i 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IMPORTÂNCIA DOS MASTÓCITOS NA PATOGÊNESE 

DA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE EM CÃES 

GOLDEN RETRIEVER 

 

 

 

 

 

 

Isabela Mancini Martins 

                                                                          Médica Veterinária 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                          

 

2015 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP 

CAMPUS DE JABOTICABAL 

 

 

 



ii 

 

 

 

IMPORTÂNCIA DOS MASTÓCITOS NA PATOGÊNESE 

DA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE EM CÃES 

GOLDEN RETRIEVER 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                                        
Isabela Mancini Martins 

        Orientadora: Profa. Dra. Julieta Rodini Engrácia de Moraes 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                           

 

             

                                                 2015 

 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP 

CAMPUS DE JABOTICABAL 

 

Dissertação apresentada à Faculdade de 
Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, 
Câmpus de Jaboticabal, como parte das 
exigências para a obtenção do título de Mestre  
em Medicina Veterinária,  Área: Patologia Animal. 



iii 

 

 

 

   

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



iv 

DADOS CURRICULARES DO AUTOR 

 

Isabela Mancini Martins – Filha de Renata Mancini e Sidnei Neri Martins 

nasceu em 25 de março de 1990, em Araraquara, São Paulo, onde cursou na rede 

pública o ensino fundamental e médio, concluído em dezembro de 2007. Em 2009, após 

a aprovação do vestibular, ingressou no curso de Medicina Veterinária na Universidade 

Estadual do Norte do Paraná – UENP, onde se graduou em dezembro de 2013. Em 

março de 2014, ingressou no Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária 

(mestrado), área de concentração Patologia Animal no Departamento de Patologia 

Veterinária da FCAV/Unesp – Jaboticabal, sob a orientação da Profa. Dra. Julieta 

Rodini Engrácia de Moraes, concluído sua dissertação em julho de 2015 e tendo sido 

aprovada no exame de qualificação em Patologia Animal no dia 26 de junho de 2015. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



v 

DEDICATÓRIA 

 

 

À Deus por sempre me proteger em todos os momentos da minha 

caminhada. 

 

À Nossa Senhora do Perpétuo Socorro, por interceder nos momentos 

difíceis.  

 

À minha família, minha mãe Renata, meu Pai Sidnei e meu irmão Raul. 

Muito obrigada por sempre estarem comigo, pelo apoio e amor. Amo vocês. 

 

Aos meus familiares que torceram por mim. 

 

Ao meu companheiro, amigo e confidente Marcos Pires de Souza. 

Sempre esteve ao meu lado nos momentos bons e ruins. Te amo. 

 

Às minhas amigas de longa caminhada Ana Paula Rennó e Estefani 

Marques da Silva Furioto, são as melhores do mundo. Aos meus amigos 

Lidiane, Rafael e Matheus, pelas risadas e momentos divertidos. 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



vi 

AGRADECIMENTOS 

 

 

À Prof. Dra. Julieta Rodini Engrácia de Moraes por acreditar em mim e 

me proporcionar a oportunidade de trabalhar com a linha de pesquisa tão rica e 

inspiradora. 

 

Ao Prof. Dr. Flávio Ruas de Moraes pelos ensinamentos em minhas 

dúvidas. 

 

À Dra. Ligia Gomes Miyazato, que foi a pioneira na linha de pesquisa 

com o cão Golden Retriever distrófico. Exemplo de dedicação que resultou em 

várias dissertações e artigos. 

 

Ao Prof. Dr. Rogério Salvador por me motivar e aconselhar a realizar o 

mestrado na Unesp, e, também pelas oportunidades cedidas na graduação. 

Sem isso não estaria aqui. 

 

À Dra. Lygia Maria Mouri Malvestio, pelos ensinamentos, conselhos e 

pela paciência comigo. Muito Obrigada. 

 

Aos meus colegas de laboratório: Fausto, Paulo, Gustavo, Marina, 

Thalita, Jefferson, Thiago, Silas e Dayanne, pela participação direta ou indireta 

no meu trabalho. 

 

As amigas Elena, Mayara, Cláudia e Branca, pelas risadas. 

 

À Profa. Dra. Simone Gusmão Ramos, a Dra. Cibele Prado e a técnica 

Elaine Medeiros Floriano da USP de Ribeirão Preto, pelo auxílio no meu 

trabalho. 

 

À Dra. Tais Harumi de Castro Sasahara, pela disponibilidade em me 

ajudar em vários momentos. 

 

 



vii 

Ao Prof. Dr. Gilson Hélio Toniollo, pelos ensinamentos e conselhos. 

 

À Profa. Dra. Maria Angélica Miglino e a Dra. Paula Fratini, pela 

oportunidade em conhecer o canil GRMD-Brasil na FMVZ-USP. 

 

Aos técnicos do Departamento de Patologia Veterinária da FCAV, Edgar, 

Theo, Francisca e a secretária Moema, pela contribuição ao meu trabalho. 

 

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES) pela 

concessão da bolsa de estudos. 

 

À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade 

Estadual Paulista – Campus Jaboticabal, em especial ao programa de Pós-

graduação em Medicina Veterinária pela oportunidade. 

 

A todos aqueles que contribuíram para a realização deste estudo. 

Obrigada. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                



viii 

SUMÁRIO 

 

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1 

2 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................... 3 

2.1 O papel da distrofina no músculo ............................................................... 3 

2.2 Lesão muscular no cão Golden Retriever distrófico ................................... 4 

2.3 Terapias para DMD/GRMD ........................................................................ 6 

2.4 O papel dos mastócitos na DMD ................................................................ 9 

3 OBJETIVO ................................................................................................ 11 

4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 12 

4.1 Amostras e grupos ................................................................................... 12 

4.2 ESTUDO QUALITATIVO .......................................................................... 14 

4.2.1 Histopatologia ........................................................................................... 14 

4.2.2 Coloração Azul de Toluidina ..................................................................... 14 

4.2.3 Coloração Tricrômio de Azan ................................................................... 14 

4.3  ESTUDO QUANTITATIVO ....................................................................... 15 

4.3.1 Histomorfometria ...................................................................................... 15 

4.3.2 Análise estatística ..................................................................................... 15 

5 RESULTADOS ......................................................................................... 15 

5.1 Estudo qualitativo das lesões ................................................................... 15 

5.2 ESTUDO QUANTITATIVO ....................................................................... 22 

5.2.1 Histomorfometria ...................................................................................... 22 

5.2.2 Morfometria de tecido fibro-colagenoso ................................................... 25 

6 DISCUSSÃO ............................................................................................ 28 

7 CONCLUSÕES ........................................................................................ 31 

8 REFERÊNCIAS ........................................................................................ 32 

 

      

 

 

 

 

 

 



ix 

 

 

IMPORTÂNCIA DOS MASTÓCITOS NA PATOGÊNESE DA DISTROFIA 

MUSCULAR DE DUCHENNE EM CÃES GOLDEN RETRIEVER 

 

 

RESUMO - O cão Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) é o melhor 
modelo natural da distrofia muscular de Duchenne (DMD) com manifestações 
genotípicas e fenotípicas semelhantes à doença humana. Como nos afetados 
pela DMD, a proliferação progressiva de tecido conectivo no endomísio das 
fibras musculares ocorre em paralelo ao curso clínico da doença nos animais 
GRMD. Estudos indicam a relação dos mastócitos com a deposição de tecido 
fibroso devido a liberação de seus mediadores que ativam os fibroblastos. O 
objetivo desse trabalho foi o de avaliar a expressão dos mastócitos e sua 
possível relação com as lesões musculares e fibrose em cães GRMD de 
diferentes idades. Foram utilizados fragmentos de quatro grupos musculares 
esqueléticos (masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral) de dez 
cães entre dois a oito meses de idade sendo seis afetados e quatro controles. 
As amostras foram processadas por técnicas usuais de histologia, coradas com 
hematoxilina e eosina, azul de toluidina para verificar a expressão dos 
mastócitos e tricrômio de Azan para a evidenciação e quantificação da fibrose. 
Em todos os grupos musculares dos cães GRMD o infiltrado de mastócitos 
apresentou aumento significativo comparado ao grupo controle. O número 
médio de mastócitos diminuiu com a idade dos cães GRMD. Todos os grupos 
musculares apresentaram aumento significativo na quantidade de tecido 
colagenoso em relação ao grupo controle. A deposição de tecido fibroso 
diminuiu de acordo com a idade dos animais. Dos resultados afere-se que o 
aumento da degranulação dos mastócitos ocorreu em cães GRMD mais jovens 
(2 meses) fato que potencializou o aumento na deposição de tecido fibroso nas 
fibras musculares que foi diminuindo gradativamente com o tempo e a idade 
dos animais. Outros estudos são necessários para esclarecer o papel dos 
mastócitos na patogênese da fibrose, a fim de contribuir no desenvolvimento de 
novas abordagens terapêuticas e melhorar a expectativa de vida de humanos e 
cães afetados pela distrofia muscular.  
Palavras-chave: azul de toluidina, distrofina, fibrose, Golden Retriever, 
histomorfometria, mastócitos  
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



x 

 

