1 Clarice Silva Cesário Aspectos parasitológicos e sanitários de tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) de vida livre Parasitological and sanitary aspects of free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) São José do Rio Preto 2021 Câmpus de São José do Rio Preto 2 Clarice Silva Cesário Aspectos parasitológicos e sanitários de tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) de vida livre São José do Rio Preto 2021 Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadoras: FAPESP – Proc. nº 2013/04957-8 FioTec – Proj. IOC-023-FIO-18-2-11 CAPES Orientadora: Profª. Drª. Rita de Cassia Bianchi Coorientador: Prof. Dr. Arnaldo Maldonado Jr. 3 4 Clarice Silva Cesário Aspectos parasitológicos e sanitários de tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) de vida livre Comissão Examinadora Profª. Drª. Rita de Cassia Bianchi UNESP – Câmpus de Jaboticabal Orientadora Prof. Dr. Estevam Guilherme Lux Hoppe UNESP – Câmpus de Jaboticabal Profª. Drª. Natalie Olifiers Universidade Veiga de Almeida - Rio de Janeiro Profª. Drª. Karin Werther UNESP – Câmpus de Jaboticabal Profª. Drª. Raquel de Oliveira Simões Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro São José do Rio Preto 17 de maio de 2021 Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. FAPESP – Proc. nº 2013/04957-8 FioTec – Proj. IOC-023-FIO-18-2-11 CAPES 5 À fauna e aos tamanduás-bandeira, por despertarem meu encanto acadêmico. Às cientistas e conservacionistas, inspiradoras e símbolos de persistência. À minha mãe Maria Gorete, mulher de mais raro afeto. 6 AGRADECIMENTOS Agradeço pelo apoio institucional, estrutural, logístico, acadêmico e/ou intelectual: À Universidade Estadual Paulista de São José do Rio Preto e ao PPG em Biologia Animal do IBILCE/Unesp. À Unesp de Jaboticabal, aos amigos do Laboratório de Ecologia de Mamíferos (LEMA) e à minha orientadora, professora Drª. Rita de Cassia Bianchi. Ao Laboratório de Animais Silvestres, à professora Drª Karin Werther, ao Laboratório de Imunoparasitologia, professor Dr. Marcos Rogério André e à Ana Cláudia Calchi. Ao Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz, ao Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios (LABPMR), meu coorientador Dr. Arnaldo Maldonado Jr., Drª. Natalie Olifiers, Drª Ana Paula do Nascimento Gomes e Drª Elisa Pucu. Ao Laboratório de Biologia Estrutural, à Drª. Helene Santos Barbosa, Plataforma de Microscopia Eletrônica Rudolf Barth, Coleção Helmintológica do IOC, ao Dr. Marcelo Knoff, Setor de Produção e Tratamento de Imagem do IOC e a todos os técnicos do IOC que me ajudaram. À Comissão Técnico-Científica do Instituto Florestal do Estado de São Paulo, ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade e Comitê de Ética para Uso Animal da Unesp de Jaboticabal. À Estação Ecológica de Santa Bárbara e gestora Sra. Marli Cardoso, ao Parque Estadual Furnas do Bom Jesus e gestor Sr. Gabriel Pereira e a todos os funcionários das referidas unidades que me ajudaram. Agradeço pelo apoio financeiro: O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pela concessão de financiamento para realização da pesquisa, processo nº 2013/04957-8. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela concessão da minha bolsa de doutorado. À Unesp de Jaboticabal e sua Pró-Reitoria de Extensão Universitária e ao PPG em Biologia Animal da Unesp de São José do Rio Preto, pelos auxílios com deslocamento. À FIOTEC (Fundação de Amparo à Fiocruz) e ao LABPMR pelos auxílios com diárias. Ao “patrocínio familiar” dos meus pais, Gorete e Fernando, meu marido Rafael e minha vó Lila, que desde o mestrado supriram a falta de recursos para as minhas pesquisas. 7 Agradeço aos orientadores e companheiros de jornada acadêmica: À minha orientadora, Drª. Rita Bianchi, o meu eterno reconhecimento por ter dado asas às minhas ideias, pela acolhida carinhosa em seu laboratório e sua casa e por todo conhecimento, experiências e fortes emoções compartilhados. Ao meu coorientador, Dr. Arnaldo Maldonado, minha gratidão por ter me respeitado profundamente, por não ter medido esforços para que o trabalho com os nematódeos desse certo e pelo incentivo às minhas descobertas profissionais e pessoais. Ao meu coorientador no primeiro projeto, Dr. Matthew Gompper, pela atenção aos meus anseios, por ter sido compreensivo, generoso, conselheiro e inspirador. Aos amigos do LEMA, com quem dividi momentos fraternais, especialmente as manas de república, Júlia e Jéssica, minhas âncoras em Jaboticabal e nas aventuras “extras”. Também a Mateus, Daiana, Kimberly, Renan, Larissa, Rômulo, Bárbara, Gisele, Eduardo, Alessandra, Mª Fernanda e Clara, meu muito obrigada pelo afeto, pelos campos, trocas profissionais, pelas vivências de extensão, de boteco e de família. À equipe de campo que viveu “sangue, suor e lágrimas”, mas também o privilégio e o prazer de estarmos juntos em lugares incríveis e fazendo o que amamos: Alessandra Bertassoni, Rullian Ribeiro, Juliana P. de Oliveira, Pedro Teles, Pedro H. F. Peres, Camila D. Larson, Alexandre Martins e Vinícius Gasparotto. Aos amigos do LABPMR, com quem tive a alegria de viver dois anos de muito aprendizado, crescimento pessoal e profissional, sou muito grata pelo acolhimento e carinho sincero, especialmente a Arnaldo, Natalie, Ana Paula, Thiago, Bia, Raquelzinha, Karina, Natália, Tainá, Camila, Raquel, Bruna, Rute, Michele e Tati. Agradeço pelo amparo emocional e apoio ilimitado: Ao meu pai Fernando, por ter me passado o gosto pelos estudos e pela cultura, o olhar atento à sociedade, e por me fazer sentir especial por ter escolhido este caminho. À minha mãe Gorete, de inumeráveis predicados, que sabe me projetar e me afagar como ninguém, que me ensina todos os dias a ser uma mulher melhor. Aos irmãos Pablo e Ludmila, em quem me espelho para conquistar meu lugar ao sol, meus trampolins, que me presentearam com meus amados Luana, Fernando e Helena. Ao meu marido Rafael, meu porto seguro e minha calmaria, que me enche de orgulho, a quem só tenho a agradecer por tudo que construímos e pelo que está por vir. 8 Aos Silva, Cesário, meus sogros Sr. Hipólito e Maria do Carmo e cunhados Bruno, Bel e Emanoel, agradeço pelo amor, dias de sol e cerveja e abrigos temporários nessas andanças acadêmicas, especialmente a Gio e Deh, Robim e Fran, Robertim e Dani. Não posso me esquecer do meu companheiríssimo, amabilíssimo e super protetor canino, Tigrão, meu ativador diário de ocitocina, e à trupe de rua que me abastece de sonhos. Às amigas, que não largaram a minha mão neste percurso complexo que é o doutorado, que foram empáticas, companheiras e compreensivas, cada uma à sua maneira: Lud, Ana (Paula), Ciça, Ju, Jéssica, Mi, Rê, Ana (Carolina), Fer, Cabeça e Dudinha. Agradecimento final Meu último agradecimento é aos tamanduás-bandeira e demais animais, que são minha vida e meu trabalho. Recebo desta convivência o conhecimento, a experiência e muitos motivos para admirá-los sempre mais. Espero continuar retribuindo a eles tudo o que me tem sido proporcionado e ser capaz de fazer a diferença para a conservação da fauna silvestre. 