UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CÂMPUS DO LITORAL PAULISTA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO Investigação dos efeitos de fármacos utilizados no tratamento da leishmaniose visceral sobre a plasticidade neural mioentérica do cólon de hamsters infectados. Evelyn Caroline Vicente Mendes São Vicente 2023 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CÂMPUS DO LITORAL PAULISTA Evelyn Caroline Vicente Mendes Investigação dos efeitos de fármacos utilizados no tratamento da leishmaniose visceral sobre a plasticidade neural mioentérica do cólon de hamsters infectados. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de graduação em Ciências Biológicas – Habilitação em Biologia Marinha da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Campus do Litoral Paulista como requisito à obtenção do título de Bióloga Marinha. Orientadora: Profª.Drª. Renata de Britto Mari São Vicente 2023 M538i Mendes, Evelyn Caroline Vicente Investigação dos efeitos de fármacos utilizados no tratamento da leishmaniose visceral sobre a plasticidade neural mioentérica do cólon de hamsters infectados. / Evelyn Caroline Vicente Mendes. -- São Vicente, 2023 27 f. Trabalho de conclusão de curso (Bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, São Vicente Orientadora: Renata de Britto Mari 1. Leishmania. 2. Sistema Nervoso Entérico. 3. NADH-diaforase. 4. Anfotericina B. 5. Ácido Ursólico. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências, São Vicente. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. 2 AGRADECIMENTO Primeiramente agradeço aos meus pais por todo o amor e suporte, pois apesar das todas as nossas dificuldades, eles continuaram confiando e acreditando em mim. Ao meu irmãozinho por todo o carinho e alegria e ao restante da minha família que sempre me arrancam muitas risadas. Agradeço à minha orientadora Profª. Drª Renata de Britto Mari por ter aceitado me orientar, por todos os ensinamentos e pela paciência ao longo da trajetória, e muito obrigada por não ter desistido de mim em nenhum momento! Agradeço ao Laboratório de Morfologia Animal (LABMA) pelo espaço cedido para fazer o experimento e agradeço ao Ítalo Novais Cavallone, por todos os ensinamentos e dicas ao longo do processo. Agradeço a CNPq pela bolsa PIBIC cedida. Além disso, agradeço também a Maria Fernanda e a Julia, por serem uma das pessoas que eu mais amo no mundo inteiro! Obrigada por todo o suporte emocional, por serem o meu porto seguro e as pessoas que eu mais confio, vocês são as minhas estrelas! Também agradeço ao Douglas, Bruna e Amanda, por serem simplesmente a minha segunda família em São Vicente, vocês são o conforto em meio ao caos da graduação, e eu não poderia estar mais feliz em encerrar esse ciclo junto de vocês, obrigada por cada gargalhada e cada momento que passamos juntos, vocês tem um espaço especial no meu coração. Também agradeço ao Henrique, por ser uma das pessoas mais incríveis que eu já conheci, e eu espero que você saiba que não há montanha alta o suficiente que me mantenha longe de você, sempre vou agradecer o universo pelo meu caminho ter cruzado o seu. Por fim, mas não menos importante, agradeço a turma XVII, apesar das desavenças não consigo me imaginar em uma turma de graduação diferente dessa, eu consegui viver momentos inesquecíveis junto com vocês e sou extremamente grata por isso! Vocês são sensacionais! 3 SUMÁRIO RESUMO .................................................................................................................................. 4 ABSTRACT .............................................................................................................................. 5 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 6 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 11 3. METODOLOGIA .............................................................................................................. 11 3.1. Análise da carga parasitária ........................................................................................ 12 3.2. Detecção dos neurônios mioentéricos NADH-diaforase reativos .............................. 12 3.3. Análise morfoquantitativa dos neurônios mioentéricos .............................................. 12 4. RESULTADOS .................................................................................................................. 