abundância desses 55 valores no M2. Por outro lado, a análise da expressão gênica de diversos fatores 56 expressos tanto pelo oócito quanto pelas CCs indicaram uma superioridade do 57 grupo Botuembryo entre os grupos tratados, já que neste foi observado, no M1, 58 menor abundância de AREG, LHR e HAS2 e maior abundância de FSHR. Já no 59 M2, o grupo Botuembryo apresentou maior abundância de GDF9. 60 Principais limitações: Disponibilidade de oócitos para a pesquisa. 61 Conclusão: Embora a Butirolactona e o Botuembryo tenham apresentado 62 resultados semelhantes na maturação nuclear e citoplasmática e possam ser 63 utilizados para manutenção dos oócitos em bloqueio meiótico, os resultados da 64 maturação molecular indicaram uma superioridade do Botuembryo. 65 Palavras-chave: reprodução assistida, fertilidade, ICSI, maturação oocitária, 66 butirolactona 67 68 69 70 71 72 73 62 5. CONCLUSÃO 689 Embora os resultados obtidos com o uso da Butirolactona ou do 690 Botuembryo, em temperatura ambiente, sejam semelhantes em relação a 691 maturação nuclear e citoplasmática, os resultados de maturação molecular 692 demonstraram a superioridade do Botuembryo para manter a qualidade de 693 oócitos e células do cumulus antes da realização de técnicas de fertilização 694 assistida em equinos. Novos estudos devem ser feitos para adequar o tempo 695 máximo de manutenção dos oócitos na PM, bem como dosagem hormonal e 696 tempo de MIV. 697 698 AGRADECIMENTOS 699 700 À Fapesp (processo 2020/01646-5); ao CNPq; à CAPES, Brasil (código 701 de financiamento 001); à Omics Biotecnologia Animal; à UFU; ao Frigofava. 702 703 REFERÊNCIAS 704 705 1Nurse P. Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature. 706 1990; 344:503-508. 707 2Conti M, Hsieh M, Zamah AM, Oh JS. Novel signaling mechanisms in the ovary 708 during oocyte maturation and ovulation. Mol. Cell. 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