Diana Maria Cano Higuita Avaliação de surfactantes de grau alimentício na formação de microemulsões W/O para posterior encapsulação de betalaina por coacervação complexa São José do Rio Preto 2017 Campus de São José do Rio Preto Diana Maria Cano Higuita Avaliação de surfactantes de grau alimentício na formação de microemulsões W/O para posterior encapsulação de betalaina por coacervação complexa Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Tecnologia de Alimentos, junto ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: FAPESP – Processo 2013/14371-0 Orientadora: Profª. Drª. Vânia Regina Nicoletti Telis São José do Rio Preto 2017 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Campus de São José do Rio Preto Higuita, Diana Maria Cano. Avaliação de surfactantes de grau alimentício na formação de microemulsões W/O para posterior encapsulação de betalaina por coacervação complexa / Diana Maria Cano Higuita. -- São José do Rio Preto, 2017 190 f. : il., gráfs., tabs. Orientador: Vânia Regina Nicoletti Telis. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Tecnologia de alimentos. 2. Surfactantes. 3. Emulsões. 4. Betaína. 5. Condutividade elétrica. I. Telis, Vânia Regina Nicoletti. II. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU – 661.18 Diana Maria Cano Higuita Avaliação de surfactantes de grau alimentício na formação de microemulsões W/O para posterior encapsulação de betalaina por coacervação complexa Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia e Tecnologia de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: FAPESP – Processo 2013/14371-0 Orientadora: Profª. Drª. Vânia Regina Nicoletti Telis Comissão Examinadora Profª. Drª. Vânia Regina Nicoletti Telis UNESP – São José do Rio Preto Orientadora Profª. Drª. Maria Aparecida Mauro UNESP – São José do Rio Preto Profª. Dra. Poliana Moser UNESP – São José do Rio Preto Profa. Dra. Audirene Amorim Santana UFMA – São Luis - MA Profª. Drª. Maria Angélica Marques Pedro UNILAGO – São José do Rio Preto São José do Rio Preto 2017 Dedico este trabalho para minha mãe Olga em Colômbia, meu filho Gustavo e meu esposo Harvey são a força que me move todos os dias e minha inspiração para continuar com meu projeto de vida. AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por todas as benções na minha vida, saúde, estudo e amor. Agradeço a Santa Rita de Cassia por todas as benções na minha vida. A minha querida mãe Olga Maria Higuita e meu irmão Martin Eduardo Espinosa Higuita, pelo amor e apoio incondicional aos meus estudos. A meu filho Gustavo porque cada dia me ensina coisas que não se aprendem em nenhum lugar e permitem que me torne uma melhor mãe. Te amo. À família Higuita, pela ajuda em todos esses anos de minha vida. Aos meus amigos Pepe, Angélica, Erick, Carolina, Luz Dary, Miriam Estevez, Dona Neuza, Kelly Tafari Catelam, Monique, Thiago, Marcia e Alder, Apolonia sempre tenho vocês presentes, por toda ajuda, pelos conselhos e por compartilhar momentos especiais comigo. Aos técnicos, Luiz, Ginaldo, Jesuino pelo apoio no projeto. Ao Francisco Jose Conceição pela força e amizade na etapa final deste projeto. À minha orientadora Vânia Regina Nicoletti Telis, pela assessoria, formação acadêmica, paciência e amizade. À UNESP, ao Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos, aos professores/as José Francisco Lopes Filho, Maria Aparecida Mauro, João Claudio, Roger Darros, por suas contribuições durante as disciplinas de estudos. À doutora Miriam Dupas Hubinger e a técnica do laboratório Vanessa pela ajuda com as análises no laboratório na Unicamp. À doutora Samantha C Pinho pelas sugestões no exame de qualificação e pelo conhecimento transmitido em diversas ocasiões. Ao doutor Cristiano Luis Pinto de Oliveira e ao estudante de doutorado Pedro Leonidas Oseleiro Filho pela colaboração nas análises das amostras no laboratório da USP. À aluna de iniciação cientifica Caroline Gregoli Fuzetti pela ajuda, paciência, tolerância e cumplicidade À Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado de São Paulo, FAPESP, pelo financiamento do projeto através do processo 2013/14371-0. Em especial à pessoa que sempre me impulsiona a continuar Harvey Alexander Villa Vélez, pela amizade, carinho, cumplicidade, apoio e amor. i Resumo RESUMO As microemulsões (MEs) são misturas isotrópicas e termodinamicamente estáveis de dois solventes imiscíveis estabilizados por surfactantes, com múltiplas aplicações em indústrias químicas, farmacêuticas e alimentares. O objetivo deste trabalho foi a avaliação de dois surfactantes de grau alimentar - monooleato de sorbitano (Span 80) e polissorbato 80 (Tween 80) - na formação de MEs com adição de propilenoglicol como co-tensioativo e a caracterização do sistema resultante. O estudo priorizou a fase isotrópica formada por MEs, cujas propriedades foram investigadas por condutividade elétrica, reologia, calorimetria de varredura diferencial e calor específico. Sete sistemas detectados foram identificados como MEs ao longo do surfactante para proporções de óleo 9: 1 e 8: 2 linhas de diluição, até 20% de água. Os sistemas obtidos mostraram uma condutividade baixa, comportamento newtoniano típico de sistemas microemulsionados e, por meio de análises qualitativas foram identificadas como sistemas óleo em água (O/W). As análises de SAXS serviram para determinar o tamanho o qual está numa faixa que varia entre ≈ 70 Å e ≈ 90 Å, com forma definida como globular achatada e/ou em forma de core-shell. Foram incorporados diferentes conteúdos de extrato de betalaina na fase aquosa da microemulsão, que se mostrou estável e foi utilizada para produzir microcápsulas liofilizadas. A distribuição de tamanho de partícula, morfologia, retenção de betalaina e parâmetros de cor foram medidos, além de um teste de estabilidade de armazenamento para avaliar a degradação do corante em condições controladas de temperatura e umidade relativa. Após 48 dias, observou-se uma retenção de betalaina de 62%, com ligeiras alterações de cor. Palavras chaves: Microemulsão, condutividade elétrica, distribuição de tamanho de particula, SAXS. i Abstract i ABSTRACT The microemulsions (MEs) are isotropic and thermodynamically stable mixtures between two immiscible solvents stabilized by surfactants with multiple applications in chemical, pharmaceutical and food industries. This work aims to evaluate two food grade surfactants – sorbitan monooleate (Span 80) and polysorbate 80 (Tween 80) – on formation of MEs, with addition of propylene glycol as cosurfactant and posterior characterization of the resulting system. The study prioritized