9 “O fascsimo é a máscara mortuária do conhecimento.” [MÁRCIA TIBURI, 2018 – em ‘Como conversar com um fascista’] “Para navegar contra a corrente são necessárias condições raras: espírito de aventura, coragem, perseverança e paixão.” [NISE DA SILVEIRA - em ‘Nise: arqueóloga dos mares’ (Horta, 2008)] 10 RESUMO O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) é vulnerável à extinção em várias escalas e tem sido crescente alvo de pesquisas nas últimas décadas. Nossos objetivos gerais com este trabalho foram (1) discutir sobre as variações dos parâmetros fisiológicos de tamanduás- bandeira de vida livre anestesiados, (2) caracterizar seu estado de saúde a partir de exames sanguíneos e infestação de parasitas, e (3) estudar a taxonomia de nematódeos do gênero Aspidodera encontrados em um dos indivíduos. As capturas e imobilizações de nove tamanduás-bandeira ocorreram em uma área protegida de bioma Cerrado no estado de São Paulo, sudeste do Brasil, entre 2014 e 2015, com uso da associação de cetamina, midazolam e xilazina, além de atropina e ioimbina. Os animais apresentaram bradipneia, bom relaxamento muscular e estabilidade dos parâmetros fisiológicos ao longo do monitoramento anestésico. A temperatura do ar e a corporal tiveram queda durante o monitoramento e correlacionaram-se positivamente. Os exames sanguíneos demonstraram eritrocitose, trombocitopenia, hemácias microcíticas e hipocrômicas, leucopenia, eosinofilia, alta concentração de LDH, ALT, AST, ureia, ácido úrico e triglicérides, além de baixas taxas de lipase, amilase, creatinina e fosfatase alcalina. Das quatro espécies de carrapatos identificadas, Amblyomma sculptum, A. nodosum e A. calcaratum foram encontradas frequentemente nos indivíduos, enquanto A. parvum, ocorreu em apenas um. Dos morfotipos de ovos/oocistos de parasitas gastrointestinais encontrados nas fezes, os de maior prevalência foram Trychostrongylidae, Aspidodera spp. e Apicomplexa. Mas além desses, identificamos Ascaridoidea, Trichuris spp. e Physaloptera spp. Apenas um tamanduá-bandeira mostrou-se positivo para o hemoparasita Mycoplasma spp. Todos testaram negativo para os demais agentes investigados (Ehrlichia canis, E. chaffeensis, Anaplasma spp. e Hepatozoon spp.). Redescrevemos duas espécies de Aspidodera, A. fasciata e A. scoleciformis, a partir de estruturas de machos e fêmeas, as comparamos com as congenéricas encontradas em Xenarthra e incluímos A. fasciata na filogenia molecular do grupo. Descrevemos uma nova espécie de Aspidodera a partir de dois espécimes fêmeas com uso de microscopia eletrônica e criamos uma nova chave de identificação para o gênero. Este estudo traz informações inéditas para a espécie e um alerta para o limitado conhecimento sobre saúde e parasitismo de tamanduás-bandeira de vida livre. Palavras–chave: Medicina da Conservação. Tamanduá-bandeira. Parasitismo. Imobilização animal. Taxonomia integrativa. 11 ABSTRACT The giant anteater (Myrmecophaga tridactyla) is vulnerable to extinction at various scales and has been a growing research target in recent decades. Our general objectives with this work were (1) to discuss about the variations in physiological parameters of anesthetized free-living giant anteaters, (2) characterize their health status from blood exams and parasite infestation, and (3) to study the taxonomy of nematodes from Aspidodera genus found in one of the individuals. The captures and immobilizations of nine giant anteaters occurred in a protected area of the Cerrado biome in São Paulo state, Southeastern Brazil, between 2014 and 2015, using the combination of ketamine, midazolam and xylazine, in addition to atropine and yohimbine. The animals presented bradypnea, good muscle relaxation and physiological parameters stability during anesthetic monitoring. Air and body temperature decreased during the monitoring and were positively correlated. Blood exams showed erythrocytosis, thrombocytopenia, microcytic and hypochromic red blood cells, leucopenia, eosinophilia, high concentration of LDH, ALT, AST, urea, uric acid and triglycerides, in addition to low rates of lipase, amylase, creatinine and alkaline phosphatase. Of the four tick species identified, Amblyomma sculptum, A. nodosum and A. calcaratum were frequently found on the individuals, while A. parvum occurred in only one. Of the egg/oocysts morphotypes of gastrointestinal parasites found in feces, the most prevalent were Trychostrongylidae, Aspidodera spp. and Apicomplexa. In addition to these, we identified Ascaridoidea, Trichuris spp. and Physaloptera spp. Only one giant anteater was positive for the hemoparasite Mycoplasma spp. All of them tested negative for the other agents investigated (Ehrlichia canis, E. chaffeensis, Anaplasma spp. and Hepatozoon spp.). We redescribed two species of Aspidodera, A. fasciata and A. scoleciformis, from male and female structures, compared them with the congeneric ones found in Xenarthra and included A. fasciata in the molecular phylogeny of the group. We described a new species of Aspidodera from two female specimens using electron microscopy and created a new identification key for the genus. This study brings unprecedented information for the species and an alert to the limited knowledge about health and parasitism of free-living giant anteaters. Keywords: Conservation Medicine. Giant anteater. Parasitism. Animal immobilization. Integrative taxonomy. 12 LISTA DE FIGURAS / LIST OF FIGURES INTRODUÇÃO GERAL Figura 1. Ocupação do solo da Estação Ecológica de Santa Bárbara (delineado vermelho) e entorno, localizada no município de Águas de Santa Bárbara, estado de São Paulo, Brasil. 27 MANUSCRITO 1 Figure 1. Day and time of captures and procedures duration of nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015 at Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. 45 Figure 2. Variation in heart and respiratory rates of nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015, at Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. 46 Figure 3. Variation of air and body temperature of nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015, at Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. 48 MANUSCRITO 2 Figure 1. Observations on physical examintaion of an anesthetized senile giant anteater (Myrmecophaga tridactyla) from Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. A. Scars on snout. B. Dry skin, flaking and pigmentation spots on the snout. C. Mild alopecia abdominal and medial on members. D. Subcutaneous nodules/cysts on axillary regions (0.5 cm). 70 Figure 2. Helminth eggs from free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) from Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Southeastern Brazil. 78 Figure 3. Apicomplexa from free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) from Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Southeastern Brazil. 78 13 Figure 4. Scale of parasitism intensity based on tick and gastrointestinal load of eight giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) (four male and four female) from the Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Southeastern Brazil. 79 MANUSCRITO 3 Figure 1A-1J. Line drawing of Aspidodera fasciata from Myrmecophaga tridactyla. 1A. Anterior end with hood and cephalic cordons, nerve ring, excretory pore and esophagus with terminal bulb; 1B (dextroventral region), 1C (dorsal-dextroventral region). Hood showing amphid, papilla, papillary nodule, interlabium, labial-root and neck-like cuticle with papillae; 1D. Genital system of female showing vulva and uterus with eggs; 1E. Egg; 1F. Posterior end of female showing rectum and anus; 1G (lateral view), 1H (ventral view). Posterior end of male showing genital sucker, spicules, gubernaculum, caudal spine and caudal papillae; 1I. Gubernaculum; 1J. Spicule. 116 Figure 2A-2I. Line drawing of Aspidodera scoleciformis from Myrmecophaga tridactyla. 2A. Anterior end with hood and cephalic cordons, nerve ring, excretory pore and esophagus with terminal bulb; 2B (dorsal-dextroventral region), 2C (sinistroventral region). Hood showing amphid, papilla, papillary nodule, interlabium with pore-like papilla on apex, labial-root and a cordon of papillae posterior to hood; 2D. Genital system of female showing vulva and uterus with eggs; 2E. Egg; 2F. Posterior end of female showing rectum and anus; 2G. Posterior end of male showing genital sucker, spicules, gubernaculum, caudal spine and caudal papillae; 2H. Gubernaculum; 2I. Spicule. 117 Figure 3A-3L. Scanning electron micrographs of adult Aspidodera fasciata from Myrmecophaga tridactyla. 3A. Anterior end with hood and cephalic cordons, dorsal lip (DL), ventral lips (VL), interlabium (i), slender projection of lip (p), inter-root expansion (Ir), neck-like cuticle (Nl), excretory pore (Ep); 3B. Oral aperture with lips showing digitiform projections (thin arrow), small projections (full arrowhead), dextroventral lip projection marked undulated (empty large arrow) and vestibulum (ve); 3C. Oral aperture with dorsal lip (DL), amphid (am), papilla (pap), papillary nodule (Pn), dextroventral lip projection marked undulated (empty large arrow) and the oral vestibulum lined with cuticular 118 14 lamellae (asterisk); 3D. Neck-like cuticle with papillae (empty arrowhead); 3E. Excretory pore; 3F. Vulva; 3G. Anus; 3H. Posterior end of male showing genital sucker (Gs), cloaca (cl), caudal spine (Cs) and distribution of caudal papillae; 3I. Genital sucker, cloaca and some papillae in detail; 3J. Exposed spicule (S), genital sucker (Gs) and the tapering tip of gubernaculum (Gu); 3K. Lateral alae absent; 3L. Tale of male showing double papillae (full large arrow) and caudal spine (Cs). Figure 4A-4k. Scanning electron micrographs of adult Aspidodera scoleciformis from Myrmecophaga tridactyla. 