UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

Campus  Araçatuba 

 

 

 

KAREN SANTOS MARÇO 

 

 

 

 

Efeitos da infecção por Leishmania infantum na morfologia 

e composição celular do timo de hamster (Mesocricetus 

auratus) 

 

 

 

 

 

 

Araçatuba 

2020 



 
 

 

KAREN SANTOS MARÇO 

 

 

 

Efeitos da infecção por Leishmania infantum na morfologia 

e composição celular do timo de hamster (Mesocricetus 

auratus) 

 

 

Dissertação apresentada à Faculdade de 
Medicina Veterinária de Araçatuba da 
Universidade Estadual Paulista “Júlio de 
Mesquita Filho”- UNESP, como parte dos 
requisitos para obtenção do título de mestre 
em Ciência Animal (Fisiopatologia Médica e 
Cirúrgica). 

Orientadora: Prof.ª Adjunta Gisele Fabrino 
Machado  

 

 

 

Araçatuba 

2020 

 



 
 

 



 
 

 



 
 



 
 

 

 

 



 
 

AGRADECIMENTOS 

 

Á Profa. Gisele Fabrino Machado, por aceitar ser minha orientadora, por sua forma 

acolhedora de orientar, sempre compreensiva, enxergando seus orientados como 

pessoas complexas e únicas. 

Á Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela 

concessão de bolsa de estudo de pós-graduação em parte do mestrado. 

Á Prof. Marcia Dalastra Laurenti responsável pelo laboratório de patologia de 

moléstias infecciosas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, suas 

orientadas de Doutorado Gabriela e Carmen que contribuíram para projeto fornecendo 

não apenas as amostras utilizadas no projeto, mas contribuindo com seus 

conhecimentos práticos e teóricos para realização do projeto.  

Á Prof. Valéria Felix Marçal de Lima pela disponibilidade e entusiasmo em conversar 

sobre imunologia, e também aos seus orientados pelo compartilhamento da bancada 

e dos protocolos do laboratório.  

Á meus pais, Ivete Domingos dos Santos Março e Edson Roberto Março que sempre 

apoiaram minhas escolhas dando todo suporte que podiam para que eu pudesse 

realizar meus planos. 

Meu amigo e namorado Samuel Alves de Quadros, minha amiga e irmã Éllem Santos 

Março, amigas e primas Elaine Cristina Março e Maria Clara Março dos Santos, que 

foram minhas companhias e apoio emocional durante a trajetória do mestrado. 

Meu cachorro Jack que na sua inocência oferece amor e alegria a minha casa.  

 

 

 

 

 



 
 

Março, K.S. Efeitos da infecção por Leishmania infantum na morfologia do timo 

de hamster (Mesocricetus auratus). 2020. 80f. Dissertação (Mestrado)- Faculdade 

de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2020. 

 

RESUMO 

 

O Timo é um órgão linfoide primário responsável pela maturação de linfócitos T que 

são importantes células efetoras da imunidade adaptativa. As células apresentadoras 

de antígeno conectam a imunidade inata a adaptativa e esta interação vai determinar 

o padrão de resposta imune a leishmaniose visceral resultando em doença 

sintomática quando um padrão de resposta é Th2 e uma resposta protetora com 

doenças assintomática quando o padrão é Th1. Outros tipos de respostas tais como 

a Th17 e Treg também são ativadas durante a doença. Está revisão tem como objetivo 

descrever os efeitos da leishmaniose visceral sobre o timo, um órgão linfoide primário 

que tem com função a maturação dos linfócitos T. Para isso foi realizada a análise e 

comparação de artigos científicos sobre as infecções Leishmania infantum (chagasi) 

no timo publicados nas bases de dados informatizadas PubMed, LILACS, SciELO, 

Google Scholar e no Portal de Periódicos da CAPES em língua inglesa no período de 

1973 a 2020. Entre os estudos utilizados destacamos cinco que abortam a presença 

e/ou os efeitos da Leishmaniose Visceral sobre o timo em diferentes modelos 

experimentais e infecção natural em cães. Concluímos que L. infantum está presente 

no timo de animais infectados e leva a um aumento de peso e celularidade do órgão 

em contraste com a redução na porcentagem de CD4 + e linfócitos duplos negativos 

em camundongos BALB/c e inflamação e atrofia granulomatosa ou piogranulomatosa 

em cães. 

 

Palavras-chave:  Leishmaniose visceral. Histopatologia. Imuno-histoquímica. 

Linfócitos. Hamster sírio. 

 

 

 



 
 

Março, K.S. Effects of Leishmania infantum infection on the morphology of the 

hamster thymus (Mesocricetus Auratus). 2020. 80f. Dissertação (Mestrado)-

Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2020. 

 

ABSTRACT 

 

The thymus is a primary lymphoid organ responsible for the maturation of T 

lymphocytes. T lymphocytes are an important part of adaptive immunity. Antigen-

presenting cells connect adaptive immunity and innate immunity, and this interaction 

will determine the pattern of immune response to visceral leishamaniasis leading to 

symptomatic disease when a pattern is Th2 and a protective response with 

asymptomatic presentation, when is Th1. Other responses, such as Th17 and Treg, 

also participate in the response to visceral leishmaniasis. This review aims to describe 

the effects of Visceral Leishmaniasis on the thymus, primary lymphoid organ that has 

the function of maturing T lymphocytes. Therefore, there is an analysis and comparison 

of scientific articles that demonstrate the presence of Leishmania infantum (chagasi) 

or the effects of Visceral Leishmaniasis on the thymus, published in the computerized 

databases PubMed, LILACS, SciELO, Google Scholar and CAPES in English from 

1973 to 2020. We concluded that L. infantum is present in the thymus of infected 

animals and leads to an increase in weight and cellularity in contrast to a reduction in 

the percentage of CD4 + and double negative lymphocytes in BALB/c mice and 

inflammation and granulomatous or pyogenic granulomatous atrophy in dogs. 

 

Keywords: Visceral leishmaniasis. Histopathology. Immunohistochemistry. 

Lymphocytes. Syrian hamster. 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE TABELAS 

 

Tabela 1- Lista de anticorpos, concentração, método de recuperação antigênica e 

cromógeno  utilizados nas reações de imuno-histoquímica ...................................... 39 

Tabela 2- Densidade parasitária em baço e fígado. .................................................. 41 

Tabela 3- Histologia e morfometria do timo. .............................................................. 43 

Tabela 4- Porcentagem de área marcada de células de origem mesenquimal, epitelial, 

macrófagos, linfócitos B e T no timo. ........................................................................ 50 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE FIGURAS 

 

CAPÍTULO 1 

 

Figura 1- Localização anatômica do timo em hamster, cranial aos pulmões e ......... 16 

Figura 2- Fotomicrografia da divisão histológica das regiões do timo. Bar= 100µm. 17 

Figura 3-Vasos sanguíneos no timo de camundongo após injeção vascular com 

emulsão fotográfica. 200µm. ..................................................................................... 18 

 

CAPÍTULO 2 

 

Figura 1- Detecção imuno-histoquímica de amastigotas em baço, fígado e timo. 

Amastigotas (setas) foram detectadas por imuno-histoquímica ................................ 41 

Figura 2- Deposição de tecido conjuntivo no timo e demonstração da avaliação da 

porcentagem de área de azul (colágeno maduro) no timo corado com tricrômico de 

Masson ...................................................................................................................... 44 

Figura 3- Imunomarcação para vimentina. ................................................................ 45 

Figura 4- Imunomarcação para citoqueratina. ........................................................... 46 

Figura 5- Imunomarcação de macrófagos ................................................................. 47 

Figura 6- Imunomarcação de linfócitos B CD79+ ...................................................... 48 

Figura 7- Imunomarcação de linfócitos T CD3+. ....................................................... 49 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 

 

APCs- Célula apresentadora de antígeno 

cTEC- Células epiteliais tímicas corticais 

DN- Duplo negativo 

DP- Duplo positivo 

L- Leishmania 

LV- Leishmaniose Visceral 

OMS- Organização Mundial da Saúde 

PBS- Tampão fosfato-salino 

PCR- Reação em cadeia da polimerase 

PS- receptor de fosfatidilserina 

MHC- Complexo principal de histocompatibilidade 

mTEC- Células epiteliais medulares 

RT- Transição reversa  

TEC- Células epiteliais tímicas 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

SUMÁRIO 

 

1 INTRODUÇÃO GERAL ..................................................................... 15 

1.1 Características tímicas gerais ......................................................... 15 

1.2 Estrutura histológica tímica ............................................................. 17 

1.3  Funções das células do timo ......................................................... 19 

1.3.1 Células epiteliais e mesenquimais ................................................................... 19 

1.3.2 Células hematopoiéticas .................................................................................. 20 

1.4 Microambiente tímico e desenvolvimento células T ........................ 21 

1.5 Leishmaniose Visceral .................................................................... 23 

1.5.1  Resposta Imune a Leishmniose Visceral ........................................................ 24 

1.6 Modelo experimental ...................................................................... 25 

1.7 Alterações no timo durante a leishmaniose visceral ....................... 25 

1.8 Justificativa ..................................................................................... 28 

1.9 Objetivos ........................................................................................ 28 

2 CAPITULO 1- EFEITOS DA INFECÇÃO POR LEISHMANIA INFANTUM 

NA MORFOLOGIA E COMPOSIÇÃO CELULAR DO TIMO DE HAMSTER 

(MESOCRICETUS AURATUS) ............................................................ 29 

2.1 Resumo .......................................................................................... 29 

2.2 Abstract .......................................................................................... 31 

2.3 Introdução ...................................................................................... 33 

2.4 Materiais e Métodos ....................................................................... 35 

2.4.1 Delineamento Experimental ............................................................................. 35 

2.4.2 Animais ............................................................................................................. 35 

2.4.3 Ética ................................................................................................................. 35 

2.4.4 Colheita do Material.......................................................................................... 36 

2.4.5 Comprovação da infecção ................................................................................ 36 

2.4.6 Histologia e morfometria do timo ...................................................................... 36 

2.4.7 Imuno-histoquímica .......................................................................................... 37 

2.4.8 Avaliação da Imuno-histoquímica ..................................................................... 39 

2.4.9 Análise estatística ............................................................................................ 40 

2.5 Resultados ..................................................................................... 40 

2.5.1 Detecção e densidade parasitária de L. infantum em baço, fígado e timo ....... 40 

2.5.2 Histologia e morfometria do timo ...................................................................... 43 

2.5.3 Imunomarcação de tipos celulares encontrados no timo.................................. 45 

2.6 Discussão ....................................................................................... 51 

2.7 Conclusão ...................................................................................... 56 

2.8 Referências .................................................................................... 56 

Apêndice A- Referências da Introdução Geral ...................................... 63 



 
 

ANEXOS .............................................................................................. 75 



15 
 

1 INTRODUÇÃO GERAL 

 

 A imunidade adaptativa é responsável pela flexibilidade e especificidade da 

resposta imune atuando a partir de respostas celulares e humorais, sendo os linfócitos 

T constituintes da resposta celular e o timo responsável pela geração dos linfócitos T 

maduros através da manutenção de um microambiente único de forma que nenhum 

outro tecido pode exercer sua função (MILIĆEVIĆ; MILIĆEVIĆ, 2004).  

 As respostas imunes, humoral e celular, estão envolvidas na resposta à 

leishmaniose visceral (LV) e vão determinar a apresentação da doença, em 

sintomática ou sintomática.  

 

1.1 Características tímicas gerais 

 

 O timo é um órgão linfoepitelial que atua como um órgão linfoide primário 

(ANDERSON; JENKINSON, 2001) e localiza-se no interior do tórax  dos mamíferos 

na região cranial ao esterno (OWEN; JENKINSON, 1984).  No hamster tem a forma 

de um corpo glandular achatado posicionado um pouco à direita do plano mediano 

(MICHEL, 2010) (Figura 1). Composto por dois lobos circundados por uma cápsula de 

tecido conectivo de onde se originam septos que penetram o parênquima formando 

vários lóbulos (DUIJVESTIJN; HOEFSMIT, 1981). Ao contrário dos mamíferos 

domésticos, o timo do hamster é pouco lobulado e achatado (MICHEL, 2010).  Cada 

lóbulo tímico possui 3 regiões distintas, córtex, medula e região corticomedular. A 

região medular do timo é rodeada pelo córtex, e na transição entre estas se localiza a 

região corticomedular (DUIJVESTIJN; HOEFSMIT, 1981) (Figura 2).  

 A composição celular do timo inclui células hematopoiéticas e não 

hematopoiéticas. Os componentes não hematopoiéticos constituem a estrutura do 

timo fornecendo a matriz para o desenvolvimento dos timócitos, podendo ser 

identificados pela expressão ou não de queratina. As células epiteliais tímicas 

possuem queratina no seu citoesqueleto, o que não é observado nas células 

mesenquimais. As células epiteliais do timo têm uma origem controversa, porém, a 

origem única a partir do revestimento endodérmico da terceira bolsa faríngea é 

atualmente a mais aceita, já as células mesenquimais, se originam da crista neural. 

Entre os componentes hematopoiéticos temos as células dendríticas, os macrófagos 



16 
 

 

 

e os linfócitos B (BLACKBURN et al., 2002; MÜLLER et al., 2005; NICOLAS et al., 

1986; RODEWALD, 2008; YAMANO et al., 2015). 