the isotropic phase formed in the MEs, since their properties investigated by electric conductivity, differential scanning calorimetric and specific heat. Seven systems were obtained and identified as MEs along the dilution lines from surfactant:oil ratios of 9:1 and 8:2, up 20% of water. The systems obtained showed low conductivity, Newtonian behavior of typical microemulsion and, system oil in water (O/W) from a qualitative analysis. Analyses of SAXS shows a size ranging from ≈70 Å to ≈90 Å, with a shape defined as flattened globular and/or core-shell form. Once obtained and characterized the MEs, different contents of betalaine extract were incorporated into the aqueous phase of the microemulsion until the stabilization and mixture with wall materials to produce microcapsules by lyophilized process. Particle size distribution, morphology, betalain retention and color analyses were determined in the betalain microcapsules. In addition, a storage stability test to evaluate the degradation of the dye under controlled conditions of temperature and relative humidity, observing after 48 days, retention values of 62% with slight color changes. Keywords: Microemulsion, electric conductivity, particle size distribution, SAXS. Sumario iii SUMÁRIO RESUMO............................................................................................................................... i ABSTRACT.......................................................................................................................... ii SUMÁRIO............................................................................................................................. iii ÍNDICE DE TABELAS........................................................................................................ iv ÍNDICE DE FIGURAS........................................................................................................ v INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 1 CAPITULO 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................. 10 1.1 DISPERSÕES COLOIDAIS....................................................................................... 11 1.2 MICROEMULSÕES................................................................................................... 11 1.3 NANOEMULSÕES..................................................................................................... 13 1.4 SIMILITUDES E DIFERENÇAS ENTRE NANO E MICROEMULSÕES.............. 13 1.4.1. Composição......................................................................................................... 13 1.4.2. Dimensão das partículas...................................................................................... 14 1.4.3. Estrutura da partícula........................................................................................... 15 1.4.4. Método de fabricação.......................................................................................... 15 1.4.5 Estabilidade a longo prazo................................................................................... 16 1.5 SURFACTANTES....................................................................................................... 17 1.6 CLASSIFICAÇÃO GERAL DE SURFACTANTES.................................................. 20 1.6.1 Surfactantes aniônicos……………….………………………………………..... 20 1.6.2. Surfactantes catiônicos........................................................................................ 20 1.6.3. Surfactante anfotéricos (zwiteriônicos)............................................................... 21 1.6.3.1 Lecitina.......................................................................................................... 21 1.6.4 Surfactantes não-iônicos...................................................................................... 22 1.6.4.1 Ésteres de sorbitano e seus derivados etoxilados (Spans e Tweens)........... 22 1.6.4.2 Monooleato de Sorbitan (Span 80).............................................................. 22 1.6.4.3 Polissorbato 80 (Tween-80)......................................................................... 23 1.6.4.4 Poliglicerol–poliricinoleato (PGPR)........................................................... 24 1.7 COSURFACTANTE................................................................................................... 24 1.7.1. Propilenoglicol (PG).......................................................................................... 25 1.8 ÓLEO DE SOJA.......................................................................................................... 25 1.9 TEORIAS DA FORMAÇÃO DA MICROEMULSÃO E ESTABILIZAÇÃO.......... 26 1.10 TIPOS DE MICROEMULSÕES............................................................................... 28 1.10.1 Microemulsões W/O.......................................................................................... 28 1.10.2. Microemulsões O/W......................................................................................... 29 1.10.3. Fase bicontínua.................................................................................................. 30 1.11 FENÔMENO DE PERCOLAÇÃO........................................................................... 31 1.12 CLASSIFICAÇÃO DE WINSOR PARA SISTEMAS MICROEMULSIONADOS............................................................................................... 32 1.13 CARACTERIZAÇÃO DE MICROEMULSÕES..................................................... 33 1.13.1 Ressonância magnética nuclear (RMN)............................................................ 34 1.13.2 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos....................................................... 35 1.14 MICROENCAPSULAÇÃO...................................................................................... 35 1.14.1 Microencapsulação por coacervação complexa................................................ 36 1.14.2 Agentes encapsulantes....................................................................................... 37 1.14.2.1 Goma Arábica........................................................................................... 37 1.14.2.2 Gelatina..................................................................................................... 38 1.15 BETALAÍNA............................................................................................................. 39 Sumario iii 1.16 REFERÊNCIAS......................................................................................................... 