IMPORTANCE OF MAST CELLS IN PATHOGENESIS OF DUCHENNE 
MUSCULAR DYSTROPHY IN GOLDEN RETRIEVER DOGS 

 

 

 

ABSTRACT - Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) is the best natural 
model of Duchenne muscular dystrophy (DMD) with genotypic and phenotypic 
manifestations similar the human disease. As in to DMD patients, the 
progressive proliferation of connective tissue in the endomysium of the muscle 
fibers is parallel to the clinical course of disease in GRMD animals. Studies 
indicate the relationship of mast cells with the deposition of fibrous tissue due to 
the release of mediators that activate fibroblasts. The aim of this study was to 
evaluate the expression of mast cells and its possible relation with muscle injury 
and fibrosis in GRMD dogs at different ages. It was used fragments of four 
skeletal muscle groups (masseter, diaphragm, triceps brachial and biceps 
femoris) of ten dogs between two and eight months age, six affected and four 
controls. Samples were processed by usual techniques of histology, stained 
with hematoxylin-eosin and toluidine blue, to verify the expression of mast cells, 
and Azan trichrome for evaluation and quantification of fibrous. In all muscle 
groups of dogs GRMD the infiltration of mast cells increased significantly 
compared to control group. The average number of mast cells decreased with 
the age of GRMD dogs. All muscle groups showed a significant increase in the 
amount of collagenous tissue in the control group. The deposition of fibrous 
tissue decreased with the age of the animals. Possibly, the increase of mast cell 
degranulation and mediator release would occur in younger GRMD dogs (2 
months), fact that potentiated the increase deposition of fibrous tissue in muscle 
fibers which was gradually decreasing over time and age of the animals. Other 
studies are needed to clarify the role of mast cells in the pathogenesis of 
fibrosis in order to contribute to the development of new therapeutic approaches 
and improve the life expectancy of humans and dogs affected by muscular 
dystrophy. 
Keywords: dystrophin, fibrosis, Golden Retriever, histomorphometry, mast 
cells, toluidine blue 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



xi 

LISTA DE ABREVIATURAS 

 

AAV9 – vetor associado ao adenovírus  

bFGF – fator básico de crescimento de fibroblastos  

Camundongos mdx- distrofia muscular com mutação no cromossomo X 

CMV – citomegalovírus  

CK – creatino quinase 

DMD – Distrofia Muscular de Duchenne 

GRMD – Golden Retriever Muscular Dystrophy 

HE – hematoxilina-eosina 

MHC I – complexo de maior histocompatibilidade de classe I  

NGF – fator de crescimento neural  

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



xii 

LISTA DE FIGURAS 

 

 

  

 

 

                                                                                                               

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fotomicrografia do músculo de animais controles com 2, 

3 e 8 meses respectivamente. Fibras musculares 

uniformemente distribuídas com diâmetro regular. A. 

Masseter. B. Tríceps braquial. C. Bíceps femoral............. 

 
Fotomicrografia do músculo masseter de cães GRMD. 

A. Fragmento muscular de cão com 2 meses de idade. 

Miofibras com variação de diâmetro (*), presença de 

infiltrado inflamatório (seta). B. Fragmento muscular de 

cão com 3 meses de idade. Presença de tecido 

colagenoso no espaço perimisial e endomisial (seta). C. 

Fragmento muscular de cão com 5 meses de idade. 

Intensa deposição de células adiposas. D. Fragmento 

muscular de cão com 8 meses de idade. Moderada 

deposição de células adiposas......................................... 

 

 

Figura 2. 

Figura 1. 

Figura 3.  Fotomicrografia do músculo tríceps braquial de cães 

GRMD. A. Fragmento muscular de cão com 2 meses de 

idade. Presença de mastócitos (seta) em áreas de 

fibrose e células adiposas. B. Fragmento muscular cão 

com 3 meses de idade. Presença de mastócitos (seta) 

em áreas de fibrose.......................................................  

 

17 

18 

 19 
Figura 3.  Fotomicrografia do músculo tríceps braquial de cães 

GRMD. C. Fragmento muscular de cão com 5 meses de 

idade. Presença de mastócitos (seta) em áreas de 

fibrose. D. Fragmento muscular de cão com 8 meses de 

idade. Presença de mastócitos (seta) no espaço 

endomisial......................................................................  20 



xiii 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 4.   Fotomicrografia do músculo bíceps femoral de cães 

GRMD. A. Fragmento muscular de cão com 2 meses de 

idade. Intensa deposição de tecido colagenoso (seta) no 

endomísio. B. Fragmento muscular de cão com 3 meses 

de idade. Intensa deposição de tecido colagenoso (seta) 

no endomísio. C. Fragmento muscular de cão com 5 

meses de idade.  Moderada deposição de fibrose (seta) 

no perimísio e endomísio. D. Fragmento muscular de cão 

com 8 meses de idade. Discreta deposição de tecido 

colagenoso (seta) no endomísio..................................... 

 

21 

Figura 5. Morfometria dos mastócitos nos músculos masseter (M), 

diafragma (D), tríceps braquial (TB) e músculo bíceps 

femoral (BF) do grupo controle (C) e de cães GRMD com 

idade entre 2, 3, 5 e 8 meses respectivamente................... 

Figura 6. 

24 

27 

Morfometria de tecido colagenoso nos músculos 

masseter (M), diafragma (D), tríceps braquial (TB) e 

músculo bíceps femoral (BF) do grupo controle (C) e 

cães GRMD com idade entre 2, 3, 5 e 8 meses 

respectivamente................................................................. 



xiv 

LISTA DE TABELAS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tabela 1. 

 
Valores médios (respectivos desvio padrão) e análise 

de variância para o número de mastócitos no 

masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral 

de cães GRMD de 2, 3, 5 e 8 meses de 

idade............................................................................. 

 

 

Tabela 2. 

12 

22 

 

Identificação de amostras musculares de controles e 

cães GRMD com idades entre 7 dias a 13 meses, 

pertencentes ao banco de fragmentos do laboratório 

de Patologia Experimental e Comparada da 

FCAV/Unesp.................................................................. 
 

 

 

 
Valores médios (respectivos desvio padrão) e análise 

de variância para o número de mastócitos no 

masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral 

de cães controle de 2, 3, 5 e 8 meses de 

idade.............................................................................. 

 
 

Tabela 3. 

Valores médios (respectivos desvio padrão) e análise 

de variância para a deposição de tecido colagenoso 

no masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps 

femoral de cães GRMD de 2, 3, 5 e 8 meses de 

idade.............................................................................. 

 
 

Tabela 4. 

Valores médios (respectivos desvio padrão) e análise 

de variância para a deposição de tecido colagenoso 

no masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps 

femoral de cães controle de 2, 3, 5 e 8 meses de 

idade.............................................................................. 

 

 
 

Tabela 5. 

23 

25 

26 



1 

1 INTRODUÇÃO 

 

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é doença degenerativa em 

humanos causada por mutação no gene da distrofina, afetando um em cada 

3500 recém-nascidos vivos do sexo masculino. Trata-se de uma desordem 

genética recessiva localizada no braço curto do cromossomo X (Xp21) 

(HOFFMAN et al., 1987; WOOLF et al., 2006). O primeiro estágio da doença é 

caracterizado pela presença de grupos focais de fibras musculares necróticas e 

hipertrofia muscular. Posteriormente, ciclos repetidos de degeneração e 

regeneração esgotam a capacidade regenerativa das células-tronco 

musculares específicas (células satélites) e mecanismos de fibrose induzem a 

substituição progressiva do tecido muscular contrátil por tecido conectivo e 

adiposo (COLLINS; MORGAN 2003; DECONINCK; DAN 2007; MALVESTIO et 

al., 2015; MIYAZATO et al., 2011b). 

