GEORGEA MARIA DOMINGOS CARACTERIZAÇÃO DE RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS DE COUVE-DE-FOLHAS Brassica oleracea (L.) VAR. acephala A Bemisia tabaci BIÓTIPO B (HEMIPTERA: ALEYRODIDAE) Botucatu 2017 3I GEORGEA MARIA DOMINGOS CARACTERIZAÇÃO DE RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS DE COUVE-DE-FOLHAS Brassica oleracea (L.) VAR. acephala A Bemisia tabaci BIÓTIPO B (HEMIPTERA: ALEYRODIDAE) Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Agronomia (Proteção de Plantas) Orientador: Prof. Dr. Edson Luiz Lopes Baldin Botucatu 2017 5I IIII OFEREÇO A Deus e Nossa Senhora Aparecida, pelos dons recebidos, por me guiarem e iluminarem meus passos; pela força de seguir em frente e sabedoria para a concretização desta etapa da minha vida. DEDICO Aos meus amados pais, Maria Antonia e João Francisco, por todo o incentivo, confiança e pelo exemplo de vida. Desejo ter sido merecedora do esforço realizado por vocês em todos os aspectos, especialmente quanto à minha formação. Aos meus tios e primos, por todo o carinho e incentivo. Ao meu namorado Rafael, por todo amor, cumplicidade, paciência e apoio em todos os momentos. Meu lugar preferido é dentro do seu abraço. Amo vocês! VI AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Edson Luiz Lopes Baldin, pela orientação, incentivo, amizade e valiosos ensinamentos no decorrer do mestrado. À Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu, em especial ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia - Proteção de Plantas, pela oportunidade. À Coordenadoria de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos. A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Agronomia - Proteção de Plantas, pelos ensinamentos transmitidos e por contribuírem para o meu crescimento pessoal e profissional. Ao Prof. Dr. André Luiz Lourenção, pelo fornecimento dos genótipos avaliados e colaboração no decorrer deste trabalho. Aos funcionários da biblioteca da UNESP/FCA e às funcionárias da Seção de Pós-Graduação da UNESP/FCA, pelo auxílio e atenção durante o mestrado, em especial Maísa, Ana e Taynan. Ao Prof. Dr. Ângelo Pedro Jacomino, ao técnico de laboratório Marcos José Trevisan e à estagiária Marina Gugliotta Veras de Araújo, do Laboratório de Pós- Colheita, do Departamento de Produção Vegetal, ESALQ/USP, pela disponibilidade e auxílio nas análises colorimétricas. Ao Nivaldo, Adriana, Luciana, Maria, Sr. Domingos, Paulinho e Pereira, funcionários do Departamento de Proteção Vegetal, pela amizade e disponibilidade sempre que foram solicitados. Aos amigos do Laboratório de Resistência de Plantas a Insetos e Plantas Inseticidas (LARESPI), Ana Flávia Godoy, Camila Moreira, Ivana Fernandes da Silva, José Paulo Franco Bentivenha (Kuti), Luiz Eduardo da Rocha Panutti (Meia), Mariane Coelho, Nádia Maebara Bueno, Thiago Fanela (Flanela), Rafaela Morando, Thais Braga e Vinícius Fernandes Canassa (Sem-Sintoma) pelo convívio, momentos de descontração e auxílio em várias etapas da pesquisa. Ao Vinícius Fernandes Canassa (Sem-Sintoma), pela amizade e auxílio na formação de mudas de couve. À Ivana Fernandes e Mariane Coelho, pela amizade e auxílio nas avaliações. Aos estagiários Thaís Peres, Sara Kuchta e William Dias, pelo importante auxílio nas avaliações e momentos de descontração. Aos estagiários Matheus Sacilotto (Leilão), Luiz Felipe Bastos (Pialo) e Samuel Filho (Barbela), pelo auxílio na preparação e manutenção dos vasos para os ensaios. À Ana Flávia Godoy, Camila Moreira, Ivana Fernandes, Mariane Coelho, Nádia Maebara Bueno, Rafaela Morando e Thais Braga, por terem em algum momento representado minha família em Botucatu. Aos colegas do Departamento de Proteção Vegetal, pela amizade e descontração sempre que possível. À Tais Dadazio, pela amizade e companheirismo. Ao Grupo de Oração Sagrada Família, pela acolhida e por me colocarem mais perto de Deus. À família do Rafael, em especial seus pais, Sérgio e Gilmara, e seus avós, Norival e Alvarina, por todo apoio, carinho, orações e marmitas e à tia Lurdes, pela confecção das gaiolas para os ensaios. À Dra. Niurka Rabelo e Dr. José Ramón Hernández Puerto, pela amizade, incentivo e apoio. A todos meus amigos de Torrinha-SP e Bandeirantes-PR, pelos momentos de descontração aos finais de semana e longas conversas; vocês serão sempre parte das minhas vitórias. A todos que contribuíram para realização deste trabalho, muito obrigada! VIII RESUMO A couve-de-folhas, Brassica oleracea (L.) var. acephala, de grande importância nutricional para a alimentação humana, sofre limitação de seu cultivo pelo ataque de insetos-praga como a mosca-branca, Bemisia tabaci biótipo B (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae), que ocasiona danos diretos e indiretos às plantas, podendo comprometer a produtividade no campo. O controle químico é o método mais utilizado para o manejo deste inseto, porém, características como elevado potencial reprodutivo, capacidade de adaptação a condições adversas e grande número de hospedeiros fazem com que o método químico não atinja a eficiência desejada. Em razão disto, métodos alternativos como o uso de plantas resistentes é considerado uma estratégia com reconhecida eficiência no manejo integrado de pragas (MIP). Neste trabalho, 32 genótipos de couve-de-folhas foram avaliados sob o ataque de B. tabaci biótipo B, visando caracterizar possíveis tipos de resistência (antixenose e antibiose) contra este inseto. Numa primeira etapa, foram realizados ensaios de antixenose (com e sem chance de escolha) a fim de avaliar a colonização e a oviposição nos diferentes materiais. Nesse mesmo estudo a coloração das folhas foi também determinada, visando estabelecer correlações. Posteriormente, foi realizado ensaio de desempenho biológico, com 13 genótipos mais promissores (primeira etapa) a fim de caracterizar a ocorrência de antibiose. Com base nos resultados obtidos, os genótipos HS-20, OE e VA foram os menos atrativos aos adultos da mosca-branca, indicando expressão de antixenose a esse inseto. Os genótipos VE e J revelaram-se os menos ovipositados tanto em ensaio de livre escolha como em ausência de escolha. Os genótipos P1C, MG, LG prolongaram o ciclo da mosca- branca, indicando a expressão de antibiose e/ou antixenose contra B. tabaci biótipo B. MOP, IMAN W e VE destacaram-se com os menores índices de viabilidade ninfal, também indicando a ocorrência dessa categoria de resistência. Os dados obtidos neste estudo podem ser úteis aos programas de melhoramento genético focando o desenvolvimento de brássicas resistentes a B. tabaci biótipo B. Palavras-chave: Brassicaceae, mosca-branca, resistência de plantas a insetos, antixenose, antibiose, colorimetria. IXI ABSTRACT Collard green, Brassica oleracea (L.) var. acephala, which is of great nutritional importance for human consumption, is endangered by the attack of insect pests such as the whitefly, Bemisia tabaci biotype B (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae), which causes direct and indirect damages to plants, and may compromise productivity in the field. The chemical control is the most used method for the management of this insect, however, characteristics such as high reproductive potential, adaptability to adverse conditions and large number of hosts cause the chemical method does not achieve the desired efficiency. Because of this, alternative methods such as the use of resistant plants is considered a strategy with recognized efficiency in integrated pest management (IPM). In this work, 32 genotypes of leaf collard green were evaluated under the attack of B. tabaci biotype B, aiming to characterize possible types of resistance (antioxenose and antibiosis) against this insect. In a first step, antixenosis tests were performed (with and without a choice) in order to evaluate the colonization and oviposition in the different materials. In this same study, the leaf color was also determined, aiming to establish correlations. Subsequently, a biological performance test was performed, with 13 more promising genotypes (first stage) in order to characterize the occurrence of antibiosis. Based on the results obtained, genotypes HS-20, OE and VA were the least attractive to adults of the whitefly, indicating expression of antixenosis to this insect. The VE and J genotypes were the least oviposited both in the free choice and the absence of choice assays. The genotypes P1C, MG, LG prolonged the whitefly cycle, indicating the expression of antibiosis and/or antixenosis against B. tabaci biotype B. MOP, IMAN W and VE stood out with the lowest rates of nymphal viability, also indicating the occurrence of this category of resistance. The data obtained in this study may be useful for breeding programs focusing on the development of brassicas resistant to B. tabaci biotype B. Keywords: Brassicaceae, whitefly, plant resistance to insects, antixenosis, antibiosis, colorimetry. XII LISTA DE TABELAS CAPÍTULO I – Resistência de genótipos de couve-de-folhas a Bemisia tabaci biótipo B: caracterização de antixenose Tabela 1 – Fonte, nome, respectivo código e principais características dos genótipos de couve-de-folhas avaliados.......................................... 41 Tabela 2 – Médias (±EP) de insetos atraídos e ovos/cm² depositados por Bemisia tabaci biótipo B em genótipos de couve-de-folhas, em ensaio com chance de escolha........................................................ 42 Tabela 3 – Médias (±EP) de parâmetros colorimétricos obtidos a partir da face superior de folhas de genótipos de couve....................................... 43 Tabela 4 – Médias (±EP) do número de ovos/cm² de Bemisia tabaci biótipo B, em ensaio sem chance de escolha, em casa de vegetação............ 44 CAPÍTULO II – Efeitos de diferentes genótipos de couve-de-folhas sobre a performance de Bemisia tabaci biótipo B (Hemiptera: Aleyrodidae) Tabela 1 – Nome, código e características das folhas dos genótipos de couve-de-folhas avaliados para resistência a Bemisia tabaci biótipo B.......................................................................................... 61 Tabela 2 – Médias (±EP) de duração de período de incubação, estágios ninfais e período ninfal de Bemisia tabaci biótipo B em genótipos de couve-de-folhas, sob condições de laboratório (26 ± 2°C; 60 ± 10% U.R.; fotoperíodo de 12:12 L:E)............................................... 