Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus de Botucatu FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU Programa de Pós – Graduação em Doenças Tropicais Taisa Trevizani Rocchetti Detecção do operon ica da produção de biofilme, gene mecA de resistência à oxacilina e identificação de espécies de Staphylococcus spp. diretamente dos frascos de hemoculturas pela técnica de PCR multiplex Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista (FMB/UNESP), para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais Orientador: Profª. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Co-orientador: Profº. Alessandro Lia Mondelli Botucatu – São Paulo 2014 Taisa Trevizani Rocchetti Detecção do operon ica da produção de biofilme, gene mecA de resistência à oxacilina e identificação de espécies de Staphylococcus spp. diretamente dos frascos de hemoculturas pela técnica de PCR multiplex Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista (FMB/UNESP), para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais Orientador: Profª. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Co-orientador: Profº. Alessandro Lia Mondelli Botucatu – São Paulo 2014 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE - CRB 8/5651 Rocchetti, Taisa Trevizani. Detecção do operon ica da produção de biofilme, gene mecA de resistência à oxacilina e identificação de espécies de Staphylococcus spp. diretamente dos frascos de hemoculturas pela técnica de PCR multiplex / Taisa Trevizani Rocchetti. - Botucatu, 2014 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Coorientador: Alessandro Lia Mondelli Capes: 21202010 1. Biofilme. 2. Microorganismos - Efeito dos antibióticos. 3. Estafilococos. 4. Reação em cadeia de polimerase. 5. Identificação. Palavras-chave: Hemocultura; Identificação; PCR multiplex; Staphylococcus spp. Epígrafe “O êxito da vida não se mede pelo caminho que você conquistou, mas sim pelas dificuldades que superou no caminho” Abraham Lincoln Dedicatória Dedico a minha família que sempre me apoiou e acreditou em mim. Agradecimentos Primeiramente a Deus por ter me protegido e me dado força na minha caminhada, fazendo com que tudo desse certo; Ao meu pai Vanderlei Roccehtti e minha mãe Maria Regina Trevizani, pela educação e carinho, me ensinando a nunca desistir dos meus sonhos; Ao meu irmão Thiago Trevizani Rocchetti e a minha irmã Talita Trevizani Rocchetti por estarem sempre ao meu lado em todos os momentos; A Rosalina Fernandes, que sempre esteve presente em todos os momentos e conquistas, me proporcionando carinho e apoio; A Professora Drª Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha, minha orientadora, por ter me aceitado como sua aluna de mestrado, me ensinando e orientando na elaboração deste trabalho; Ao Professor Drº Alessandro Lia Mondelli pela orientação e principalmente por ter aberto as portas do Laboratório de Microbiologia da Seção Técnica de Laboratórios Clínicos do Hospital da Clínicas para que eu pudesse realizar o meu trabalho; A Professora Drª Terue Sadatsune por sempre ter me apoiado, me orientado, ter sido mais que uma professora, desde a minha chegada a Botucatu; Aos colegas do Laboratório de Microbiologia da Seção Técnica de Laboratórios Clínicos do Hospital da Clínicas, Adriano, Marcos, Reonice, Jackson, Ana e Roque pelo aprendizado e paciência; Aos Meus colegas do Laboratório de Bacteriologia do Instituto de Biociências, Mariana, Lígia, Camila, Aydir, Eliane, Valéria, Danilo, Priscila, Luiza, Carla, Carlos, Adilson, Ariane pelo companheirismo e ensinamentos; A minha amiga e colega de mestrado Katheryne Benine, pelo companheirismo, força, e principalmente pela ajuda na realização do trabalho e pela amizade; Aos meus grandes amigos, Berenice Simões, Clarissa Palombarini, Patricia Chidichino, Gabriel Vitor, pela força, amizade, carinho, companheirismo e paciência; Ao meu namorado Rafael Dellevedove pelo companheirismo e carinho e principalmente pela paciência e a sua família por todo o carinho para comigo; A Flávia, Camila, Aline e Melissa pelo companheirismo, amizade e paciência; Aos meus colegas de trabalho do Laboratório Clínico do Hospital Misericórdia por toda atenção, aprendizado e paciência; À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo auxilio financeiro, processo 2010/14250-0; E a Todos que de alguma forma contribuíram para a minha caminhada e a realização desse trabalho. Muito obrigada!!!!!!! Sumário 1 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16 2.OBJETIVO ............................................................................................................................ 28 2.1 Objetivo Geral .................................................................................................................. 28 2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................... 28 3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 3030 3.1 Coleta das amostras ...................................................................................................... 3030 3.2 Identificação fenotípica de Staphylococcus aureus e Estafilococos coagulase negativa ............................................................................................................................................ 3131 3.3 Extração do DNA diretamente dos frascos de hemocultura ......................................... 3333 3.4 Testes de susceptibilidade à antimicrobianos ................................................................. 355 3.5 Padronização do multiplex 1 para detecção do gênero Staphylococcus spp., S. aureus e do gene mecA ....................................................................................................................... 366 3.6 Teste de sensibilidade ..................................................................................................... 388 3.7 Teste de especificidadade ............................................................................................... 388 3.8 Padronização do multiplex 2 para detecção do operon ica............................................. 388 3.9 Padronização do multiplex 3 para identificação de espécies de ECN .......................... 4444 3.10 Internal Transcribed Spacer PCR (ITS-PCR) para confirmação do resultado da identificação genotípica ...................................................................................................... 4646 3.11 Análise estatística............................................................................................................48 2 4. RESULTADOS ................................................................................................................4950 4.1 Amostragem .................................................................................................................. 5050 4.2 Identificação Fenotípica ............................................................................................... 5151 4.3 Detecção de suscetibilidade à oxacilina pelo teste de Disco difusão ........................... 5252 4.4 Multiplex 1.................................................................................................................... 5353 4.5 Teste de sensibilidade do PCR multiplex 1 .................................................................... 566 4.6 Teste de especificidade do PCR multiplex 1 .................................................................. 577 4.7 Multiplex 2...................................................................................................................... 588 4.8 Multiplex 3.................................................................................................................... 6060 4.9 Identificação Genotípica ITS-PCR ............................................................................... 6262 4.10 Identificação Genotípica ............................................................................................. 6363 4.11 Custos.............................................................................................................................64 5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 67 6.CONCLUSÃO.......................................................................................................................78 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................80 8. ANEXO....................................... ....................................................................................... 9797 8.1 Anexo 1: Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE)......................................97 3 Indíce de Figuras 4 INDÍCE DE FIGURAS Figura 1: Microscopia eletrônica de células de Staphylococcus spp............................ 17 Figura 2: Organização estrutural do operon ica........................................................... 19 Figura 3: Etapas da formação do biofilme................................................................... 20 Figura 4: Microscopia eletrônica de biofilme em superfície de cateter........................ 21 Figura 5: Diagrama do mecanismo de resistência à oxacilina e presença da PBP2a que confere menor afinidade para β-lactâmicos em geral............................................ 23 Figura 6: Frascos de hemocultivos.............................................................................. 24 Figura 7: Aparelho Bactec 9120 utilizado para a detecção de culturas positivas nos frascos de hemoculturas................................................................................................ 31 Figura 8: Placa de Ágar sangue com crescimento de colônias de Staphylococcus spp.................................................................................................................................. 31 Figura 9: Provas bioquímicas para identificação de espécies de ECN......................... 32 Figura 10: Tratamento com álcool Benzílico.............................................................. 34 Figura 11: Kit Illustra GE Healthcare utilizado na extração do DNA diretamente do frasco de Hemocultura.................................................................................................. 35 Figura 12: Gel de eletroforese com o produto da padronização do PCR multiplex 1 para a detecção do gênero Staphylococcus spp., S. aureus e gene mecA.............................................................................................................................. 37 Figura 13: Gel de eletroforese com o produto da primeira padronização do multiplex 2 para detecção dos genes do operon ica.................................................................................................................................. 39 Figura 14: Gel de eletroforese com o produto do multiplex 2 para detecção do operon ica em ECN....................................................................................................... 42 5 Figura 15: Gel de eletroforese do produto da reação do multiplex 2 para detecção do operon ica em S. aureus............................................................................................ 43 Figura 16: Gel de eletroforese do produto da reação do PCR multiplex 3 para a detecção de espécies de ECN........................................................................................ 45 Figura 17: Gel de eletroforese do produto da reação do ITS-PCR para a confirmação da identificação das espécies de ECN pelo PCR multiplex 3.................. 