A doença apresenta manifestações clínicas como fraqueza muscular de 

progressão relativamente rápida que se inicia antes dos cinco anos de idade 

atingindo os músculos da cintura pélvica e, em seguida, os da cintura escapular 

com pseudo-hipertrofia muscular da panturrilha, cifose, escoliose e dificuldade 

em deambular durante a primeira infância, levando os indivíduos afetados ao 

uso de cadeira de rodas por volta dos 14 anos de idade. A morte de pacientes 

com DMD ocorre geralmente entre a segunda e a terceira décadas de vida por 

complicações respiratórias e/ou cardíacas (EAGLE et al., 2002; GULATI et al., 

2005; VAN BOCKEL, 2009).  

O cão Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) é o melhor modelo 

natural da DMD com manifestações genotípicas e fenotípicas próximas da 

doença humana (COLLINS; MORGAN, 2003; COOPER et al., 1988). 

Semelhante aos portadores da DMD, a proliferação progressiva de tecido 

conectivo no endomísio das fibras musculares ocorre em paralelo ao curso 

clínico da doença nos animais GRMD (GOROSPE et al., 1994). 

A ausência da distrofina pode ser detectada em várias espécies animais 

como cães, gatos, roedores, peixes e invertebrados. Apesar de apresentar 

fenótipos diferentes – o que deve estar relacionado com a resposta específica 

de cada espécie à ausência de distrofina – esses animais são usados como 

modelos naturais na busca de um tratamento eficiente das distrofinopatias do 



2 

homem (COLLINS; MORGAN, 2003). Em cães, mutações espontâneas no 

gene que codifica a distrofina foi inicialmente identificada na raça Golden 

Retriever (KORNEGAY et al., 1988), no German short-haired pointer 

(SCHATZBERG et al., 1999), no  Rottweiler (COLLINS; MORGAN, 2003), no 

Beagle (SHIMATSU et al., 2003) e no Weimaraner (BALTZER et al., 2007). 

Em camundongos, a distrofia muscular é reproduzida em animais com 

mutação no cromossomo X (mdx). Todavia, se comparado com a doença no 

homem, a disfunção muscular neste modelo animal apresenta menor 

intensidade e por isso não mimetiza o fenótipo da DMD humana (BULFIELD et 

al., 1984; COLLINS; MORGAN, 2003).  

Em cães, as fêmeas portadoras apresentam apenas um cromossomo X 

afetado, podendo transmiti-lo à sua progênie, sendo mais frequente a 

existência de machos afetados. Uma vez, herdado o cromossomo X alterado 

invariavelmente os machos serão afetados. As fêmeas acometidas pela 

distrofia muscular necessariamente apresentam dois cromossomos X 

alterados, que na maioria das vezes acontece por mutação, devido ao fato de 

que o macho afetado não se reproduz em condições normais em virtude da 

extrema fraqueza muscular (ARAÚJO et al., 2009). 

As principais manifestações clínicas em cães incluem: disfagia, atrofia 

dos músculos mastigatórios, hipertrofia dos músculos da língua, sialorréia, 

megaesôfago, hipertrofia do músculo diafragma e prejuízo progressivo na 

marcha em cães com 6 a 10 semanas de idade. Em consequência do 

enrijecimento dos membros pélvicos, podem ocorrer atrofia e hipertrofia 

muscular seletiva, desvio do eixo de membros, fraqueza muscular e contraturas 

(ARAÚJO et al., 2009; VALENTINE et al., 1988; VALENTINE, 1989).  

Semelhante aos portadores da DMD, a insuficiência cardíaca constitui 

uma das principais causa mortis nos animais GRMD (VALENTINE, 1989). As 

alterações cardíacas são comuns, porém assintomáticas ao longo de um 

período variável de tempo, antes de ocorrer a cardiomiopatia dilatada 

resultante da fibrose (ARAÚJO et al., 2009; MALVESTIO et al., 2015). A 

cardiomiopatia hipertrófica pode ser detectada em todos os pacientes humanos 

acima de 18 anos de idade e classificada em pré-clínica, leve, moderada e 

severa (NIGRO et al., 1990). Como consequência à intensa fibrose miocárdica 

pode ocorrer a perda da contratilidade do músculo cardíaco, levando a 



3 

insuficiência cardíaca congestiva (VALENTINE et al., 1989; MALVESTIO et al., 

2015). 

 

 

2 REVISÃO DE LITERATURA 

 

2.1  O papel da distrofina no músculo  

 

A distrofina é uma proteína de 427 kDa, que integra o complexo 

distrofina glicoproteínas associadas (DGC) localizada logo abaixo do 

sarcolema, co-localizada com a β-espectrina e a vinculina, tendo a sua porção 

N-terminal ligada à actina e a porção C-terminal conectada à proteína 

transmembrana β-distroglicana (ALLIKIAN; MCNALLY, 2007; LAPIDOS et al., 

2004). Está presente na musculatura lisa, esquelética e cardíaca. Atua no 

importante papel do estabelecimento das conexões entre o meio intracelular, 

da actina citoesqueleto e/ou a estrutura sarcomérica e a membrana basal 

externa. As suas principais funções compreendem a estabilização da 

membrana durante os ciclos de contração e a transdução de força (LAPIDOS 

et al., 2004; TOWBIN, 1998). 

Alguns estudos demonstraram que a distrofina e o DGC desempenham 

papel fundamental na proteção e estabilização da membrana plasmática contra 

o estresse mecânico induzido pela contração muscular (DANIALOU et al., 

2001; LAPIDOS et al., 2004; RYBAKOVA et al., 2000). Além disso, os miócitos 

que perdem a distrofina são mais vulneráveis ao estresse mecânico imposto 

sobre a célula resultando na perda da integridade sarcolemal com progressiva 

degeneração miofibrilar (miocitólise) na musculatura esquelética e cardíaca 

(DANIALOU et al., 2001; KORNEGAY et al., 2012). 

Na DMD, a ausência da distrofina nas células musculares desencadeia 

mecanismos compensatórios como o aumento da expressão de proteínas 

estruturais visando a manutenção da estabilidade da membrana celular durante 

a contração (HELLIWELL et al., 1992). Nesse sentido, aumento na expressão 

sarcolemal da utrofina, proteína homóloga e estruturalmente muito similar à 

distofina (73% de sequência de aminoácidos homólogos), foi documentado em 

pacientes com DMD (HELLIWELL et al., 1992; KLEOPA et al., 2006), em 



4 

animais GRMD (LANFOSSI et al., 1999) e em modelo murino mdx 

(MATSUMURA et al., 1992). 

O aumento na expressão endógena da utrofina foi documentado em 

animais GRMD, todavia essa não parece ser eficiente para reconstruir a 

ligação com o complexo DGC, uma vez que o modelo animal apresenta graves 

lesões musculares e cardíacas semelhante aos acometidos pela DMD 

(BERETTA et al., 2014; LANFAROSSI et al., 1999; MALVESTIO et al., 2015). 

 

 

2.2  Lesão muscular no cão Golden Retriever distrófico 

 

 A GRMD é caracterizada por fraqueza muscular progressiva e atrofia. 

Estas características são semelhantes às da DMD humana (NAKAMURA; 

TAKEDA, 2011). Níveis extremamente elevados de creatino quinase (CK) são 

identificados nos primeiros dias de vida e atingem o máximo em 6-8 semanas 

após o nascimento, antes mesmo do aparecimento dos primeiros sinais 

clínicos, sugerindo que o início das lesões poderia ocorrer ainda no útero o que 

permitiria o diagnóstico precoce da doença (COLLINS; MORGAN, 2003; 

MERLINI; SABATELLI, 2015; NGUYEN et al., 2002; VALENTINE et al., 1988). 

Os níveis de CK permanecem elevados durante o estágio avançado da doença 

indicando necrose persistente da fibra muscular. Declínio progressivo em seus 

níveis é observado em cães de 3,5 a 6 anos de idade, semelhante ao 

observado em pacientes com DMD (VALENTINE et al., 1988). Os cães que 

sobrevivem durante o período neonatal apresentaram ondas de degeneração e 

necrose musculares com regeneração inicial suficiente para compensar a 

degeneração das fibras (BANKS; CHAMBERLAIN, 2008; MIYAZATO et al., 

2011b; NGUYEN et al., 2002; VALENTINE et al., 1990).  