41 CAPITULO 2. Microemulsão de grau alimentar à base de tween 80 + span 80 + propileno glicol / óleo de soja / água: condutividade eléctrica, propriedades térmicas e reológicas................................................................................................................................ 59 ABSTRACT........................................................................................................................... 60 2.1 INTRODUCTION....................................................................................................... 61 2.2. MATERIAL AND METHODS................................................................................. 62 2.2.1 Raw materials....................................................................................................... 62 2.2.2 Phase diagram construction.................................................................................. 63 2.2.3 Characterization by chemical diffusion............................................................... 63 2.2.4 Characterization by electrical conductivity.......................................................... 63 2.2.5 Thermal characterization...................................................................................... 64 2.2.5.1 Determination of free, interfacial, bound, and unfreezable water contents..................................................................................................................... 64 2.2.5.2 Determination of the specific heat................................................................ 65 2.2.6 Rheological characterization…………………………………………………… 65 2.2.7 Statistical analysis……………………………………………………………… 66 2.3. RESULTS AND DISCUSSION................................................................................ 66 2.3.1 Pseudo-ternary phase diagram............................................................................ 66 2.3.2 Chemical characterization.................................................................................... 68 2.3.3 Electrical conductivity …………………………………………………………. 69 2.3.4 Thermal results..................................................................................................... 71 2.3.4.1 Free, interfacial, bound, and unfreezable water contents………………… 71 2.3.4.2 Specific heat of the MEs…………………………………………………... 74 2.3.5 Rheological characterization…………………………………………………… 75 2.4. CONCLUSIONS………………………………………………………………........ 77 2.5 ACKNOWLEDGEMENTS........................................................................................ 78 2.6 REFERENCES................................................................................................................. 78 CAPITULO 3. Medidas de SAXS e análise de dados das microemulsões…….………….. 84 3.1 INTRODUÇÃO……………………………………………………………………... 85 3.2 MÉTODO EXPERIMENTAL…………………………………………………........ 85 3.3 MATERIAIS……………………………………………………………………….. 86 3.4 PROCEDIMENTOS PARA ANÁLISE DOS DADOS……………………………. 87 3.4.1 Informações iniciais…………………………………………………………… 87 3.4.2 Análise dos dados de SAXS de microemulsão……………………………….. 91 3.5 RESULTADOS……………………………………………………………………... 92 3.6 CONCLUSÕES……………………………………………………………………... 103 3.7 REFERÊNCIAS…………………………………………………………………...... 103 CAPITULO 4. Incorporação de extrato de betalaina em uma microemulsão e subseqüente encapsulação por coacervação complexa.......................................................... 106 ABSTRACT........................................................................................................................... 107 4.1.INTRODUCTION....................................................................................................... 108 4.2 MATERIAL AND METHODS.................................................................................. 110 4.2.1 Materials............................................................................................................. 110 4.2.2 Preparation of microemulsions........................................................................... 110 4.2.3 Microencapsulation by complex coacervation.................................................... 111 4.2.4 Characterization of the microcapsules................................................................ 112 4.2.4.1 Color measurements.................................................................................... 112 4.2.4.2 Particle size distribution.............................................................................. 112 4.2.4.3Scanning electron microscopy (SEM)............................................................................................................. 112 Sumario iii 4.2.4.4 Quantification of total betalains in the microcapsules................................................................................................................... 113 4.2.4.5 Powder storage............................................................................................. 114 4.3 RESULTS AND DISCUSSION................................................................................. 114 4.3.1 Color measurements............................................................................................. 114 4.3.2 Particle size distribution....................................................................................... 116 4.3.3 Particle morphology............................................................................................. 117 4.3.4 Betalain retention during storage of microcapsules............................................. 118 4.4 CONCLUSIONS ........................................................................................................ 122 4.5 ACKNOWLEDGEMENTS......................................................................................... 122 4.6 REFERENCES………………………………………………………………………. 122 5.0 CONCLUSÃO GERAL………………………………………………………........... 127 APÊNDICE I………………………………………………………………………………. 128 APÊNDICE II……………………………………………………………………………... 142 APÊNDICE III……………………………………………………………………………. 152 Índice de Figuras | v ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1. Estruturas que podem ser formadas no auto empacotamento do surfactante.............................................................................................................................. 19 Figura 1.2. Formula química do Span 80............................................................................ 23 Figura 1.3. Formula química do Tween 80: polioxietileno (20) sorbitan mono oleato...................................................................................................................................... 