62 Tabela 3 – Médias (±EP) de viabilidade ninfal de Bemisia tabaci biótipo B em genótipos de couve-de-folhas, sob condições de laboratório (26 ± 2°C; 60 ± 10% U.R.; fotoperíodo de 12:12 L:E)................................ 63 XIIII SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL............................................................................... 17 CAPÍTULO 1 – Resistência de genótipos de couve-de-folhas a Bemisia tabaci biótipo B: caracterização de antixenose Resumo....................................................................................................... 24 Abstract....................................................................................................... 25 1.1 Introdução................................................................................................... 26 1.2 Material e métodos...................................................................................... 27 1.3 Resultados e discussão............................................................................... 30 Agradecimentos........................................................................................... 34 Referências. ............................................................................................... 34 CAPÍTULO 2 – Efeitos de diferentes genótipos de couve-de-folhas sobre a performance de Bemisia tabaci biótipo B (Hemiptera: Aleyrodidae) Resumo....................................................................................................... 45 Abstract....................................................................................................... 46 2.1 Introdução.................................................................................................... 47 2.2 Material e Métodos...................................................................................... 48 2.3 Resultados................................................................................................... 50 2.4 Discussão.................................................................................................... 52 Agradecimentos........................................................................................... 55 Referências citadas..................................................................................... 55 CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................ 66 CONCLUSÕES........................................................................................... 67 REFERÊNCIAS........................................................................................... 68 17 INTRODUÇÃO GERAL Brassicaceae é uma importante família botânica que abrange várias espécies de hortaliças de grande valor econômico, social e nutricional, tais como o repolho [Brassica oleracea (L.) var. capitata], a couve-de-folhas ou couve-manteiga [B. oleracea (L.) var. acephala], a couve-flor [B. oleracea (L.) var. botrytis], o brócolis [B. oleracea (L.) var. italica Plenck] e a couve-chinesa [B. pekinensis (L.)]. Além destas, existem várias outras espécies hortícolas e/ou oleaginosas tais como a rúcula [Eruca sativa (L.)], o repolho-chinês [Brassica campestris (L.) var. chinensis Makino], a couve- rabano [B. olaracea (L.) var. gongylodes], o nabo-comprido [B. rapa (L.) var. rapa], o rabanete [Raphanus sativus (L.)], a mostarda-de-folha [B. juncea (L.)], entre outras (FILGUEIRA, 2008). Esta família botânica possui ainda diversas espécies que atuam como invasoras, dificultando cultivos de hortaliças. São elas, a mostarda-dos-campos [Sinapis arvensis (L.)], a nabiça-roxa [Raphanus sativus (L.)], o nabo-forrageiro [R. sativus (L.) var. oleiferus Metzg.], entre outras (LORENZI, 2006). A planta de couve-de-folhas [B. oleracea (L.) var. acephala] apresenta porte ereto, que sustenta a planta e emite folhas novas. Por não apresentar formação de “cabeça”, suas folhas distribuem-se em forma de roseta, em torno do caule. A propagação é feita através dos rebentos laterais, que são emitidos em grande número nos clones. Trata-se de uma planta rústica, em comparação quanto às demais espécies de Brassicaceae, inclusive quanto às exigências nutricionais, sendo capaz de fornecer folhas próprias para o consumo o ano todo (FILGUEIRA, 2008). A couve-de-folhas destaca-se entre as hortícolas como um importante alimento para a alimentação humana, pois é rica em vitaminas e minerais, sendo muito utilizada em forma de salada ou refogada (FRANCO, 1960). Com base nos dados obtidos no ano de 2014, a área equivalente ao plantio de couve-de-folhas no Brasil foi de 1.299,70 hectares, com ligeiro crescimento em 2015, passando para 1.383 hectares cultivados (ANUÁRIO BRASILEIRO DE HORTALIÇAS, 2016). Até meados de 2016, foram comercializadas cerca de 5.231 toneladas desta hortaliça (AGRIANUAL, 2016). As diversas espécies de hortaliças da família Brassicaceae tornaram-se motivo de estudo, devido à sua influência na alimentação humana, seja pela fração consumida, pelo alto valor nutricional ou por sua elevada produtividade. Atualmente, os 18 consumidores estão mais conscientes da necessidade do consumo de nutrientes presentes nas plantas, com enormes benefícios à saúde, o que aumenta a exigência por produtos de melhor qualidade (CARTEA et al., 2011). Entretanto, uma das importantes limitações do cultivo deste grupo de hortaliças tem sido o ataque de agentes bióticos, como insetos-praga e patógenos. Entre os insetos-praga, se destaca a mosca-branca Bemisia tabaci biótipo B (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae), que ocasiona danos diretos e indiretos às plantas, podendo comprometer a produtividade no campo (VILLAS BÔAS, 2005). Moscas-brancas são hemípteros pertencentes à subordem Sternorrhyncha e família Aleyrodidae (GALLO et al., 2002), que se encontram distribuidos em 161 gêneros, com mais de 1500 espécies descritas (MARTIN; MOUND, 2007). Esta família é dividida entre as subfamílias Aleyrodicinae e Aleyrodinae (INBAR; GERLING, 2008). Aleyrodinae tem Bemisia como o principal gênero, sendo este considerado o mais prejudicial, distribuído e estudado no mundo (HAJI et al., 2004). Bemisia tabaci foi descrita pela primeira vez como Aleurodes tabaci (Genn.) em plantas de fumo na Grécia, no ano de 1889, sendo provavelmente originária do Oriente (GENNADIUS, 1889). No novo mundo, os primeiros exemplos de B. tabaci foram coletados em plantas de batata-doce nos Estados Unidos da América. Entre 1926 e 1981, B. tabaci foi reportada como praga esporádica, mas passou a ser considerada o vetor mais importante de vírus para plantas em regiões tropicais, subtropicais e temperadas com invernos mais amenos (BROWN et al., 1995). À partir da introdução do biótipo B no início da década de 1980, B. tabaci dispersou-se por todo o mundo e passou a ser considerada praga-chave para inúmeras culturas de interesse economico (COSTA et al., 1993). No Brasil, acredita-se que o biótipo B de mosca-branca tenha sido introduzido através de importações da planta ornamental poinsétia ou bico-de-papagaio (Euphorbia pulcherrima Willd), sendo registrada no Estado de São Paulo no ano de 1990 (LOURENÇÃO; NAGAI, 1994). Em 1993, o inseto foi reportado no Distrito Federal (FRANÇA et al., 1996), e posteriormente, se dispersou para todas as áreas agrícolas do país (LOURENÇÃO et al., 2011). A mosca-branca é um inseto de porte pequeno, cujos adultos medem aproximadamente de 1 a 2 mm de comprimento, sendo as fêmeas maiores que os machos (EICHELKRAUT; CARDONA, 1989). Os dois pares de asas são membranosos, cobertos por uma substância pulverulenta esbranquiçada. Em 19 repouso, as asas são mantidas separadas, deixando o abdome visível. Adultos e ninfas possuem aparelho bucal do tipo picador sugador (LACERDA; CARVALHO, 2008). Bemisia tabaci apresenta metamorfose incompleta, passando pelas fases de ovo, quatro estádios ninfais e adulto, durante o seu ciclo de desenvolvimento (EICHELKRAUT; CARDONA, 1989). A reprodução das moscas-brancas ocorre por partenogênese arrenótoca, originando machos de ovos não-fertilizados e fêmeas de ovos fertilizados (BYRNE; BELLOWS, 1991). As ninfas de primeiro instar são transparentes e móveis, e se locomovem sobre a folha, possibilitando a escolha de local para fixação e desenvolvimento (EICHELKRAUT; CARDONA, 1989; SUMMERS et al., 1996). No segundo e terceiro instares, as ninfas permanecem fixas nas plantas, uma vez que suas antenas e pernas são atrofiadas (BYRNE; BELLOWS, 1991; SALGUERO, 1993; GERLING et al., 2001). O quarto instar, erroneamente denominado pupa, é caracterizado pelo amarelecimento da ninfa e aparecimento de olhos avermelhados. A emergência do adulto ocorre por meio de uma ruptura em forma de “T” invertido na região ântero- dorsal da ninfa de último estádio (HAJI et al., 2005; BORROR; DeLONG, 2011). Geralmente, a identificação de espécies de mosca-branca é feita através do pupário (exoesqueleto da ninfa de quarto instar), podendo variar em estrutura, dependendo do tamanho e da presença ou ausência de tricomas nas folhas da planta hospedeira. Devido ao reduzido tamanho dos adultos, sua identificação morfológica é difícil (OLIVEIRA, 2001) e as ferramentas moleculares são as mais utilizadas atualmente para esta finalidade. O biótipo B diferencia-se no quarto ínstar ninfal pela ausência de uma seta submarginal disposta anteriormente na região dorsal, encontrada em ninfas de B. tabaci (BYRNE; BELLOWS, 1991). Outra diferença pode ser observada com relação às projeções cerosas marginais das dobras traqueais torácicas posteriores, que são estreitas no biótipo B, e se caracterizam por filamentos cerosos curtos e frágeis. As elevadas populações e agilidade de dispersão de B. tabaci biótipo B devem- se, basicamente à fecundidade, duração do ciclo biológico, razão sexual (HAJI et al., 2000), alta taxa de oviposição (LOURENÇÃO; NAGAI, 1994), facilidade de adaptação a novos hospedeiros e variações climáticas (VILAS BOAS et al., 1997), além da rápida seleção de indivíduos resistentes à maioria dos ingredientes ativos utilizados em seu manejo (PRABHAKER et al., 1999). 