RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 26/05/2021. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” Campus de Araraquara - Instituto de Química Programa de Biotecnologia FLÁVIA ALVES DE JESUS SILVA POLIMORFISMOS DE INSERÇÃO/DELEÇÃO NO CROMOSSOMO X: ANÁLISE DE 32 MARCADORES NA POPULAÇÃO DA REGIÃO SUDESTE DO BRASIL ARARAQUARA - SP 2020 FLÁVIA ALVES DE JESUS SILVA POLIMORFISMOS DE INSERÇÃO/DELEÇÃO NO CROMOSSOMO X: ANÁLISE DE 32 MARCADORES NA POPULAÇÃO DA REGIÃO SUDESTE DO BRASIL Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia. Área de concentração: Biologia Molecular ORIENTADORA: Profa. Dra. Regina Maria Barretto Cicarelli ARARAQUARA 2020 DEDICATÓRIA As minhas filhas, Camila e Helena, por suportar e compreender a minha ausência em diversos momentos, para que este trabalho pudesse ser realizado. Isto é por vocês meus amores! Ao meu amado esposo e companheiro de todas as horas, Elias, que sempre me apoiou e incentivou a prosseguir, por maiores que fossem as dificuldades, fortalecendo-me a cada dia. A todos vocês, que amo muito, a minha gratidão e o meu reconhecimento. Nos méritos desta conquista há muito de vocês! AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida, por iluminar sempre o meu caminho, me proporcionando saúde e sabedoria para buscar sempre mais conhecimento. Agradeço a toda minha família pelo tempo doado para a realização das pesquisas, pela imensa compreensão, em especial as minhas filhas, Camila e Helena, ao meu esposo Elias, sem o apoio de vocês nada disso seria possível. Aos meus pais, Conceição e Geraldo, meu profundo apreço por todo o apoio durante toda a minha vida e, sobretudo, nos momentos mais difíceis dos últimos anos, suprindo minhas ausências junto as minhas filhas e permitindo que eu me dedicasse à realização do meu trabalho. Aos meus irmãos, Fabrício e Flaviane, que sempre estiveram ao meu lado, me dando as maiores forças e os melhores conselhos, os quais sempre me mantiveram no caminho certo. A vocês a minha eterna gratidão. A minha Orientadora, Profa. Dra Regina Cicarelli, por dedicar seu tempo a me ensinar um pouco do muito que ela sabe. Serei sempre grata por sua confiança, compreensão e paciência. Tenho um imenso orgulho em ter você como minha orientadora. A você minha professora, meu muito obrigado. A Profa. Dra Leonor Gusmão, por estar sempre disponível a nos atender, mesmo tendo inúmeros compromissos. Agradeço a enorme contribuição que fez a este trabalho, por disponibilizar as amostras do Rio de Janeiro e por todo ensinamento e atenção que dedicou a mim neste período, serei sempre eternamente grata. A Juliana Martinez, amiga que me incentivou, aconselhou e ensinou desde o desenvolvimento teórico do projeto até a sua conclusão final, agradeço pelas numerosas sugestões e, antes de tudo, pela amizade, carinho e disponibilidade em ajudar. A Fernanda Polverari e Bianca Belon, pelas conversas serias quando necessárias, pelos momentos de descontração, pelo apoio, ensinamentos, por tirar minhas dúvidas e me apontar soluções quando tudo parecia estar perdido. Agradeço também pela amizade sincera que dedicaram a mim. A Isabela Brunelli e Danilo Braganholi, companheiros na viagem mais fantástica que já realizei, agradeço pelas conversas e por sempre se disponibilizarem a me ajudarem, mesmo com a correria do dia-a-dia. A Silvia Loiola, por auxiliar na seleção das amostras da população do Rio de Janeiro. Muito obrigada por ceder este tempo a este trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudo. A todos os colegas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP de Araraquara, pela gentileza, pela atenção, sempre disposta a ajudar. A todos as funcionárias da Seção Técnica de Pós-Graduação do Instituto de Química da UNESP de Araraquara, em especial Wennia, Robson, Cíntia e Ana Paula, pelos serviços prestados e pela atenção. A todas as pessoas que fizeram parte na construção deste trabalho sempre me apoiando. A estes dedico este trabalho, sem a ajuda e compreensão de todos a realização deste sonho não seria possível. Muito obrigada por tudo! RESUMO Na rotina forense, há casos em que a amostra biológica se encontra degradada ou com baixa concentração de DNA, o uso exclusivo dos marcadores STRs pode gerar um resultado estatístico inconclusivo, tornando fundamental a análise de marcadores adicionais