 O tecido primordial do timo surge entre o nono e o décimo dia de 

desenvolvimento embrionário e está associado ao primórdio da paratireoide 

(ACKERMAN; KNOUFF, 1965). O peso relativo do timo do hamster aumenta de forma 

acentuada até cerca de 15 dias de idade, atingindo seu maior peso juntamente com a 

maturidade sexual por volta de 42 dias. Esse peso se mantém praticamente o mesmo 

até os 60 dias, quando começa uma lenta e gradativa redução. Após 200 dias de idade 

é possível observar alterações relacionadas a involução tímica como aumento na 

deposição de gordura na cápsula e septos, no entanto até um ano de idade o hamster 

ainda tem um timo bastante grande (MICHEL, 2010). Embora a resposta imune T 

dependente diminua com a idade não se sabe se involução tímica decorrente dela é 

irreversível ou se é um processo dinâmico. Outros fatores, tais como, doenças, 

estresse e emagrecimento podem levar a involução ou atrofia aguda do timo, um 

processo possivelmente reversível (MOHR; DUNGWOTTH, 1992).  

 

Figura 1- Localização anatômica do timo em hamster, cranial aos pulmões e 

Coração (seta) 

.  



17 
 

 

 

Fonte: Arquivo do laboratório de patologia das moléstias infecciosas da Universidade de São Paulo. 

 

Figura 2- Fotomicrografia da divisão histológica das regiões do timo. Bar= 100µm. 

 

Fonte: Arquivo pessoa 

 

1.2 Estrutura histológica tímica 

  

 O timo é composto por uma rede tridimensional organizada (3D) de células 

epiteliais tímicas corticais e medulares (cTECs e mTECs, respectivamente). 

Entremeadas a estas células epiteliais estão dispersos linfócitos T, linfócitos B e 

populações de outras células distribuídas no córtex, medula e região cortimedular 

(PEARSE, 2006; VAN EWIJK, 2011). Histologicamente, o córtex é caracterizado por 

possuir uma alta densidade de timócitos, pequenos linfócitos imaturos, que dão a a 

esta região uma aparência basofílica mais escura. Entremeados a estas células, são 

encontrados macrófagos e, na região subcapsular, linfoblastos grandes e 

mitoticamente ativos. Os linfoblastos subcapsublares se dividem rapidamentemas tem 

uma vida curta. Morrem por apoptose e formam os corpos apoptóticos corticais, que 

são fagocitados por macrófagos resultando nos chamados "macrófagos corpo 

Córtex 

Medula 

Corticomedular 



18 
 

 

 

tingíveis". A medula é caracterizada pela baixa densidade de linfócitos T, a maioria 

maduros, com tamanho maior e com mais citoplasma que os linfócitos T corticais, o 

que explica a sua coloração basofílica mais clara. Suas células epiteliais são 

proeminentes e se juntam formando os corpúsculos de Hassal. Além de linfócitos T e 

células epiteliais são encontrados macrófagos, células dendríticas e linfócitos B na 

região medular. A zona corticomedular é caracterizada por conter vasos sanguíneos 

abundantes, linfócitos T maduros e imaturos, células dentríticas, linfócitos B e células 

plasmáticas (DUIJVESTIJN; HOEFSMIT, 1981; PEARSE, 2006). 

 Os vasos sanguíneos chegam e saem do timo através do hilo localizado no 

septo principal. A artéria hilar bifurca no septo em dois ramos, cranial e caudal que se 

ramificam em arteríolas. As arteríolas são sustentadas pelos septos de tecido 

conjuntivo que penetram os lobos até a região corticomedular, formando os lóbulos, 

onde estes vasos se ramificam em capilares que irrigam o córtex e a medular. No 

córtex, os capilares formam arcos que retornam a região corticomedular onde 

desembocam em vênulas e estas nas veias (Figura 3) (RAVIOLA; KARNOVSKY, 

1972; SAINTE-MARIE, 1974).  

 

Figura 3-Vasos sanguíneos no timo de camundongo após injeção vascular com 
emulsão fotográfica. 200µm. 

 



19 
 

 

 

Fonte: RAVIOLA; KARNOVSKY, 1972. 

 Os vasos sanguíneos, juntamente com macrófagos e linfócitos formam uma 

barreira sangue-timo que controla a entrada de moléculas, principalmente na região 

cortical, através de junções endoteliais impermeáveis e macrófagos posicionados em 

uma fileira contínua ao longo dos capilares. Já na medular são encontradas vênulas 

pós-capilares permeáveis que deixam passar macromoléculas, e arteríolas com 

poucas junções endoteliais intercelulares, deixando os linfócitos medulares em 

contato com qualquer substancia veiculada no sangue. No entanto, as moléculas que 

alcançam a medular não chegam ao parênquima cortical (MILIĆEVIĆ; MILIĆEVIĆ, 

2004; RAVIOLA; KARNOVSKY, 1972). 

 

1.3  Funções das células do timo 

 

 No timo são encontradas células linfoides representadas pelos timócitos e 

células não linfoides tais como as células sistema mononuclear fagocitário, células 

epiteliais e mesenquimais que compõem o estoma tímico juntamente com linfócito B 

(MILICEVIC et al., 1987; MILIĆEVIĆ; MILIĆEVIĆ, 2004; RITTER; BOYD, 1993; 

RODEWALD, 2008; STUTMAN, 1977).  

 

1.3.1 Células epiteliais e mesenquimais 

 

 As células epiteliais tímicas (TECs) são divididas em duas populações 

denominadas células epiteliais corticais (cTECs) e células epiteliais medulares 

(mTECs) (RITTER; BOYD, 1993), porém, existem outras subpopulações celulares 

considerando-se morfologia e fenótipos diferentes. Por meio de imuno-histoquímica 

com anticorpos monoclonais para citoqueratinas foram identificados seis subtipos de 

células epiteliais tímicas (COLIC et al., 1989). Já em estudos ultraestruturais foram 

descritos sete subtipos de células epiteliais, quatro deles foram predominantemente 

situados no córtex e três estavam posicionados dentro da medula tímica. No córtex 

foram descritas as células epiteliais subcasulares paraseptais perivasculares (1), 

células epiteliais pálidas (2), células epiteliais intermediárias (3) e células epiteliais 

escuras (4). Na medula, células epiteliais indiferenciadas (5), células epiteliais grandes 



20 
 

 

 

medulares (6) e células epiteliais em formato de fuso (7) (MILIĆEVIĆ; MILIĆEVIĆ, 

1997). 

 As TECs representam o principal componente celular do microambiente tímico 

(GUYDEN; PEZZANO, 2002), e são responsáveis pela formação de uma rede 

tridimensional esponjosa composta por extensões citoplasmáticas alongadas 

interconectadas por desmossomas, que facilitam a migração de timócitos em 

desenvolvimento, e melhoram as interações célula-célula entre linfócitos e 

componentes do estroma (VAN EWIJK, 1991; VAN EWIJK et al., 1988). As cTECs 

estão intimamente ligadas ao estroma, e estão relacionadas ao recrutamento das 

células pré-Ts da medula óssea e seu comprometimento em linfócito T, seus 

prolongamentos são perpendiculares a capsula permitindo a sustentação de timócitos 

que vão do córtex para medula, induzem a expressão do TCR e expressam MHC I e 

II o que permite a seleção positiva (DERBINSKI et al., 2016; MILIĆEVIĆ et al., 1992; 

NITTA et al., 2008). As mTECs se agrupam concentricamente formando os 

corpúsculos de Hassall, estruturas raras em roedores (KOHNEN; WEISS, 1964), que 

atuam na seleção negativa e indução de tolerância central e geração de linfócitos T 

regulatórios (BOEHM et al., 2003; NITTA et al., 2008).  

 As células mesenquimais são representadas pelas células que compõem o 

tecido conjuntivo da capsula e septos, e as células endoteliais (RODEWALD, 2008).  

No timo embrionário as células mensenquimais regulam a proliferação do epitélio 

tímico fornecendo fatores de crescimento para células epiteliais tímicas imaturas 

(JENKINSON; JENKINSON; ANDERSON, 2003). Além disso as células 

mesenquimais não apenas suportam a diferenciação da estrutura epitelial tímica, mas 

podem ter um papel no desenvolvimento inicial de células T e na linfopoiese 

(SUNIARA; JENKINSON; OWEN, 2000). 

 

1.3.2 Células hematopoiéticas 

 

 Entre as células com origem hematopoéticas do timo estão descritas as células 

dendrídicas, os macrófagos, linfócito B (MILICEVIC et al., 1987; RODEWALD, 2008), 

e eosinófilos (THROSBY et al., 2000). 



21 
 

 

 

 Os macrófagos são encontrados nas três regiões tímicas, no entanto, eles 

variam morfologicamente em cada área. No córtex, os macrófagos contêm linfócitos 

em vários estágios de degradação em seu interior, e são chamados de “macrófagos 

corpo tingíveis”. Na zona corticomedular, os macrófagos se caracterizam por conter 

numerosas inclusões vacuolares de diferentes tamanhos. E na medula são 

caracterizados como células interdigitantes. Atuam no reconhecimento e fagocitose 

de células apoptóticas, ativação da proliferação de timócitos maduros e seleção na 

negativa de linfócitos (MILICEVIC et al., 1987; MILIĆEVIĆ; MILIĆEVIĆ, 2004) 

 No timo são descritas pelo menos duas populações de células dendríticas, as 

linfoides ou plasmocitoides e as mielóides (DONSKOY; GOLDSCHNEIDER, 2003). 

Não está claro a relação das células dendríticas com o desenvolvimento de células 

interdigitantes, porém, as células dendríticas linfoides ou plasmocitoides parecem 

serem capazes de se diferenciar em células interdigitantes (Bendriss-Vermare et al., 

2001).  

 A presença de células B no timo normal é descrita principalmente na região 

medular e corticomedular, em geral agrupadas em torno dos corpúsculos de Hassall, 

e de origem sanguínea. Estas células têm no timo um papel  importante na 

apresentação de antígenos que permitem a seleção negativa (ISAACSON; NORTON; 

ADDIS, 1987; YAMANO et al., 2015). 

 Os eosinófilos tímicos ainda não têm função esclarecida na fisiologia tímica, no 

entanto parecem atuar na modulação da seleção e diferenciação de células T. A 

quantidade de eosinófilos no timo apresenta variações, e atingem um pico aos 14 dias 

de gestação seguida por uma posterior redução e novo aumento que coincide com 

início da involução decorrente da idade em camundongos (THROSBY et al., 2000). 

 

1.4 Microambiente tímico e desenvolvimento células T 

 

 A maturação e desenvolvimento imunológico das células T envolve as etapas 

de diferenciação e proliferação, rearranjo genético do receptor de células T (TCR), e 

as seleções positiva e negativa (LIND et al., 2001; PEARSE, 2006).  



22 
 

 

 

 Os timócitos passam por vários estágios sucessivos de maturação, e diferentes 

células não linfocitárias fornecem e mantem os nichos microambientais adequados 

em diferentes regiões do  timo para que cada estágio de maturação ocorra 

(MILIĆEVIĆ; MILIĆEVIĆ, 2004). Contudo, a manutenção destes microambientes 

depende da presença dos linfócitos em diferenciação, caracterizando uma interação 

bidirecional (RITTER; BOYD, 1993; ZHANG; SUN; ZHAO, 2007). 

 As células pré-T são originadas no saco vitelino, fígado fetal, e na medula 

óssea, e migram para o timo onde são chamados de timócitos (STUTMAN, 1977). A 

população de timócitos pode ser dividida em três subpopulações: duplo-negativas, 

duplo-positivas e simples positivas, de acordo com o estágio de diferenciação em que 

expressam CD4 e CD8. Essa divisão reflete os eventos fisiológicos e as interações 

célula-célula que ocorrem no timo de acordo com características morfológicas, 

fenotípicas, e distribuição dos timócitos dentro do tecido do timo (MILIĆEVIĆ; 

MILIĆEVIĆ, 2004).  

 O estágio I é representado pelos timócitos imaturos que não expressam TCR 

ou as moléculas acessórias CD4 e CD8, devido a isto, são denominadas timócitos 

duplo-negativos (DN) e representam 5% do total de timócitos (SAVINO et al., 2007). 

Estes podem ser classificadas em quatro subestágios de diferenciação denominados 

DN-1, 2, 3 e 4 (LIND et al., 2001). As células pré-Ts chegam no timo na região 

corticomedular, estas são consideradas em estágio DN1 e tem potencial 

multilinhagem, incluindo linfócitos T e B, e células dendríticas. Durante a migração 

através do córtex as células DN1 tornam-se DN2, e se acumulam na região 

subcapsular. Estas têm potencial de originar linhagens T e células dendríticas e se 

diferenciam em DN3. As DNA3 já estão absolutamente comprometidas com a 

linhagem T, mas ainda podem dar origem as células α/β ou γ/δ, geralmente 

encontradas no terço externo do córtex (PETRI; SCOLLAY; SHORTMAN, 1992; WU; 

LI; SHORTMAN, 1996). As DN4 representam uma população préT-duplo positivas 

(TOURIGNY et al., 1997).  

 As duplo positivas (DP) representam o segundo estágio de diferenciação e são 

uma população que expressa CD4 e CD8 e representam 80% de toda a população 

tímica (SAVINO et al., 2007). No próximo nível de maturação as DP se diferenciam 

em CD8+ ou CD4+ positivos únicos o terceiro estágio de diferenciação. Nesta fase 

ocorre o desenvolvimento do TCR e este permite a diferenciação para o estágio III de 



23 
 

 

 

diferenciação, simples positivo (CAMPBELL; HASHIMOTO, 1993), que é dependente  

do envolvimento bem-sucedido do TCR no DP com moléculas de classe do complexo 

principal de histocompatibilidade (MHC). Neste ponto, a interação com MHC I leva à 

diferenciação em precursores de células T citotóxicas/supressoras CD8+, enquanto 

que o envolvimento com MHC II leva à diferenciação em precursores de células T 

auxiliares CD4+ (DE WAAL et al., 1997; KISIELOW et al., 1988).  

