PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA 

 

 

 

Natalia Maria Candido 
 

 

 

 

 

 

Estudo da ação de nanopartículas magnéticas de ferro no 

câncer oral 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 

São José Do Rio Preto - SP 
2013



 

 

 

 

Natalia Maria Candido 
 

 

 

 

Estudo da ação de nanopartículas magnéticas de ferro no 

câncer oral 

 

 

 

 

Dissertação apresentada para obtenção do título de 
Mestre em Genética, área de Biologia Celular e 
Molecular junto ao Programa de Pós-Graduação em 
Genética do Instituto de Biociências, Letras e Ciências 
Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de 
Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. 
 
 
Orientadora: Profª. Drª. Paula Rahal 
Co-orientadora: Drª. Marília de Freitas Calmon 

 

 

 

 

 

 
 

São José do Rio Preto - SP 
2013 

  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
Candido, Natalia Maria. 

Estudo da ação de nanopartículas magnéticas de ferro no câncer oral / 
Natalia Maria Candido. - São José do Rio Preto : [s.n.], 2013. 

112 f. : il. ; 30 cm. 
 
Orientadora: Paula Rahal 
Co-orientadora: Marília de Freitas Calmon 
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de 

Biociências, Letras e Ciências Exatas 
            

1. Câncer.  2. Boca - Câncer.  3. Carcinoma de células escamosas.    
4. Hamster sírio.  5. Nanopartículas. 6. Ferromagnetismo. I. Rahal, Paula.  
II. Calmon, Marília de Freitas.  III. Universidade Estadual Paulista, 
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas.  IV. Título 

 
                    CDU - 616.31-002-4 

 
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE  

Campus de São José do Rio Preto - UNESP 
 



 

 

 

Natalia Maria Candido 
 
 
 

Estudo da ação de nanopartículas magnéticas de ferro no câncer oral 

 

 

Dissertação apresentada para obtenção do título de 
Mestre em Genética, área de Biologia Celular e 
Molecular junto ao Programa de Pós-Graduação em 
Genética do Instituto de Biociências, Letras e Ciências 
Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de 
Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. 

 
 
 

BANCA EXAMINADORA 
 
 

Profª. Drª. Paula Rahal 
Professora Livre Docente 
Universidade Estadual Paulista “Júlio de 
Mesquita Filho” - UNESP/IBILCE 
 
 
Drª. Patrícia Simone Leite Vilamaior 
Assistente de Suporte Acadêmico e docente 
colaborador do Progama de Pós-Graduação em 
Biologia Animal da Universidade Estadual 
Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - 
UNESP/IBILCE 
 
 
Dr. Fernando Lucas Primo 
Pós-Doutorado em Nanotecnologia, Engenharia 
Tecidual e Fototerapia na Universidade de São 
Paulo – USP Ribeirão Preto e Pesquisador da 
empresa Nanophoton 

 
 
 

São José do Rio Preto, 21 de fevereiro de 2013. 
 



 

 

 

 
 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Estudos Genômicos, do Departamento 

de Biologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, UNESP de São 

José do Rio Preto, com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do 

Estado de São Paulo (FAPESP). 

  



 

 

 

 
 

 

 
 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

Dedico este trabalho aos meus pais, Amaury e Neucir, 

a quem agradeço pelo amor que incondicionalmente 

dedicam a mim, por todos os ensinamentos que 

proporcionaram meu crescimento pessoal e por todo o 

apoio às minhas decisões e à minha vida acadêmica. 



 

 

 

AGRADECIMENTOS 

 

 

À minha orientadora, Profª. Drª. Paula Rahal, pela oportunidade de realizar este trabalho, pela 

amizade, por todos os ensinamentos, por confiar na minha capacidade e, desta forma, fazer 

com que eu buscasse pelo melhor em mim. Algumas palavras aqui escritas não poderiam 

estimar a gratidão que sinto. Você realmente é um exemplo a ser seguido! 

"A melhor coisa que você pode fazer por uma pessoa é inspirá-la." 

 

À minha co-orientadora, Drª. Marília de Freitas Calmon, pelas risadas, por ter acreditado no 

meu trabalho desde o início e por todo esforço para que se fizesse possível a implantação de 

uma nova linha de pesquisa dentro do laboratório. Muito obrigada por me tratar de igual para 

igual, mesmo sabendo que tenho um longo caminho a percorrer até chegar próxima ao 

conhecimento que você possui. 

“Se você tratar as pessoas como irmãs, elas respondem de acordo.” 

 

Aos meus amigos do Laboratório de Estudos Genômicos, Ana Beatriz, André, Bruna, Bruno, 

Carol Bonfim, Carol Jardim, Cintia, Guilherme, Henrique, Jaqueline, Lucas, Mariana, Marina, 

Miyuki, Paola, Renata e Tasso pela companhia, por todos os auxílios prestados e por se 

empenharem em fazer do ambiente de trabalho um lugar confortável e repleto de momentos 

de diversão. Sem dúvida nenhuma, o sucesso de nossos projetos deve-se à colaboração de 

todos do laboratório, que pensam e agem como uma verdadeira equipe. 

"Seja a mudança que você deseja ver no mundo." 

 

À secretária do Laboratório, Lenira Bueno, pela eficiência e pelo tempo que sempre dedica à 

resolução de nossos problemas, sempre disposta a nos ajudar. Muito obrigada! 

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água do mar. Mas o 
mar seria menor se lhe faltasse uma gota.” 

 

Ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga (Sebaca) por ser extremamente atencioso e 

minucioso, principalmente quando se trata de auxiliar quem lhe pede. Obrigada por ter aberto 

as portas de seu laboratório, por ter me dado ótimos conselhos e por passar adiante sua 

maneira única de enxergar grandes possibilidades. 

“A mente que se abre a uma nova ideia jamais volta ao seu tamanho original." 

 



 

 

 

 

Ao Luiz Roberto Falleiros Jr., técnico do Laboratório de Microscopia e Microanálise, por 

todo auxílio prestado – que não foi pouco – e pela incrível capacidade de nos fazer rir de tudo. 

Muito obrigada por não me deixar abalar quando as coisas não saíam como o esperado e por 

sempre procurar uma alternativa para os obstáculos ao longo da trajetória. 

“Não importa quanta seriedade a vida exija de você, cada um de nós precisa de um amigo 

brincalhão para se divertir junto” 

 

Gostaria de deixar registrado o meu muito obrigada àqueles do Laboratório de Microscopia e 

Microanálise que não mediram esforços para que meu trabalho fosse finalizado e que aliaram 

isso à ótima convivência diária. Muitos que nem me conheciam, mas que realmente me 

mostraram o significado de “fazer o bem sem olhar a quem”. Agradeço, em especial, Ana 

Paula, Bianca, Carol Christante, Carol Frandsen, Carol Negrin, Cássia, Cintia, Diego, Elô, 

Fabi, Maê, Manoel, Mari Marcielo, Mari Pulegio, Mari Zanatelli, Marina, Ricardinho, 

Silvana, Thiago, Tião e Vanessinha.  

A mesma gratidão se aplica a todos do Laboratório de Imunomorfologia, principalmente a 

Analice, Ayla, Kallyne, Laila, Nathy e Rubens. A vida uniu as pessoas certas no momento 

certo. Sinto-me em casa na presença de vocês. 

“As pessoas entram em nossa vida por acaso, mas não é por acaso que elas permanecem.” 

 

À Profª. Drª. Zulmira Guerrero Marques Lacava por ter me acolhido tão prontamente. Sinto 

como se já nos conhecêssemos há tempos. Sua simpatia e disposição em ajudar o próximo são 

incomparáveis. Tenho muita sorte de tê-la encontrado durante o percurso e sei que somente 

bons frutos surgirão de nossa parceria. 

“Seja gentil quando for possível...Sempre é possível.” 

 

À Profª. Drª. Emília Celma de Oliveira Lima, por ter gentilmente cedido a amostra de fluido 

ferromagnético e por sempre ser tão solícita. 

"No meio da dificuldade encontra-se a oportunidade.” 

 

À Drª. Jane Lopes Bonilha, pela prontidão em analisar todas as amostras necessárias e sempre 

me receber com um sorriso em seu laboratório. 

“Supor é bom, descobrir é melhor.” 

 

 



 

 

 

A todos os professores do curso de Ciências Biológicas pela formação e pelos ensinamentos 

que, com certeza, colaboraram muito para a elaboração deste trabalho e para meu crescimento 

pessoal. 

“Professores há milhares. Mas professor como profissão, não é algo que se define por 

dentro, por amor. Educador, ao contrário, não é profissão, é vocação. E toda vocação nasce 

de um grande amor, de uma grande esperança.” 

 

Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e aos seus docentes, por estimularem nossa 

busca pelo conhecimento e serem exemplos admiráveis de profissionais. 

“Ninguém educa ninguém. Ninguém se educa a si mesmo. Os homens se educam entre si, 

mediatizados pelo mundo." 

 

Aos membros da pré-banca e banca examinadora, Dr. Fernando Lucas Primo, Dr. José 

Geraldo Nery e Drª. Patrícia Simone Leite Vilamaior, pela disponibilidade em participar do 

enriquecimento e finalização deste trabalho. 

“Não devemos permitir que alguém saia da nossa presença sem se sentir melhor consigo 

mesmo.” 

 

A todos os amigos da faculdade que, de alguma forma, fizeram parte desta etapa da minha 

vida. Obrigada pela ajuda sempre imediata e por todo o carinho e companheirismo. Um 

agradecimento especial a Mari Franco, Mari Sabbag, Mari Zanatelli, Pablo, Val, Vanessa e 

Yuri pelo grande afeto que se faz presente mesmo com a distância. Obrigada pela amizade tão 

valiosa que descobri em vocês. Significam muito para mim. 

“O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na intensidade com que 

acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas 

incomparáveis.” 

 

Às minhas companheiras do “apê 24”, Ana e Bia, que compreendem a pressão e os dias de 

cansaço que se tornam presentes algumas vezes durante a pós-graduação. Obrigada por 

tornarem o convívio tão fácil e por passarem comigo o período de maior ganho em 

conhecimento e experiências que tive. Foram meu lar em Rio Preto. 

“A única amizade que vale é a que nasceu sem razão.” 

 

 



 

 

 

Aos meus amigos, Amanda, Arthur, Bruno, Caio, Camila, Cintia, Fábio, Fer, Gabo, Léo, 

Lívia, Mário, Mayara, Naty, Nayara, Pinceta, Renato e Thá. Nada resume melhor a 

importância de vocês do que dizer que são a família que escolhi. Sempre presente, mesmo 

com a distância. A alegria que a companhia de vocês me traz é indiscutível e inigualável. 

Conservar os velhos amigos é realmente melhor do que fazer novos. Tenho a certeza de que é 

amizade inabalável e que cada detalhe que nos une se torna mais forte a cada dia. 

“A gente não faz amigos, reconhece-os.” 

 

Mais uma vez e para sempre serei grata aos meus pais, Amaury e Neucir, por terem me 

ensinado que dar sempre o melhor de si vale a pena. Vocês continuam sendo os principais 

responsáveis pelas minhas conquistas e pelas minhas escolhas acertadas. Espero que um dia 

se orgulhem tanto de serem meus pais quanto me orgulho de ser sua filha. É imensurável o 

tamanho do meu amor por vocês! 

“Há pais que gostam de dar presentes. Há pais que gostam de estar presentes. 

Há pais que investem para os filhos. Há pais que investem nos filhos. 

Há pais que deixam de herança valores em reais. Há pais que deixam de herança valores 

reais.” 

 

Às minhas irmãs, Fer e Bru, pela torcida, pelas palavras de incentivo e pelo carinho que 

sempre recebi. Cada uma com seu jeito especial, incondicionalmente ao meu lado. Estarão 

eternamente em meus melhores pensamentos. Vocês são meu passado, presente e futuro. Amo 

vocês. 

“O que é um irmão? Uma única alma habitando dois corpos.” 

 

À minha avó Yolanda, porque sem ela meu mundo ficaria tão vazio e cinzento. Sempre 

acreditando em mim, independente dos meus deslizes. Meu porto seguro. A melhor pessoa 

que conheço e de uma bondade infinita. Sou extremamente abençoada por ser sua neta. Você 

é incomparável e eu te amo muito. Você nem imagina o quanto! 

 “Não acrescente dias à sua vida, mas vida aos seus dias.” 

 

Aos meus tios, “Dica” e Rita, pelo incentivo e por estarem sempre presentes em minha vida. 

Tenho um grande respeito e amor por vocês. 

“Só tios podem abraçar como pais, guardar segredos como irmãos, dar conselhos como 

amigos e permitir travessuras como avós.” 