20 Nos processos de interação inseto-planta, estímulos reconhecidos pelos órgãos sensoriais do inseto o levam a reconhecer a planta como potencial hospedeiro e assim utilizá-la para se alimentar e/ou ovipositar. Adultos de B. tabaci são atraídos para superfícies que refletem comprimentos de onda de luz azul, verde e amarela (faixa de 400 a 700 nm) (BERLINGER, 1980; COOMBE, 1982). De acordo com Mound (1962), o azul induz o comportamento migratório do inseto, enquanto que o amarelo induz o comportamento de colonização sobre o hospedeiro. Assim, alguns autores estudaram a relação da cor da folha de diversas culturas com relação à atratividade e oviposição de moscas-brancas, como por exemplo, em melão (COELHO et al., 2009), pimentão, berinjela e abóbora (MOREAU; ISMAN, 2011), algodão (PRADO et al., 2015), berinjela (HASANUZZAMAN et al., 2016), entre outros. A duração do ciclo de vida da mosca-branca pode variar conforme as condições ambientais; no entanto, a temperatura é um dos fatores mais determinantes (LACERDA; CARVALHO, 2008). O ciclo de B. tabaci pode durar de 19 dias a 32ºC, podendo chegar até 73 dias sob 15ºC (SALGUERO, 1993). Em condições favoráveis, o biótipo B dessa mosca-branca pode apresentar de 11 a 15 gerações ao ano e cada fêmea pode depositar de 100 a 300 ovos durante o seu ciclo de vida (BROWN; BIRD, 1992). O hospedeiro também influencia no período de desenvolvimento de ovo a adulto de B. tabaci biótipo B, sendo este mais curto em soja, repolho, feijão-caupi, melão (17 a 22 dias) e mais longo em tomate, mandioca e poinsétia (25 a 27 dias) (VILLAS BÔAS et al., 1997; LIMA; LARA, 2004; BALDIN et al., 2005; BALDIN et al., 2012; SILVA et al., 2012; CRUZ et al., 2014; CRUZ; BALDIN, 2016). Os danos provocados por B. tabaci podem ser diretos, quando o inseto suga a seiva das plantas e devido à injeção de toxinas contidas na saliva, ocorrem alterações em seu desenvolvimento vegetativo e reprodutivo, podendo resultar em alguns sintomas como prateamento das folhas em cucurbitáceas e branqueamento do caule em brássicas; ou indiretos, quando estão relacionados à excreção de substâncias açucaradas (honeydew), que recobrem as folhas, servindo como substrato para o desenvolvimento de fungos (Capnodium sp.), resultando na formação da fumagina. Nesse caso, a fotossíntese é afetada, podendo provocar redução na produção e até mesmo a morte das plantas, principalmente quando a densidade populacional da praga se encontra elevada (GALLO et al., 2002; HAJI et al., 2004; VILLAS BÔAS, 2005). Em adição, a mosca-branca atua como vetora de importantes vírus letais para 21 inúmeras plantas de interesse agrícola (JONES, 2003; MARUBAYASHI et al., 2010; NAVAS-CASTILLO et al., 2011; POLSTON et al., 2014). Com base no exposto acima, mosca-branca é considerada uma das principais pragas da agricultura mundial (MOUND; HALSEY, 1978; BROWN, 1994; OLIVEIRA, 2001) e seu manejo e controle são um desafio para pesquisadores e produtores (PRABHAKER et al., 1999; VILLAS BÔAS et al., 1997). O método mais utilizado no manejo de populações de mosca-branca ainda é o controle químico, através de pulverização com inseticidas. Entretanto, características como elevado potencial reprodutivo, capacidade de adaptação a condições adversas e grande número de hospedeiros fazem com que essa medida não atinja a eficiência desejada (JONES, 2003; BERRY, 2004; MUSA; REN, 2005). Em adição, vale ressaltar que o uso indiscriminado de inseticidas sintéticos inviabiliza a adoção de outras táticas de manejo, onera os custos de produção, causa desequilíbrio ao meio ambiente, além de permitir a rápida seleção de indivíduos resistentes aos inseticidas (BYRNE et al., 2003; PRABHAKER et al., 2005; SILVA et al., 2009). Dentre os métodos alternativos em relação ao manejo químico, o uso de plantas resistentes é considerado uma estratégia com reconhecida eficiência no manejo integrado de pragas (MIP) (SMITH, 2005). Essa tática pode ser utilizada em conjunto com outros métodos de controle e age na redução das populações dos insetos, limitando-as a níveis que não causem danos econômicos. Além disso, não causa desequilíbrio ecológico; não polui o meio ambiente e tem efeito cumulativo sobre a população da praga (LARA, 1991; VENDRAMIM; GUZZO, 2009). Segundo Painter (1951), planta resistente é aquela que, em condições semelhantes de infestação por um inseto-praga, é menos danificada que as demais, devido a sua constituição genotípica. De acordo com este mesmo autor, a resistência de plantas é dividida em três grupos: antixenose, antibiose e tolerância. A antixenose ocorre devido a presença de fatores químicos ou morfológicos na planta que afetam negativamente o comportamento do inseto durante o processo de alimentação, oviposição ou procura por abrigo. Geralmente é causada por fatores morfológicos da planta, como arquitetura, tricomas, coloração de estruturas ou presença de aleloquímicos (LARA, 1991; VENDRAMIM; GUZZO, 2009). A antibiose ocorre quando um inseto se alimenta normalmente da planta, porém esta passa a exercer um papel negativo sobre seu desenvolvimento biológico. Elevadas taxas de mortalidade durante as fases jovens, reduções do porte dos indivíduos e fecundidade, além de alterações 22 do tempo de vida e proporção sexual dos insetos são exemplos da expressão de resistência por antibiose sobre insetos (KOGAN, 1975; PANDA, 1979; LARA, 1991; VENDRAMIM; GUZZO, 2009). Na tolerância a planta sofre o ataque do inseto, porém apresenta a habilidade de se recuperar da injúria sofrida, sem comprometimento de performance biológica do inseto e sem causar efeito negativo sobre o seu comportamento (LARA, 1991). As plantas vêm desenvolvendo mecanismos de resistência através dos processos evolutivos, os quais interferem no ataque do inseto à planta. Lara (1991) dividiu estes mecanismos ou causas em três tipos: físicos, químicos e morfológicos. As causas físicas são representadas pelas cores do substrato e podem afetar a seleção hospedeira, a preferência para alimentação e a oviposição. As causas químicas são representadas por substâncias químicas que, quando ingeridas, irão atuar no metabolismo do inseto, através de compostos tóxicos, inibidores enzimáticos e reprodutivos, podendo afetar a biologia, desenvolvimento e reprodução deste. A ação destes compostos adversos é frequentemente verificada em materiais portadores de antibiose. As causas morfológicas podem ser representadas por características diversas da planta, as quais afetam a locomoção, acasalamento e seleção hospedeira, tanto para alimentação como para oviposição. Essas características podem se manifestar por meio de fatores relacionados à dimensão e disposição das estruturas vegetais e fatores da epiderme, como espessura, dureza, textura, cerosidade e presença de tricomas. Considerando-se a importância de B. tabaci biótipo B para a cultura de couve-de- folhas e a ausência de trabalhos que focassem a busca por materiais resistentes utilizando um germoplasma mais amplo desta cultura, este trabalho teve como intuito caracterizar mecanismos de resistência de 32 genótipos comerciais e não comerciais de couve-de-folhas sobre a mosca-branca. Os objetivos específicos do trabalho foram: a) verificar a ocorrência de antixenose (infestação e oviposição) por meio de ensaios com e sem chance de escolha, além de investigar a possível correlação das cores das folhas dos materiais com a preferência do inseto; b) avaliar a performance biológica de B. tabaci biótipo B, confinada aos diferentes genótipos de couve-de-folhas, a fim de caracterizar a ocorrência de antibiose. Para este fim, esta dissertação foi dividida em dois capítulos, sendo o primeiro intitulado “Resistência de genótipos de couve-de-folhas a Bemisia tabaci biótipo B: 23 caracterização de antixenose”, redigido conforme as normas da revista Neotropical Entomology, e o segundo capítulo intitulado como “Efeitos de diferentes genótipos de couve-de-folhas sobre a performance de Bemisia tabaci biótipo B (Hemiptera: Aleyrodidae)”, redigido de acordo com as normas da revista Journal of Economic Entomology. 24 CAPÍTULO 1 Resistência de genótipos de couve-de-folhas a Bemisia tabaci biótipo B: caracterização de antixenose Revista: Neotropical Entomology Resumo A mosca-branca Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) é uma importante praga de hortaliças, incluindo a couve-de-folhas Brassica oleracea var. acephala. O uso de genótipos resistentes mostra-se como uma alternativa eficiente na redução das populações do inseto e pode ser utilizado como importante ferramenta do Manejo Integrado de Pragas (MIP). Este trabalho avaliou 32 genótipos de couve-de-folhas frente ao ataque de mosca-branca, visando caracterizar a ocorrência de antixenose. Inicialmente, foi realizado um ensaio com chance de escolha, utilizando todos os genótipos, onde se avaliou a atratividade de adultos com 24 e 48 horas após a infestação. Após a segunda avaliação, uma folha de cada genótipo foi avaliada determinando-se o número de ovos/cm². A partir destes resultados, foram selecionados 13 genótipos para um novo ensaio de oviposição sem chance de escolha, seguindo a metodologia do ensaio anterior. Análises colorimétricas foram realizadas a fim de se estabelecer possíveis correlações entre a cor das folhas e a colonização do inseto. Os genótipos HS-20, OE e VA, foram menos atrativos, indicando a ocorrência de antixenose. LG, VE, J, MG, MOP, HS-20, VA e MT revelam- se menos ovipositados em teste com chance de escolha, indicando a expressão de antixenose. No ensaio sem chance de escolha, VE, P1C, CCB, RI-919, H e J foram menos ovipositados, apresentando essa mesma categoria de resistência. Os genótipos VE e J apresentam a maior estabilidade de resistência, uma vez que se mostraram menos ovipositados nas duas modalidades de ensaio. Assim, HS-20, OE, VA, VE e J são genótipos promissores quanto à resistência para B. tabaci biótipo B, podendo ser utilizados em programas de melhoramento dessa cultura visando resistência a insetos. Palavras-chave: Brassica oleracea var. acephala, mosca-branca, resistência de plantas a insetos, Aleyrodidae, colorimetria. 