UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU 

 

 

ANÁLISE PROGNÓSTICA DA IMUNOEXPRESSÃO DE OSTEOPONTINA NO 

MICROAMBIENTE DOS CARCINOMAS MAMÁRIOS ESPORÁDICOS DE 

CADELAS 

 

LIDIANNE NARDUCCI MONTEIRO 

 

 

 

 

 

 

 

 

BOTUCATU/SP 

2013 

 

Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação 

em Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, 

Universidade Estadual Paulista – UNESP para obtenção 

do título de mestre em Patologia 

Orientadora: Profa. Dra. Noeme Sousa Rocha 

Co-orientador: Prof. Dr. Deilson Elgui de Oliveira 
re em Patologia 

Orientadora: Profa. Dra. Noeme Sousa Rocha 

Co-orientador: Prof. Dr. Deilson Elgui de Oliveira 



 

LIDIANNE NARDUCCI MONTEIRO 

 

 

 

ANÁLISE PROGNÓSTICA DA IMUNOEXPRESSÃO DE OSTEOPONTINA NO 

MICROAMBIENTE DOS CARCINOMAS MAMÁRIOS ESPORÁDICOS DE 

CADELAS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BOTUCATU/SP 

2013 

Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação 

em Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, 

Universidade Estadual Paulista – UNESP para obtenção 

do título de mestre em Patologia 

Orientadora: Profa. Dra. Noeme Sousa Rocha 

Co-orientador: Prof. Dr. Deilson Elgui de Oliveira 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. 
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP 

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE 

Monteiro, Lidianne Narducci. 
    Análise prognóstica da imunoexpressão de osteopontina no microambiente 
dos carcinomas mamários esporádicos de cadelas. – Botucatu : [s.n.], 2013 
 
    Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de 
Medicina de Botucatu 
    Orientador: Noeme Sousa Rocha 
    Coorientador: Deilson Elgui de Oliveira 
    Capes: 40105008 
                                                                                                                      
    1. Mamas – Câncer.  2. Cão - Doenças.  3. Câncer em cão.  4. Fosforilação.  
5. Proteínas – Análise.  6. Glicoproteínas. 
 
 
                                                 
Palavras-chave: Cão; EGFR; HER2; MAPK; tumores mamários. 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedicatória 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

À Deus, criador de todas as coisas 

Aos meus pais, Joacy e Maria de Lurdes, pelo amor e incentivo 

Dedico 



 

 

 

 

 

 

 

 

Agradecimentos 



 

Agradeço à Deus, em primeiro lugar, por tudo que tem feito em minha vida, por me 

permitires chegar até aqui e me amparar nos momentos de dificuldade e me mostrar os 

caminhos nas horas incertas, pelo ar que respiro, pelos dons que me deste. 

Agradeço à minha orientadora Noeme Sousa Rocha pela oportunidade, por acreditar 

em mim e aos ensinamentos passados, que com certeza me fizeram crescer muito. 

Ao meu coorientador Professor Deilson Elgui de Oliveira, agradeço pelo apoio e 

colaboração neste projeto. 

Aos Professores do Serviço de Patologia Veterinária, Julio Lopes Sequeira e Renée 

Laufer Amorim, que me acompanharam desde a residência e são parte fundamental na 

minha formação, obrigada por acreditarem no meu potencial. 

À Professora e amiga Louisiane de Carvalho Nunes, agradeço por me apresentar à 

Patologia, por ser um exemplo de determinação e força, pelos ensinamentos e 

especialmente pela amizade, confiança e apoio durante esses anos. 

À professora Isabella Villena Martins, minha primeira orientadora, obrigada pela 

amizade, pelo incentivo e pelos ensinamentos. 

À professora Fátima Gartner e aos amigos da Universidade do Porto, Irina Amorin, 

Celia Lopes e Fátima Carvalho pelo acolhimento e conhecimentos compartilhados. 

Ao Dr. Rafael Malagoli e Juliana Gadum de Lalla pelo auxílio na análise estatística. 

Aos funcionários da pós-graduação FMB/UNESP, em especial à secretária Vânia 

Soler e à coordenadora do programa de Patologia Professora Márcia Guimarães da 



 

Silva, e aos funcionários da pós-graduação FMVZ/UNESP, em especial José Roberto 

de Lalla, por toda prestatividade e auxílio durante meu mestrado.. 

Aos membros do Departamento de Anatomia Patológica - Hospital A.C. 

Camargo/Fundação Antônio Prudente, por todo o auxílio prestado no desenvolvimento 

deste trabalho. 

Aos funcionários do Serviço de Patologia, Maury Raul, Claudinei Domingues, Maria 

Valéria M. Dalanezi e Noel Melo, muitíssimo obrigada pela ajuda, pelos momentos de 

descontração, por todo incentivo e pela amizade. 

.Aos residentes do Serviço de Patologia, Priscila E. Kobayashi, Diogo Zanoni e 

Cláudia Cordiolli, e aos residentes da Ornitopatologia, João Zamae e Milena 

Coppola, pelos conhecimentos compartilhados e pela agradável convivência.  

Aos pós-graduandos Isabelle Ferreira, Francisco Pedraza, Maurício Montoya, Carlos 

Eduardo Fonseca, Cynthia Viana, Hugo Orsini, Ana Angelita S. Baptista, Taís 

Donato, Rafael Torres, Pedro Pinczowski, Ana Paula Masseno, Camila Dias Porto, 

Anita Menconi, Ticiana Rocha, Érica M. Terra, Elisane Milbradt, Paulo O. Bersano 

e Rodolfo Frankson, agradeço pelo agradável convívio e troca de conhecimentos que 

tanto nos engrandece.  

Aos pós-graduandos que me acompanharam desde a residência, Didier Quevedo 

Cagnini, Arita Cremasco, Freddi Bardella de Souza e Fabrizio Grandi, agradeço 

especialmente pelos conhecimentos compartilhados, pelo apoio e pelo convívio durante 

esses anos, vocês são parte especial da minha formação. 



 

Aos pós-graduandos Raquel Beneton Ferioli, Gabriela Daniel, Marcela Marcondes, 

Luciano Fonseca e Mariana Marras Vidale pela companhia divertida e agradável! 

À pós-graduanda Márcia Moleta Colodel, agradeço pelas coletas das amostras e apoio 

na execução deste trabalho. 

As minhas amigas-irmãs Lalá, Thai e Carol, não tenho palavras pra agradecer, 

obrigada pela amizade sincera, pelo amparo nos momentos difíceis e pelas boas 

gargalhadas, vocês foram minha família aqui e vou levá-las sempre comigo! 

Aos amigos não menos queridos Renata (Alfs), Aline e João Marcelo, obrigada pela 

amizade e por todos os momentos bons compartilhados, e aos queridos Fezinha, João 

Carlos e Margarete por terem me acolhido de forma tão carinhosa. 

Aos meus amigos de longa data Leonita, Cida e Diego, amigos especiais que mesmo 

distante sempre me apoiaram e estiveram presentes nessa jornada. 

Ao meu cunhado Rumenick e sua família nas pessoas de Edna, Amarildo, Cristiane e 

Vô, obrigada pela amizade e apoio. 

À minha segunda família Elme, Victor, Angel, José, Ellen e vó Branca, obrigada por 

me receberem com tanto carinho. 

À minhas tias-mães tia Cida, tia Deli e tia Bel, obrigada por tudo, pelo incentivo, por 

todo carinho e cuidado que sempre tiveram comigo, e aos meus tios tio Pedro, Antero e 

tio Daniel pelo apoio.  

Agradeço de forma especial aos tios Luis, Dedê, Bingo e Ângela, por todo cuidado e 

ajuda nos momentos difíceis. 



 

Aos meus primos-irmãos Manu, Mari, João Victor e Dani, obrigada por sempre 

estarem presentes na minha vida, vocês são parte essencial dela. 

À minha vó Madalena e vô Domingos, obrigada pelo exemplo de vida, por todo 

carinho e todo amor que sempre tiveram comigo, são meu porto seguro! 

À minha irmã Lorenna, não tenho palavras para agradecer, obrigada por sempre estar 

do meu lado, por toda cumplicidade, por me ajudar a suportar os momentos difíceis e 

por todos os momentos bons vividos, e principalmente pelas gargalhadas juntas. Te 

amo! 

Agradeço de modo muito especial ao meu pai Joacy e à minha mãe Maria de Lurdes, 

responsáveis por mais essa conquista, obrigada pelo amor incondicional e dedicação 

que sempre tiveram comigo, por sempre batalharem pra que eu pudesse chegar até 

aqui, e por acreditarem nos meus sonhos e na minha capacidade, sem vocês nada disso 

seria possível. E quero agradecer aqui de forma mais que especial à minha mãe, uma 

guerreira, batalhadora, exemplo de vida, de superação e força. Amo vocês! 

Ao meu amor, amigo e companheiro Breno, por todo amor, carinho, dedicação e 

cuidado que sempre teve comigo, é parte essencial na minha vida. Obrigada por ter me 

apoiado sempre durante toda essa etapa, pelo auxílio na execução deste projeto, pela 

orientação e pelo cuidado pra que tudo desse certo. Te amo infinitamente! 