47 Figura 18: Identificação fenotípica de S. aureus e Estafilococos coagulase-negativa (ECN)............................................................................................................................. 51 Figura 19: Identificação fenotípica de ECN................................................................. 52 Figura 20: Resistência à oxacilina em amostras de Staphylococcus spp. pelo método de disco difusão................................................................................................ 53 Figura 21: Gel de eletroforese do produto da amplificação do multiplex 1 em amostras de hemocultura para a detecção do gênero Staphylococcus e do gene mecA.............................................................................................................................. 54 Figura 22: Gel de eletroforese do produto da amplificação do teste de sensibilidade para ECN e S. aureus do PCR multiplex 1.................................................................... 56 Figura 23: Gel de eletroforese do produto da amplificação do teste de especificidade do PCR multiplex.................................................................................. 57 Figura 24: Gel de eletroforese do produto da amplificação do multiplex 2 para detecção do operon ica em amostras de ECN............................................................... 58 Figura 25: Gel de eletroforese do produto da amplificação do multiplex 2 para detecção do operon ica para amostras de S. aureus....................................................... 59 Figura 26: Gel de eletroforese do produto da amplificação do multiplex 3 para a 6 identificação de espécies de ECN diretamente dos frasco de hemoculturas................. 61 Figura 27: Gel de eletroforese do produto do ITS-PCR para a identificação das amostras em que ocorreu discrepância com o resultado da identificação fenotípica.... 63 Figura 28: Identificação genotípica do multiplex 3 para identificação de espécies de ECN diretamente de hemoculturas................................................................................ 64 7 Indíce de Tabelas 8 ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1. Primers utilizados na reação de PCR multiplex 1 para detecção do gênero Staphylococcus spp.e do gene mecA................................................................................. 36 Tabela 2. Primers utilizados na reação de PCR multiplex 2 para a detecção do operon ica em S.aureus e ECN..................................................................................................... 40 Tabela 3: Primers utilizados na reação do PCR multiplex 3 para detecção de espécies de ECN diretamente do frasco de hemocultura................................................................ 44 Tabela 4. Valores para o teste de concordância Kappa.................................................... 48 Tabela 5: Distribuição das amostras isoladas de pacientes por enfermarias do Hospital das Clínicas da FMB, UNESP............................................................................................ 50 Tabela 6: Relação entre os resultados da detecção do gene mecA e o teste de Disco difusão com oxacilina (1 µg) e cefoxitina (30 µg), e os testes complementares para confirmação da resistência a oxacilina............................................................................... 55 Tabela 7: Distribuição dos genes do operon ica encontrados nas amostras de ECN e S.aureus pelo multiplex 2.................................................................................................. 60 Tabela 8: Discordância entre identificação fenotípica e genotípica no PCR multiplex 3. 62 Tabela 9: Custos da identificação realizada pelo aparelho Vitek e pela técnica de PCR multiplex............................................................................................................................. 65 9 Resumo 10 RESUMO Na última década houve uma clara mudança na etiologia da sepse. Dados recentes do National Healthcare Safety Network (NHSN) mostram que os cocos Gram-positivos têm ultrapassado os bacilos Gram-negativos como os principais agentes etiológicos e os Estafilococos coagulase negativa (ECN) se tornaram os agentes mais frequentes. Entretanto a maioria dos laboratórios clínicos não identifica esses microrganismos a nível de espécies devido à necessidade de realização de uma série de provas bioquímicas. A aplicação de técnic as de biologia molecular, entre elas a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a identificação de bactérias se mostrou uma técnica promissora devido a sua rapidez, acurácia e sensibilidade. Assim, este trabalho objetivou avaliar a eficiência, acurácia e sensibilidade da técnica de PCR multiplex para a detecção do gênero e de espécies de Staphylococcus spp. mais encontradas em hemoculturas, do operon ica de produção de biofilme e da presença do gene mecA de resistência à oxacilina diretamente dos frascos de hemocultivo. Foram analisadas 371 amostras de hemoculturas, positivas para o gênero Staphylococcus obtidas de pacientes atendidos no HC da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB). As amostras foram isoladas e identificadas por testes bioquímicos convencionais e simultaneamente o DNA bacteriano foi extraído diretamente das hemoculturas e destes realizou-se o PCR multiplex. Das 371 amostras estudadas 85 (23,0%) foram de S. aureus e 286 (77,0%) ECN. Dos ECN 152 (53,1%) foram identificados como S. epidermidis, 36 (12,6%) S. haemolyticus, 36 (12,6%) S. hominis, 23 (8,0%) S. capitis, 18 (6,3%) S. warneri, 7 S. caprae, 5 S. simulans, dois S. lugdunensis, dois S. cohnii, um S. saprophyticus, um S. schleiferi, um S. xylosus e concomitantemente um S. haemolyticus e S. hominis, e um S. haemolyticus e S. epidermidis. Das 85 amostras de S. aureus, 43 (50,6%) se mostraram resistentes à oxacilina pelo teste de Disco difusão e destes 42 (97,7%) apresentaram o gene mecA, e das 286 amostras de ECN 236 (82,5%) foram resistentes à oxacilina no teste 11 fenotípico e destes 218 (92,4%) foram positivas para o gene mecA. A identificação fenotípica e a genotípica (PCR multiplex 1) mostrou 100% de concordância nas amostras de hemoculturas onde foram isolados S. aureus e ECN. Nas 286 amostras de ECN foi realizado o multiplex 2 para a detecção dos genes presentes no operon ica. Em 96 (33,5%) amostras não ocorreu a amplificação de nenhum gene, enquanto que em 88 (30,7%) amostras ocorreu a amplificação do operon completo. Das 85 amostras de S. aureus, somente três (3,5%) apresentaram o operon completo. Dentre as 286 amostras positivas para ECN pelo multiplex 1, quando submetidas ao multiplex para identificação das espécies (multiplex 3) revelaram 162 (56,6%) S. epidermidis, 44 (15,7%) S. haemolyticus, 36 (12,6%) S. hominis, 22 (7,7%) S. capitis, um S. warneri, um S. lugdunensis, e concomitantemente um S. epidermidis e S. lugdunensis, um S. haemolyticus e S. hominis e 18 amostras não foram identificadas. A comparação dos resultados obtidos na identificação fenotípica e multiplex 3 mostrou concordância de 93,0% (266 amostras). Palavras-chaves: Identificação, Staphylococcus spp., Hemocultura, PCR multiplex. 12 Abstract 13 ABSTRACT A clear shift in the etiology of sepse has occurred in the last decade. Recent data from the National Healthcare Safety Network (NHSN) show that Gram-positive cocci have exceeded Gram-negative bacilli as the major etiological agents. In this respect, coagulase-negative staphylococci (CoNS) have become the most frequent. However, most clinical laboratories do not identify these microorganisms to species level due to the need for a series of biochemical tests. The application of molecular biology techniques, including the polymerase chain reaction (PCR), for bacterial identification proved to be promising due to their speed, accuracy and sensitivity. The aim of this study was to evaluate the efficiency, accuracy and sensitivity of multiplex PCR for the detection of Staphylococcus spp. frequently found in blood cultures, investigation of the ica operon involved in biofilm formation and the mecA gene encoding oxacillin resistance, and direct detection of major CoNS species in blood culture flasks. A total of 371 blood culture samples positive for Staphylococcus spp. obtained from patients seen at the Hospital of the Botucatu School of Medicine (FMB) were analyzed. The strains were isolated and identified by conventional biochemical tests. Simultaneously, bacterial DNA was extracted directly from the blood cultures for multiplex PCR. S. aureus was isolated from 85 (23%) of the 371 samples studied and CoNS from 286 (77%). Among the latter, 152 (53.1%) isolates were identified as S. epidermidis, 36 (12.6%) as S. haemolyticus, 36 (12.6%) as S. hominis, 23 (8%) as S. capitis, 18 (6.3%) as S. warneri, 7 as S. caprae, 5 as S. simulans, two as S. lugdunensis, two as S. cohnii, one as S. saprophyticus, one as S. schleiferi, and one as S. xylosus. S. haemolyticus and S. hominis were concomitantly identified in one sample and S. haemolyticus and S. epidermidis in another. Forty-three (50.6%) of the 85 S. aureus strains were resistant to oxacillin in the Disk diffusion test and 42 (97.7%) carried the mecA gene. Of the 286 CoNS strains, 236 (82.5%) were resistant to oxacillin in the phenotypic test and 218 (92.4%) were positive for the mecA gene. Phenotypic and genotypic (multiplex 1) 14 identification showed 100% agreement in samples of blood culture from which S. aureus and CoNS were isolated. The 286 CoNS isolates were submitted to multiplex 2 for the detection of genes of the ica operon. None of the genes was amplified in 96 (33.5%) isolates, whereas amplification of the complete operon was observed in 88 (30.7%). Only three (3.5%) of the 85 S. aureus strains carried the complete operon. Multiplex 3 for species identification in the 286 samples positive for CoNS revealed S. epidermidis in 162 (56.6%), S. haemolyticus in 44 (15.7%), S. hominis in 36 (12.6%), S. capitis in 22 (7.7%), S. warneri in one, S. lugdunensis in one, S. epidermidis and S. lugdunensis concomitantly in one, and S. haemolyticus and S. hominis in one. Eighteen isolates could not be identified by multiplex PCR. Comparison of the results obtained by phenotypic and genotypic identification of CoNS species showed 93% agreement (266 strains). Keywords: Identification, Staphylococcus spp., Blood culture, Multiplex PCR. 15 Introdução 16 1. INTRODUÇÃO Infecções da Corrente sanguínea constitui um problema de saúde pública, pois eleva o tempo de hospitalização, morbidade e mortalidade dos pacientes além dos custos no tratamento 1 . Pode ser causada tanto pela microbiota do paciente ou pela contaminação pelo manuseio deste pelos profissionais da saúde, aumentando sua probabilidade em internações mais longas ou em procedimentos mais complicados 2 . A sepse refere-se ao sistema circulatório, sendo resultado da complexa interação entre o sistema imune com o microrganismo infectante 3 . Ela pode ser causada por bactérias, fungos ou vírus, ocorrendo quando os agentes se multiplicam a uma taxa que excede sua remoção. É uma síndrome clínica caracterizada por febres, calafrios, mal-estar, taquicardia, hiperventilação, e toxidade ou prostração. Os seus sintomas são produzidos por toxinas microbianas e/ou citocinas produzidas por células inflamatórias 4 . A sepse pode indicar a disseminação de uma infecção em um órgão ou tecido, podendo manifestar quadros leves até ao óbito 5 . Pode ser classificada como adquirida na comunidade ou nosocomial, podendo ocorrer em pacientes imunocompetentes ou imunossuprimidos, onde o tipo de microrganismo e o prognóstico da infecção resultante variam muito dependendo desses fatores, bem como da idade do paciente 6 . Inúmeras bactérias são isoladas da corrente sanguínea, tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Dados do National Healthcare Safety Network 7 mostram que na última década houve uma clara mudança na natureza da microbiota infecciosa, onde os cocos Gram- positivos têm ultrapassado os bacilos Gram-negativos como os principais agentes etiológicos das sepses, e os Estafilococos coagulase negativa (ECN) se tornaram os agentes mais prevalentes. 