25 Abstract Whitefly Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) is an important vegetable pest, including collard green Brassica oleracea var. acephala. The use of resistant genotypes is an efficient alternative in the reduction of insect populations and can be used as an important tool for Integrated Pest Management (IPM). This work evaluated 32 genotypes of collard green against the whitefly attack, aiming to characterize the occurrence of antixenosis. Initially, a randomized trial was conducted using all genotypes, where the attractiveness of adults at 24 and 48 hours after infestation was evaluated. After the second evaluation, one leaf of each genotype was evaluated by determining the number of eggs/cm². From these results, 13 genotypes were selected for a new oviposition test with no chance of choice, following the methodology of the previous test. Colorimetric analyzes were performed in order to establish possible correlations between leaf color and insect colonization. Genotypes HS-20, OE and VA were less attractive, indicating the occurrence of antixenosis. LG, VE, J, MG, MOP, HS-20, VA and MT were less likely to be tested with a chance of choice indicating antixenose expression. In the trial with no chance of choice, VE, P1C, CCB, RI-919, H and J were less oviposited, showing the same category of resistance. VE and J genotypes showed the highest resistance stability, since they were less oviposited in both test modalities. Thus, HS-20, OE, VA, VE and J are promising genotypes for resistance to B. tabaci biotype B, and can be used in breeding programs for insect resistance. Keywords: Brassica oleracea var. acephala, whitefly, plant resistance to insects, Aleyrodidae, colorimetry. 26 1.1 Introdução A couve-de-folhas [Brassica oleracea (L.) var. acephala], também conhecida como couve-comum ou couve-manteiga, é uma hortaliça folhosa pertencente à mesma família do repolho [B. oleracea (L.) var. capitata], couve-flor [B. oleracea (L.) var. botrytis] e brócolis [B. oleracea (L.) var. italica Plenck] (Filgueira 2008). Seu consumo na alimentação humana vem aumentando gradativamente em comparação a outras hortaliças, devido ao maior teor de fibras e compostos antioxidantes, além de selênio, cálcio, ferro e vitaminas A e C (Hendler 1994; Lee & Kader 2000). Embora a cultura apresente elevado potencial produtivo e capacidade de gerar folhas comestíveis durante quase o ano todo (Filgueira 2008), o ataque de insetos- praga limita consideravelmente a produção nas lavouras. Dentre as espécies que atacam a cultura, destaca-se a mosca-branca Bemisia tabaci (Genn.) biótipo B (Hemiptera: Aleyrodidae), cujos adultos e ninfas sugam a seiva das plantas durante o processo de alimentação, injetando toxinas e podendo provocar alterações fisiológicas, como o branqueamento do caule (Villas Bôas 2005). Além dos danos decorrentes de alimentação, o excremento açucarado (honeydew) depositado sobre as estruturas vegetais favorece a ocorrência de fumagina (fungo Capnodium sp) que prejudica o processo de fotossíntese e reduz a produtividade das plantas (Inbar & Gerling 2008). Embora não existam relatos de patógenos transmitidos pela mosca para a couve-de-folhas, este inseto é considerado um dos principais vetores de vírus para plantas de importância agrícola (Jones 2003, Marubayashi et al 2010, Navas-Castillo et al 2011, Polston et al 2014). Até o presente momento, o método de controle mais utilizado no manejo desse inseto-praga é o químico, através de pulverizações com inseticidas. No entanto, o uso indiscriminado desta prática pode trazer riscos aos produtores e consumidores, além de prejudicar o meio ambiente e favorecer a rápida seleção de populações resistentes aos compostos químicos (Prabhaker et al 2005, Silva et al 2009). No intuito de disponibilizar alternativas eficientes e ao mesmo tempo menos agressivas ao meio ambiente e ao homem, o uso de genótipos resistentes pode ser uma valiosa estratégia para o manejo de insetos-praga (Lara 1991, Smith 2005). Planta resistente é definida como aquela que, devido à sua composição genotípica, é menos danificada por uma determinada espécie de inseto em comparação com outros genótipos, sob condições semelhantes de infestação do artrópode (Painter 1951). A resistência é dividia em três 27 categorias: antixenose, antibiose e tolerância (Panda & Khush 1995). A antibiose ocorre quando um inseto se alimenta normalmente da planta, porém esta passa a exercer um papel negativo sobre seu desenvolvimento biológico. Na tolerância a planta sofre o ataque do inseto, porém apresenta a habilidade de se recuperar da injúria sofrida, sem comprometimento de performance biológica do inseto e sem causar efeito negativo sobre o seu comportamento (Lara 1991). Plantas expressando antixenose apresentam características químicas e/ou morfológicas que afetam negativamente o comportamento de alimentação e oviposição do inseto, fazendo com que ocorra a inibição da atividade do inseto, durante o processo de colonização na planta (Smith 2005). Dentre as prováveis causas de antixenose das plantas sobre B. tabaci biótipo B, a densidade e morfologia de tricomas (Lambert et al 1995, Valle et al 2012) e a coloração das estruturas vegetativas (Prado et al 2015) possuem grande importância na expressão da resistência. Genótipos resistentes têm apresentado resultados positivos no manejo de mosca- branca em diversas culturas como tomate (Baldin et al 2005), abobrinha (Baldin et al 2009), melão (Coelho et al 2009), brássicas (Elsey & Farnham 1994), soja (Valle & Lourenção 2002, Silva et al 2012, Cruz & Baldin 2016), feijão (Oriani & Lara 2000), feijão-caupi (Cruz et al 2014) e algodão (Prado et al 2015). No entanto, até o presente momento, não existem trabalhos reportando a possível resistência de genótipos de couve-de-folhas a esse inseto. Considerando-se a importância da praga para a cultura e também a necessidade de métodos de controle mais sustentáveis, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar a resistência de 32 genótipos de couve-de-folhas a Bemisia tabaci biótipo B, através de testes de atratividade e preferência para oviposição, em casa de vegetação. Adicionalmente, foram feitas análises colorimétricas nas folhas dos genótipos utilizados, a fim de se estabelecer possíveis correlações com a colonização da mosca-branca. Os resultados poderão auxiliar na recomendação de genótipos de couve-de-folhas mais adequados, visando a redução de danos da mosca-branca na cultura. 1.2 Material e Métodos Este trabalho foi desenvolvido em casa de vegetação e no Laboratório de Resistência de Plantas a Insetos e Plantas Inseticidas (LARESPI), pertencentes ao Departamento 28 de Proteção Vegetal, da Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Campus de Botucatu/SP, durante os anos de 2015 e 2016. Criação de Bemisia tabaci biótipo B A criação da mosca-branca foi mantida em casa de vegetação (2,5 x 2,5 x 2 m), fechada no teto com vidro e lateralmente com telado anti-afídeo. Para a manutenção dos insetos foram fornecidas plantas de couve-de-folhas (variedade Manteiga da Geórgia – Feltrin®). As plantas foram cultivadas em vasos plásticos com capacidade para 2,5 L, irrigadas diariamente e trocadas periodicamente, conforme a necessidade, visando manter sua qualidade nutricional e também o vigor das populações da mosca- branca. A caracterização de B. tabaci biótipo B foi feita antes do início da pesquisa, a fim de confirmar o biótipo (Walsh et al 1991, Simon et al 1994, De Barro et al 2003). Multiplicação dos genótipos Para a realização do trabalho, foram utilizadas plantas de 32 genótipos de couve-de- folhas (Tabela 1). Vinte e oito genótipos foram fornecidos pelo Instituto Agronômico (IAC) e fazem parte do Banco de Germoplasma daquela instituição. Os genótipos Gaudina e Arieli foram fornecidos pela empresa Sementes Feltrin, enquanto que os genótipos HS-20 e Manteiga da Geórgia foram fornecidos pela empresa Horticeres. As plantas foram cultivadas em vasos contendo solo autoclavado composto por terra, areia, esterco e substrato, na proporção 1:1:1:1. Para a propagação vegetativa, os brotos foram retirados das plantas e acondicionados em bandeja de isopor com 72 células, preenchidas com substrato comercial Tropstrato® (Vida Verde Indústria e Comércio de Insumos Orgânicos Ltda, Mogi Mirim-SP, Brasil) rico em matéria orgânica, a fim de produzir o número de plantas necessário de cada genótipo. Na fase de pegamento das mudas, tomou-se especial atenção com a irrigação, a fim de garantir um bom enraizamento (Trani et al 2015). Os vasos foram acondicionados em casa de vegetação, livre da infestação de insetos e foram adubados conforme a recomendação para a cultura (Trani et al 2015). As plantas receberam os demais tratos culturais necessários (irrigação, desbaste, limpeza etc), conforme a necessidade. 29 Ensaios de atratividade e preferência para oviposição com chance de escolha Foram realizados ensaios de atratividade e preferência para oviposição com chance de escolha, utilizando todos os genótipos. Quando estavam com duas folhas expandidas, as plantas, sendo uma de cada genótipo, foram dispostas ao acaso, em círculo, no interior de gaiolas metálicas de 2,5 x 3,0 x 2,5 m, com teto revestido por plástico e sombrite (30%) e as laterais revestidas por telado anti-afídeo. Os vasos contendo as plantas foram espaçados em aproximadamente 30 cm, a fim de evitar o contato entre as mesmas. As moscas-brancas utilizadas nos ensaios foram coletadas da criação, com auxílio de aspirador bucal, liberando-se 3.200 moscas-brancas (cerca de 50 casais por genótipo), a partir do chão e no centro de cada gaiola. Cada gaiola foi considerada uma repetição (total de cinco), seguindo um delineamento de blocos casualizados (DBC). A atratividade foi avaliada 24 e 48 horas após a liberação dos insetos, contando- se, com o auxílio de um espelho, o número de adultos presentes na parte abaxial das duas folhas expandidas. Após a última avaliação, uma das folhas avaliadas de cada planta foi retirada e levada ao laboratório onde, com o auxílio de um microscópio estereoscópico (aumento de 40 x), foi contado o número de ovos presentes em sua face abaxial. Após as contagens, determinou-se a área foliar com o medidor LI-COR (LAI 3000A), obtendo-se o número de ovos/cm². Ensaio de oviposição sem chance de escolha A partir dos resultados do ensaio com chance de escolha, foram selecionados treze genótipos, considerando-se os critérios de genótipos com potencial para resistência (OE, J, G, R I-919, VE, MG e H), genótipos intermediários (IMAN W, LG, CCB e MOP) e genótipos aparentemente suscetíveis (IAC-CM e P1C), para um ensaio de oviposição sem chance de escolha em casa de vegetação. Esse ensaio foi realizado com plantas de idade semelhante à das empregadas no teste anterior; no entanto, neste teste, as plantas foram individualizadas no interior de gaiolas metálicas (23 cm altura x 13 cm diâmetro) recobertas com tecido “voil”, e infestadas com 50 casais de moscas-brancas por gaiola. Após dois dias da infestação, uma folha de cada planta foi retirada para determinação do número de ovos/cm², conforme descrito para o