para a resolução do caso. Utilizado como método complementar, os polimorfismos de inserção e deleção (InDels) têm mostrado grande potencial para superar as limitações dos marcadores tradicionais. Adicionalmente, estudos de genética forense tem sido cada vez mais explorados no âmbito do cromossomo X, especialmente nos casos em que a análise dos autossômicos não é suficiente. Nessa perspectiva, este trabalho avaliou a utilidade de um conjunto de 32 polimorfismos de inserção/deleção do cromossomo X em amostras da população da região sudeste do Brasil. Afim de avaliar a diversidade genética destas populações, foram analisados os perfis genotípicos de 627 indivíduos sem relação genética pelo cromossomo X, residentes nos estados de Minas Gerais (90 mulheres e 116 homens), Espírito Santo (201 homens) e Rio de Janeiro (220 homens). Os resultados indicam que o painel dos 32 X-InDels é bastante eficiente para a sua finalidade, sendo que praticamente todos os marcadores se mostraram altamente informativos para as populações estudadas. O teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg foi realizado nas amostras femininas de Minas Gerais e não foram verificados desvios significativos. Em todas populações analisadas o painel demonstrou alta eficiência forense, confirmado pelo alto poder de discriminação para Minas Gerais (PDF=0,999999999994 e PDM=0,99999994), Espírito Santo (PDF=0,999999999994 e PDM=0,99999995) e Rio de Janeiro (PDF=0,999999999997 e PDM=0,99999997), e pelo elevado poder de exclusão estimado em trios: pai/mãe/filha (Minas Gerais: 0,999996; Espírito Santo: 0,999996; Rio de Janeiro: 0,999997) e duos: pai/filha (Minas Gerais: 0,9994; Espírito Santo: 0,9995; Rio de Janeiro: 0,9996). No estudo comparativo com outras populações, a maior similaridade observada foi das 3 populações estudadas neste trabalho com as outras populações brasileiras, seguido pelas populações dos departamentos colombianos e Europa. Durante a análise foi observada, nas três populações estudadas, a presença de uma variante no MID1361. Na análise de ancestralidade para estas populações, foi identificada proporções ancestrais de europeus (MG= 39%, RJ= 35% e ES= 38%), africanos (MG= 36%, RJ= 38% e ES= 37%) e nativo-americanos (MG= 25%, RJ= 27% e ES= 25%). Os dados para os marcadores de inserção/deleção no cromossomo X disponíveis na literatura vêm sendo cada vez mais explorados, mas o conhecimento sobre este assunto deve ser ampliado. Os valores de poder de discriminação e exclusão obtidos neste trabalho já demonstram seu potencial como método complementar para a análise de amostras forenses. Palavras-chave: Identificação humana. Genética populacional. Polimorfismos de inserção/deleção. InDels. Cromossomo X. X-InDels. Minas Gerais. Rio de Janeiro. Espírito Santo. Brasil. Abstract In the forensic routine, there are cases in which the biological sample is degraded or with a low concentration of DNA, the exclusive use of STR markers can generate an inconclusive statistical result, making the analysis of additional markers essential for the resolution of the case. Used as a complementary method, the insertion and deletion polymorphisms (InDels) have shown great potential to overcome the limitations of traditional markers. Additionally, the X chromosome has been increasing significant importance in forensic genetics studies, especially in cases where the analysis of autosomal is not enough. In this perspective, this work evaluated the usefulness of a set of 32 polymorphisms of insertion/deletion of the X chromosome in samples from the population of the southeastern region of Brazil. In order to evaluate the genetic diversity of these populations, the genotypic profiles of 627 individuals without genetic relationship were analyzed by the X chromosome, living in the states of Minas Gerais (90 females and 116 males), Espírito Santo (201 males) and Rio de Janeiro (220 males). The results indicate that the 32 X-InDels panel is enough efficient for its purpose, with practically all the markers proving to be highly informative for the studied populations. The Hardy- Weinberg equilibrium test was performed on female samples from Minas Gerais and no significant deviations were found. In all analyzed populations, the panel demonstrated high forensic efficiency, confirmed by the high power of discrimination