17 Em um levantamento realizado no Laboratório de Microbiologia da Seção Técnica de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu em 2011, 55% das hemoculturas positivas foram por cocos Gram-positivos, e destes, 94% eram Staphylococcus spp. Os Estafilococos são cocos Gram-positivos, que se dispõem em cachos quando visualizados no microscópio (Figura 1). O gênero Staphylococcus é composto por 48 espécies 8 , 17 das quais podem ser isoladas de amostras biológicas humanas, sendo dividido em dois grandes grupos: os Estafilococos coagulase positiva, onde o principal representante é o S. aureus e os Estafilococos coagulase negativa (ECN). Os ECN foram anteriormente considerados não patogênicos ou somente parte da microbiota normal da pele humana. Porém recentemente eles têm sido implicados em uma enorme variedade de infecções tanto em hospedeiros imunodebilitados quanto em pessoas saudáveis 9 . Figura 1: Microscopia eletrônica de células de Staphylococcus spp. Fonte:http://www.redorbit.com/education/reference_library/health_1/bacteria/2584196/staphylococcus _aureus/. http://www.redorbit.com/education/reference_library/health_1/bacteria/2584196/staphylococcus%20%20_aureus/ http://www.redorbit.com/education/reference_library/health_1/bacteria/2584196/staphylococcus%20%20_aureus/ 18 S. aureus pode causar uma grande variedade de infecções, muitas delas adquiridas no ambiente hospitalar. De 20% a 30 % da população humana é colonizada por essa bactéria sendo a mucosa nasal o principal nicho 10 . S. aureus apresenta uma grande variedade de fatores de virulência, podendo produzir enzimas, moléculas de adesão, peptidoglicano e ácido teicóico, e quatro classes de citotoxinas 11 , as quais compreendem: quatro hemolisinas (alfa, beta, gama e delta); a leucocidina de Panton-Valentine (genes pvl, LukE-lukD), designada como PVL, sendo a principal função dessas exoproteínas a conversão do tecido local do hospedeiro em nutrientes necessários para o crescimento bacteriano 12 , toxina da síndrome do choque tóxico (gene tst), enterotoxinas estafilocócicas (genes sea, seb, sec, sed, see, seg, seh e sei) e toxinas esfoliativas (genes eta e etb). Esses fatores possuem potente efeito no sistema imune, possibilitando a disseminação desses microrganismos pelo tecido do hospedeiro, causando uma série de infecções 13 . Entre os ECN, as espécies que mais frequentemente causam doenças em humanos são: S. epidermidis, sendo o mais isolado, podendo causar sepse, infecções por implante de cateteres e próteses, peritonites entre outras 14 . S. haemolyticus que também faz parte da microbiota normal da pele, representa o segundo mais isolado de infecções, podendo causar infecções graves, como meningites, endocardites, peritonites, sepse 15 , sendo frequentemente resistentes a um grande número de antimicrobianos, incluindo resistência aos Glicopeptídeos 16 . S. saprophyticus, sendo o mais comum dos estafilococos causador de infecção urinária em mulheres jovens e sadias 17 ; S. warneri, constitui 1% dos Staphylococcus encontrados na pele humana, e é peculiar por produzir uma enzima extracelular que possui atividade tanto de lipase quanto de fosfolipase 18 ; S. lugdunensis que em termos de virulência e destruição tecidual tem o mesmo curso clínico que infecções causadas por S. aureus 19 , podendo causar endocardites, peritonite, osteomielite entre outras 20 e S. hominis, também encontrado na pele de humanos, é 19 um patógeno de baixo grau de virulência, podendo causar endocardite e infecções relacionadas a cateteres 21 . Dentre os Staphylococcus spp. as espécies mais frequentemente isoladas em hemoculturas são S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus e S. hominis. O principal fator de virulência dos Staphylococcus spp. está associado à formação do biofilme que propicia a adesão destes as superfícies plásticas. A aderência é mediada por uma adesina intracelular polissacarídica (PIA) composto por N-acetilglucosamina β-1,6-glicosídio, e sintetizado pela enzima N-acetilglucosaminiltransferase 22,23 . O PIA é codificada pelo operon icaADBC (Figura 2), composto de quatro genes icaA, icaD, icaC, icaB, e uma região promotora denominada icaR. O icaD sozinho não induz atividade enzimática de transferase, enquanto que o icaA isolado induz pouca atividade. Entretanto, quando icaA e icaD são expressos conjuntamente, a atividade enzimática é aumentada, formando oligômeros de até 20 resíduos, sintetizando maior quantidade de PIA. Também se constatou que o gene icaC é necessário para a síntese de oligômeros de N- acetilglucosamina, por aumentar o tamanho destes para 130 resíduos. Ainda se conhece pouco da função do icaB, mas o que se sabe é que este participa como um catalizador da diacetilação da molécula de PIA. Assim, os genes icaA, icaD são essenciais para a produção do PIA, mas quando presentes o icaC e icaB auxiliam na síntese de longos oligômeros, estando envolvidos na biossíntese do PIA completo 24,25,26 . Figura 2: Organização estrutural do operon ica. 20 O desenvolvimento do biofilme ocorre em duas etapas (Figura 3), a primeira é a rápida adesão das bactérias à superfície, e a segunda é a acumulação, onde esta é mais prolongada e envolve a proliferação e adesão intracelular formando várias camadas de bactérias 27 . Figura 3: Etapas da formação biofilme. Fonte: http://www.biofilm.montana.edu/image. O biofilme completamente formado é constituído por várias camadas de bactéria embebidas em um material extracelular amorfo-slime (Figura 4) que consiste da complexa mistura de vários açúcares constituintes da parede celular, proteínas extracelulares e ácido teicóico 28 . Essa matriz extracelular pode atuar protegendo os microrganismos de agentes antimicrobianos, o que torna necessária a remoção do corpo estranho para que seja alcançada a cura do paciente 29,30 . http://www.biofilm.montana.edu/image 21 Figura 4: Fotomicrografia de varredura de biofilme em superfície de cateter. Fonte:http://alerafasamlu.blogspot.com.br. Assim com a formação do biofilme, ocorre a possibilidade dessas bactérias colonizarem a superfície de cateteres e terem acesso à corrente sanguínea do paciente podendo causar infecção, tornando importante a retirada do material para que ocorra a cura do quadro infeccioso. Outro fator relevante que torna difícil o tratamento é a alta taxa de resistência desenvolvida pelos estafilococos, fazendo com que ocorra o uso em grande escala de antimicrobianos mais caros ou tóxicos como a Vancomicina 31 . Segundo levantamento do SENTRY entre 1997 e 2001 em Hospitais brasileiros e da América Latina a resistência à meticilina em Staphylococcus spp. isolados de hemoculturas já se apresentava alta, com uma taxa de 76% a 80% de amostras resistentes 32 . http://alerafasamlu.blogspot.com.br/ 22 A parede celular das bactérias Gram-positivas tem como função a proteção contra lise osmótica e confere forma, rigidez e funciona como uma barreira em relação ao meio externo. O principal componente químico da parede celular dos estafilococos é formado pelo peptideoglicano, um polímero que consiste em longas cadeias de glicídeos com ligações cruzadas flexíveis de peptídeos que forma uma estrutura forte, mas elástica 33 . O processo da ligação cruzada é catalisada por enzimas transpeptidases, as proteínas ligadoras de penicilina- PBPs 34 . Os antibióticos β-lactâmicos produzem um efeito bactericida pela inibição das PBPs na síntese dos peptideoglicanos 35 . Esta inibição é o resultado de uma ligação covalente formando um complexo estável do antibiótico com uma ou mais PBPs 36 . Quando o peptideoglicano não pode ser formado, ocorre um distúrbio do mecanismo de controle das hidrolases (autolisinas), assim a bactéria entra em ciclo lítico e este processo leva à morte celular 35 . A resistência dos Staphylococcus spp. aos antibióticos β-lactâmicos deve-se principalmente a dois mecanismos distintos, porém ambos podem interagir. O primeiro mecanismo é a produção da enzima β-lactamase que hidrolisa o antibiótico, e o segundo está associado à alteração do sitio de ação dos β - lactâmicos pela produção de uma nova proteína ligadora de penicilina, a PBP2a (Figura 5), que tem baixa afinidade pelos antibióticos, ausente nos estafilococos sensíveis 37 . 23 Figura 5: Diagrama do mecanismo de resistência à oxacilina e presença da PBP2a que confere menor afinidade para beta-lactâmicos em geral. Fonte: Rev. chil. infectol. v.19 supl.3 Santiago, 2002. As β-lactamases são enzimas extracelulares, codificadas por plasmídeos, e baseado em testes sorológicos e cinéticos, podem ser divididas em 4 tipos (A a D), onde com exceção da D, são expressas em altos níveis somente na presença dos indutores, como a penicilina e seus análogos 36,38 . A PBP2a é codificada pelo gene mecA, contido no elemento cromossômico móvel denominado SCCmec (Staphyloccocal Chromossome Cassete mec), amplamente distribuído entre os Staphylococcus 39 . A PBP2a atua como uma transpeptidase retomando as funções da síntese de parede celular quando as outras PBPs estão inibidas, garantindo a integridade da célula bacteriana na presença de β-lactâmicos 31 . 