teste com chance de escolha. Nesse experimento, cada 30 planta representou uma repetição, efetuando-se dez por genótipo, seguindo um delineamento inteiramente casualizado. Análise colorimétrica Para a realização das análises colorimétricas, foram produzidas outras plantas dos genótipos, conforme metodologia descrita anteriormente, as quais foram mantidas livres da infestação por insetos. Então, dez folhas com idade semelhante àquela das plantas utilizadas nos testes foram removidas e conduzidas ao Laboratório de Pós- Colheita da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, da Universidade de São Paulo, Piracicaba-SP, Brasil. A cor das folhas foi avaliada em colorímetro CR 300 (Minolta), através de leitura pelo sistema CIE L*a*b* que se baseia em luz e cor, e expressa as cores numericamente. Descrita em 1976, a mensuração L*a*b* representa: L*, que se refere à luminosidade, variando do preto ao branco; a*, medida do croma, varia de vermelho ao verde; e b*, medida do croma, varia de amarelo a azul (Comission Internacionale de L’Eclairage 1986). O valor de L* pode variar de 0 a 100, onde 0 é preto e branco é 100. O valor de a* é representado por números positivos quando o objeto for vermelho, e por números negativos quando o objeto for verde. O valor de b* é positivo quando o objeto for amarelo, e negativo quando este for azul (Takatsui 2011). Análise estatística Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância usando o Teste F. Foi verificada a normalidade dos dados através do teste de Shapiro-Wilk e a homogeneidade através do teste de Levene. Quando o Teste F foi significativo, foram utilizados os testes de Scott-Knott (p<0,05) e de Fisher LSD (p<0,05) para a comparação das médias, utilizando-se os programas estatísticos Assistat (versão 7.7) e SAS (Statistical Analysis System, versão 9.2). 1.3 Resultados e Discussão Foram verificadas diferenças significativas entre os genótipos de couve-de-folhas nas duas avaliações de atratividade com adultos de B. tabaci biótipo B (Tabela 2). Na primeira avaliação (24h), os genótipos CP, J, G, MMA, R I-919, VE, MG, MM, MRP I- 2620, IMAN W, LG, VA, OE e HS-20 foram os menos atrativos, destacando-se os três últimos com menos de 50 insetos. Nessa primeira avaliação, MSR I-1812 (209,40 31 insetos) destacou-se como o mais atrativo, com cerca de nove vezes mais insetos que no genótipo VA (23,60 insetos). Na avaliação de 48 horas após a liberação das moscas-brancas, os genótipos VA, OE, HS-20, CP, J, G, MMA, R I-919, VE, MG, MM, H e CCB foram os menos atrativos (31,00 a 98,80 indivíduos), diferindo dos demais materiais. Considerando-se as duas avaliações de atratividade, os genótipos VA, OE e HS-20 apresentaram as menores médias, seguidos por CP, J, G, MMA, R I-919, VE, MG, MM, MRP I-2620 e H, sugerindo a presença de fatores antixenóticos. Os demais materiais foram comparativamente mais atrativos aos adultos da mosca-branca. Em estudo com essa mesma mosca-branca, avaliou-se a colonização do inseto sobre diferentes espécies de brássicas (Elsey & Farnham 1994), verificando-se maior preferência do inseto por couve-de-Bruxelas, repolho e couve-de-folhas, comparativamente a brócolis e couve-rábano. Embora ainda não estejam disponíveis trabalhos que investiguem a resistência de B. tabaci biótipo B em germoplasma de couve-de-folhas, alguns dos genótipos aqui estudadosjá foram avaliados com espécies de Lepidoptera. Em um desses trabalhos, avaliou-se a atratividade e a preferência para alimentação da traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae), em 18 genótipos de couve-de-folhas (alguns comuns ao presente estudo) e verificou-se que os genótipos IMAN W, MMA e RI-919 foram menos atrativos às lagartas em teste com chance de escolha (Tagliari 2007). Em nosso trabalho, níveis intermediários de atratividade foram obtidos com esses três genótipos. Em outro estudo, com o curuquerê-da-couve, Ascia monuste orseis (Godart) (Lepidoptera: Pieridae), os genótipos P1C, P2C, CCB, MM, MG, J e OE foram os menos atrativos às lagartas de terceiro instar do inseto, sendo descritos como portadores de antixenose (Schlick-Souza et al 2011). Os quatro últimos também se destacaram entre os menos atrativos à mosca-branca neste trabalho. Em brássicas, a diferença de antocianina presente nas diferentes espécies, aliada à presença ou ausência de cera sobre a superfície das folhas, pode resultar em diferentes tonalidades de cor, com significativo impacto sobre o nível de infestação de insetos-praga (Radcliffe & Chapman 1966, Eigenbrode et al 1990). Assim, em situações onde a mosca-branca possui chance de escolha, estímulos visuais aliados aos odores emitidos pelas plantas afetam a escolha do inseto pelo hospedeiro (Elsey & Farnham 1994). Para moscas-brancas, a visão apresenta importância primária e é utilizada na discriminação de formas, tamanhos e cores do substrato (Vaishampayan et al 1975, van Lenteren & Noldus 1990). 32 Embora possam existir outros fatores atuando conjuntamente para a atratividade da mosca-branca, neste estudo verificou-se que as intensidades de verde e amarelo podem estar relacionadas à seleção do hospedeiro pelo inseto (Tabela 3). Nossos resultados mostraram que nas folhas de alguns genótipos, como por exemplo MMA, VE e MG, com tonalidades tendendo ao vermelho, o número de insetos atraídos foi significativamente menor em relação aos genótipos que apresentaram teores de verde mais intensos (CL e IAC-CM). Com base em outros estudos com espécies de brássicas e cucurbitáceas (Elsey e Farnham 1994, Alves et al 2006, Coelho et al 2009, Zaché et al 2013) assume-se que a cor verde desempenha um importante papel na orientação de moscas-brancas. Com solanáceas, verificou-se que genótipos de berinjela refletindo tons mais próximos do vermelho foram menos atrativos a B. tabaci biótipo B do que materiais com folhas verdes brilhantes, também indicando que a intensidade da cor verde está relacionada com a atração de adultos e a preferência para oviposição (Hasanuzzaman et al 2016). Elsey & Farnham (1994) destacam que, embora a característica de tonalidade mais avermelhada seja de difícil transferência para materiais verde-claros, o plantio intercalado entre esses dois tipos de plantas pode representar uma estratégia valiosa no manejo da mosca-branca em brássicas. Os três genótipos menos atrativos (VA, OE, HS-20) apresentaram menor intensidade de amarelo, que corresponde a leitura de b* (Tabela 3), indicando a influência dessa cor na colonização por B. tabaci biótipo B. Esse fato corrobora outros estudos (Berliner 1986, Moreau & Isman 2011), onde se verificou que os adultos de mosca-branca são mais atraídos para superfícies que refletem amarelo, as quais induzem o comportamento de colonização na planta hospedeira. Quanto à oviposição em ensaio com chance de escolha (Tabela 2), LG, VE, J, MG, MOP, HS-20 e MT destacaram-se como os menos ovipositados (< 1 ovo/cm2), indicando a ocorrência de antixenose. Os genótipos P1C, IMAN W, MI-1811, MRPI- 2620, MJ, IAC-CM e TZ apresentaram as maiores médias (8,72 a 3,83 ovos/cm2), diferindo dos outros materiais. Em teste com chance de escolha, Tagliari (2007) avaliou a oviposição de P. xylostella em vários genótipos de couve-de-folhas e verificou menor oviposição em MRP I-2620, enquanto que MSJ foi o mais ovipositado. Com adultos de A. monuste orseis, constatou-se a expressão de antixenose (oviposição) em MRP I-2446, MJ e C (Schlick-Souza et al 2011). Os genótipos OE, J, G, RI-919, VE, MG, H, IMAN W, LG, P1C, CCB, MOP e IAC- CM foram selecionados para a etapa seguinte em função dos resultados obtidos nos 33 ensaios com chance de escolha. No teste de oviposição sem chance de escolha (Tabela 4), os genótipos VE, P1C, CCB, RI-919, H e J apresentaram as menores médias, diferindo de IAC-CM, IMAN W, LG, G e OE (7,44 a 6,19 ovos/cm2) e indicando a ocorrência de antixenose. MOP e MG apresentaram médias intermediárias de oviposição da mosca-branca. Assim como verificado no ensaio de oviposição com chance de escolha, VE destacou-se entre os menos ovipositados (< 1 ovo/cm2). Diversos estudos vêm demonstrando que a oviposição da mosca-branca pode estar diretamente relacionada à presença de tricomas em diferentes hospedeiros. Tricomas glandulares, comuns em algumas espécies de solanáceas geralmente inibem à alimentação e a oviposição de B. tabaci biótipo B (Freitas et al 2002, Oriani & Vendramim 2010, Rodríguez-Lopez et al 2012, Lucatti et al 2014). Opostamente, em batata (Silva et al 2008), melão (Coelho et al 2009), feijão (Oriani et al 2005) e soja (Silva et al 2012), a presença dos tricomas estimula a oviposição do inseto. Recentemente, verificou-se que a preferência para oviposição de B. tabaci biótipo B em algodoeiro está positivamente correlacionada à densidade de tricomas presentes na superfície abaxial de folhas, enquanto que a atratividade é principalmente afetada pelos níveis de intensidade de cor verde na superfície adaxial das folhas (Prado et al 2015). Em nosso trabalho, verificou-se que todos os genótipos de couve-de-folhas avaliados apresentam folhas glabras, ou seja, sem pilosidade. Assim, acredita-se que o comportamento de oviposição do inseto tenha sido influenciado pela cor do substrato, sem excluir a possibilidade da presença de voláteis indesejáveis (Smith 2005). No caso do genótipo VE (menos ovipositado nos dois ensaios), constatou-se a menor intensidade de luz refletida e também a tonalidade mais escura das folhas (tendendo ao vermelho e azul), comparativamente aos demais materiais (Tabela 3), o que poderia explicar o comportamento do inseto nesse material. Os resultados deste estudo mostraram que dentre os 32 genótipos avaliados, HS- 20, OE e VA são menos atrativos aos adultos da mosca-branca indicando a expressão de antixenose. Sob condições de livre escolha, LG, VE, J, MG, MOP, HS-20, VA e MT revelam-se menos ovipositados, indicando a presença de fatores deterrentes à oviposição. Na ausência de escolha, condição que mais se assemelha à cultivos comerciais, VE, P1C, CCB, RI-919, H e J são menos ovipositados e apresentam resistência por antixenose. Os genótipos VE e J apresentam a maior estabilidade de 34 resistência, uma vez que se mostraram menos ovipositados nas duas modalidades de ensaio. Aqui procuramos caracterizar a expressão de resistência por antixenose a partir de um elevado número de materiais, com ampla variabilidade genética. Considerando-se o expressivo dano que a mosca-branca pode ocasionar ao cultivo de couve-de-folhas, estudos mais aprofundados ainda são necessários a fim de melhor interpretar os fatores (presença de voláteis, coloração e teor de cera) de resistência presentes em alguns dos materiais. Essas informações podem ser úteis aos programas de melhoramento genético focando resistência a pragas, além de auxiliarem no manejo de B. tabaci biótipo B nas lavouras de couve-de-folhas. Agradecimentos À CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado ao primeiro autor e ao CNPq, pela Bolsa de Produtividade em Pesquisa (nº 305649/2013-2) concedida ao segundo autor. 