 Após se tornarem simples positivas, as células T passam pela seleção negativa 

que consiste na eliminação por apoptose de células que reagem a autoantígenos 

(KAPPLER; ROEHM; MARRACK, 1987). Após uma meticulosa seleção as células que 

cumprem os rigorosos critérios funcionais são liberadas do timo para compor o pool 

de linfócitos periféricos (MILIĆEVIĆ; MILIĆEVIĆ, 2004). 

 

1.5 Leishmaniose Visceral 

 

 As leishmanioses são um grupo de doenças infecciosas parasitárias com 

significativa diversidade clínica e epidemiológica causada por várias espécies 

diferentes do protozoário Leishmania (BANETH et al., 2008).  A LV é causada pelo 

protozoário Leishmania donovani em seres humanos e L. infantum (chagasi) em 

humanos e cães (MULLA; OSMAN HUSSIEN; MOHAMED ELHUSSEIN, 2016). É 

transmitida principalmente durante o repasto sanguíneo de flebotomíneos fêmeas, na 

forma de promastigotas metacíclicas flageladas, que são fagocitadas por macrófagos 

onde se diferenciam em amastigotas não flageladas. Tem como principal vetor no 

continente americano o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis (BANETH et al., 2008; 

STANLEY; ENGWERDA, 2007).  

 A OMS estima que o risco de transmissão de Leishmania sp atinja mais de 350 

milhões de pessoas, sendo que a LV foi considera endêmica  em 78 países e territórios 

(WHO | EPIDEMIOLOGICAL SITUATION, 2020).  No período de 2011 até 2018 houve 

uma tendência decrescente no número de casos notificados, com menos de 20.000 

casos anuais. Esta redução se deve ao programa de eliminação de LV na região do 

Sudeste Asiático, a única região em que a prevalência da doença tem diminuído de 

forma acentuada e continua. Contudo, a leishmaniose continua a se espalhar, com 

quatro novos países sendo adicionados como endêmicos de 2017 a 2018. O Brasil 



24 
 

 

 

está entre os cinco países que reportaram mais de 1000 casos em 2018  

representando 83% dos casos globais (OPS, 2017). (PLAN DE ACCIÓN PARA FORTALECER LA VIGILANCIA Y 

CONTROL DE LAS LEISHMANIASIS EN LAS AMÉRICAS 2017-2022 - OPS/OMS | ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD, [s.d.]). 

1.5.1  Resposta Imune a Leishmniose Visceral 

 

 A evolução clínica da LV depende da resposta imune desenvolvida. Em geral 

as célula alvo do parasita são os macrófagos que devido sua atividade antiparasitária 

inibida, servem como local de replicação (BANETH et al., 2008; BARBIÉRI, 2006; 

NYLÉN; GAUTAM, 2010).  

 Resumidamente, a susceptibilidade à leishmaniose decorre da capacidade do 

protozoário de modular a resposta imune através de um desequilíbrio entre as 

respostas Th1 e Th2. Provocando uma resposta imune predominante humoral, com 

perfil de citocinas Th2 como a IL-4, IL-10 e TGF-β, que são ineficientes no controle da 

multiplicação do protozoário. A resposta Th2 está relacionada à ocorrência de lesões 

sistêmicas, com proliferação de linfócitos B, plasmocitose, hipergamaglobulinemia e 

formação de imunocomplexos. A apresentação assintomática é caracterizada por uma 

resposta predominante Th1, com a produção de citocinas como INF-, TNF-α, IL-2 e 

IL-12, e proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+ (BARBIÉRI, 2006; NYLÉN; 

GAUTAM, 2010; PERUHYPE-MAGALHAES et al., 2005). Os linfócitos T-reguladores 

participam da susceptibilidade à LV através da supressão da resposta Th1 pela IL-10 

(ANDERSON; MENDEZ; SACKS, 2005).  O papel da resposta Th17 ainda permanece 

controverso, estando relacionada a lesões mais graves em estudo L. major 

(ANDERSON et al., 2009) e com redução da carga parasitária em estudo com L. 

infantum (QUIRINO et al., 2016).  

 A ativação dos diferentes subgrupos de respostas na LV depende da interação 

de células apresentadoras de antígenos (APCs), macrófagos e células dendríticas, 

com a TCD4+ modulando a secreção de citocinas (LEÓN; LÓPEZ-BRAVO; ARDAVÍN, 

2007). Para se manter a Leishmania precisa evitar a ativação de macrófagos e o 

reconhecimento de antígenos pelas células T utilizando-se de vários mecanismos, tais 

como entrada silenciosa nos macrófagos utilizando receptores não desencadeantes 

que levam a fagocitose não inflamatória utilizado para fagocitose de células 

apoptóticas, como CR1 e o receptor de fosfatidilserina, a inibição da função do 



25 
 

 

 

macrófago e regulação negativa de co-receptores como B7 e do MHC de classe II,  e 

promovendo a produção de citocinas regulatórias como IL-10 e TGFβ (GOTO; 

LINDOSO, 2004; KIMA, 2007; ROSENTHAL et al., 1996; UENO et al., 2009; 

WANDERLEY et al., 2006). 

   

1.6 Modelo experimental 

 

 O hamster é considerado um importante modelo experimental na LV devido à 

sua suscetibilidade à infecção por diferentes cepas de Leishmania (REQUENA et al., 

2000), desenvolvendo sinais clínicos e alterações patológicas semelhantes às 

observadas nas doenças humanas e caninas (MOREIRA et al., 2012). A infecção 

experimental e a progressão da doença no hamster podem ser conduzidas a partir de 

um inóculo próximo ao que ocorre durante a infecção natural (REQUENA et al., 2000; 

WARBURG; SCHLEIN, 1986), e após a infecção sistêmica desenvolvem uma carga 

parasitária visceral progressiva, esplenomegalia, disfunção da medula óssea, 

caquexia e morte (MELBY et al., 2001). 

  Apesar de muito utilizados em estudos experimentais da LV, os camundongos 

podem não reproduzir as características da LV humana ativa, o que vai depender da 

linhagem do camundongo, via de inoculação e carga da infecção experimental. Além 

disso, mesmo os camundongos BALB/c que possuem supressão do gene Slc11a1 

que permite o aumento inicial da carga parasitária no fígado, posteriormente 

desenvolvem mecanismos imunes adquiridos que controlam a carga parasitária em 

baço (KAYE et al., 2004; NIETO et al., 2011; PACIELLO et al., 2010). 

 Levando em consideração esses fatores, o hamster sírio foi considerado um 

bom modelo experimental para o estudo das características patológicas da LV ativa 

(NIETO et al., 2011).  

 

1.7 Alterações no timo durante a leishmaniose visceral 

 



26 
 

 

 

 O timo é afetado por diversos agentes infecciosos, tais como bactérias, vírus, 

fungos e helmintos (SAVINO, 2006). Entre os protozoários descritos afetando o timo 

temos a L. infantum (chagasi), L. donovani, L. tropica, Trypanosoma cruzi, 

Plasmodium chabaudi chabaudi (COSTA et al., 2003; CUERVO-ESCOBAR et al., 

2014; GONZÁLEZ et al., 2016; SCHNUR; ZUCKERMAN; MONTILIO, 1973). A 

presença de amastigotas de L. infantum foi descrita no timo de cão, camundongo e 

hamster (CUERVO-ESCOBAR et al., 2014; GONZÁLEZ et al., 2016; LOSADA-

BARRAGÁN et al., 2017; SCHNUR; ZUCKERMAN; MONTILIO, 1973). 

 No estudo em cães naturalmente infectados com L. infantum foram colhidos 16 

timos. Além da avaliação histológica, foram submetidos à imuno-histoquímica para 

pesquisa do parasito e detecção de laminina e fibronectina. Também foi feita  pesquisa 

do DNA do parasito com hibridização in situ e reação em cadeia da polimerase (PCR). 

Na imuno-histoquímica foram detectadas amastigotas em 8 timos, enquanto que, no 

PCR foi encontrado DNA de L. infantum em 14 timos. Nos timos onde não foi 

detectado DNA por PCR, este foi detectado por hibridização in situ. NO exame  

histopatologico os autores relataram a ocorrência de  timite granulomatosa ou 

piogranulomatosa com maior deposição de fibronectina em cães com mais sinais 

clínicos (SILVA et al., 2020). 

 Três estudos utilizaram camundongos BALB/c divididos em quatro grupos. O 

1º grupo foi não infectado e foi mantido bem nutrido em proteínas, o 2º foi infectado e 

mantido bem nutrido em proteínas, o 3º grupo não infectado mantido malnutrido em 

proteínas e o 4º grupo foi infectado e mantido malnutrido em proteínas. Nestes 

estudos foram avaliados parâmetros como peso, histologia e morfometria tímicas. A 

presença de amastigotas no timo foi investigada com imuno-histoquímica e 

imunoflorecencia, e as populações celulares foram avaliadas por meio de citometria 

de fluxo. Os estudos incluíram também a  expressão genica de citocinas e quimiocinas 

por RTqPCR, e detecção de citocinas e quimiocinas pela técnica de luminex e  teste 

ELISA . Como resultado, os autores observaram que no grupo infectado e bem nutrido 

houve aumento de peso e celularidade do timo, em contraste a uma redução na 

porcentagem de timócitos duplo positivos e linfócitos TCD4+. Além disso a expressão 

de citocinas e quimocinas, e a quantidade de proteínas no timo também foram 

https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/plasmodium-chabaudi


27 
 

 

 

alteradas pela LV(CUERVO-ESCOBAR et al., 2014; LOSADA-BARRAGÁN et al., 

2017, 2019). 

 No estudo realizado em  hamsters foram utilizados 5 grupos infectados de sete 

animais eutanasiados nos dias 7, 15, 30, 45 e 60 após a infecção. Foram realizadas 

avaliações histopatológicas do timo com colorações de hematoxilina-eosina, Giemsa, 

coloração prata de Wilder e solução de verde de metila pironina para identificar 

plasmócitos. Neste estudo não foram encontradas amastigotas no timo e nem atrofia 

tímica até os 60 dias após infecção (CORBETT et al., 1992). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



28 
 

 

 

1.8 Justificativa 

 

 O desenvolvimento de doença clínica progressiva na LV depende da resposta 

imune desenvolvida pelo hospedeiro. Esta resposta é órgão específica, estando as 

respostas do Th1, Th2, Th17 e Treg envolvidas na LV. O timo é um órgão linfoide 

primário responsável pelo desenvolvimento dos linfócitos T, o que torna importante o 

estudo do timo durante a LV progressiva para se compreender o papel do timo da 

doença sistêmica. Além disto, a escassa literatura existente sobre alterações tímicas 

durante há LV, reforçam a importância deste estudo.  

 

1.9 Objetivos 

 

 Pesquisar a presença de amastigotas de L. infantum no timo e identificar 

possíveis alterações na morfologia do órgão. Também será estudado a presença e   

na e distribuição das células hematopoiéticas e estromais no timo de hamsters 

(Mesocricetus auratus) em diferentes momentos após a inoculação de L. infantum. 

 

 

 

 

 

 

 



29 
 

 

 

2 CAPITULO 1- EFEITOS DA INFECÇÃO POR LEISHMANIA 

INFANTUM NA MORFOLOGIA E COMPOSIÇÃO CELULAR DO TIMO 

DE HAMSTER (MESOCRICETUS AURATUS) 

 

Março, K.S. Effects of Leishmania infantum infection on the morphology of the 

hamster thymus (Mesocricetus Auratus). 2020. 80f. Dissertação (Mestrado)-

Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2020. 

 

2.1  Resumo 

 

A leishmaniose visceral é uma zoonose com significativa diversidade clínica e 

epidemiológica, causada por várias espécies diferentes do protozoário Leishmania. A 

maioria das pessoas e cães expostos à leishmaniose não desenvolve doença clínica, 

o que decorre do padrão de resposta imune desenvolvida pelo hospedeiro, sendo que 

os mecanismos que direcionam a resposta imune e resultam em suceptibilidade ou 

resistência a doença ainda não foram completamente elucidados.  O fato de o timo 

ser um órgão linfoide importante no desenvolvimento de células T, que são 

responsáveis por orientar as respostas imunes dos tipos Th1, Th2, Th17 e Treg 

envolvidas na resposta à infecção pela Leishmania, faz com que o estudo de 

parâmetros morfológicos, composição celular e parasitológico no timo, durante o curso 

da infecção, sejam importantes. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo 

avaliar características morfológicas e a distribuição tecidual das células 

hematopoiéticas e estromais no timo de hamsters infectados experimentalmente. Para 

isso foram utilizados 15 hamsters infectados experimentalmente com 107 

promastigotas de Leishmania infantum (MHOM/BR/1972/BH46) por via intraperitonel 

e divididos em três grupos com cinco hamsters, que foram eutanasiados em diferentes 

tempos pós-infecção, aos 15 (I-15), 60 (I-60) e 120 (I-120) dias. O grupo controle foi 

constituído por seis hamsters, eutanasiados nos tempos I-15 e I-120.  Utilizando 

técnicas histopatológicas e imuno-histoquímica avaliamos a presença de atrofia, 

inflamação, alteração morfológica e a distribuição dos tipos celulares do timo. 