23 Figura 1.4. (a) Fórmula química do PGPR, na qual R é um hidrogênio, ácido ricinoleico ou ácido polyricinoleico (b) Fórmula química do ácido ricinoleico............................................................................................................................... 24 Figura 1.5 Formula química do Propilenoglicol.................................................................. 25 Figura 1.6 Microemulsão W/O............................................................................................ 29 Figura 1.7 Microemulsões O/W consistem de micelas de surcfactante com moleculas de oleo incorporados dentro deles. (a) Moleculas de óleo incorporadas na cauda do surfactante, (b) Molecuas de óleo incorporadas como nucleo hidrofobico............................................................................................................................. 30 Figura 1.8. Fase bicontínua.................................................................................................. 30 Figura 1.9. Sistema de classificação de Winsor mostra as possíveis fases óleo e água em sistemas de microemulsões.................................................................................................... 32 Figura 1.10. Diagrama de fases ternário da mistura de água e óleo-surfactante representando a classificação de Winsor e estruturas internas prováveis................................................................................................................................ 33 Figura 1.11. Formula quimica (a) Betacianinas e (b) Betaxantinas..................................... 39 Figure 2.1. Pseudo-ternary phase diagram of Tween 80+Span 80+PG/soybean oil/water system. PS: Phase separation; ME: Microemulsion............................................................... 67 Figure 2.2. Thermograms of the MEs at the at surfactant to oil ratio of 9:1 (a), and 8:2 (b), with water contents of 5 to 20 %, and mixtures of Tween 80+Span 80+PG/soybean oil without water (c)................................................................................................................... 71 Figure 2.3. Specific heat capacity of the MEs at surfactant to oil ratio of 9:1 (a) and 8:2 (b) as a function of the temperature and water content............................................................... 74 Figure 2.4. Experimental rheograms of the MEs at surfactant to oil ratio of 8:2 at different water contents,5 % (a), 10 % (b), 15 % (c), 20% (d) and ratio of 9:1 at different water contents, 5 % (e), 10 % (f), 15 % (g), temperatures of 25 oC (*), 30 oC (○), 40 oC ( ), 50 oC (□) and 60 oC (+)……………………………………………………….......................... 76 Figura 3.1 Equipamento usado na realização dos experimentos de SAXS. O feixe de raios X é produzido na fonte, é colimado e incide na amostra, que está colocada em vácuo. O espalhamento do feixe pela amostra é coletado pelo detector……………………………… 86 Figura 3.2 A) Espalhamento da água medido em várias temperaturas. No intervalo de q utilizado, a água não apresenta auto-organização. B) Espalhamento do óleo medido em diferentes temperaturas. O óleo apresenta um pico de correlação em q≅0,28 Å^(-1) indicando auto-organização. C) Espalhamento do Tween 80 medido em diferentes temperaturas. O Tween 80 apresenta um pico de correlação em q≅0,12 Å^(-1) indicando auto-organização…………………………………………………………………………… 87 Figura 3.3 Feixe de raios X espalhado por uma partícula, fixa no espaço, formando um ângulo 2θ em relação ao feixe incidente. …………………………………………………. 88 Figura 3.4 Cada estrutura mostrada à direita (esfera, cilindro, prisma...) possui um único perfil de intensidade assim como um único perfil de p(r)………………………………….. 90 Figura 3.5 –Contribuição dos fatores de forma e estrutura para diferentes sistemas…………………………………………………..…………………………………. 91 Índice de Figuras | v Figura 3.6 Exemplo de análise dos dados usando o programa WGIFT. A) Dado ajustado. B) Função p(r) obtida pela Transformada Indireta de Fourier (IFT) do fator de forma P(q)…………………………………………………………………………………………. 92 Figura 3.7 Dados experimentais de SAXS obtidos para todas as séries estudadas com variação de temperatura………………………………………………... .………………… 93 Figura 3.8 Série 821. A) Curvas experimentais de SAXS ajustadas com o Método GIFT. B) Fator de forma P(q). C) Fator de estrutura S(q). D) Função p(r). ................................... 94 Figura 3.9 Série 822. A) Curvas experimentais de SAXS ajustadas com o Método GIFT. B) Fator de forma P(q). C) Fator de estrutura S(q). D) Função p(r). ……………………… 94 Figura 3.10 Série 823. A) Curvas experimentais de SAXS ajustadas com o Método GIFT. B) Fator de forma P(q). C) Fator de estrutura S(q). D) Função p(r)……………….............. 95 Figura 3.11 Série 824. A) Curvas experimentais de SAXS ajustadas com o Método GIFT. B) Fator de forma P(q). C) Fator de estrutura S(q). D) Função p(r)……………….............. 95 Figura 3.12 Série 911. A) Curvas experimentais de SAXS ajustadas com o Método GIFT. B) Fator de forma P(q). C) Fator de estrutura S(q). D) Função p(r)………………............... 96 Figura 3.13 Série 912. A) Curvas experimentais de SAXS ajustadas com o Método GIFT. B) Fator de forma P(q). C) Fator de estrutura S(q). D) Função p(r)………………............... 96 Figura 3.14 Série 913. A) Curvas experimentais de SAXS ajustadas com o Método GIFT. B) Fator de forma P(q). C) Fator de estrutura S(q). D) Função p(r)………………………. 97 Figura 3.15 Valores do parâmetro R_HS (raio de interação) em função da temperatura para todas as séries de microemulsão estudadas…………………………………………………. 98 Figura 3.16 Valores do parâmetro ϕ (fração de volume ocupado pelas partículas) em função da temperatura para todas as séries de microemulsão estudadas………………….. 99 Figura 3.17 Valores calculados para a densidade de partículas, 𝑵𝒑 𝝁𝒎𝟑, a partir dos parâmetros de ajuste RHS e ϕ…………………………………………………………………………….. 102 Figure 4.1. Images of freeze-dried microcapsules produced by complex coacervation with different % of betalain extract in the microemulsion aqueous phase. (a) 10 %; (b) 20 %; (c) 30 %; (d) 40 %; (e) 50 %....................................................................................................... 115 Figure 4.2- Particle size distribution of freeze-dried microcapsules produced by complex coacervation with different % of betalain extract in the microemulsion aqueous phase. (●) 10%; ( ) 20%; (□) 30%; (*) 40%; (+) 50%.......................................................................... 117 Figure 4.3 Micrographs (500x magnification) of freeze-dried microcapsules produced by complex coacervation with different % of betalain extract in the microemulsion aqueous phase. (a) 10 %; (b) 20 %; (c) 30 %; (d) 40 %; (e) 50 %....................................................... 