13 5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 18 6. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 20 7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 21 4 RESUMO A Leishmaniose Visceral (LV) é uma das manifestações clínicas mais letais da Leishmania, sendo relatada principalmente em países emergentes. Sua transmissão ocorre através da picada de dípteras da família dos flebotomíneos, comprometendo os órgãos associados ao sistema imunológico, como é o caso do baço, fígado e medula óssea. Estudos recentes observaram alterações expressivas no sistema nervoso entérico e intestino delgado de hamster infectados. Quanto ao tratamento, um dos medicamentos mais utilizados é a Anfotericina B, porém devido aos fortes efeitos colaterais, somados a resistência do parasita, tem-se a necessidade de se obter novas alternativas de terapias saudáveis, sendo uma delas o Ácido Ursólico, que é um fitoterápico que promove uma visível eficácia do tratamento, concomitante a uma baixa taxa de feitos colaterais. Portanto, este estudo visou analisar os efeitos colaterais do tratamento de Anfotericina B e Ácido Ursólico no cólon de Hamster Dourado (Mesocricetus auratus) infectados com L. (L.) infantum através das análises quantitativas de populações metabolicamente ativas. Hamster previamente infectados e tratados foram eutanasiados e os cólons coletados, posteriormente as amostras submetidas à técnica de evidenciação neural NADH-diaforase reativa. Por fim, os resultados obtidos foram analisados estatisticamente pelo teste one-way ANOVA. Foram observadas redução da carga parasitária no baço e no fígado dos grupos tratados os respectivos fármacos. Além disso, não foram observadas alterações significativas na densidade neuronal dos grupos. Os valores da análise morfométrica tanto do perfil celular quanto nuclear apresentaram-se estatisticamente significativos (P < 0,001). Dentre os modos que a leishmaniose visceral afeta o sistema nervoso entérico, temos a indução do estresse oxidativo, que resulta na alteração fenotípica dos neurônios. Apesar da eficácia, a anfotericina B apresenta uma alta toxicidade, aumentando o metabolismo do organismo e promovendo um estresse oxidativo dos neurônios. Já o ácido ursólico, é um fitoterápico eficaz que possui uma toxicidade reduzida, causando menos danos ao sistema nervoso entérico. Palavras-chave: Leishmania, Sistema Nervoso Entérico, NADH-diaforase, Anfotericina B, Ácido Ursólico; 5 ABSTRACT Visceral Leishmaniasis is one of the most lethal clinical manifestations of Leishmania, being detected mostly in emerging countries. Its transmission occurs through the sting of diptera from the Flebotominae Family, which compromises the organs connected to the immune system, such as the liver, spleen, and boné marrow. The clinical symptoms include fever, weight loss and hepatosplenomegaly o que, gastrointestinal disturbances have also occurred. Recent studies observed significant changes in the enteric nervous system and in the small intestine of infected hamsters. Regarding the treatment, one of the most utilized drugs is Amphotericin B, however, due to its severe collateral effects and to the parasite’s resistance to it, it is necessary to seek new alternatives of healthier treatments, with Ursolic Acid being one of them, a herbal substance that promotes effective treatment along with low collateral effects. Therefore, this study aimed to analyze the side effects of the treatment with Amphotericin B and Ursolic Acid on the colon of Golden Hamsters (Mesocricetus auratus) infected with L. infantum through quantitative analysis of metabolically active populations. Previously infected and treated hamsters were euthanized, and their colons were collected. Subsequently, the samples were subjected to the neural staining technique using NADH-diaphorase. Finally, the obtained results were statistically analyzed using the one-way ANOVA test. Reduction in parasitic load was observed in the spleen and liver of the treated groups with their respective drugs. Additionally, no significant alterations were observed in the neuronal density of the groups. The values from both cellular and nuclear morphometric analysis were statistically significant (P < 0.001). Among the ways visceral leishmaniasis affects the enteric nervous system, induction