24 Assim, devido aos fatores de patogenicidade descritos, a rápida detecção da bacteremia, seguida da rápida identificação das bactérias e determinação da sensibilidade a agentes antimicrobianos, pode ter uma grande importância diagnóstica e prognóstica 40 , pois o pronto início da terapia antimicrobiana apropriada é comprovadamente importante para evitar o agravamento e mortalidade do paciente 41 . Os laboratórios de rotina normalmente detectam microrganismos no sangue usando aparelhos automatizados. A introdução desses sistemas de leitura contínua representou um importante avanço na microbiologia clínica. Esses aparelhos, como exemplo o Bactec, possuem um dispositivo que detecta o crescimento do microrganismo nos frascos de hemocultivo (Figura 6) pela liberação de CO2, onde cada um contém uma mistura de sangue e caldo. Cada frasco é colocado no aparelho, incubado a 37º C, onde a intervalos de 10 minutos um feixe de luz emitido por diodos, sendo projetado através de um filtro de excitação para refletir o sensor sensível a CO2 no fundo de cada frasco. Assim se ocorrer acúmulo de CO2 no frasco, ocorrerá à alteração do sensor, que gerará um alerta 42 . Se positivo sua identificação ocorrerá levando mais 48 a 72 horas. Figura 6: Frascos de hemocultivos. Fonte: www.bd.com. 25 Muitos laboratórios não identificam as espécies de ECN, só os S. aureus e ECN pelos testes de catalase e coagulase, pois a identificação dos ECN consiste em uma série de testes bioquímicos 43 . Esses testes necessitam de longo período de incubação tornando-o de pouca aplicabilidade prática nos laboratórios de microbiologia clínica de rotina. Este método consiste em uma série de testes bioquímicos como a utilização de xilose, arabinose, sacarose, trealose, maltose, lactose, manitol, ribose, frutose, tioglicolato, urease, ornitina entre outros 9,43 . Mesmo com a automação da detecção de microrganismo no sangue, a identificação e a determinação da sensibilidade aos antimicrobianos ainda são demoradas, necessitando de métodos eficientes e mais rápidos, principalmente se tratando da urgência nos casos de bacteremia. A aplicação de técnicas de biologia molecular, entre elas a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a identificação de bactérias se mostrou uma técnica promissora devido a sua rapidez, acurácia e sensibilidade na obtenção dos resultados 44 . O PCR constitui uma técnica que visa à replicação do DNA com o objetivo final de amplificar uma porção específica de DNA, que contenha informações diagnósticas úteis 45 . As técnicas de PCR foram aprimoradas. Atualmente com a técnica de PCR multiplex consegue-se amplificar genes de múltiplos patógenos e mais de uma sequência de DNA específica para cada patógeno, utilizando-se múltiplos conjuntos de primers numa única reação 46 . Com a utilização de PCR multiplex essa detecção pode ocorrer mais rapidamente, mostrando-se uma técnica eficiente para a identificação dos microrganismos patogênicos em amostras clínicas, principalmente naquelas em que ocorre grande emergência para o início do tratamento. Os argumentos apresentados acima mostram a necessidade e a importância da utilização de técnicas de biologia molecular para auxiliar o diagnóstico de Staphycoccus spp. diretamente de hemoculturas, diminuindo o tempo da identificação, favorecendo rápido início de um tratamento específico, auxiliando o médico na conduta a ser tomada e consequentemente na diminuição do agravamento desses pacientes. 26 Assim, este trabalho objetivou avaliar a eficiência, acurácia e sensibilidade da técnica de PCR multiplex para a detecção de espécies de Staphylococcus spp. mais encontradas em hemoculturas, a presença do gene mecA de resistência a oxacilina e o operon ica responsável pela produção do biofilme nas amostras estudadas. 27 Objetivo 28 2. OBJETIVO 2.1 Objetivo Geral O presente trabalho tem como objetivo avaliar a eficiência, acurácia e sensibilidade da técnica de PCR multiplex para a detecção de espécies de Staphylococcus spp. mais encontradas em hemoculturas, da presença do gene mecA de resistência à oxacilina e do operon ica responsável pela produção do biofilme nas amostras estudadas. 2.2 Objetivos Específicos  Identificar S. aureus e as espécies de Estafilococos coagulase negativa (ECN) pela técnica de PCR multiplex direto dos frascos de hemoculturas;  Identificar as espécies de S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis e S. lugdunensis pela técnica de PCR multiplex direto dos frascos de hemoculturas;  Identificar S. aureus e as espécies de ECN pelo método convencional com testes bioquímicos;  Comparar a identificação de espécies de Staphylococcus spp. pelo método convencional com a detecção genotípica pela técnica de PCR multiplex;  Detectar o gene mecA nas espécies de Staphylococcus spp. pela técnica de PCR multiplex direto do frasco de hemocultivo.  Comparar o resultado do teste de Disco difusão e o resultado da detecção do gene mecA pela técnica de PCR multiplex;  Detectar os genes icaA, icaD, icaB, icaC e icaR do operon ica nas amostras de Staphylococcus spp. pela técnica de PCR multiplex direto do frasco de hemocultivo. 29 Material e Métodos 30 3. MATERIAL E MÉTODOS Foram estudadas 371 amostras de hemoculturas positivas para o genero Staphylococcus cedidas pelo no Laboratório de Microbiologia da Seção Técnica de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu, isoladas de maio de 2011 a maio de 2012. 3.1 Coleta das amostras As amostras incluídas no estudo foram obtidas no dia seguinte em que foram positivadas após incubação no aparelho Bactec 9120 (Figura 7) e após a confirmação pela coloração de Gram, de serem cocos Gram-positivos e positivos para o teste da catalase, comprovando que seriam prováveis amostras contendo Staphylococcus spp. Antes da coleta foi realizada a desinfecção dos frascos de hemocultura com álcool 70% e com o auxílio de uma seringa de 5 ml e uma agulha calibre 70X25 mm foram retirados 3 ml da amostra e colocados em 2 microtubos (1,5ml em cada tubo). Um dos microtubos foi utilizado para a semeadura em Ágar sangue, para posterior identificação fenotípica e o outro microtubo foi utilizado para a extração do DNA das bactérias para a realização do PCR multiplex. Todos os pacientes incluídos no estudo assinaram o Termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1). 31 Figura 7: Aparelho Bactec 9120 utilizado para a detecção de culturas positivas nos frascos de hemoculturas. 3.2 Identificação fenotípica de Staphylococcus aureus e Estafilococos coagulase negativa A identificação fenotípica foi realizada no Laboratório de Bacterioscopia do departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências-IB da UNESP de Botucatu. As amostras foram semeadas em Ágar sangue e incubadas a 37Cº por 24 horas (Figura 8). Figura 8: Placa de Ágar sangue com crescimento de colônias de Staphylococcus spp. 32 Após isolamento em Ágar sangue as bactérias foram submetidas à coloração de Gram para confirmar características morfológicas tintoriais, teste da catalase para a caracterização do gênero Staphylococcus e teste da coagulase para a diferenciação de S. aureus e ECN. Estes últimos foram identificados por provas bioquímicas simplificadas conforme proposto por Cunha 43 , com provas de utilização de açúcares: xilose, sacarose, trealose, maltose, manitol e crescimento em anaerobiose em tioglicolato de sódio (Figura 9). Para a identificação de algumas espécies de ECN foram realizadas provas adicionais, incluindo a produção de urease, descarboxilação da ornitina, redução do nitrato e teste de sensibilidade ao antimicrobiano Novobiocina. Após a identificação dessas amostras, os Staphylococcus spp. identificados foram congelados a - 20Cº e - 80Cº. Xilose Sacarose Trealose Maltose Manitol Tioglicolato Figura 9: Provas bioquímicas para identificação de espécies de ECN. 33 3.3 Extração do DNA diretamente dos frascos de hemocultura Os frascos de hemocultivo do sistema Bactec utilizados nesse estudo contém meio de cultura, anticoagulante polianetolesulfonato de sódio-SPS, substâncias que inibem a cascata do complemento do sistema imune do paciente, micropartículas que auxiliam na detecção da presença da bactéria pelo aparelho Bactec. Estes elementos podem comprometer o processo da extração do DNA bacteriano 47,48 principalmente na técnica de extração utilizada neste trabalho, no qual a amostra é capturada em uma coluna de sílica e os elementos interferentes não permitem que o DNA se desprenda para eluição. Muitos protocolos foram testados para a extração do DNA, onde o mais eficaz foi o descrito a seguir. Previamente à extração do DNA foi realizado um tratamento da amostra de sangue para a retirada de elementos presentes na hemocultura. A amostra de hemocultura foi centrifugada a 850g por 2 minutos 49 . O sobrenadante foi colocado em outro microtubo e novamente centrifugado a 11.000g por 1 minuto. O sobrenadante foi retirado cuidadosamente deixando somente no microtubo o pellet. Foram adicionados a esse pellet 500l de tampão de lisozima (1 M de EDTA, 0,1 ml de NaCl, 10 mM Tris pH 8,0 e 5% Triton X-100) e homogeneizado no Vortex. Foram adicionados 800l de álcool Benzílico (Sigma), homogeneizado no Vortex e o microtubo foi centrifugado a 7.000g por 5 minutos 50 . Após esta etapa formou-se duas fases no microtubo, a inferior que continha o álcool com as substâncias interferentes (inibidores) e na fase superior estavam presentes as bactérias (Figura 10). 34 Figura 10: Tratamento com álcool Benzílico. A- Fase superior com bactérias; B- Fase inferior com álcool Benzílico mais interferentes. Foram retirados 320µl do líquido da fase superior e colocados em outro microtubo, onde foram adicionados 10µl da enzima lisozima (10mg lisozima em 1 ml de Tris-HCl 10 mM), sendo então homogeneizado no Vortex e colocado para incubação à temperatura ambiente por 15 minutos, onde foi realizada uma homogeneização a cada 5 minutos. Após essa etapa foram adicionados 10µl de proteinase K e incubação por 15 minutos a 56Cº sendo homogeneizado a cada 5 minutos no Vortex. Após esse período o líquido (330µl) foi transferido para a coluna de sílica fornecido pelo Kit de extração Illustra (GE Healthcare) (Figura 11). Essa coluna foi colocada dentro de um tubo e centrifugado a 11.000g por 1 minuto. Após essa etapa adicionou-se 500µl de solução de lise à coluna e centrifugou-se a 11.000g por 1 minuto. Foram adicionados 500µl de solução de lavagem na coluna, sendo novamente centrifugada a 11.000g por 3 minutos. O tubo foi descartado e a coluna foi transferida para um microtubo. Dentro da coluna foram adicionados 200µl de solução de eluição, previamente A B 35 aquecida a 70Cº em banho Maria, e após incubação a temperatura ambiente por 1 minuto foi centrifugado a 11.000g por 1 minuto e o DNA obtido foi mantido em Freezer a -20C º. Figura 11: Kit Illustra (GE Healthcare) utilizado na extração do DNA diretamente do frasco de hemocultura. 3.4 Testes de susceptibilidade a antimicrobianos Os isolados foram submetidos aos testes de susceptibilidade in vitro, a partir da técnica de difusão em disco em placas de Ágar Mueller-Hinton, realizado pelo Laboratório de Microbiologia da Seção Técnica de Laboratórios Clínicos do Hospital das Clínicas da UNESP, Campus de Botucatu conforme critérios recomendados pelo Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI 51 . 36 3.5 Padronização do multiplex 1 para detecção do gênero Staphylococcus spp., S. aureus e do gene mecA Inicialmente à padronização do PCR, foi realizado um gradiente de anelamento para se estabelecer uma temperatura de anelamento adequada para todos os primers. Tabela 1: Primers utilizados na reação de PCR multiplex 1 para detecção do gênero Staphylococcus spp. e do gene mecA. A amplificação foi realizada no aparelho termociclador da marca Eppendorf. As condições de amplificação foram: 92ºC por 3 minutos, seguido de 30 ciclos da etapa de desnaturação do DNA a 92ºC por 1 minuto, etapa de anelamento a 56ºC por 1 minuto e etapa de extensão a 72ºC por 3 minutos. O volume final da reação foi de 35µl, sendo 10,2 µl água milli Q autoclavada, 3,5µl de desoxirribonucleotídeos trifosfatado-dNTP (Life Technologies), 0,8µl de Taq DNApolimerase (Biotools), 2,5µl de Buffer MgCl Free (Biotools), 2,5µl MgCl2 (Biotools), 0,14 µM de cada primer 16S, 0,86 µM de cada primer MRS, 0,35 µM de cada primer SAU, 0,57µM de cada primer COA e 3,5µl de DNA bacteriano. O produto das Gene Primer Fragmento Amplificado pb S. aureus 52 SAU 327- 5’ GGA CGA CAT TAG ACG AAT CA 3’ SAU 1645- 3’ CGG GCA CCT ATT TTC TAT CT 5’ 1250 16S 53 (RNAr) 16S1- 5’ CCTATAAGACTGGGATAACTTCGGG 3’ 16S2- 3’ CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCG 5’ 791 coa 54 COA1- 5’ GTA GAT TGG GCA ATT ACATTT TGG AGG 3’ COA2- 5’ CGC ATCAGC TTT GTT ATC CCA TGT A 3’ 117 mecA 55 MRS1- 5' AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC 3’ MRS2- 3' AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC 5’ 533 37 amplificações foi analisado por eletroforese (3,0% de gel agarose) a 70 V. Todas as reações de amplificação foram realizadas com controles: ATCC 33591 (S. aureus mecA positivo), ATCC 25923 (S. aureus mecA negativo), ATCC 12228 (S. epidermidis mecA negativo) e Controle negativo (água). O gel de eletroforese com o resultado da amplificação da padronização do PCR multiplex 1 está presente na Figura 12. Foi utilizado Ladder de 2.000 pb como marcador de corrida. Figura 12: Gel de eletroforese (agarose 3%) com o produto da padronização do PCR multiplex 1 para a detecção do gênero Staphylococcus spp., S. aureus e gene mecA. Coluna 1: Ladder de 2.000pb; Coluna 2: amostra de ECN mecA positiva (16S-791pb e MRS-533pb); Coluna 3: amostra negativa; Coluna 4 e 5: S. aureus mecA negativo (SAU-1250pb, 16S-791pb, COA- 117pb); Coluna 6: ECN mecA negativo (16S-791pb); Coluna 7: amostra negativa; Coluna 8: ECN mecA positiva (16S-791pb e MRS-533pb); Coluna 9: S. aureus mecA positivo (SAU- 1250pb, 16S-791pb, MRS-533pb e COA-117pb); Coluna 10: S. aureus mecA negativo (SAU- 1250pb, 16S-791pb, COA-117pb) e Coluna 11: ECN mecA negativo (16S-791pb). 