Agradeço aos meus amorzinhos, Shiva, Valente, Malhado, Pitico e Roni, e 

especialmente aos tinenéns Tetela-málinda! e Amarelo-meu príncipe,  por me fazerem 

rir sempre! 

Ao Thor (in memorian), meu eterno filhote e companheiro, mãezinha te ama! 



 

Ao Nick, muito mais que meu cão, meu companheirinho e amigo fiel, amor 

incondicional. Lili te ama! 

Aos cães e proprietários que participaram deste projeto, minha gratidão. 

À FAPESP e CAPES, pelo auxílio financeiro para a execução deste projeto.  

À todos que não citei, que de alguma forma contribuíram para a realização deste 

trabalho, muito obrigada! 

 

 

Sinceramente.  

 

 

 

 

 

 

 

Quando se sonha sozinho é apenas um sonho.  

Quando se sonha juntos é o começo da realidade. 

D. Quixote 

http://pensador.uol.com.br/autor/d_quixote/


 

"O Guerreiro da Luz se vê, de vez em quando, andando pelas ruas sem qualquer 

destino. Nestes momentos, ele pensa: "Nada do que planejei esta acontecendo. Dei o 

melhor de mim, segui os meus sonhos, fui fiel a DEUS. Entretanto, as coisas não 

parecem caminhar para frente, meus esforços não estão sendo recompensados. DEUS 

parece que esta surdo porque ele não escuta minha voz", diz o guerreiro, com uma 

certa amargura na voz. Neste momento, a melhor coisa que ele deve fazer é sentar-se 

num bar e pedir um café. Depois de alguns momentos, ele irá ele irá entender que o 

tempo de DEUS não é seu próprio tempo. Em algum lugar do Universo, milhares de 

anjos estão se movendo e caminhando para ajudar todos aqueles que seguem seu 

coração. " 

 

 

Paulo Coelho 

O Guerreiro da Luz 

 

 

 

 

 

 

http://pensador.uol.com.br/autor/paulo_coelho/


 

RESUMO 

A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína secretável que tem sido relacionada 

com diferentes processos fisiológicos e de doença nos seres humanos. Sabe-se que a 

OPN está relacionada com a progressão neoplásica e metástase em diversos cânceres 

humanos, porém esta relação ainda é pouco explorada na literatura veterinária. O 

objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de osteopontina nos carcinomas 

mamários caninos e sua relação com biomarcadores tumorais bem estabelecidos nessas 

neoplasias. Para isso, a expressão de OPN, EGFR, HER2 e c-Kit foi avaliada em 

conjunto com a análise da taxa de Ki67 em 43 carcinomas mamários provenientes de 

cadelas diferentes. Demonstrou-se que a expressão acentuada de OPN está relacionada 

com a expressão de EGFR (P < 0.001) e com a superexpressão de HER2 (P = 0.012). 

Em conclusão, a osteopontina aparenta estar relacionada com prognóstico ruim e 

ativação da via MAPK, este ultimo fato podendo implicar na futura utilização de 

tratamentos baseados em drogas direcionadas para esta via de sinalização particular nas 

neoplasias mamárias de cadelas com expressão acentuada de osteopontina. 

Palavras-chave: EGFR, HER2, MAPK, tumores mamários, cão. 



 

ABSTRACT 

Osteopontin (OPN) is a secreted glycophosphoprotein that has been implicated in a 

number of different normal physiologic and pathologic processes in humans. OPN is 

known to be involved in the progression and metastasis of various humans cancers, but 

this relation is still little explored in the veterinary literature. The aim of this study was 

to evaluate the expression of osteopontin in canine mammary carcinomas and its 

relation with well established canine mammary tumor biomarkers. For that, the 

expression of OPN, EGFR, HER2, and c-Kit were evaluated along with Ki67 rate in 43 

mammary carcinomas from different female dogs. OPN was demonstrated to be 

expressed by neoplastic epithelial cells in all carcinomas as well as in stromal cells from 

the tumor microenvironment. Relation between OPN high expression and EGFR 

positivity (P < 0.001) and high HER2 expression (P = 0.012) was demonstrated.  In 

conclusion, osteopontin seems to be related to poor prognosis and MAPK pathway 

activation, the latter a feature that could imply in the future use of treatments with drugs 

directed against this particular signaling pathway in highly OPN expressing canine 

mammary tumors. 

Keywords: EGFR, HER2, MAPK, mammary tumors, dog. 

 

 

 

 

 



 

LISTA DE TABELAS, QUADROS E FIGURAS 

MANUSCRITO  
 

Table 1. Antibodies used in the immunohistochemical study ...................................... 44 

Table 2 – Relation between OPN immunostaining in neoplastic cells and other markers 

in canine mammary carcinoma……..…………………………………………………..50 

Figure 1. Osteopontin immunoexpression in canine mammary neoplasms. A) 

intermediate osteopontin immunoexpression ; B) High osteopontin immunoexpression. 

DAB immunohistochemistry. Harris hematoxylin counterstain (bar = 20µm) .............. 47 

Figure 2. A –B) Osteopontin positive stromal cells, including inflammatory cells, can 

be observed within the neoplastic microenvironment. DAB immunohistochemistry. 

Harris hematoxylin counterstain (bar = 50µm)………………………………………...48 

Figure 3. More intense OPN expression can be observed in necrotic areas (asterisk). 

DAB immunohistochemistry. Harris hematoxylin counterstain (bar = 200µm) ............ 49 

Figure 4. Osteopontin positive macrophages. DAB immunohistochemistry. Harris 

hematoxylin counterstain (bar = 20µm) ....................................................................... 49 

Figure 5. Osteopontin expression in normal (asterisk) tissue, neoplastic foci (arrows) 

and invasive tumors borders (arrowhead) (bar = 100µm) ............................................. 50 

 

 



 

LISTA DE ABREVIATURAS 

AgNOR - taxa de regiões organizadoras nucleolares argirofílicas 

CD44 – grupamento de diferenciação 44 

CK5- citoqueratina 5 

EGF - fator de crescimento epidérmico 

EGFR – receptor de fator de crescimento epidérmico1 

erbB1- receptor de fator de crescimento epidérmico1 

erbB2- receptor de fator de crescimento epidérmico2 

erbB3- receptor de fator de crescimento epidérmico3 

erbB4- receptor de fator de crescimento epidérmico4 

HER-1 - receptor de fator de crescimento epidérmico 1 

HER-2 – receptor de fator de crescimento epidérmico 2 

HER3- receptor de fator de crescimento epidérmico 3 

HER4- receptor de fator de crescimento epidérmico 4 

HGF - fator de crescimento de hepatócitos 

IHC - imunoistoquímica 

MAPK – via de sinalização intracelular da quinase protéica ativada por mitógeno 

ME – matriz extracelular 

MMP – metaloproteinase 

MMP – metaloproteinase 2  

NF-κB – fator nuclear kappa 

OMS – Organização Mundial da Saúde 

OPN – osteopontina 

PKC – proteína quinase C 

RE – receptor de estrógeno 

RGD - arginina-glicina-asparagina 

RNA – ácido ribonucléico 



 

mRNA – ácido ribonucléico mensageiro 

RTK – receptor tirosina quinase  

RT-PCR – Reação em cadeia da polimerase com a transcriptase reversa 

SIBLING - famíla das glicoproteínas pequenas ligantes de integrina ligada ao N  

VEGF - fator de crescimento endotelial vascular  

uPA- fator do ativador de plasminogênio tipo uroquinase 

WHO - World Health Organization 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

SUMÁRIO 

CAPÍTULO 1 .............................................................................................................. 1 

REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 2 

1- NEOPLASIAS MAMÁRIAS DE CADELAS: ASPECTOS 

CLINICOPATOLÓGICOS, PROGNÓSTICOS E BIOMARCADORES ............ 3 

1.1-Apresentação clínica e diagnóstico .............................................................. 3  

1.2-Fatores prognósticos .................................................................................... 5 

1.3-Biomarcadores ............................................................................................. 7 

2- POTENCIAIS NOVOS BIOMARCADORES: OSTEOPONTINA .................. 9 

2.1-OPN e a progressão tumoral ...................................................................... 13 

2.1.1-Adesão celular e proliferação ........................................................ 14  

2.1.2-Invasão e remodelamento da matriz extracelular ........................... 15 

2.1.3-Inflamação e evasão ...................................................................... 15 

2.1.4-Neoangiogênese ............................................................................ 16 

2.2-A OPN e o câncer de mama ....................................................................... 17  

3-REFERÊNCIAS ................................................................................................. 21 

CAPÍTULO 2 ............................................................................................................ 38 

MANUSCRITO .......................................................................................................... 39 

CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................................... 60 

ANEXOS ................................................................................................................... 62 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

Capítulo 1 
 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Revisão da Literatura 



 

1. NEOPLASIAS MAMÁRIAS DE CADELAS: ASPECTOS 

CLINICOPATOLÓGICOS, PROGNÓSTICO E BIOMARCADORES 

 

1.1 Apresentação clínica e diagnóstico 

Em cães, as neoplasias mamárias esporádicas representam as neoplasias que 

mais afetam as cadelas, constituindo cerca de 50% de todas as neoplasias nessa espécie, 

dos quais cerca de 60% são benignas e 40% malignas (Brodey et al., 1983; Kurzman  e 

Gilbertson,1986; Misdorp, 2002). A incidência dessas neoplasias em cadelas é 

aproximadamente três vezes maior do que nas mulheres (Brodey et al., 1983).  