 



 

 

 

Ao Evandro, meu sempre amigo, o melhor de todos! O amor da minha vida e a pessoa com 

quem mais gosto de conversar. Esta é mais uma etapa que completo ao seu lado. Obrigada por 

me fazer acreditar que você é a pessoa certa que estará junto a mim nos momentos incertos. 

Você me faz feliz, muitas vezes sem motivo óbvio. Em minha opinião, esse tipo de felicidade 

é a forma mais autêntica de todas e a que você, e só você, me proporciona! Te amo demais! 

"O amor só é lindo quando encontramos alguém que nos transforma no melhor que podemos 

ser." 

 

À FAPESP, pelo suporte financeiro concedido nas formas de bolsa de Mestrado e reserva 

técnica (processo nº 2010/14001-0). 

“Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas como uma oportunidade invejável 

para aprender a conhecer a influência libertadora e a beleza do reino do espírito, para seu 

próprio prazer pessoal e para proveito da comunidade à qual seu futuro trabalho pertencer.” 

 

E, por fim, a Deus, por iluminar meus passos e pelas graças recebidas diariamente. 

“Se eu creio em Deus e Deus existe, eu ganhei tudo. 

Se eu creio em Deus e Deus não existe, eu não perdi nada. 

Se eu não creio em Deus e Deus não existe, eu não ganhei nada. 

Se eu não creio em Deus e Deus existe, então eu perdi tudo.” 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Conta certa lenda, que estavam duas crianças patinando num lago congelado. 

Era uma tarde nublada e fria, e as crianças brincavam despreocupadas. 

De repente, o gelo quebrou e uma delas caiu, ficando presa na fenda que se formou. 

A outra, vendo seu amiguinho preso, e se congelando, tirou um dos patins e começou a 

golpear o gelo com todas as suas forças, conseguindo por fim, quebrá-lo e libertar o amigo. 

Quando os bombeiros chegaram e viram o que havia acontecido, perguntaram ao menino: 

- Como você conseguiu fazer isso? É impossível que tenha conseguido quebrar o gelo, sendo 

tão pequeno e com mãos tão frágeis! 

Nesse instante, um ancião que passava pelo local, comentou: 

- Eu sei como ele conseguiu. 

Todos perguntaram: 

- Pode nos dizer como? 

- É simples - respondeu o velho. 

- Não havia ninguém ao seu redor para lhe dizer que não seria capaz.” 

 

Albert Einstein 



 

 

 

RESUMO 

 

 

O carcinoma oral epidermóide é a neoplasia mais frequente da cavidade bucal, representando, 

aproximadamente, 90% dos cânceres orais. A maioria das pessoas com câncer bucal realiza 

diagnóstico em estádios avançados quando o prognóstico é ruim e, consequentemente, a 

terapia é incerta com possibilidades de cura reduzidas. Sendo assim, o tratamento deste câncer 

envolve a utilização de recursos terapêuticos complexos, com resultados estéticos e 

fisiológicos pouco promissores. Portanto, outras terapias são almejadas a fim de reverter o 

quadro insatisfatório de qualidade de vida, amenizando os efeitos colaterais. Para isso, a 

nanoterapia aplicada ao tratamento do câncer tem-se desenvolvido rapidamente e 

nanopartículas, como as de óxidos de ferro, vem demonstrando vantagens sobre outros 

carreadores, sendo o tratamento do câncer por meio de hipertermia uma aplicação bastante 

visada. Portanto, o objetivo do trabalho foi investigar a citotoxicidade das nanopartículas 

magnéticas de ferro revestidas por polifosfato em linhagem celular de câncer de assoalho de 

boca (UM-SCC14A) e sua ação em carcinoma oral in vivo. As células foram incubadas com 

nanopartículas em diferentes concentrações (0,35; 0,7 e 1,4x1015 partículas/mL) e, em 

seguida, foram realizadas técnicas de microscopia eletrônica de transmissão, microsopia de 

luz, microscopia de fluorescência e ensaio de viabilidade celular. Os diferentes ensaios 

mostraram que apenas a incubação com 1,4 x1015 partículas desencadeou processo apoptótico 

significativo, refletindo alterações morfológicas e menor viabilidade celular. Sendo assim, a 

concentração de 0,7x1015 partículas foi escolhida para os experimentos in vivo, já que não 

demonstrou caráter tóxico expressivo. Após os experimentos in vitro, trinta hamsters sírios 

foram divididos igualmente em cinco grupos, sendo um grupo controle normal no qual não foi 

induzido tumor. No restante dos animais foi feita a indução de câncer oral por meio da 

aplicação do carcinógeno DMBA na bochecha direita dos hamsters, resultando no 

desenvolvimento de carcinoma espinocelular oral. Os demais grupos com tumor foram 

tratados com nanopartículas. Dentre estes animais, um grupo foi tratado exclusivamente desta 

forma e outros dois grupos foram separados para combinar a terapia de nanopartículas à 

exposição a um campo magnético capaz de gerar hipertermia. Um grupo foi eutanasiado um 

dia pós-tratamento e outro grupo após sete dias. Os tecidos da cavidade oral foram corados 

com Hematoxilina-Eosina e Azul da Prússia, bem como seus corações, pulmões, fígados, rins 

e baços. Foram feitas imunocitoquímicas do tecido oral para os anticorpos PCNA e caspase-3 

ativada, marcadores de proliferação celular e apoptose, respectivamente; e o sangue dos 



 

 

 

animais foi retirado, para análise dos leucogramas. O grupo não tratado e os animais tratados 

somente com nanopartículas apresentaram carcinoma espinocelular oral in situ com diversas 

mitoses atípicas e presença de infiltrado mononuclear. Entretanto, os animais tratados com 

nanopartículas associadas à hipertermia como terapia demonstraram regressão do câncer, 

atestada pelas análises histopatológicas, imunocitoquímicas e pela quantidade normalizada de 

leucócitos. Dessa forma, a hipertermia mediada por tais nanopartículas é bastante 

encorajadora, sendo necessários mais estudos que visem à melhoria das abordagens 

terapêuticas atuais e ao entendimento dos mecanismos sistêmicos dessas nanopartículas, 

aperfeiçoando as técnicas disponíveis, especialmente em cânceres que carecem maior atenção, 

como o carcinoma oral. 

 

Palavras-chave: Carcinoma oral, UM-SCC14A, Hamster sírio, Nanopartículas magnéticas de 

ferro revestidas por polifosfato, Magneto-hipertemia. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

ABSTRACT 

 

 

Oral squamous cell carcinoma is the most common neoplasm of the oral cavity, representing, 

approximately, 90% of oral cancers. Most people affected by oral cancer performs the 

diagnosis in advanced stages when the prognosis is poor and, therefore, therapy is uncertain 

with reduced chances of healing. Thus, treatment of this cancer involves the use of complex 

therapeutic resources, with hardly promising aesthetic and physiological results. Therefore, 

other therapies are desired to reverse the unsatisfactory quality of life, minimizing side 

effects. For this, nanotherapy applied to the treatment of cancer has developed rapidly and 

nanoparticles, such as iron oxides, have shown advantages over other carriers, being cancer 

treatment by hyperthermia quite an application newsworthy. So, the aim of this study was to 

investigate the cytotoxicity of iron magnetic nanoparticles coated with polyphosphate in 

cancer cell line from the floor of mouth (UM-SCC14A) and its action on oral carcinoma in 

vivo. Cells were incubated with nanoparticles at different concentrations (0.35, 0.7 and 

1.4x1015 particles/mL) and, then, were performed transmission electron microscopy, light 

microscopy, fluorescence microscopy and viability assay. Different tests have shown that only 

incubation with 1.4x1015 particles triggered significative apoptotic process reflecting 

morphological changes and reduced cell viability. Thereby, the concentration of 0.7x1015 

particles has been chosen for the experiments in vivo, as demonstrated no expressive toxic 

character. After the in vitro experiments, thirty Syrian hamsters were divided into five groups, 

with a normal control group in which no tumor was induced. In the remaining animals was 

induced oral cancer by applying the carcinogen DMBA on the hamsters’ right cheek, resulting 

in the development of oral squamous cell carcinoma. The other groups with tumor were 

treated with nanoparticles. Among these animals, one group was treated solely in this way and 

two other groups were separated to combine therapy nanoparticles exposure to a magnetic 

field capable of generate hyperthermia. One group was euthanized one day post-treatment and 

another group after seven days. The tissues of the oral cavity were stained with Hematoxylin-

Eosin and Prussian blue, as well as their hearts, lungs, livers, kidneys and spleens. Were 

performed immunocytochemistry for PCNA and activated caspase-3 antibodies, markers of 

cell proliferation and apoptosis, respectively; and the animals' blood was withdrawn and 

analyzed their white cell counts. The untreated group and the animals treated with 

nanoparticles showed oral squamous cell carcinoma in situ with several atypical mitosis and 

presence of mononuclear cell infiltrates. However, animals treated with nanoparticles 



 

 

 

associated with hyperthermia demonstrated cancer regression, confirmed by histopathologic 

and immunocytochemistry analysis and the normalized amount of total leukocytes. As a 

result, this nanoparticle-mediated hyperthermia is quite encouraging, however more studies 

are needed in order to advance the current therapeutic approaches and understand the systemic 

mechanisms of these nanoparticles, improving the available methodologies, especially in 

cancers that reflect the greater need of attention, as the oral carcinoma. 

 

Keywords: Oral squamous cell carcinoma, UM-SCC14A, Syrian hamster, Iron magnetic 

nanoparticles coated with polyphosphate, Magnetohyperthermia. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

LISTA DE ILUSTRAÇÕES 

 

 

Figura 1. Hamsters sírios representando os grupos experimentais do estudo ........................ 37 

Figura 2. Campo magnético de frequência alternada e metodologia utilizada ...................... 37 

Figura 3. Caracterização das nanopartículas de maguemita revestidas por polifosfato 

provenientes do fluido ferromagnético ................................................................................... 43 

Figura 4. Análise morfológica da linhagem celular UM-SCC14A ........................................ 46 

Figura 5. Análise ultraestrutural da linhagem celular UM-SCC14A ..................................... 48 

Figura 6. Ensaio de apoptose da linhagem celular UM-SCC14A ......................................... 50 

Figura 7. Percentual de viabilidade celular na linhagem UM-SCC14A avaliada por ensaio 

MTT ........................................................................................................................................ 52 

Figura 8. Análise biométrica dos hamsters sírios .................................................................. 53 

Figura 9. Histopatologia dos cortes dos tecidos da cavidade oral direita dos hamsters ........ 56 

Figura 10. Fotomicrografias de tecido da cavidade oral esquerda dos hamsters ................... 58 

Figura 11. Fotomicrografias do fígado dos hamsters ............................................................. 59 

Figura 12. Fotomicrografias do coração dos hamsters .......................................................... 60 

Figura 13. Fotomicrografias do pulmão dos hamsters ........................................................... 61 

Figura 14. Fotomicrografias dos rins dos hamsters ............................................................... 62 

Figura 15. Fotomicrografias do baço dos hamsters ............................................................... 63 

Figura 16. Análise morfométrica do epitélio da cavidade oral direita dos hamsters ............. 64 

Figura 17. Análise morfométrica da queratina da cavidade oral direita dos hamsters........... 65 

Figura 18. Imunocitoquímica para marcação de proliferação celular (PCNA) ..................... 67 

Figura 19. Imunocitoquímica para marcação de apoptose (caspase-3 ativada) ..................... 69 

Figura 20. Contagem de leucócitos totais do sangue dos hamsters ....................................... 71 

Figura 21. Contagem de linfócitos do sangue dos hamsters .................................................. 72 

Figura 22. Contagem de neutrófilos do sangue dos hamsters ................................................ 73 

Figura 23. Contagem de eosinófilos do sangue dos hamsters ............................................... 74 

Figura 24. Contagem de monócitos do sangue dos hamsters ................................................ 75 

 

 

 

 

 



 

 

 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 

 

 

cm: Centímetro 

cm2: Centímetro quadrado 

cm3: Centímetro cúbico 

CO2: Dióxido de carbono 

DAB: Diaminobenzidina 

DMBA: 7,12-dimetilbenz(a)antraceno 

DMSO: Dimetilsulfóxido 

et al.: e outros 

Fe: Ferro 

Fe3O4: Magnetita  

FFM: Fluido ferromagnético à base de nanopartículas magnéticas de maguemita recobertas 

com polifostato de sódio 

HCl: Ácido clorídrico 

HE: Hematoxilina-eosina 

HPV: Human papillomavirus (papilomavírus humano) 

INCA: Instituto Nacional do Câncer 

MCL: Magnetic cationic liposomes (lipossomos catiônicos magnéticos) 