30 
 

 

 

Notamos que após 15 dias de infecção ocorreu um aumento de linfócitos T CD3+ no 

timo que se normalizou com tempo aos valores de parâmetros normais, e que aos 120 

dias de infecção, ocorreu uma redução de linfócitos B CD79a+. Além disso 

amastigotas intactas de Leishmania estavam presentes em 9/15 hamsters confinada 

nas regiões medular e corticomedular do timo. Estes achados confirmam que a 

presença do parasito causa alterações na população celular do timo. Mais estudos 

são necessários para avaliar o reflexo destas alterações na resposta imune dos 

animais infectados.  

Palavras-chave:  Leishmaniose visceral. Histopatologia. Imuno-histoquímica. 

Linfócitos. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



31 
 

 

 

Março, K.S. Efeitos da infecção por Leishmania infantum na morfologia do timo 

de hamster (Mesocricetus auratus). 2020. 80 f. Dissertação (Mestrado)- Faculdade 

de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2020. 

 

2.2 Abstract 

 

Visceral leishmaniasis is a zoonosis that presents variable clinical and epidemiological 

aspects, being caused by several species of the Leishmania protozoan. Most people 

and dogs exposed to leishmaniasis do not have clinical disease, which results from the 

pattern of immune responses developed by the host. However, the mechanisms that 

direct immune responses and result in susceptibility or resistance to the disease have 

not yet been fully elucidated. The fact that the thymus is an important lymphoid organ 

in the development of T cells, responsible for guiding the Th1, Th2, Th17 and Treg 

immune responses involved in the response to Leishmania infection, makes it 

important to study the morphological, cellular and parasitological composition in the 

thymus during the course of the infection. Thus, the present study aimed to evaluate 

the morphological characteristics and tissue distribution of hematopoietic and stromal 

cells in the thymus of experimentally infected hamsters.  For this, 15 hamsters were 

experimentally infected with 107 promastigotes of Leishmania infantum 

(MHOM/BR/1972/BH46) intraperitoneally and divided into three groups with five 

hamsters, which were sacrificed at different times pos-infection in 15 (I-15), 60 (I-60) 

and 120 (I-120) days. The control group consisted of six hamsters, sacrificed at times 

I-15 and I-120. Using histopathological and immunohistochemical techniques, we 

evaluated the presence of atrophy, inflammation, morphological changes and the 

distribution of thymus cell types. We observed that after 15 days of infection there was 

an increase in CD3 T lymphocytes in the thymus, which tends to normalize with normal 

values, according to age, and that at 120 days of infection there is a reduction of CD79a 

B lymphocytes. These findings confirm that the presence of the parasite causes 

changes in the thymus cell population. Further studies are evaluated to assess the 

reflex changes in the immune response of infected animals. 

 



32 
 

 

 

Keywords: Visceral leishmaniasis. Histopathology. Immunohistochemistry. 

Lymphocyte. 

 

 

 

 



33 
 

PlosOne 
Anexo C 

2.3 Introdução 

 

 A leishmaniose visceral (LV) é uma enfermidade infecciosa parasitária de 

caráter crônico e sistêmico com apresentação clínica e epidemiológica variável [1,2]. 

Segundo a organização mundial da saúde 350 milhões de pessoas estão sobre o risco 

de transmissão de leishmaniose no mundo [3]. Em 2018, 200 países e territórios 

notificaram casos à OMS, 39% (78) deles foram considerados endêmicos, estando 12 

(15%) destes localizados nas Américas. Desde 2011 o número de casos notificados 

vem reduzindo, mas apesar disso, a leishmaniose continua a se espalhar e quatro 

novos países foram adicionados como endêmicos no período de 2017 a 2018 [4]. 

 A evolução clínica da LV depende da resposta imune desenvolvida [2]. 

Resumidamente, a susceptibilidade a LV decorre da capacidade do protozoário de 

modular a resposta imune, através de um desequilíbrio entre as respostas Th1 e Th2, 

provocando uma resposta imune predominante humoral, com perfil de citocinas Th2 

ineficientes no controle da multiplicação do protozoário e relacionadas à ocorrência 

de lesões sistêmicas. Já hospedeiros assintomáticos tem uma resposta predominante 

Th1 com proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+ [5]. Outros estudos também 

descrevem a participação de linfócitos T reguladores (Treg) e da resposta Th17 na 

leishmaniose. As células Treg estão envolvidas na produção de IL-10 e supressão da 

resposta Th1, contribuindo para o desenvolvimento da doença progressiva [6]. O 

papel da resposta Th17 durante a leishmaniose até o momento é confuso, e a 

influência da presença de interleucina IL-17 e consequentemente dos neutrófilos 

durante a infecção é dependente do tecido e espécies dos parasitas [7-9].  

 O timo é um órgão linfo-epitelial responsável por promover a maturação e 

desenvolvimento imunológico dos linfócitos T, que após a diferenciação dentro do timo 

expressam um amplo repertório de receptores TCR, capazes de reconhecer 

virtualmente qualquer antígeno estranho [10]. Os linfócitos T CD4+ que deixam o timo 

são constituintes de vários subgrupos de respostas imunes, sendo os subgrupos Th1, 

Th2, Th17 e Treg os mais descritos [11].  

 Para que a maturação e desenvolvimento imunológico dos linfócitos T ocorram 

é necessária uma interação bidirecional entre o microambiente tímico, composto por 



34 
 

 

 

células epiteliais, células dendríticas, macrófagos e a matriz extracelular com os 

linfócitos em diferenciação [12,13]. Os componentes não hematopoiéticos do timo 

podem ser classificados conforme a expressão de citoqueratinas, onde células 

epiteliais tímicas são queratina positivas e as mesenquimais que compõe vasos 

sanguíneos, septos e capsula não expressam esta proteína [14]. As células 

mesenquimais tímicas podem ser identificadas pela expressão positiva de vimentina 

[15]. 

 Histologicamente o timo pode ser dividido em três regiões, córtex, medula e 

região cortimedular. O córtex é caracterizado por possuir uma alta densidade de 

timócitos, células epiteliais e macrófagos entremeados. A medula é caracterizada pela 

baixa densidade de linfócitos T maduros e células epiteliais proeminentes, 

macrófagos, células dendríticas e linfócitos B. A transição entre o córtex e a medula 

forma a zona corticomedular, caracterizada por conter vasos sanguíneos abundantes, 

linfócitos T maduros e imaturos, células dentríticas, linfócitos B e células 

plasmáticas[16,17]. Além desses os eosinófilos também são descritos como 

residentes no timo [18]. 

 A presença de amastigotas de Leishmania infantum foram relatadas no timo 

em estudos com camundongos BALB/C [19] e em cães [20], e também em cultura de 

amostras de tecido de hamsters [21]. Na infecção pela L. infantum foi observada 

atrofia do timo e timite granulomatosa ou piogranulomasosa em cães, e aumento de 

celularidade e do peso do timo em contraste com redução da porcentagem de 

linfócitos TCD4+/CD8+ e TCD4+ em camundongos [19,20,22]. 

 Neste estudo, usamos o hamster como modelo para avaliar o efeito da infecção 

por L. infantum na morfologia do órgão e na sua composição celular. Utilizando imuno-

histoquímica demonstramos que a L. infantum está presente no timo dos animais 

infectados. A presença do parasito e/ou os efeitos sistêmicos da doença inicialmente 

resultam em aumento do número total de linfócitos T CD3+, e em uma fase mais tardia, 

ocorre redução do número total de linfócitos B CD79a+. No entanto, a infecção não 

afeta a involução fisiológica do timo, e a distribuição e número de células epiteliais, 

mesenquimais e macrófagos.  

 



35 
 

 

 

2.4 Materiais e Métodos 

 

2.4.1 Delineamento Experimental  

 

 Quinze hamsters inoculados por via intraperitoneal com 107 promastigotas de 

Leishmania infantum (MHOM/BR/1972/BH46), em fase estacionária de crescimento 

mantidas por no máximo quatro passagens em meio de cultura Schneider 

suplementado 10% com soro fetal bovino, foram divididos aleatoriamente em 3 grupos 

com cinco animais, que foram eutanasiados em diferentes tempos pós-infecção, 15 

(I-15), 60 (I-60) e 120 (I-120) dias. O grupo controle foi constituído por seis animais 

que foram eutanasiados nos tempos I-15 (n=3) e I-120 (n=3) (Fig S1).  

 

2.4.2 Animais 

 

 Foram utilizados hamsters sírios (Mesocricetus auratus), machos entre seis e 

oito semanas de idade com peso corporal entre 50 a 80g, originados do Biotério 

Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, onde foram 

mantidos em gaiolas com temperatura constante, e ciclo de luz e escuro de 12 horas, 

ração comercial e água à vontade até o momento da eutanásia. Os animais foram 

inoculados e mantidos no Biotério de Experimentação Animal do Instituto de Medicina 

Tropical até o momento em que foram eutanasiados para colheita das amostras. O 

processamento histológico e imunohistoquímico foi realizado no LApap (Laboratório 

de Patologia Aplicada) na FMVA-Araçatuba-UNESP. 

 

2.4.3 Ética 

 

  Todos os procedimentos e métodos utilizados no estudo foram submetidos à 

avaliação das Comissões de Ética no Uso de Animais – CEUA da FOA, UNESP, 

Araçatuba/SP, nº00620-2019, e USP-São Paulo/SP, nº172/14 

 



36 
 

 

 

2.4.4 Colheita do Material 

 

 A eutanásia foi realizada com dose letal de tiopental sódico (120 mg/kg) 

seguida pela realização de necropsia para colheita do timo, baço e fígado. O timo foi 

então separado em dois lobos, um lobo foi juntamente com fragmentos de baço e 

fígado, fixados em formalina 10% e processados rotineiramente para inclusão em 

parafina e o outro foi armazenado por 24 horas a temperatura de 4ºC e posteriormente 

estocado a -80ºC para utilização em outros experimentos. 

 

2.4.5 Comprovação da infecção 

 

 Para comprovar a infecção sistêmica foi realizada imuno-histoquímica para 

detecção de amastigotas em fígado e baço segundo Tafuri et al. [23]. Utilizando como 

anticorpo primário soro hiperimune heterólogo de camundongo cronicamente 

infectado com Leishmania (V.) shawi (MHOM/BR/1996/m15789) (gentilmente cedido 

pela Professora Marcia Dalastra Laurenti) na concentração de 1:1000 em PBS com 

BSA 1%, incubado por duas horas em estufa a 37ºC. O sistema estreptavidina-biotina 

com incubações de 45 min a 37ºC (Kit Link-DAKO, LSAB2, Catálogo nº KO675-1; 

Carpinteria, Califórnia, EUA) foi utilizado como anticorpo secundário. 

 

2.4.6 Histologia e morfometria do timo 

 

 Cortes histológicos com 5µm foram corados com hematoxilina e eosina ou 

tricrômico de Masson, e avaliados em microscopia de luz para avaliação de 

parâmetros morfológicos.  

 A atrofia foi avaliada subjetivamente e classificadas em linha gerais segundo 

van Baarlen [24]. O grau 0 foi definido pelo a distinção clara da demarcação 

corticomedular e alta densidade de linfócitos no córtex, com lóbulos compactados e 

separados apenas por delicados septos de tecido conjuntivo e presença discreta de  

linfofagocitose no córtex. O grau 1 foi definido como idêntico ao grau 0, exceto pela 

presença de moderada linfofagocitose no córtex. O grau 2 foi definido por uma 



37 
 

 

 

linfofagocitose acentuada no córtex, com aparecimento de sinais de redução do córtex 

e septos de tecido conjuntivo mais espessados. Em outros aspectos, o quadro 

histológico foi semelhante ao de grau 0 ou 1. O grau 3 foi definido por uma perda de 

distinção entre o córtex e a medular em baixa ampliação, linfofagocitose acentuada, 

estreitamento irregular do córtex e separação crescente dos lóbulos tímicos. O grau 4 

foi definido por uma linfodepleção acentuada do córtex, inversão histológica, perda 

frequente da demarcação corticomedular, proeminência do interstício e dos vasos 

sanguíneos, encolhimento e separação acentuada dos lóbulos tímicos. 

 A inflamação foi avaliada por dois examinadores de forma subjetiva com base 

na experiência do histopatologista. Foi avaliada a presença de alterações como 

inflamação granulomatosa ou piogranulomatosa, e presença de células inflamatórias 

nas trabéculas de tecido conjuntivo, que foram descritas previamente em cães com 

LV [20]. 

 A avaliação morfométrica foi realizada segundo o protocolo descrito por   

Bozzetta et al. [25], com algumas modificações. Para tal, as secções do timo coradas 

com HE, em ampliação 100x, foram medidas em imagens capturadas com 

microscópio Olympus BX 50 acoplado a Câmera e computador e avaliadas com 

software cellSens (Olympus Life Science). A espessura do córtex e da medula foi 

mensurada em 10 lóbulos compostos por um córtex externo e medula interna e 

cercados por tecido conjuntivo, selecionados aleatoriamente, para o cálculo da razão 

córtex:medula (Fig S2). 

 Com a aplicação da coloração de tricrômico de Masson a porcentagem de área 

de tecido conjuntivo foi avaliada no software ImageJ em 10 imagens capturadas com 

ampliação 400x (Dispositivo de imagem digital Olympus BX 50 acoplado a Câmera e 

computador). 