for Minas Gerais (PDF= 0.9999999999994 and PDM= 0.999999994), Espírito Santo (PDF=0.999999999994 and PDM= 0.99999995) and Rio de Janeiro (PDF= 0.999999999997 and PDM= 0.99999997), and the high exclusion power estimated in trios: father/mother/daughter (Minas Gerais: 0.999996; Espírito Santo: 0.999996; Rio de Janeiro: 0.999997) and duo: father/daughter (Minas Gerais: 0.9994; Espírito Santo: 0.9995; Rio de Janeiro: 0.9996). In the comparative study with other populations, the greatest similarity observed was between the 3 populations studied in this work, followed by the other Brazilian populations, from the Colombian departments and Europe. During the analysis, the presence of a variation in MID1361 was observed in the three populations studied. In the analysis of ancestry for these populations, ancestral proportions of Europeans were identified (MG = 39%, RJ = 35% and ES = 38%), Africans (MG = 36%, RJ = 38% and ES = 37%) and native-americans (MG = 25%, RJ = 27% and ES = 25%). The data for insertion / exclusion markers on the X chromosome are available in the has been increasingly explored literature, but the knowledge on this subject must be expanded. The values of discriminating power and excluding them in this work already demonstrate its potential as a complementary method for analyzing forensics. Keywords: Human identification. Population genetics. Insertion/deletion polymorphisms. InDels. X chromosome. X-InDels. Minas Gerais. Rio de Janeiro. Espírito Santo. Brazil LISTA DE FIGURAS Figura 1:Esquema representando a simulação do resultado de um sistema de STRs em eletroforese para investigação de paternidade comparando o número de repetições de um determinado loci pesquisado .............................................................................................. 24 Figura 2:O polimorfismo de nucleotídeo único ....................................................................... 25 Figura 3: Eletroferograma de detecção de Inserção e Deleção .......................................... 27 Figura 4: Ideograma do cromossomo X indicando a localização dos 32 marcadores X- InDel selecionados. ..................................................................................................................... 43 Figura 5: Eletroferograma de uma amostra masculina amplificada com o multiplex 32 X- InDels. ........................................................................................................................................... 49 Figura 6: Eletroferograma de uma amostra feminina amplificada com o multiplex 32 X- InDels. ........................................................................................................................................... 50 Figura 7: Eletroferograma parcial de três amostras de Minas Gerais obtidas com o multiplex 32 X-InDels. Em destaque a variante alélica do alelo curto do marcador MID1361 ....................................................................................................................................... 51 Figura 8: Eletroferograma parcial de uma amostra do Espírito Santo obtida com o multiplex 32 X-InDels. Em destaque a variante alélica do alelo curto do marcador MID1361. ...................................................................................................................................... 51 Figura 9: Eletroferograma parcial de uma amostra do Rio de Janeiro obtida com o multiplex 32 X-InDels. Em destaque a variante alélica do alelo curto do marcador MID1361. ...................................................................................................................................... 52 Figura 10: Parâmetros estatísticos de interesse forense para os marcadores 32 X-InDels, para a população da Somália, Angola e Moçambique, Portugal e Macau. ....................... 66 Figura 11: Gráfico MDS bidimensional elaborado a partir da distância genética (FST) entre África, Europa, Leste Asiático, Nativo-americano (Pasto - Colômbia), diversas populações da Colômbia e Brasil (São Paulo, Mato Grosso, Brasília, Minas Gerais, Rio de Janeiro e Espírito Santo). ..................................................................................................... 