 A patogênese da distrofia muscular é caracterizada por duas fases: a 

fase I que envolve os efeitos diretos da deficiência de distrofina e a fase II 

relacionada à fibrose do endomísio e atrofia muscular (HOFFMAN; GOROSPE, 

1991; MORAES et al., 2015; NGUYEN et al., 2002). Lesões da fase I são 

relatadas em todas as espécies com ausência de distrofina e caracterizam-se 

por hialinização, hipertrofia, acúmulo intracelular de sais de cálcio e necrose 

com subsequente regeneração de miofibras para compensar a degeneração, 



5 

além de grande resposta inflamatória (MIYAZATO et al., 2011a; MIYAZATO et 

al., 2011b; MORAES et al., 2015; NGUYEN et al., 2002). As lesões da fase II 

podem ser observadas em cães GRMD aos 2 meses de idade. Estas lesões 

consistem principalmente no aumento do tecido conectivo no endomísio 

caracterizando a fibrose endomisial e substituição de fibras musculares por 

tecido fibroso e células adiposas. Além disso, marcada atrofia muscular, focos 

de miofibras completamente mineralizadas e heterogeneidade no diâmetro das 

fibras também são observadas em músculos na fase II da doença. Somente 

crianças com DMD, cães GRMD e músculo diafragma de camundongos mdx 

apresentam esta fase da doença. Ademais, o cão GRMD é o único modelo 

animal que demonstra precocemente por volta de dois meses de idade, 

desenvolvimento generalizado das lesões secundárias pela deficiência de 

distrofina de um modo compatível com meninos afetados pela DMD (BANKS; 

CHAMBERLAIN, 2008; LESSA et al., 2014a; NGUYEN et al., 2002). Os 

principais achados ultraestruturais em cães GRMD incluem dilatação do 

retículo sarcoplasmático, fibras hipercontraídas, necrose, degeneração de 

áreas subsarcolemais e desorganização citoplasmática (VALENTINE et al., 

1990). 

  Estudo envolvendo 16 cães machos Golden Retriever afetados pela 

distrofia muscular com idades entre 5 a 51 meses mostrou na análise 

histopatológica presença de hialinização e necrose das fibras musculares bem 

como aumento das células inflamatórias, particularmente as mononucleares 

(MIYAZATO et al., 2011b). Além disso, foram observadas variações no 

tamanho das fibras, calcificação distrófica, regeneração das fibras de menor 

diâmetro e infiltração de células adiposas em áreas interfasciculares. Verificou-

se ainda, aumento significativo no número de fibras positivas para a deposição 

de cálcio na musculatura esquelética desses cães, sugerindo que a ruptura da 

homeostase do cálcio poderia estar associada com as lesões degenerativas 

severas observadas nesses animais (MIYAZATO et al. 2011a). A avaliação 

histológica das fibras musculares esqueléticas de cães GRMD evidenciou 

irregularidade na forma e perda do padrão em mosaico entre os diferentes tipos 

de fibras musculares. Ainda neste estudo, observou-se o envolvimento 

cardíaco com pronunciadas lesões em 87,5% dos cães GRMD analisados. As 

análises do músculo cardíaco desses cães distróficos revelaram aumento na 



6 

deposição de tecido conectivo, presença de células inflamatórias, necrose e 

algumas fibras com calcificação distrófica (MIYAZATO et al. 2011a).  

 Estudo histopatológico, bioquímico e imunológico realizado no músculo 

gastrocnêmio e junção miotendínea de animais GRMD revelou alterações 

semelhantes às observadas nos humanos acometidos pela distrofia muscular, 

tais como: fibrose, hialinização, hipertrofia, necrose, calcificação e 

regeneração. Entretanto, a morfologia das lesões nas junções miotendíneas 

foram mais acentuadas do que as do músculo gastrocnêmio, caracterizada 

pelo aumento da fibra do Tipo II, diminuição da expressão do complexo de 

maior histocompatibilidade de classe I (MHC I) e menor atividade citotóxica das 

células CD8. Tais resultados sugerem fortemente a ação do sistema 

imunológico no processo inflamatório na distrofia muscular do Golden Retriever 

(BERETTA et al., 2014). 

 Recentemente estudo de nosso laboratório com animais GRMD com 

idade entre 5 a 51 meses de idade, demonstrou que os cães apresentaram 

grandes áreas do ventrículo esquerdo e direito com deposição de tecido fibroso 

e adiposo, fato este que poderia comprometer o correto funcionamento do 

coração e possivelmente progredir à insuficiência cardíaca. No mesmo estudo 

foi encontrado pela primeira vez as células de Anitschkow (células 

indiferenciadas) nos corações dos cães GRMD, antes apenas encontradas na 

doença cardíaca reumática em humanos (MALVESTIO et al., 2015). 

 

 

2.3 Terapias para DMD/GRMD 

 

 Atualmente existem técnicas diagnósticas bem estabelecidas para a 

DMD, porém nenhum tratamento efetivo foi desenvolvido para esta doença. O 

surgimento de novas terapias possibilita a busca de diferentes estratégias no 

tratamento da doença (MORAES et al., 2015).  

 As estratégias terapêuticas utilizadas para a DMD podem ser 

categorizadas como farmacológica, celular ou mesmo a associação delas. As 

terapias farmacológicas visam controlar os mecanismos patogênicos buscando 

amenizar o fenótipo distrófico da doença. As duas abordagens moleculares 

mais comuns são a terapia gênica, na qual o gene da distrofina é introduzido 



7 

no músculo por injeção local ou através da vasculatura usando plasmídios ou 

vetores virais e a correção genética que envolve a introdução de 

oligonucleotídeos para restabelecer a sequência correta de nucleotídeos 

(KORNEGAY et al., 2012). A terapia celular através do transplante de células 

normais como os mioblastos, ou células-tronco visa estabelecer fibras 

musculares saudáveis no músculo doente a fim de amenizar o processo 

distrófico (MORAES et al., 2015; KORNEGAY et al., 2012). 

 Atualmente, os corticosteroides são o tratamento mais utilizado para a 

fraqueza muscular em pacientes com DMD, principalmente em crianças 

ambulantes. Vários estudos demonstraram a eficácia da terapia com 

corticoides em retardar a perda da independência, a deambulação autônoma e 

a manutenção da função pulmonar (MERLINI; SABATELLI, 2015). Outro 

estudo, estudou a correlação entre o tratamento com corticosteroide 

(prednisona e deflazacorte) e o tempo de perda da mobilidade em 477 

pacientes com DMD. Foi verificado, que os pacientes que receberam 

tratamento com corticosteroide em longo prazo obtiveram resultados positivos 

com 82% menor risco de perda da deambulação (KIM et al., 2015). 

Muitos estudos foram desenvolvidos em cães GRMD para avaliar o 

papel das terapias farmacológicas para o tratamento da DMD. Foram avaliadas 

alterações funcionais e histopatológicas em cães GRMD submetidos à 

administração oral diária do corticóide prednisona por 4 meses (LIU et al., 

2004). Os resultados mostraram hipertrofia do músculo sartório cranial e 

melhora da angulação da articulação tíbio-társica, aumento da calcificação das 

miofibras e diminuição da expressão da miosina fetal, achados esses que 

mostraram os benefícios, mas também alterações histopatológicas deletérias 

após o tratamento com prednisona a esses animais (LIU et al., 2004; MORAES 

et al., 2015). 

 A combinação terapêutica entre a ciclosporina A e a prednisolona em 

níveis imunossupressores no percurso da doença de cães GRMD foi avaliada 

(BARTHÉLÉMY et al., 2012). Os resultados demonstraram intenso efeito sobre 

o fenótipo GRMD após o tratamento, conduzindo à exacerbação das lesões de 

calcificação e atrofia além da diminuição da força muscular e aumento da 

fadiga. Todavia, verificou-se surpreendente melhora na progressão das 

manifestações sistêmicas e na locomoção dos animais como também 



8 

diminuição dos valores de CK. Este fato salienta a importância do estudo no 

modelo canino na DMD (BARTHÉLÉMY et al., 2012; MORAES et al., 2015). 

Outro estudo sugeriu, para que o tratamento imunossupressor efetivo seja em 

cães a dose de ciclosporina A deve ser no decorrer do tratamento, orientado 

pelos valores séricos e idade dos animais (MORINI et al., 2008). 

Estudo com terapia gênica indicou que cães GRMD que receberam 

injeções no músculo com o mini-gene da distrofina expressaram marcações 

positivas para essa proteína 14 dias após o tratamento. Por outro lado, dois 

dos seis cães inoculados com o gene completo apresentaram fortes marcações 

para distrofina aos 10 dias após a injeção, contudo não foi observada melhora 

clínica nos cães afetados (HOWELL et al., 1997; HOWELL et al., 1998; 

MORAES et al., 2015). Outro estudo com terapia gênica demonstrou que cães 

GRMD com 4 dias de idade que receberam a injeção intravenosa de um vetor 

associado ao adenovírus (AAV9) carreando um códon humano com o mini-

gene da distrofina sob o controle do citomegalovírus (CMV), apresentaram 

expressão muscular generalizada do transgene após 16 semanas de 

tratamento, porém sem resultados clínicos satisfatórios (KORNEGAY et al., 

2010; MORAES et al., 2015). 