4A. Anterior end with hood and cephalic cordons, dorsal lip (DL), ventral lips (VL), interlabium (i), slender projection of lip (p), inter-root expansion (Ir); 4B. Oral aperture with lips showing digitiform projections (thin arrow), small projections (full arrowhead), dextroventral lip projection (empty large arrow) and vestibulum (ve); 4C. Oral aperture with dorsal lip (DL), amphid (am), papilla (pap), pore-like papilla (Pp) on the apex of interlabium and the oral vestibulum lined with cuticular lamellae (asterisk); 4D. Lined papillae posterior to hood (empty arrowhead); 4E. Excretory pore; 4F. Vulva; 4G. Anus; 4H. Posterior end of male showing genital sucker (Gs), cloaca (cl), caudal spine (Cs) and distribution of caudal papillae; 4I. Lateral alae absent; 4J. Tale of male showing simple papilla (full large arrow) and caudal spine (Cs); 4K. Genital sucker, cloaca and some papillae in detail. 119 Figure 5. Bayesian inference phylogenetic reconstruction tree of 16S rRNA gene sequences of Aspidodera fasciata in the present study (consensus sequence) and Aspidodera sequences from GenBank. The species Lauroia bolivar and L. trinidadensis are outgroups. Node values are BP-ML. 121 MANUSCRITO 4 Figures 1-5. Line drawings of Aspidodera serrata n. sp., female. 1. Entire nematode, lateral view. 2. Hood showing dextroventral lip, amphid, papilla, papillary nodule, interlabium, labial-root with pore-like papilla, serrated cephalic cordons and neck-like cuticle. 3. Genital system showing vulva, muscular ovojector, vulvar vestibules and posterior and anterior uterus. 4. Terminal portion of the gastrointestinal system, showing rectum and anus. 5. Unembryonated egg with thick and smooth shell. 134 15 Figure 6. Light micrograph of Aspidodera serrata n. sp., female. Hood showing sinistroventral lip (VL), dorsal lip (DL), cephalic cordons with anterior smooth cordons (sm) and posterior serrated cordons (se), interlabium (i) and inter-root expansions (Ir). 135 Figures 7-12. Scanning electron micrographs of Aspidodera serrata n.sp., female. 7. Hood showing dorsal lip (DL), lateroventral lips, serrated cephalic cordons, slender projections of lips (p), interlabium (i), inter-root expansions (Ir) and neck-like cuticle (Nl). In detail, pore-like papilla (Pp) and serrated cephalic cordons. 8. Oral aperture with lips showing digitiform projections (thin arrow), small acute projections (full arrowhead), dextroventral lip projection shallow undulated (large arrow), amphid (am), papilla (pap), papillary nodule (Pn). Cephalic end showing the oral vestibulum lined with cuticular membranes with an external smooth edge (asterisk). 9. Lateral alae. 10. Vulva. 11. Anus with small papillae (empty arrowhead). 12. Posterior end. In detail, phasmid (ph) and papilla (pap) on tail. 136 16 LISTA DE TABELAS / LIST OF TABLES MANUSCRITO 1 Table 1. Characteristics of free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) capture campaigns at Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. 44 Table 2. Doses used to immobilize nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015, at the Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. 45 Table 3. Physiological parameters and air temperature during the monitoring of nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015, at the Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. 47 Table 4. Physiological parameters and duration of monitoring steps of nine free- living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015, at Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. 49 MANUSCRITO 2 Table 1. Oligonucleotide sequences and thermal conditions used in conventional PCR assays. 68 Table 2. Evaluation of visual inspection, physical exam, observations on anesthetic monitoring and general condition of nine giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) captured on Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Southeastern Brazil. 71 Table 3. Comparison of hematological data (means and standard deviation) between the present study and other researches from literature about captive and free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla). 73 Table 4. Hematological data from seven free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) from the Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Southeastern Brazil. 74 17 Table 5. Comparison of biochemical data (means and standard deviation) between the present study and other researches from literature about captive and free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla). 75 Table 6. Serum biochemistry data from seven free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) from the Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Southeastern Brazil. 76 Table 7. Diversity and infestation of ticks on nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) from the Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Southeastern Brazil. 77 Table 8. Parasitic load obtained by OPG and OoPG from free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) from the Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Southeastern Brazil. 79 MANUSCRITO 3 Table 1. Accession numbers of GenBank sequences used in our phylogenetic analyzes with 16S rRNA gene. 110 Table 2. Morphometric data for males of Aspidodera nematodes that parasitize xenarthrans. 114 Table 3. Morphometric data for females of Aspidodera nematodes that parasitize xenarthrans. 115 Table 4. Morphological data of Aspidodera nematodes that parasitize xenarthrans. 123 MANUSCRITO 4 Table 1. Comparative measurements for female specimens of Aspidodera serrata n. sp. (this study) and the most similar Aspidodera species (literature compilation). Ranges of body, hood, bulb and egg are for length and width (separated by a “x”). 138 18 LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES / LIST OF SYMBOLS AND ABBREVIATIONS ha hectare % percent kg kilogram km² square kilometers º degree ’ minute ” second º C Celsius degree ® Trademark mg/kg milligram per kilogram mg/ml milligram per milliliter bpm heart beats per minute rpm breathing movements per minute ± more or less min minutes GPS Global Positioning System µl microliters g/dL gram per decilitre fL fentoliter Pcg Picogram e.g. exempli gratia TM Trademark ISIS International Species Information System nº number OPG eggs per gram of feces OoPG oocytes per gram of feces cm centimeter RBC Red Boold Cels MCV Mean Corpuscular Volume MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration MCH Mean Corpuscular Haemoglobin 19 WBC White Blood Cels TPP Total Plasma Protein A/G Relation of Albumin and Globulin mg/dL milligram per deciliter mmol/dL millimoles per liter ALT Alanine Transaminase IU/L International Unit per Liter AST Aspartate Transaminase AF Alkaline Phosphatase GGT Gamma-Glutamyl Transferase CK Creatine Kinase LDH Lactate Dehydrogenase µm micrometers SEM Scanning Electron Microscopy pH potential of Hydrogen M Molar O5O4 osmium tetroxide kV quilovolts PCR Polymerase Chain Reaction DNA Deoxyribonucleic Acid rRNA ribosomal Ribonucleic Acid Na sodium ML Maximum Likelihood nm nanometers CO2 carbon dioxide BI Bayesian Inference AIC Akaik Information Criterion aLRT approximate Likelihood-Ratio Test ML-BP nonparametric Bootstrap Percentages BPPs Bayesian Posterior Probabilities n.sp. new species 20 SUMÁRIO / SUMMARY 1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................. 23 1.1. Referências .............................................................................................. 28 1. 2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 37 1.1. Objetivo geral .......................................................................................... 