MEM: Meio essencial mínimo 

MET: Microscopia eletrônica de transmissão 

mL: Mililitro 

mm3: Milímetro cúbico 

mS: Milissegundo 

MTT: 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5difeniltetrazolium bromídeo 

mV: Milivolt 

nm: Nanômetro 

PBS: Phosphate buffered saline (tampão salino de fosfato) 

PCNA: Proliferating cell nuclear antigen (antígeno nuclear de proliferação celular) 

PdI: Polydispersity index (índice de polidispersão) 

pH: Potencial de hidrogênio 

rpm: Rotações por minuto 

s: Segundo 



 

 

 

SFB: Soro fetal bovino 

U: Unidades 

UM-SCC14A: Linhagem celular de câncer de assoalho de boca (carcinoma escamoso oral) 

UV: Ultravioleta 

V: Volt 

γ-Fe2O3: Maguemita 

µcm: Microcentímetro 

µg: Micrograma 

µL: Microlitro 

ºC: Grau Celsius 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

SUMÁRIO 

 

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 20 

1.1 Câncer oral ................................................................................................................. 20                                                                                                     

1.2 Experimentação in vitro ligada ao estudo do câncer oral .......................................... 21 

1.3 Modelo animal para tratamento de câncer oral .......................................................... 23 

1.4 Nanobiotecnologia e tratamento do câncer ................................................................ 24 

1.5 Tratamento do câncer envolvendo hipertermia mediada por nanopartículas 

magnéticas ........................................................................................................................ 26 

2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 28 

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 29 

3.1 Caracterização das nanopartículas magnéticas de ferro ............................................. 29 

3.2 Linhagem celular de câncer UM-SCC14A ................................................................ 30 

3.3 Incubação das nanopartículas na linhagem celular de câncer UM-SCC14A ............. 31 

3.4 Métodos de avaliação da internalização e citotoxicidade das nanopartículas 

magnéticas de ferro in vitro ............................................................................................. 32 

3.4.1 Análise da morfologia da linhagem celular UM-SCC14A pós-incubação com o 

FFM ............................................................................................................................. 32 

3.4.2 Análise da ultraestrutura da linhagem UM-SCC14A e verificação da 

internalização das nanopartículas por microscopia eletrônica de transmissão ........... 33  

3.4.3 Ensaio de apoptose ............................................................................................. 34 

3.4.4 Ensaio MTT ....................................................................................................... 34 

3.5 Experimentação in vivo ................................................................................................ 35 

 3.5.1 Animais .............................................................................................................. 35 

3.5.2 Delineamento experimental e tratamento in vivo combinando nanopartículas à 

hipertermia .................................................................................................................. 36 

3.5.3 Processamento histológico ................................................................................. 38 

3.5.4 Avaliação dos cortes pela coloração Hematoxilina-eosina e por sua combinação 

ao Azul da Prússia ....................................................................................................... 38 

 3.5.5 Análise morfométrica populacional ................................................................... 39 

3.5.6 Imunocitoquímica para avaliação da proliferação celular (PCNA) ................... 39 

3.5.7 Imunocitoquímica para avaliação da apoptose induzida pelo tratamento (caspase-

3 ativada) ..................................................................................................................... 40 

3.6 Análise da série branca sanguínea ............................................................................. 41 



 

 

 

3.6.1 Avaliação da contagem global de leucócitos ..................................................... 41 

3.6.2 Avaliação da contagem diferencial de leucócitos .............................................. 41 

3.7 Análises estatísticas ................................................................................................... 42 

4. RESULTADOS ................................................................................................................. 42 

4.1 Caracterização das nanopartículas magnéticas de ferro in vitro ................................ 42 

4.2 Métodos de avaliação da internalização e citotoxicidade das nanopartículas ........... 44 

4.2.1 Análise da morfologia da linhagem celular UM-SCC14A pós-incubação com o 

FFM ............................................................................................................................. 44 

4.2.2 Análise da ultraestrutura da linhagem UM-SCC14A e verificação da 

internalização das nanopartículas por microscopia eletrônica de transmissão ........... 46 

4.2.3 Ensaio de apoptose ............................................................................................. 49  

4.2.4 Ensaio MTT ........................................................................................................ 51 

4.3 Experimentação in vivo ................................................................................................ 52 

4.3.1 Avaliação biométrica .......................................................................................... 52 

4.3.2 Avaliação dos cortes de tecido oral pela coloração Hematoxilina-eosina ......... 53 

4.3.3 Avaliação dos demais tecidos pela coloração Hematoxilina-eosina e por sua 

combinação ao Azul da Prússia ................................................................................... 57 

4.3.4 Análise morfométrica populacional ................................................................... 63 

4.3.5 Imunocitoquímica para avaliação da proliferação celular (PCNA) ................... 65 

4.3.6 Imunocitoquímica para avaliação da apoptose induzida pelo tratamento (caspase-

3 ativada) ..................................................................................................................... 68 

4.4 Análise da série branca sanguínea ............................................................................. 70 

4.4.1 Avaliação da contagem global de leucócitos ..................................................... 70 

4.4.2 Avaliação da contagem diferencial de leucócitos .............................................. 71 

5. DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 75 

6. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 87 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 89 

ANEXO: Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais ......................................... 112 

 

 

 



20 

 

 

1. INTRODUÇÃO 

1.1 Câncer oral 

Os carcinomas de cabeça e pescoço correspondem, mundialmente, a 10% dos tumores 

malignos, ocupando o sexto lugar entre os mais prevalentes (TOLEDO et al., 2010). Cerca de 

40% destes cânceres ocorrem na cavidade oral, sendo que 90% destes últimos são 

epidermóides (também denominados escamosos) (MARCU; YEOH, 2009; GRIMM et al., 

2012) e a porcentagem restante refere-se a sarcomas, melanomas e tumores malignos de 

glândulas salivares (VASCONCELOS, 2006).  

Apresenta uma distribuição variável nas diferentes regiões do mundo (GUERRA; 

MOURA-GALLO; MENDONÇA, 2005; KANETO, 2007), sendo mais recorrente em países 

desenvolvidos (MARUR; FORASTIERE, 2008; RUBACK et al., 2012). No Brasil, em 

estudos conduzidos a fim de investigar a ocorrência de câncer de boca na população, 

verificou-se que a maior taxa de incidência encontrava-se no estado de São Paulo (WUNSCH 

FILHO, 2002; ALVARENGA et al., 2008).  

Para o ano de 2012, foram estimados dez mil novos casos deste tipo tumoral em 

homens e aproximadamente quatro mil novas ocorrências para mulheres (INCA, 2012 a). A 

maioria das pessoas acometidas pelo câncer oral tem idade superior a 45 anos, porém, ao 

longo da última década, houve um aumento significativo deste câncer entre indivíduos mais 

jovens, que está diretamente relacionado à crescente realidade de fumantes e alcoólatras numa 

faixa etária precoce (GILLISON et al., 2008; HENNESSEY; WESTRA; CALIFANO, 2009). 

Dessa forma, os dois principais fatores de risco relacionados ao carcinoma oral são o 

tabagismo e o consumo excessivo de bebidas alcoólicas (BROTHWELL; ARMSTRONG, 

2004; CHIN et al., 2004; WARNAKULASURIYA; SUTHERLAND; SCULLY, 2005; 

BUNNELL et al., 2010), existindo um efeito sinérgico entre esses fatores etiológicos e uma 

relação diretamente proporcional da quantidade e tempo de exposição com o grau patológico 

(KERR; CRUZ, 2002; FIOCRUZ, 2011; IBCC, 2012).  

Entretanto, outros fatores também têm sido associados ao desenvolvimento do câncer 

oral, incluindo agentes biológicos, como o papilomavírus humano (HPV), fator que vem 

aumentando sua significância exponencialmente (VIDAL et al., 2006; THOMISON; 

THOMAS; SHROYER, 2008; CHUANG et al., 2012; INCA, 2012 b), além da higiene oral 

precária, dieta pobre em vegetais e frutas, história pregressa de neoplasia do trato digestivo e 

exposição excessiva à luz ultravioleta (PAVIA et al., 2006; MARTINS et al., 2008; PETERS 

et al., 2008; REZENDE et al., 2008; PRADO; PASSARELLI, 2009). 



21 

 

 

A maioria dos casos é diagnosticada em estágios clínicos avançados, quando o 

prognóstico é ruim e, consequentemente, a terapia é mais complexa e as possibilidades de 

cura são reduzidas (MACPHERSON et al., 2003; LEÃO et al., 2005; ZYGOGIANNI et al., 

2011), sendo que o carcinoma oral possui uma das mais baixas taxas de sobrevida em cinco 

anos dentre os principais tipos de câncer, incluindo pele, mama, próstata e colo de útero 

(RAJENDRAN; SIVAPATHASUNDHARAM, 2006; BYAKODI et al., 2012). O diagnóstico 

precoce é crucial para a melhoria das taxas de sobrevida, possibilitando uma abordagem 

terapêutica conservadora, de recuperação mais rápida e prognóstico favorável. No entanto, 

esse caráter preventivo não é verificado na grande maioria dos casos (KUJAN et al., 2006; 

MAURICIO et al., 2009; DEVADIGA; PRASAD, 2010; SOUZA et al., 2012). 

Portanto, o tratamento do câncer oral envolve a utilização de recursos terapêuticos 

complexos e de alto custo, com resultados estéticos pouco satisfatórios que implicam, 

consequentemente, no comprometimento social do paciente. Esse fato é devido às ressecções 

cirúrgicas combinadas aos tratamentos radioterápicos e quimioterápicos que originam 

mutilações na região de cabeça e pescoço (CANTO; HOROWITZ; CHILD, 2002; ARGIRIS 

et al., 2008; GANLY et al., 2012). Sendo assim, outras terapias são almejadas a fim de 

reverter o quadro insatisfatório de qualidade de vida, amenizando os efeitos colaterais e 

aperfeiçoando as técnicas já existentes (FALCÃO et al., 2010). 

 

1.2 Experimentação in vitro ligada ao estudo do câncer oral 

De acordo com o exposto acima, estudos que visem averiguar o padrão envolvido na 

carcinogênese deste tipo tumoral por meio de avaliações in vitro e in vivo são importantes 

para o desenvolvimento de estratégias eficientes de combate a esta doença. Devido à grande 

quantidade de estudos toxicológicos que a situação atual exige, o novo quadro legal apóia o 

desenvolvimento de métodos alternativos à experimentação animal, segundo a filosofia dos 3 

R’s (reduzir, reutilizar e reciclar). Esta circunstância representa uma oportunidade 

excepcional para a melhoria e a concepção de novas estratégias metodológicas para a 

avaliação toxicológica de nanocompostos, livres das variações sistêmicas que ocorrem dentro 

do organismo durante a homeostase normal, com destaque para estudos envolvendo o câncer 

(HENGSTELER et al., 2006; REINA, 2006). 

Neste contexto, as culturas de células revelam-se um interessante campo, considerando 

o amplo espectro de metodologias disponíveis para avaliação toxicológica. Supondo que os 

efeitos tóxicos vistos em um organismo inteiro sejam devidos a falhas prévias das funções 

celulares básicas (EISENBRAND et al., 2002), estudos da citotoxicidade oferecem um bom 



22 

 

 

consenso entre o uso de métodos alternativos e a elucidação de mecanismos de ação tóxica, 

mesmo que estas abordagens sejam reducionistas da toxicidade aguda in vivo (FREIRE et al. 

2009). 

Dessa forma, as células de carcinoma escamoso oral, UM-SCC14A, que embora sejam 

um clássico exemplo de linhagem celular imortalizada decorrente de atividade alterada da 

telomerase, sendo utilizada em diferentes tipos de experimentos que investigam a biologia do 

câncer oral (LOTEMPIO et al., 2005; CALMON et al., 2009; COHEN et al., 2009; 

SUBRAMANYA et al., 2010), nunca foi avaliada na presença de nanopartículas semelhantes 

às sintetizadas e analisadas pelo presente estudo. 

Tais células crescem e se dividem de modo indefinido in vitro enquanto as condições 

ideais de manutenção são sustentadas. Além disso, tratam-se de células aderentes que 

perderam o caráter de inibição por contato, tendo a capacidade característica de 

desenvolvimento de células oncogênicas, acumulando-se em densidades superiores à da 

monocamada normal (CREE, 2011). 