Os tumores malignos de glândula mamária afetam principalmente as cadelas 

com idade entre os nove e 11 anos, e um aumento na incidência é observado a partir dos 

seis anos de idade (Fowler et al., 1974; Alenza et al., 2000, Zatloukal et al., 2005). O 

desenvolvimento de tumores em cadelas antes dos cinco anos de idade é raro, e quando 

ocorrem, geralmente são de natureza benigna (Alenza et al., 2000). É descrito que cães 

de raças puras, reconhecidamente os das categorias spaniel e pointer, e cães da raça 

daschund, aparentemente são predispostos ao seu desenvolvimento (Rutteman et al., 

2001; Misdorp, 2002; Zatloukal et al., 2005). 

A apresentação clínica das neoplasias mamárias é variável: apresentam-se 

como nódulos únicos ou múltiplos, de tamanhos e consistência variáveis, que podem 

afetar uma única glândula mamária ou várias simultaneamente. Os tumores podem ser 

aderidos ou não aos planos muscular e epitelial, e também podem apresentar ulceração 

da pele ou reação inflamatória local (Kurzman e Gilbertson, 1986; Misdorp et al., 

1999).  



 

A ocorrência de múltiplos tumores mamários sincrônicos é comum e podem 

representar neoplasias primárias independentes uma das outras com diferentes tipos 

histogênicos, por isso recomenda-se que todos os tumores sejam biopsiados de modo a 

determinar sua malignidade (Fowler et al., 1974; Misdorp et al., 1999; Sorenmo et al., 

2009), já que a biópsia excisional é o método de diagnóstico recomendado para os 

tumores mamários caninos (Cassali et al., 2011).  

O exame citológico pode ser utilizado como um método adicional, e tem sido 

aplicado ao diagnóstico de lesões da glândula mamária em cães, mostrando uma boa 

acurácia diagnóstica, com uma correlação em torno de 70% entre o diagnóstico 

estabelecido no exame citológico e o diagnóstico histológico (Zuccari et al., 2001; 

Simeonov e Stoikov, 2006; Sangha et al., 2011). O exame citológico também pode ser 

utilizado para excluir diagnósticos diferenciais como mastite, lipomas e mastocitomas, 

dentre outros, além da inspeção de linfonodos regionais para a detecção de possíveis 

metástases (Cassali et al., 2011). Mas devido às limitações da técnica, a confirmação do 

diagnóstico e a classificação da neoplasia exigem o exame histológico (Simeonov e 

Stoikov, 2006; Sangha et al., 2011). A histopatologia permite que se realize uma análise 

morfológica mais detalhada, assim como a análise de pleomorfismos celulares, grau de 

diferenciação, índice mitótico e margens cirúrgicas (Misdorp et al., 1999). 

Apesar da remoção cirúrgica, o prognóstico para cães com tumores malignos é 

reservado. Até 48% dos cães tratados cirurgicamente morrem ou são sacrificados no 

prazo de um ano de sua cirurgia por causa da recorrência do tumor ou pela ocorrência 

de metástases (Fowler et al., 1974). Tendo em vista a alta taxa de ocorrência das 

neoplasias mamárias, o aparecimento e crescimento rápidos, e a escassez de estatísticas 

de sobrevida, vários estudos têm avaliado diversos fatores com significado prognóstico 

em cães com tumores mamários. No entanto o comportamento biológico dos tumores 



 

mamários caninos continua difícil de prever, e por isso, estudos de fatores prognósticos 

mais precisos são necessários para identificar pacientes com alto risco de recorrência da 

doença e de morte (Graham e Myers, 1999).  

 

1.2 Fatores prognósticos 

A análise dos fatores prognósticos tem por objetivo predizer de forma mais 

acurada possível o comportamento biológico das neoplasias mamárias, e são 

importantes na tomada de decisões relacionadas ao tratamento e procedimentos 

relevantes à qualidade de vida do animal. Diversos estudos têm reconhecido alguns 

fatores prognósticos para as neoplasias mamárias, dentre eles o tamanho do tumor, tipo 

e grau histológico, e acometimento de linfonodos (Misdorp e Hart, 1976; Misdorp et al., 

1999).  

O tamanho do tumor é considerado um fator prognóstico independente nas 

neoplasias mamárias de cadelas (Yamagami et al., 1996, Ferreira et al., 2009). Tumores 

com dimensões de até três centímetros estão diretamente relacionados com um melhor 

prognóstico em relação àqueles de dimensões maiores. Este parâmetro pode ser 

facilmente obtido durante o exame clínico do paciente e deve ser considerado na tomada 

de decisão sobre o tratamento a ser estabelecido (Sorenmo, 2003).   

Além do tamanho tumoral, o padrão de crescimento também é importante 

como característica determinante do prognóstico. Assim, tumores com crescimento 

invasivo, infiltrando tecidos subjacentes à ele, e de grandes dimensões estão 

relacionados à um prognóstico ruim.  O tamanho do tumor (T), a avaliação dos 

linfonodos (N) e de metástases distantes (M) são critérios utilizados para o 

estabelecimento do prognóstico e estadiamento clínico (Alenza et al., 2000).  Esse 

sistema, denominado TNM foi estabelecido pela OMS - Organização Mundial de Saúde 



 

(World Health Organization – WHO) para o estadiamento clínico das neoplasias 

mamárias em cadelas (Owen, 1980). A determinação do estádio clínico permite a 

definição da extensão do tumor, e consequentemente, permite que um prognóstico seja 

estabelecido e o tratamento seja planejado (Sobin e Wittekind, 1997). 

O histotipo e o grau de diferenciação histológica também são reconhecidos 

como importantes fatores prognósticos.  Os sarcomas são descritos como os tumores 

com pior prognóstico comparado com aqueles de origem epitelial, com exceção dos 

carcinomas inflamatórios (Hellmén et al., 1993). Os sarcomas mamários primários se 

comportam como sarcomas de alto grau e são associados com metástases precoces por 

via hematógena e alta incidência de recorrência local (Misdorp et al., 1999). Os 

carcinomas sólidos têm sido relacionados com uma menor sobrevida do que os 

carcinomas tubulopapilares (Bostock, 1975).  De acordo com a classificação histológica 

descrita pela OMS, o comportamento biológico da neoplasia corresponde ao grau de 

diferenciação histológica, havendo comportamento mais agressivo a partir de 

carcinomas não invasores (carcinoma in situ) até carcinomas complexos, passando por 

carcinomas simples, tubulopapilares, sólidos, até carcinomas anaplásicos (Misdorp et al, 

1999). 

A graduação histológica também tem grande importância prognóstica nas 

neoplasias mamárias, pois permite avaliar a arquitetura da neoplasia e a morfologia dos 

núcleos, e posteriormente o grau histológico, que apresenta uma correlação significativa 

com a agressividade do tumor (Elston e Ellis, 1991). Portanto, a graduação histológica 

dos tumores determinada pelo sistema Nottingham e modificado por Elston e Ellis 

(1998), representa uma ferramenta sensível que pode ser incorporada na rotina 

veterinária. 



 

Outras características anatomopatológicas também podem estar associadas com 

um prognóstico reservado a ruim, como infiltração estromal (Itoh et al., 2008), ausência 

de resposta inflamatória (Estrela-Lima et al., 2010) taxa de regiões organizadoras 

nucleolares argirofílicas (AgNOR) (Kumar et al., 2010) e  microdensidade vascular 

(Graham et al., 1999).  

 

1.3 Biomarcadores 

Embora diversas proteínas tenham sido identificadas por serem diferencialmente 

expressas entre grandes grupos de tumores benignos e malignos, a detecção 

imunoistoquímica de biomarcadores ainda não se tornou uma rotina no diagnóstico de 

neoplasias mamárias caninas. Uma vez que mudanças genéticas podem estar associadas 

com diversos tipos de câncer, a expressão de diversos genes e as proteínas originadas a 

partir destes têm sido determinada de modo a detectar associações com o aumento na 

agressividade e um pior prognóstico. Recentemente, observa-se crescente aumento na 

busca por marcadores prognósticos para as neoplasias mamárias na cadela, incluindo 

aqueles de proliferação celular (Matos et al., 2006; Penã et al., 1998), receptores 

hormonais (Martín de las Mulas et al., 2005; Nieto et al., 2000), p53 (Lee et al., 2004) e 

receptor de fator de crescimento epidérmico 2 (HER2) (Martin de las Mulas et al., 

2003) e ainda moléculas de adesão celular (Gama et al., 2008; Matos et al., 2007).   