1000 pb 800 pb 500 pb 100 pb 38 3.6 Teste de sensibilidade Para a detecção da sensibilidade do PCR multiplex 1 foi realizada a amplificação de várias diluições seriadas de uma amostra controle de S. aureus e ECN, iniciando a partir da diluição10 -1 (correspondente a 10 7 UFC/ml) a 10 -7 (10 UFC/ml) a partir do tubo da escala 0,5 de Mc Farland (1,5 x 10 8 UFC/ml). 3.7 Teste de especificidadade Para a detecção da especificidade do PCR multiplex 1 foi realizado PCR com amostras de outras espécies de microrganismos, diretamente da cultura isolada, e dos frascos de hemoculturas positivas com outras espécies de bactérias. As espécies analisadas foram: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus Grupo viridans, Streptococcus pneumoniae, Candida spp., Bacilos Gram-positivos (BGP), Pseudomonas auruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Salmonella spp., Morganella morganii e Proteus mirabilis. 3.8 Padronização do multiplex 2 para detecção do operon ica Inicialmente tentou-se colocar os 5 primers para a detecção do operon ica completo na mesma reação. Porém, a visualização ficou difícil devido à proximidade das bandas formadas pelos genes icaA e icaR, e outro problema encontrado foi o fato do primer do gene icaD não ser um bom competidor para dNTP (Figura 13). Assim, foram padronizadas duas reações multiplex, sendo uma para detecção dos genes icaA, icaB e icaC e outra reação para a detecção 39 dos genes icaD e icaR. Outra mudança realizada foi a substituição do primer do gene icaA utilizado para ECN por um específico para a espécie S. aureus. Figura 13: Gel de eletroforese (agarose 3%) com o produto da primeira padronização do multiplex 2 para detecção dos genes do operon ica. Coluna 1: Ladder de 2.000pb; Coluna 2: ECN operon ica completo (icaA-502pb, icaR-469pb, icaC-400pb, icaB302pb e icaD-198pb); Coluna 3 e 4: Controle negativo para o operon ica e Coluna 5: ECN operon ica completo (icaA-502pb, icaR-469pb, icaC-400pb, icaB302pb e icaD-198pb). 1 2 3 4 5 500 pb 400 pb 250 pb 150 pb 40 Tabela 2: Primers utilizados na reação de PCR multiplex 2 para a detecção do operon ica em S. aureus e ECN. Gene Primer Fragmento amplificado em pb icaA (ECN) 56 ICA A1- 5’CACGTGCTCTATGCTGGATG 3 ICA A2- 5’ CCGTTGGATATTGCCTCTGT 3’ 502 icaA (S. aureus) 57 ICA SA1- 5’ TGG CTG TAT TAA GCG AAG TC-3’ ICA SA2-5’ CCT CTG TCT GGG CTT GAC C 3’ 669 icaB 58 ICA B1- 5’ AAA GTC CCA TAA GCC TGT TT 3’ ICAB2- 5’ AAA GTC CCA TAA GCC TGT TT 3’ 302 icaC 58 ICA C1- 5’ TAA CTT TAG GCG CAT ATG TTT T 3’ ICA C2- 5’ TTC CAG TTA GGC TGG TAT TG 3’ 400 icaD 58 ICA D1- 5’ CCT CTG TCT GGG CTT GAC C 3 ICA D2- 5’ TAA TCC CGA ATT TTT GTG AA 3’ 198 icaR 58 ICA R1- 5’ TAA TCC CGA ATT TTT GTG AA 3’ ICA R2- 5’ AAC GCA ATA ACC TTA TTT TCC 3’ 469 As condições de amplificação foram: 92ºC por 3 minutos, seguindo de 30 ciclos da etapa de desnaturação do DNA a 92ºC por 1 minuto, etapa de anelamento a 56ºC por 1 minuto e etapa de extensão a 72ºC por 3 minutos. Reação 1 (icaA, icaB e icaC) para ECN: o volume final da reação foi de 35 µl sendo 13,9 µl água milli Q autoclavada, 2,0 µl de desoxirribonucleotídeos trifosfatados-dNTP (Life Technologies), 0,6 µl de Taq DNApolimerase (Biotools), 2,0 µl de Buffer MgCl Free (Biotools), 2,5 µl de MgCl2 (Biotools), 0,57 µM de cada primer icaA, 0,43 µM de cada primer icaB, 0,29 µM de cada primer icaC e 5,0 µl de DNA bacteriano. Reação 1 (icaA, icaB e icaC) para S. aureus: o volume final da reação foi de 35 µl sendo 6,9 µl água milli Q autoclavada, 2,0 µl de desoxirribonucleotídeos trifosfatados-dNTP (Life Technologies), 0,6 µl de Taq DNApolimerase (Biotools), 2,0 µl de Buffer MgCl Free (Biotools), 2,5 µl de MgCl2 (Biotools), 0,14 µM de cada primer icaA, 1,14 µM de cada primer icaB, 0,86 µM de cada primer icaC e 5,0 µl de DNA bacteriano. Reação 2 (icaD e icaR): o volume final da reação foi de 35 µl sendo 14,9 µl água milli Q autoclavada, 41 2,0 µl de desoxinucleotídeos trifosfatado-dNTP (Life Technologies), 0,6 µl de Taq DNApolimerase (Biotools), 2,0 µl de Buffer MgCl Free (Biotools), 2,5 µl de MgCl2 (Biotools), 0,29 µM de cada primer içaR, 0,86 µM de cada primer icaD e 5,0 µl de DNA bacteriano. O produto das amplificações foi analisado por eletroforese (3,0% de gel agarose) a 70 V. Todas as reações de amplificação foram realizadas com controles: amostra conhecida de S.epidermidis icaADBC positivo e Controle negativo (água). O gel de eletroforese com o resultado da amplificação da padronização do PCR multiplex 2 para o operon ica está presente na Figura 14 (ECN) e 15 (S. aureus). Foi utilizado Ladder de 500 pb para o gel do operon ica em ECN e de 2.000 pb para o gel da amplificação desses genes em S. aureus. 42 Figura 14: Gel de eletroforese (agarose 3%) do produto da reação do PCR multiplex 2 para detecção do operon ica em ECN. Coluna 1: Ladder de 500pb; Coluna 2: reação 2 (icaR-469pb e icaD-198pb); Coluna 3: reação 1 (icaA-502pb, icaC-400pb e icaB-302pb) e Coluna 4: Controle negativo para o operon ica. 1 2 3 4 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 43 Figura 15: Gel de eletroforese (agarose 3%) do produto da reação do multiplex 2 para detecção do operon ica em S. aureus. Coluna 1: Ladder de 2.000pb; Coluna 2: reação 1 (icaA-669pb, icaC-400pb e icaB-303pb); Coluna 3: reação 2 (icaR-469pb e icaD-198pb) e Coluna 4:Controle negativo para operon ica. 1 2 3 4 600 pb 400 pb 300 pb 200 pb 44 3.9 Padronização do multiplex 3 para identificação de espécies de ECN O multiplex 3 foi elaborado para identificar as espécies S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. warneri, S. capitis e S. lugdunensis. Tabela 3: Primers utilizados na reação de PCR multiplex 3 para detecção de espécies de ECN diretamente do frasco de hemocultura. Gene Primer Fragmento amplificado pb S. epidermidis 59 SE1-5’ATCAAAAAGTTGGCGAACCTTTTC A 3’ SE2-5’CAAAAGAGCGTGGAGAAAAGT ATCA 3’ 124 S. haemolyticus 15 SHa1- 5’GGT CGC TTA GTC GGA ACA AT 3’ SHa2- 3’CACGAGCAATCTCATCACCT 5’ 271 S. hominis 60 SHo1- 5’TACAGGGCCATTTAAAGACG 3’ SHo2- 3’GTTTCTGGTGTATCAACACC 5’ 177 S. warneri 60 SWa1- 5’CGTTTGTAGCAAAACAGGGC 3’ SWa2- 3’ GCAACGAGTAACCTTGCCAC 5’ 999 S. capitis 60 SCap1- 5’ ACTACGCCTATGATTATTGC3’ SCap2- - 3’GAGCTTCTTTACCATAGGG 5’ 525 S. lugdunensis 60 SLu1- 5’TCCAATGATGGTAACGAGGC 3’ SLu2- - 3’ TTTTGCGCCTCGTTTTGTGC 5’ 695 As condições de amplificação foram: 92ºC por 3 minutos, seguido de 30 ciclos da etapa de desnaturação a 92ºC por 1 minuto, etapa de anelamento a 56ºC por 1 minuto e etapa de extensão a 72ºC por 3 minutos. O volume final da reação foi de 45 µl sendo 6,5 µl água milli Q autoclavada, 2,0 µl de desoxirribonucleotídeos trifosfatados-dNTP (Life Technologies), 0,5 µl de Taq DNApolimerase (Biotools), 5,0 µl de Buffer MgCl Free (Biotools), 2,0 µl de MgCl2 (Biotools), 0,89 µM de cada primer de cada espécie de ECN (SE, SHo, SHa, SCap, SLu e SWa) e 5,0 µl de DNA bacteriano. O produto das amplificações foi analisado por eletroforese 45 (2,0% de gel agarose) a 110V. Todas as reações de amplificação foram realizadas com controles: ATCC 12228 (S. epidermidis), ATCC 29970 (S. haemolyticus), ATCC 00243 (S. warneri), ATCC 700237 (S. hominis), ATCC 700328 (S. lugdunensis), ATCC 49325 (S. capitis) e Controle negativo (água). O gel de eletroforese com o resultado da amplificação da padronização do PCR multiplex 3 para identificação das espécies de ECN está presente na Figura 16. Foi utilizado Ladder de 2.000 pb. Figura 16: Gel de eletroforese (agarose 2%) do produto da reação do PCR multiplex 3 para a detecção de espécies de ECN. Coluna 1: Ladder de 2.000pb; Coluna 2: S. epidermidis (SE- 124pb); Coluna 3: S. hominis (SHo-177pb); Coluna 4: S. haemolyticus (SHa-271pb); Coluna 5: S. capitis (SCap-525pb); Coluna 6: S. lugdunensis (SLu-695pb); Coluna 7: S. warneri (SWa- 999pb) e Coluna 8: Controle negativo. 1 2 3 4 5 6 7 8 1000 pb 800 pb 600 pb 300 pb 200 pb 100 pb 46 3.10 Internal Transcribed Spacer PCR (ITS-PCR) para confirmação do resultado da identificação genotípica Após a realização do PCR multiplex 3 para a identificação das espécies de ECN, foi realizado o ITS-PCR (Internal Transcribed Spacer PCR) 61 para a confirmação dos resultados. As condições de amplificação foram: etapa de desnaturação inicial a 94ºC por 4 minutos, seguido de 25 ciclos com 94ºC por 1 minuto, etapa de anelamento a 55ºC por 2 minutos e 55ºC por 7 minutos, etapa de extensão a 72ºC por 2 minutos e 72ºC por 7 minutos. O volume final da reação foi de 25l, sendo 15,8l água milli Q autoclavada, 0,5l de desoxinucleotídeos trifosfatado-dNTP (Life Technologies), 0,2l de Taq DNApolimerase (Biotools), 2,5l de Buffer MgCl Free (Biotools), 1,0l de MgCl2 (Biotools), 1,0 l de cada primer G1(5’- GAAGTCGTAACAAGG-3’) e L1(5’-CAAGGCATCCACCGT-3’) e 3,0l de DNA bacteriano. O produto das amplificações foi analisado por eletroforese (3,6% de gel agarose) a 80V. O gel ficou secando por 2 horas e a corrida por 5 horas (Couto et al., 2001). Todas as reações de amplificação foram realizadas com controles: ATCC 12228 (S. epidermidis), ATCC 29970 (S. haemolyticus), ATCC 00243 (S. warneri), ATCC 700237 (S. hominis), ATCC 700328 (S. lugdunensis), ATCC 49325 (S. capitis) e Controle negativo (água). O gel de eletroforese com o resultado da amplificação do ITS-PCR está presente na figura 17. Foi utilizado Ladder de 2.000 pb. 47 Figura 17: Gel de eletroforese (agarose 3,6%) do produto da reação do ITS-PCR para a confirmação da identificação das espécies de ECN pelo PCR multiplex 3. Coluna 1: Ladder de 2.000 pb; Coluna 2: Controle negativo; Coluna 3: ATCC 12228 (S. epidermidis); Coluna 4: ATCC 700237 (S. hominis); Coluna 5: ATCC 29970 (S. haemolyticus), Coluna 6: ATCC 49325 (S. capitis); Coluna 7: ATCC 700328 (S. lugdunensis) e Coluna 8: ATCC 00243 (S. warneri). 