118 Figure 4.4. Total betalain retention in freeze-dried microcapsules produced by complex coacervation of microemulsion containing 30 % betalain extract and stored at 25 °C and 33 % relative humidity............................................................................................................... 119 Índice de Tabelas | iv ÍNDICE DE TABELAS Table 2.1. Electrical conductivity, at 25 °C and viscosity values at 25°C, 30°C, 40°C, 50°C and 60°C for Tween 80+Span 80+PG/soybean oil/water MEs at the surfactant to oil ratios 9:1 and 8:2 with water contents between 5 and 20 %........................................ 70 Table 2.2. Thermal behavior of MEs and mass fractions of free water, interfacial water, bound water and non-freezable water at the surfactant to oil ratios 9:1 and 8:2, at different water contents measured by DSC....................................................................... 73 Tabela 3.1 Descrição das amostras usadas nos experimentos.......................................... 86 Tabela 3.2 Valores do parâmetro RHS (raio de interação) usado na modelagem dos dados de SAXS................................................................................................................. 98 Tabela 3.3 Valores do parâmetro σ (tem relação com a polidispersidade de tamanho de partícula) usado na modelagem dos dados de SAXS........................................................ 99 Tabela 3.4 Valores do parâmetro ϕ (fração de volume ocupado pelas partículas) usado na modelagem dos dados de SAXS................................................................................. 100 Tabela 3.5 Valores do parâmetro 𝑵𝒑 𝝁𝒎𝟑 calculado a partir dos parâmetros 𝑹𝑯𝑺 e 𝝓......... 102 Table 4.1. Mean diameter D[4,3] and color parameters of the freeze-dried microcapsules produced by complex coacervation with different % of betalain extract in the microemulsion aqueous phase…………………………………………………… 115 Table 4.2. Color parameters, moisture content and total betalain retention in freeze- dried microcapsules produced by complex coacervation of microemulsion containing 30 % betalain extract and stored at 25 °C and 33 % relative humidity............................. 120 Introdução Geral | 1 ____________________________________________________________________________________________________ Introdução Geral INTRODUÇÃO GERAL As microemulsões (MEs) são sistemas termodinamicamente estáveis que consistem tipicamente de óleo, surfactante (às vezes co-surfactante/co-solvente) e água (GARTI et al., 2001; RAO; MCCLEMENTS, 2011). Esses sistemas podem ser classificados como do tipo água em óleo (W/O), fase bicontínua ou óleo em água (O/W) em função da sua microestrutura, que é influenciada pelas propriedades físico-químicas de seus ingredientes. As MEs são caracterizadas por ultra baixa tensão interfacial entre as fases imiscíveis e oferecem a vantagem de formação espontânea, estabilidade termodinâmica, simplicidade de fabricação, capacidade de solubilização de solutos lipofílicos, hidrofílicos e anfifílicos, grande área de transferência de massa por unidade de volume, e potencial de aumento de permeação (BURGUERA; BURGUERA, 2012; FANUN, 2012). As características das MEs têm atraído uma atenção considerável, principalmente devido a sua capacidade para solubilizar grandes quantidades de aditivos hidrofílicos ou lipofílicos, para aumentar a eficiência e para permitir reações químicas como as reações de preparação de partículas inorgânicas ou polimerização de monômeros orgânicos. No entanto, os ingredientes e a composição do sistema são extremamente importantes na formação de microemulsão e da sua funcionalidade (FASOLIN et al., 2012). A capacidade de aumentar a solubilidade das vitaminas hidrofílicas, sabor e outros aditivos em MEs W/O são de grande interesse tecnológico, uma vez que estas podem fornecer radicais estabilizados pela incorporação desses ingredientes e protegê-los de reações de degradação. Por outro lado, pouco se conhece sobre a formação de MEs utilizando apenas materiais de grau alimentício, caso em que essas gotículas poderiam ser utilizadas, por exemplo, para solubilizar aditivos polares hidrofóbicos ou hidrofílicos típicos de produtos alimentícios (POLIZELLI et al., 2006; RAO; MCCLEMENTS, 2011). A escolha do surfactante é crítica para a formulação de MEs. O equilíbrio hidrofílico- lipofílico (EHL) do surfactante pode ser ajustado por um álcool de cadeia curta, ou seja, adicionando um surfactante não-iônico para a preparação de microemulsão estável (LIN et al., 2009). O crescente interesse em MEs como veículos para formulações de alimentos decorre, principalmente, das vantagens de suas propriedades físico-químicas. No entanto, a maioria Introdução Geral | 2 ____________________________________________________________________________________________________ Introdução Geral dos estudos sobre MEs W/O e O/W têm se concentrado em hidrocarbonetos e sistemas surfactantes iônicos, e poucos trabalhos têm sido relacionados com a formação de MEs com materiais de grau alimentar, sendo que a escolha adequada de surfactantes para a formação de MEs de grau alimentício W/O é bastante limitada (FENG et al., 2009). Assim, um estudo para compreender as interações entre água, óleo e emulsificante na interface e os fatores que afetam a estabilidade da emulsão permitiria a produção de emulsões estáveis W/O e, portanto, incentivaria o desenvolvimento de novos produtos e aplicações (USHIKUBO; CUNHA, 2012). Devido à sua capacidade para solubilizar os aditivos do núcleo, as microemulsões são usadas como um agente solubilizante em aplicações tais como (MITTAL; SHAH, 2002):  Dispersar aditivos solúveis em óleo em alimentos e bebidas à base de água;  Dispersar aditivos solúveis em água, em alimentos à base de óleo;  Veiculação de sabores e aromas;  Aumentar a eficiência de antioxidantes;  Melhorar a cor dourada e a crocância durante o cozimento em micro-ondas;  Microemulsões para descongelamento rápido de um alimento congelado em um forno de micro-ondas;  Microemulsão de cera como uma barreira à umidade. Uma dessas aplicações seria como estrutura protetora de corantes naturais que sofrem altas taxas de degradação e oxidação. A cor é um dos atributos mais importantes dos alimentos, sendo considerado como um indicador de qualidade que determina frequentemente a sua aceitação. Em muitos alimentos coloridos naturalmente, tais como produtos à base de frutas, ocorrem perdas de cor durante o processamento, requerendo