of oxidative stress leading to phenotypic changes in neurons is notable. Despite its efficacy, amphotericin B presents high toxicity, increasing the organism's metabolism and promoting oxidative stress in neurons. On the other hand, ursolic acid, as an effective phytotherapeutic agent, exhibits reduced toxicity, causing less harm to the enteric nervous system. Keywords: Leishmania, Enteric Nervous System, NADH-diaphorase, Amphotericin B, Ursolic Acid; 6 1. INTRODUÇÃO A leishmaniose é uma patologia promovida pelo parasita do gênero Leishmania, cuja distribuição é cosmopolita. Devido a fatores como urbanização, desmatamento e ausência de serviços de saúde, são registrados aumento global dos casos, havendo em torno de 15 milhões de indivíduos infectados (IRFAN et al. 2022). Essa doença é considerada negligenciada, visto que ela acomete principalmente as regiões mais pobres, sendo relatado principalmente em países localizados na África, Oriente Médio e América do Sul, como é o caso do Brasil (PAULAN et al. 2016; ANVERSA et al. 2018; MANN et al. 2021). A sua transmissão pode ocorrer de forma zoo-antroponógica, onde seu ciclo de vida pode ser dividido em dois estágios: promastigota e amastigota (TORRES-GUERRERO et al. 2017). A forma promastigota é caracterizada por ser flagelada, sendo encontrada em dípteros, como é o caso da da espécie de flebotomíneos Lutzomyia longipalpis, considerado o principal vetor da doença (WAMAI et al 2020). Após infectar o hospedeiro, o parasita se modifica em sua segunda forma, também conhecida como amastigota. Nesse estágio de vida o organismo passa a ser não flagelado, além de se tornar um parasita intracelular, se instalando nas células fagocíticas do hospedeiro (TORRES-GUERRERO et al. 2017). Durante a infecção, as amastigotas se replicam dentro das células fagocíticas, até a célula se romper, disseminando esses microrganismos e possibilitando que eles não só atinjam os demais macrófagos, como também sejam transmitidos pela corrente sanguínea, contaminando assim o sistema retículo endotelial do hospedeiro, afetando órgãos como baço e fígado (IRFAN et al. 2022). Kumar e Nylén (2012) relatam experimento com camundongos infectados com Leishmania (Leishmania) infantum ou Leishmania (Leishmania) donovani, sendo observada uma multiplicação rápida do parasita no fígado, e posteriormente um controle da sua proliferação devido à resposta imune dos animais. O mesmo também pode ser observado na região do baço, onde a diferença é uma progressão lenta do parasita no órgão, além de uma reação imunológica menos imediata quando comparado ao fígado, demonstrando diferentes respostas imunes à infecção da leishmania no mesmo hospedeiro. (KUMAR & NYLÉN, 2012) 7 Figura 1. Fases do ciclo de vida do protozoário do gênero Leishmania ssp. dividido em seus respectivos estágios. (1) Flebotomíneo injetam a forma promastigota na pele (2) A forma promastigota é fagocitada por células mononucleares fagocitícas (3) Os promastigotas se diferenciam em amastigotas (4) As amastigotas se multiplicam e posteriormente infectam outras células (5) Flebotomíneos ingerem sangue (6) Ocorre a ingestão de macrófagos infectado com amastigotas (7) Amastigotas se transformam em promastigotas na região do intestino (8) Ocorre a divisão no intestino e posteriormente a migração para a probóscide do flebotomíneo (Fonte: CDC) A presença da amastigota na corrente sanguínea gera uma das principais manifestações clínicas da doença, sendo ela a Leishmaniose Visceral (LV), também considerada a forma mais alarmante da doença, principalmente em pacientes imunossuprimidos (LIMA et al. 2021). A Leishmania (Leishmania) infantum é uma das principais espécies responsáveis por essa patologia, onde os sintomas incluem anemia, febre, hepatomegalia, perda de peso (ZULFIQAR et al. 2017; LIMA et al. 2021) e diarreia (SILVA et al. 2018). Os dois últimos sintomas sugerem que, além dos órgãos conhecidos, a Leishmaniose Visceral também acomete o trato gastrointestinal do paciente, gerando sintomas atípicos da doença (YADAV et al. 2023) O trato gastrointestinal (TGI) é um conjunto de órgãos responsável pela recepção e digestão de alimentos. Dentre os órgãos presentes no TGI, podemos citar o intestino delgado e o intestino grosso, sendo que este último possui como principal função a absorção de água e eletrólito dos