1 2 3 4 5 6 7 8 SE SHo SHa SCap SLu SWa 48 3.11 Análise estatística Para avaliar a concordância dos métodos utilizados para identificação de Staphylococcus spp. foi utilizado o teste de análise de concordância – Kappa 62 , conforme Tabela 4. Todos os testes foram feitos considerando o nível de significância de 5%. Tabela 4:Valores para o teste de concordância Kappa Valores de Kappa Interpretação <0 Não concordância 0-0.19 Pouca concordância 0.20-0.39 Satisfatória concordância 0.40-0.59 Moderada concordância 0.60-0.79 Boa concordância 0.80-1.00 Concordância quase perfeita 49 Resultados 50 4. RESULTADOS 4.1 Amostragem Foram estudadas 371 amostras de hemoculturas positivas para o gênero Staphylococcus no período de maio de 2011 à maio de 2012 e todas foram provenientes de pacientes internados nas diferentes enfermarias do Hospital das Clínicas da FMB, UNESP (Tabela 5). Tabela 5: Distribuição das amostras isoladas de pacientes por enfermarias do Hospital das Clínicas da FMB, UNESP. Complexos de enfermarias Nº de amostras Enfermarias Enfermarias cirúgicas N=22 Cirurgia Cirurgia cardíaca Cirurgia Torácica Gastrocirurgia Ortopedia Urologia Clínica Médica N=114 Dermatologia Gastroclínica Clínica Médica Centro de terapia Intensiva Cardiologia, Cardioclínica Hematologia Pneumologia Pronto Socorro N=68 Pronto Socorro Pronto Socorro-Unidade de Tratamento Intensivo Enfermarias Pediátricas N=76 Berçário Pediatria Unidade de Tratamento Intensivo Pediatria Unidades de Tratamento Intensivo Neonatal Ginecologia e Obstetrícia N=3 Ginecologia Obstetrícia Unidade de Tratamento Intensivo N=55 Unidade de Tratamento Intensivo Unidade de Tratamento Intensivo- Central Unidade de Tratamento Intensivo- Coronariano Outras Enfermarias N=33 Quimioterapia Oncologia Moléstias Infecciosas e Parasitárias Neurologia Diálise 51 4.2 Identificação Fenotípica A identificação por métodos bioquímicos das 371 amostras revelou 85 (23,0%) amostras de S. aureus, 286 (77,0%) amostras de ECN (Figura 18). Dentre os ECN identificados foram encontrados 152 (53,1%) S. epidermidis, 36 (12,6%) S. haemolyticus, 36 (12,6%) S. hominis, 23 (8,0%) S. capitis, 18 (6,3%) S. warneri, 7 (2,4%) S. caprae, 5 S. simulans, duas S. lugdunensis, duas S. cohnii, uma S. saprophyticus, uma S. schleiferi, uma S. xylosus e concomitantemente uma S. haemolyticus e S. hominis, e uma S. haemolyticus e S. epidermidis (Figura 19). 85 23% 286 77% S. aureus ECN Figura 18: Identificação fenotípica de S. aureus e Estafilococos coagulase-negativa (ECN). 52 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% S. e p id er m id is (1 5 2 ) S. h a em o ly ti cu s( 3 6 ) S. h o m in is (3 6 ) S. c a p it is (2 3 ) S. w a rn er i( 1 8 ) S. ca p ra e( 7 ) S. s im u la n s( 5 ) S. c o h n ii( 2 ) S. lu g d u n en si s( 2 ) S. sa p ro p h yt ic u s( 1 ) S. xy lo su s( 1 ) S. s ch le if er i( 1 ) S. h a em o ly ti cu s + S. … S. h a em o ly ti cu s + S. … % d e a m o st ra s d e E C N Figura 19: Identificação fenotípica de ECN. 4.3 Detecção de suscetibilidade à oxacilina pelo teste de Disco difusão Pelo teste de Disco difusão 43 (50,6%) das amostras de S. aureus se mostraram resistentes. Das 286 amostras de ECN, 236 (82,5%) foram resistentes (Figura 20), com 132 (86,8%) das amostras de S. epidermidis resistentes, 33 (91,6%) S. haemolyticus, 30 (83,3%) S. hominis, 15 (65,2%) S. capitis, 13 (72,2%) S. warneri, 4 S. caprae, 3 S. simulans, uma S. cohnii, uma S. lugdunensis, uma S. saprophyticus e uma S. xylosus. 53 Figura 20: Resistência à oxacilina em amostras de Staphylococcus spp. pelo método de Disco difusão. 4.4 Multiplex 1 O PCR multiplex 1 foi padronizado para identificar genotipicamente o gênero Staphylococcus (gene do RNAr 16S), diferenciar Estafilococos coagulase positiva ou negativa (gene coa), identificar S. aureus (gene específico para S. aureus) e a detecção de resistência à oxacilina (gene mecA) diretamente do frasco de hemocultura (Figura 21). 54 Figura 21: Gel de eletroforese (agarose 3%) do produto da amplificação do multiplex 1 em amostras de hemocultura para a detecção do gênero Staphylococcus e do gene mecA. Coluna 1: Ladder de 2.000pb; Coluna 2: ATCC 33591 (S. aureus mecA negativo); Coluna 3: ATCC 25923 (S. aureus mecA negativo); Coluna 4: ATCC 12228 (S. epidermidis mecA negativo); Coluna 5: Controle negativo; Coluna 6 e 7: amostra de S. aureus mecA positivo; Coluna 8 e 9: amostra de ECN mecA negativo e Coluna 10: amostra de S. aureus mecA negativo. Foi realizada a amplificação das 371 amostras incluídas no trabalho. Nas 85 amostras com S. aureus identificadas fenotipicamente houve 100% de concordância com o resultado do PCR multiplex 1, com amplificação dos genes RNAr16S, S. aureus e coa. Nas 286 amostras de ECN ocorreu 100% de concordância onde ocorreu a amplificação apenas do fragmento do gene RNAr16S. Das 85 amostras de S. aureus ocorreu amplificação do fragmento do gene mecA em 43 (50,6%), com 42 resistentes pelo teste de Disco difusão e 1 amostra sensível. Das 42 (49,4%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1000 pb 800 pb 500 pb 100 pb 55 negativas na amplificação do gene mecA, 41 se mostraram sensíveis pelo método de Disco difusão e 1 amostra se mostrou resistente. Das 286 amostras de ECN, o gene mecA foi amplificado em 225 (78,7%) e destes 218 foram resistentes pelo teste do Disco difusão e 7 sensíveis. Das 61 (21,3%) amostras de ECN negativas para o gene mecA, 43 foram consideradas sensíveis pelo teste do Disco difusão e 18 resistentes. A concordância Kappa entre os resultados obtidos na detecção de resistência por PCR e Disco difusão foi de 92%. Nas amostras que não apresentou gene mecA, mas que se mostraram resistentes no teste do Disco difusão foi realizado o PCR simplex para o gene mecA, teste com o disco de Nitrocefim para a detecção da hiperprodução de β-lactamase e o teste com o disco de Ácido clavulânico + Amoxacilina para a confirmação da resistência (Tabela 6). Tabela 6: Relação entre os resultados da detecção do gene mecA e o teste de Disco difusão com oxacilina (1 g) e cefoxitina (30g), e os testes complementares para confirmação da resistência a oxacilina. Espécie Disco difusão* mecA positivo mecA negativo Nitrocefin positivo Ácido clavulânico + Amoxacilina S. aureus 43 R 42 1 1 1 S 42 S 1 41 ECN 236 R 218 18 18 12 S 50 S 7 43 6 R * Teste de Disco difusão com oxacilina (1 g) e cefoxitina (30g). R: Resistente; S: Sensível 56 4.5 Teste de sensibilidade do PCR multiplex 1 No teste de sensibilidade ocorreu amplificação dos fragmentos até a diluição 10 -5 (10 3 UFC/ml) para ECN e para S. aureus até a diluição 10 -2 (10 6 UFC/ml) como mostrado na Figura 22. Figura 22: Gel de eletroforese da amplificação do teste de sensibilidade para ECN e S. aureus do PCR multiplex 1. Linhas 1: Marcador de peso molecular: 2.000 bp; 2:ATCC S. aureus mecA positivo; 3: ATCC S. epidermidis; 4: ECN (10 8 UFC/ml) diluído a 10 -7 (10 UFC/ml); 5: 10 -6 (10 2 UFC/ml); 6: 10 -5 (10 3 UFC/ml); 7: 10 -4 (10 4 UFC/ml); 8: 10 -3 (10 5 UFC/ml); 9: 10 -2 (10 6 UFC/ml); 10: 10 -1 (10 7 UFC/ml),11: S. aureus diluido 10 -7 (10 UFC/ml); 12: 10 -6 (10 2 UFC/ml); 13: 10 -5 (10 3 UFC/ml); 14: 10 -4 (10 4 UFC/ml); 15: 10 -3 (10 5 UFC/ml); 16: 10 -2 (10 6 UFC/ml); 17: 10 -1 (10 7 UFC/ml), 18: Marcador de peso molecular 2.000 bp. ECN S. aureus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 57 4.6 Teste de especificidade do PCR multiplex 1 No teste de especificidade realizada com amostras de outras espécies não ocorreu a amplificação de nenhum dos fragmentos dos genes pesquisados no PCR multiplex em amostras de outras espécies (Figura 23). Figura 23: Gel de eletroforese da amplificação do teste de especificidade do PCR multiplex. Coluna 1:Ladder de 2.000 pb; 2: ATCC S. aureus mecA positivo; 3: ATCC S. aureus mecA negativo;4: ATCC ECN; 5: Salmonella spp.; 6: Proteus mirabilis;7: Morganella morganii; 8: Klebsiella pneumoniae; 9: Pseudomonas aeruginosa; 10: Acinetobacter baumannii; 11: Enterobacter cloacae; 12: Enterobacter aerogenes; 13: E. coli; 14: E. faecalis; 15: E. faecium; 16: S. Grupo viridans; 17: S. pneumoniae; 18: Candida spp. e 19: BGP. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 58 4.7 Multiplex 2 O PCR multiplex 2 foi padronizado para detectar os 5 genes presentes no operon ica: icaA, icaB e icaC na reação 1 e icaD e icaR na reação 2, em espécies de Staphylococcus spp. diretamente dos frascos de hemoculturas. Os resultados estão descritos na Tabela 7. Figura 24: Gel de eletroforese (agarose 3%) do produto da amplificação do multiplex 2 para detecção do operon ica em amostras de ECN. Coluna 1: Ladder de 500pb; Coluna 2: amostra de ECN positiva para icaR e icaD; Coluna 3: amostra de ECN positiva para icaA, icaC e icaB; Coluna 4 e 5: amostra de ECN negativa para o operon ica; Coluna 6: amostra de ECN positiva para icaA, icaC e icaB; Coluna 7: amostra de ECN positiva para icaR e icaD; Coluna 8: amostra de ECN positiva para icaA, icaC e icaB e Coluna 9: amostra de ECN positiva para icaR e icaD. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 59 Figura 25: Gel de eletroforese (agarose 3%) do produto da amplificação do Multiplex 2 para detecção do operon ica para amostras de S. aureus. Coluna 1: Ladder de 2.000pb; Coluna 2: amostra de S. aureus positivo para icaD e negativo para o icaR; Coluna 3: amostra de S. aureus positivo para o icaA e negativo para o icaC e icaB; Coluna 4: amostra de S. aureus positivo para icaD e negativo para o icaR; Coluna 5: amostra de S. aureus positivo para o icaA e negativo para o icaC e icaB; Coluna 6: amostra de S. aureus positivo para icaD e negativo para o icaR e Coluna 7: amostra de S. aureus positivo para o icaA e negativo para o icaC e icaB. 1 2 3 4 5 6 7 600 pb 200 pb 60 Tabela 7: Distribuição dos genes do operon ica encontrados nas amostras de ECN e S.aureus pelo multiplex 2. Microrganismo Nº de isolados icaA icaB icaC icaD icaR icaA + icaD Operon completo Negativo S. aureus 85 83 26 29 70 3 70 3 2 S. epidermidis 152 84 84 87 98 85 78 75 47 S. haemolyticus 36 5 2 7 20 9 4 2 12 S. hominis 36 6 2 5 13 5 3 2 22 S. capitis 23 16 4 6 13 10 9 4 3 S. warneri 18 7 3 7 12 6 5 2 4 S. lugdunensis 2 0 0 0 0 0 0 0 2 S. simulans 5 1 1 1 3 1 1 1 2 S. caprae 7 3 1 1 5 3 3 1 2 S. xylosus 1 0 0 0 0 0 0 0 1 S. saprophyticus 1 0 0 0 0 0 0 0 1 S. cohnii 2 1 0 0 0 0 0 1 0 S. schleiferi 1 0 0 0 1 0 0 0 0 4.8 Multiplex 3 O PCR multiplex 3 foi padronizado para identificar diretamente do frasco de hemoculturas as espécies: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. warneri, S. capitis e S. lugdunensis. 61 Figura 26: gel de eletroforese da amplificação do multiplex 3 para a identificação de espécies de ECN diretamente dos frasco de hemoculturas. Coluna 1: Ladder de 2.000pb; Coluna 2: S. epidermidis (SE-124pb); Coluna 3: S. hominis (SHo-177pb); Coluna 4: S. haemolyticus (SHa-271pb); Coluna 5: S. capitis (SCap-525pb); Coluna 6: S. lugdunensis (SLu-695pb); Coluna 7: S. warneri (SWa-999pb); Coluna 8: Controle negativo; Coluna 9 e 10: amostra de S. epidermidis; Coluna 11: amostra de S. lugdunensis; Coluna 12: amostra concomitantemente de S. hominis e S. haemolyticus; Coluna 13, 14 e 15: amostra de S. epidermidis. Das 371 amostras de hemoculturas positivas para o gênero Staphylococcus coletadas durante o trabalho, 286 foram identificadas como ECN pelo multiplex 1. Posteriormente, foi realizado o PCR multiplex 3 para a identificação genotípica dessas espécies. Como mostra a tabela 8, a comparação dos resultados obtidos na identificação fenotípica e genotípica de espécies das 286 de ECN mostrou concordância de 93,0% (266 amostras). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1000 pb 800 pb 600 pb 300 pb 200 pb 100 pb 62 Tabela 8: Discordância entre identificação fenotípica e genotípica no PCR multiplex 3. 