Em relação às terapias celulares, é sabido que as células fetais e as 

células-troncos embrionárias podem contribuir para a regeneração do músculo 

doente (KORNEGAY et al., 2012; MORAES et al., 2015). Estudo verificou que 

o transplante de mioblastos caninos mostrou-se incapaz de alcançar 

significativa implantação em cães GRMD (KORNEGAY et al., 2012). Por outro 

lado, o transplante de mesangioblastos (células-tronco associadas a vasos) em 

cães GRMD resultou em grande recuperação da expressão da distrofina e no 

restabelecimento da morfologia e função muscular (confirmado pela 

mensuração da força de contração das fibras individuais) que possibilitou 

notável melhora clínica e preservação da atividade motora (SAMPAOLESI et 

al., 2006). Outro estudo, avaliando as células-tronco imaturas da polpa dental 

de humanos (hIDPSC) transplantado por injeção arterial ou muscular em quatro 

cães GRMD, evidenciou  mínima expressão da distrofina nos animais tratados. 

No entanto, melhora do quadro clínico foi observado nos animais que 

receberam injeções arteriais mensais, sugerindo que múltiplos fornecimentos 



9 

sistémicos seriam mais eficazes do que as injeções locais (KERKIS et al., 

2008). 

 Apesar do progresso de diversas abordagens terapêuticas, a DMD 

possuí altas taxas de mortalidades. Possivelmente, esta falha seria explicada 

porque a maioria das pesquisas ainda são realizadas em modelos murinos que 

não reproduzem de forma fidedigna a patologia da doença. Portanto, os 

animais GRD são extremamente úteis para melhor compressão dos 

mecanismos patológicos e estudos pré-clínicos de terapias recentemente 

desenvolvidas utilizando as do tipo farmacológicas bem como as genéticas e 

as baseadas em células, no intuito de buscar a cura ou aumento na expectativa 

de vida aos acometidos pela DMD (MALVESTIO et al.,2015). 

 

 

2.4 O papel dos mastócitos na DMD 

 

Em condições normais do músculo esquelético, o dano causado pela 

força contrátil é seguido da resposta inflamatória que desaparece após alguns 

dias. Esta resposta transitória é uma reação homeostática normal à injúria que 

induz reparação muscular. Embora a mutação na distrofina represente a causa 

principal na DMD, são os processos secundários que envolvem a inflamação 

crônica, degeneração muscular e necrose que agravam a progressão da 

doença (ABDEL-SALAM, 2009).  

Nos pacientes com DMD há resposta inflamatória persistente nos 

músculos esqueléticos com a invasão de macrófagos e leucócitos 

polimorfonucleares, que secretam citocinas e mediadores químicos 

(GROUNDS; TORRISI, 2004). Os neutrófilos constituem umas das primeiras 

células inflamatórias que interagem com o tecido distrófico e com isso números 

elevados destas células são observados nas primeiras horas após a lesão 

inicial. No entanto, os neutrófilos são células de curta duração, cujo número 

diminui rapidamente sendo pouco detectáveis 3 a 4 dias após a lesão 

(HODGETTS et al., 2006).  

Neste sentido, a presença dos macrófagos é constante tanto na injúria 

aguda (lise das miofibras) como nas fases mais tardias (regeneração muscular) 

no músculo quadríceps de camundongos mdx (TIDBALL; WEHLING-



10 

HENRICKS, 2004). Ademais, foi sugerido que os mastócitos são capazes de 

iniciar e modular o recrutamento de neutrófilos e macrófagos em resposta à 

injúria muscular (DUMONT et al., 2007). 

Os mastócitos são células que derivam de células-tronco 

hematopoiéticas presentes na medula óssea e migram para os tecidos 

periféricos como células imaturas e passam por diferenciação in situ. São 

encontrados em tecidos vascularizados, tais como mucosas e epitélios, sendo 

particularmente abundantes na pele, no trato respiratório e gastrointestinal e 

principalmente próximos aos vasos sanguíneos.  Por esta razão, são umas das 

primeiras células inflamatórias susceptíveis à injúria (ABBAS, 2008; FRENZEL; 

HERMINE, 2013; REBER; FROSSARD, 2014). Os mastócitos variam em sua 

forma, possuem núcleos redondos e no citoplasma contém grânulos ligados à 

membrana e corpos lipídicos. Os grânulos contêm proteoglicanos ácidos que 

se ligam aos corantes básicos (ABBAS, 2008). Foi relatado que meninos 

afetados pela DMD de 3 a 5 anos de idade, apresentam a primeira 

manifestação clínica da deficiência de distrofina no mesmo período em que 

ocorre aumento significativo do número de mastócitos nos músculos afetados, 

sugerindo a participação dessas células na patogênese da DMD (GOROSPE et 

al., 1994).  

A ativação dos mastócitos ocorre por uma série de agentes físicos 

(trauma mecânico, calor, frio e irradiação) e compostos químicos (enzimas, 

polissacarídeos, lectinas, anafilatoxinas, compostos básicos e Ca2+) que 

induzem a liberação de várias moléculas contidas no citoplasma em um 

processo conhecido como degranulação. As principais moléculas dos grânulos 

são histamina, serotonina, proteases (triptase, quimase, carboxipeptidase), 

mediadores de lipídios (prostaglandinas), citocinas, quimiocinas e as espécies 

reativas de oxigénio. Estas moléculas agem em vários sítios, aumentam a 

permeabilidade do epitélio e endotélio, estimulam a angiogênese, induzem a 

contração do músculo liso, ativam o recrutamento de neutrófilos e macrófagos 

e estimulam os fibroblastos a produzirem colágeno (ABBAS, 2008; ABDEL-

SALAM, 2009; FRENZEL; HERMINE, 2013; GOROSPE et al., 1994). 

Os mastócitos são conhecidos por promoverem a proliferação de 

fibroblastos, porém este mecanismo não foi completamente elucidado. A 

triptase é a protease mais abundante encontrada nos mastócitos, que pode 



11 

compreender até 25% do peso seco destas células. Além disso, a triptase não 

só é conhecida por degradar substratos no meio extracelular, mas sim por 

ativar o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), um potente 

promotor de fibrose, ou por estimular diretamente os fibroblastos (GOROSPE 

et al., 1994; RUOSS et al., 1991). Mesmo em baixas concentrações, a triptase 

estimula significativamente a mitogênese de fibroblastos in vitro (RUOSS et al., 

1991).   

Os mastócitos são conhecidos por possuírem sensores in situ de 

anormalidades do tecido e por estarem envolvidos nos mecanismos de 

reparação de feridas e destruição tecidual. Dessa forma, o extravasamento do 

conteúdo citoplasmático da miofibra causada pela deficiência de distrofina 

atuaria como estímulo para o recrutamento de mastócitos. Foi sugerido que o 

acúmulo e a degranulação dos mastócitos poderia causar a necrose e a 

progressão da fibrose levando assim a regeneração muscular incompleta 

(GOROSPE et al., 1994; NAHIRNEY et al., 1997). Neste contexto, foi 

observado aumento no número de mastócitos no músculo fibular longo de 

pacientes DMD, além de cães GRMD e de camundongos mdx pela técnica de 

imunofluorescência em comparação ao grupo controle (não afetados) 

(GOROSPE et al., 1994). Outro estudo verificou que camundongos mdx que 

receberam injeções intraperitoneais de cromoglicato dissódico (agente 

estabilizador de mastócitos) por 15 dias apresentaram redução na mionecrose 

nos músculos esternocleidomastoideu, tibial anterior e diafragma (MARQUES 

et al., 2008). Além disso, injeções intramusculares de grânulos de mastócitos 

purificados em camundongos mdx causaram danos extensos localizados nos 

músculos deficientes de distrofina, fato este não observado nos músculos de 

animais controles. Portanto, não só o músculo distrófico contém maior número 

de mastócitos, mas também possui elevada sensibilidade aos seus produtos 

(GRANCHELLI, 1995).   

 

 

3 OBJETIVO 

 

O objetivo da presente pesquisa foi o de avaliar a expressão dos 

mastócitos e sua possível relação com as lesões histopatológicas em quatro 



12 

grupos musculares esqueléticos (masseter, diafragma, tríceps braquial e 

bíceps femoral) de cães Golden Retriever de 2 a 8 meses de idade afetados 

pela distrofia muscular buscando estabelecer uma inter-relação dessas células 

inflamatórias com a patogênese da fibrose.  