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Fonte Nome original Código Características das folhas IAC Manteiga de Ribeirão Pires I-2620 MRPI-2620 Margem irregularmente sinuada, denticulada;* Manteiga I-1811 MI-1811 Margem irregularmente sinuada, denticulada;* Roxa I-GAAR919 RI-919 Nervuras arroxeadas;* Manteiga de São Roque I-1812 MSRI-1812 Margem levemente denticulada, sinuada;* Manteiga de Ribeirão Pires I-2446 MRPI-2446 Pecíolo de cor verde;* Crespa de Capão Bonito CCB Nervuras proeminentes;* Manteiga de Tupi MT Base auriculada assimétrica;* Couve Seção de Leguminosas CL Margem de cor verde;* Manteiga de Jundiaí MJ Coloração verde-clara;* Manteiga de Mococa MM Limbo bulado;* Manteiga São José MSJ Ápice assimétrico;* Manteiga Monte Alegre MMA Nervuras arroxeadas;* Verde Escura VE Coloração verde-escura;* Pires 1 de Campinas P1C Nervuras branco-esverdeadas;* Pires 2 de Campinas P2C Limbo orbicular;* Japonesa J Coloração verde-brilhante;* Hortolândia H Limbo orbicular* Orelha de Elefante OE Margem denticulada* Vale das Garças VG Nervuras arroxeadas* Arthur Nogueira 1 IMANW Limbo oval-oblongo* Comum C Limbo elíptico-oblongo* Variegata de Andradas VA Bordos esbranquiçados* Tozan TZ Pecíolo longo*** Campinas Mendonça IAC-CM Folhas macias ao tato* Manteiga Osvaldo Pires MOP Limbo oval* Guaranésia G Bordos serrilhados*** Campinas CP Bordos arredondados*** Leguminosa 1 LG Coloração verde-clara*** Feltrin Gaudina GA Coloração verde escuro, bordos crespos** Arieli AR Coloração verde claro, bordos lisos** Horticeres HS-20 HS-20 Coloração verde médio, bordos lisos** Manteiga da Geórgia MG Coloração verde escuro** 42 Tabela 2 Médias (±EP) de insetos atraídos e de ovos/cm² depositados por Bemisia tabaci biótipo B em genótipos de couve-de-folhas, em ensaio com chance de escolha. Genótipo Número de insetos atraídos Média de insetos atraídos (48 h) Número de ovos/cm² (48 h) 24 h 48 h MSR I-1812 209,4 ± 36,60 a 125,6 ± 27,29 a 167,5 ± 25,66 a 2,57 ± 0,89 b AR 192,0 ± 47,97 a 139,2 ± 51,87 a 165,6 ± 34,45 a 1,05 ± 0,49 b TZ 191,4 ± 31,07 a 157,8 ± 26,95 a 174,6 ± 17,29 a 3,83 ± 2,42 a CL 182,8 ± 58,78 a 184,0 ± 56,13 a 184,4 ± 39,33 a 2,77 ± 1,43 b MSJ 174,8 ± 36,9 a 139,2 ± 35,94 a 157,0 ± 24,58 a 3,32 ± 1,38 b VG 171,4 ± 45,09 a 183,4 ± 46,85 a 177,4 ± 30,72 a 2,62 ± 1,79 b M I-1811 170,8 ± 51,72 a 157,2 ± 56,98 a 157,1 ± 36,28 a 6,28 ± 5,22 a IAC-CM 157,0 ± 52,65 a 183,6 ± 64,96 a 177,2 ± 39,48 a 3,95 ± 3,16 a MRP I 2446 155,6 ± 43,28 a 148,8 ± 50,12 a 150,5 ± 35,82 a 3,25 ± 1,83 b P2C 152,2 ± 34,99 a 143,2 ± 33,76 a 146,7 ± 25,58 a 1,38 ± 0,88 b MT 151,8 ± 36,60 a 188,8 ± 54,98 a 172,2 ± 31,63 a 0,95 ± 0,40 b GA 150,2 ± 45,46 a 131,8 ± 33,63 a 141,8 ± 28,77 a 1,95 ± 1,19 b MOP 144,8 ± 32,14 a 146,2 ± 40,29 a 145,5 ± 24,30 a 0,80 ± 0,43 b CCB 142,2 ± 44,19 a 98,8 ± 43,99 b 120,5 ± 30,27 a 0,16 ± 0,08 b MJ 132,6 ± 39,19 a 131,8 ± 36,00 a 132,2 ± 26,89 a 4,33 ± 1,96 a P1C 126,4 ± 30,17 a 136,6 ± 32,67 a 131,5 ± 21,03 a 8,72 ± 3,81 a C 125,4 ± 26,17 a 138,8 ± 27,53 a 132,1 ± 18,04 a 1,10 ± 0,49 b LG 115,2 ± 35,81 b 118,0 ± 39,92 a 116,6 ± 25,29 a 0,12 ± 0,07 b IMAN W 115,0 ± 37,48 b 118,0 ± 23,85 a 116,5 ± 22,35 a 8,36 ± 2,52 a H 107,6 ± 37,17 b 77,8 ± 24,60 b 92,7 ± 20,06 b 2,16 ± 0,96 b MRP I-2620 98,4 ± 24,60 b 110,2 ± 37,30 a 104,3 ± 21,16 b 4,39 ± 1,05 a MM 97,8 ± 26,65 b 96,0 ± 37,27 b 96,9 ± 21,60 b 1,12 ± 0,50 b MG 94,6 ± 20,98 b 48,6 ± 25,94 b 82,0 ± 13,01 b 0,76 ± 0,52 b VE 84,8 ± 38,20 b 75,8 ± 30,10 b 80,3 ± 22,98 b 0,32 ± 0,17 b R I-919 77,2 ± 25,17 b 73,0 ± 49,29 b 75,1 ± 18,17 b 1,64 ± 0,57 b MMA 77,0 ± 18,61 b 96,6 ± 33,91 b 86,8 ± 18,53 b 1,64 ± 0,73 b G 76,4 ± 31,43 b 71,2 ± 33,51 b 73,8 ± 17,94 b 1,10 ± 0,28 b J 73,0 ± 34,54 b 71,4 ± 27,91 b 72,2 ± 20,94 b 0,37 ± 0,31 b CP 64,6 ± 13,85 b 71,4 ± 10,51 b 68,0 ± 8,27 b 1,96 ± 0,88 b HS-20 46,2 ± 6,59 b 36,8 ± 7,33 b 41,5 ± 4,91 b 0,85 ± 0,44 b OE 32,2 ± 8,70 b 32,0 ± 11,30 b 32,1 ± 6,73 b 0,89 ± 0,63 b VA 23,6 ± 4,92 b 31,0 ± 6,01 b 27,3 ± 3,87 b 1,12 ± 0,31 b P <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 Médias seguidas de mesma letra, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Scott Knott (P > 0,05). 43 Tabela 3 Médias (±EP) de parâmetros colorimétricos obtidos a partir da face superior de folhas de genótipos de couve. Genótipo L* a* b* CL 51,23 ± 1,05 a -11,18 ± 0,43 a 21,34 ± 1,02 a VA 51,07 ± 2,08 a -7,50 ± 0,80 c 14,96 ± 1,19 d IAC-CM 50,90 ± 0,98 a -10,95 ± 0,51 a 20,63 ± 0,96 a G 49,49 ± 0,85 b -8,36 ± 0,36 c 13,19 ± 0,98 d J 49,14 ± 0,91 b -9,34 ± 0,62 b 18,88 ± 1,12 b MOP 49,04 ± 1,00 b -10,21 ± 0,45 a 19,03 ± 0,82 b MT 48,97 ± 0,42 b -7,86 ± 0,34 c 13,61 ± 0,55 d MSJ 48,85 ± 0,57 b -7,84 ± 0,36 c 12,71 ± 0,82 d CP 48,71 ± 1,03 b -9,29 ± 0,51 b 16,38 ± 1,04 c CCB 48,56 ± 1,28 b -9,24 ± 0,68 b 18,31 ± 1,33 c LG 48,13 ± 0,86 b -10,24 ± 0,44 a 18,46 ± 0,86 c M I-1811 48,07 ± 0,62 b -8,09 ± 0,44 c 14,33 ± 0,88 d HS-20 48,01 ± 0,51 b -7,19 ± 0,30 c 11,44 ± 0,43 e H 47,68 ± 0,82 b -8,65 ± 0,44 b 14,48 ± 0,79 d MJ 47,49 ± 0,75 c -9,09 ± 0,30 b 15,88 ± 0,56 c VG 47,27 ± 0,38 c -9,56 ± 0,32 b 17,79 ± 0,37 c MRP I-2446 47,26 ± 0,62 c -7,97 ± 0,38 c 14,40 ± 0,74 d OE 47,25 ± 0,69 c -9,30 ± 0,33 b 16,42 ± 0,57 c TZ 47,25 ± 0,71 c -9,25 ± 0,35 b 17,34 ± 0,63 c MM 46,87 ± 0,58 c -9,15 ± 0,32 b 16,33 ± 0,56 c MRP I-2620 46,76 ± 0,71 c -7,40 ± 0,36 c 13,65 ± 0,77 d AR 46,60 ± 0,41 c -7,56 ± 0,34 c 11,95 ± 0,62 e C 46,48 ± 0,67 c -8,25 ± 0,41 c 14,05 ± 0,68 d GA 46,14 ± 0,48 c -7,15 ± 0,31 c 11,14 ± 0,61 e MSR I-1812 46,02 ± 0,73 c -7,45 ± 0,55 c 13,75 ± 0,94 d R I-919 45,68 ± 0,68 d -6,94 ± 0,38 c 13,27 ± 0,44 d MG 45,46 ± 0,65 d -6,08 ± 0,66 d 9,82 ± 1,07 f IMAN W 45,30 ± 0,84 d -7,16 ± 0,46 c 12,63 ± 0,72 d P1C 45,20 ± 0,67 d -7,56 ± 0,42 c 13,84 ± 0,64 d P2C 45,13 ± 0,52 d -7,90 ± 0,29 c 13,93 ± 0,55 d MMA 44,57 ± 0,49 d -6,23 ± 0,35 d 11,34 ± 0,49 e VE 43,20 ± 0,64 d -4,39 ± 0,43 e 7,75 ± 0,62 f P 0,00000 0,13034 0,17986 Médias seguidas de mesma letra, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Scott Knott (P > 0,05). 44 Tabela 4 Médias (±EP) do número de ovos/cm² de Bemisia tabaci biótipo B, em ensaio sem chance de escolha. Genótipo Número de ovos/cm² (48 h) IAC-CM 7,44 ± 0,86 a IMAN W 7,39 ± 1,49 a LG 6,36 ± 0,98 ab G 6,19 ± 1,88 ab OE 6,19 ± 1,58 ab MOP 3,92 ± 1,05 bc MG 3,57 ± 0,61 bc J 3,03 ± 0,94 cd H 2,48 ± 0,90 cd R I-919 1,66 ± 0,75 cd CCB 1,25 ± 0,58 cd P1C 1,17 ± 0,31 cd VE 0,48 ± 0,19 d P <0,0001 Médias seguidas de mesma letra, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Fisher LSD (P > 0,05). 45 CAPÍTULO 2 Efeitos de diferentes genótipos de couve-de-folhas sobre a performance de Bemisia tabaci biótipo B (Hemiptera: Aleyrodidae) Revista: Journal of Economic Entomology Resumo Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) é uma importante praga para a cultura de couve-de-folhas, Brassica oleracea var. acephala. Esse inseto atinge elevados níveis de infestação no campo, provocando danos diretos e indiretos às plantas, comprometendo a produtividade. Dentre os métodos alternativos ao controle químico, o uso de genótipos resistentes pode ser uma valiosa estratégia para o manejo deste inseto no campo, reduzindo suas populações abaixo do nível de dano econômico. Este trabalho avaliou o desenvolvimento biológico de B. tabaci biótipo B em 13 genótipos de couve-de-folhas, em condição de laboratório. Foram determinados os parâmetros: período de duração por instar, período ninfal, viabilidade ninfal, período de desenvolvimento de ovo a adulto e longevidade. O ensaio foi realizado em delineamento inteiramente casualizado e cada folha contendo 30 ovos representou uma repetição (total de seis por genótipo). Com base nos resultados obtidos, os genótipos P1C, MG e LG expressaram antibiose e/ou antixenose contra B. tabaci biótipo B, prolongando o ciclo do inseto. IMAN W, MOP e VE também apresentaram resistência, reduzindo a viabilidade ninfal da mosca-branca. Devido à importância do cultivo de couve-de-folhas e o grande potencial de danos que B. tabaci apresenta para a cultura, a seleção de genótipos resistentes é fundamental e pode representar uma importante ferramenta para o manejo da mosca-branca nas lavouras. Nossos resultados auxiliam nos programas de melhoramento genético de brássicas focando resistência a B. tabaci biótipo B. Palavras-chave: Brassica oleracea var. acephala, mosca-branca, resistência de plantas a insetos, antibiose. 46 Abstract Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) is an important pest for the cultivation of collard green, Brassica oleracea var. acephala. This insect reaches high levels of infestation in the field, causing direct and indirect damage to the plants, compromising productivity. Among alternative methods to chemical control, the use of resistant genotypes may be a valuable strategy for the management of this insect in the field, reducing its populations below the level of economic damage. This work evaluated the biological development of B. tabaci biotype B in 13 genotypes of leaf collard green under laboratory conditions. The determined parameters were: duration period per instar, nymphal period, nymphal viability, egg development period to adult and longevity. The assay was performed in a completely randomized design and each leaf containing 30 eggs represented one replicate (total of six per genotype). Based on the results obtained, genotypes P1C, MG and LG expressed antibiosis and/or antixenosis against B. tabaci biotype B, prolonging the cycle of the insect. IMAN W, MOP and VE also showed resistance, reducing the nymphal viability of the whitefly. Due to the importance of collard green cultivation and the great damage potential that B. tabaci presents to the crop, the selection of resistant genotypes is fundamental and may represent an important tool for the management of whitefly in crops. Our results may support the genetic improvement programs of brassicas focusing on resistance to B. tabaci biotype B. Keywords: Brassica oleracea var. acephala, whitefly, resistance of plants to insects, antibiosis. 