4.9 Identificação Genotípica ITS-PCR A identificação genotípica realizada pelo método de ITS-PCR nas amostras em que ocorreu discordância na identificação pelo método convencional e pelo genotípico, concordou em 100% com a identificação do PCR multiplex 3 (Figura 27). ID FENOTIPICA Nº DE AMOSTRAS ID GENOTÍPICA DISCORDÂNCIA NO TESTE CONVENCIONAL ITS PCR S. epidermidis 1 S.capitis Manitol- S.capitis S. capitis 2 S.epidermidis Manitol + S.epidermidis S. warneri 10 S. epidermidis Trealose + S. epidermidis S. warneri 7 S. haemolyticus Uréia + S. haemolyticus 63 Figura 27: Gel de eletroforese do ITS-PCR para a identificação das amostras em que ocorreu discrepância com o resultado da identificação fenotípica. Coluna 1: Ladder de 2.000 pb; Coluna 2: Controle negativo; Coluna 3: ATCC 12228 (S. epidermidis); Coluna 4: ATCC 700237 (S. hominis); Coluna 5: ATCC 29970 (S. haemolyticus), Coluna 6: ATCC 49325 (S. capitis); Coluna 7: ATCC 700328 (S. lugdunensis); Coluna 8: ATCC 00243 (S. warneri) e Coluna 9 e 10: amostras que foram tipadas. 4.10 Identificação Genotípica Dentre os 286 ECN identificados pelo PCR multiplex, foram encontrados 162 (56,6%) S. epidermidis, 44 (15,4%) S. haemolyticus, 36 (12,6%) S. hominis, 22 (7,7%) S. capitis, um S. warneri, um S. lugdunensis, concomitantemente um S. epidermidis e S. lugdunensis, um S. haemolyticus e S. hominis e 18 amostras não identificadas pelo PCR multiplex (Figura 28). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 SE SHo SHa SCap SLu SWa 64 162 44 36 22 1 1 1 1 18 S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. capitis S. epidermidis e S. lugdunensis S. haemolyticus e S. hominis S. warneri S. lugdunensis 56,6%15,4% 12,6% 7,7% 6,3% 0,35% Figura 28: Identificação genotípica do multiplex 3 para identificação de espécies de ECN diretamente de hemoculturas. 4.11 Custos A Tabela 9 apresenta a comparação dos custos para a identificação dos microrganismos isolados das hemoculturas positivas no Laboratório de Microbiologia da Seção Técnica de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, que utiliza o sistema automatizado Vitek 2 após o isolamento dos microrganismos em Ágar MacConkey e Ágar sangue com a identificação genotípica realizada diretamente dos frascos de hemocultura (extração de DNA, multiplex 1 e multiplex 3) padronizada nesse estudo. 65 Tabela 9: Comparação do custos da identificação realizada pelo aparelho Vitek e pela técnica de PCR multiplex. Método Custo Identificação Vitek Total: $ 16,12 por amostra Ágar Sangue: $ 1,19 MacConkey: $ 0,49 Cartela Vitek: $ 14,44 Identificação PCR multiplex Total: $ 12,64 por amostra Extração: $ 6,80 PCR Multiplex 1: $ 2,90 Gel de eletroforese 1: $0,70 PCR Multiplex 3: $ 1,64 Gel de eletroforese 2: $ 0,60 66 Discussão 67 5. DISCUSSÃO Das 371 hemoculturas positivas para Staphylococcus spp. coletadas durante o período do trabalho, 77% foram positivas fenotipicamente para ECN. Por muito tempo os ECN foram apenas considerados como colonizadores da microbiota humana. Atualmente são reconhecidos como patógenos com potencial para causarem infecções hospitalares, particularmente em pacientes imunocomprometidos e com o uso de dispositivos médicos 11 . Os dados deste estudo estão de acordo os encontrados em outros trabalhos 1,63,64 que também relataram os ECN como os principais responsáveis por infecções da corrente sanguínea. Outro fator relevante encontrado neste estudo foi a resistência à oxacilina, com 82,5% entre ECN e 50,6% entre S. aureus. Na década de 50 quando o uso da penicilina foi introduzido, mais de 90% dos Staphylococcus spp. eram sensíveis a essa droga 65 , e em menos de uma década, 80 a 90% dos isolados já se apresentavam resistentes. Estudo realizado pela ANVISA (Agência de Vigilância Sanitária) 66 em 75 hospitais brasileiros no período de julho de 2006 a junho de 2008 mostrou que além de Staphylococcus spp. serem os microrganismos mais isolados de infecções da corrente sanguínea, apenas 39% dos S. aureus eram sensíveis à oxacilina. De acordo com trabalhos realizados com pacientes do Hospital Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu 67 , 45,1 % dos isolados de S. aureus e 72,5% dos ECN foram resistentes a esta droga. Outros estudos mostram a alta taxa de isolados resistentes à oxacilina 31,68,69 . Devido a esse aumento de isolados resistentes à oxacilina, a terapia apropriada está restrita ao uso de Glicopeptídeos e novas drogas sintéticas como a Linezolida 70 . Estas além de serem mais caras e tóxicas, estão selecionando cepas resistentes, onde em alguns países já existem relatos de Staphylococcus spp. com resistência à Vancomicina 71,72 , limitando assim cada vez mais a opção terapêutica. 68 Assim quanto mais rápida for a liberação do resultado da cultura e do teste de suscetibilidade aos antimicrobianos, o médico poderá adequar o tratamento, diminuindo os riscos e os danos causados ao organismo do paciente. Neste trabalho foi padronizado um PCR multiplex para ser utilizado diretamente da hemocultura para a rápida identificação de Staphylococcus spp., e da resistência à oxacilina. A utilização do PCR multiplex permitiu o diagnóstico em menos de 10 horas, pelo fato desta ter sido realizado diretamente da hemocultura, não necessitando de semicultivos. Em 1994, Greisen et al. 73 elaboraram um dos primeiros PCR para a identificação de bactérias em hemocultivos, porém este trabalho utilizou o gene rRNA 16S de diversas eubactérias, não sendo específico para a identificação de S. aureus e ECN. Salisbury et al. 74 , elaboraram um PCR multiplex onde foi utilizado rRNA 16S encontrado em S. aureus, porém este fragmento era limitado a um número de ECN e em seus experimentos não foram incluídas outras espécies de bactérias para testar a especificidade do método. Neste estudo foi utilizado o primer RNAr16S especifico para o gênero Staphylococcus spp., mostrando 100% de concordância com a identificação fenotípica e no teste realizado com diferentes gêneros de bactérias para analisar a especificidade, não amplificando outros gêneros de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas ou levedura, revelando ótima especificidade. Em nosso trabalho, elaboramos PCR multiplex capaz de detectar amplamente as espécies de Staphylococcus spp. diretamente de hemoculturas, utilizando uma técnica de extração que se mostrou eficiente e capaz de eliminar os interferentes presentes no sangue, o primer para detecção do gene rRNA 16S específico para o gênero Staphylococcus, a pesquisa do gene coa que diferencia o grupo dos estafilococos coagulase positiva e negativa e ainda o primer SAU específico para S. aureus, capaz de diferenciar a espécie S. aureus mais importante encontrada em hemoculturas, de outros estafilococos coagulase positiva. A pesquisa do gene coa também presente no multiplex 1, detectou como estafilococos coagulase positiva somente a espécie S. aureus, porém pode ocorrer o aparecimento de outras espécies de 69 coagulase positiva. Assim, com a utilização do PCR padronizado nesse trabalho, com o primer para a detecção do gene coa concomitante com o primer SAU, específico de S. aureus é possível estabelecer se a amostra é um S. aureus ou não. Schimitz et al. 75 padronizaram um PCR multiplex com o uso de rRNA 16S específico para o gênero Staphylococcus, além de incluir o gene coa e o gene mecA, porém com esse método não é possível diferenciar S. aureus de outras espécies positivas para o gene coa. Além da detecção de espécies de Staphylococcus spp., foi utilizada a pesquisa do gene mecA para a detecção da resistência à oxacilina, podendo assim direcionar o tratamento do paciente já no momento da identificação. Pereira e colaboradores 44 elaboraram em 2010 um PCR multiplex que identificava, diretamente de hemoculturas três espécies de Staphylococcus spp., S. aureus, S. epidermidis e S. haemolyticus e o gene mecA, porém sua identificação ficava restrita a essas espécies, excluindo outras que possam ser encontradas em hemoculturas. Com o mutilplex 1 padronizado nesse estudo todas as espécies de estafilococos isoladas de bacteremias são detectadas. O PCR multiplex foi testado em 371 amostras clínicas, 13 amostras de hemoculturas com a presença de outras espécies de bactérias e DNA bacteriano de outras espécies diretamente da cultura bacteriana, mostrando ótima sensibilidade e especificidade. Mason et al. 53 elaboraram um PCR multiplex utilizando primers para a pesquisa dos genes rRNA 16S, gene coa e o gene clfA, detectando o gênero Staphylococcus e a espécie S. aureus. Porém, um dos problemas citados pelos autores foi a utilização de um pequeno número de amostras, podendo assim ter falhado na detecção de qualquer problema. A única discrepância do PCR multiplex 1 padronizado nesse estudo foi quanto a detecção do gene mecA e da suscetibilidade à oxacilina em testes fenotípicos, sendo que em 19 amostras não foi detectado o gene mecA e estas amostras se mostraram resistentes no teste de suscetibilidade à oxacilina (1 amostra de S. aureus e 18 de ECN). Nessas amostras foi realizada 70 a detecção do gene mecA por PCR simplex, ocorrendo confirmação dos resultados do PCR multiplex. Outros estudos também relataram esta discrepância 53,75,76,77,78 , que pode estar relacionado com outras formas de resistência, como a hiperprodução de beta-lactamase ou modificação de outra PBP. Em adição, 8 amostras foram positivas para o gene mecA e se mostraram sensíveis pelo teste fenotípico (1 amostra de S.aureus e 7 de ECN), mostrando a importância da técnica genotípica na detecção de resistência à oxacilina, mas não descartando a importância de outras técnicas fenotípicas para a implantação de um tratamento mais específico e eficaz. O PCR multiplex se mostrou sensível, específico, rápido e com uma boa concordância com os resultados fenotípicos, podendo ser utilizado para auxiliar em laboratórios clínicos para uma identificação rápida, iniciando um tratamento mais especifico e eficaz, diminuindo assim a probabilidade de mortalidade e morbidade dos pacientes, além de contribuir para a diminuição do uso indevido de outras classes de antimicrobianos, que além de serem mais caros e tóxicos, contribuem para um aumento no aparecimento de resistência por essas bactérias. Além da alta taxa de resistência a antibióticos, outro fator que pode dificultar o tratamento e a recuperação do paciente está associado a capacidade dos Staphylococcus spp. em produzir biofilme. O segundo multiplex padronizado em nosso trabalho objetivou a detecção do operon ica em amostras de ECN e de S. aureus diretamente dos frascos de hemocultura. Hernández e colaboradores 79 descrevem a produção do biofilme como sendo um importante fator de virulência, pois promove a bactéria uma camada protetora contra o sistema imune e aos antibióticos, podendo estar relacionado inclusive com a sua resistência a esses, assim a rápida detecção da possível capacidade de produzir biofilme é de suma importância para a recuperação do paciente. 