 O papel dos hormônios esteróides, estrógeno e progesterona, na patogênese dos 

carcinomas mamários da cadela é bem estabelecido. Esses receptores estão presentes em 

altas proporções nas mamas normais e nos tumores benignos comparado aos tumores 

malignos (Rutteman et al., 1988), e nos sítios metastáticos os receptores geralmente são 

negativos (Alenza et al., 2000). Assim, acredita-se que existe uma relação inversa entre 

o número de receptores hormonais e a capacidade proliferativa das células neoplásicas 



 

(Cassali, 2000; Geraldes et al., 2000). Este fato é importante uma vez que neoplasias 

com altos índices de proliferação celular possuem um comportamento clínico mais 

agressivo e risco aumentado de metástase (Nieto et al., 2000; Dutra et al., 2008). Nos 

cães, resultados semelhantes aos descritos em mulheres foram observados em termos de 

aumento da expressão de Ki67 nos tumores malignos, particularmente nas neoplasias 

menos diferenciadas (Cassali, 2000).   

 A neoangiogênese tem sido descrita como um indicador prognóstico 

independente e altamente significativo em mulheres com câncer de mama (Weidner et 

al., 1991; Weidner et al., 1992; Bosari et al., 1992). Nas cadelas, há uma correlação 

significativa entre o aumento do número microvasos (microdensidade vascular) nas 

neoplasias mamárias e a presença de metástases (Weidner et al., 1991; Grahan e Myers, 

1999). Outras investigações concluíram que a densidade de microvasos em tumores de 

mama mostrou uma correlação significativa com intervalos livres de doença e tempo de 

sobrevida (Weidner et al., 1992; Bosari et al., 1992). 

 A família de receptores erbB compreende quatro membros, o receptor do fator 

de crescimento epidérmico (EGFR, também conhecido como erbB-1/HER-1), erbB-

2/Neu/HER-2, erbB-3/HER-3 e erbB-4/HER-4, que pertencem a classe tipo I de 

receptores tirosina quinase (RTK). Eles desempenham um papel importante na 

mediação de sinalização de fatores de crescimento (Yarden e Sliwkowski, 2001). A 

sinalização anormal destas vias resulta em proliferação celular desregulada, evasão de 

apoptose, angiogênese, migração e metástase (Eccles et al., 1995). Vários estudos 

demonstram que a superexpressão da proteína HER-2 se correlaciona com menor 

sobrevida, fenótipo de maior agressividade e de prognóstico ruim em mulheres com 

câncer de mama (Perou et al., 2000; Sorlie et al., 2003).  As neoplasias mamárias de 

cadelas superexpressas para HER-2 geralmente estão associadas com indicadores bem 



 

estabelecidos de prognóstico ruim, como maior tamanho tumoral, grau histológico 

elevado, invasão e altas taxas proliferativas (Martín de las Mulas et al., 2003; Gama et 

al., 2008). Entretanto, a superexpressão de HER2 nos carcinomas mamários caninos 

ainda não está totalmente clara (Gama et al., 2008). 

 Na mulher, foram identificados subtipos moleculares em carcinomas mamários a 

partir do perfil de expressão de alguns genes, e estes subtipos se diferem quanto ao seu 

comportamento biológico e desfecho clínico (Perou et al., 2000, Sorlie et al., 2001).  Os 

subtipos foram estabelecidos por meio da técnica de microarranjos de acordo com 

grupos de perfis de expressão gênica, a saber: subtipo luminal A e luminal B, que 

expressam receptor de estrógeno (RE), sendo que o subtipo luminal A geralmente 

apresenta baixo grau de agressividade com bom prognóstico, e luminal B, de alto grau 

de agressividade e possui prognóstico reservado; subtipos basal-símile, que não 

expressam RE e possuem prognóstico ruim; subtipos que apresentam superexpressão do 

gene erbB2 ou da proteína gerada a partir deste – o receptor de fator de crescimento 

epidérmico 2 (HER-2) , que também possuem prognóstico ruim (Morris, 2010).   

 Na cadela, Gama e colaboradores (2008) também identificaram subtipos 

fenotípicos distintos utilizando um painel imunohistoquímico, que inclui os marcadores 

moleculares ER, HER2, CK5, p63 e Caderina-P, e baseados na classificação molecular 

da expressão de ER/HER2 os grupos foram classificados em: luminal A (ER+/HER2−), 

luminal B (ER+/HER2+), basal-símile (ER−/HER2−) que foi considerado o subtipo 

com o comportamento clínico mais agressivo e superexpressão de HER2 

(ER−/HER2+).  

  

2. POTENCIAIS NOVOS BIOMARCADORES: OSTEOPONTINA 



 

Uma das melhores estratégias de combate ao câncer é o diagnóstico precoce e 

administração de tratamento eficaz (Etzioni  et al., 2003). Outra abordagem inclui um 

controle rigoroso do paciente após o tratamento inicial (geralmente a cirurgia) para 

detectar possíveis recidivas precocemente e em seguida, prescrever uma terapia 

adicional (Rodrigues et al., 2007). Para tal, biomarcadores do câncer estabelecidos 

previamente são utilizados para monitorar a condição do paciente que apresenta a 

neoplasia. 

Na medicina veterinária, novos biomarcadores são necessários para melhorar 

ainda mais a capacidade dos profissionais para avaliar o prognóstico, já que a neoplasia 

mamária em cadelas é um dos tumores diagnosticados com maior frequência e 

representam um problema de grande impacto na prática veterinária mundial e é assunto 

preocupante tanto para oncologistas quanto patologistas veterinários. 

Recentemente, o uso de biomarcadores tumorais para prever os padrões futuros 

da doença tem sido uma questão emergente, especialmente pelos avanços positivos no 

tratamento do câncer nos últimos anos. Neste contexto, a osteopontina (OPN) constitui 

um possível biomarcador, pois tem sido demonstrado seu papel funcional na progressão 

e malignidade das neoplasias em humanos (Rodrigues et al., 2007). A OPN é 

considerada uma molécula que faz mediação na comunicação célula-matriz e célula-

célula, e em muitos casos, essa comunicação resulta na adesão ou orienta a migração 

celular (Weber e Cantor, 1996).  

Observou-se que a OPN desempenha diferentes papéis em diversos processos 

de desenvolvimento e diferenciação de tecidos, incluindo a glândula mamária (Rittling e 

Novick, 1997) e osso (Yamate et al., 1997), bem como na reparação de feridas (Liaw et 

al., 1998). Além disso, já é conhecido o seu envolvimento na resposta inflamatória, a 

remodelação vascular e mineralização/calcificação (Tuck e Chambers, 2001; Wai e 



 

Kuo, 2004). A OPN também tem sido implicada numa variedade de processos 

patológicos, tais como septicemia e resposta inflamatória (incluindo inflamação 

granulomatosa) para uma variedade de agentes diferentes, reparação de fraturas, 

regulação da formação de cálculos e de mineralizações mamárias e renais, aterosclerose 

e outras doenças cardiovasculares (Tuck e Chambers, 2001; Wai e Kuo, 2004). Além 

disso, a OPN tem sido associada a processos neoplásicos de diferentes origens (Sodek et 

al., 2000; Tuck e Chambers, 2001; Weber, 2001; Wai e Kuo, 2004; Tuck et al., 2007; 

Cho et al. 2009; Shevde et al., 2010) . Nos últimos anos, diversos estudos têm dado 

atenção para a expressão de OPN nas células neoplásicas e também no microambiente 

tumoral (Anborgh et al., 2010).   

A OPN é uma é uma glicofosfoproteína encontrada em todos os fluidos 

corporais, componentes da matriz extracelular (ME) e matrizes proteináceas de tecidos 

mineralizados (Zohar et al., 2000; Suzuki et al., 2002; Sodek et al., 2002; Furger et al., 

2001; Weber, 2001). Em conjunto com a sialoproteína óssea, proteína da matriz 

dentinária I, sialofosfoproteína da dentina e fosfoglicoproteína da matriz extracelular, a 

OPN forma a famíla das glicoproteínas pequenas ligantes de integrina ligadas ao N 

(small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein - SIBLING) (Fisher et al., 2001),  

que pode tanto modular o comportamento celular por mecanismos autócrinos e 

parácrinos, como pela sua interação com receptores de superfície celular tais como as 

integrinas (Bellahcène  et al., 2008).   

A OPN contém diversos domínios de ligação celular, sendo particularmente 

evidenciados aqueles com afinidade pelas integrinas, tais como αVβ1, aVβ3, aVβ5, 

avβ6, α4β1, α5β1, α8β1 e α9β . Essas proteínas são as maiores proteínas 

transmembrânicas que atuam na cascata de adesão (em conjunto com CD44), por meio 

de mecanismos RGD (arginina-glicina-asparagina) dependentes e independentes (Fisher 



 

et al., 2001; Wai e Kuo 2004; Rodrigues et al., 2007; Tuck et al., 2007; Bellahcène et 

al., 2008).  A sequência RGD facilita as interações RGD-dependentes com os receptores 

de integrina e media as sinalizações/ligações celulares (Sodek, 2000; Denhardt et al., 

2001). Normalmente as células aderem à OPN via integrinas e, mesmo interagindo com 

um número diferente de integrinas via sequência RGD, o que melhor caracteriza o 

receptor de OPN é a integrina αvβ3, a qual facilita a adesão da OPN mediada por RGD 

para células neoplásicas (Senger et al., 1995; Senger et al., 1996).  