 

2.4.7 Imuno-histoquímica 

 

  Foi realizada reação imuno-histoquímica em cortes histológicos do timo dos 

hamsters para detecção de linfócitos T e B, células de origem mesenquimal, células 



38 
 

 

 

de origem epitelial e macrófagos utilizando os anticorpos primários conforme Tabela 

1.  

  A imuno-histoquímica para detecção de amastigotas de Leishmania spp foi 

realizada segundo Tafuri et al. [23]. Para tanto foi utilizado soro hiperimune heterólogo 

de camundongo cronicamente infectado com Leishmania (V.) shawi 

(MHOM/BR/1996/m15789) como anticorpo primário (gentilmente cedido pela 

Professora Marcia Dalastra Laurenti). 

 Os anticorpos primários foram utilizados segundo recomendação do fabricante 

ou diluídos em tampão de PBS contendo soro fetal bovino 1%. A diluição padronizada 

para uso dos anticorpos primários e a recuperação antigênica estão descritos na 

tabela 1. Para o controle negativo das reações foi adicionado o diluente sem anticorpo 

primário (Fig S3). Como controle positivo das reações, os anticorpos foram testados 

em tecido humano (tonsila). Após a recuperação antigênica, as secções histológicas 

foram lavadas com uma solução de PBS pH 7,4, e em seguida tratadas por 30 min 

com peróxido de hidrogênio a 3% diluído em metanol 50% em água, para bloquear a 

atividade endógena da peroxidase. Após lavadas 3 vezes com PBS pH7,4, as sessões 

foram incubados por 30 min em temperatura ambiente com um tampão de bloqueio 

contendo 3% de leite em pó desnatado (Molico®) em PBS pH7,4, para bloquear sítios 

de ligação inespecíficos.  

 Todos os anticorpos primários foram incubados ”overnight” por 12 a 14 horas a 

4°C em câmera úmida. Com exceção do soro hiperimune de camundongo, que foi 

incubado por duas horas em estufa a 37ºC. Após três lavagens com PBS pH7,4, os 

cortes foram incubados com anticorpo secundário conjugado com peroxidase 

(EnVisionTM FLEX - HRP) por 40 min a temperatura ambiente.  Para o soro hiperimune 

anti-leishmania foi utilizado o sistema estreptavidina-biotina com incubações de 45 

min a 37ºC (Kit Link-DAKO, LSAB2, Catálogo nº KO675-1; Carpinteria, Califórnia, 

EUA). Após três lavagens com PBS pH 7,4 foi realizada a incubação com cromógeno 

(Tabela 1), lavagem em água corrente e contracoloração com hematoxilina.  Em 

seguida os cortes foram desidratados, diafanizados e montados com resina 

transparente (Entelan®) e lamínulas de vidro.  

 

 



39 
 

 

 

Tabela 1- Lista de anticorpos, concentração, método de recuperação antigênica e 
cromógeno  utilizados nas reações de imuno-histoquímica 

Célula/ 
Parasita 

Anticorpo Concentração 
Recuperação 
antigênica 

Substrato 
Cromógeno 

Referência 

Linfócitos T 
CD3+ 

Anti-CD3 anti-
humano 
(DAKO) 

Pré-diluído Citrato pH6 
3,3’-
diaminobezidine 
(DAKO) 

[26,27] 

Linfócitos B 

Anti-CD79a 
anti-humano 
Clone 11E3 
(NovocastraTM) 

1:100 Citrato pH6 
ImmPACT™VIP-
VECTOR) 

 

Linhagem 
macrofágica 

MAC-387 rato, 
coelho, bovino, 
cão, suíno e 
macaco 
(Abcam®) 

1:300 Citrato pH6 
ImmPACT™VIP-
VECTOR) 

[27,28] 

Origem 
epitelial 

Anti-
citoqueratina 
Anti-humano 
Clone 
AE1/AE3 
(Dako) 

Pré-diluído 

Tris Hcl pH 9 
(EnVisionTM 
FLEX, High 
pH - Dako®) 

3,3’-
diaminobezidine 
(DAKO) 

[29] 

Origem 
mesenquimal 

Monoclonal 
Anti-Vimentin 
Clone V9 
(Dako) 

Pré-diluído 

Tris Hcl pH 9 
(EnVisionTM 
FLEX, High 
pH - Dako®) 

3,3’-
diaminobezidine 
(DAKO) 

[30] 

Leishmania 
spp 

Soro 
hiperimune 
Camundongo*  

1: 1000 Citrato pH6 
ImmPACT™VIP-
VECTOR) 

[23] 

* Cedido pela Professora Marcia Dalastra Laurenti  

 Para controle da especificidade do anticorpo anti-CD79a clone 11e3 para 

detectar linfócitos B em tecido de hamster, foi padronizada a reação em tecido de 

tonsila humana e baço de hamster. Observamos um padrão morfológico da marcação 

de folículos (Fig S3), e a localização morfológica das células marcada estava de 

acordo descrito por estudos em timo [16]. 

 

2.4.8 Avaliação da Imuno-histoquímica 

 

 A imunomarcação para os diferentes anticorpos foi avaliada com auxílio de um 

sistema de análise de imagem computadorizada (Olympus BX 50 acoplado a Câmera 

e computador). Após calibrado o sistema, realizou-se a captura de imagens, em 

objetiva de 40x resultando em uma ampliação final de 400x. Foram avaliadas 10 áreas 

distintas por corte histológico, cada uma medindo 89.432 µm². O software Image J 

1,52a foi utilizado para avaliar a percentagem média das áreas imunomarcadas de 



40 
 

 

 

todos os anticorpos e para contagem de parasitos imunomarcados em baço e fígado, 

que foi realizada por contagem manual de parasitos/área em µm2, tendo como 

resultado densidade parasitária em amastigotas/µm2.  Esta avaliação permitiu a 

comprovação da infecção e progressão da doença (Fig S4).  

 

2.4.9 Análise estatística 

 

 O teste de Shapiro-Wilk foi usado para avaliar a normalidade dos dados. As 

diferenças entre os grupos foram determinadas pelo teste de Kruskal-Walis e Dunn, 

para dados não paramétricos e ANOVA e Tukey para dados paramétricos. Valores de 

P <0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises 

estatísticas foram realizadas com o software Prism (v8.0.1, GraphPad, La Jolla, CA, 

EUA). 

 

2.5 Resultados  

 

2.5.1 Detecção e densidade parasitária de L. infantum em baço, fígado e timo 

  

 Para comprovar a infecção sistêmica dos hamsters verificamos a presença de 

amastigotas em baço, fígado e timo por meio de imuno-histoquímica, e determinamos 

a densidade parasitária (amastigotas/µm²) em baço e fígado.  

 As amastigotas foram detectadas no baço de 15/15 (100%) e em fígado em 

14/15 (93,3%) dos hamsters experimentalmente infectados (Figura 1A-H). Em timo as 

imunomarcações de amastigotas de Leishmania Spp foram observadas em 9/15 dos 

hamsters experimentalmente infectados, na região medular e corticomedular. Poucas 

amastigotas foram encontradas no timo o que inviabilizou o cálculo da densidade 

parasitária neste órgão. Não observamos formas amastigotas no citoplasma de 

macrófagos no timo (Figura 1B-1C). Tanto no baço como no fígado densidade 

parasitária média aumentou gradativamente com a progressão da doença (Tabela 2) 

(Figura 1G e H). 

 



41 
 

 

 

Tabela 2- Densidade parasitária em baço e fígado.  

Órgão 
Grupo 

I-15 I-60 I-120 
Média+DP Média+DP Média+DP 

Fígado 8x10-6±9x10-6 2,9x10-5±3,4x10-5 1,38x10-4±2,51x10-4 
Baço 1x10-5±5x10-6 9,4x10-5±1,11x10-4 9,5x10-4±1,188x10-3 

Hamsters infectados por L. infantum Densidade calculada pela contagem de amastigotas marcadas 

Imuno-histoquímica(amatigotas/µm2. DP- Desvio Padrão). 

 

Figura 1- Detecção imuno-histoquímica de amastigotas em baço, fígado e timo. 

Amastigotas (setas) foram detectadas por imuno-histoquímica. A e F – Soro hiperimune 

de camundongo + ImmPACT™VIP, C e D - Soro hiperimune de camundongo + 3,3’-

diaminobezidine- DAKO. (A) Baço de hamster controle positivo da reação. (B) Baço 

controle negativo sem adição de anticorpo primário. (C) Baço do hamster I2-120. (D) 

Fígado de hamster I-120.  (E) Animal controle negativo (C1-15). (F) Timo de hamster I-

120. Bar=20µm. G- Densidade parasitária no baço dos hamsters dos grupos infectados 

com de L. infantum, I-15(15 dias pós-infecção), I-60 (60 dias pós-infecção) e I-120 (120 

dias pós infecção) expresso em média ± desvio padrão. H Densidade parasitária em 

fígado dos hamsters dos grupos infectados com de L. infantum, I-15(15 dias pós-

infecção), I-60 (60 dias pós-infecção) e I-120 (120 dias pós infecção) expresso em média 

± desvio padrão. 



42 
 

 

 

 



43 
 

 

 

2.5.2 Histologia e morfometria do timo 

 

 Para determinar se a infecção pela L. infantum afetou a morfologia do timo 

foram realizadas avaliações em cortes corados por HE, buscando alterações 

compatíveis com atrofia tímica e/ou inflamação no parênquima. Os cortes corados por 

HE também foram utilizados para avaliação morfométrica e determinação da razão 

córtex:medula.  

 O grau de atrofia foi avaliado segundo van Baarlen [23], a perda de demarcação 

corticomedular foi observada em 10 hamsters infectados (6,7%) e 2 (3,3%) controles, 

a proeminência do tecido conjuntivo formando ilhas de timócitos variou foi observada 

em 6 hamsters infectados (40%) e 3 (50%) controles, a linfofagocitose foi observada 

em todos os hamsters infectados e controles, enquanto que a inversão histológica não 

foi observada em nenhum hamster.  Notamos que houve um aumento no grau de 

atrofia conforme a idade, no entanto, não houve diferença significativa entre os grupos 

(Tabela 3).  

 Avaliamos a presença de inflamação granulomatosa ou piogranulomatosa e 

presença de células inflamatórias nas trabéculas, no entanto não observamos 

inflamação no timo dos hamsters. 

 Para avaliar a quantidade de tecido conjuntivo e/ou aumento proporcional de 

tecido conjuntivo no timo por redução de outros componentes, foi utilizada a coloração 

de tricrômico de Masson, que cora o colágeno maduro em azul. A quantidade de tecido 

conjuntivo variou significativamente devido ao tempo, com aumento da porcentagem 

de área corada em azul entre os grupos controles (C-15 e C-120) (p=0,0069), sendo 

que o C-120 também teve média de área azul significativamente maior que os grupos 

infectados dos tempos 15 (p= 0,0076) e 60 (p=0,0113) e não diferiu do grupo infectado 

com mesma idade (Tabela 3 e Figura 2A-2C). 

  

 

Tabela 3- Histologia e morfometria do timo. 

Parâmetro 

Grupo 

C-15 I-15 I-60 I-120 C-120 

Média±DP Média±DP Média±DP Média±DP Média±DP 

Razão C:M 1,848±0,091 2,180±0,404 2,059±0,543 1,230±0,486 1,123±0,131 



44 
 

 

 

Atrofia 0,000±0,000  0,800±0,837 1,000±1,000 1,800±1,095 1,667±0,577 

Colágeno 1,013±0,526a 1,564±0,683b 1,770±0,993c 3,944±2,478 5,747±0,8903abc 
DP- Desvio Padrão; C:M córtex:medula; As letras indicam diferenças estatísticas usando uma análise 

Kruskal-Wallis e Dunn para razão C:M e ANOVA e Tukey para atrofia e colágeno maduro. Diferenças 

estatísticas C-15 e C-120: a (p=0,0069), I-15 e C-120: b (p=0,0076), I-60 e C-120: c (p= 0,0113). 

 

Figura 2- Deposição de tecido conjuntivo no timo e demonstração da avaliação da 

porcentagem de área de azul (colágeno maduro) no timo corado com tricrômico de 

Masson.  (A) Porcentagem de área marcada em azul (colágeno maduro) dos hamsters 

dos grupos infectados com de L. infantum, I-15(15 dias pós-infecção), I-60 (60 dias pós-

infecção) e I-120 (120 dias pós infecção) e não infectados C-15 (Mesma idade de I-15) e 

C-120 (Mesma idade de I-120) expresso em média ± desvio padrão. Diferença devido ao 

tempo de infecção entre C-120 e C-15 (**p=0,0069), I-15 (**p=0,0076), I-60 (*p=0,0113). 

(B) Avaliação da área marcada em azul utilizando o Software ImageJ, a área a ser 

mensurada é vista em vermelho (seta). (C) Colágeno maduro perivascular em azul (seta) 

(C2-120). Bar= 20µm. 

 

 



45 
 

 

 

 

2.5.3 Imunomarcação de tipos celulares encontrados no timo 

 

 Para avaliar se a infecção afetou a morfologia do timo no que diz respeito a 

distribuição e localização de células, avaliamos a quantidade de área ou células 

marcadas dos principais tipos celulares encontrados no timo, tais como, células de 

origem mesenquimal, incluindo macrófagos, e de origem epitelial, e hematopoiéticas.  

 A porcentagem média de área imunomarcada de células mesenquimais 

positivas para vimentina (Figura 3A), e células epiteliais positivas para citoqueratina 

(Figura 4A) e macrófagos MAC387 não apresentaram diferenças significativas entre 

os grupos (p>0,05) (Figura 5A) (Tabela 4). A marcação com anticorpo anti-vimentina 

foi observada na capsula, parede de vasos sanguíneos, e em células com morfologia 

compatível com macrófagos e células dendríticas, em geral a marcação estava mais 

evidente na região medular do timo (Figura 3B). 