71 Para as 286 amostras de ECN foram realizadas as reações 1 e 2 para a detecção dos genes presentes no operon ica, em 96 (33,5%) amostras não ocorreu a amplificação de nenhum gene, enquanto que em 88 (30,7%) houve a amplificação do operon completo e 98 (34,2%) amostras apresentaram alguns dos genes do operon, e concomitantemente o gene icaA e icaD. Das 85 amostras de S. aureus, somente 3 (3,5%) apresentaram o operon completo, 70 (82,3%) revelaram a presença concomitante dos genes icaA e icaD e duas (2,3%) amostras não apresentaramu a amplificação de nenhum gene ica. Dentre os ECN a espécie que mais apresentou os genes do operon ica foi S. epidermidis, com 49,3 % positivos para o operon completo e em 51,3% ocorreu a amplificação concomitante dos genes icaA e icaD. Resultados semelhantes foram encontrados no trabalho elaborado por Arciola e colaboradores 58 com multiplex para a detecção do operon ica em amostras de S. epidermidis, porém não diretamente de amostras clínicas, e sim da cultura pura da bactéria. S. epidermidis foi relatado como a primeira espécie a produzir biofilme, porém já se sabe que essa capacidade também é encontrada em S. aureus e em outros ECN 80 . Nas outras espécies de ECN também ocorreu a amplificação de genes do operon, exceto nas 2 amostras de S. lugdunensis, uma de S. saprophyticus e uma de S. xylosus. Nas amostras de S. aureus 82,3% foram positivos para os genes icaA e icaD, resultados similares aos relatados por outros trabalhos 81,82 , porém superiores aos resultados encontrados por Arciola et al. 83 . Esse resultado é explicado devido ao fato de que o primer utilizado por Arciola et al. 83 ter sido desenhado em cima da sequência do operon icaADBC de S. epidermidis, e o icaA e o icaD deste apresentar 72 e 76% de similaridade com os respectivos genes do S. aureus 80 . 72 Com a elaboração do multiplex para a detecção do operon ica diretamente do frasco de hemocultura, diminuímos o tempo necessário para a detecção de genes contidos no operon. O uso de dispositivos e próteses se tornou uma importante porta de entrada para os Staphylococcus spp. devido a sua capacidade de colonizar esses dispositivos 84 , assim com a informação da presença desses genes o médico poderá direcionar uma conduta mais específica quanto ao procedimento a ser tomado. Porém não realizamos um teste fenotípico para a detecção da produção de biofilme. O gene está presente, mas isso não pode afirmar que este está sendo expresso, não implicando realmente que está ocorrendo a produção do biofilme. Porém muitos trabalhos relatam a importância do operon ica, principalmente da presença dos genes icaA e icaD na formação do biofilme 85,86 , onde a relação da taxa de detecção de presença dos genes e da produção de biofilme são altas. Outro fato que reforça a importância de um PCR multiplex para a rápida detecção dos genes ica, é a correlação entre a produção de biofilme e resistência a antibióticos, sendo que a formação de biofilme pode implicar em falha terapêutica, já que em biofilme os microrganismos são protegidos da ação dos antimicrobianos 79,87 . A produção de biofilme também pode ser influenciada por condições em que estas bactérias são expostas, dentre elas a presença de concentrações subinibitórias de antibióticos, promovendo a expressão gênica e a produção do biofilme 88 . Assim o PCR multiplex 2 padronizado para a detecção do operon ica em amostras de ECN e S. aureus se mostrou uma técnica rápida, sensível e de grande importância, podendo melhorar a conduta médica. O terceiro multiplex padronizado nesse estudo teve como objetivo de identificar as espécies de ECN mais isoladas em hemoculturas, como S. epidermidis, S. haemolyticus 73 S. hominis, S. capitis, S. warneri 89 e S. lugdunensis, onde este, apresar de raro, é um importante patógeno 90 . ECN estão em grande número presentes na microbiota normal da pele humana, sendo predominantemente um dos maiores contaminantes de hemoculturas 91,92 , porém a incidência de infecções causadas por esses agentes teve um grande aumento nos últimos anos, associadas ao uso de cateteres, próteses, válvulas 61,93 devido a sua capacidade de colonizar esses dispositivos, tornando-se capazes de adentrarem o organismo do paciente e promover infecções mais sérias 94 . Outro fator de grande importância é a taxa de ECN resistentes a antimicrobianos, tornando-se assim importante sua rápida identificação. Dentre as espécies de ECN, identificadas pelo método bioquímico convencional, o mais frequente foi o S. epidermidis, das 286 amostras de ECN, identificado em 53,1%. Segundo trabalho de Schuenck et al. 15 , a segunda espécie de ECN prevalente é o S. haemolyticus, dado esse também encontrado em nosso trabalho. Os autores descrevem a preocupação sobre esse fato, devido a alta taxa de isolados de S. haemolyticus resistentes a múltiplas drogas, das 36 amostras de S. haemolyticus isolados em nosso trabalho 91,6% se mostraram resistentes à oxacilina, dificultando o tratamento das infecções causadas por esses microrganismos. A terceira espécie mais identificada foi S. hominis e a quarta foi S.capitis. Essa última espécie tem sido isolada de hemoculturas, mas não nessa proporção 95 . S. warneri ficou em quinto lugar, porém a sua identificação é a mais difícil de ser realizada, devido a baixa acurácia na identificação fenotípica 96 . S. lugdunensis foi isolada em somente duas hemoculturas, porém apesar da baixa freqüência em hemoculturas, essa espécie pode apresentar uma virulência similar à de S. aureus 97 , e causar infecções invasivas e severas como endocardites 20 , devendo ser valorizado, sempre que isolado de espécimes clínicos. 74 A identificação de ECN requer muito tempo e o uso de muitas provas bioquímicas, não sendo viáveis para a rotina dos laboratórios de microbiologia clínica 9 . Entre o isolamento e a identificação fenotípica das espécies de ECN, levou-se um período de 3 a 5 dias, principalmente em espécies que necessitaram de provas complementares, além das provas simplificadas 43 . No terceiro multiplex elaborado nesse estudo, a extração foi realizada diretamente da hemocultura, não necessitando de subcultivos, diminuindo o tempo em que o resultado é liberado, e a identificação simultânea de seis espécies de ECN, as cinco primeiras (S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. capitis e S. warneri) mais frequentemente isoladas de hemoculturas, totalizando 93% dos isolados, e também S. lugdunensis, menos frequente, mas de importante significância clínica. Os resultados da identificação fenotípica e genotípica mostraram algumas discrepâncias. Duas amostras de S. epidermidis foram identificadas pelas provas bioquímicas como S. capitis, a discrepância foi na prova de utilização do açúcar Manitol, que deveria ser negativa, mas positivou. Uma amostra de S. capitis identificado como S. epidermidis fenotipicamente, onde o problema aconteceu com o mesmo açúcar, porém nesse caso o manitol deveria ser positivo, mas foi negativo. Outras 10 amostras de S. epidermidis foram identificadas fenotípicamente como S. warneri, devido à utilização do açúcar trealose por essas cepas que deveriam ser negativas e positivaram. Também foi verificado 7 amostras de S. haemolyticus identificadas fenotípicamente como S. warneri, onde a discrepância ocorreu devido a utilização da uréia por essas amostras, fato que não deveria ter ocorrido em amostras de S. haemolyticus. Essas discrepâncias podem ter acontecido devido a aquisição de genes, mutações no DNA dessas bactérias ou devido a não expressão de genes. Entretanto, essas discrepâncias (6,9%) em relação à utilização fenotípica de substratos é esperada, já que nenhuma prova bioquímica é 100% encontrada em todos os isolados de uma determinada 75 espécie. Esses resultados são importantes, pois revelam um perfil variável para a utilização de trealose e manitol por S. epidermidis e de uréia por S. haemolyticus, indicando a importância de testes moleculares na confirmação da identificação de espécies de ECN. Em outros estudos 89,91 também foram encontradas discrepâncias entre os resultados obtidos nas provas bioquímicas convencionais e resultados de identificação genotípica de ECN. Devido ao fato de que a identificação fenotípica necessitar de muito tempo para ser realizada, e por poder ocorrer falhas na utilização dos açúcares outros autores elaboraram trabalhos com PCR para a identificação genotípica desses microrganismos 98,99 . Em 2001, Couto et al. 61 elaboraram um estudo com um PCR simplex, onde este identificava espécies de ECN, detectando uma região satélite do RNAr. Porém a técnica padronizada é demorada, em média 18 horas para a liberação dos resultados, além da extração ser realizada de colônias já isoladas. Já em nosso estudo, entre a extração e a identificação por PCR Multiplex 3, o tempo gasto foi em média de seis a sete horas. O PCR multiplex se mostrou uma técnica rápida e de grande eficácia na identificação de ECN diretamente de hemoculturas, e os resultados demonstraram boa concordância com os resultados obtidos no ITS-PCR que é muito mais demorado e realizado somente a partir de culturas puras de microrganismos, e envolvendo a utilização de vários controles (cepas ATCC) que acabam aumentando o número de amostras a serem processadas, o que dificulta e encarece a técnica para ser utilizada em laboratórios de microbiologia clínica de rotina. Porém, ao se pensar em uma técnica de biologia molecular como o PCR multiplex para auxiliar no diagnóstico rápido em casos de infecção da corrente sanguínea logo se pensa nos custos dessa técnica para a instituição. Em um levantamento realizado por nosso trabalho, detectou-se que para a identificação das espécies da cultura, ou seja, após a detecção da positividade da hemocultura pelo aparelho Bactec, sua semeadura em placas contendo cultura e 76 sua identificação, que no caso do Laboratório de Microbiologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu utiliza o aparelho Vitek, sai em média $ 16,12 reais. No caso do PCR multiplex que não necessita da semeadura da hemocultura por ocorrer a identificação diretamente do frasco de hemocultivo, o PCR multiplex 1 para a detecção do gênero de Staphylococcus spp., da espécie de S. aureus e do gene mecA, e do PCR multiplex 3 que identifica as 6 espécies de Staphylococcus isoladas de hemoculturas tem um custo de $ 12,73 por amostra. Assim o PCR multiplex mostrou-se uma técnica rápida, sensível e eficaz, não sendo mais cara que o método automatizado de identificação por provas bioquímicas realizadas pelo laboratório de microbiologia do Hospital das Clínicas de Botucatu, podendo ser utilizado para auxiliar no diagnóstico de Estafilococos em hemoculturas, liberando o resultado mais rápidamente para auxiliar na conduta médica. 77 Conclusão 78 6. CONCLUSÃO  O PCR multiplex apresentou boa concordância com os métodos fenotípicos para a identificação de S. aureus, ECN e do gene mecA de resistência à oxacilina direto dos frascos de hemoculturas.  A detecção do operon ica diretamente dos frascos de hemoculturas se mostrou uma técnica rápida, sensível e de grande importância para a conduta médica.  O PCR multiplex para identificação de espécies de ECN se mostrou sensível e específico para essas espécies, podendo contribuir para a identificação rápida dessas espécies.  O PCR multiplex se mostrou uma técnica rápida, custo adequado, sensível e específica, podendo auxiliar na identificação de espécies de estafilococos em um tempo mais curto, podendo direcionar o médico em um tratamento mais rápido e específico. 79 Referências Bibliográficas 80 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Banderó Filho VC, Reschke CR, Horner R. 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