Portanto, essas características das linhagens celulares que mimetizam fielmente um 

ambiente comprometido por processo carcinogênico e que remetem às suas células tumorais 

de origem são as melhores opções para estudos iniciais (LANGDON, 2003) como, por 

exemplo, os que visem à verificação de caráter citotóxico de nanocompostos. Assim, as 

células que hoje são estudadas in vitro, servem de parâmetro e comparação ao tecido do qual 

foram retiradas, facilitando a visualização da resposta aos tratamentos aos quais são 

submetidas e tornando-se de grande valia já que esses testes são mais simples, rápidos, 

rentáveis e não levantam problemas éticos quando comparados a estudos in vivo 

(MAHMOUDI et al., 2010 a; 2010 b). 

Não obstante, é de nítida imperatividade e não pode ser descartada a enorme 

importância da experimentação de novas abordagens terapêuticas em modelos animais por 

meio de testes prévios aos testes pré-clínicos e clínicos em humanos (HOGENESCH; 

NIKITIN, 2012). A fim de obter resultados confiáveis sobre a citotoxicidade das 

nanopartículas magnéticas de ferro revestidas por polifosfato de sódio, estudos sobre seus 

efeitos devem ser realizados em diferentes modelos experimentais, tanto in vitro quanto in 

vivo. 

 

 

 

 



23 

 

 

1.3 Modelo animal para tratamento de câncer oral 

 Não existe uma única linhagem de células ou modelo in vivo de câncer que fielmente 

prediz a eficácia de fármacos anticancerígenos em ensaios clínicos humanos. Abordagens de 

cultura de células oferecem a vantagem de que as linhagens podem ser derivadas de origem 

humana ou fragmentos de tecido de tumores primários, mas não é capaz de imitar a 

complexidade da interação mútua entre o crescimento do tumor e o microambiente co-

evoluindo (BARABASI; GULBAHCE; LOSCALZO, 2011). 

Já um modelo animal experimental ideal de câncer humano apresenta mecanismos 

moleculares comuns ao tipo tumoral humano, tem patologia semelhante à neoplasia de 

interesse e mostra a progressão cancerosa, incluindo suas alterações metastáticas e respostas 

terapêuticas e imunes que se assemelham às dos pacientes (FRESE; TUVESON, 2007). 

Sendo assim, como alternativa às limitações significativas do estudo do câncer por meio de 

xenoenxertos, estão as linhagens de hamsters nas quais os cânceres são desenvolvidos 

espontaneamente (HARDISTY, 1985) ou por meio de indução, que pode ser decorrente de 

agentes químicos (BALMAIN; PRAGNELL, 1983), radiação (VAN KRANEN, 1995), vírus 

patogênicos (CARDIFF; KENNEY, 2007), outros microorganismos (ENNO et al., 1995) ou 

abordagens envolvendo manipulações genéticas (JONKERS; BERNS, 2002). 

Um dos exemplos clássicos de carcinogênese química é a indução de tumores orais em 

hamsters sírios (Mesocriterus auratus) por um protocolo de tratamento com aplicação tópica 

de 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (DMBA) (HSUE; CHEN; LIN, 2008; CHEON; ORSULIC, 

2011). Neste caso, os tumores originados na mucosa progridem para carcinomas in situ de 

células escamosas (WANG et al., 2008). Apesar de variações anatômicas e histológicas entre 

a mucosa da cavidade oral dos hamsters e o tecido bucal humano, os protocolos de 

carcinogênese experimental para induzir as mudanças pré-malignas e carcinomas 

assemelham-se aos que ocorrem durante o desenvolvimento análogo na mucosa oral humana 

(CHEN; HSUE; LIN, 2005). 

Então, espera-se que os dados de indução de câncer e de tratamento do mesmo possam 

simular o regime experimental em humanos, traduzindo um imenso potencial para avanços 

futuros na medicina. Portanto, se o modelo animal for bem sucedido quando estabelecido, 

pode demonstrar como o organismo reagiria a diferentes estímulos positivos ou negativos, o 

que seria impossível de se visualizar em pacientes antes de testes pré-clínicos e clínicos 

(FRESE; TUVESON, 2007). 

Uma abordagem de experimentação envolvendo cultivo celular de uma variedade de 

linhagens de células humanas combinada a testes in vivo em um modelo experimental que se 



24 

 

 

aproxime do tumor humano alvo apresenta uma maior chance de sucesso em prever a eficácia 

de novos tratamentos de câncer em humanos (TALMADGE et al., 2007; BONO, 

ASHWORTH, 2010). Portanto, a junção do estudo in vitro a este modelo de hamster sírio 

demonstra-se particularmente interessante para realização de testes envolvendo indução de 

câncer oral e verificação da resposta a diferentes tratamentos, já que este modelo animal 

apresenta características fenotípicas desejadas para a pesquisa em questão.  

   

1.4 Nanobiotecnologia e tratamento do câncer 

O conceito de medicina personalizada tem sido defendida como a próxima fronteira 

em desenvolvimento de tratamento de tumores sólidos (MAITLAND; SCHILSKY, 2011). 

Tradicionalmente, o tratamento de tumores orais tem-se baseado na combinação de redução 

cirúrgica e radioterapia ou quimioterapia citotóxicas para melhorar os resultados em pacientes 

com malignidades na região bucal. Ao contrário de muitas outras subespecialidades 

oncológicas, no entanto, as taxas de recidiva e sobrevida global melhoraram apenas 

modestamente ao longo das últimas décadas, apesar da contínua procura por novos regimes 

terapêuticos (CROZIER; SUMER, 2010; RUBACK et al., 2012). Dessa forma, espera-se que 

a identificação e utilização de agentes direcionadores levem a um tratamento individualizado 

que, por sua vez, conduzirá a resultados significativamente melhores, manifestados por mais 

curas e melhor qualidade de vida por meio de amenização da toxicidade (ROBERTS et al., 

2011). 

Com este intuito, a aplicação da nanotecnologia na área biológica, também 

denominada nanobiotecnologia, tem-se mostrado bastante promissora (JAIN, 2012) e vem 

contribuindo para a superação das limitações no tratamento de diferentes doenças, 

principalmente do câncer (PANKHURST et al., 2003). No que concerne ao tratamento do 

câncer, alguns problemas como o fato de muitos fármacos serem lipossolúveis e apresentarem 

baixa biodisponibilidade podem ser resolvidos com o uso de carreadores nanoestruturados 

(WANG; CHUI; HO, 2011; YANG et al., 2012). Nanopartículas magnéticas recobertas com 

monooleato de glicerol, por exemplo, ao serem associadas ao paclitaxel, aumentaram a meia 

vida do fármaco de cinco horas para mais de 15 horas (SINGH et al., 2011). 

Aumentando a biodisponibilidade do fármaco e o acúmulo no tumor, a nanotecnologia 

se destaca por propiciar um aumento na eficácia terapêutica e uma redução da toxicidade da 

terapia em tecidos saudáveis (WERNER et al., 2012). Existem vários tipos de 

nanocarreadores que podem ser utilizados para se alcançar esses objetivos, tais como os 

lipossomos (CARNEIRO et al., 2011; SERWER et al., 2011), dendrímeros (WARD et al., 



25 

 

 

2011), nanotubos de carbono (JI et al., 2012) e nanocompostos metálicos, como as 

nanopartículas magnéticas (JAIN et al., 2012). 

Características interessantes podem ser encontradas nas nanopartículas de ferro. Além 

de serem importantes agentes de contraste na ressonância magnética, podem se apresentar 

como agentes de imagem multifatoriais ou responsáveis por terapia combinada a diagnóstico 

(CHUNFU et al., 2004; LACAVA; MORAIS, 2004; HEATH; DAVIS, 2008). Estes 

nanocompostos magnéticos podem ser constituídos de diferentes ferritas, como as de ferro, 

manganês, zinco e cobalto, sendo as mais comuns as de óxido de ferro magnetita (Fe3O4) e 

maguemita (γ-Fe2O3). Devido ao tamanho em escala nanométrica, as nanopartículas de ferro 

exibem propriedades magnéticas diferentes dos materiais em escala micro ou macroscópicas 

(PISON et al., 2006).  

Em tamanhos variando entre 10 e 20nm, cada nanopartícula se torna um domínio 

único carregado eletricamente que apresenta características superparamagnéticas, 

comportando-se como um átomo gigante paramagnético que responde rapidamente a um 

campo magnético, mas com coercividade e magnetismo residual quase nulos (MOGHIMI; 

HUNTER, MURRAY, 2005).  

As nanopartículas de ferro utilizadas na nanobiotecnologia e nanomedicina recebem 

uma cobertura biocompatível que tem o objetivo de estabilizá-las, propiciando uma 

funcionalização dependendo da aplicação desejada que proteja contra a degradação em um 

ambiente fisiológico (GUPTA; GUPTA, 2005; LU; SALABAS; SCHUTH, 2007). Várias 

moléculas têm proporcionado essas características, como o ácido dimercapto-succínico 

(DMSA) (VALOIS et al., 2010) e diferentes polímeros (ARSALANI et al., 2012; 

AZBARZADETH et al., 2012) que permitem ainda a ligação química de moléculas 

direcionadoras como, por exemplo, anticorpos monoclonais (ACHARYA; DILNAWAZ; 

SAHOO, 2009). 

Nanopartículas de magnetita recobertas com dextran (LACAVA, 2004) ou ácido 

poliaspártico (SADEGHIANI, 2004) e maguemitas revestidas por polifosfato (PORTILHO-

CORRÊA, 2007) ou citrato (BRUGIN, 2007) mostraram resultados promissores quanto ao 

seu potencial biomédico. No entanto, nem sempre os revestimentos apresentam uma resposta 

favorável, como no caso das nanopartículas magnéticas iônicas de ferrita de manganês 

recobertas com citrato (LACAVA et al., 1999 a) e com tartarato (LACAVA et al., 1999 b), 

que injetadas intraperitonealmente em camundongos, provocaram alta toxicidade e 

mutagenicidade, não sendo consideradas biocompatíveis.  



26 

 

 

No entanto, uma vez biocompatíveis, as nanopartículas magnéticas demonstram um 

vasto campo de aplicação biomédica e vem sendo amplamente utilizadas no tratamento do 

câncer, como carreadores de quimioterápicos (TEDESCO, 2006; CARNEIRO et al., 2011; 

ESTEVANATO et al., 2011) e em terapia fotodinâmica (PRIMO et al., 2008). Além disso, 

devido ao núcleo de ferro, as nanopartículas magnéticas são adequadas para o tratamento por 

magneto-hipertermia (GUEDES et al., 2004; BALIVADA et al., 2010; PORTILHO et al., 

2010). 

Diante do exposto, pode-se perceber que o direcionamento de agentes terapêuticos é 

viável, mesmo que de forma passiva, já que as nanopartículas podem se acumular 

normalmente no tumor devido à maior permeabilidade e retenção, características do tecido 

canceroso (BRIGGER; DUBERNET; COUVREUR, 2002). Isso ocorre porque o rápido 

crescimento do câncer requer grandes quantidades de nutrientes que não é suportado pelos 

vasos sanguíneos adjacentes, fazendo com que a formação de novos vasos seja induzida. Do 

mesmo modo, devido à ausência de vasos linfáticos, a saída de moléculas do tumor é 

diminuída, fazendo com que as nanopartículas permaneçam por mais tempo no local 

(PARVEEN; SAHOO, 2006; SAHOO; PARVEEN; PANDA, 2007). Pelas razões descritas 

acima, o tratamento do câncer por meio de nanopartículas magnéticas é uma alternativa que se 

torna cada vez mais possível, especialmente quando combinada à hipertermia.   

 

1.5 Tratamento do câncer envolvendo hipertermia mediada por nanopartículas 

magnéticas 

Para a maioria dos pacientes, a cirurgia ainda é a metodologia mais recomendada 

como tratamento para diversos tipos de câncer (PURUSHOTHAM; LEWISON; SULLIVAN, 

2012; WEI; HARARI, 2012), porém, a fim de aumentar a eficiência dos procedimentos 

cirúrgicos, utilizam-se atualmente terapias adjuvantes como a radioterapia (DELANEY et al., 

2005) e a quimioterapia (BASKAR et al., 2012). No delineamento do tratamento para o 

câncer oral não é diferente; no entanto, o tipo de abordagem terapêutica depende, em sua 

grande maioria, do estadiamento da doença, tamanho do tumor e fatores pessoais, como idade 

e comprometimento social decorrente de mutilações na área da cabeça e pescoço do indivíduo 

(INCA, 2012 b). 

Contudo, a eficiência destas metodologias terapêuticas não depende apenas dos 

agentes antineoplásicos utilizados, mas também da maneira como são entregues aos tecidos e 

células cancerígenas alvos (ALEXIOU et al., 2000; 2003), já que ambas terapias podem 

danificar consideravelmente os tecidos normais (TSENG et al., 2007). O surgimento de 



27 

 

 

efeitos adversos, como o fato de acarretar toxicidade sistêmica que se torna mais evidente à 

medida que o tratamento aumenta, é a confirmação do caráter generalizado que essas terapias 

desempenham (NIE et al., 2007; RIBEIRO et al., 2012). 