47 2.1 Introdução As plantas da família Brassicaceae são amplamente consumidas pelo homem em todo o mundo (Lin e Harnly, 2009). Dentro desse grupo, a couve-de-folhas [Brassica oleracea (L.) var. acephala] é uma das espécies mais utilizadas na alimentação, uma vez que possui elevado valor nutricional, além de vitaminas e minerais essenciais (Franco, 1960, Cartea et al., 2011). Devido às qualidades supracitadas, o consumo dessa hortaliça no Brasil vem crescendo ao longo dos anos, estimulando sua produção e comércio (Agrianual, 2016). Embora a couve-de-folhas apresente bom potencial produtivo, o ataque de insetos-praga como a mosca-branca, Bemisia tabaci (Genn.) biótipo B, pode limitar significativamente a produtividade nas lavouras (Perring et al., 1991, Farnham e Elsey, 1995, Villas Bôas, 2005). O ataque de adultos e ninfas da mosca-branca causa danos diretos às plantas, tornando-as subdesenvolvidas, além de favorecer o desenvolvimento de fumagina (Capnodium sp.), comprometendo sua capacidade fotossintética (Naranjo e Legg, 2010). Durante sua alimentação também ocorre a injeção de substâncias tóxicas, que induzem uma série de desordens fisiológicas como o amarelecimento irregular de frutos em tomateiro e o prateamento foliar em abóbora (Perring, 2001, Brown et al., 1995). Adicionalmente, B. tabaci biótipo B é descrita como vetor de mais de 100 espécies de vírus letais às plantas, incluindo aqueles dos gêneros Begomovirus (Geminiviridae), Crinivirus (Closteroviridae) e Ipomovirus (Potyviridae) (Polston et al 2014). O método de controle mais utilizado no manejo de B. tabaci biótipo B ainda é o químico, por meio de pulverizações intensivas com inseticidas sintéticos (Toscano et al., 2001). No entanto, o uso excessivo de inseticidas tem causado sérios impactos sobre o meio ambiente, além de ser inviável para uso associado com outras práticas de manejo, estimulando a busca por métodos menos agressivos de controle dessa mosca-branca (Cruz et al., 2014, Prado et al., 2015; Cruz e Baldin, 2016, Hasanuzzaman et al., 2016, Fanela et al., 2016). Em adição, o uso abusivo e inapropriado de inseticidas tem acelerado a seleção de populações resistentes aos principais ingredientes ativos comerciais, comprometendo a eficiência desse método a longo prazo (Byrne et al., 2003, Prabhaker et al., 2005, Silva et al., 2009). O uso de genótipos resistentes a insetos é considerado uma valiosa estratégia do Manejo Integrado de Pragas (MIP), podendo reduzir a população de artrópodes-praga 48 abaixo do nível de dano econômico, além de não causar desequilíbrio ambiental e ser compatível com outras ferramentas de manejo (Painter, 1951, Kogan, 1975). A resistência de plantas é dividida em três categorias: antixenose, tolerância e antibiose (Smith, 2005). Na antixenose, os fatores químicos e morfológicos da planta interferem no comportamento do inseto, afetando os processos de alimentação, oviposição ou procura por abrigo. Na tolerância, a planta sofre o ataque do inseto mas esta consegue se recuperar da injuria sofrida, não comprometendo a biologia do inseto e tampouco afetando seu comportamento. Na antibiose, a planta afeta negativamente a biologia do inseto que tenta utilizá-la como hospedeiro. Dentre os efeitos antibióticos mais comuns, destacam-se a elevada mortalidade nas fases imaturas, reduções de tamanho e peso dos indivíduos, redução da taxa de fecundidade e alterações na duração das fases de vida dos insetos (Kogan, 1975, Panda e Khush, 1995). Alguns trabalhos tiveram como objetivo avaliar a performance biológica da mosca- branca em culturas como tomate (Baldin et al., 2005), abobrinha (Baldin et al., 2009), melão (Coelho et al., 2009), soja (Valle e Lourenção, 2002, Silva et al., 2012, Cruz e Baldin, 2016), feijão (Oriani e Lara, 2000), feijão-caupi (Cruz et al., 2014) e algodão (Prado et al., 2015). No entanto, até o presente momento, não existem trabalhos que avaliaram a possível antibiose de genótipos de B. oleracea var. acephala sobre o inseto, utilizando um germoplasma tão amplo. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar alguns parâmetros biológicos de B. tabaci biótipo B em 13 genótipos de couve- de-folhas previamente selecionados, a fim de caracterizar a ocorrência de antibiose. Os resultados poderão ser utilizados em programas de melhoramento genético, focando resistência de brássicas à B. tabaci biótipo B. 2.2 Material e métodos O estudo foi desenvolvido sob condições controladas (26 ± 2°C; 60 ± 10% U.R.; fotoperíodo de 12:12 L:E) no Laboratório de Resistência de Plantas a Insetos e Plantas Inseticidas (LARESPI) da Faculdade de Ciências Agronômicas (UNESP), Campus de Botucatu, no período de junho a setembro de 2016. Genótipos. Avaliamos 13 genótipos de couve-de-folhas (Tabela 1), os quais mostraram-se previamente promissores quanto à resistência para B. tabaci biótipo B em ensaios preliminares. A maioria dos genótipos foi fornecida pelo Instituto Agronômico - IAC (Campinas-SP, Brasil) e faz parte do Banco de Germoplasma 49 daquela instituição. O genótipo Manteiga da Geórgia foi cedido pela empresa Horticeres (Indaiatuba-SP, Brasil). Visando a propagação vegetativa dos genótipos, brotos foram retirados de plantas previamente cultivadas e acondicionados em bandeja de isopor (72 células), preenchidas com substrato comercial Tropstrato® (Vida Verde Indústria e Comércio de Insumos Orgânicos Ltda, Mogi Mirim-SP, Brasil) e foram irrigadas conforme a necessidade. Após 45 dias, as mudas de couve-de-folhas foram transplantadas para vasos de 1L, contendo substrato autoclavado, composto por solo, areia grossa lavada e matéria orgânica (esterco de curral), na proporção de 1:1:1. As plantas foram acondicionadas em casa de vegetação, livre da infestação de insetos e receberam os demais tratos culturais normalmente recomendados para a cultura (adubação, irrigação, desbaste, limpeza, etc) (Trani et al., 2015). Criação de B. tabaci biótipo B. Uma criação de B. tabaci biótipo B foi mantida em casa de vegetação (2,0 m x 2,5 m x 2,0 m), fechada lateralmente com telado anti- afídeo (200 mesh) e vidros no teto. Para a manutenção dos insetos, plantas de couves-de-folhas, variedade Manteiga da Geórgia – Feltrin®, foram fornecidas periodicamente e substituídas conforme a necessidade, visando manter a qualidade nutricional e também o vigor da população. A caracterização molecular do inseto foi feita antes do inicio do estudo, a fim de confirmar o biótipo B de B. tabaci (Walsh et al., 1991, Simon et al., 1994, De Barro et al., 2003). Bioensaios. Quando as plantas dos genótipos atingiram cerca de 90 dias de idade (duas folhas totalmente expandidas), as mesmas foram conduzidas ao laboratório e acondicionadas em prateleiras sob iluminação artificial com lâmpadas “super day light” (20W) e fluorescente “plant light” (Grolux F 20W T12 – Sylvania®). As folhas dos genótipos foram individualizadas com gaiolas confeccionados em “voil” (15 cm x 15 cm), as quais foram presos aos pecíolos das folhas com fitilho de cetim. Com auxílio de um aspirador bucal, 25 casais de moscas-brancas foram coletados da criação e liberados no interior das gaiolas e mantidos por um período de 24 horas. Após esse período, as gaiolas foram retiradas e os insetos adultos removidos das plantas. Sob microscópio estereoscópico (aumento de 40 x), a face abaxial das folhas foi examinada e uma área contendo 30 ovos viáveis por folha foi delimitada com “glitter”. O excedente dos ovos foi retirado com auxílio de hastes flexíveis de algodão (Cotonete®). Foram utilizados três vasos por genótipo e cada folha representou uma 50 repetição, totalizando seis repetições por genótipo em delineamento inteiramente casualizado. Os insetos foram avaliados diariamente para a obtenção dos seguintes parâmetros biológicos: período de incubação, período de duração dos instares, período ninfal, viabilidade ninfal, período de desenvolvimento de ovo a adulto e longevidade. A longevidade foi avaliada sob dois cenários (com e sem fonte de alimentação). Para este fim, 20 adultos de B. tabaci biótipo B recém-emergidos de cada genótipo foram coletados, sendo 10 deles acondicionados em tubos de ensaio (8,5 cm x 2,5 cm) sem alimento e outros 10 mantidos em tubos de ensaio (8,5 cm x 2,5 cm) junto à folhas dos materiais. Na avaliação de longevidade cada inseto representou uma repetição (10 por cenário) em delineamento inteiramente casualizado. Análises estatísticas. Os dados dos parâmetros biológicos de B. tabaci biótipo B foram analisados por meio de um modelo misto generalizado (PROC GLIMMIX). A normalidade dos dados foi verificada através do teste de Shapiro-Wilk e a homogeneidade através do teste de Levene (Winer et al., 1991). As médias foram comparadas quando o Teste F apresentou significância (P ≤ 0,05), utilizando o teste de Fisher LSD Statistical Analysis System, version 9.2 (SAS Institute, 2008). 