organismos, e ele compreende por porções do ceco, cólon ascendente e cólon 8 transverso, que também são conhecidas como cólon proximal, que é a parte inicial da região. Além disso, o intestino grosso também é composto pelo cólon descendente e cólon sigmóide, que consistem na parte final da região, nomeada como cólon distal, que compreende a parte final do intestino grosso. (LIAO et al. 2009; LIMA et al. 2021; OGOBUIRO et al. 2023). Da perspectiva histológica, a parede dessa região é composta por quatro camadas, sendo elas a mucosa, submucosa, serosa e muscular (LIAO et al. 2009). A mucosa é composta por uma única camada epitelial, responsável por aumentar a região de superfície do local para facilitar a absorção, já na submucosa encontra-se, além do tecido conjuntivo, vasos sanguíneos, linfáticos e o plexo submucoso (OGOBUIRO et al. 2023). A camada muscular possui duas camadas, conhecidas como: camada muscular circular interna e camada muscular longitudinal, e é entre elas que se encontra o plexo mioentérico. Por fim, a camada serosa é constituída por uma fina camada de tecido conjuntivo e de células que atuam secretando um fluido lubrificante que reduz o atrito da região durante o movimento da região (OGOBUIRO et al. 2023). Na literatura há descritas alterações fisiológicas que ocorrem no TGI, sendo que um dos motivos dessas alterações se dá pelo impacto da patologia no sistema nervoso entérico (OBATA & PACHNIS, 2016). O SNE, também conhecido como “segundo cérebro” realiza diversas funções ligadas a motilidade do trato gastrointestinal, como o controle da secreção do ácido gástrico, modificação do transporte de alimento, contrações peristálticas e regulação de processos inflamatórios e imunológicos (FURNESS, 2012; YOO & MAZMANIAN, 2017; MAGALHÃES & CASTELUCCI, 2020). Ele é composto por uma série de nervos organizados em pequenos gânglios interligados entre si, além de células gliais entéricas, encontrados na camada muscular do TGI (FURNESS, 2012; OBATA & PACHNIS, 2016; SPENCER & HU, 2020). A organização dos neurônios entéricos ocorre através de plexos submucosos e plexos mioentéricos. Além disso, também é evidenciado a presença de feixes de fibras nervosas, responsáveis pela conexão dos gânglios (FURNESS, 2012). Os neurônios que compõem o plexo mioentérico são responsáveis por promover o relaxamento e contração intestinal, através da alteração da projeção dos axônios presentes na região, além de também interagirem com os macrófagos presentes no tecido muscular. (SCHNEIDER et al. 2018). Já no plexo submucoso, estão presentes neurônios responsáveis por regular a secreção epitelial, fluxo sanguíneo local (PAWOLSKI & SCHMIDT, 2020), e também pelo transporte de íons através do epitélio intestinal (DIPOSAROSA et al. 2021). 9 Figura 2. Esquematização anatômica do Sistema Nervoso Entérico (Adaptado: Furness, 2012) Estudos indicam que, quando expostos a um agente estressor, como por exemplo o parasitismo, os neurônios entéricos apresentam respostas adaptativas ao dano promovido por ele, como é o caso da alteração de plasticidade fenotípica (LIMA et al. 2021). Experimentos realizados com protozoários da espécie Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi e Giardia duodenalis evidenciam alterações morfofisiológicas do SNE como resposta a esses patogênicos. (MAIFRINO et al. 1999; HALLIEZ & BURET, 2015; VICENTINO-VIEIRA et al. 2015). No geral, têm-se registros de necrose, apoptose, degeneração nos gânglios entéricos e demais alterações tanto funcionais quanto morfológicas consequentes da inflamação intestinal, como por exemplo, modificações nos padrões de motilidade, respostas secretoras inadequadas do epitélio frente a estímulos e mortes celulares consequentes da ausência de enzimas associadas regulação da apoptose e inflamação celular. (MAGALHÃES & CASTELUCCI, 2021). Apesar de recentes, são encontrados estudos envolvendo a Leishmaniose e o seu impacto no TGI. Infecções experimentais com diferentes cepas de Leishmania foram realizadas em íleo de espécies de roedores, onde foram mostradas alterações na morfometria dos neurônios do plexo mioentérico e submucoso, mais especificamente uma hipertrofia dos corpos 10 neuronais, podendo acarretar alterações na motilidade intestinal do organismo modelo (SANTOS et al. 2021). Além disso, também é relatado uma redução significativa da densidade da