37 2.2. Objetivos específicos .............................................................................. 37 3. MANUSCRITO 1: Imobilização, monitoramento anestésico e influência da temperatura do ar em tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) de vida livre ................................ 38 Immobilization, anesthetic monitoring and air temperature influence on free- living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) ................................................. 39 3.1. Introduction ............................................................................................ 40 3.2. Material and methods ............................................................................ 41 3.2.1. Study area ................................................................................... 41 3.2.2. Data collection ............................................................................ 42 3.2.3. Data analyses .............................................................................. 43 3.3. Results ..................................................................................................... 43 3.4. Discussion ................................................................................................ 49 3.5. References ............................................................................................... 53 4. 4. MANUSCRITO 2: Estado de saúde do ameaçado tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) no Cerrado brasileiro ..................................................................................................... 60 Health status of the endangered giant anteater (Myrmecophaga tridactyla) in the Brazilian Cerrado ......................................................................................... 61 4.1. Introduction ............................................................................................ 62 4.2. Material and methods ............................................................................ 63 4.2.1. Study area ................................................................................... 63 4.2.2. Data collection and analyses ..................................................... 63 4.2.2.1. Physical condition .................................................... 64 4.2.2.2. Hematology and serum biochemistry ..................... 64 4.2.2.3. Ticks assessment ....................................................... 65 21 4.2.2.4. Hemoparasites assessment ....................................... 65 4.2.2.5. Coproparasitological assessment ............................ 66 4.3. Results ..................................................................................................... 69 4.3.1. Physical condition ...................................................................... 69 4.3.2. Hematology and serum biochemistry ...................................... 72 4.3.3. Ticks ............................................................................................ 77 4.3.4. Hemoparasites ............................................................................ 78 4.3.5. Coproparasitology …................................................................. 78 4.4. Discussion ................................................................................................ 80 4.4.1. Physical condition ...................................................................... 80 4.4.2. Hematology and serum biochemistry ...................................... 81 4.4.3. Ticks and Hemoparasites .......................................................... 86 4.4.4. Coproparasitology ..................................................................... 86 4.5. References ............................................................................................... 88 5. MANUSCRITO 3: Novos dados morfológicos e genéticos de duas espécies de Aspidodera (Nematoda: Heterakoidea) em tamanduá-bandeira Myrmecophaga tridactyla Linnaeus, 1758 (Mammalia: Myrmecophagidae) ................................................... 105 New morphological and genetic data of two Aspidodera species (Nematoda: Heterakoidea) in the giant anteater Myrmecophaga tridactyla Linnaeus, 1758 (Mammalia: Myrmecophagidae) .............................. 106 5.1. Introduction .......................................................................................... 107 5.2. Material and methods .......................................................................... 108 5.2.1. Specimens collection ................................................................ 108 5.2.2. Molecular analyses .................................................................. 109 5.3. Results ................................................................................................... 110 5.3.1. Taxonomic summary ............................................................... 110 5.3.2. Redescription of Aspidodera fasciata ..................................... 111 5.3.3. Redescription of Aspidodera scoleciformis ............................ 112 5.3.4. Molecular analyses .................................................................. 120 5.3.5. Remarks .................................................................................... 122 5.4. Discussion .............................................................................................. 124 5.5. References ............................................................................................. 125 22 6. MANUSCRITO 4: Uma nova espécie de Aspidodera (Nematoda: Heterakoidea) parasitando o tamanduá-bandeira Myrmecophaga tridactyla (Pilosa: Myrmecophagidae) no Brasil e nova chave para as espécies ...................................................................... 128 A new species of Aspidodera (Nematoda: Heterakoidea) parasitizing the giant anteater Myrmecophaga tridactyla (Pilosa: Myrmecophagidae) in Brazil and new key to species .............................................................................. 129 6.1. Introduction ......................................................................................... 130 6.2. Material and methods ......................................................................... 130 6.3. Results .................................................................................................. 132 6.3.1. Generic diagnosis .................................................................... 132 6.3.2. Description ............................................................................... 132 6.3.3. Taxonomic summary .............................................................. 133 6.3.4. Remarks ................................................................................... 137 6.3.5. Key for the species .................................................................. 139 6.3.6. Aspidodera species recovered from the host ......................... 139 6.4. Discussion ............................................................................................. 140 6.5. References ............................................................................................ 141 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 143 Anexo A - Parecer de aprovação do projeto na Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista ....................................................................... Anexo B - Autorização para execução do projeto concedida pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e do Recursos Naturais (IBAMA) e Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), Brasil ....... 145 ............................. 