A OPN intracelular é parte integrante de um complexo de ligação ácido 

hialurônico-CD44-ERM (ezrina/radixina/moesina), complexo envolvido na fixação dos 

fibroblastos, macrófagos, e a migração de células de tumorais, o que sugere que OPN 

estimula ou participa na atividade mitogênica das células (Zohar et al., 2000; Suzuki et 

al., 2002; Sodek et al., 2002). A família CD44 inclui várias isorformas da proteína, 

codificadas por um único agente e gerada por splicing alternativo, e várias dessas 

isoformas tem-se mostrado superexpressos em células malignas (Ponta et al.,  1998; 

Goodison et al., 1999).  

Essas interações da OPN com os diversos receptores de superfície celular pode 

induzir a ativação de várias vias de transdução de sinal, resultando em mudanças na 

expressão de uma série de genes e proteínas que contribuem para o comportamento de 

células alteradas, incluindo a migração e invasão. Esse efeitos da OPN provavelmente 

variam entre os tipos celulares, dependendo, por exemplo, de qual integrina é 

expressada e qual via de sinalização pode ser ativada (Rodrigues et al., 2007; Anborgh 

et al., 2010).  

No homem, uma grande variedade de tipos celulares expressa a OPN. A OPN 

pode ser produzida pelas células epiteliais do trato gastrointestinal, urinário e 

reprodutivo, além da vesícula urinária, pâncreas, brônquios, mama lactante, glândula 



 

salivar, ductos de glândulas salivares (Brown, et al. 1992), células do ouvido interno 

(Sodek et al., 2000), osteoblastos, osteoclastos, células endoteliais, células musculares 

lisas, células do sistema nervoso (neurônios, células da glia e do neurilema – Schwann) 

(Wai e Kuo, 2004; Rangaswami et al., 2006; Wai e Kuo, 2008) e células do sistema 

imunitário ativadas (linfócitos T, linfócitos B, macrófagos, linfócitos natural killer e 

células de Kupffer) (Patarca et al., 1989; Santana e Rosenstein, 2003; Wai e Kuo, 2004; 

Xu et al., 2005; Rangaswami et al. 2006; Wai e Kuo, 2008) e fibroblastos do estroma 

embriogênico (Liaw et al., 1998). A OPN também foi detectada em secreções de alguns 

órgãos como os rins (Shiraga et al., 1992; Yagisawa et al., 1998; Khan et al., 2002), 

tireóide (Castellone et al., 2004), útero (Yagisawa et al., 1998), placenta e testículos 

(Siiteri et al., 1995; Luedtke et al., 2002),  leite e sangue (Senger et al., 1989; Senger et 

al., 1988), fluido seminal e bile (Wai e Kuo, 2004; Rangaswami et al., 2006). 

A expressão da OPN nas células tumorais tem sido mostrada também em uma 

grande variedade de tumores (Brown et al., 1994; Coppola et al., 2004) incluindo o 

carcinoma mamário (Tuck et al., 1998), neoplasias prostáticas (Hotte et al., 2002), 

colônicas (Agrawal et al., 2002), dos ovários (Bao et al., 2007), gástricas (Imano et al., 

2009), hepáticas (Ye et al., 2003; Chen et al., 2010; Lin et al., 2010) e pulmonares 

(Chambers et al., 1996; Zhang et al., 2001; Zhao et al., 2011), além de mesoteliomas 

(Pass et al., 2005), carcinomas de células escamosas cutâneos (Chien et al., 2009), 

sarcomas (Sulzbacher et al., 2002) e mieloma múltiplo (Saeki et al., 2003). 

A expressão de OPN nas neoplasias nos seres humanos foi inicialmente 

demonstrada por Brown e colaboradores em diversos tipos de carcinomas (Brown et al., 

1992), e o seu potencial para predizer o prognóstico foi primeiramente descrito por 

Chambers e colaboradores (1996). A associação da OPN com a progressão tumoral nas 

neoplasias mamárias da mulher foi descrita por Tuck e colaboradores (1997), que 



 

sugeriram que a OPN, tanto nas células tumorais quanto avaliada como presente no 

plasma, pode ser considerada um marcador prognóstico nas neoplasias mamárias nas 

mulheres. Ademais, seus níveis elevados no tumor primário podem predizer um futuro 

desenvolvimento de metástases. Esses resultados sugerem que a superexpressão de OPN 

pode representar um evento molecular chave na progressão tumoral e metástase, 

particularmente na mama da mulher (Rodrigues et al., 2007). 

 

2.1 OPN e progressão tumoral 

A progressão do tumor implica uma sequência de eventos que confere uma 

vantagem de sobrevivência de células transformadas. Estes eventos começam com a 

transformação neoplásica e continuam através da subversão de bloqueios de 

proliferação, restrição de crescimento, barreiras físicas e sistemas de defesa do 

hospedeiro. A sobrevivência das células tumorais requer a proliferação e interação com 

a matriz extracelular a fim de proporcionar espaço para seu crescimento, vias para o 

acesso de nutrientes e de fuga das células para um novo ambiente. Ainda, a progressão 

bem sucedida também envolve respostas celulares e evasão da vigilância imune 

(Bellahcène  et al., 2008). As interações entre a OPN, células inflamatórias/sistema 

imunintário e o microambiente provavelmente desempenham um papel importante no 

desenvolvimento e progressão do tumor (Anborgh et al., 2010).  

 

2.1.1 Adesão celular e proliferação 

As células tumorais se ligam a OPN e a seus fragmentos proteolíticos através 

de uma variedade de receptores de integrina, tanto por interações RGD-dependentes 

quanto independentes, e também podem interagir com variantes específicos de CD44 

que podem ser expressas pelas células tumorais (Bellahcène  et al., 2008). Em um 



 

estudo realizado por Lee e colaboradores (2007), observou-se que a OPN ligada ao 

CD44 resulta na propagação de sinais citoplasmáticos que aumentam a ativação das 

integrinas e, assim, a migração de células da linhagem HT29 em neoplasias de cólon. 

As células tumorais podem ser estimuladas a se propagarem após a interação do CD44 e 

OPN provavelmente através de integrinas, as quais têm funções bem caracterizadas na 

célula permitindo a adesão (Katagiri et al., 1999).  

A reposta proliferativa induzida pela OPN pode ocorrer através da ativação do 

receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e seu receptor Met, e sinalização 

de Ca+2 intracelular mediado por integrinas (Tuck et al., 2007; Bellahcène  et al., 2008). 

Essas interações da OPN com as vias de receptor de crescimento podem influenciar no 

comportamento das células do tumor. A migração de células tumorais também pode ser 

influenciada pelo fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e seu receptor, Met. Além 

disso, a via HGF foi recentemente relacionada à aderência e invasão de células tumorais 

(Trusolino et al., 2000; Tuck et al., 2000). Luo e colaboradores (2011) demonstraram 

que a OPN promove a proliferação e sobrevivência celular de queratinócitos pré-

neoplásicos através de receptores celulares CD44 e ativação da via MAPK, sugerindo 

que a OPN derivada do estroma tumoral têm grande importância na tumorigênese. 

 

2.1.2  Invasão e remodelamento da matriz extracelular 

A capacidade de invasão depende que as células tumorais tornem-se providas 

de alta motilidade e aumentem a expressão de proteases que remodelam a matriz 

extracelular (Thompson e Price, 2002). As integrinas presentes em diversas localidades 

são capazes de interagir com diversos receptores de membrana, por exemplo, o ativador 

de plasminogênio tipo uroquinase (urokinase-type plasminogen activator - uPA).  A 

uPA, como outras enzimas expressas por células tumorais, podem contribuir com o 



 

fenótipo maligno através da degradação dos componentes da matriz extracelular 

favorecendo a migração e invasão, ou também pela ativação de outras proteases (Furger 

et al., 2001).   

Em vários tipos celulares a OPN foi capaz de induzir a expressão e atividade de 

proteases, como os membros da família das metaloproteinases de matriz (MMP), que 

podem contribuir para o processo de metástase por meio de múltiplos mecanismos 

(Chambers e Matrisian, 1997; Teti et al., 1998, Bendeck et al., 2000). A MMP2 é capaz 

de degradar vários componentes da ME e se correlaciona com a capacidade de invasão e 

metástase (Nagase et al., 1992).  

 

2.1.3  Inflamação e evasão 

As atividades biológicas conhecidas da OPN apoiam o seu papel na ocorrência 

do processo de metástase para o tecido ósseo e também a outros órgãos, provavelmente 

influenciado pelas células do microambiente neoplásico que estão intimamente 

associados com sítios neoplásicos primários e metastáticos (Bellahcène  et al., 2008). A 

OPN também tem mostrado um importante papel no câncer ao aumentar a 

sobrevivência de diversos tipos celulares através de interações com diferentes sistemas 

de defesa do hospedeiro. O grupo de células que passa por esse processo inclui células 

neoplásicas, células endotelilais vasculares e células do sistema imunitário associadas 

ao tumor, sendo que os efeitos pró-sobrevivência podem ter influências conflitantes no 

crescimento e na agressividade do tumor. Isso acontece, por exemplo, nas ocasiões nas 

quais a OPN indiretamente favorece a sobrevivência de células tumorais por meio da 

ligação com macrófagos, os quais podem ter sua produção de óxido nítrico alterada 

devido à interações entre a OPN e integrina αvβ3 (Denhardt e Chambers, 1994; 

Denhardt e Guo, 1993; Bellahcène et al., 2008). Assim, a OPN produzida pelas células 



 

tumorais pode promover uma evasão ao sistema imunitário ao tornar deficiente a 

produção de óxido nítrico pelas células por vezes passíveis de realizar o combate às 

células neoplásicas/alteradas (Denhart e Chambers, 1994; Feng et al., 1995).  