população metabolicamente ativa do duodeno de hamster dourado infectado com Leishmania (Leishmania) infantum (CAVALLONE et al. 2022), o que corrobora com a possibilidade o TGI ser um dos órgãos alvos desse parasita. Sabe-se que a maioria dos pacientes acometidos pela Leishmaniose Visceral possuem um alto índice de mortalidade quando não são submetidos a um tratamento (VAN GRIENSVEN & DIRO, 2019). São diversas as drogas anti leishmanias disponíveis para o controle dessa doença, sendo que o sucesso do tratamento aplicado varia conforme o sistema imune do paciente e a localização geográfica da infecção adquirida (MCGWIRE & SATOSKAR, 2014; VAN GRIENSVEN & DIRO, 2019). Dentre as classes de medicamento utilizadas na atividade parasitária, tem-se a Anfotericina B, que é antifúngico com atividade leishmanicida (AGUIAR & RODRIGUES, 2017) cujo mecanismo de ação baseia-se não só em efeitos diretos na membrana celular como também em efeitos associados à indução do estresse oxidativo, e consequentemente, efeitos tóxicos para as células patogênicas (FALCI & PASQUALOTTO, 2015; VAN GRIENSVEN & DIRO, 2019). Porém, há registro de efeitos adversos nos pacientes tratados com esse medicamento, como por exemplo calafrios, febre, náuseas e vômitos, também sendo descritos outros efeitos mais graves como anemia, nefrotoxicidade e perda da função hepática (MCGWIRE & SATOSKAR, 2014; FALCI & PASQUALOTTO, 2015). Além disso, também há relatos de resistência do parasita à anfotericina B (PONTE-SUCRE et al. 2017), havendo a necessidade de novas vias de tratamento. Dentre as novas formulações desenvolvidas, tem-se a Anfotericina B Lipossomal (L- AmB), cuja composição se difere da anterior devido a adição de lipossomos unilamelares à estrutura do fármaco, o que ocasiona efeitos nefrotóxicos significativamente reduzidos (FALCI & PASQUALOTTO, 2015), além de ter sido registrado o sucesso do seu uso no tratamento da Leishmaniose Cutânea (SHIRZADI, 2019). Além disso, há também o Ácido Ursólico (AU), que é um metabólito isolado a partir de diversas plantas medicinais que possui atividades anticancerígenas (BILBAO-RAMOS et al. 2020) antimicrobiana e potencialmente antileishmania (JESUS et al. 2020). Infecções experimentais demonstraram que esse medicamento possui resultados positivos quanto ao 11 tratamento de roedores infectados com diferentes espécies de Leishmania, visto que há um aparente aumento da resposta imune desses animais quando tratados com esse medicamento, demonstrando que o AU pode ser considerado uma via promissora quanto o tratamento da Leishmaniose (JESUS et al. 2020). Portanto, ao considerar o impacto da doença nos indivíduos, e os sintomas clínicos como a diarreia e perda de peso, se faz necessário estudos a respeito do comprometimento neuronal e morfológico do trato gastrointestinal, mais especificamente o cólon, tendo em vista a análise dos possíveis efeitos dos fármacos utilizados para tratamento da Leishmaniose. 2. OBJETIVOS Esse estudo tem como objetivo a investigação da plasticidade neuronal mioentérica do cólon de hamsters (Mesocricetus auratus) infectados com Leishmania (Leishmania) infantum e submetidos ao tratamento com anfotericina B ou ácido ursólico. 3. METODOLOGIA Para a realização da pesquisa, foram utilizados doze hamsters dourados (Mesocricetus auratus), divididos em quatro grupos experimentais, contendo três animais em cada um (n=3), sendo eles: Grupo Controle Saudável (GC), Grupo Controle Infectado (GI), Grupo Tratado com Ácido Ursólico (GIAU) e Grupo Tratado com Anfotericina B (GIAnB). Com exceção do grupo controle, os demais grupos foram infectados com 2x107 promastigotas de L. (L.) infantum por meio da via intraperitoneal. Após 45 dias da infecção, iniciou-se o tratamento do GIAnB, que consistiu na administração intraperitoneal de 5 mg/kg de anfotericina B, e do GIAU, onde foi administrado 1 mg/kg de Ácido Ursólico. Ambos os procedimentos ocorreram por um período de 15 dias consecutivos. Após uma semana da última injeção, todos os animais foram eutanasiados em câmara de CO2. Será realizada a celiotomia e os cólons foram coletados, lavados para eliminação do conteúdo fecal e destinados às técnicas de evidenciação neuronal da população metabolicamente ativas (NADH-diaforase reativos). 