 

 

4 MATERIAL E MÉTODOS 

 

4.1 Amostras e grupos 

 

A escolha dos grupos musculares foi baseada no estudo prévio do nosso 

laboratório com músculos distróficos de Golden Retriever em que os quatro 

grupos musculares supracitados foram apontados como os mais degenerados 

(MIYAZATO, 2010). 

Foram utilizados fragmentos de quatro grupos musculares esqueléticos 

(músculo masseter, diafragma, músculo tríceps braquial e músculo bíceps 

femoral) de 6 cães GRMD de 2 a 8 meses de idade, provenientes do banco de 

fragmentos do laboratório de Patologia Experimental e Comparada do 

Departamento de Patologia Animal da FCAV/Unesp (Tabela 1). Quatro animais 

de 2, 3, 5 e 8 meses e negativos para a doença do mesmo banco de 

fragmentos foram utilizados como controle. Todos os procedimentos 

histopatológicos foram realizados de acordo com Luna, 1968. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



13 

 

 

 

 

 

Animal Idade Sexo 

Controle 

Controle 

Controle 

Controle 

Controle 

Controle 

Afetado 1    

Afetado 2    

Afetado 3 

Afetado 4 

Afetado 5 

Afetado 6 

Afetado 7 

Afetado 8 

Afetado 9 

Afetado 10 

  7 dias 

  2 meses 

  3 meses 

  5 meses 

  8 meses 

 13 meses 

  7 dias   

  2 meses 

  2 meses 

  3 meses 

  5 meses 

  7 meses 

  8 meses 

  8 meses 

 11 meses 

 13 meses 

Macho 

Macho  

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

Macho 

 

  

Este trabalho cumpriu os princípios éticos na experimentação animal 

adotado pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório 

(SBCAL) e aprovado pela Comissão de ética no uso de Animais (CEUA) da 

Universidade Estadual Paulista Júlio Mesquita Filho, FCAV- Campus de 

Jaboticabal, (protocolo 01465/15). 

 

 

 

 

 

Tabela 1. 

Identificação, idade e sexo de amostras musculares de 
controles e cães GRMD com idades entre 7 dias a 13 
meses, pertencentes ao banco de fragmentos do 
laboratório de Patologia Experimental e Comparada da 
FCAV/Unesp. 
 

 

 



14 

 

4.2 ESTUDO QUALITATIVO 

 

4.2.1 Histopatologia 

 

Fragmentos da musculatura esquelética de animais GRMD de 2 a 8 

meses de idade foram incluídos em parafina e cortados ao micrótomo em 

secções de 3 μm de espessura e corados com hematoxilina-eosina (HE) pelo 

aparelho corador automático Belatrix (EasyPath®, São Paulo-SP) azul de 

toluidina e tricrômio de Azan, com a finalidade de avaliar a presença de 

mastócitos e do infiltrado fibroso nos grupos musculares por microscopia de luz 

convencional.  

 

 

4.2.2 Coloração Azul de Toluidina 

 

As lâminas com cortes parafinados foram mantidas em estufa a 60ºC por 

45 minutos e, em seguida, passaram por desparafinização em xilol e hidratação 

em concentrações decrescentes de etanol. Após lavagem com água destilada 

as lâminas foram coradas com azul de toluidina 0,1% (MERCK®, Darmstadt- 

Alemanha) por 15 segundos. 

 

 

4.2.3 Coloração Tricrômio de Azan 

 

A desparafinização e hidratação foram semelhantes à coloração anterior. 

Seguiu-se à imersão das lâminas no corante azocarmim (Sigma-Aldrich®, Saint 

Louis-USA) em estufa a 60ºC por 30 minutos. Após lavagem com água 

destilada foram imersas em óleo de anilina a 5% por 30 segundos. Em seguida, 

foram no ácido acético e posteriormente em solução alcóolica a 10% por um 

minuto. As lâminas foram transferidas para um recipiente de vidro com ácido 

fosfotúngstico a 5% em solução aquosa por uma hora. Após imersão com água 

destilada por 5 minutos, as lâminas foram contra coradas com azul de anilina 

(Sigma-Aldrich®, Saint Louis-USA) por 23 minutos e imersas no álcool a 95%. 



15 

 

4.3 ESTUDO QUANTITATIVO 

 

4.3.1 Histomorfometria 

 

O estudo histomorfométrico de contagem de mastócitos e quantificação 

de fibras colágenas foi realizado em todos os grupos musculares de afetados e 

controles, totalizando 40 lâminas para a leitura.  

A quantificação dos mastócitos foi realizada em movimentos de "zigue-

zague" por toda extensão dos fragmentos e quantificados pelo numerador 

automático sequencial KW-trio®, no microscópio de luz Primo Star Zeiss® 

(aumento de 40x).  

A quantificação das fibras colágenas foi realizada em 10 campos 

aleatórios (aumento de 40x) dos fragmentos musculares de acordo com Prado 

et al. (2012), no microscópio de luz Leica® DMR (câmera DFC 290), mensurado 

pelo software Leica® Qwin V3. 

  

 

4.3.2 Análise estatística 

 

Os dados obtidos foram analisados utilizando-se o programa estatístico 

GraphPad Prism 5  (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Os dados 

foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov e Smirnov. 

Comparações múltiplas foram feitas pela análise de variância (ANOVA) e pós-

teste de Tukey. Foi admitido o valor de p<0,05. Os resultados foram 

apresentados como média±desvio padrão. 

 

 

5 RESULTADOS 

 

5.1 Estudo qualitativo das lesões 

 

Os fragmentos musculares dos cães controle apresentaram 

características musculares normais, com presença de fibras musculares 



16 

uniformemente distribuídas com diâmetro regular, formato poliédrico envolvido 

por tecido conectivo e núcleos periféricos (Figuras 1A, 1B e 1C).  

Os músculos masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral dos 

cães distróficos de 2 a 8 meses de idade apresentaram lesões distintas de 

intensidades variadas. A coloração de HE possibilitou evidenciar lesões 

degenerativas e alternância entre atrofia e hipertrofia das fibras em todos os 

músculos avaliados. A necrose foi mais frequente no diafragma, tríceps 

braquial e bíceps femoral e rara no masseter, enquanto a hialinização foi mais 

frequente nos músculos masseter, diafragma e tríceps braquial e rara no 

músculo bíceps femoral.  

O infiltrado inflamatório de células mononucleares distribuído pelo 

interstício ou margeando os fascículos apresentou-se mais frequente nos 

músculos tríceps braquial e bíceps femoral e no músculo masseter (Figura 2A) 

ao contrário do diafragma. A infiltração de células adiposas interfasciculares e 

fibrose intersticial foram achados constantes em todos os grupos musculares 

distróficos (Figuras 2C e 2D).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



17 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    

          

 

       

 

                                                               

 

 

 

 

 

 

Figura 1. Fotomicrografia do músculo de animais controles com 2, 3 
e 8 meses respectivamente. Fibras musculares uniformemente 
distribuídas com diâmetro regular. A. Masseter. B. Tríceps braquial. 
C. Bíceps femoral. 

   A 

   B 

  C 



18 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                              

 

 

Figura 2. Fotomicrografia do músculo masseter de cães GRMD. A. Fragmento muscular de cão 
com 2 meses de idade. Miofibras com variação de diâmetro (*), presença de infiltrado 
inflamatório (seta). B. Fragmento muscular de cão com 3 meses de idade. Presença de tecido 
colagenoso no espaço perimisial e endomisial (seta). C. Fragmento muscular de cão com 5 
meses de idade. Intensa deposição de células adiposas. D. Fragmento muscular de cão com 8 
meses de idade. Moderada deposição de células adiposas.  

   A   B 

C  D 

  *  
  *  

  *  



19 

A coloração de azul de toluidina revelou que a distribuição dos 

mastócitos nos músculos masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps 

femoral ocorreu predominantemente em áreas de fibrose, sendo estas ao redor 

de arteríolas e vênulas e no interior do espaço endomisial (Figura 3). 

  

 

   

 

 

 

 

 

 

 

       

 

 

 

 

 

 
Figura 3. Fotomicrografia do músculo tríceps braquial de cães GRMD. A. Fragmento 
muscular de cão com 2 meses de idade. Presença de mastócitos (seta) em áreas de 
fibrose e células adiposas. B. Fragmento muscular cão com 3 meses de idade. Presença 
de mastócitos (seta) em áreas de fibrose.  

B 



20 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 3.  Fotomicrografia do músculo tríceps braquial de cães GRMD. C. Fragmento 
muscular de cão com 5 meses de idade. Presença de mastócitos (seta) em áreas de 
fibrose. D. Fragmento muscular de cão com 8 meses de idade. Presença de mastócitos 
(seta) no espaço endomisial.  