2.3 Resultados As médias do período de incubação variaram de 6,08 a 7,03 dias entre os genótipos de couve-de-folhas avaliados (Tabela 2). As maiores médias foram verificadas nos genótipos H e MG (≥ 7,0 dias) (F = 13,24; gl = 12; P < 0,0001), enquanto que os genótipos IMAN W, IAC-CM e MOP induziram os menores períodos de incubação. Os demais genótipos apresentaram médias intermediárias. A duração do primeiro instar ninfal foi maior nos genótipos MOP, IAC-CM e IMAN W (F = 6,93; gl = 12; P < 0,0001) e menor em OE, P1C, MG e H (Tabela 2). Os genótipos LG e MG (7,03 e 6,99 dias, respectivamente) foram os que mais prolongaram o segundo instar ninfal (F = 63,73; gl = 12; P < 0,0001), diferindo da maioria dos genótipos, especialmente de CCBe RI-919, que exigiram menos tempo do inseto para completar essa fase. Para o terceiro instar, o maior período de duração foi verificado em P1C (13,63 dias) (F = 63,73; gl = 12; P < 0,0001), diferindo de todos os demais genótipos. IMAN W e IAC-CM exigiram os menores períodos para que B. 51 tabaci biótipo B completasse esse estágio ninfal (4,00 e 3,93 dias, respectivamente). As maiores médias de duração no quarto instar foram verificadas em H e P1C (F = 3,11; gl = 12; P = 0,0017), os quais diferiram da maioria dos genótipos. De maneira oposta, IAC-CM mostrou a menor média de duração no período (2,39 dias). Moscas- brancas confinadas ao genótipo P1C (22,68 dias) apresentaram seu período ninfal significativamente prolongado (F = 8,38; gl = 12; P < 0,0001) em relação aos demais genótipos. LG e MG também provocaram ligeiro aumento na fase imatura (17,61 e 17,03 dias, respectivamente), enquanto que RI-919, J e CCB (< 14 dias) exigiram menor tempo para a conclusão da fase jovem da mosca-branca. O genótipo P1C prolongou o ciclo de ovo a adulto do inseto (29,45 dias), diferindo de todos os outros genótipos (F = 12,03; gl = 12; P < 0,0001) (Fig. 1). RI-919 e CCB apresentaram as menores médias para o período de ovo a adulto (19,89 e 18,89 dias, respectivamente). Os genótipos VE, OE e H apresentaram a menor viabilidade, abaixo de 85%, enquanto o genótipo RI-919 apresentou a maior viabilidade (100,00%) para ninfas de primeiro instar da mosca-branca (F = 1,94; gl = 12; P = 0,0448) (Tabela 3). A menor viabilidade para o segundo instar foi verificada em IMAN W (86,10%), diferindo de H e OE (F = 0,96; gl = 12; P = 0,0042). No terceiro instar, o genótipo IMAN W apresentou a menor viabilidade (73,38%), diferindo de MG, J, OE, H, G e CCB que apresentaram as maiores viabilidades (F = 2,46; gl = 12; P = 0,0104), com índices acima de 95%. Para o quarto instar, o genótipo MOP apresentou a menor viabilidade (82,02%), diferindo de RI-919, J, OE, MG, H, CCB, LG e IAC-CM que apresentaram índices de viabilidade ninfal acima de 95% (F = 1,32; gl = 12; P = 0,0023). Considerando-se todo o período ninfal, verificou-se que MOP (58,33%), IMAN W (61,99%) e VE (62,21%) permitiram os menores índices de viabilidade. De maneira oposta, MG (92,21%) e CCB (88,33%) propiciaram os maiores índices de viabilidade (F = 2,11; gl = 12; P = 0,0286). Na presença de alimento, as moscas-brancas provenientes dos genótipos IAC-CM e IMAN W mostraram as menores médias (1,8 e 1,7 dias, respectivamente). CCB (3,8 dias) e P1C (3,2 dias) apresentaram as maiores médias de longevidade (F = 5,30; gl = 12; P <0,0001), diferindo dos demais materiais (Fig. 2). Na ausência de alimento, a longevidade foi menor em LG, MG e IMAN W (1,0 dia) e maior em CCB (1,6 dias) e OE (1,4 dias) (F = 3,11; gl = 12; P = 0,0017). 52 2.4 Discussão O período de incubação médio foi de 5,97 dias. Embora não existam dados disponíveis sobre a biologia do inseto em couve, estudos realizados sob condições ambientais semelhantes reportaram médias de incubação entre 6 e 7 dias para as culturas de feijão-caupi (Rodrigues et al., 2012, Cruz et al., 2014), soja (Silva et al., 2012, Cruz e Baldin, 2016), feijão (Mansaray e Sundufu, 2009) e tomate (Baldin et al., 2005). A duração média do período ninfal da mosca-branca nos genótipos de couve-de- folhas foi de aproximadamente 16 dias. Esses resultados são similares aos encontrados por Elsey e Farnham (1994), que avaliaram diferentes espécies de brássicas, incluindo a couve-de-folhas, e obtiveram médias de duração da fase jovem variando de 13,0 a 14,8 dias. Diversos estudos mostraram períodos de duração entre 11 e 18 dias em melão (Baldin et al., 2012), soja (Musa e Ren, 2005), feijão (Oriani e Lara, 2000), feijão-caupi (Cruz et al., 2014) e tomate (Baldin et al., 2005). Por se tratar de um inseto altamente polífago, a duração da fase jovem da mosca-branca pode variar significativamente em função do hospedeiro (Byrne e Bellows Jr., 1991) e de condições ambientais (Gerling, 1990). Entretanto, o prolongamento acentuado de fases imaturas do inseto em um determinado genótipo em comparação com outros da mesma espécie sugere a ocorrência de resistência (Painter, 1951). Em nosso estudo, o genótipo P1C exigiu 22,68 dias até que o inseto pudesse completar a fase jovem; ou seja, cerca de nove dias a mais em comparação com RI- 919 (13,45 dias). As ninfas de terceiro instar confinadas ao genótipo P1C necessitaram de 13,63 dias antes de passarem para o quarto instar, ou seja, quase 10 dias a mais do que aquelas confinadas em IAC-CM (3,93 dias), indicando a presença de compostos indesejáveis nas folhas do material. Esse fato pode também estar associado à viabilidade ninfal baixa (66,66%) obtida com os insetos confinados em P1C. O prolongamento da fase imatura verificado em P1C sugere que o material é menos adequado ao desenvolvimento das ninfas de B. tabaci biótipo B e indica a expressão de antibiose e/ou antixenose no genótipo (Smith, 2005). Os efeitos antibióticos de uma planta resistente podem ser brandos ou letais, dependendo dos teores ou densidade com que ocorrem e geralmente estão associados a fatores 53 químicos e/ou morfológicos, tais como a presença de proteínas, aminoácidos, ácidos graxos e tricomas (Panda e Khush, 1995). Insetos que tentam colonizar plantas portadoras de antibiose podem apresentar reduções no tamanho e no peso, elevados índices de mortalidade (principalmente nas fases imaturas), deformidades, além de prolongamentos das fases do ciclo de vida (Painter, 1951). Considerando-se o período médio de desenvolvimento de ovo a adulto, o genótipo P1C (29,45 dias), seguido por MG (24,03 dias), LG (23,88 dias) e H (23,74 dias) prolongaram o ciclo da mosca-branca indicando a expressão de antibiose, conforme discutido anteriormente. RI-919 e CCB exigiram menor tempo para a conclusão do ciclo e, portanto, apresentam maior suscetibilidade. A duração do ciclo de vida da mosca-branca é afetada por fatores ambientais (Brown e Bird, 1992) e também pela espécie de planta hospedeira, variando de 17 a 22 dias em culturas como a soja (Lima e Lara, 2004), repolho (Villas Bôas et al., 1997), feijão-caupi (Cruz e Baldin, 2014) e de 25 a 27 dias em tomate (Baldin et al., 2005), e poinsétia (Villas Bôas et al., 1997). A diferença entre o tempo exigido para que a mosca-branca completasse o ciclo no genótipo resistente P1C (29,45 dias) e no suscetível CCB (18,89) é superior a 10 dias, ressaltando a importância do uso de genótipos resistentes para o manejo da mosca- branca na cultura da couve-de-folhas. Além da duração do ciclo, a viabilidade das fases imaturas do inseto confinado a diferentes genótipos é um importante parâmetro para a caracterização de resistência (Panda e Khush, 1995). No presente estudo verificou-se variação nos índices de viabilidade ninfal dentro de cada instar da mosca-branca (71,66 a 100,00%), indicando que a suscetibilidade/resistência pode variar ao longo dos estágios de desenvolvimento do inseto. Considerando-se a viabilidade total da fase imatura, os índices variaram de 58,33% a 92,21%. MOP (58,33%), IMAN W (61,99%) e VE (62,21%) destacaram-se com os menores índices, indicando a ocorrência de resistência por antibiose. No entanto, a expressão conjunta de antibiose e antixenose (alimentação) não pode ser descartada, uma vez que o consumo do inseto não foi quantificado neste estudo. Conforme discutido por outros autores (Panda e Khush, 1995, Diaz-Montano et al., 2006, Stout, 2013), plantas expressando elevados níveis de antixenose podem também causar efeitos deletérios, como subdesenvolvimento, altos índices de mortalidade e atraso no ciclo de vida, em decorrência da presença de fatores inibidores de alimentação, o que pode ser erroneamente atribuído à expressão isolada de antibiose. 54 Outros estudos identificaram a ocorrência de antibiose e/ou antixenose sobre o mesmo biótipo de mosca-branca, reportando variações de viabilidade entre 36,1% e 100% em abobrinha (Baldin e Beneduzzi, 2010), 68,6% a 89,6% em soja (Cruz e Baldin, 2016), 45,5% a 89,1% em feijão-caupi (Cruz et al., 2014) e 46,8% a 84,8% em algodão (Prado et al., 2015). A menor longevidade apresentada por adultos de IMAN W e IAC-CM (com alimento) sugere a presença de fatores antibióticos e/ou antixenóticos de resistência. De maneira oposta, adultos da mosca-branca provenientes do genótipo CCB apresentaram maior longevidade, independente da presença ou ausência de alimento, confirmando a maior suscetibilidade do material. Na ausência de alimento, com exceção a CCB (1,6 dias), as médias de longevidade foram próximas (1,0 a 1,3 dias), semelhante ao verificado em trabalhos com o mesmo objetivo em tomate (Baldin et al., 2005) e soja (Silva et al., 2012). Os dados obtidos nesse estudo mostraram que os genótipos de couve-de-folhas avaliados afetam significativamente o desempenho biológico de B. tabaci biótipo B. As diferenças observadas podem ser decorrentes da inadequação de alguns genótipos como fonte alimentar para o inseto, sugerindo a expressão de antibiose (Painter, 1951, Panda e Khush, 1995). Considerando-se todos os parâmetros avaliados, este estudo demonstrou que os genótipos P1C, MG e LG expressam antibiose e/ou antixenose contra B. tabaci biótipo B, prolongando o ciclo do inseto. IMAN W, MOP e VE também apresentaram resistência, reduzindo a viabilidade ninfal da mosca-branca. Devido à importância do cultivo de couve-de-folhas no mundo (Lin e Harnly, 2009, Trani et al., 2015) e o grande potencial de danos que B. tabaci apresenta para a cultura, a seleção de genótipos resistentes é fundamental e pode representar uma importante ferramenta para o manejo da mosca-branca nas lavouras, principalmente em áreas com histórico de infestação dessa praga. Como parte de nosso estudo mais amplo e que visa a caracterização de genótipos de couve-de-folhas resistentes à mosca-branca, neste trabalho selecionamos alguns genótipos portadores de antibiose e/ou antixenose. Trata-se de um estudo inédito e, embora existam outros aspectos a serem investigados com relação às causas de resistência de couve-de-folhas à mosca-branca (determinação dos teores de cera e caracterizações químicas), as informações apresentadas podem auxiliar nos programas de melhoramento genético focando o desenvolvimento de genótipos resistentes a B. tabaci biótipo B. 55 Agradecimentos Ao Dr. André Luiz Lourenção pelo fornecimento dos genótipos de couve-de-folhas. À CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado ao primeiro autor e ao CNPq, pela Bolsa de Produtividade em Pesquisa (nº 305649/2013-2) concedida ao segundo autor. Referências citadas Agrianual. 2016. Anuário Estatístico da Agricultura Brasileira. (http://www.agrianual.com.br). Baldin, E. L. L., J. D. Vendramim, and A. L. Lourenção. 2005. Resistência de Genótipos de Tomateiro à Mosca-Branca Bemisia tabaci (Gennadius) Biótipo B (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotrop. Entomol. 34: 435-441. Baldin, E. L. L., R. A. Beneduzzi, D. R. 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