 A citoqueratina foi detectada na camada células epiteliais subcapsulares-

perivasculares. No córtex tímico as células epiteliais corticais com prolongamentos 

interconectados foram observadas como uma malha ao redor dos tímócitos, na região 

medular tímica marcou células epiteliais medulares com morfologias variadas e 

marcou intensamente os corpúsculos de Hassal (Figura 4B-4C). 

 Os macrófagos foram identificados pelo anticorpo MAC387 nos septos, 

capsula, região cortical, medular e corticomedular do timo. Grande parte dos 

macrófagos estavam no tecido conjuntivo que constitui a capsula e septos que 

adentram o parênquima (Figura 5B). 

 

Figura 3- Imunomarcação para vimentina. (Vimentina clone V9- DAKO+3,3’-

diaminobezidine-DAKO). A- Porcentagem de área marcada nos grupos C-15, I-15, I-60, 

I-120 e C-120, expresso em média ± desvio padrão. ANOVA+Tukey. (p>0,05). B- Observa-

se marcação da parede de vasos sanguíneos (seta amarela) e de células com 

morfologia compatível com macrófagos (seta preta) (I4-60).  



46 
 

 

 

 

 

Figura 4- Imunomarcação para citoqueratina. (Citoqueratina clone AE1/AE3- 

DAKO+3,3’-diaminobezidine-DAKO). A- Porcentagem de área marcada nos grupos C-

15, I-15, I-60, I-120 e C-120, expresso em média ± desvio padrão. As diferenças 

estatísticas foram determinadas pelo teste ANOVA+Tukey. (p>0,05). (B) Células 

epiteliais subcapsulares-perivasculares descritas (seta preta) e corpúsculo de Hassal 

(seta amarela). (C) Corpúsculo de Hassal (seta). Bar=20µm. 



47 
 

 

 

 

 

Figura 5- Imunomarcação de macrófagos. (MAC-387- Abcam® + ImmPACT™VIP-

VECTOR).  A- Porcentagem de área marcada nos grupos C-15, I-15, I-60, I-120 e C-120, 

expresso em média ± desvio padrão. ANOVA+Tukey. (p>0,05). B- Observa-se a 

invaginação da capsula formando um septo (S), e no septo, a presença de macrófagos 

(seta) (I3-60). Bar=50µm.  



48 
 

 

 

 

 

 A marcação para linfócitos B (CD79a+) foi observada menor porcentagem 

média de área marcada no grupo I-120 (1,318±1,116) que no grupo C-120 (4,530± 

2,219) (Tabela 4; Fig 6A), os linfócitos B estavam principalmente na região 

corticomedular e na medular do timo, ao redor dos corpúsculos de Hassal (Fig 6B e 

C).   

 

Figura 6- Imunomarcação de linfócitos B CD79+. (Anti-CD79a Clone 11E3/NovocastraTM 

+ ImmPACT™VIP-VECTOR).  A- Porcentagem média de área marcada nos grupos C-15, 

I-15, I-60, I-120 e C-120, expresso em média ± desvio padrão. As diferenças estatísticas 

foram determinadas pelo teste ANOVA+Tukey. (p=0,0182). B- Controle negativo da 

reação (timo sem adição de anticorpo primário). C e D- Observa-se a presença de 

linfócitos B (seta) principalmente nas regiões medular e corticomedular do timo (seta). 

Timo do controle negativo grupo C-120 (C). Timo animal I2-120(D). Bar=20µm.  



49 
 

 

 

 

 A marcação para as células CD3+ estava mais evidente e intensa na região 

medular do timo dos grupos controle e infectado. A marcação de CD3+ citoplasmática 

foi observada na medular tímica dos animais infectados, enquanto que nos controles 

a marcação CD3+ foi observada na membrana das células.  A porcentagem média de 

imunomarcação de linfócitos T CD3+ do I-15 (54,66±0,512) foi significativamente 

maior que do C-15 (41,79±2,845; p=0,0031), I-60 (38,83±4,851; p=0,0001) e I-120 

(42,72±4,077; p=0,0031) (Tabela 4; Figura 7A- 7C).  

 

Figura 7- Imunomarcação de linfócitos T CD3+. (Anti-CD3 - DAKO+3,3’-diaminobezidine- 

DAKO).  (A) Porcentagem média de área marcada nos grupos 1C-15, I-15, I-60, I-120 e 

C-120, expresso em média ± desvio padrão. Grupo I-15 apresentou maior média de área 

marcada que I-60 (p=0,0001) e I-120 (p=0,0031) e menor que C-15 (p=0,0031). As 

diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste ANOVA+Tukey. (B) Controle 

negativo da reação sem adição do anticorpo primário. (C) Região medular do timo de 



50 
 

 

 

um hamster do grupo C-15 (C2-15), onde observa-se marcação predominante na 

membrana da célula. (D) Região medular do timo de um hamster do grupo I-15 (I3-15) 

onde observa-se marcação predominante citoplasmática.    

 

 

Tabela 4- Porcentagem de área marcada de células de origem mesenquimal, epitelial, macrófagos, 
linfócitos B e T no timo. 

Marcador 

Grupo 

Média ± Desvio Padrão(%) 

C-15 I-15 I-60 I-120 C-120 

Vim 44,17±0,56 48,58±11,08 48,37±2,11 42,40±17,20 55,04±7,75 

Cit 49,98±4,66 33,84±11,49 35,59±3,73 46,75±8,79 51,81±0,84 

MAC 1,46±0,48 1,24±0,32 1,58±1,50 1,49±0,97 1,30±0,26 

CD79a 2,04±0,65a 3,65±1,19 3,49±0,74 1,32±1,12 4,53±2,22a 



51 
 

 

 

CD3 41,79±2,85 a 54,66±0,50 abc 38,83±4,85b 42,72±4,07c 46,49±3,60 

Vim- Vimentina; Cit- Citoqueratina; MAC- Macrófagos; DP- Desvio Padrão; C:M córtex:medula. As 

letras indicam diferenças estatísticas usando uma análise ANOVA e Tukey. Diferenças estatísticas de 

CD79a entre C-120 e I-120: a (p=0,0182). CD3 entre C-15 e I-15: a (p=0,0031), I-15 e I-60: b 

(p=0,0001), I-15 e I-120: c (p=0,0031). 

 

2.6 Discussão 

 

 A leishmaniose visceral é uma zoonose com significativa diversidade clínica. 

Esta diversidade decorre do padrão de resposta imune desenvolvida pelo hospedeiro 

e da patogenicidade da cepa [5]. O timo é um órgão linfoide importante no 

desenvolvimento de células T, que são responsáveis por direcionar as respostas 

imunes dos tipos Th1, Th2, Th17 envolvidas na resposta a LV, assim é importante a 

avaliação de alterações tímicas durante a doença. Neste estudo avaliamos a 

morfologia tímica, o padrão de distribuição de células, e a presença do parasita no 

timo.  

 Para comprovar a infecção sistêmica dos hamsters verificamos a presença de 

amastigotas em fígado e baço por meio de imuno-histoquímica e determinamos a 

densidade parasitária (amastigotas/µm²). A média da densidade parasitária aumentou 

gradativamente em baço e fígado com o tempo da infecção (Tabela 2 e Figura 1A). 

Como a leishmaniose é uma doença progressiva em hamsters, o aumento de 

amastigotas com a progressão da doença era esperado [31].  Semelhante ao baço e 

fígado, amastigotas do parasito também foram observadas no timo (Figura 1B-1D), 

comprovando a infecção deste órgão já descrita em camundongos [19], cães [20] e 

hamster [21]. Porém neste órgão as formas amastigotas íntegras foram pouco 

frequentes. O que está de acordo com estudo em camundongos onde as amastigotas 

intactas também foram raramente observadas [19]. Neste mesmo estudo foi descrito 

um aumento da expressão de IL-12a no timo [22] o que sugere ativação da resposta 

Th1 e explica a destruição das amastigotas. Contudo o hamster é um modelo 

experimental considerado susceptível a leishmaniose, enquanto que o camundongo 

BALC/c pode montar uma resposta efetiva contra a infecção [31]. Estudos sobre as 

citocinas no timo são necessários para confirmar o tipo de resposta imune deste órgão 



52 
 

 

 

no hamster, já que leishmania é capaz de induzir diferentes respostas imunes em cada 

órgão [32].  

 Em cães as formas amastigotas foram descritas nas regiões cortical e medular 

do timo [20], enquanto que em camundongos [19] e hamsters as amastigotas foram 

detectadas apenas na região medular e/ou corticomedular. Em condições normais a 

barreira sangue-timo controla a entrada no córtex de componentes presentes no 

sangue, e mesmo moléculas que adentram a região medular não alcançam o córtex 

[33]. Portanto a falha na função dessa barreira poderia explicar a entrada de 

amastigotas no córtex tímico em cães onde o tempo de infecção não é controlado 

como em modelos experimentais, e a doença pode se desenvolver com maior 

cronicidade e estar associada a outros fatores como co-infecção e déficit nutricional.  

 Aspectos da morfologia e celularidade do timo foram estudados por meio de 

avaliação histopatológica, morfometria e imuno-histoquímica. A razão córtex: medular 

média foi de aproximadamente 2:1 nos grupos C-15, I-15 e I-60 e de 1:1 nos C-120 e 

I-120 (Tabela 3). A medular tímica ocupa normalmente um terço do volume lobular de 

um roedor adulto com uma razão córtex: medula de aproximadamente 2:1 [34]. A 

infecção pelo parasito não afetou a razão entre os compartimentos, o que também foi 

observado em estudos em cães e camundongos [20,35].  Esta ausência de diferença 

pode ter decorrido da dificuldade de detectar alterações discretas por este método [34] 

e/ou devido ao número de animais utilizado no estudo.  

 A atrofia do timo foi avaliada nos cortes corados com HE e atribuída uma 

graduação de atrofia de 0 a 4, o grau de atrofia aumentou com a idade. Contudo, não 

foi encontrada diferença no grau de atrofia tímica entre os grupos [31] (tabela 3). 

Portanto a infecção parece não induzir atrofia precoce do timo. O que está de acordo 

com um estudo que avaliou timo de hamster experimentalmente infectado com L. 

infantum [32]. Contudo, a ausência de atrofia significativa no timo dos infectados pode 

ter decorrido do caráter crônico da LV, sendo o timo um órgão-alvo comum nas 

infecções agudas [36]. Na fase aguda da Doença de Chagas por exemplo a atrofia 

tímica é frequente e severa [37,38]. No entanto, em camundongos BALB/c infectados 

com L. infantum também não foi observada atrofia 14 dias após infecção, exceto 

quando os animais foram submetidos a uma dieta pobre em proteínas [22]. 



53 
 

 

 

 Também não foi observada inflamação granulomatosa no parênquima do timo 

apesar destas alterações estarem descritas no timo de cães, onde ocorre timite 

granulomatosa ou piogranulomatosa e inflamação das trabéculas interlobulares. A 

ausência de inflamação pode ser explicada pelo fato dos hamsters possuírem mesmo 

aos 120 dias pós infecção um timo com alta celularidade linfoide T, linfócitos B e 

macrófagos residentes que não podem ser diferenciados de um infiltrado inflamatório 

na coloração de HE e ou na imuno-histoquímica com os marcadores utilizados neste 

estudo [20], outros métodos seriam necessários para caracterizar diferenças na 

subpopulação dos linfócitos. Os eosinófilos, que são células geralmente associadas 

com as infecções parasitárias são descritos no timo normal [18,39]. 

 Para melhor avaliar a deposição de tecido conjuntivo e/ou aumento 

proporcional devido à redução de outros componentes foi utilizada a coloração de 

tricrômico de Masson. A quantidade de colágeno maduro variou significativamente 

devido ao tempo, com aumento da porcentagem de área em azul entre os grupos 

controles (C-15 e C-120) (p=0,0069), sendo que o C-120 também teve média de área 

corada em azul significativamente maior que os grupos infectados dos tempos 15 (p= 

0,0076) e 60 (p=0,0113) e não diferiu do grupo infectado com mesma idade. Isto 

sugere que o aumento de tecido conjuntivo maduro foi afetado pela idade e não pela 

infecção por Leishmnaia infantum (Figura 2A). O aumento do tecido conjuntivo 

capsular e septal e dos vasos sanguíneos é descrito em camundogos infectados com 

Trypanosoma cruzi,  e possivelmente se deve a atrofia do órgão [40]. A ausência de 

atrofia significativa no timo dos hamsters infectados em relação ao controle pode ser 

confirmada pela ausência de alteração na quantidade de tecido conjuntivo. 

 A vimentina marca fibrócitos, lipócitos, células endoteliais vasculares e 

macrófagos[16,41]. Não houve diferença na área marcada por vimentina entre grupos, 

indicando que esta população de células de origem mesenquimal não é afetada pela 

infecção nos momentos estudados.  