Por essas razões, métodos alternativos que apresentam maior especificidade para os 

tecidos neoplásicos e/ou possam ser utilizados como adjuvantes às terapias convencionais têm 

sido, nas últimas décadas, um importante foco dos estudos científicos, como, por exemplo, o 

uso da hipertermia (MORNET et al., 2004).  

A lógica subjacente à hipertermia é o fato de que as temperaturas entre 40 e 44ºC são 

citotóxicas e menos toleradas pelas células tumorais do que pelas células saudáveis (JORDAN 

et al., 2001; RIEHEMANN et al., 2009), especialmente em ambientes com condições de 

hipóxia e valores de pH baixos que normalmente são encontrados nos tecidos tumorais devido 

à perfusão sanguínea insuficiente e pela incapacidade de expelir apropriadamente os produtos 

derivados do metabolismo anaeróbico (VAN DER ZEE, 2002). O aumento da temperatura 

ataca principalmente as células ácidas uma vez que essas apresentam membrana plasmática 

mais frágil que as células normais, bem como apresentam alterações de permeabilidade 

(GUFFY et al., 1982).  

Além disso, a hipertermia interfere diretamente na vida das células malignas 

provocando necrose por efeito físico interferindo na membrana plasmática, no núcleo e no 

citoesqueleto. A oxidação sistêmica interfere em várias vias de transdução de sinais 

aumentando a apoptose, diminuindo a proliferação celular maligna e provocando 

antiangiogênese. Da maior relevância é que todos esses resultados podem aparecer nos mais 

variados tipos de tumores, isto é, independente de sua classificação. Seus benefícios sobre as 

terapias clássicas são, principalmente, a acessibilidade a diferentes tipos de tumores, 

especificidade induzida e redução dos efeitos colaterais (MILLERON; BRATTON, 2007; 

CHERUKURI; GLAZER; CURLEY, 2010). 

A hipertermia combinada à nanotecnologia, também chamada de magneto-

hipertermia, baseia-se no princípio de que uma nanopartícula magnética seja direcionada ao 

local de interesse e gere calor por meio de um campo magnético alternado, liberando energia 

térmica e eliminando, consequentemente, as células tumorais devido às elevadas temperaturas 

(ITO; HONDA; KOBAYASHI, 2006). Em contrapartida, o aquecimento convencional dos 

tecidos por microondas ou laser resulta também na destruição das células normais próximas 

ao tumor, sendo muitas vezes maléfico ao tratamento (FORTINA et al., 2007; JOHANNSEN 

et al., 2007).  



28 

 

 

Estudos em modelos animais com diferentes nanopartículas magnéticas já 

comprovaram a completa regressão de câncer de cólon usando hidroxiapatitas (HOU et al., 

2009), tumores de próstata (KAWAI et al., 2006) e mama (ITO et al., 2003) com MCLs 

(lipossomos catiônicos magnéticos), sendo que neste último tipo tumoral também foi 

observada aquisição de imunidade antitumoral após exposições à hipertermia mesmo em 

tumores maiores que 15mm. Diversos outros estudos têm visado o uso da hipertermia 

associada às nanopartículas (GUEDES et al., 2004; LACAVA, 2006), mas há muito o que se 

explorar neste vasto e relativamente novo campo da nanobiotecnologia.  

Portanto, pode-se afirmar que as nanopartículas apresentam capacidade tanto de 

auxiliar na busca de tratamentos eficientes quanto podem causar reações adversas, 

dependendo da concentração e do modo que são empregadas (MAHMOUDI et al., 2009 a; 

2009 b; 2011). Logo, estudos como o presente são de grande valia a fim de caracterizar os 

efeitos benéficos, indiferentes ou prejudiciais do uso de nanopartículas magnéticas de ferro, 

recobertas ou desprovidas de revestimento, in vitro e in vivo. 

 

2. OBJETIVOS 

O presente trabalho teve como objetivo geral verificar a ação de nanopartículas 

magnéticas de ferro revestidas por polifosfato de sódio em linhagem celular de carcinoma 

escamoso oral (UM-SCC14A), sua capacidade de internalização celular e sua citotoxicidade. 

Além disso, propôs-se analisar o padrão de resposta destas nanopartículas in vivo a fim de 

investigar esta nova terapia alvo contra o câncer oral. 

Para isso, foram realizados experimentos no Laboratório de Estudos Genômicos 

localizado no IBILCE/UNESP - São José do Rio Preto, procurando atender os seguintes 

objetivos específicos: 

 Avaliar a eficiência de transfecção das nanopartículas magnéticas de óxido de ferro 

revestidas por polifosfato de sódio na linhagem celular de câncer de assoalho de boca 

UM-SCC14A. 

 Analisar a taxa de morte desencadeada pela linhagem celular quando exposta às 

diferentes concentrações de nanopartículas. 

 Aferir a viabilidade celular e o crescimento das células expostas a diferentes 

concentrações de nanopartículas. 

 Registrar as diferenças morfológicas entre as células cancerosas incubadas ou não com 

as diferentes concentrações de nanopartículas magnéticas. 



29 

 

 

 Observar o efeito do fluido ferromagnético nos tumores orais dos animais inoculados 

com nanopartículas magnéticas de ferro e induzidos ao tratamento magneto- 

hipertérmico por meio de um campo magnético de frequência alternada.  

 Quantificar e classificar as diferenças entre os grupos tratados e não tratados com 

hipertermia, atestando a eficiência deste procedimento terapêutico por meio de 

análises histopatológicas, morfológicas e imunocitoquímicas, avaliando os resultados 

estatisticamente e destacando os pontos ímpares deste estudo. 

 Verificar a existência de comprometimento histopatológico em outros órgãos e a 

biodistribuição das nanopartículas nos mesmos, constatando o tempo necessário para 

eliminação do fluido ferromagnético pelo modelo animal. 

 

3. MATERIAL E MÉTODOS 

3.1 Caracterização das nanopartículas magnéticas de ferro 

A síntese e a caracterização do fluido ferromagnético (FFM) utilizado neste estudo 

foram realizadas no Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás (UFG, Goiânia), 

sendo que as nanopartículas foram gentilmente cedidas pela Profª. Drª. Emília Celma de 

Oliveira Lima. 

O fluido utilizado foi desenvolvido à base de nanopartículas de maguemita (γ-Fe2O3), 

funcionalizadas com polifosfato de sódio. A concentração original da amostra de FFM 

empregada neste trabalho foi de 3,7x1015 partículas/mL de FFM e a concentração de ferro de 

3,3mg Fe/mL, determinada por colorimetria (método da ortofenantrolina). A partir daí, a 

amostra foi diluída em água milliQ imediatamente antes de cada experimento até atingir as 

concentrações utilizadas de 0,35, 0,7 e 1,4x1015 partículas/mL de FFM. As amostras 

permaneceram estáveis e com o mesmo valor de pH 7,2 durante todo o período experimental, 

sendo armazenadas ao abrigo de luz. 

A caracterização física e a avaliação da ultraestrutura das amostras foram feitas por 

microscopia eletrônica de transmissão (MET) e, antes da análise, a amostra de FFM ainda 

sem revestimento foi diluída 1000 vezes em soro fisiológico e colocada sobre telas de 

microscopia eletrônica recobertas com Formvar. Após secarem por duas horas, as telas foram 

analisadas e fotomicrografadas em microscópio eletrônico JEOL 100CXII. Os diâmetros das 

partículas magnéticas foram obtidos por análise em computador, utilizando-se o programa 

ImagePro 4.0. A distribuição das partículas foi conseguida utilizando-se o melhor ajuste 



30 

 

 

lognormal. Além disso, o diâmetro modal médio de cada nanopartícula foi obtido por difração 

de raio-X. 

Após a funcionalização das nanopartículas com polifosfato, o FFM foi sonicado à 

temperatura ambiente por dez minutos no sonicador Ultrasonic cleaner 2840 D e foram 

realizadas as medições do índice de polidispersão (PdI), potencial zeta, mobilidade elétrica e 

condutividade por espalhamento dinâmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nono 

series Z590 (Malvern). 

A técnica envolve direcionar um feixe de laser para uma amostra altamente diluída e 

contabilizar a luz espalhada em um fotomultiplicador posicionado em um determinado 

ângulo. Dessa forma, a intensidade de luz espalhada que atinge o detector é determinada pela 

interferência mútua das ondas de luz espalhadas pelas partículas individuais na suspensão. 

Este método também pode ser utilizado na determinação de diâmetro de partículas de 5nm a 

5µm, porém para evitar imprecisões devidas ao espalhamento múltiplo e a interações que 

influenciam a difusão, as medidas devem ser feitas em diluições no intervalo de 10 -5 a 10-2%, 

como o realizado no presente estudo. 

 

3.2 Linhagem celular de câncer UM-SCC14A 

Para a realização da incubação das nanopartículas magnéticas de ferro, foi cultivada a 

linhagem celular contínua proveniente de câncer de assoalho de boca (UM-SCC14A) em 

meio essencial mínimo de Eagle modificado, MEM alfa 1x (GIBCO-BRL, Life Technologies, 

Nova Zelândia), suplementado com 100U de penicilina por mL, 100μg de estreptomicina por 

mL, 1% (v/v) de aminoácidos não essenciais e 10% (v/v) de soro fetal bovino inativado (SFB) 

(GIBCO-BRL, Life Technologies, EUA).  

O cultivo foi realizado em garrafa de poliestireno de 75cm2 com dispositivo de 

aeração acoplado à tampa com filtro (TPP, Suíça), sendo que as células foram repicadas 

segundo a necessidade. Com essa finalidade, o meio de cultura da garrafa foi descartado e o 

tapete celular lavado com PBS (GIBCO-BRL, Life Technologies, EUA). Em seguida, foram 

adicionados aproximadamente 2mL de tripsina (GIBCO-BRL, Life Technologies, Canadá) e a 

cultura foi mantida por alguns minutos em estufa a 37ºC na presença de 5% CO2. A 

monocamada foi monitorada no microscópio invertido de luz para verificar o desprendimento 

das células. Posteriormente, a solução de tripsina foi inativada com meio de cultura e a 

suspensão foi homogeneizada. Parte da solução resultante foi devolvida à garrafa e o volume 

foi completado com meio de cultura fresco. Finalmente, a garrafa foi incubada em estufa e 

utilizada nos experimentos até atingir cerca de 20 passagens.
 



31 

 

 

 

3.3 Incubação das nanopartículas na linhagem celular de câncer UM-SCC14A 

No caso dos experimentos de coloração com Azul da Prússia e no ensaio de apoptose, 

foi inserida nas placas de microtitulação de seis poços (TPP, Suíça) uma lamínula por poço, 

lavada em etanol 70% e água milliQ, seca e esterilizada em luz UV a fim de evitar qualquer 

tipo de contaminante que pudesse interferir nos experimentos. Nestes experimentos, a 

linhagem foi semeada com densidade de 5x105 células por poço. Para o experimento 

envolvendo a análise por microscopia eletrônica de transmissão, as células foram semeadas 

diretamente na placa, sem lamínulas aderidas, com a mesma densidade dos experimentos 

anteriores. E, por fim, para o ensaio MTT, as células foram semeadas em placas de 

microtitulação de 96 poços (TPP, Suíça), com densidade de 104 células por poço. 

Para o semeio das células, foi necessário retirar o meio de cultura da garrafa contendo 

a linhagem celular, com posterior lavagem utilizando-se PBS e incubação em estufa de CO2 a 

37ºC por alguns minutos com tripsina, semelhante ao procedimento de repique descrito 

anteriormente. Após desprendimento das células da garrafa, adicionou-se meio de cultura 

suplementado com 10% de SFB e esta solução foi transferida para um tubo de polipropileno 

de 15mL.   

Seguiu-se a centrifugação da solução, a fim de separar o meio contendo tripsina das 

células, foi retirado o sobrenadante, adicionado meio de cultura fresco e feita 

homogeneização. Separou-se em um tubo do tipo eppendorf cerca de 50µL do conteúdo do 

tubo e foram acrescentados outros 50µL de Azul de Tripan (Vetec, Brasil) diluído em PBS, já 

que se pretendia conhecer a taxa de viabilidade dessa cultura a fim de não contabilizar para 

posterior transferência para a placa de microtitulação de células inviáveis ou em processo 

apoptótico. Posteriormente à incubação em temperatura ambiente por cerca de quatro 

minutos, parte do conteúdo foi transferido para a câmara de Neubauer (Boeco, Alemanha) 

para efetuar a contagem das células. 