146 23 1. INTRODUÇÃO GERAL O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla Linnaeus, 1758) é um mamífero Xenarthra com origem há 13 milhões de anos (Delsuc & Douzery, 2008; Gibb et al., 2015). Sua distribuição original compreende do norte da América Central, onde é o mamífero mais ameaçado (Superina et al., 2010), ao sul da América do Sul (Miranda et al., 2014a). Ele é considerado extinto em Belize, Costa Rica e Guatemala, regionalmente extinto no Uruguai, e pouco se sabe sobre seu estado de conservação em algumas áreas, incluindo em partes do Brasil (Miranda et al., 2014a,b). No Brasil está presente nos seis biomas (Paglia et al., 2012), mas possivelmente extinto nos Pampas, quase extinto na Caatinga (Miranda et al., 2014a; Dias et al., 2019), em baixas densidades na Mata Atlântica (Passos et al., 2017) e sob drásticas reduções populacionais no Cerrado (Miranda et al., 2014a; Diniz & Brito, 2015; Rocha et al., 2018; Bertassoni et al., 2019). A principal ameaça à espécie é a perda e fragmentação do habitat, que desencadeiam atropelamentos (Diniz & Brito, 2013; Freitas et al., 2014; Desbiez et al., 2020), perseguição por cães (Lacerda et al., 2009), morte em incêndios (Silveira et al., 1999; Diniz & Brito, 2013), caça (Koster, 2008; Ferreira et al., 2013; Bertassoni et al., 2017) e depressão gênica (Collevatti et al., 2007; Clozato et al., 2017). Áreas menores que 200 ha não suprem suas exigências ecológicas (Zanirato, 2017), explicando, em parte, a redução de 30% de sua população nos últimos 26 anos (Miranda et al., 2014a). Estima-se que a espécie provavelmente desapareça do estado de São Paulo entre 20 e 30 anos (FAPESP, 2017). Tamanduás-bandeira desenvolveram adaptações ao longo do seu processo evolutivo para conservarem energia, provavelmente como resultado de uma dieta pobre em calorias (formigas e cupins) (Fernandes & Young, 2007). Eles são homeotérmicos imperfeitos e possuem baixas temperatura corporal e taxa de metabolismo basal - cerca de 3º C a menos e o equivalente a 34%, respectivamente - quando comparados com mamíferos de massa corporal similar (McNab, 1984, 1985). Seus padrões de uso do habitat dependem da temperatura do ar, se estão ou não em atividade e da sazonalidade (Medri & Mourão, 2005; Camilo-Alves & Mourão, 2006; Di Blanco et al., 2015, 2016). Embora seja uma espécie geralmente considerada de áreas abertas, porque as usam mais durante seus períodos de atividade, áreas florestais agem como um refúgio de temperatura e podem ser um fator chave para tamanduás-bandeira (Bertassoni et al., 2019). Eles utilizam ambientes com maior cobertura vegetal para termorregular (Camilo- Alves & Mourão, 2006), repousar (Medri & Mourão, 2005) e se abrigar (Kreutz et al., 2012). Apesar de crescente o número de publicações envolvendo o tamanduá-bandeira nas duas últimas décadas (Diniz & Brito, 2012), há muitas lacunas sobre seu estado sanitário e 24 parasitismo, especialmente para indivíduos de vida livre. Essas lacunas se manifestam, inclusive, em áreas temáticas que subsidiam todo tipo de trabalho de conservação e manejo, como a captura e imobilização farmacológica. Os títulos que abordam o assunto são muito escassos, estão dispersos, são pouco aprofundados e, na maioria das vezes, permanece na experiência e rotina do pesquisador. A escolha de um protocolo anestésico seguro para um indivíduo depende do seu estado de saúde, do conhecimento sobre drogas, fisiologia e comportamento da espécie, e das possíveis influências ambientais. Estas variáveis, no entanto, são pouco conhecidas para a maioria das espécies silvestres, e não é diferente para tamanduás- bandeira. Os maiores problemas clínicos em tamanduás de cativeiro são as doenças digestivas (26%) - principalmente enteroparasitoses (13,5%) -, as desordens nutricionais (20%), as injúrias (15,5%) e as doenças respiratórias (10%). Mas, cerca de 13% dos indivíduos tem afecções de causa inconclusa (Diniz et al., 1995), sugerindo que nossa capacidade de monitoramento da saúde ainda é insuficiente, mesmo em condições mais controladas, como as de cativeiro. Por isso é importante estabelecer parâmetros sanitários que contribuam no diagnóstico precoce de doenças e em programas de conservação. O perfil hematológico de tamanduás-bandeira (Sanches et al., 2013; Di Nucci et al., 2014; Rojano-Bolaño et al., 2014; Oliveira et al., 2017) começou a ser mais investigado nos últimos anos. Ainda sabemos pouco sobre os limites de referência dos parâmetros, quais circunstâncias e como elas interferem nos resultados, o que dificulta as comparações entre os estudos já realizados. Sobre o perfil bioquímico, as referências para a espécie são ainda mais raras (Di Nucci et al., 2014; Oliveira et al., 2018) e este tipo de informação não tem sido bem explorada. Considerando a crescente importância do parasitismo, não apenas na saúde das populações (Ebert et al., 2000; Tompkins et al., 2001; Watson, 2013), mas nas comunidades (Poulin, 1999; Telfer & Bown, 2012) e nos ecossistemas (Thomas et al., 2005; Tompkins et al., 2011), é urgente o entendimento sobre as espécies de parasitas que se relacionam com o tamanduá-bandeira. É esperado que (1) hospedeiros com grande massa corporal sustentem uma comunidade parasitária mais rica já que eles provêm maior área e, como consequência, é possível que espécies que possuem diferentes nichos possam coexistir (Bordes & Morand, 2008; Esser et al., 2016); (2) seus longos e fartos pelos amplifiquem sua superfície de contato com o ambiente comparado com os demais mamíferos (Szabó et al., 2019); (3) a mirmecofagia os predisponha ao consumo de hospedeiros intermediários e ovos/cistos por meio da ingestão acidental de partículas de solo contaminadas (Freitas et al., 2006); (4) sua área de vida relativamente grande dentre hospedeiros vertebrados e sua distribuição em vários biomas os 25 tornem mais expostos a uma maior diversidade de espécies parasitas (Linardi & Avelar, 2014); e (5) conhecemos pouco a diversidade parasitária porque existem poucos levantamentos e descrições de espécies para este hospedeiro. As parasitoses gastrointestinais mais frequentes em tamanduás-bandeira são causadas por protozoários dos gêneros Cryptosporidium, Eimeria, Isospora, Entamoeba, Acanthamoeba e Giardia (Pérez et al., 2015; Rojano et al., 2015; Marinho & Valdes, 2012; Marques & Ludwig, 2011; Freitas et al., 2006; Coke et al., 2002; Diniz et al., 1995; Gardner et al., 1991). Elas estão associadas a quadros diarreicos e debilidade física, bem caracterizados em animais de cativeiro (Diniz et al., 1995; Cubas et al., 2014). O encontro de ovos de Strongyloides spp. (Diniz et al., 1995; Marinho & Valdes, 2012), Ancylostoma spp. (Marinho & Valdes, 2012), Ascaris spp. (Rojano-Bolaño et al., 2014; Rojano et al., 2015) e Trichuris spp. (Diniz et al., 1995) nas fezes foi relatado principalmente em regiões onde a espécie convive mais proximamente ao ser humano e a animais domésticos, como os cães. Mas o estudo mais robusto sobre nematódeos brasileiros é da década de 90 (Vicente et al., 1997), e nele há um pequeno número de trabalhos que envolvem tamanduás-bandeira. Desde então, pouco foi acrescido ao grupo devido à escassez de especialistas em taxonomia e parasitologia de mamíferos silvestres de médio e grande porte. A impossibilidade da coleta destes hospedeiros para obtenção de amostras frescas também é uma das razões, visto que boa parte das espécies estão ameaçadas de extinção, como o tamanduá-bandeira. Além disso, amostras oriundas de animais atropelados muitas vezes se degradam até que sejam recuperadas (Griese, 2007) e os espécimes de coleções helmintológicas são muito antigos, pouco conservados ou pouco numerosos (comunicação pessoal). Existem pelo menos onze espécies de nematódeos descritos para tamanduás-bandeira pertencentes às famílias Aspidoderidae, Molineidae e Physalopteridae, os quais apresentam alta relação de especificidade com hospedeiros Xenarthra (Navone, 1990; Vicente et al., 1997). Tamanduás-bandeira são os principais hospedeiros das formas adultas dos carrapatos das espécies Amblyomma calcaratum e A. nodosum, enquanto as formas jovens preferem se alimentar em passeriformes (Nava et al., 2017; Ogrzewalska & Pinter, 2016). Amblyomma sculptum, do complexo A. cajennense (Nava et al., 2014), também é comum (Martins et al., 2015; Witter et al., 2016; Cançado et al., 2017; Pascoal, 2017; Martins et al., 2004), mas não apresenta relação de especificidade, portanto, parasita uma grande variedade de hospedeiros (Pereira et al., 2000; Nava et al., 2014). A alta prevalência e intensidade de infestações por carrapatos em tamanduás-bandeira é comum e há possibilidade de encontro de mais de uma espécie de carrapato num mesmo hospedeiro (Szabó et al., 2019). Várias das cerca de 70 espécies de carrapatos do Brasil (Barros-Battesti et al., 2015; Krawczak et al., 2015; Wolf et 26 al., 2016) já foram