69 https://d.docs.live.net/51db45012fade257/Documentos/Doutorado/Resultado%20final%20por%20estados/Tese_Flavia%20Alves_Versão%20final.docx#_Toc42021859 https://d.docs.live.net/51db45012fade257/Documentos/Doutorado/Resultado%20final%20por%20estados/Tese_Flavia%20Alves_Versão%20final.docx#_Toc42021859 Figura 12: Representação esquemática para a população de Minas Gerais (MG), Rio de Janeiro (RJ) e Espírito Santo (ES) utilizando os marcadores 32 X-InDels obtidos atraves da anlise do STRUCTURE baseado na contibuição da população africana (AFR), europeira (EUR) e nativo-americano (NAM) (K=3) ................................................................ 70 Figura 13: Proporção de ancestralidade identificada em marcadores X-InDels, mtDNA, Y- SNP e AIM-InDels nas populações de Minas Gerais, Rio de Janeiro e Espírito Santo. . 72 https://d.docs.live.net/51db45012fade257/Documentos/Doutorado/Resultado%20final%20por%20estados/Tese_Flavia%20Alves_Versão%20final.docx#_Toc42021868 https://d.docs.live.net/51db45012fade257/Documentos/Doutorado/Resultado%20final%20por%20estados/Tese_Flavia%20Alves_Versão%20final.docx#_Toc42021868 LISTA DE TABELAS Tabela 1: InDels do cromossomo X e sequências iniciadoras de PCR usadas no multiplex ....................................................................................................................................... 44 Tabela 2: Frequência alélica dos 32 marcadores X-InDels nas populações de Minas Gerais, Espírito Santo e Rio de Janeiro. Número de cromossomos analisados: 296 (Minas Gerais) 201 (Espírito Santo) e 220 (Rio de Janeiro). ..................................................... 53 Tabela 3: Parâmetros estatísticos da diversidade gênica para os 32 marcadores X-InDels na população feminina de Minas Gerais. Tamanho da amostra: 90. ............................. 55 Tabela 4: Desequilíbrio de ligação dos pares de marcadores analisados na população masculina de Minas Gerais. Tamanho da amostra: 116 ................................................ 57 Tabela 5: Desequilíbrio de ligação dos pares de marcadores analisados na população do Rio de Janeiro. Tamanho da amostra: 220 .................................................................... 58 Tabela 6: Desequilíbrio de ligação dos pares de marcadores analisados na população do Espírito Santo. Tamanho da amostra: 201 .................................................................... 59 Tabela 7: Frequência haplotípica observada na população masculina de Minas Gerais para os marcadores em desequilíbrio de ligação. Tamanho da amostra: 116. .............. 60 Tabela 8: Frequência haplotípica observada na população masculina de Espírito Santo para os marcadores em desequilíbrio de ligação. Tamanho da amostra: 201. ............. 60 Tabela 9: Frequência haplotípica observada na população masculina de Rio de Janeiro para os marcadores em desequilíbrio de ligação. Tamanho da amostra: 220. ............. 61 Tabela 10: Parâmetros estatísticos de interesse forense para os marcadores 32 X-InDels na população de Minas Gerais. Número de cromossomos analisados: 296. ................ 62 Tabela 11: Parâmetros estatísticos de interesse forense para os marcadores 32 X-InDels na população do Espírito Santo. Número de cromossomos analisados: 201 ................ 64 Tabela 12: Parâmetros estatísticos de interesse forense para os marcadores 32 X-InDels na população do Rio de Janeiro. Número de cromossomos analisados: 220 ............... 65 Tabela 13: Amostras usadas na comparação entre as populações, número de cromossomos analisados (N) e respectivas referências. ............................................... 67 Tabela 14: Distância genética (FST) entre as populações (abaixo da diagonal) e o valor de p correspondente (acima da diagonal) ...................................................................... 