a utilização de corantes para restaurar a sua cor (RAVICHANDRAN et al., 2013). A natureza produz uma variedade de compostos adequados para a coloração de alimentos, tais como as antocianinas, betalaínas, ácido carmínico solúvel em água, bem como os carotenoides e alguns derivados das clorofilas solúveis em óleo. A maioria dos estudos de pigmentos naturais têm se centrado especialmente em carotenoides e antocianinas, cujas propriedades antioxidantes têm sido extensivamente estudadas devido a sua facilidade de obtenção na natureza. Já as betalaínas, devido à sua escassez, não foram muito exploradas como compostos bioativos, mas alguns estudos têm indicado o seu potencial como pigmentos Introdução Geral | 3 ____________________________________________________________________________________________________ Introdução Geral e antioxidantes (SPÓRNA-KUCAB et al., 2013; RAVICHANDRAN et al., 2014; VERGARA et al., 2014). Esses estudos têm ajudado a motivar a utilização de betalaínas como corantes alimentícios (AZEREDO, 2009). Apesar das antocianinas serem mais aplicadas para cobrir uma ampla gama de cores de roxo até vermelho, as betalaínas são mais estáveis ao pH, e portanto podem ser adequadas para alimentos com baixa acidez, onde o uso de antocianinas usualmente não é possível. Para a faixa de cor do amarelo ao alaranjado, os carotenos são os pigmentos naturais mais usados, mas devido à baixa solubilidade em água, a betaxantina poderia ser utilizada em alimentos com o mesmo propósito (RAVICHANDRAN et al., 2013). Por outro lado, os pigmentos naturais são sensíveis às condições ambientais e aos processos tecnológicos, tais como temperatura, pH, presença de oxigênio, atividade da água, luz, ultravioleta e radiação gama, presença de certos íons metálicos e enzimas redox (JANISZEWSKA, 2014). Tais dificuldades podem ser superadas pela microencapsulação. A microencapsulação pode ser definida como um processo no qual uma matriz envolve pequenas partículas de sólido, líquido ou gás com o objetivo de proteger o material das condições adversas do meio, tais como luz, umidade, oxigênio e interações com outros compostos, estabilizando o produto, aumentando a vida útil e promovendo a liberação controlada do encapsulado em condições pré-estabelecidas (SANTOS et al., 2005). Vários métodos são utilizados na produção de microcápsulas. Na indústria de alimentos, entre os métodos mais comuns utilizados encontram-se a secagem por spray- drying, recobrimento em leitos fluidizados, co-cristalização, emulsificação e coacervação complexa. O processo de coacervação complexa é particularmente adequado quando o objetivo é controlar a liberação do agente, produzindo uma cápsula verdadeira, que protege completamente o material ativo no interior do material de parede. A microencapsulação por coacervação complexa baseia-se na interação associativa que pode ocorrer como resultado da mistura de soluções de biopolímeros com cargas opostas. Em tal circunstância, a complexação entre biopolímeros tem lugar e conduz a uma separação agregativa de fases, em que as fases coexistentes apresentam a seguinte composição: uma fase rica em solvente com uma concentração muito pequena de biopolímeros e uma fase de precipitado rica em biopolímeros chamado de coacervado (DOUBLIER et al., 2000; DICKINSON, 2003; SANTOS et al., 2015). Introdução Geral | 4 ____________________________________________________________________________________________________ Introdução Geral A finalidade desta tecnologia é a estabilização de partículas, a proteção e/ou o isolamento do material do núcleo ativo do ambiente, permitindo que os materiais sejam manuseados com maior facilidade (BUTSTRAEN; SALAÜN, 2014). A incorporação da betalaína numa microemulsão W/O e sua posterior encapsulação por coacervação complexa visa à conservação das propriedades da betalaína, prolongando assim a vida de prateleira e as propriedades do corante. ORGANIZAÇÃO DO TRABALHO EM CAPÍTULOS O presente trabalho encontra-se estruturado da seguinte forma: Capítulo 1: Revisão bibliográfica: São apresentados os principais fundamentos teóricos que abrangem este estudo, incluindo informações referentes às definições de microemulsão e nanoemulsão, diferenças e similitudes entre os dois sistemas, definição de surfactantes, co-surfactantes, óleo de soja, teoria de formação de microemulsões, tipos de microemulsões, caracterização de microemulsões, agentes encapsulantes e aspectos gerais da betalaína. Capítulo 2: Microemulsão de grau alimentar à base de tween 80 + span 80 + propileno glicol / óleo de soja / água: condutividade eléctrica, propriedades térmicas e reológicas: Nesse capítulo estão descritas as metodologias de obtenção das microemulsões, assim como as análises de caracterização dos sistemas obtidos e os resultados e conclusões que fazem parte desse capítulo. Capítulo 3: Medidas de SAXS e análise de dados das microemulsões. Materiais, método experimental, desenvolvimento matemático através do método GIFT. Resultados e conclusão do capítulo. Capítulo 4. Incorporação de extrato de betalaina em uma microemulsão e subsequente encapsulação por coacervação complexa. Caracterização das microcápsulas por distribuição de tamanho, morfologia, cor, retenção e estabilidade das betalaínas. Resultados e conclusões do capítulo. Introdução Geral | 5 ____________________________________________________________________________________________________ Introdução Geral Apêndices I, II e III. São mostrados os testes preliminares com várias misturas de surfactante até a obtenção da mistura que deu origem a formação da microemulsão que foi estudada no Capítulo 2, onde podem ser encontradas também imagens de cada um dos testes feitos e a descrição das características, diagramas de fases e gráficos de índice de cremeação das diversas misturas. Introdução Geral | 6 ____________________________________________________________________________________________________ Introdução Geral OBJETIVOS OBJETIVO GERAL:  Estudar a formação de microemulsão W/O utilizando misturas de óleo de soja/surfactante e, se necessário, um co-surfactante, bem como a incorporação de extrato de betalaína à microemulsão para posterior encapsulação por coacervação complexa. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:  Identificar fases isotrópicas de microemulsão W/O a partir da construção de diagramas de fases ternários e pseudoternários de misturas água, surfactante:co-surfactante e óleo de soja comercial;  Investigar as estruturas formadas e tamanho das partículas por espalhamento de raios- X a baixos ângulos (SAXS);  Estudar a reologia das fases isotrópicas formadas por MEs W/O;  Estudar a incorporação de extrato de betalaína nas MEs W/O e seu efeito sobre a estrutura e estabilidade do sistema;  Estudar a formação de microcápsulas de betalaína incorporada nas MEs W/O pela metodologia de coacervação complexa em matrizes de gelatina/goma arábica;  Avaliar as microcápsulas obtidas, analisando sua morfologia, distribuição de tamanho, parâmetros de cor e estabilidade quanto à oxidação. Introdução Geral | 7 ____________________________________________________________________________________________________ Introdução Geral REFERÊNCIAS AZEREDO, H. M. C. 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Para certas aplicações, é desejável utilizar dispersões coloidais contendo partículas muito pequenas, uma vez que estas apresentam diversas vantagens potenciais em relação aos sistemas que contêm partículas maiores (MCCLEMENTS, 2012). Entre essas vantagens está a de maior estabilidade em relação à agregação das partículas e separação gravitacional (TADROS et al., 2004), conter partículas que apenas dispersam as ondas de luz (adequados para incorporação em produtos que necessitam ser opticamente transparentes, ou apenas ligeiramente turvos) (MASON et al., 2006), apresentar propriedades reológicas diferenciadas como, por exemplo, alta viscosidade ou características de gel (SONNEVILLE-AUBRUN et al., 2004) e, poder aumentar a biodisponibilidade de certos tipos de substâncias bioativas encapsuladas no interior das partículas (ACOSTA, 2009). As dispersões coloidais podem ser fabricadas a partir de óleo, água, surfactantes e co- surfactantes que são amplamente utilizados como sistemas de veiculação em diferentes indústrias. Os dois tipos mais comuns de dispersões coloidais que podem ser criados a partir desses componentes são microemulsões e nanoemulsões. Existem muitas semelhanças estruturais entre esses dois tipos de dispersões coloidais, mas também existem algumas diferenças importantes. No entanto, existe uma grande confusão sobre a natureza precisa desses sistemas, assim como erros generalizados na classificação das dispersões coloidais relatados na literatura científica (MCCLEMENTS, 2012). 1.2 MICROEMULSÕES O conceito de microemulsão (ME) foi introduzido no início dos anos de 1940 por Hoar e Schulman que geraram uma solução monofásica translúcida titulando uma emulsão leitosa com hexanol (HOAR; SCHULMAN, 1943). C a p í t u l o 1 | 12 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica As microemulsões são sistemas de dois líquidos imiscíveis, usualmente água e óleo, estabilizados por um filme interfacial de surfactantes localizados na interface óleo/água. A formulação de MEs geralmente envolve a combinação de três a cinco componentes: óleo, água, surfactante, co-surfactante ou co-solvente e eletrólito (PAUL; MOULIK, 1997; FLANAGAN; SINGH, 2006). Em um nível microscópico, diversas microestruturas, tais como gotículas de óleo dispersas numa fase contínua de água (O/W), fases bicontínuas, micelas e gotículas de água dispersas na fase contínua de óleo (W/O) podem ser formados, dependendo de vários fatores, tais como a natureza química do óleo e dos agentes surfactantes, a sua concentração e as condições físicas (temperatura, pressão, pH, força iônica, etc.). A água nas MEs pode ser substituída por outros solventes polares. A formação espontânea de domínios com dimensões nanométricas facilitou a sua utilização como nanoreatores para a produção de nanopartículas, devido à facilidade e baixo custo do processo de preparação (SOLANS; GARCÍA-CELMA, 1997; LÓPEZ-QUINTELA, 2003). Devido à natureza dinâmica desses sistemas, as MEs não devem ser consideradas como molduras rígidas que podem governar estritamente a forma e o tamanho das partículas sintetizadas. Devido ao movimento Browniano, as gotas das MEs nanométricas colidem constantemente e a troca de fase interna ocorre de forma contínua. Vários parâmetros, tais como a elasticidade da película de surfactante, a temperatura, a fração de volume da fase interna, etc., governam este processo de fissão-fusão. Portanto, a previsão do resultado do processo de formação de partículas é muito desafiadora e, muitas vezes, é baseada apenas no conhecimento experimental (LÓPEZ-QUINTELA et al., 2004; GRADZIELSKI, 2008). Hoar e Schulman em 1943 concluíram que a fase dispersa da ME consiste em gotas esféricas quase uniformes com diâmetros variando entre 8 e 80 nm, as quais foram determinadas através de raios-X de baixo ângulo, espalhamento de luz, ultracentrifugação, microscopia eletrônica e medidas de viscosidade. Estudos recentes realizados por Pramanik et al. (2011), Zhang et al. (2012), Bardhan et al. (2013), Kundu e Paul (2013) e Bardhan et al. (2014) também reportam MEs na faixa de tamanhos descritos por esses autores. Por essa razão, as MEs são relativamente translúcidas, ou seja, opticamente límpidas, o que se justifica pelo fato do diâmetro médio das gotículas ser menor do que o comprimento de onda da luz C a p í t u l o 1 | 13 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica incidente (λ = 390 – 750 nm), evitando o espalhamento da luz (KAWAKAMI et al., 2002; DAMASCENO et al., 2011; RAO; MCCLEMENTS, 2011). 1.3 NANOEMULSÕES Uma nanoemulsão pode ser considerada como uma emulsão convencional que contém partículas muito pequenas. Nanoemulsão pode ser do tipo óleo em água (O/W) ou água em óleo (W/O), dependendo se o óleo é disperso como gotículas em água, ou vice-versa. Uma nanoemulsão de óleo em água é definida como uma dispersão coloidal termodinamicamente instável que consiste de dois líquidos imiscíveis, com um dos líquidos a ser disperso como pequenas gotas esféricas (r < 100 nm) no outro líquido. Em princípio, uma nanoemulsão poderia ser formada a partir de óleo e de água sem o uso de um surfactante, no entanto, este sistema seria altamente instável e as gotas sofreriam coalescência, sendo necessário empregar um agente surfactante para facilitar a formação desta e para garantir a sua estabilidade cinética durante o armazenamento (MCCLEMENTS, 2015). Uma nanoemulsão é, portanto, geralmente preparada usando os mesmos componentes de uma microemulsão: óleo, água, surfactante e possivelmente um co-surfactante. A estrutura das partículas em uma nanoemulsão O/W também é muito similar à encontrada numa microemulsão: as caudas não polares das moléculas tensoativas orientam-se para o núcleo hidrofóbico formado pela fase óleo, enquanto que os grupos de cabeça polar das moléculas do surfactante se orientam para a fase aquosa envolvente. 