infectadas por pelo menos oito espécies de rickettsias (Oliveira et al., 2008; Almeida et al., 2011; Labruna et al., 2011). O carrapato A. sculptum é o mais comum em picadas a humanos no país e é o principal vetor da bactéria causadora de febre maculosa, Rickettsia rickettsii (Martins et al., 2016). Em tamanduás-bandeira, estudos sobre identificação de bactérias desse gênero são escassos, mas há relatos de sua infecção por R. parkeri (Nieri-Bastos et al., 2018; Szabó et al., 2019), também encontrada em carrapato da espécie A. nodosum numa área endêmica de febre maculosa no Brasil (Moerbeck et al., 2018). Infecções simultâneas com A. nodosum e A. sculptum nessas circunstâncias podem representar um risco de infecção em A. sculptum por R. parkeri, colocando o tamanduá-bandeira como possível fonte desta Rickettsia para humanos (Szabó et al., 2019). Outra bactéria, Anaplasma marginale, causadora de anaplasmose, provoca muitos danos à pecuária nacional e já foi identificada e isolada de um tamanduá-bandeira apresentando os sintomas da doença (Guillemi et al., 2016). No entanto, permanecemos necessitando de esforços para conhecer quais espécies de ectoparasitas e hemoparasitas infectam tamanduás-bandeira, os possíveis danos à sua saúde e o verdadeiro papel deste hospedeiro nestas e em diversas outras doenças infecciosas. A carência de informações sobre estado sanitário e parasitismo em tamanduás-bandeira, as dificuldades em obtê-las na vida livre e a oportunidade de se explorar estes aspectos em populações monitoradas, nos motivou a realizar o estudo registrado nesta tese. Ela se compõe de quatro capítulos originais em formato geral de artigo científico, escritos no idioma inglês. As porções textuais “Introdução geral”, “Objetivos” e “Considerações finais” estão em português. No Capítulo 1, apresento um estudo de caso sobre captura ativa, contenção físico- química e monitoramento anestésico de tamanduás-bandeira de vida livre. No Capítulo 2, realizo um levantamento sanitário da população com uso de análises hematológicas, bioquímica sérica, identificação e infestação de carrapatos e ovos/cistos de parasitas gastrintestinais e identificação de hemoparasitas. No Capítulo 3, caracterizo a morfologia de duas espécies de nematódeos, Aspidodera scoleciformis e A. fasciata, e incluo este último na árvore filogenética do gênero Aspidodera. No Capítulo 4, descrevo uma nova espécie de Aspidodera (A. serrata Cesário et al., 2021) e apresento nova chave de identificação para o gênero. Este estudo fez parte de um projeto (FAPESP nº 2013/04957-8) sobre a população de tamanduás-bandeira da Estação Ecológica de Santa Bárbara (EESB, -22º48’59”, -49º14’12”) e seu entorno. Ele envolveu também outras linhas de pesquisa: genética populacional (Ribeiro, 2016), ecologia espacial e populacional (Bertassoni, 2017), ocupação e padrão de atividade (Zanirato, 2017), toxicologia (Carvalho, 2018), dieta (Polli, 2018) e parasitologia – filo Acanthocephala (Gomes, 2019). A EESB é uma unidade de conservação localizada no estado 27 de São Paulo, sudeste do Brasil, que apresenta um mosaico de fitofisionomias típicas do bioma Cerrado, com destaque para as áreas campestres, raras no estado (Durigan & Ratter, 2006; Melo & Durigan, 2011). É o maior remanescente de área com vegetação nativa da região, imerso em uma paisagem constituída por diferentes usos do solo, como: plantios de cana-de-açúcar, fazendas de pecuária bovina, granjas de frango e suíno, brejos e a Floresta Estadual de Santa Bárbara - composta por silvicultura e malha urbana. Três estradas fragmentam a EESB, as rodovias SP-280, a SP-261 e a estrada de acesso “da Erva”, as últimas não pavimentadas (Figura 1). A EESB contém espécies exóticas como Pinus spp., Eucalyptus spp., Brachiaria spp. (Melo & Durigan, 2011) e fauna invasora, como javali (Sus scrofa), lebre europeia (Lepus europaeus), cães (Canis familiaris) e gatos (Felis catus). Figura 1. Ocupação do solo da Estação Ecológica de Santa Bárbara (delineado vermelho) e entorno, localizada no município de Águas de Santa Bárbara, estado de São Paulo, Brasil. 28 1.1. Referências ALMEIDA, A. P.; CUNHA, L. M.; BELLO, A. C. P. P.; CUNHA, A. P.; DOMINGUES, L. N.; LEITE, R. C.; LABRUNA, M. B. 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Objetivo geral Analisar alguns parâmetros sanitários e parasitológicos de uma população de tamanduás- bandeira de vida livre do Cerrado do estado de São Paulo, Brasil. 2.2. Objetivos específicos - Discutir sobre as variações dos parâmetros fisiológicos de tamanduás-bandeira de vida livre anestesiados em campo. - Avaliar o estado sanitário de tamanduás-bandeira de vida livre através de hematologia, bioquímica sanguínea e levantamento de carrapatos, hemoparasitas e ovos/cistos de parasitos gastrintestinais. - Caracterizar a filogenia molecular e a morfologia de nematódeos do gênero Aspidodera encontrados em um tamanduá-bandeira. - Descrever nova espécie de nematódeo do gênero Aspidodera em um tamanduá-bandeira e propor nova chave taxonômica para o gênero. 38 3. MANUSCRITO 1: Imobilização, monitoramento anestésico e influência da temperatura do ar em tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) de vida livre Resumo Capturamos, realizamos imobilização física e química e monitoramos a anestesia de nove tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) em uma área protegida de bioma Cerrado, no estado de São Paulo, sudeste do Brasil. Também calculamos o esforço e sucesso de captura e testamos a correlação da temperatura do ar com a do corpo de indivíduos anestesiados. As capturas ocorreram principalmente em maio e junho, temperaturas amenas (24,0 ± 3,5º C), áreas abertas e ao entardecer. O conhecimento sobre a área de estudo e população, a experiência da equipe e a possibilidade de tiros com pistola anestésica foram elementos importantes no sucesso de captura. Os animais receberam a associação de cetamina (12,2 ± 4,2 mg/kg), midazolam (0,3 ± 0,1 mg/kg) e xilazina (0,9 ± 0,4 mg/kg), e ainda, atropina (0,04 mg/kg) e ioimbina (0,3 mg/kg). Observamos pouca salivação, ausência de convulsões ou vocalizações, bom grau de relaxamento muscular e estabilidade de parâmetros fisiológicos. Embora dentro das faixas consideradas normais para a espécie, a taxa respiratória esteve baixa em todos os indivíduos e a temperatura corporal, comparativamente mais baixa em dois. A temperatura do ar caiu do início para o final do monitoramento e correlacionou-se positivamente com a temperatura corporal. O estresse de captura provavelmente afetou os tempos de indução (11,8 ± 8,9 min), imobilização (66,3 ± 21,4 min) e recuperação inicial (11,4 ± 5,0 min), superiores aos reportados em literatura. Estudos como este são necessários dada à escassez e dispersão de informações e por contribuírem para estabelecermos estratégias de campo em trabalhos que envolvam captura e anestesia de tamanduás-bandeira. Palavras-chaves: Busca ativa. Contenção físico-química. Drogas anestésicas. Homeotermia imperfeita. Xenarthra. Medicina da conservação. 39 Immobilization, anesthetic monitoring and air temperature influence on free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) Abstract We captured, performed physical and chemical immobilization and monitored the anesthesia of nine giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) in a protected area of Cerrado biome from São Paulo state, Southeastern Brazil. We also calculated the capture effort and success and tested the correlation between air and body temperature in anesthetized individuals. Captures occurred mostly in May and June, mild temperatures (24.0 ± 3.5º C), open areas and at dusk. The knowledge about the study area and population, team experience and the possibility of anesthetic pistol shots were important elements in the capture success. The animals received the association of ketamine (12.2 ± 4.2 mg/kg), midazolam (0.3 ± 0.1 mg/kg) and xylazine (0.9 ± 0.4 mg/kg), and also atropine (0.04 mg/kg) and yohimbine (0.3 mg/kg). We observed little salivation, absence of convulsions or vocalizations, good degree of muscle relaxation and physiological parameters stability. Although within the ranges considered normal for the species, the respiratory rate was low in all individuals and body temperature was comparatively lower in two. Air temperature dropped from the beginning to the end of the monitoring and correlated positively with body temperature. Capture stress probably affected induction (11.8 ± 8.9 min), immobilization (66.3 ± 21.4 min) and initial recovery (11.4 ± 5.0 min) times, higher than those reported on literature. Studies like this are necessary given the scarcity and dispersion of information and because they contribute on establishing field strategies to works involving capture and anesthesia of giant anteaters. Keywords: Active search. Physicochemical restraint. Anesthetic drugs. Imperfect homeothermia. Xenarthra. Conservation medicine. 