12 3.1. Análise da carga parasitária A carga parasitária nos animais infectados com L. (L.) infantum foi analisada através de unidades Leishman-Donovan. O baço e fígado de todos os grupos experimentais foram coletados e pesados. Em seguida, a posição destes fragmentos foi feita em lâminas, as quais foram fixadas com metanol e coradas com Giemsa. A carga parasitária foi feita avaliando-se o número de amastigotas em ao menos 1000 células nucleadas, e a carga parasitária foi normalizada de acordo com o peso do órgão analisado. 3.2. Detecção dos neurônios mioentéricos NADH-diaforase reativos (GABELLA, 1969) Os cólons foram lavados e preenchidos com solução de Krebs (pH 7,3). Após a lavagem, os segmentos foram submetidos ao procedimento para evidenciação dos neurônios. Para tanto, os segmentos foram passados por duas lavagens de dez minutos cada em solução de Krebs, e posteriormente foram incubados em solução de Krebs contendo Triton X-100 a 0,3% durante cinco minutos. Ocorreram mais duas lavagens de dez minutos em cada solução de Krebs e posteriormente a incubação em meio de reação constituído por 25ml de solução estoque de Nitro Blue Tetrazolium (NBT, solução estoque com concentração de 0,5 mg/ml), 25 ml de tampão fosfato de sódio (0,1 M; pH 7,3), 0,05 g de b-NADH em 50ml de água destilada. O tempo de incubação foi padronizado em 45 minutos e a reação histoquímica foi acompanhada em estereomicroscópio. Por fim, os segmentos foram fixados em solução de formaldeído a 10% em tampão fosfato (0,1 M, pH 7,3). 3.3. Análise morfoquantitativa dos neurônios mioentéricos Os segmentos intestinais marcados pela técnica de NADH-diaforase foram seccionados na margem mesocólica e microdissecado sob estereomicroscópio, para retirada das túnicas mucosa e submucosa e preservação das túnicas muscular e serosa. Os preparados de membrana obtidos foram montados entre lâmina e lamínula de vidro com resina sintética Permount®. A quantificação neuronal por gânglio foi feita por meio dos preparados de membrana de cada animal. A densidade neuronal será obtida com o auxílio do microscópio de luz 13 (aumento de 400X), sendo as imagens capturadas pela câmera digital Motic Image® transferidas para o computador. Para cada preparado de membrana foi percorrida todas as regiões mesocólica, antimesocólica e intermediária, até que 40 gânglios fossem capturados. Todos os neurônios presentes no perfil ganglionar fotografado foram quantificados e a mensuração da área dos perfis do corpo celular e nuclear dos neurônios mioentéricos do cólon foi realizada pelo programa de análise de imagem computadorizado Image-Pro-Plus 3.0.1. Para tanto, as imagens dos neurônios capturadas para a análise quantitativa foram utilizadas na análise morfométrica. Os 250 primeiros neurônios quantificados serão mensurados. 3.4. Análise Estatística A distribuição dos dados morfoquantitativos foram analisados pelo teste one-way ANOVA e o pós-teste utilizado foi o Tukey. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão. O nível de significância foi de 5% 4. RESULTADOS Os valores da análise da carga parasitária foram expressos na Tabela 1, onde é possível observar uma eficácia de ambos os tratamentos, dando destaque a anfotericina B, que apresentou uma melhor performance, reduzindo praticamente toda a carga parasitária dos órgãos analisados. Apesar dos resultados expressivos, eles não são estatisticamente significativos. Tabela 1. Análise dos efeitos dos fármacos na redução da carga parasitária sendo expressa tanto em média quanto em formato de porcentagem. 14 Baço Infectado AnfB AU Média ± Desvio padrão 5,79x109± 7,0x108 6,99x107±9,01x106 1,49x109±2,08x109 Redução da carga parasitária (%) 0% 98,79% 74,21% Fígado Infectado AnfB AU Média ± Desvio padrão 3,38x108±3,40x10 7 9,45x105+4,01x105 3,37x107± 4,65x107 Redução da carga parasitária (%) 0% 99,72% 90,04% Quanto à análise da densidade neuronal, observa-se uma alteração quanto a quantidade de neurônios por gânglio dos grupos experimentais (Imagem 1). O GI apresentou um aumento de 28% da média neuronal quando comparado ao GC, enquanto o GIAnB e o GIAU apresentaram uma diminuição de 36% e 28% respectivamente, também comparado ao GI. A média e o desvio padrão da densidade neuronal encontrada no cólon dos hamster infectados e tratados pode ser encontrada na Tabela 2. Tabela 2. Média e desvio padrão da densidade neuronal dos grupos experimentais. Grupos Média ± Desvio padrão Controle 39,9 ± 7,6 Infectado sem tratamento 51,0 ± 1,3 Anfotericina B 32,8 ± 13,8 15 Ácido Ursólico 36,7 ± 4,1 A comparação entre os grupos é mostrado graficamente na Figura 2. Foi realizado o teste estatístico de normalidade (Shapiro-Wilk) entre os grupos, onde os dados não se mostraram estatisticamente significativos (P = 0,419). Figura 3. (A) Gânglio do Grupo Controle, (B) Gânglio do Grupo Infectado sem Tratamento, (C) Gânglio do Grupo Infectado tratado com Anfotericina B e (D) Grupo Infectado tratado com Ácido Ursólico. 