C 

D 



21 

A coloração de tricrômio de Azan evidenciou a deposição de tecido 

colagenoso (azul) nos músculos masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps 

femoral. O tecido fibroso ocupou principalmente o perimísio e endomísio da 

musculatura esquelética dos cães GRMD (Figura 4).                                            

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 4.  Fotomicrografia do músculo bíceps femoral de cães GRMD. A. Fragmento muscular 
de cão com 2 meses de idade. Intensa deposição de tecido colagenoso (seta) no endomísio. B. 

Fragmento muscular de cão com 3 meses de idade. Intensa deposição de tecido colagenoso 
(seta) no endomísio. C. Fragmento muscular de cão com 5 meses de idade.  Moderada 
deposição de fibrose (seta) no perimísio e endomísio. D. Fragmento muscular de cão com 8 
meses de idade. Discreta deposição de tecido colagenoso (seta) no endomísio.  

   A 

  C 

   A 

 B 

 D 



22 

5.2 ESTUDO QUANTITATIVO 

 

5.2.1 Histomorfometria  

 

Das 40 amostras analisadas o grupo muscular que apresentou o maior 

número médio de mastócitos foi o do tríceps braquial, seguido do músculo 

bíceps femoral, e músculo masseter (p<0,05). O menor número foi observado 

no músculo diafragma (p<0,05). A concentração de mastócitos nos grupos 

musculares dos animais afetados variou em relação à faixa etária de 2 a 8 

meses. Em todos os grupos musculares a idade de 2 meses apresentou o 

maior número de mastócitos ao contrário dos animais com 8 meses (Tabela 2 e 

Figura 3). 

 

 

 

 

Músculos        2 meses 3 meses 5 meses   8 meses  

 

Masseter             

 

368±7,043A       

  

   338±2,366AC 

  

351,3±8,595BC 

 

 330±10,10B 

 

      

Diafragma 

 

Tríceps      53            

braquial 

157,3±6,976A 

 

761,3±9,606A 

   139±2,683B 

 

  736,3±2,251B 

140,3±1,862AB 

 

722,3±1,366B 

129,5±4,848C 

 

671,5±18,37C 

 

 

 

Bíceps     

femoral 

575,7±6,348A   557,3±4,227B 545±3,869C 524,2±3,869C  

 

 

 

 

 

 

 

 
Tabela 2 
Valores médios1 (respectivos desvio padrão) e análise de variância para o número de mastócitos no 
masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral de cães GRMD de 2, 3, 5 e 8 meses de idade. 
 

 

 

1 Médias (n=40)  nas linhas seguidas por letras em comum não diferem entre si pelo teste Tukey (p<0,05). 



23 

Os controles apresentaram menor número de mastócitos nos quatro 

grupos musculares avaliados. No grupo de afetados o infiltrado de mastócitos 

apresentou aumento significativo (p<0,05) comparado ao grupo controle 

(Tabela 3 e Figura 1B). 

 

 

 

 

Músculos        2 meses 3 meses 5 meses   8 meses  

 

Masseter             

 

119,7±4,926A       

  

   95,00±2,898B 

  

93,50±2,739B 

 

55,33±21,28C 

 

      

Diafragma 

 

Tríceps      53            

braquial 

74,00±3,742A 

 

274,3±6,563A 

   65,00±2,530B 

 

  135,0±2,366B 

63,83±3,312BC 

 

124,5±2,588B 

50,00±25,72C 

 

88,83±4,792C 

 

 

 

Bíceps     

femoral 

277,8±8,085A   134,8±2,483B 144,2±3,061B 84,00±11,83C  

 

    

                                                                                                                                                                                                                                               

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Tabela 3 
Valores médios1 (respectivos desvio padrão) e análise de variância para o número de mastócitos no 
masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral de cães controle de 2, 3, 5 e 8 meses de idade. 
 

 

 

1 Médias (n=40)  nas linhas seguidas por letras em comum não diferem entre si pelo teste Tukey (p<0,05). 



24 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 5. Morfometria dos mastócitos nos músculos masseter (M), diafragma (D), tríceps braquial (TB) 

e músculo bíceps femoral (BF) do grupo controle (C) e de cães GRMD com idade entre 2, 3, 5 e 8 

meses respectivamente. Colunas com letras em comum não diferem entre si pelo teste de Tukey 

(p<0,05). 

Masseter

C
2 

M
2 

C
3 

M
3 

C
5 

M
5 C

8
M

8 
0

100

200

300

400

A

B

C
C

D

E

BF DF

n
ú

m
e
ro

 d
e
 m

a
s
tó

ti
c
o

s
 (

n
º)

Diafragma

C
2 D

2
C
3 

D
3 

C
5 D

5
C
8 

D
8 

0

50

100

150

200

A

B

C C

D

E

F
BD

n
ú

m
e
ro

 d
e
 m

a
s
tó

ti
c
o

s
 (

n
º)

Tríceps braquial

C
2 

TB
 2

 
C
3 

TB
 3 C

5

TB
 5

 
C
8

TB
 8

 

0

200

400

600

800

1000

A

B

C C

D D

E

F

n
ú

m
e
ro

 d
e
 m

a
s
tó

ti
c
o

s
 (

n
º)

Bíceps femoral

C
2 

B
F 2

 
C
3 

B
F 3

 C
5 

B
F 5 C

8
B
F 8

0

200

400

600

800

A

B

C C

D E E

F

n
ú

m
e
ro

 d
e
 m

a
s
tó

ti
c
o

s
 (

n
º)



25 

5.2.2 Morfometria do tecido fibro-colagenoso 

 

Verificou-se intensa deposição de tecido fibro-colagenoso em todos os 

fragmentos musculares dos animais GRMD. O músculo tríceps braquial 

apresentou maior quantidade deste tecido, seguido pelos músculos bíceps 

femoral, diafragma e masseter. A quantidade deste tecido variou em relação ao 

grupo muscular e faixa etária em todos os grupos musculares estudados  

(Tabela 4 e Figura 4).  

 

 

 

 

Músculos        2 meses 3 meses 5 meses   8 meses  

 

Masseter             

 

7,053±1,352A       

  

4,595±0,4926B 

  

3,817±1,350B 

 

1,944±0,442C 

 

      

Diafragma 

 

Tríceps      53            

braquial 

17,12±1,687A 

 

53,70±3,715A 

12,09±1,369B 

 

45,87±2,369B 

5,314±0,506C 

 

6,468±0,427C 

3,523±0,283D 

 

8,471±0,697C 

 

 

 

Bíceps     

femoral 

 31,95±4,704A  25,73±3,484B 15,18±3,267C 6,343±1,498D  

 

 

 

 

Quando comparado ao grupo controle, o grupo dos afetados apresentou 

aumento significativo na quantidade de tecido colagenoso em todos os grupos 

musculares (p<0,05) medido em porcentagem de tecido por campo (Tabela 5 e 

Figura 1C). 

 

 

 

 
Tabela 4 
Valores médios1 (respectivos desvio padrão) e análise de variância para a deposição de tecido 
colagenoso no masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral de cães GRMD de 2, 3, 5 e 8 
meses de idade. 
 

1 Médias (n=40) nas linhas seguidas por letras em comum não diferem entre si pelo teste Tukey (p<0,05). 



26 

 

 

 

Músculos        2 meses 3 meses 5 meses   8 meses  

 

Masseter             

 

1,167±0,194A       

  

0,706±0,047A 

  

0,690±0,03A 

 

0,407±0,295A 

 

      

Diafragma 

 

Tríceps      53            

braquial 

2,518±0,599A 

 

1,213±0,108A 

1,080±0,097B 

 

0,701±0,068A 

0,818±0,104B 

 

0,650±0,037A 

0,256±0,131B 

 

0,382±0,120A 

 

 

 

Bíceps     

femoral 

 1,038±0,092A  0,711±0,328A 0,603±0,688A 0,238±0,077A  

                                           

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 Médias (n=40) nas linhas seguidas por letras em comum não diferem entre si pelo teste Tukey (p<0,05). 

 
Tabela 5 
Valores médios1 (respectivos desvio padrão) e análise de variância para a deposição de tecido colagenoso 
no masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral de cães controle de 2, 3, 5 e 8 meses de idade. 
 



27 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 6. Morfometria de tecido colagenoso nos músculos masseter (M), diafragma (D), tríceps braquial 

(TB) e músculo bíceps femoral (BF) do grupo controle (C) e cães GRMD com idade entre 2, 3, 5 e 8 

meses respectivamente. Colunas com letras em comum não diferem entre si pelo teste de Tukey 

(p<0,05). 