 A área marcada para citoqueratina não diferiu entre os grupos. A citoqueratina 

AE1/AE3 marca células epiteliais tímicas, corticais e medulares [42], notamos neste 

estudo a marcação em uma fileira de células separando a capsula do parênquima 

(Figura 4B). Estas células correspondem as descritas por Milicévic et al. [43] como 

células epiteliais subcapsulares septais perivasculares, assim como as células tipo 



54 
 

 

 

“nurse” que tem um formato irregular e formam uma malha de prolongamentos na 

região cortical externa (Figura 4B e 4C). A presença de corpos de Hassal não císticos 

e não calcificados e um padrão rendado claro de células epiteliais tímicas positivas 

para citoqueratina estão entre os fatores considerados como evidência histológica de 

timopoiese (Figura 4C) [44]. As células epiteliais tímicas estão envolvidas no 

recrutamento das células pré-Ts da medula óssea e seu comprometimento em 

linfócito T, induzem a expressão do TCR e atuam na seleção positiva e negativa [45-

48]. Morfologicamente não observamos indícios de que a infecção pela L. infantum 

tenha interferido com a diferenciação dos timócitos. No entanto, a presença do 

parasito pode interferir na dinâmica deste processo, uma vez o microambiente 

necessário para desenvolvimento dos linfócitos T é mantido por uma interação 

bidirecional [12,13] e mudanças nas populações de timócitos em diferentes estágios 

de maturação já foram relatados na LV [22], e na doença de Chagas [38,40]. 

 Os macrófagos identificados com o anticorpo MAC387 foram observados na 

capsula, septos, córtex, medular e na região corticomedular do timo. A quantidade de 

área marcada para macrófagos não diferiu entre os grupos (Fig 5A). Na infecção por 

Tripanosoma cruzi os macrófagos atuam como reservatório para o parasita no timo 

[54]. Não observamos formas amastigotas no citoplasma de macrófagos no timo. Em 

seres humanos naturalmente infectados com Trypanosoma cruzi ocorre uma 

migração de macrófagos corticomedulares para região cortical do timo [40], estes 

macrófagos tem um papel importante no processo de maturação dos timócitos e tem 

a capacidade de apresentar antígenos por moléculas de MHC classe I e II, atuando 

no processo de seleção negativa dos timócitos [43] (Tabela 4).  

 Os linfócitos B CD79a+ foram observados em maior quantidade no grupo C-

120 (4,530± 2,219) que no grupo I-120 (1,318±1,116) (Tabela 4 e Fig 6A). Os linfócitos 

B e plasmócitos são descritas na medular tímica, em geral ao redor dos corpúsculos 

de Hassal. Seu número aumenta com idade [17,55] devido a um acumulo de linfócitos 

B maduros. No entanto, há uma redução de formas imaturas que tem o maior potencial 

de apresentação de antígenos que permitem a seleção negativa [56]. Sugerindo que 

a LV pode estar alterando a seleção negativa de linfócitos. Além disso, o recrutamento 

de linfócitos B devido a resposta Th2 estimulada pela LV crônica pode estar 

relacionada a sua redução no timo dos hamsters. 



55 
 

 

 

 Em relação à população das células CD3 positivas, o aumento da porcentagem 

de área marcada indica aumento da celularidade. Assim, animais do grupo I-15 

apresentaram maior número de linfócitos TCD3 do que C-15, I-60 e I-120 (Fig. 7A). O 

CD3 é um co-receptor associado ao TCR e tem a função de reconhecimento e 

sinalização, a sua expressão representa o comprometimento com a linhagem T 

[49,50]. Nossos resultados estão de acordo com a literatura onde as infecções agudas 

por L. infantum causam um aumento no número total de células no timo após 14 dias 

de infecção em camundongos[22]. Este fato também é descrito nas infecções agudas 

por Tripanosoma cruzi, devido ao aumento de CD4+ ou CD8+ TCRCD3high. Contudo, 

com a cronificação da doença ocorre a normalização do número de células linfoides 

tímicas [51] o que explica a redução da área marcada para linfócitos TCD3+ 

observada nos grupos I-60 e I-120. Além disso, observamos a marcação 

citoplasmática para o receptor CD3 de forma predominante na região medular do timo 

nos hamsters infectados (Figura 7D).  

 Os timócitos imaturos expressam marcação para o receptor CD3 no citoplasma, 

e quando maduros e localizados na região medular, o CD3 é expresso na membrana 

destas células [52,53]. Desta forma, ficou caracterizada a presença de linfócitos 

imaturos na região medular, o que possivelmente interfere com na resposta imune dos 

animais. Em estudos em camundongos foi descrita taxa de maturação acelerada de 

células duplamente positivas (CD4+/CD8+) [22] e aumento de quimiocinas como 

CXCL12 e CXCR4 que controla o fluxo de timócitos imaturos da região subcapsular 

para a medular do timo [19]. As alterações observadas no timo de hamster podem 

estar relacionadas com a chegada de timócitos imaturos na região medular, e estes 

linfócitos imaturos na medular tímica podem estar relacionados a uma liberação de 

linfócitos imaturos pelo timo.  

 A possível liberação de linfócitos imaturos parece ser um mecanismo de defesa 

importante desencadeado no início da infecção. Entretanto mais estudos precisam ser 

concluídos para confirmar alterações fenotípicas no sangue periférico e linfonodos de 

hamsters infectados. 

 



56 
 

 

 

2.7 Conclusão 

 

 Neste trabalho confirmamos que a L. infantum pode infectar o timo de hamsters 

e levar a alterações na população de linfócitos T e B, com aumento de linfócitos 

TCD3+ e presença de linfócitos T imaturos na região medular do timo após 15 dias de 

infecção e redução de linfócitos B após 120 dias de infecção. Não foi observada atrofia 

tímica até 120 dias pós infecção. O reflexo das alterações na população e maturação 

das células linfoides do timo na resposta imune sistêmica dos animais infectados 

necessita ser melhor avaliado.  

2.8 Referências 

 

1.  Moreno, J., Alvar, J. Canine leishmaniasis: Epidemiological risk and the 

experimental model. Trends Parasitol. 2002;18: 399–405. doi:10.1016/S1471-

4922(02)02347-4 

2.  Baneth G, Koutinas AF, Solano-Gallego L, Bourdeau P, Ferrer L. Canine 

leishmaniosis - new concepts and insights on an expanding zoonosis: part one. Trends 

Parasitol. 2008;24: 324–330. doi:10.1016/j.pt.2008.04.001 

3.  WHO | Epidemiological situation. WHO. 2020 [cited 22 Sep 2020]. Available: 

http://www.who.int/leishmaniasis/burden/en/ 

4.  Plan de Acción para fortalecer la vigilancia y control de las leishmaniasis en las 

Américas 2017-2022 - OPS/OMS | Organización Panamericana de la Salud. [cited 19 

Sep 2020]. Available: https://www.paho.org/es/documentos/plan-accion-para-

fortalecer-vigilancia-control-leishmaniasis-americas-2017-2022 

5.  Nylén S, Gautam S. Immunological perspectives of leishmaniasis. J Glob Infect 

Dis. 2010;2: 135. doi:10.4103/0974-777x.62876 

6.  Anderson CF, Mendez S, Sacks DL.  Nonhealing Infection despite Th1 

Polarization Produced by a Strain of Leishmania major in C57BL/6 Mice . J Immunol. 

2005;174: 2934–2941. doi:10.4049/jimmunol.174.5.2934 



57 
 

 

 

7.  Gonçalves-de-Albuquerque S da C, Pessoa-e-Silva R, Trajano-Silva LAM, de 

Goes TC, de Morais RCS, Oliveira CN d. C, et al. The equivocal role of Th17 cells and 

neutrophils on immunopathogenesis of leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 

Frontiers Media S.A.; 2017. p. 1437. doi:10.3389/fimmu.2017.01437 

8.  Anderson CF, Stumhofer JS, Hunter CA, Sacks D.  IL-27 Regulates IL-10 and 

IL-17 from CD4 + Cells in Nonhealing Leishmania major Infection . J Immunol. 

2009;183: 4619–4627. doi:10.4049/jimmunol.0804024 

9.  Quirino GFS, Nascimento MSL, Davoli-Ferreira M, Sacramento LA, Lima MHF, 

Almeida RP, et al. Interleukin-27 (IL-27) mediates susceptibility to visceral 

leishmaniasis by suppressing the IL-17-neutrophil response. Infect Immun. 2016;84: 

2289–2298. doi:10.1128/IAI.00283-16 

10.  Anderson G, Jenkinson EJ. Lymphostromal interactions in thymic development 

and function. Nat Rev Immunol. 2001;1: 31–40. doi:10.1038/35095500 

11.  Bluestone JA, Abbas AK. Natural versus adaptive regulatory T cells. Nature 

Reviews Immunology. Nature Publishing Group; 2003. pp. 253–257. 

doi:10.1038/nri1032 

12.  Ritter MA, Boyd RL. Development in the thymus: it takes two to tango. Immunol 

Today. 1993;14: 462–469. doi:10.1016/0167-5699(93)90250-O 

13.  Zhang L, Sun L, Zhao Y. Thymic epithelial progenitor cells and thymus 

regeneration: An update. Cell Research. Nature Publishing Group; 2007. pp. 50–55. 

doi:10.1038/sj.cr.7310114 

14.  Rodewald H-R. Thymus Organogenesis. Annu Rev Immunol. 2008;26: 355–

388. doi:10.1146/annurev.immunol.26.021607.090408 

15.  Azumi N, Battifora H. The distribution of vimentin and keratin in epithelial and 

nonepithelial neoplasms. A comprehensive immunohistochemical study on formalin- 

and alcohol-fixed tumors. Am J Clin Pathol. 1987;88: 286–296. 

doi:10.1093/ajcp/88.3.286 



58 
 

 

 

16.  Pearse G. Normal Structure, Function and Histology of the Thymus. Toxicol 

Pathol. 2006;34: 504–514. doi:10.1080/01926230600865549 

17.  Duijvestijn AM, Hoefsmit ECM. Ultrastructure of the rat thymus: The micro-

environment of T-lymphocyte maturation. Cell Tissue Res. 1981;218: 279–292. 

doi:10.1007/BF00210344 

18. Throsby, M, Herbelin, A, Pléau, JM, Dardenne, M. CD11c+ eosinophils in the 

murine thymus: developmental regulation and recruitment upon MHC class I-restricted 

thymocyte deletion. The Journal of Immunology.2000; 165(4): 1965-1975. doi: 

10.4049/jimmunol.165.4.1965 

19.  Losada-Barragán M, Umanã-Pérez A, Cuervo-Escobar S, Berbert LR, Porrozzi 

R, Morgado FN, et al. Protein malnutrition promotes dysregulation of molecules 

involved in T cell migration in the thymus of mice infected with Leishmania infantum. 

Sci Rep. 2017;7: 45991. doi:10.1038/srep45991 

20.  Silva AVA, Souza TL, Figueiredo FB, Mendes AA V., Ferreira LC, Filgueira 

CPB, et al. Detection of amastigotes and histopathological alterations in the thymus of 

Leishmania infantum ‐infected dogs. Immunity, Inflamm Dis. 2020;8: 127–139. 

doi:10.1002/iid3.285 

21.  Schnur L, Zuckerman A, Montilio B. Dissemination of leishmanias to the organs 

of Syrian hamsters following intrasplenic inoculation of promastigotes. Exp Parasitol. 

1973;34: 432–447. doi:10.1016/0014-4894(73)90103-3 

22.  Cuervo-Escobar S, Losada-Barragán M, Umaña-Pérez A, Porrozzi R, Saboia-

Vahia L, Miranda LHM, et al. T-Cell populations and cytokine expression are impaired 

in thymus and spleen of protein malnourished balb/c mice infected with leishmania 

infantum. PLoS One. 2014;9: 1–22. doi:10.1371/journal.pone.0114584 

23.  Tafuri WL, Santos RDL, Arantes RME, Gonçalves R, De Melo MN, Michalick 

MSM, et al. An alternative immunohistochemical method for detecting Leishmania 

amastigotes in paraffin-embedded canine tissues. J Immunol Methods. 2004;292: 17–

23. doi:10.1016/j.jim.2004.05.009 



59 
 

 

 

24. van Baarlen J, Schuurman HJ, Huber J. Acute thymus involution in infancy and 

childhood: A reliable marker for duration of acute illness. Hum Pathol. 1988;19: 1155–

1160. doi:10.1016/S0046-8177(88)80146-1  

25.  Bozzetta E, Pezzolato M, Maurella C, Varello K, Richelmi GB, Draisci R, et al. 

Development of an enhanced histopathological approach to detect low-dose 

dexamethasone illicit treatment in veal calves. Food Addit Contam - Part A Chem Anal 

Control Expo Risk Assess. 2011;28: 1187–1192. doi:10.1080/19440049.2011.584909 

26.  Sia SF, Yan LM, Chin AWH, Fung K, Choy KT, Wong AYL, et al. Pathogenesis 

and transmission of SARS-CoV-2 in golden hamsters. Nature. 2020;583: 834–838. 

doi:10.1038/s41586-020-2342-5 

27.  Parviainen S, Ahonen M, Diaconu I, Kipar A, Siurala M, Vähä-Koskela M, et al. 

GMCSF-armed vaccinia virus induces an antitumor immune response. Int J Cancer. 