A OPN é secretada por leucócitos ativados, como macrófagos e linfócitos T 

(Weber et al., 1996) e também funciona como uma fator quimiotático para macrófagos 

(Giachelli et al., 1998), células dendríticas (Lee et al., 2007) e neutrófilos (Koh et al., 

2007). Possivelmente a expressão da OPN pelos tumores promove o crescimento do 

tumor promovido pela inflamação e culmine na progressão, por exemplo, pela atuação 

de macrófagos e de neutrófilos no microambiente neoplásico. As células do tumor que 

secretam OPN podem induzir um quadro de inflamação crônica, a qual pode acelerar o 

processo de transformação e a progressão do tumor (Feng et al., 1995; Rittling et al., 

2002; Bellahcène  et al., 2008).  

 

2.1.4  Neoangiogênese 

Um estudo recente demonstrou que a OPN desencadeia o crescimento de 

neoplasias mamárias por meio da ativação do fator de crescimento endotelial vascular 

(VEGF) e da indução de neoangiogênese por meio de mecanismos autócrinos e 

parácrinos (Chakraborty et al., 2008). As integrinas αvβ3 medeiam a migração de 

células endoteliais ativadas durante a formação de novos vasos (Liaw et al., 1995). É 

também possível que a modulação da atividade de proteases gere fragmentos bioativos 

de componentes da ME responsáveis pela neoangiogênese (Cui et al., 2007). A OPN 

tem demonstrado ser eficaz na proteção de células endoteliais contra o fenômeno de 

apoptose, sendo que este efeito pode ser mediado pela ativação da via de sinalização do 

fator nuclear kappa B (nuclear factor-kappa B - NF-κB) (Scatena et al.,1998). Ademais, 

a proliferação e a capacidade de invasão mediada pela expressão de OPN estão ligados a 



 

ocorrência de splicing alternativo, gerando diferentes subtipos de OPN, a dizer OPN-a, 

OPN-b e OPN-c; a OPN-b pode afetar a proliferação celular, enquanto a OPN-c 

apresenta uma forte correlação com o comportamento invasivo por parte das células 

neoplásicas (Zhao et al., 2011). 

 Mirza e colaboradores (2008) analisaram amostras de neoplasias mamárias e 

tecido mamário normal em mulheres por meio da utilização de RT-PCR (Reverse 

Transcriptase Polymerase Chain Reaction), verificando que o RNAm de OPN-c é 

expresso em neoplasia mamárias, porém o mesmo não é expresso nos tecidos mamários  

normais. Adicionalmente, os níveis de OPN-c se mostram relacionados com a 

graduação histológica do tumor. As características supracitadas fazem com que a OPN-c 

seja, consequentemente, um marcador candidato para avaliação do potencial invasivo de 

tumores da mama, fato este que poderia abrir precedentes para a intituição de novas 

abordagens diagnósticas.  

 

2.2  A OPN e o câncer de mama 

Embora os mecanismos exatos ainda não tenham sido elucidados, a OPN tem 

sido associada ao desenvolvimento da glândula mamária normal e na sua diferenciação 

(Tuck e Chambers, 2001). Estudos recentes têm abordado o padrão de expressão e o 

possível papel de OPN no desenvolvimento da glândula mamária normal. Rittling e 

Novick (1997) examinaram o padrão de expressão da OPN em glândulas mamárias de 

ratas em diferentes estádios de desenvolvimento pós-natal. Os autores deste estudo 

descobriram que enquanto a OPN é expressa em níveis baixos a moderados nas 

glândulas mamárias de ratas não-prenhes e prenhes, os níveis de OPN são mais altos na 

glândula mamária em lactação desses animais. 



 

Na glândula mamária neoplásica, por sua vez, a OPN afeta o comportamento 

das células neoplásicas de diversas maneiras, tanto in vivo como in vitro (Tuck e 

Chambers, 2001). Os trabalhos de Brown e colaboradores (Brown et al.,1994) e 

Bellahcène  e Castronovo (1995), estabeleceram que, em geral, maiores níveis de 

mRNA ou da proteína OPN, respectivamente, são normalmente encontrados em 

neoplasias mamárias e outros tipos de tumor do que nos seus correspondentes tecidos 

normais, e alterações do crescimento e diferenciação celular que não neoplasias. Além 

de estar presente nos componentes celulares do tecido, a OPN encontra-se também 

presente em associação com calcificações (Bellahcène e Castronovo, 1995). Embora 

tenha sido inicialmente sugerido que OPN presente no tumor seja fornecida 

primariamente pelas células inflamatórias associadas ao tumor (principalmente 

macrófagos e linfócitos T) (Bellahcène  e Castronovo, 1995) e secundariamente 

absorvido pelas células neoplásicas, vários estudos posteriores demonstraram que as 

células do carcinoma de mama em si também sintetizam a OPN (Tuck e Chambers, 

2001). 

Na mulher, a expressão de osteopontina normalmente é ausente ou baixa em 

tecidos normais, entretanto é superexpressaa em epitélios pré-neoplásicos e neoplásicos 

(Senger et al., 1988; Agrawal et al., 2002; Senger et al., 1985), incluindo os da glândula 

mamária(Rudland et al., 2002). 

Alguns autores determinam como os níveis de OPN em tecido tumoral e 

plasma/soro correlacionam-se com o prognóstico e sobrevida em uma variedade de 

neoplasias (Tuck et al., 2007; Wai e Kuo 2008). Nas neoplasias mamárias da mulher, a 

expressão elevada de OPN, no plasma ou mesmo no tumor, tem sido associada com 

menor sobrevida. Em um estudo abordando 333 pacientes com câncer de mama 

(linfonodos negativos e positivos para metástase), a imunoexpressão para OPN foi 



 

negativamente correlacionada com a sobrevida (Rudland et al., 2002). Tem sido 

mostrado também que as metástases linfonodais são mais comuns nas neoplasias 

mamárias com expressão de OPN positiva do que naqueles com ausência de expressão 

de OPN.  

Em mulheres normais, os níveis plasmáticos de OPN, analisados 

quantitativamente através de ELISA, não apresentaram influências hormonais do ciclo 

menstrual (Bautista et al., 1996), assim, diversos estudos posteriores foram conduzidos 

a fim de quantificar a OPN no sangue de pacientes com neoplasias mamárias. Em 

estudo realizado por Singhal e colaboradores (1997), foi constatado que os níveis de 

OPN no plasma de mulheres com neoplasias mamárias metastáticas foram 

significativamente mais elevados em relação a mulheres saudáveis ou mulheres que 

inicialmente foram submetidas a tratamento da neoplasia mamária primária. Além disso, 

verificou-se que níveis mais altos de OPN estavam associados com menor sobrevida e 

com maior número de sítios metastáticos. Estes dados sugerem que os níveis 

plasmáticos da OPN também podem funcionar como um indicador de possível doença 

metastática.  Em outro estudo, a análise seriada da OPN, mensurada nos momentos 

iniciais do diagnóstico e durante a evolução da doença revelou aumento nos níveis 

plasmáticos de OPN ao longo do tempo, confirmando que os níveis plasmáticos de OPN 

podem funcionar como indicadores prognósticos para a sobrevida no câncer de mama 

da mulher (Bramwell et al., 2006).  

Como descrito anteriormente, a OPN pode influenciar no pontencial de 

invasividade de células neoplásicas e na ocorrência de metástases (Brown et al., 1994). 

Finak e colaboradores (2008) relataram a ativação de genes ligados a angiogênese, 

hipóxia e resposta de macrófagos associados ao tumor de OPN no estroma de neoplasias 

mamárias associadas a pior prognóstico, embora Rodrigues e colaboradores (2009) não 



 

tenham encontrado nenhuma relação entre a expressão da OPN no estroma em 

neoplasias mamárias na mulher com parâmetros clínicopatológicos.  

Na cadela, a OPN produzida pelas células e depositada na ME já foi 

identificada no osso e na cartilagem normais de cães (Schnapper e Meyer, 2004), e 

Klopfleisch e colaboradores (2010) analisaram o perfil de expressão gênica por meio da 

utilização de RT-PCR para avaliar a expressão de 49 genes de 10 neoplasias benignas e 

13 neoplasias malignas metastáticas caninas, porém não foi observada diferenças na 

expressão da OPN nos grupos testados.  

Contudo, ainda não existem estudos sobre o padrão de imunoexpressão da 

OPN nas neoplasias mamárias da cadela e, como existem similaridades entre as 

neoplasias de mama na cadela e na mulher, novas pesquisas devem ser desenvolvidas 

nesta área a fim de esclarecer o papel da OPN nesse grupo de neoplasias.  