16 Figura 4. Média e Desvio Padrão da densidade neuronal dos grupos experimentais No geral, os dados da análise morfométrica dos grupos experimentais se mostraram estatisticamente significativos (P < 0,001), tanto aos resultados voltados ao perfil celular, como também os voltados à análise do perfil nuclear. Em relação ao perfil celular, o grupo infectado sem tratamento apresenta a maior média, tendo aumentado 42% em comparação ao GC. O GIAU possui a menor média dos grupos tratados, apresentando uma redução de 11% em relação ao GI. O grupo infectado sem tratamento e o grupo tratado com anfotericina B não apresentaram diferença significativa quando comparados entre si. (Tabela 3) Tabela 3. Média e desvio padrão da análise morfométrica do perfil celular e nuclear dos grupos experimentais. Perfil celular Perfil Nuclear Grupos Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Controle 60,24 ± 17,72 (a) 32,68 ± 14,98 (a) Infectado sem tratamento 85,36 ± 2,42 (b) 56,67 ± 3,18 (b) Anfotericina B 78,90 ± 12,78 (c) 53,56 ± 10,09 (b,c) Ácido Ursólico 75,55 ± 9,09 (a) 42,92 ± 7,60 (a) 17 Quanto à análise do perfil nuclear, com exceção da comparação entre o GC e o GIAU, os grupos apresentaram diferença significativa (P < 0,001) o GI apresentou o maior valor de média e desvio padrão quando comparado aos demais grupos, tendo um aumento de 73% em comparação ao GC. O grupo tratado com Ácido Ursólico possui a menor média dentre os fármacos, possuindo uma redução de 24% em relação ao grupo infectado. A comparação gráfica entre a análise do perfil celular e perfil nuclear pode ser vista na Figura 3. Figura 5. (A) Comparação gráfica do perfil celular entre os grupos experimentais e (B) Comparação gráfica do perfil nuclear entre os grupos experimentais 18 5. DISCUSSÃO São diversos os estudos que relacionam o parasitismo com alterações morfofuncionais do sistema nervoso entérico (ARAÚJO et al. 2015; SCHNEIDER et al. 2016; TREVIZAN et al. 2016). Recentemente, experimentos demonstraram como a leishmaniose visceral possui como alvo de infecção o intestino do hospedeiro, induzindo a alterações morfofisiológicas na região (LIMA et al. 2021; CAVALLONE et al. 2022). Apesar de existirem estudos sobre a infecção e progressão sistêmica da Leishmania (Leishmania) infantum no organismo hospedeiro, ainda são limitadas as análises dos efeitos dos fármacos utilizados no tratamento da doença na região entérica. No estudo atual, realizamos análises para averiguar como os medicamentos afetam os neurônios do sistema nervoso entérico durante a fase aguda da doença. Avaliamos a quantidade de parasitas presentes no fígado e no baço, que são os órgãos afetados ao longo da infecção. Diante disso, foi demonstrado um sucesso de ambos os fármacos durante o tratamento, dando ênfase a anfotericina B, que apresentou maior potencial no tratamento, reduzindo a presença dos parasitas dos órgãos quase que em sua totalidade, o que pode ser explicado através da sua alta toxicidade (BORGES et al. 2017). Apesar disso, os dados não se mostraram estatisticamente significativos. Para a análise da densidade neuronal, os neurônios foram marcados com a técnica histoquímica NADH-diaforase, utilizada para evidenciar os neurônios metabolicamente ativos (ODORIZZI et al. 2010). Não foram observados resultados estatisticamente significativos, porém nota-se uma tendência de aumento de neurônios por gânglio do grupo infectado sem tratamento em comparação aos demais grupos experimentais. Essa diferença entre os grupos pode ser justificada através do aumento do metabolismo do animal, consequente da alteração do funcionamento mitocondrial, proveniente da infecção do parasita no organismo (ODORIZZI et al. 2010; PEREIRA et al. 2010). A proximidade das médias de densidade neuronal dos grupos tratados com fármacos com o grupo controle pode ser justificada pela