No microscópio de luz (Leica CTR 4000), foi focalizada a área demarcada da câmara 

de Neubauer com a objetiva de 10x. O volume total desejado da câmara com a lamínula 

colocada corresponde a 0,1mm3; sendo assim, a contagem das células nas quatro áreas de um 

lado da câmara foi realizada e a média foi obtida. Como a suspensão foi inicialmente diluída a 

1/2, o número de células contadas foi igual à média multiplicada pelo fator de diluição, no 

caso 2. Para se obter o número de células/mL, multiplicou-se o valor obtido por 10000 para 

correção, já que: 1mL = 1cm3. Desta forma: 1cm3 = 10 x 10 x 10mm = 1000mm3 



32 

 

 

Na câmara de Neubauer obtemos o número de células por 0,1mm
3
, então devemos 

multiplicar por 10, portanto 10 x 1000 = 10000. Finalmente, o volume desejado foi obtido 

pelo seguinte resultado: 

Média da câmara de Neubauer x Fator de diluição x 104 → 1 mL de solução 

                                5x105 (ou 104, dependendo do experimento) → X mL 

Após transferir o volume X referido para os poços da placa de microtitulação, 

completou-se com meio específico MEM alfa até o volume final desejado de cada placa. A 

placa foi então incubada em estufa de CO2 a 37ºC, 24 horas antes da incubação.  

Finalizada essa etapa, quando as células atingiram cerca de 60% de confluência, foi 

realizada a incubação do fluido ferromagnético, adicionando-se meio de cultura com as 

diferentes concentrações de nanopartículas (0,35; 0,7 e 1,4x1015 partículas/mL de FFM) em 

cada poço da placa, também deixando poços sem nanopartículas para controle da reação e 

para verificar a ação das mesmas nas células. Seguiu-se incubação na estufa de CO2 a 37ºC e 

os testes foram realizados após 24 horas (ou, no caso do ensaio MTT, que foi realizado após 

12 e 24 horas de incubação). Todos os experimentos foram realizados em triplicatas e, 

posteriormente, repetidos. 

 

3.4 Métodos de avaliação da internalização e citotoxicidade das nanopartículas 

magnéticas de ferro in vitro 

3.4.1 Análise da morfologia da linhagem celular UM-SCC14A pós-incubação com 

o FFM 

A linhagem celular foi semeada nas placas de microtitulação sobre lamínulas 

esterilizadas e, após a incubação das nanopartículas descrita anteriormente no item 3.3, as 

células foram fixadas em solução Karnovisky (partes iguais de paraformaldeído 4% e 

glutaraldeído 4%, Sigma, Alemanha) por cerca de uma hora. Após lavagens com água 

destilada, realizou-se contraste com Hematoxilina-eosina, no qual foi adicionada aos poços 

hematoxilina de Harris (Sigma, Alemanha) por dez minutos. Seguiu-se lavagem com água 

corrente e etanol 80%, sendo posteriormente retirado e adicionada eosina (Merck, Alemanha) 

por cerca de quatro minutos. O material foi desidratado em série crescente de etanol e as 

lamínulas foram removidas dos poços com auxílio de uma pinça, secas em papel-filtro à 

temperatura ambiente e, para a montagem da lâmina, foi utilizado meio de entellan (Merck, 

Alemanha). 



33 

 

 

Para a captura de imagens e verificação qualitativa das alterações morfológicas nas 

células, utilizou-se o analisador de imagens Image ProPlus Media Cybernetics acoplado ao 

microscópio Olympus BX60, do Centro de Microscopia “Prof. Dr. Celso Abbade Mourão”.  

 

3.4.2 Análise da ultraestrutura da linhagem UM-SCC14A e verificação da 

internalização das nanopartículas por microscopia eletrônica de transmissão 

As células foram semeadas de acordo com o item 3.3 e tratadas com nanopartículas 

como descrito anteriormente, na concentração de 0,7x1015 partículas/mL. Após 24 horas, as 

células foram tripsinizadas, adicionou-se meio de cultura para inativar a tripsina e a solução 

foi repassada a um tubo de polipropileno. Este procedimento foi feito em todos os poços do 

mesmo grupo e o conteúdo foi transferido para o mesmo tubo. As células foram centrifugadas 

a 1000rpm, 4ºC por 20 minutos para a retirada do sobrenadante e foi adicionado PBS, 

ressuspendida a solução para lavar as células e foi feita nova centrifugação. Esta lavagem com 

PBS foi repetida e o conteúdo foi repassado para um tubo eppendorf. 

Para a fixação do material, foi utilizado o fixador paraformaldeído a 4% e 

glutaraldeído a 0,5% a 4ºC, seguido de uma solução 10% fixador e 90% tampão cacodilato de 

sódio (pH 7,4). Em seguida, as amostras foram lavadas em tampão cacodilato e a desidratação 

foi feita em série crescente de metanol (J. T. Baker, México). Por fim, as amostras foram pré-

incluídas em mistura de partes iguais de LR gold (London Resin Co., Reading, Berkshire, 

Reino Unido) e metanol 100%, durante 24 horas a -20ºC. Os conteúdos dos eppendorfs foram 

transferidos para cápsulas, foi feita uma centrifugação de 1500rpm a 4ºC por 20 minutos e a 

polimerização foi realizada utilizando-se 200µL de LR gold puro por cápsula. Finalmente, foi 

adicionado LR gold e ativador (solução fresca 0,25%) nas cápsulas expostas à luz UV por 

cerca de 24 horas a -20ºC (OLIANI et al., 2001). 

As cápsulas foram retiradas, os blocos contendo as amostras foram trimados e deles 

obtidos cortes semifinos de 500nm e, posteriormente, ultrafinos de 50nm, cortados no 

ultramicrótomo Leica Ultracut UCT, sendo cada corte depositado em tela de cobre. Após esta 

etapa, as telas foram contrastadas em acetato de uranila por 20 minutos, seguindo lavagens em 

água destilada e, por fim, foram expostas ao citrato de chumbo por seis minutos, lavadas e 

secas.  

Finalmente, as grides foram analisadas qualitativamente quanto à morfologia da 

linhagem celular e presença de FFM internalizado, sendo fotodocumentadas no microscópio 

eletrônico de transmissão Leo-Zeiss 906 EXII, do Centro de Microscopia “Prof. Dr. Celso 

Abbade Mourão”, IBILCE/UNESP. 



34 

 

 

 

3.4.3 Ensaio de apoptose 

O Laranja de acridina é um corante metacromático seletivo para ácidos nucléicos útil 

para a determinação do ciclo celular. O corante pode penetrar e identificar células apoptóticas 

ligando-se ao DNA, enquanto as células viáveis não são permeáveis, possibilitando tal 

diferenciação (KASTEN, 1967).  

Sendo assim, o procedimento inicial de fixação das células nas lamínulas seguiu o 

protocolo descrito para a coloração por HE (item 3.4.1). A metodologia baseou-se em 

adicionar a cada poço Alumen férrico 4% (Carlo Erba, Itália) por cerca de quatro minutos e, 

depois de retirada a solução e as lamínulas bem lavadas com água destilada, foi empregado 

Laranja de acridina (Sigma, EUA) por dez minutos. O corante foi removido, as lamínulas 

lavadas com água destilada e colocadas para secar. 

A montagem da lâmina foi realizada com glicerina (Synth, Brasil) somente antes da 

visualização no analisador de imagens (Image ProPlus Media Cybernetis acoplado ao 

microscópio Olympus BX60, do Centro de Microscopia “Prof. Dr. Celso Abbade Mourão”, 

IBILCE/UNESP) para captura de fotomicrografias, análise da morfologia e verificação de 

morte celular. Após a visualização das fotomicrografias, foram contados 15 campos 

diferentes, sob o mesmo aumento no microscópio (400x), nos quais foram quantificadas as 

células nas quais havia ocorrido apoptose e as quais não foram afetadas, a fim de encontrar a 

taxa relativa de morte desencadeada pelas diferentes concentrações de FFM. 

 

3.4.4 Ensaio MTT  

O MTT amarelo é reduzido a formazan roxo nas mitocôndrias das células e essa 

redução ocorre somente quando enzimas redutases mitocondriais estão ativas e, portanto, a 

conversão pode ser diretamente relacionada ao número de células viáveis (SLADOWSKI et 

al., 1993).  

Então, a citotoxicidade foi analisada por meio do ensaio colorimétrico MTT (3[4,5-

dimetiltiazol-2-il]-2,5difeniltetrazolium bromídeo, Sigma, Brasil) após a incubação da cultura 

celular juntamente às nanopartículas em placas de microtitulação de 96 poços, durante 12 e 24 

horas. O teste abrangeu tais períodos de tempo já que é sabido que as nanopartículas são 

internalizadas pelas células em até 24 horas, tornando desnecessário um acompanhamento, 

neste caso, durante outros períodos de tempo ou a longo prazo (CALMON et al., 2012). 

Também foram reservados poços para células UM-SCC14A, servindo de controle negativo 

em solução de meio de cultura sem FFM e células expostas a meio de cultura em conjunto 



35 

 

 

com dimetilsulfóxido 100% (DMSO) (Sigma, Reino Unido), para controle positivo no qual 

era sabido que desencadearia morte celular.  

Sendo assim, as células foram semeadas e foi feita a incubação das nanopartículas 

como descrito anteriormente no item 3.3. Nos tempos indicados de cada experimento (12 e 24 

horas pós-incubação com FFM), o meio de cultura foi removido dos poços e trocado pela 

solução previamente preparada de MTT, em concentração de 1mg/mL em 100µL (por 

orifício) de meio de cultura suplementado com antibióticos, sem SFB. Posteriormente, a placa 

envolta em papel alumínio foi incubada em estufa de CO2 a 37°C por 30 minutos. Após a 

formação dos cristais de formazan, a solução MTT foi removida e foram adicionados 100µL 

de DMSO por orifício, sendo a placa incubada sob agitação de 60rpm, à temperatura ambiente 

por cinco minutos. 

A absorbância foi determinada pelo espectrofotômetro Spectra Max Plus 384 sob 

comprimento de onda de 570nm, sendo que os valores brutos obtidos de cada grupo foram 

comparados aos valores referentes às células não tratadas, tomadas como controle com 100% 

de viabilidade, e a viabilidade celular relativa (%) em relação ao controle foi então calculada. 

 

3.5 Experimentação in vivo 

 3.5.1 Animais 

 Foram utilizados trinta hamsters Sírios machos de oito semanas de vida, não 

isogênicos, adquiridos comercialmente (empresa Anilab Animais de Laboratório, Paulínia, 

Brasil). Durante a fase experimental, os animais foram mantidos em recintos com dieta 

balanceada e água ad libitum, além de condições fixas de temperatura e umidade, com ciclo 

de claro/escuro de 12 horas (KRISHNAKUMAR et al., 2009).  

Os hamsters foram acondicionados e tratados de acordo com o a lei 11.794/2008 que 

dita os parâmetros de criação e utilização de animais em atividades de ensino e pesquisa 

científica. No momento da coleta do material para o estudo, os animais foram anestesiados em 

câmara de CO2 e, por fim, eutanasiados por decapitação. Este projeto e seu delineamento 

experimental proposto foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais 

do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, IBILCE-UNESP (protocolo CEUA nº 

029/2010).  

 

 

 



36 

 

 

3.5.2 Delineamento experimental e tratamento in vivo combinando 

nanopartículas à hipertermia  

 Após os experimentos in vitro para delineamento da concentração biocompatível de 

FFM a ser inoculada para tratamento in vivo de câncer oral, os trinta hamsters sírios foram 

divididos igualmente em cinco grupos (n=6), sendo um grupo reservado para se enquadrar 

como controle normal (Figura 1 A), no qual não foi induzido tumor (Grupo Normal). No 

restante dos animais foi feita a indução do carcinoma oral, por meio da aplicação de 7,12-

dimetilbenz(a)antraceno (DMBA) (Sigma, Reino Unido), um hidrocarboneto aromático 

policíclico iniciador e promotor de carcinogênese e mutagênese frequentemente utilizado em 

experimentação animal. No presente estudo, uma solução 0,5% de DMBA em óleo mineral 

(Nujol, Brasil) foi aplicada na região interna da bochecha direita dos animais por meio de um 

pincel (Condor 441) durante 16 semanas (três vezes por semana), resultando em mudanças 

histológicas e finalmente no desenvolvimento de carcinoma espinocelular na cavidade oral 

(VENGADESAN; ARUNA; GANESAN, 1998; MANOHARAN et al., 2009; 

PANJAMURTHY et al., 2009). 