 

 

 

 

 

 

 



 

REFERÊNCIAS 

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Capítulo 2 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Manuscrito 



 

Relation between osteopontin, EGFR, and HER2 expression in canine mammary 

carcinomas  

Lidianne Narducci Monteiro1,2, Breno Souza Salgado1, Deilson Elgui de Oliveira1, 

Noeme S. Rocha1,2 

1Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina de Botucatu, Univ. Estadual 

Paulista (Department of Pathology, Botucatu Medical School, São Paulo State 

University) – UNESP. Botucatu, Brazil. 

2Laboratório de Patologia Investigativa e Comparada, Faculdade de Medicina 

Veterinária e Zootecnia, Univ. Estadual Paulista (Investigative and Comparative 

Pathology Laboratory, School of Veterinary Medicine and  Animal Science, São Paulo 

State University) – UNESP. Botucatu, Brazil. 

 

Corresponding author 

Lidianne Narducci Monteiro. Departamento de Clínica Veterinária, Serviço de 

Patologia Veterinária. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP – Univ. 

Estadual Paulista. Botucatu, São Paulo, Brazil. ZIP Code: 18618-970. Telephone/fax: 

+55 14 3880 2064. E-mail: lidinarducci@hotmail.com 

 

 

*Manuscrito modelo redigido para submissão para periódico científico. As figuras e as 

tabelas estão dispostas ao longo do texto de modo a facilitar a compreensão do mesmo. 



 

ABSTRACT 

Osteopontin (OPN) is a secreted glycophosphoprotein that has been implicated in 

different physiologic and pathologic processes in humans. OPN is known to be involved 

in progression and metastasis of various humans cancers, but this relation is still little 

explored in the veterinary literature. The aim of this study was to evaluate the 

expression of osteopontin in canine mammary carcinomas and its relation with well 

established canine mammary tumor biomarkers. For that, expression of OPN, EGFR, 

HER2, and c-Kit were evaluated along with Ki67 rate in 43 mammary carcinomas from 

different female dogs. OPN was demonstrated to be expressed by neoplastic epithelial 

cells in all carcinomas as well as in stromal cells from the tumor microenvironment. 

Relation between high OPN expression and EGFR positivity (P < 0.001) and HER2 

overexpression (P = 0.012) was demonstrated. In conclusion, high OPN expression 

seems to be related to poor prognosis and MAPK pathway activation, given the 

association with EGFR and HER2, members of the MAPK signaling pathway. Such 

feature could imply in the future use of treatments with drugs directed against this 

particular signaling pathway in highly OPN expressing canine mammary tumors. 

Keywords: EGFR, HER2, MAPK, mammary tumors, dog. 



 

INTRODUCTION 

Mammary tumors are the most prevalent neoplasms that affect intact female dogs (Lana 

et al., 2007), with approximately 40 to 50% being described as histologically malignant 

(Sorenmo, 2003). Unfortunately, the prognosis for dogs with malignant mammary 

tumors is guarded. Up to 48% of dogs treated surgically die or are euthanized within 1 

year after surgery due to tumor recurrence or metastasis (Fowler et al., 1974). Numerous 

prognostic factors have been evaluated for dogs with mammary tumors and cancer 

biomarkers that allow the anticipation of disease outlines are desired. Despite this, there 

is a growing need for additional reliable molecular markers (Lacroix et al., 2002) since 

the biologic behavior of canine mammary neoplasms continues to be difficult to predict. 

Consequently, additional and more accurate prognostic aids are needed to identify 

patients at high risk for disease recurrence and death (Graham and Myers, 1999). 

Several proteins have been identified to be differentially expressed in large groups of 

benign and malignant tumors, and immunohistochemical analysis of biomarkers has a 

key role in this evaluation. Previous studies on the supplementation of the 

histopathologic prognosis of the clinical outcome of canine mammary tumors showed 

the need for the establishment of immunohistochemical markers capable of providing 

useful data (Klopfleisch et al., 2010). In humans, osteopontin (OPN) – a secreted 

glycophosphoprotein that has been implicated in a number of different normal 

physiologic and pathologic processes (Tuck et al., 2007) such as increase in metastatic 

potential (Kadar et al, 2002) – was demonstrated to be expressed in a variety of tumors 

(Brown et al. 1994; Coppola et al., 2004). The mechanism of OPN overexpression and 

its role in human breast cancer is not clear but it was established that OPN interacts with 

various cell surface receptors such as EGF receptor (Yarden and Sliwkowski, 2001). 

EGF receptor subfamily genes encode 4 structurally related tyrosine kinase receptors 

(TKR): epidermal growth factor receptor (ERBB1 gene, EGFR/HER1 protein); ERBB2 

gene, erbB2/Neu/HER2 protein; ERBB3 gene, HER3 protein; and ERBB4 gene, HER4 

protein, all of them belonging to the type I TKR class. They play an important role in 

mediating growth factor signaling (Yarden and Sliwkowski, 2001).  

Within the repertoire of signaling molecules in the network is a family of protein kinase 

cascades known as mitogen-activated protein kinase modules (MAPK). These cascades 



 

contain consecutively activated protein kinases that culminate in the activation of a 

multifunctional MAPK. MAPK are major pathway components that control 

embryogenesis, cell differentiation, cell proliferation, and cell death (PEARSON et al., 

2001). As well as EGFR and HER2, the c-Kit oncoprotein – a tyrosine kinase receptor 

like those from the erbB family – is also said to be related to cell proliferation and 

differentiation (Chui et al., 1996). 

There are no studies that can explain the role of OPN’s immunoexpression in canine 

mammary tumors and its relation with proteins from the MAPK pathway. 

Consequently, the aim of the present study was to evaluate OPN immunoexpression in 

canine mammary carcinomas from 43 patients in order to assess its relation with 

different well established canine mammary carcinoma cancer biomarkers, including 

proliferation rate (Ki67 rate), expression of the MAPK pathway-related proteins EGFR 

and HER2, and the tyrosine kinase receptor c-KIT.  

MATERIALS AND METHODS 

Tissue samples 

Canine mammary carcinomas (n=43) collected at the time of surgical excision by the 

Investigative and Comparative Pathology Laboratory, São Paulo State University, 

Botucatu, Brazil, were used in this study. Samples were fixed in 10% neutral formalin 

and embedded in paraffin wax. Sections (4µm thick) were obtained and stained with 

hematoxylin and eosin for histological examination in order to confirm mammary 

carcinoma diagnosis. Samples were classified using the most recent classification 

scheme for canine mammary tumors by the World Health Organization (Misdorp et al., 

1999). Three independent pathologists (LNM, BSS, NSR) were responsible for the 

evaluation of tissues and diagnosis of the neoplasms. 

Immunohistochemistry 

For immunohistochemistry, 3 µm thick sections were obtained from paraffinized tissue 

blocks and subsequently deparaffinizated and rehydrated. The primary antibodies used 

in this study are summarized in table 1. A polymer-based labeling system kit (NovoLink 

Polymer System, Novocastra Laboratories, Newcastle, UK) was used for detection of 

antigen-antibody reaction and peroxidase and protein blockages. Antigen retrieval was 



 

carried out by heat treatment in 10mM citrate buffer, pH 6.0. After cooling (20 minutes 

at room temperature), sections were sequentially immersed in solutions provided by the 

kit according to manufacturer’s instructions in order to block endogenous peroxidase 

activity and unspecific proteins. Then, slides were overnight incubated at 4 oC with the 

specific antibodies. Subsequently, 3,3’ diaminobenzidine tetrahydrochloride was used 

as chromogen in order to allow the visualization of antigen-antibody reaction. The 

slides were then counterstained using Harris’s hematoxylin, dehydrated, and mounted 

for evaluation under light microscopy.  

Table 1. Antibodies used in the immunohistochemical study 

Antibody Clone Dilution Origin Source 

Osteopontin LFMb-14 1:50 
Novocastra 

Laboratories, UK 
Mouse 

Ki67 MIB1 1:50 Dako Mouse 

CD117 104D2 1:400 Dako Mouse 

HER-2 policlonal 1:2000 Dako Rabbit 

EGFR 
NCL-

EGFR 
1:100 

Novocastra 

Laboratories, UK 
Mouse 

Immunohistochemical results evaluation 

The evaluation of immunohistochemistry results was performed by three pathologists 

(LNM, BSS, NSR). OPN was considered positive whenever any cytoplasmic staining 

was observed in the neoplastic and stromal cells. The assessment of OPN expression in 

neoplastic cells was performed semiquantitatively using the Allred 8-unit system 

(Allred et al., 1993). In such scoring system, tumor epithelial cells proportion score and 

intensity score were determined for each tumor, represented by one slide, as follows: the 

proportion score included the fraction of positively stained tumor cells and was as 

follows: 0 =none, 1= <1/ 100th; 2=1/100th to 1/10th; 3=1/10th to 1/3; 4 =1/3 to 2/3; 5= 

> 2/3. The estimated average staining intensity of the positive tumor cells was expressed 

as follows: 0 = none; 1 = weak; 2 = intermediate; 3 = strong. For statistical purposes, an 

OPN score of 1–3 was considered low (+1), an OPN score of 4–6 was considered 

intermediate (+2), and an OPN score of 7–8 was considered high(+3). OPN expression 

was evaluated also in peritumoral inflammatory and tumor stromal cells.  