40 3.1. Introduction Much of research, conservation and management work in medium and large wild mammals require immobilization. It is one of the biggest challenges for the professionals involved because it can expose the animals to injury, morbidity and even death (Nicholson et al., 2000; Arnemo et al., 2006). However, it is surprising how little we know (or report) about capture and anesthesia of most species. This gap is even more relevant in free-living populations, where adverse environmental conditions impose additional concerns, the human and material infrastructure is less and the health and responses of individuals to stress and drugs are little or unknown. Therefore, we need to increase efforts to understand if, how and when physicochemical restraint can affect animal survival. The few information available on capture and anesthesia of giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) is disperse in some unpublished materials, gray literature or concentrated on researchers’ experiences and routines. Aside from the difficulties imposed by the environment and the giant anteaters capture method - active via persecution - there are physiological, behavioral and anatomical particularities that make them anesthetic management quite complex. They feed on prey with low caloric content (McNab, 2000), have low body temperature and basal metabolism rate (McNab, 1984, 1985). As a result, fluctuations in air temperature can affect them body temperature (Camilo-Alves & Mourão, 2006; Fernandes & Young, 2007), as well as influence them activity pattern (Mourão & Medri, 2007; Di Blanco et al., 2016; Bertassoni & Ribeiro, 2019) and habitat use (Mourão & Medri, 2007). Although giant anteaters, in general, escape when they feel threatened, they can behave defensively (Haddad et al., 2014). This also requires caution considering its strength, size and body weight, from 26 to 41 kg in adulthood (Medri & Mourão, 2005). Every Xenarthra, mammalian superorder to which the giant anteater belongs, can be immobilized with cyclohexamine drugs (ketamine, tiletamine) associated with diazepines (midazolam, diazepam, zolazepam) or alpha2-adrenergic agonists (xylazine, dexmedetomidine and medetomidine) (West et al., 2007). Despite diazepines and “alfa2” have a synergistic effect if combined (Bol et al., 2000), curiously, they are little reported in the same protocol on literature. The most cited associations for captive or free-living giant anteaters are ketamine/xylazine, ketamine/midazolam and tiletamine/zolazepam (Deem & Fiorello, 2002; Miranda et al., 2006; West et al., 2007; Rojano-Bolaño et al., 2014). Few studies mention the use of atropine (Gillespie & Adams, 1985; Deem & Fiorello, 2002; Satake & Fagliari, 2006) and antagonists (Kreeger, 1999; Deem & Fiorello, 2002; West et al., 2007). Only two present 41 detailed data on anesthetic monitoring (Carregaro et al., 2009; Canelo, 2017), which is a concern, because such records indicate the effects of drugs, sedation degree and emergencies signs, in addition to enabling comparative studies. It is notoriously tricky to find and capture giant anteaters in wildlife in most of their occurrence area (Bertassoni & Ribeiro, 2019). Data on capture effort and success are not available, and reports on xenarthrans physiological parameters under anesthesia are rare (Gasparotto et al., 2017). Due to their imperfect homeothermia, probably their physiological parameters alter under anesthesia and air temperature will likely affect their body temperature. Anesthetic risks are prompt to happen (Miranda et al., 2006), but the right drug's combination could minimize them. With this in mind, the need for improvements and dissemination of methods on capture and anesthesia of giant anteaters on field, we aim to: (1) calculate the capture effort and success; (2) assess variations in the physiological parameters of anesthetized individuals; (3) test the correlation between air and body temperature of anesthetized individuals; (4) classify the quality of anesthesia promoted by the association of drugs. 3.2. Material and methods 3.2.1. Study area We carried out fieldwork at Santa Bárbara Ecological Station (SBES; - 22º48'59”, - 49º14'12”) and surroundings, an area of 67 km². The relief is of low altitudes (600 to 680 m), the climate is hot and humid with dry winter (Cwa) and the average temperatures vary between 17 and 24° C (Melo & Durigan, 2011). The SBES (27 km²) is a protected area of Cerrado biome in São Paulo state, Southeastern Brazil, of high relevance in the state for maintaining natural portions of open field and savanna vegetation (Melo & Durigan, 2011). It is composed by open habitats (41% - Cerrado grassland and humid grassland), exotic timber plantation (22% - plots of Pinus spp. and Eucalyptus spp.), savanna (21% - Cerrado stricto sensu and dense Cerrado), forest (13% - Cerradão, seasonal and alluvial forests, and its transition areas), and anthropogenic sites (3% - roads, built-up areas, and urban) (Bertassoni et al., 2020). Two state highways, a municipal road and several internal dirt roads (firebreaks), fragment the SBES area. The surroundings are characterized by sugar cane culture, Pinus spp., Eucalyptus spp., pastures with Brachiaria sp., extensive cattle breeding and urban area (Águas de Santa Bárbara municipality). 42 3.2.2. Data collection We conducted the fieldwork from 10/16 to 11/19/2014, 1/9 to 02/10/2015 and 05/26 to 07/02/2015. They occurred across the internal dirt roads and surroundings of SBES with the aid of a car at low speed (20 km/h). We concentrated the searches during the day and early night, except in the second campaign (January-February), when we also searched at all night and dawn and on foot too. We performed the immobilization by silent approach on foot, siege, application of drugs with blowpipe or CO2 injection pistol and physical restraint with a net. We used records from camera traps that were arranged in a grid with a distance of 1.2 km in SBES, obtained for a parallel study (Bertassoni, 2017), to plan the searches on areas of better individuals’ detection. The anesthetic drugs we used were ketamine hydrochloride (Dopalen® [100mg / ml] Ceva Saúde Animal Ltda), midazolam maleate (Dormonid® [15mg / 3ml] Cenexi S.A.S.) and xylazine hydrochloride (Anasedan® 2% Ceva Saúde Animal Ltda), intramuscularly. We slightly adapted the anesthetic protocol to meet the objectives, field conditions and according to individual responses. In the first individual, the only who received the injection manually, the protocol was ketamine 10 mg/kg and midazolam 0.2 mg/kg. As we did not achieve the desired muscle relaxation, we started to use ketamine 10 mg/kg, midazolam 0.2 - 0.5 mg/kg and xylazine 0.5 - 0.8 mg/kg, from the second captured individual. We based the drug volume on estimated weight. We used atropine 0.04 mg/kg [0.5 mg/ml] from the fourth animal and yohimbine 0.3 mg/kg [2.0 mg/ml] at the end of the procedures (except for TB01 and TB07 individuals). We performed the following procedures with a team of veterinarians and biologists: physical examination, anesthetic monitoring, sample collection (blood, ectoparasites, hair and feces), microchip application, biometry, photograph, installation of telemetry equipment and data record. We placed the anesthetized individuals in lateral decubitus with members and head stretched, and anterior claws tied. We lubricated the eyes with an ophthalmic ointment and covered them with a cotton band. We cleaned nostrils, mouth and tongue and humidified the tongue. We measured the following physiological parameters during anesthesia: heart rate (HR) by chest auscultation, respiratory rate (RR) by direct observation and body temperature (BT) using a digital thermometer placed in rectum. We constantly checked these parameters and recorded them after the induction, every 15 minutes (monitoring moments: 0, 15, 30, 45 and 60 min). We also monitored local air temperature (AT) every 15 minutes with a portable USB Tag- temp. We observed the effect of the anesthetic protocol on each individual and during all monitoring moments to classify the anesthetic quality based on: physiological parameters (HR, 43 RR and BT); muscle relaxation; drugs adverse effects; and duration of induction (IND), immobilization (IMO) and initial recovery (RECi). We considered “initial recovery” as the time from the application of the antagonist or the appearance of the first voluntary movements (TB01 and TB07) until the first steps, and not the time taken for complete release. 