Dessa forma, um grupo foi tomado como controle com câncer (Figura 1 B), no qual 

foi somente administrado o carcinógeno DMBA diluído em óleo mineral (Grupo C+). Os 

demais grupos com tumor induzido foram tratados com nanopartículas (Figura 1 C). Estes 

animais foram anestesiados por meio de solução contendo 40µL de xilasina (Rompum, Bayer, 

Brasil) e 160µL de quetamina (Dopalen, Vetbrands, Brasil). Enquanto a anestesia surtiu 

efeito, o FFM foi aplicado sob a concentração de 0,7x1015 partículas/mL, sob um volume total 

de 40µL para tumores de 3mm. As nanopartículas foram aplicadas subcutaneamente no local 

do tumor por meio de uma seringa descartável de insulina Injex 1mL (agulha 0,45x13; 2G1/2; 

BD) e, esta aplicação foi realizada lentamente, a fim de evitar quaisquer complicações 

decorrentes da rápida injeção contendo a significativa concentração de FFM estranho ao 

organismo dos animais. 

 

 



37 

 

 

 

Figura 1. Hamsters sírios representando os grupos experimentais (A) normal, (B) com 

carcinoma escamoso oral in situ e (C) tratados com 0,7x1015 partículas/mL de FFM, aplicado 

topicamente na região interna da bochecha direita. 

 

Dentre estes três grupos de hamsters, um grupo foi tratado exclusivamente com FFM 

(Grupo Nanos) e outros dois grupos foram separados para combinar a terapia de 

nanopartículas à exposição a um campo magnético de frequência alternada (desenvolvido 

pelos alunos do Laboratório de Nanobiotecnologia e gentilmente cedido pela Profª. Drª. 

Zulmira Guerrero Marques Lacava da Universidade de Brasília) (Figura 2 A). O 

procedimento de exposição ao campo magnético foi realizado durante 15 minutos por três 

dias consecutivos, logo após a aplicação do FFM (Figura 2 B) (PORTILHO-CORRÊA, 

2007). Um grupo foi eutanasiado após um dia de tratamento (Grupo N+CM1dia) e outro 

grupo após sete dias (Grupo N+CM7dias), a fim de verificar a resposta à terapia em 

diferentes períodos de acompanhamento dos animais. 

 

 

Figura 2. (A) Aparato do campo magnético de frequência alternada, cedido pela Profª. Drª. 

Zulmira Guerrero Marques Lacava. (B) Exposição tópica do hamster sírio ao campo 

magnético.  



38 

 

 

 

O procedimento cirúrgico e a coleta dos tecidos das bochechas (direitas – alvo do 

tratamento – e esquerdas), fígados, corações, pulmões, rins e baços (órgãos retirados para 

possibilitar a verificação de reações adversas às nanopartículas e ao tratamento) foram 

realizados seguindo normas gerais e básicas para dissecção de mamíferos. Os animais foram 

anestesiados via inalação de CO2 em câmara apropriada (modelo GCSCO2G, Beira-mar) e 

acomodados em decúbito dorsal sobre a placa de dissecção. Além disso, foi realizada 

pesagem de todos os animais e retirada de sangue para análise de seus leucogramas. 

Por fim, todos os tecidos de interesse foram corados com Hematoxilina-eosina e Azul 

da Prússia e foram realizadas imunocitoquímicas dos tecidos da cavidade oral direita para os 

anticorpos PCNA e caspase-3 ativada, marcadores de proliferação celular e apoptose, 

respectivamente. 

 

3.5.3 Processamento histológico 

Os animais foram eutanasiados após os devidos tempos descritos anteriormente e as 

amostras de tecido normal, canceroso e tratado foram retiradas das bochechas direitas de 

todos os animais. Além disso, os demais órgãos de interesse do estudo também foram 

removidos, sendo, em seguida, o material devidamente identificado e processado. Para o 

processamento em parafina (Histosec, Merck, Alemanha), foi realizada a fixação em 

Metacarn (razão de 6 metanol: 3 clorofórmio: 1 ácido acético) por quatro horas a 4ºC, 

desidratação em série crescente de etanol, diafanização em xilol (Sigma, Bélgica) e, 

finalmente, inclusão em parafina. 

Dos blocos, foram obtidos cortes de 4µm em micrótomo rotativo (Leica RM2155). Os 

cortes foram primeiramente depositados em banho-maria (Leica HI 1210) para distendê-los e, 

por fim, foram arranjados em lâminas de vidro previamente silanizadas e incubados em estufa 

37ºC (Odontobrás ECB 1.2) para retirada do excesso de parafina, seguindo para os devidos 

testes. 

 

3.5.4 Avaliação dos cortes pela coloração Hematoxilina-eosina e por sua 

combinação ao Azul da Prússia 

Para início do protocolo de coloração, as lâminas foram desparafinizadas em xilol e 

hidratadas em série decrescente de etanol, chegando à água. Logo depois, foi feita coloração 

com Hematoxilina-eosina, primeiramente com hematoxilina, lavagem rápida em água 

destilada para retirar o excesso do corante, seguido de mergulho em diferenciador (partes 



39 

 

 

iguais de HCl 1% e etanol 70%) (Sigma, EUA; Merck, Alemanha), gotejamento de água 

corrente, lavagem em etanol 80%, imersão em eosina, desidratação em etanol, clarificação 

com xilol e montagem da lâmina com bálsamo do Canadá (Synth, Brasil). 

Após a montagem das lâminas, foi realizada análise histopatológica pela Drª. Jane 

Lopes Bonilha da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP) para 

confirmação do diagnóstico de todos os animais. Foram analisadas variáveis quanto à 

presença de infiltrado mononuclear, neoangiogênese e aspecto da amostra em geral, 

verificando o comprometimento tecidual. 

Para verificação da presença de nanopartículas remanescentes nos diferentes tecidos, 

foi realizada, em conjunto à coloração HE, a contracoloração com Azul da Prússia 

(combinação previamente preparada de HCl 20% e ferrocianeto de potássio 10% em 

proporções iguais) (Sigma, EUA). O protocolo seguiu-se de forma similar, apenas 

adicionando uma etapa de 20 minutos de contracoloração logo após a hidratação dos cortes. O 

ferro intracelular foi marcado em azul, possibilitando atestar qualitativamente a presença do 

FFM nos cortes pela análise em microscópio de luz. 

Por fim, também foi utilizado o Sistema Analisador de Imagens, com o programa 

Image ProPlus Media Cybernetics, para a análise morfológica e fotodocumentação das 

possíveis áreas de comprometimento por metástase ou biodistribuição/acúmulo de FFM nos 

diferentes tecidos coletados. As figuras obtidas foram avaliadas qualitativamente quanto à 

presença de características morfológicas de tecidos tumorais e normais. 

 

 3.5.5 Análise morfométrica populacional 

A análise morfométrica foi realizada para que se determinassem as medidas de altura 

(m) da camada do epitélio e de queratina. Todas as medições foram feitas a partir de 

imagens capturadas em aumento de 100x de cortes histológicos corados por HE de seis 

animais por grupo, por meio do Sistema Analisador de Imagens. Isto foi realizado de maneira 

automatizada pelo programa Image ProPlus Media Cybernetics devidamente calibrado por 

régua micrométrica. Para esta análise foram utilizadas 200 medidas para cada variável de cada 

grupo experimental e a determinação da frequência populacional por tecido bucal foi feita a 

partir da transformação dos valores das medidas por grupo experimental em porcentagem. 

 

3.5.6 Imunocitoquímica para avaliação da proliferação celular (PCNA) 

Foi realizada desparafinização dos cortes em xilol e hidratação em série decrescente de 

etanol (absoluto, 95%, 70% e 50%), seguido de lavagem em água destilada. Logo após, foi 



40 

 

 

feita a recuperação antigênica com tampão citrato (pH6,0) em panela (Philips Walita) a 100ºC  

e resfriado à temperatura ambiente e, bloqueio da peroxidase endógena, pela solução de 

peróxido de hidrogênio 3% (Merck, Alemanha) em metanol à temperatura ambiente em local 

escuro.  

Seguiu-se a inibição de ligações inespecíficas com background sniper em câmara escura 

à temperatura ambiente, sendo que entre todas as etapas desta imunocitoquímica, foram 

realizadas lavagens em tampão PBS. A incubação com anticorpo primário PCNA (sc56, clone 

PC10, IgG mouse monoclonal, Santa Cruz Biotechnology, EUA) foi feita pela diluição de 

1µL de anticorpo em 100µL de BSA1%, em câmara úmida por uma hora em estufa a 37°C. 

Para o controle negativo da reação, o anticorpo primário foi omitido e substituído pelo soro. 

Posteriormente, o polímero (BioCare Medical, EUA) foi gotejado sobre o material, em 

câmara escura por 40 minutos à temperatura ambiente, a revelação do material foi feita com 

DAB cromogênico líquido (Dako, EUA) por 50 segundos e, finalmente, foi realizada a 

contracoloração com hematoxilina de Harris por 40 segundos. A desidratação foi feita em 

série crescente de etanol (95% e absolutos), seguida de lavagens em xilol e montagem da 

lâmina com bálsamo do Canadá. 

As imunocitoquímicas dos cortes foram fotodocumentadas e a análise da expressão da 

proteína foi realizada pela demarcação nuclear, quantificada por densitometria óptica pelo 

programa analisador de imagem AxioVision do Microscópio AxioSkop 2 (Zeiss), do 

Laboratório de Morfologia, IBILCE-UNESP. A partir das fotomicrografias das 

imunomarcações, foram avaliados dois campos aleatórios de cada animal, nos quais 15 

valores foram obtidos a partir de pontos escolhidos aleatoriamente (unidades arbitrárias de 0 a 

255). Estes valores foram expressos como média de cada grupo ± desvio padrão. 

 

3.5.7 Imunocitoquímica para avaliação da apoptose induzida pelo tratamento 

(caspase-3 ativada) 

Foi realizada desparafinização, hidratação, recuperação antigênica e bloqueio da 

peroxidase endógena do material de maneira similar à descrita no item 3.5.6, sendo que o 

tampão, neste caso, tratou-se do TBS. Seguiu-se para a permeabilização com triton 0,2% em 

TBS em câmara escura à temperatura ambiente, bloqueio de proteínas inespecíficas com leite 

5% em TBS e incubação com o anticorpo primário (ab13847, IgG rabbit polyclonal, ABCam, 

EUA) por meio da diluição de 1µL de anticorpo em 50µL de BSA1% em TBS, overnight na 

câmara escura na geladeira. Para o controle negativo, o anticorpo primário foi substituído pelo 

soro.  



41 

 

 

  No dia seguinte, foi realizada incubação com 1µl de anticorpo secundário (sc-2018, 

Rabbit ABC Staining System ImmunoCruz, Santa Cruz Biotechnology, EUA) em 200µl 

BSA1% por 45 minutos em câmara escura na estufa 37ºC. Posteriormente, houve incubação 

com o complexo AB, revelação do material com DAB cromogênico líquido e a 

contracoloração com hematoxilina. A análise por densitometria foi realizada da mesma forma 

que no item 3.5.6. 

 

3.6 Análise da série branca sanguínea 

3.6.1 Avaliação da contagem global de leucócitos 

Para a contagem global de leucócitos, foram pipetados 20μL de sangue em tubos 

ependorff com 400μL de líquido diluidor no qual o material foi homogeneizado por 20 

minutos. O líquido diluidor era composto de 2mL de ácido acético glacial, 1mL de azul de 

metileno em 100mL de água destilada. Após a homogeneização, 10μL da solução foi 

transferida para a câmara de Neubauer, onde se procedeu a contagem em quatro retículos 

laterais da câmara em microscópio de luz. Por fim, a soma dos quatro retículos foi 

multiplicada pelo fator de cálculo para expressar o total de células por microlitro. Os dados 

foram obtidos em termos de quantidade de leucócitos totais. 

 

3.6.2 Avaliação da contagem diferencial de leucócitos 

A contagem diferencial ou específica é feita em esfregaço sanguíneo, com a finalidade 

de contar, em valores percentuais, as várias células da série branca (linfócitos, neutrófilos, 

eosinófilos e monócitos, principalmente) circulantes no sangue periférico (VALLE, 2001).  

Para a realização da análise citométrica, esfregaços sanguíneos foram obtidos a partir 

da coleta do sangue após a eutanásia dos grupos. Depois da secagem, as lâminas foram 

fixadas em metanol por cinco minutos e coradas com Wright/Giemsa. A análise foi feita em 

microscopia de luz (aumento de 100x) possibilitando, assim, a distinção do tipo celular 

sanguíneo (linfócitos, neutrófilos, eosinófilos e monócitos) e suas possíveis alterações. Foram 

contadas 500 células por animal e os dados foram expressos em porcentagem de cada tipo 

celular em relação ao total da série leucocitária. 