 

HER2 expression was evaluated according to the DakoCytomation HercepTest scoring 

system: 0 = no staining or membrane staining in fewer than 10% of tumor cells; 1+ = 

faint, barely perceptible membrane staining in more than 10% of tumor cells, the cells 

are stained only in part of the membrane; 2+ = weak to moderate complete membrane 

staining observed in more than 10% of tumor cells; and 3+ = strong, complete 

membrane staining in more than 10% of tumor cells. Cases were considered positive 

(overexpressed) for HER2 when immunostaining was characterized as 2+ or 3+. EGFR 

staining was classified in positive or negative, according to Dako’s EGFR pharmDx 

interpretation manual. 

For Ki67, four categories were defined, as follows: <10%, 10-25%, 26-50% and >50% 

of stained nuclei. For c-kit expression, the reaction product was evaluated along the cell 

membrane, as well as in the cytoplasm. Firstly, the quantity of immunoreactive cells 

was estimated according to the scheme adopted by Biermann et al. (2007): none; <10%; 

10–75%; and >75% of the cells. The level of immunoreactivity was assessed on the 

basis of its predominant intensity: weak (+); moderate (++); and strong (+++). The final 

immunoreactive score was calculated as strong (4), when at least 75% of cells exhibited 

at least moderate immunoreactivity; in cases of weak immunoreactivity in <10% of all 

tumor cells, the final score was considered as (1). The (0) score was considered 

negative. The (3) score was assigned if a weak immunoreactivity was present in >75% 

of tumor cells or if in 10–75% tumor cells strong or moderate staining was observed. 

All other cases were given a score of (2). 

Positive and negative controls were included in each run in order to guarantee the 

reliability of the assays. For OPN, canine kidney was used. Additionally, a canine 

mammary carcinoma already recognized as HER2 positive, a canine cutaneous mast cell 

tumor positive for c-Kit, and a canine cutaneous squamous cell carcinoma recognized as 

positive for EGFR and Ki67 were used. Rabbit and mouse IgGs (Dako, Carpinteria, 

CA) were used in tumor samples for negative control purposes.  

Statistical analysis 

Differences in proteins expression were compared using Fisher’s exact test or Pearson’s 

X2 test for qualitative variables and using Student’s t-test or analysis of variance for 

continuous variables. Survival curves were estimated using Kaplan-Meier product-limit 



 

method, and the significance of differences between survival curves was determined 

using the log rank text. All statistical tests were two sided, and statistical significance 

was accepted at the P < 0.05 level. All analyses were performed using the Prism 

GraphPad software version 5.0 (San Diego, CA).  

RESULTS  

Immunohistochemistry 

Ctoplasmic OPN staining was consistently observed in neoplastic cells of all mammary 

tumors evaluated (43/43), always presenting an intermediate or high classification score 

(fig. 1); 12 of 43 (28%) samples showed intermediate score and 31 of 43 (72%) high 

score. We observed that all samples presented more than 50% of positive neoplastic 

cells and revealed a high score variation due to the staining intensity. The OPN 

positivity was seen mainly within the cytoplasm, sometimes perinuclearly or, less 

commonly, in a cell surface distribution in the neoplastic cells. There was no 

immunohistochemically negative sample for osteopontin.  

A strong OPN expression was consistently observed in the epithelial component and 

myoepithelial cell layer, with cells showing a cytoplasmic expression pattern. The 

surrounding stroma was usually OPN positive, since OPN immunoexpression was also 

observed in tumor stromal matrix component, stromal fibroblasts, vascular endothelial 

cells, muscular cells, macrophages and other inflammatory cells in all samples (fig. 2). 

A consistent OPN immunoexpression was also observed in areas with necrosis (fig. 3), 

chronic inflammation (fig. 4) and on invasive tumor borders (fig. 5). We also observed a 

weak OPN immunoexpression in luminal mammary cells from the normal mammary 

tissue adjacent to neoplastic foci (fig. 5). 



 

 

 

Figure 1. Osteopontin immunoexpression in canine mammary neoplasms. A) 

intermediate osteopontin immunoexpression ; B) High osteopontin immunoexpression. 

DAB immunohistochemistry. Harris hematoxylin counterstain (bar = 20µm)  

A 

B 



 

 

 

Figure 2. A – B) Osteopontin positive stromal cells, including inflammatory cells, can 

be observed within the neoplastic microenvironment. DAB immunohistochemistry. 

Harris hematoxylin counterstain (bar = 50µm) 

A 

 

 

 

 

 

 

 

 

B 

 

 

 

 

 

 



 

 

Figure 3. More intense OPN expression can be observed in necrotic areas (asterisk). 

DAB immunohistochemistry. Harris hematoxylin counterstain (bar = 200µm) 

 

Figure 4. Osteopontin positive macrophages. DAB immunohistochemistry. Harris 

hematoxylin counterstain (bar = 20µm) 



 

 

Figure 5. Osteopontin expression in normal (asterisk) tissue, neoplastic foci (arrows) 

and invasive tumors borders (arrowhead) (bar = 100µm) 

Relation between osteopontin and other markers 

The relation between OPN immunoexpression in neoplastic cells and HER2, EGFR, c-

Kit immunoexpression, and proliferation/Ki67 rates are shown in Table 2. 

Table 2 – Relation between OPN immunostaining in neoplastic cells and other markers 

in canine mammary carcinomas 

  

Intermediate 

OPN 

[n*, (%)] 

High 

OPN 

[n*, 

(%)] 

p 

HER2 
HER2 + 6 (50) 

28 

(90.3) 0.012 

HER2 - 6 (50) 3 (9.7) 

EGFR 
EGFR + 7 (58.3) 

29 

(93.5) <0.001 

EGFR - 5 (41.7) 2 (6.4) 



 

CD117 

(c-Kit) 

Negative 0 (0) 0 (0) 

0.799 

Score 1 5 (41.7) 
11 

(35.5) 

Score 2 2 (16.7) 
11 

(35.5) 

Score 3 4 (33.3) 
8 

(25.8) 

Score 4 1 (8.3) 1 (3.2) 

Ki67 

< 10% 1 (8.3) 
7 

(22.6) 

0.214 10-25% 8 (66.7) 
20 

(64.5) 

26-50% 3 (25) 3 (9.7) 

>50% 0 (0) 1 (3.2) 

From the 43 mammary carcinoma evaluated samples, 34 (79.07%) were positive for 

HER2 and 36 (83.72%) were for EGFR. Additionally, 28 tumors with high OPN high 

expression (90.3%) also showed HER2 overexpression, revealing a statistically 

significant association (P = 0.012). For EGFR, 29 (93.5%) of positive cases also 

presented high OPN expression, revealing a statistically significant relation (P < 0.001). 

All cases (43/43) were positive for c-Kit, presenting score variation between 1 to 4. 

There was no significant association with c-Kit and proliferation rates (Ki67) (P > 

0.05). Despite this, 27 from the 31 OPN overexpressing cases (87%) revealed less than 

25% neoplastic cells positive for Ki67; however, no statistically significant relation 

between OPN and Ki67 rate could be stated.  

DISCUSSION 

The aim of this study was to determine the OPN glycoprotein expression level in the 

stroma and neoplastic cells of canine mammary tumors and its association with others 

proteins by means of immunohistochemistry. Since there are no similar reported studies, 

an elucidation on its significance in canine mammary tumors was required. OPN-

producing cells and OPN deposition in extracellular matrix were previously identified 

by IHC in bone and cartilage in dogs (Schnapper & Meyer, 2004). Additionally, a 



 

quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction array was 

established to quantify the expression levels of 49 genes relevant to carcinogenesis in 

laser-microdissected tumor cells of 10 benign and 13 metastatic canine mammary 

tumors (Klopfleisch et al., 2010). In such study, OPN have been detected in normal 

tissues; however no significant differences in expression among any of the groups tested 

were observed for osteopontin. 

Presently, it is fully accepted that OPN is expressed by tumor cells both in humans and 

animals and affect the malignant properties of neoplastic cells, specifically by affecting 

their ability to grow, invade, and metastasize. Additionally, OPN is also known to be 

expressed in both normal and malignant tissues (Rodrigues et al., 2009). In the study 

herein reported, we have found that all of the carcinomas are stained positively for OPN 

and, according to the used immunohistochemical grading system, tumors consistently 

highly expressed such protein. This finding is similar to previous studies that focused on 

OPN in women breast tumor tissue (Tuck et al., 1998; Kim et al., 1998; Coppola et al., 

2004; Rodrigues et al, 2009), since authors report a high frequence of OPN positive 

samples. Additionally, some authors reported OPN positivity in 100% of studied cases 

of human hepatocellular carcinomas (Tsai et al., 2012), in a similar way to what was 

observed in this study. Despite canine mammary tumors can sometimes be 

histologically and biologically different from women breast cancer, the