 

Masseter

 C
2

M
2 

C
3 

M
3 

C
5 

 M
5

C
8

M
8 

0

2

4

6

8

A
A A A

B

C
C

D

p
o

rc
e
n

ta
g

e
m

 (
%

)

Diafragma

C
2 

D
2 

C
3 

D
3 

C
5 

D
5 

C
8 

D
8 

0

5

10

15

20

A

B

C C C

D

E
F

p
o

rc
e
n

ta
g

e
m

 (
%

)

Tríceps braquial

C2 

TB 2 C3 

TB 3
 

C5
TB 5 C8 

TB 8
 

0

20

40

60

A A A A

B

C

D
D

p
o

rc
en

ta
g

em
 (

%
)

Bíceps femoral

C2 

BF 2 C3 

BF 3
 

C5 

BF 5
 

C
8

BF 8
 

0

10

20

30

40

A A A A

B

C

D

E

p
o

rc
en

ta
g

em
 (

%
)



28 

   6 DISCUSSÃO 

 

No masseter, diafragma, tríceps braquial e bíceps femoral de cães 

distróficos de 2 a 8 meses de idade, foram identificadas lesões caracterizadas 

por variações no diâmetro das fibras, necrose, hialinização, infiltrado 

inflamatório predominantemente mononuclear, infiltração gordurosa e fibrose 

intersticial. Essas variavam em extensão e distribuição de acordo com o 

músculo e a idade, corroborando com o descrito por outros autores para os 

mesmos músculos e idades entre 10 a 21 meses e 5 a 51 meses, 

respectivamente (BERETTA et al., 2014; MIYAZATO et al., 2011a; MIYAZATO 

et al., 2011b). 

Da análise dos resultados constatou-se que o músculo masseter 

apresentou menor incidência de lesões, dentre os quatro músculos avaliados. 

Acredita-se, que o masseter sofra degeneração mínima nas suas fibras por 

possuírem menor diâmetro e também pela exposição a uma carga mecânica 

mais leve do que os músculos localizados nos membros torácicos e pélvicos 

(LEE et al., 2006). 

Na coloração azul de toluidina verificou-se aumento de mastócitos nos 

grupos distróficos em relação aos controles. Estudo em pacientes DMD com 

idade média de 41 meses demonstrou aumento no número de mastócitos em 

amostras musculares, pela técnica de imuno-histoquímica em relação ao grupo 

controle. Estes mastócitos foram imuno-positivos para o fator de crescimento 

neural (NGF), enquanto que outras células inflamatórias, tais como linfócitos e 

macrófagos foram negativos. O NGF é capaz de desencadear e favorecer 

processos de regeneração na fibra muscular (crescimento e diferenciação dos 

mioblastos) e tem papel importante na regulação da resposta inflamatória local. 

Além disso, o NGF induz por meio de ação nos receptores o recrutamento e 

degranulação dos mastócitos, sendo responsáveis também pela deposição de 

tecido conectivo nos músculos distróficos (TOTI et al., 2003). Estas premissas 

explicam a relação entre os níveis de NGF e o número de mastócitos. 

A análise quantitativa dos mastócitos mostrou que os músculos tríceps 

braquial, bíceps femoral, e masseter apresentaram o maior número médio de 

mastócitos na faixa etária de 2 meses de idade. Acredita-se que esses 

músculos sejam os mais severamente afetados pelo processo inflamatório nos 



29 

animais jovens (em torno de 2 meses) devido ao fato de no período pós natal 

esses músculos serem os mais ativos, responsáveis pela sucção e locomoção  

como descrito por Miyazato (2010), Nguyen et al. (2002) e Valentine e Cooper 

(1991). Pelo exposto, conclui-se que existe uma relação direta entre a 

degeneração muscular e o número de mastócitos.  

No presente estudo o diafragma apresentou diminuição no número 

médio de mastócitos e na porcentagem de deposição de tecido colagenoso, o 

que indicaria menor grau de lesão neste músculo. Estudo com onze músculos 

de cães GRMD de diferentes idades revelou que o diafragma foi o músculo 

menos acometido e apresentou maior capacidade regenerativa assim como o 

músculo masseter (MIYAZATO, 2010). Por outro lado, em humanos o 

diafragma é o principal músculo afetado na idade adulta, período que os 

pacientes apresentam deformidades estruturais resultante do confinamento em 

cadeira de rodas (LESSA et al., 2014b). Portanto, o grau de lesão do diafragma 

em humanos poderia estar relacionado com a idade numa relação direta. Em 

cães GRMD elas ocorrem em jovens e em humanos nos adultos DMD. 

Outro estudo, revelou que cães GRMD com 3 meses de idade 

apresentavam maior número de mastócitos no músculo fibular longo em 

relação aos cães GRMD de 6 meses de idade. Numa analogia, os cães GRMD 

com 6 meses corresponderiam a faixa etária de 11 anos nos pacientes com 

DMD período em que é necessário o uso de cadeira de rodas pelos acometidos 

(GOROSPE et al., 1994). O grau de lesão poderia estar relacionado com a 

atividade muscular, uma vez que pacientes em cadeira de rodas diminuem a 

movimentação dos membros, assim como a resposta inflamatória.  

A inter-relação dos mastócitos com a patogênese da fibrose em cães 

GRMD é pouco conhecida. No nosso estudo a fibrose foi a mais evidente em 

cães com 2 meses quando comparados aos de 8 meses de idade. Estudo com 

cães GRMD com 2, 15, 30, 60 dias e idade e adultos, observou aumento 

significativo da deposição de tecido fibroso nos músculos quadríceps e tibial 

anterior, porém não houve aumento da deposição com a idade. O processo 

distrófico, incluindo a substituição do músculo por tecido fibroso, foi claramente 

evidente a partir dos 15 dias de idade, bem antes da conclusão da maturação 

muscular, diferentemente do observado em pacientes DMD, onde a deposição 

de fibrose está correlacionada com a idade (COZZI et al., 2001). 



30 

Segundo Cozzi et al. (2001), a diminuição da fibrose com o avanço da 

idade pode ser devido ao esgotamento dos potenciais musculares, seguidos de 

repetidos ciclos de degeneração e regeneração. A extensão da proliferação do 

tecido conectivo também é variável em pacientes DMD apesar da fibrose 

geralmente aumentar com a progressão da doença, o que pode sugerir que o 

processo fibrótico difere entre pacientes e caninos distróficos.  

Miofibras deficientes de distrofina possuem instabilidade em sua 

membrana e a liberação de conteúdo citoplasmático para o meio extracelular 

poderia agir como estímulo para o recrutamento de mastócitos no endomísio 

(GOROSPE et al., 1994). Além disso, os mastócitos contêm vários mediadores 

químicos que atuam na fibrose como a histamina, a triptase e as citocinas que 

poderiam modular o comportamento dos fibroblastos ou ativar o bFGF 

(BARRY; GRUBER, 2003; DOUAIHER et al., 2014). No entanto, o bFGF está 

ligado à matriz extracelular na forma inativa sendo ativado e liberado pelos 

mediadores dos mastócitos. Acredita-se que a concentração ativa do  bFGF na 

corrente sanguínea seja mais significativa do que a concentração ligada à 

matriz extracelular (GOROSPE et al., 1994). 

Nossos achados confirmam a hipótese que os mastócitos estão em 

maior número no músculo deficiente de distrofina, participam no 

comprometimento das lesões histopatológicas e na deposição de tecido 

colagenoso nas fibras musculares. Os músculos bíceps femoral, tríceps 

braquial e masseter apresentaram maior número médio de mastócitos e menor 

intensidade das lesões. Pode-se assim inferir uma relação direta entre a 

intensidade da lesão e o número de mastócitos. O mesmo foi observado para 

deposição de tecido colagenoso. A idade de 2 meses apresentou o maior 

número médio de mastócitos e de fibrose nos grupos musculares e a idade de 

8 meses a menor resposta das variáveis estudadas.  

Fica assim evidente que o número de mastócitos em cães GRMD estaria 

relacionado com a intensidade das lesões e não com a idade. 

 

 

 

 

 



31 

7 CONCLUSÕES 

 

Embora a inter-relação entre os mastócitos e a patogênese da fibrose 

não estejam completamente elucidados, nossos resultados demonstraram 

relação direta entre as lesões histopatológicas e o número de mastócitos e de 

tecido colagenoso nos quatro grupos de musculatura esquelética de cães 

GRMD de dois a oito meses.  

  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



32 

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