  

 

 

 

 



42 

 

 

3.7 Análises estatísticas 

A partir das imagens obtidas em microscopia de luz por meio do Sistema Digital de 

Análise de Imagens, foram efetuadas avaliações quantitativas dos diferentes ensaios. 

A análise exploratória e tratamento estatístico dos dados foram realizados em planilhas 

e gráficos do software GraphPad Prism versão 5.01 (Software Inc., 1992-2007). Para a 

comprovação da significância dos resultados, foram utilizados os testes Anova – análise de 

variância de fator único, por meio de combinação entre dois fatores – e, quando havia 

significância, eram seguidos do teste de Tukey para comparações múltiplas. O nível de 

significância adotado foi de 5% (p  0,05). 

 

4. RESULTADOS 

4.1 Caracterização das nanopartículas magnéticas de ferro 

O fluido utilizado neste trabalho, sintetizado no Instituto de Química da UFG, foi 

desenvolvido à base de nanopartículas de maguemita (γ-Fe2O3), sendo que a microscopia 

eletrônica de transmissão (MET) mostrou que as nanopartículas de óxido de ferro sem a 

camada de revestimento apresentam morfologia esférica, mesmo estando aglomeradas, já que 

se tratam de nanopartículas magnetizadas. Também se pôde atestar que se apresentam com 

10nm de diâmetro nestas condições, corroborando o perfil nanoestrutural das partículas 

sintetizadas (Figura 3 A). Por difração de raio-X, a distribuição lognormal dos diâmetros 

mostrou que as nanopartículas da amostra possuem diâmetro modal de aproximadamente 

8nm. 

Como não é possível funcionalizar com polifosfato cada maguemita individualmente, 

são funcionalizados agregados de nanopartículas e, a partir daí, o diâmetro hidrodinâmico, 

que representa o diâmetro médio dos agregados, foi obtido apresentando-se em uma 

distribuição gaussiana com polidispersão de tamanho (Figura 3 B), que girou em torno de 

80,58nm (± 4,14). 

 



43 

 

 

 
Figura 3. (A) Fotomicrografia eletrônica proveniente de análise de MET, mostrando 

nanopartículas magnéticas de óxido de ferro da amostra de FFM sem revestimento. Escala: 

100nm. (B) Histograma dos diâmetros das nanopartículas revestidas por polifosfato da 

amostra de FFM, obtidos por espalhamento dinâmico de luz. 

 

A polidispersão é um parâmetro calculado a partir da análise da função de 

autocorrelação em medições por espalhamento de luz. Nesta análise, assume-se que todas as 

nanopartículas possuem o mesmo tamanho e um ajuste exponencial simples é aplicado a esta 

função anterior. Então, o índice de polidispersão (PdI) mediu a uniformidade do tamanho das 

nanopartículas e mostrou o quanto seu tamanho desviou da faixa mais frequente de tamanho, 

verificando o grau de homo ou heterogeneidade da amostra. A maior uniformidade do fluido 

ferromagnético depende de um menor PdI. Dessa forma, foi obtido o valor de 0,193 (± 0,01) 

que se encaixa nos padrões aceitáveis de um lote homogêneo de nanopartículas. 

Além disso, foi obtido o potencial zeta das amostras em meio aquoso de -43,4mV (± 

3,55), valor que é influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão 

da dissociação de grupos funcionais na superfície. Tal valor foi considerado adequado para 

manter o sistema sem agregação e precipitação das nanoestrutras, devido à repulsão 

eletrostática que as nanopartículas apresentam resultante da densidade de carga de superfície. 

Partículas com alto potencial zeta e mesmo sinal de carga, tanto positivo quanto negativo, irão 

se repelir. Então, quanto maior o valor do potencial zeta em módulo, mais estável se torna a 

suspensão diminuindo a probabilidade de formação de agregados, que foi o caso do fluido 

sintetizado. 

Quando um campo elétrico é aplicado através de eletrodos, as partículas carregadas 

suspensas no eletrólito são atraídas para o eletrodo de carga oposta. A mobilidade elétrica 

representa, então, a habilidade de partículas carregadas de mover-se através de um meio em 

resposta a um campo elétrico que as está puxando. Portanto, quanto maior a capacidade de se 



44 

 

 

mover neste ambiente (expresso por valores próximos a zero), mais magnética a amostra. No 

presente estudo, foi obtido o valor de -0,4µcm/V.s (±0,05), que se adequa a uma 

nanopartícula de qualidade.  

Por fim, foram adquiridos os valores de condutividade, demonstrando que quanto 

maior carga de superfície, melhor condutividade e menor a resistividade. Sendo assim, o valor 

de condutância de 0,05mS/cm (± 0,003) reflete a presença de uma boa amostra quanto a estes 

parâmetros 

 

4.2 Métodos de avaliação da internalização e citotoxicidade das nanopartículas 

magnéticas de ferro in vitro 

4.2.1 Análise da morfologia da linhagem celular UM-SCC14A pós-incubação com 

o FFM 

Depois de verificados padrões aceitáveis para utilização destas nanopartículas, tais 

como tamanho, formato ultraestrutural, natureza, revestimento e carga de superfície, foi 

iniciada a experimentação in vitro na linhagem celular de câncer UM-SCC14A. As células 

foram transferidas para as placas de microtitulação e incubadas com o FFM, de acordo com o 

item 3.3. Posteriormente, foi realizada a coloração HE, descrita no item 3.4.1. 

 No controle do experimento, no qual as células não foram incubadas com 

nanopartículas, pôde-se observar expansão da linhagem celular de acordo com os padrões de 

proliferação de células tumorais, fato verificado pela sua morfologia característica inalterada, 

pelas divisões celulares recorrentes e pelo processo apoptótico verificado principalmente em 

casos de elevado contato célula-célula, ocorrência bastante comum em células cancerígenas já 

que as mesmas não respondem aos sinais de regulação para cessar seu crescimento e divisão 

celular (Figura 4 A, B e C). Nas células incubadas com nanopartículas, nas diferentes 

concentrações (0,35; 0,7 e 1,4x1015 partículas/mL), foram notadas algumas diferenças 

morfológicas, principalmente nas células expostas à maior concentração de FFM (Figuras 4 J-

L).  

Nas células incubadas com 0,35x1015 partículas/mL (Figura 4 D, E e F), a maior parte 

da linhagem permaneceu se dividindo e morrendo de forma semelhante ao controle, apesar da 

presença das nanopartículas, sendo que algumas células apresentaram alterações morfológicas 

e de desenvolvimento, como mitoses irregulares e atípicas (Figura 4 D). Neste caso, foi 

verificada a presença de células multinucleadas e bastante vacuoladas (Figura 4 D e F), que 

não mantêm um desenvolvimento similar às demais células desta linhagem, tornando-se 

maiores e apresentando um marcado caráter proliferativo diferente do demonstrado pelas 



45 

 

 

demais. Nas células incubadas com a concentração intermediária de nanopartículas, de 

0,7x1015 partículas/mL (Figura 4 G, H e I), observou-se morfologia semelhante àquela 

apresentada pelas células expostas à menor concentração de FFM. 

Por fim, nas células incubadas com a concentração de 1,4x1015 partículas/mL, foi 

averiguada a presença de grandes alterações morfológicas, como vesículas hipercromáticas e 

membranas plasmáticas com projeções disformes, culminando na formação de corpos 

apoptóticos (Figura 4 J e K), além de aglomerados de células (Figura 4 L). Esse fato pode ser 

explicado devido à elevada quantidade de FFM a que as células foram expostas e que, 

consequentemente, tornaram o meio tóxico e impediram que a maior parte das nanopartículas 

fosse internalizada, excedendo sua capacidade de absorção e aumentando as alterações que 

refletem tal toxicidade. 

Esta análise demonstrou que o aumento da quantidade de nanopartículas disponíveis 

no meio de cultura foi diretamente proporcional à quantidade de alterações morfológicas 

observadas. 

 

 

 



46 

 

 

 
Figura 4. Imagens de microscopia de luz da linhagem celular de carcinoma escamoso oral 

UM-SCC14A, corada com HE, (A, B e C) na ausência de nanopartículas magnéticas de ferro 

e incubada na presença de maguemitas na concentração de (D, E e F) 0,35; (G, H e I) 0,7 e (J, 

K e L) 1,4x1015 partículas/mL de FFM. Escala: 10µm. Setas vermelhas: células em processo 

de mitose. Setas pretas: células em processo apoptótico. Setas verdes: vesículas 

hipercromáticas e alterações do contorno celular. 

 

4.2.2 Verificação de alterações ultraestruturais na linhagem UM-SCC14A e 

análise da internalização das nanopartículas por microscopia eletrônica de transmissão 

As células UM-SCC14A variaram ligeiramente suas formas, volumes e quantidades de 

nucléolos (Figura 5 A e D), quando incubadas ou não com FFM na concentração de 0,7x1015 

partículas/mL. Uma feição proeminente, observada em muitas células, foram projeções 

digitiformes da membrana plasmática, como microvilos (Figura 5 B e E).  

Como a atividade mitótica da linhagem era alta, foi possível identificar células que 

mostraram no citoplasma extenso complemento de organelas citoplasmáticas, principalmente 



47 

 

 

mitocôndrias e vacúolos. Aliada a essa abundância de organelas, a natureza neoplásica destas 

células também foi atestada pela grande quantidade de núcleos e de nucléolos.  

Várias células apresentaram grandes vacúolos digestivos eletrolucentes, de variados 

tamanhos no citoplasma, redondos ou ovalados. Alguns pareciam cisternas dilatadas do 

retículo endoplasmático liso (Figura 5 F) na forma de canais tortuosos e de diâmetro irregular. 

Além disso, o complexo de Golgi (Figura 5 C) foi repetidamente observado, bem como o 

elevado contato célula-célula, característico do crescimento e alta proliferação da UM-

SCC14A. 

A abundância de citoplasma encontrada em todas as células, riqueza de mitocôndrias e 

microvilos na superfície dão idéia da intensa atividade metabólica destas células cancerosas e 

permitem supor que haveria internalização eficiente das nanopartículas magnéticas de óxido 

de ferro revestidas por polifosfato neste tipo celular (Figura 5 D, E e F), já que poderiam 

endocitar ou fagocitar diferentes compostos biocompatíveis que estivessem disponíveis no 

meio de cultura. 

Dessa forma, foi inferida a presença destas nanopartículas no interior celular em 

vesículas, provavelmente endocíticas ou mesmo fagolisossomos, as quais possibilitaram a 

entrada do FFM e que o encaminhava para sua degradação. Tais vesículas eram ora 

eletrolúcidas (vacúolos autofágicos) ora eletrodensas (endossomos). Isso confirmou que as 

céluas UM-SCC14A são capazes de internalizar este FFM e que o procedimento foi bem 

sucedido, não demonstrando diferenças ultraestruturais extremas entre as células incubadas 

com as nanopartículas quando comparadas ao controle. 

http://anatpat.unicamp.br/nptglioblastoma8f.html#re


48 

 

 

 
Figura 5. Microscopia eletrônica de transmissão da linhagem celular UM-SCC14A, das 

células controle (A, B e C) na ausência de nanopartículas magnéticas de ferro e quando 

incubadas na presença de (D, E e F) 0,7x1015 partículas/mL de FFM, sob aumento variando 

de 6000 a 27800x. Escala: 500nm. Setas pretas: indicam nanopartículas internalizadas em 

vesículas eletrolúcidas ou eletrodensas no citoplasma. Setas vermelhas: projeções da 

membrana plasmática. CG: complexo de Golgi. End: endossomo eletrodenso. Mi: 

mitocôndria. N: núcleo. Nu: nucléolo. V: vacúolo autofágico eletrolúcido.  

 



49 

 

 

4.2.3 Ensaio de apoptose 

Depois da transferência das células para as placas de microtitulação e realização da 

metodologia dos itens 3.3 e 3.4.3, a linhagem foi avaliada quanto ao seu perfil de morte 

celular quando incubadas com diferentes concentrações de nanopatículas, a fim de distinguir 

se houve diminuição da atividade metabólica ou no número de células. Por meio desta 

técnica, foi possível verificar que as células apoptóticas concentram o corante Laranja de 

acridina e, dessa forma, possibilitam a confirmação dos locais onde ocorreu processo 

apoptótico. 

Apesar de não terem sido administradas nanopartículas magnéticas de ferro às células 

referentes ao controle, também foi observada apoptose neste caso, já que se trata de um 

processo fisiológico (Figura 6 A, B e C). Além de evidenciarem células em crescimento 

semelhante ao controle, a linhagem incubada com diferentes concentrações de FFM 

demonstrou mudanças morfológicas como presença de célul