2015;136: 1065–1072. doi:10.1002/ijc.29068 

28.  Subimerb C, Pinlaor S, Lulitanond V, Khuntikeo N, Okada S, McGrath MS, et 

al. Circulating CD14+CD16+ monocyte levels predict tissue invasive character of 

cholangiocarcinoma. Clin Exp Immunol. 2010;161: 471–479. doi:10.1111/j.1365-

2249.2010.04200.x 

29.  Zotto H Del, Massa L, Rafaeloff R, Pittenger GL, Vinik A, Gold G, et al. Possible 

relationship between changes in islet neogenesis and islet neogenesis-associated 

protein-positive cell mass induced by sucrose administration to normal hamsters. J 

Endocrinol. 2000;165: 725–733. doi:10.1677/joe.0.1650725 

30.  Seco-Rovira V, Beltrán-Frutos E, Ferrer C, Sáez FJ, Madrid JF, Pastor LM. The 

death of sertoli cells and the capacity to phagocytize elongated spermatids during 

testicular regression due to short photoperiod in Syrian hamster (Mesocricetus 

auratus). Biol Reprod. 2014;90: 1–10. doi:10.1095/biolreprod.113.112649 

31.  Nieto A, Domínguez-Bernal G, Orden JA, De La Fuente R, Madrid-Elena N, 

Carrión J. Mechanisms of resistance and susceptibility to experimental visceral 

leishmaniosis: BALB/c mouse versus syrian hamster model. Veterinary Research. 

BioMed Central; 2011. pp. 1–13. doi:10.1186/1297-9716-42-39 



60 
 

 

 

32.  Corbett CE, Paes RA, Laurenti MD, Andrade Júnior HF, Duarte MI. 

Histopathology of lymphoid organs in experimental leishmaniasis. Int J Exp Pathol. 

1992;73: 417–33. Available: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1390190%0Ahttp://www.pubmedcentral.nih.gov/

articlerender.fcgi?artid=PMC2002360 

33.  Raviola E, Karnovsky MJ. Evidence for a blood-thymus barrier using electron-

opaque tracers. J Exp Med. 1972;136: 466–498. doi:10.1084/jem.136.3.466 

34.  Elmore SA. Enhanced Histopathology of the Thymus. Toxicol Pathol. 2006;34: 

656–665. doi:10.1080/01926230600865556 

35.  Losada-Barragán M, Umaña-Pérez A, Durães J, Cuervo-Escobar S, Rodríguez-

Vega A, Ribeiro-Gomes FL, et al. Thymic microenvironment is modified by malnutrition 

and Leishmania infantum infection. Front Cell Infect Microbiol. 2019;9: 1–19. 

doi:10.3389/fcimb.2019.00252 

36.  Savino W, Dardenne M, Velloso LA, Silva-barbosa SD. The thymus is a 

common target in malnutrition and infection. British Journal of Nutrition. Cambridge 

University Press; 2007. pp. S11–S16. doi:10.1017/S0007114507832880 

37.  González FB, Calmon-Hamaty F, Nô Seara Cordeiro S, Fernández Bussy R, 

Spinelli SV, D’Attilio L, et al. Trypanosoma cruzi Experimental Infection Impacts on the 

Thymic Regulatory T Cell Compartment. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10. 

doi:10.1371/journal.pntd.0004285 

38.  González FB, Villar SR, Fernández Bussy R, Martin GH, Pérol L, Manarin R, et 

al. Immunoendocrine dysbalance during uncontrolled T. cruzi infection is associated 

with the acquisition of a Th-1-like phenotype by Foxp3+ T cells. Brain Behav Immun. 

2015;45: 219–232. doi:10.1016/j.bbi.2014.11.016 

39.  Shamri R, Xenakis JJ, Spencer LA. Eosinophils in innate immunity: An evolving 

story. Cell and Tissue Research. Springer; 2011. pp. 57–83. doi:10.1007/s00441-010-

1049-6 

40.  Morrot A, Terra-Granado E, Pérez AR, Silva-Barbosa SD, Milićević NM, Farias-

de-Oliveira DA, et al. Chagasic thymic atrophy does not affect negative selection but 



61 
 

 

 

results in the export of activated CD4+CD8+ T cells in severe forms of human disease. 

PLoS Negl Trop Dis. 2011;5. doi:10.1371/journal.pntd.0001268 

41.  Osborn M, Debus E, Weber K. Monoclonal antibodies specific for vimentin. Eur 

J Cell Biol. 1984;34: 137–143. Available: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6428888/ 

42.  Jablonska-Mestanova V, Sisovsky V, Danisovic L, Polak S, Varga I. The normal 

human newborns thymus. Bratislava Med J. 2013;114: 402–408. 

doi:10.4149/BLL_2013_086 

43.  Milicevic NM, Milicevic Z, Colic M, Mujovic S. Ulstructural study of macrophages 

in the rat thymus, with special reference to the cortico-medullary zone. J Anat. 

1987;Vol. 150: 89–98. Available: /pmc/articles/PMC1261667/?report=abstract 

44.  Hale LP. Histologic and Molecular Assessment of Human Thymus. Ann Diagn 

Pathol. 2004;8: 50–60. doi:10.1016/j.anndiagpath.2003.11.006 

45.  Milićević Ž, Živanović V, Todorović J, Čolić M, Kamperdijk EWA, Heofsmit ECM, 

et al. Differential effect of cyclosporin application on epithelial cells of the rat thymus. 

Immunohistochemical study. J Comp Pathol. 1992;106: 25–35. doi:10.1016/0021-

9975(92)90065-3 

46.  Derbinski J, Schulte A, Kyewski B, Klein L. Promiscuous gene expression in 

medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. J Immunol. 2016;196: 

2915–2922. doi:10.1038/ni723 

47.  Nitta T, Murata S, Ueno T, Tanaka K, Takahama Y. Chapter 3 Thymic 

Microenvironments for T-Cell Repertoire Formation. Advances in Immunology. 

Academic Press; 2008. pp. 59–94. doi:10.1016/S0065-2776(08)00603-2 

48.  Boehm T, Scheu S, Pfeffer K, Bleul CC. Thymic medullary epithelial cell 

differentiation, thymocyte emigration, and the control of autoimmunity require lympho-

epithelial cross talk via LTβR. J Exp Med. 2003;198: 757–769. 

doi:10.1084/jem.20030794 



62 
 

 

 

49.  Wu L, Li CL, Shortman K. Thymic dendritic cell precursors: Relationship to the 

T lymphocyte lineage and phenotype of the dendritic cell progeny. J Exp Med. 

1996;184: 903–911. doi:10.1084/jem.184.3.903 

50.  Weiss A, Imboden J, Hardy K, Manger B, Terhorst C, Stobo J. The role of the 

T3/antigen receptor complex in T-cell activation. Annual review of immunology. Annu 

Rev Immunol; 1986. pp. 593–619. doi:10.1146/annurev.iy.04.040186.003113 

51.  Leite-de-Moraes MC, Hontebeyrie-Joskowicz M, Dardenne M, Savino W. 

Modulation of thymocyte subsets during acute and chronic phases of experimental 

Trypanosoma cruzi infection. Immunology. 1992;77: 95–8. Available: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1398769 

52.  Crompton T, Mooreu M, MacDonald HR, Malissen B. Double-negative 

thymocyte subsets in CD3′ chain-deficient mice: Absence of HSA+CD44−CD25− cells. 

Eur J Immunol. 1994;24: 1903–1907. doi:10.1002/eji.1830240828 

53.  Tourigny MR, Mazel S, Burtrum DB, Petrie HT. T cell receptor (TCR)-β gene 

recombination: Dissociation from cell cycle regulation and developmental progression 

during T cell ontogeny. J Exp Med. 1997;185: 1549–1556. doi:10.1084/jem.185.9.1549 

54.  Goncalves da Costa SG, Calabrese KS, Bauer PG, Savino W, Lagrange PH. 

Studies of the thymus in Chagas’ disease: III. Colonization of the thymus and other 

lymphoid organs of adult and newborn mice by Trypanosoma cruzi. Pathol Biol. 

1991;39: 91–97. Available: https://europepmc.org/article/med/1901987 

55.  Yamano T, Nedjic J, Hinterberger M, Steinert M, Koser S, Pinto S, et al. Thymic 

B Cells Are Licensed to Present Self Antigens for Central T Cell Tolerance Induction. 

Immunity. 2015;42: 1048–1061. doi:10.1016/j.immuni.2015.05.013 

56.  Cepeda S, Cantu C, Orozco S, Xiao Y, Brown Z, Semwal MK, et al. Age-

Associated Decline in Thymic B Cell Expression of Aire and Aire-Dependent Self-

Antigens. Cell Rep. 2018;22: 1276–1287. doi:10.1016/j.celrep.2018.01.015 



63 
 

 

APÊNDICE A- REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO GERAL 

 

ACKERMAN, G. A.; KNOUFF, R. A. The epithelial origin of the lymphocytes in the 

thymus of the embryonic hamster. The Anatomical Record, [s. l.], v. 152, n. 1, p. 35–

53, 1965. Disponível em: <http://doi.wiley.com/10.1002/ar.1091520106>. Acesso em: 

2 nov. 2020. 

ANDERSON, C. F.; MENDEZ, S.; SACKS, D. L.  Nonhealing Infection despite Th1 

Polarization Produced by a Strain of Leishmania major in C57BL/6 Mice . The Journal 

of Immunology, [s. l.], v. 174, n. 5, p. 2934–2941, 2005. Disponível em: 

<http://www.jimmunol.org/content/174/5/2934>. Acesso em: 3 out. 2020. 

ANDERSON, C. F.; STUMHOFER, J. S.; HUNTER, C. A.; SACKS, D.  IL-27 Regulates 

IL-10 and IL-17 from CD4 + Cells in Nonhealing Leishmania major Infection . The 

Journal of Immunology, [s. l.], v. 183, n. 7, p. 4619–4627, 2009. Disponível em: 

<http://www.jimmunol.org/content/183/7/4619>. Acesso em: 3 out. 2020. 

ANDERSON, G.; JENKINSON, E. J. Lymphostromal interactions in thymic 

development and function. Nature Reviews Immunology, [s. l.], v. 1, n. 1, p. 31–40, 

2001.  

BANETH, G.; KOUTINAS, A. F.; SOLANO-GALLEGO, L.; BOURDEAU, P.; FERRER, 

L. Canine leishmaniosis - new concepts and insights on an expanding zoonosis: part 

one. Trends in Parasitology, [s. l.], v. 24, n. 7, p. 324–330, 2008.  

BARBIÉRI, C. L. Immunology of canine leishmaniasis. Parasite Immunology, [s. l.], 

v. 28, n. 7, p. 329–337, 2006.  

BLACKBURN, C. C.; MANLEY, N. R.; PALMER, D. B.; BOYD, R. L.; ANDERSON, G.; 

RITTER, M. A. One for all and all for one: Thymic epithelial stem cells and 

regeneration, Elsevier Current Trends, 2002.  

BOEHM, T.; SCHEU, S.; PFEFFER, K.; BLEUL, C. C. Thymic medullary epithelial cell 

differentiation, thymocyte emigration, and the control of autoimmunity require lympho-

epithelial cross talk via LTβR. Journal of Experimental Medicine, [s. l.], v. 198, n. 5, 

p. 757–769, 2003. Disponível em: 

<http://www.jem.org/cgi/doi/10.1084/jem.20030794>. Acesso em: 5 out. 2020. 



64 
 

 

CAMPBELL, J. J.; HASHIMOTO, Y. Recombinase activating gene expression in 

thymic subpopulations. A transitional cell type has lost RAG-2 but not RAG-1. The 

Journal of Immunology, [s. l.], v. 150, n. 4, 1993.  

COLIC, M.; JOVANOVIC, S.; MITROVIC, S.; DUJIC, A. Immunohistochemical 

identification of six cytokeratin-defined subsets of the rat thymic epithelial cells. In: 

THYMUS 1989, Anais... [s.l: s.n.] Disponível em: 

<https://europepmc.org/article/med/2482555>. Acesso em: 9 nov. 2020. 

CORBETT, C. E.; PAES, R. A.; LAURENTI, M. D.; ANDRADE JÚNIOR, H. F.; 

DUARTE, M. I. Histopathology of lymphoid organs in experimental leishmaniasis. 

International journal of experimental pathology, [s. l.], v. 73, n. 4, p. 417–33, 1992. 

Disponível em: 

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1390190%0Ahttp://www.pubmedcentral.nih.go

v/articlerender.fcgi?artid=PMC2002360> 

COSTA, F. A. L.; GOTO, H.; SALDANHA, L. C. B.; SILVA, S. M. M. S.; SINHORINI, I. 

L.; SILVA, T. C.; GUERRA, J. L. Histopathologic patterns of nephropathy in naturally 

acquired canine visceral leishmaniasis. Veterinary Pathology, [s. l.], v. 40, n. 6, p. 

677–684, 2003.  

CROMPTON, T.; MOOREU, M.; MACDONALD, H. R.; MALISSEN, B. Double-

negative thymocyte subsets in CD3′ chain-deficient mice: Absence of 

HSA+CD44−CD25− cells. European Journal of Immunology, [s. l.], v. 24, n. 8, p. 

1903–1907, 1994. Disponível em: <http://doi.wiley.com/10.1002/eji.1830240828>. 

Acesso em: 7 out. 2020. 

CUERVO-ESCOBAR, S.; LOSADA-BARRAGÁN, M.; UMAÑA-PÉREZ, A.; 

PORROZZI, R.; SABOIA-VAHIA, L.; MIRANDA, L. H. M.; MORGADO, F. N.; 

MENEZES, R. C.; SÁNCHEZ-GÓMEZ, M.; CUERVO, P.; STAGER, S. T-Cell 

populations and cytokine expression are impaired in thymus and spleen of protein 

malnourished balb/c mice infected with leishmania infantum. PLoS ONE, [s. l.], v. 9, n. 

12, p. 1–22, 2014.  

DE WAAL, E. J.; SCHUURMAN, H. J.; VAN LOVEREN, H.; VOS, J. G. Differential 

effects of 2,3,7,8-tetrachlorodib