68 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS DNA Deoxyribonucleic acid dbSNP Single Nucleotide Polymorphism database DG Diversidade gênica EUA Estados Unidos da América GHEP-ISFG Grupo de Línguas Espanhola e Portuguesa da Sociedade Internacional de Genética Forense HID Human Identification InDel Inserção/deleção LD Linkage Disequilibrium MID Marshfield identification MCMC Markov chain Monte Carlo MDS Multidimensional scaling MEC Chance média de exclusão MECT Chance média de exclusão em trios envolvendo filha MECD Chance média de exclusão em duo pai/filha MECPGM Chance média de exclusão em casos deficientes envolvendo mãe, filha e avó paterna PCR Polymerase Chain Reaction PD Poder de discriminação PDF Poder de discriminação em mulheres PDM Poder de discriminação em homens RFU Relative fluorescence unit SNP Single Nucleotide Polymorphism STR Short Tandem Repeat UNESP Universidade Estadual Paulista Júlio Mesquita Filho X-InDel Inserção/deleção no cromossomo X X-STR Short Tandem Repeat no cromossomo X LISTA DE SÍMBOLOS ~ Aproximadamente % Porcento ng Nanogramas nº Número ºC Graus Célsius ® Marca registrada ml Mililitros µL Microlitros cm Centímetros mg Miligramas D’ Valor normalizado do desequilíbrio de ligação p-LD Valor de p do desequilíbrio de ligação p-HWE Valor de p do equilíbrio de Hardy-Weinberg pb Par de bases kb Kilobase Mb Megabase q.s.p. Quantidade suficiente para rpm Rotações por minuto min Minutos seg Segundos Sumário 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................................... 19 2. REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................................................... 21 2.1. Marcadores biológicos para identificação humana ...................................................... 22 2.2 . Polimorfismos genéticos e análise do DNA ................................................................. 22 2.2.1. Short Tandem Repeats (STRs) ................................................................................... 23 2.2.2. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) .............................................................. 25 2.2.3. Insertion/Deletion Polymorphisms (InDels) ............................................................ 26 2.3 Cromossomo X ....................................................................................................................... 29 2.3.1. Marcadores genéticos do cromossomo X ............................................................... 30 2.3.2. Aplicação dos marcadores genéticos do cromossomo X .................................. 32 2.4. Aspectos históricos do povoamento do Brasil .............................................................. 34 2.5. Justificativa e hipótese do estudo ..................................................................................... 36 3. OBJETIVOS .............................................................................................................................................. 38 3.1. Objetivo Geral ......................................................................................................................... 39 3.2. Objetivos Específicos ........................................................................................................... 39 4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................................. 40 4.1. Aspectos éticos da pesquisa .............................................................................................. 41 4.2. Sujeitos da pesquisa ............................................................................................................. 41 4.3. Extração do DNA .................................................................................................................... 41 4.4. Amplificação do DNA e Genótipo dos X-InDels ............................................................. 42 4.5. Análise dos resultados e dos parâmetros estatísticos ................................................ 46 4.6. Análise comparativa .............................................................................................................. 46 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 48 5.1. Avaliação da metodologia .................................................................................................... 49 5.2. Variante alélica identificada nas populações estudadas ............................................ 50 5.3. Variabilidade genética populacional ................................................................................. 53 5.4. Desequilíbrio de ligação entre os marcadores X-InDels ............................................. 56 5.5. Parâmetros estatísticos de eficiência forense ............................................................... 61 5.6. Comparação genética entre as populações e análise de ancestralidade ............... 