3.2.3. Data analyses We calculated capture effort for each campaign by the ratio between time in hours spent on active searches per captured individual (h/ind) and kilometers traveled by car per captured individual (km/ind). Capture success for each campaign was the ratio (%) between individuals captured and the total individuals (the sum of the sighted, not caught and captured) (Table 1). We qualitatively assessed the physiological parameters variation among sampled individuals (HRi, RRi and BTi, Table 4) and throughout the monitoring moments (HRt, RRt and BTt, Table 3) by mean and standard deviation. We calculated the average, minimum and maximum air temperature over the three campaigns (Table 1). To test the correlation between air and body temperature of anesthetized individuals, we used the Spearman's correlation. We tested the stability of air temperature through monitoring moments by Shapiro-Wilk, ANOVA and Tukey's Test. We subjectively classified the anesthetic quality on a scale ranging from good, satisfactory to unsatisfactory, taking into account the: values of physiological parameters and safe margin, vital signs stability, occurrence of adverse effects, steps duration and animal handling capacity provided by the drugs. 3.3. Results The active searches lasted 779 hours distributed in 98 days and we traveled 12605 km by car (Bertassoni et al., 2020). One capture occurred in January - the second campaign -, when the capture effort was 191 h/ind and 2564 km/ind, and capture success was 12.5%. In this period we sighted giant anteaters in difficult to reach places (e.g. covered vegetation, muddy areas, dense shrub areas) in four occasions and we were not able to approach them. We tried to capture, without success, in three opportunities (Table 1). The other captures (89%) were concentrated between May and June 2015 - the third campaign -, with capture effort of 37 h/ind and 564.9 km/ind, and capture success of 50%. In this period we sighted giant anteaters five times and tried to capture three times (Table 1). Capture events were mostly around 17:30 h (Figure 1) 44 with local air temperature of 24 ± 3.5º C (18.2 to 27.4º C). Average air temperatures during the three campaigns were 25.9 ± 4º C, 27.1 ± 3.6º C and 19.7 ± 3.6 º C, respectively (Table 1). Three of the nine giant anteaters captured (TB01, TB06 and TB09) started to flee and were contained. We surrounded an animal in an area of forest and dirty field, but it managed to escape when hit by the anesthetic dart. Table 1. Characteristics of free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) capture campaigns at Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. Characteristics CAMPAIGN 1 CAMPAIGN 2 CAMPAIGN 3 Period of year 10/16 to 11/19/2014 1/9 to 02/10/2015 05/26 to 07/02/2015 Days on field 27 days 33 days 38 days Period of day morning, afternoon, early night morning, afternoon, night, dawn morning, afternoon, early night Search time 292 hours 191 hours 296 hours Traveled distance 5762 Km 2564 Km 4279 Km Average air temperature 25.9 ± 4° C 27.1 ± 3.6° C 19.7 ± 3.6 ° C Air temperature range 17.1 to 41.7° C 19.7 to 42. 3° C 10.1 to 29.9° C Sightings* 9 4 5 Attempts** 9 3 3 Captures 0 1 8 Total 18 8 16 Capture effort 0 191 h/ind 37 h/ind Capture effort 0 2564 km/ind 534.9 km/ind Capture sucess 0 12.5% 50% *Sightings: number of times we saw giant anteaters in difficult to reach places and the approach did not belong. **Attempts: number of times we saw giant anteaters and tried to capture them, but we were unsuccessful. We captured and anesthetized four female (a juvenile and three adults) and five adult males with unknown health histories and an average of 34 ± 5.1 kg (Table 2). Upon visual inspection, all individuals were alone, without impairment of locomotion, physically healthy and with normal foraging, alert and escape behaviors. The animals received the association of ketamine (12.2 ± 4.2 mg/kg), midazolam (0.3 ± 0.1 mg/kg) and xylazine (0.9 ± 0.4 mg/kg), in addition to atropine (0.04 mg/kg) and yohimbine (0.3 mg/kg) (Table 2). 45 Figure 1. Day and time of captures and procedures duration of nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015 at Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. Table 2. Doses used to immobilize nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015, at the Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. ID Sex Age Weight (kg) Doses applied (mg/Kg) ATR YOH TB01 F A 32 Keta 10 + Mida 0.2 no no TB02 M A 38.7 Keta 7.27 + Mida 0.36 + Xyla 0.36 no yes TB03 F A 34.8 Keta 6.83 + Mida 0.34 + Xyla 0.34 no yes TB04 M A 35.2 Keta 12.5 + Mida 0.63 + Xyla 0.63 no yes TB05 M A 36.6 Keta 9.7 + Mida 0.19 + Xyla 0.77 yes yes TB06 M A 38 * Keta 17.79 + Mida 0.36 + Xyla 1.42 yes yes TB07 F A 33 Keta 12.2 + Mida 0.24 + Xyla 0.97 yes no TB08 M A 36.2 Keta 13.8 + Mida 0.27 + Xyla 1.1 yes yes TB09 F J 21.6 Keta 17.5 + Mida 0.35 + Xyla 1.4 yes yes ID: individual, F: female, M: male, A: adult, J: juvenile, Keta: ketamine hydrochloride, Mida: midazolam maleate, Xyla: xylazine hydrochloride, ATR: atropine application 0.04 mg/kg (0.5 mg/ml), YOH: yohimbine application 0.3 mg/kg (2.0 mg/ml), no: not applied, yes: applied, *A dart ricocheted and it must not have injected the entire volume, but in dose recording we disregarded this possibility. The HRi average was 57.9 ± 4 bpm. The least stable HRi was from TB01 (85.3 ± 17.3 bpm) and the most stable was from TB07 (50.8 ± 1.8 bpm) (Figure 2). The lowest HRi recorded was 38 bpm in the monitoring moment 60' (TB03) and the highest was 116 bpm in the 0' 0:00 2:24 4:48 7:12 9:36 12:00 14:24 16:48 19:12 21:36 TB01 27/jan TB02 27/mai TB03 31/mai TB04 02/jun TB05 04/jun TB06 05/jun TB07 07/jun TB08 09/jun TB09 13/jun Ti m e Capture day 46 (TB01). The HRt presented an average value of 58 ± 4 bpm and was similar through all monitoring moments (Table 3). The RRi average was 7.3 ± 0.5 rpm. The least stable RRi was from TB02 (6.2 ± 2.2 rpm) and the most stable was from TB07 (7.6 ± 0.9 rpm) (Figure 2). The lowest RRi recorded was 3 rpm in the monitoring moment 0’ (TB06) and the highest was 12 rpm in the 45’ (TB01). The RRt presented an average value of 7.2 ± 0.4 bpm and was similar through all monitoring moments (Table 3). The BTi average was 34.5 ± 0.5º C. The least stable BTi was from TB02 (35.1 ± 0.96º C) and the most stable was from TB03 (32.5 ± 0.17º C) (Figure 3). The lowest BTi recorded was 32.1º C in the monitoring moment 15’ (TB08) and the highest was 36.7º C in the 0’ (TB02). The BTt presented an average value of 34.6 ± 0.3º C and was similar through the monitoring moments (Table 3). ♦ TB01, ⁃ TB02, • TB03, ▲ TB04, □ TB05, ■ TB06, ◦ TB07, ∆ TB08, ◊ TB09 Figure 2. Variation in heart and respiratory rates of nine free-living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) anesthetized with ketamine, midazolam and xylazine in 2015, at Santa Bárbara Ecological Station, Cerrado of São Paulo state, Brazil. 35 45 55 65 75 85 95 105 115 0 15 30 45 60 H ea rt r a te ( b p m ) Anesthetic monitoring moments (min) 2 4 6 8 10 12 0 15 30 45 60 R es p ir a to ry r a te ( b p m ) Anesthetic monitoring moments (min) 47 Table 3. Physiological