ação dos medicamentos perante o parasita. Embora o gênero Leishmania tenha como célula hospedeira os macrófagos, monócitos, neutrófilos e demais células voltadas a resposta imune do organismo infectado (SCOTT & NOVAIS, 2016), a anfotericina B é caracterizada pelo estímulo das células fagocíticas do hospedeiro, eliminando assim o parasita da região (NOOR & PREUSS, 2022). Já os grupos 19 tratados com ácido ursólico apresentam um valores de neurônio por gânglio semelhante aos tratados com anfotericina B, visto que a atividade leishmanicida de ambos os fármacos pode ser considerada similar, entretanto, o ácido ursólico possui uma menor toxicidade (YAMAMOTO et al. 2014), o que pode estar relacionado com sutil variação dos valores. A análise morfométrica dos neurônios metabolicamente ativos apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos (P < 0,001). Tanto a análise do perfil celular, quanto a análise do perfil nuclear apresentou um registro de hipertrofia dos grupos GI e GIAnB. O aumento do perfil celular e nuclear do grupo infectado está associado ao aumento da atividade metabólica, que é a consequência da resposta inflamatória do organismo frente ao parasitismo para tentar manter a homeostase (CAVALLONE et al. 2021). Apesar de ser um método de combater o agente estressor, a alta atividade metabólica pode gerar um estresse oxidativo no organismo. Apesar do óxido nítrico (NO) possuir um papel neuroprotetor, o seu aumento pode ser considerado citotóxico, gerando uma mudança fenotípica nos neurônios. (LIN et al. 2004; VICENTINO-VIEIRA et al. 2015; CAVALLONE et al. 2021). Além das alterações fenotípicas, a síntese excessiva de NO também pode promover mudanças na motilidade intestinal (SANTOS et al. 2021), o que pode explicar os casos de diarreia nos pacientes infectados. Semelhante ao GI, o grupo tratado com anfotericina B também apresentou valores elevados na média da análise do perfil nuclear e celular. Este medicamento é uma droga altamente competente no tratamento da leishmaniose, visto que ele apresenta uma alta toxicidade (BALASEGARAM et al. 2012). Assim como dito anteriormente, um dos seus mecanismos de ação ocorre através da eliminação do amastigota proveniente do aumento da presença de células fagocíticas na região. Além disso, a anfotericina B age no meio celular através do aumento da permeabilidade da membrana, resultante dos danos oxidativos nas células (NOOR & PREUSS, 2022). Esses fatores corroboram para o aumento da atividade metabólica e consequentemente a mudança fenotípica dos neurônios entéricos. O ácido ursólico é um medicamento fitoterápico recente utilizado como alternativa no tratamento da leishmaniose visceral. A ação leishmanicida desse fármaco vem sendo estudado (GNOATTO et al. 2008; PASSERO et al. 2011; JESUS et al. 2020), tendo demonstrado uma boa eficiência na ação contra o parasita, além de se mostrar um via menos tóxica quando comparado aos demais tratamentos (JESUS et al. 2020). 20 Ao estudar os resultados na análise morfométrica dos grupos tratados com ácido ursólico, percebe-se o quanto seus valores se aproximam do grupo controle, demonstrando o sucesso do fármaco na ação contra o parasita. Gnoatto et al. (2008), afirma que esse medicamento possui ação mais intensa no controle da doença, impedindo a disseminação das amastigotas no organismo do hospedeiro. Além disso, também há evidências desse medicamento apresentar um efeito citotóxico reduzido, visto que a sua atividade ocorre diretamente no parasita, sem ocorrer a ativação dos macrófagos (GNOATTO et al. 2008), o que pode justificar a baixa alteração fenotípica dos neurônios entéricos e consequentemente a sua semelhança com o GC. 6. CONCLUSÃO Através das análises realizadas, observa-se que a leishmaniose visceral atua no sistema nervoso entérico através do estresse oxidativo, promovendo a mudança fenotípica dos neurônios. Os fármacos utilizados se mostraram eficazes quanto ao tratamento da doença, porém o ácido ursólico mostra-se mais promissor, visto que, além da redução da carga parasitária no organismo, também há uma baixa toxicidade, diminuindo o estresse oxidativo da região e facilitando eliminação do parasita no hospedeiro. 21 7. REFERÊNCIAS Aguiar, P. F., & Rodrigues, R. K. (2017). Leishmaniose visceral no Brasil: artigo de revisão. 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