66 6. CONCLUSÕES .......................................................................................................................................... 74 7. REFERÊNCIAS .......................................................................................................................................... 76 ANEXO I ......................................................................................................................................................... 85 19 1. INTRODUÇÃO 20 Desde os anos 80, os avanços nas técnicas de análise do ácido desoxirribonucleico (DNA) vêm se tornando uma poderosa aliada na identificação humana e para a investigação criminal proporcionando um significativo impacto no campo da ciência forense (ZIĘTKIEWICZ et al, 2012). O aprimoramento destas técnicas favoreceu o alto poder de discriminação de um indivíduo/vestígio biológico pelo DNA, o qual permite comparações genéticas entre indivíduos e/ou material biológico (THOMPSON; ZOPPIS; MCCORD,2012) O genoma humano possui mais 3 bilhões de pares de bases localizados em cada célula nucleada do corpo. O genoma, que se manteve bem conservado ao longo da evolução, é no mínimo 99,5% idêntico entre quaisquer seres humanos do planeta e esta pequena fração variável é o que nos torna único (LEVY et al, 2007) e são essas regiões variáveis que possibilitam que o DNA seja utilizado na identificação humana (BUTLER, 2007). Para a identificação humana são considerados marcadores genéticos os polimorfismos herdáveis, que podem ser identificados em uma ou mais populações (DAVEY et al, 2011). Os marcadores nucleares autossômicos estão amplamente padronizados na prática forense, pois apresentam alto grau de diversidade e alta resolubilidade dos casos (ALVAREZ-CUBERO et al, 2012). Entretanto, há circunstâncias em que o material biológico pode ser coletado de casos post-mortem oriundos de corpos exumados, putrefeitos e de vestígios. Nessas condições, o DNA disponível pode estar degradado e em baixa quantidade, dificultando a solução do caso com a análise apenas dos marcadores nucleares autossômicos. Nesse contexto, a análise de outros marcadores e em outras regiões polimórficas, como no cromossomo X, podem complementar a análise tradicional de forma eficaz (ALVAREZ- CUBERO et al, 2012). 74 6. CONCLUSÕES 75 Os dados para os marcadores de inserção/deleção no cromossomo X disponíveis na literatura ainda são pouco explorados e este conhecimento sobre o assunto deve ser ampliado. Os valores de poder de discriminação e exclusão obtidos neste trabalho já demonstram seu potencial como método complementar para a análise de amostras forenses. Com os resultados obtidos neste trabalho pode-se concluir que: • Os 32 X-InDels mostraram-se polimórficos nas populações de Minas Gerais, Rio de Janeiro e Espírito Santo, demostrando que estes marcadores genéticos são bastantes informativos para estas populações; • Através da identificação de uma variante no MID1361, concluiu-se existir um alelo exclusivo para a população brasileira não sendo identificado em populações estrangeiras; • Para todos os parâmetros de eficiência forenses, esse painel se mostrou altamente discriminativo nas três populações estudadas; • Nas comparações de distância genética, se obteve valores significativos entre as populações estudadas e as estrangeiras com dados publicados na literatura. Concluindo que estas informações estão de acordo com a história do povoamento do Brasil; • Com os dados de proporção ancestral, conclui-se que a ancestralidade identificada confirma a miscigenação destas populações. 76 7. REFERÊNCIAS 77 ALVAREZ-CUBERO, M.J. et al. Genetic identification of missing persons: DNA analysis of human remains and compromised samples. Pathobiology. v. 79. n. 5 p. 228–38. 2012. ALVES-SILVA et. Al. 2000. The ancestry of Brazil-ian mtDNA lineages. Am J Hum Genet 67:444–461. AMBROSIO et al. DNA 30-SNP data confirm high prevalence of African lineages in the population of Espirito Santo, Brazil Forensic Sci. Int.: Gene. Suppl. Ser., 5 (2015), pp. e346-e347 ANDREWS, C. The Hardy-Weinberg Principle. Nature Education Knowledge. v. 3. n. 10. p. 65. 2010. BONFERRONI, C.E. Pubblicazioni del R Istituto Superiore di Scienze Economiche e Commerciali di Firenze. v. 8. p. 3-62. 1936. BRAGANHOLI, D. F. Análise de polimorfismos INDELs na Identificação Humana. 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