1.4 SIMILITUDES E DIFERENÇAS ENTRE NANO E MICROEMULSÕES 1.4.1 Composição Os constituintes das nano e microemulsões são similares, incluindo a fase oleosa, fase aquosa, agente surfactante e possivelmente um agente co-surfactante, porém, em proporções C a p í t u l o 1 | 14 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica diferentes. Na preparação de uma microemulsão é necessária uma proporção maior de surfactante:óleo do que na preparação de uma nanoemulsão. A quantidade máxima de óleo que pode ser incorporada nas micelas de surfactantes depende das características das moléculas de óleo (por exemplo, o volume molar, geometria, polaridade), as características das moléculas de surfactante (por exemplo, grupo de cabeça, grupo da cauda), e as condições ambientais (temperatura, pH, força iônica). A quantidade máxima de óleo que pode ser incorporada numa dada massa de surfactante pode ser caracterizada por uma concentração de saturação (Csat*), que é a massa de óleo solubilizada por unidade de massa de agente surfactante sob condições ambientais especificas. Acima da concentração micelar crítica (CMC) de um agente surfactante, a quantidade máxima de óleo que pode ser incorporada nas micelas (Csat) varia de modo aproximadamente linear em função da concentração total de surfactante Eq.(1.1). Se a quantidade total de óleo presente no sistema está abaixo desse valor, então todas as moléculas de óleo serão solubilizadas e a microemulsão formada consistirá de micelas inchadas dispersas em água. Por outro lado, se a quantidade total de óleo presente no sistema é superior a esse valor, então ele não pode ser solubilizado por todas as micelas e qualquer gotícula de óleo adicional no sistema permanecerá intacta. No entanto, o tamanho das gotas pode mudar durante o armazenamento devido à floculação, coalescência e/ou fenômenos de maturação de Ostwald (MCCLEMENTS, 2012). 𝐶𝑇𝑜𝑡 = 𝐶𝑠𝑎𝑡 × (𝐶𝑇𝑜𝑡 − 𝐶𝑀𝐶) (1.1) 1.4.2 Dimensão das partículas Em relação à classificação das microemulsões e nanoemulsões, incongruências se devem principalmente ao prefixo usado para denota-las. O termo ''micro'' normalmente significa 10-6, enquanto o termo ''nano'' normalmente significa 10-9, o que implicaria que nanoemulsões contêm partículas menores do que aquelas em microemulsões. A razão para essa terminologia confusa é resultado do desenvolvimento histórico no campo da ciência dos coloides. Através de uma busca realizada na literatura on-line usando ''Web of Knowledge'' (Thomson Reuters) em outubro de 2011, descobriu que o primeiro artigo onde é utilizado o termo ''microemulsão'' foi publicado em 1961 (SCHULMAN; C a p í t u l o 1 | 15 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica MONTAGNE, 1961), enquanto que o primeiro artigo usando o termo ''nanoemulsão'' apareceu em 1996 (CALVO et al., 1996). 1.4.3 Estrutura da partícula As partículas em nanoemulsões tendem a ser esféricas, porque a tensão interfacial (γ) é relativamente elevada e o raio da partícula (r) é relativamente baixo, existindo assim uma pressão de Laplace (ΔPL- 2γ/r) relativamente grande a favor de uma redução da área interfacial: uma esfera tem a menor área interfacial para um dado volume de material (VAN OSS, 1992). Por outro lado, as partículas em microemulsões podem ser esféricas e não esféricas, dependendo da curvatura ótima da monocamada de agente surfactante e da quantidade de óleo incorporado no sistema (BIRDI, 2015). Isto porque a tensão interfacial da monocamada de surfactante é relativamente baixa para os sistemas de microemulsão. Assim, microemulsões O/W podem conter partículas que são esféricas ou em forma de minhoca, uma vez que isso permite que as moléculas de surfactante adotem sua configuração ideal. Portanto, é possível distinguir entre microemusões e nanoemulsões avaliando a forma das partículas presentes, utilizando métodos de microscopia e espalhamento de luz (MCCLEMENTS, 2012). 1.4.4 Método de fabricação Na formulação de nanoemulsões é muito importante a ordem de adição dos compostos: nanoemulsões são formadas somente se os surfactantes são misturados primeiro com a fase oleosa; se estes são misturados primeiro com a fase aquosa antes de adicionar a fase oleosa, apenas uma emulsão macroscópica será gerada. As microemulsões, por outro lado, serão estritamente idênticas qualquer que seja a ordem em que os compostos são misturados (após o tempo de equilíbrio). Este ponto é muito importante e constitui um teste preliminar para caracterizar a natureza da dispersão obtida (ANTON; VANDAMME, 2010). Além disso, o método normalmente utilizado para caracterizar nano-sistemas também pode afetar fortemente as propriedades estruturais das amostras. O espalhamento de luz dinâmica (DLS) proporciona a distribuição do tamanho das dispersões, e muitas vezes requer C a p í t u l o 1 | 16 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica uma diluição da amostra antes da medição, sendo que esta diluição, no caso de microemulsões, resulta numa modificação do tamanho das micelas inchadas, que simplesmente invalida a caracterização e pode até mesmo conduzir à destruição das micelas. No caso de nanoemulsões, tal diluição não tem influência sobre o tamanho das gotículas e a distribuição de tamanho (ANTON; VANDAMME, 2010). Para alguns sistemas de agentes surfactantes, óleo e água, existem grandes semelhanças entre os métodos de fabricação que podem ser utilizados para produzir microemulsões e nanoemulsões. No método de emulsificação espontânea, uma dispersão coloidal opticamente transparente é formada quando uma mistura de surfactante e de óleo é adicionada a uma solução aquosa com agitação suave. Do mesmo modo, no método da temperatura de inversão de fase (TIP), uma dispersão coloidal opticamente transparente é formada quando uma mistura de agente surfactante, óleo e água é aquecida perto da temperatura de inversão de fase, e em seguida, o sistema é resfriado com agitação contínua. As dispersões coloidais formadas usando essas duas abordagens podem ser ou não microemulsões e nanoemulsões, dependendo da proporção de óleo e surfactante, onde a maior proporção dos dois dará origem a uma microemulsão e em uma baixa proporção será formada uma nanoemulsão. 1.4.5 Estabilidade a longo prazo Uma microemulsão é termodinamicamente estável em determinadas condições e, portanto, deve permanecer estável indefinidamente, desde que essas condições iniciais não sejam alteradas. O conhecimento sobre a influência da composição do sistema e da temperatura sobre o comportamento da fase dos sistemas surfactante-óleo-água é crucial para o desenvolvimento de sistemas bem sucedidos. Assim, as microemulsões têm uma energia livre menor (ΔG) do que o estado de fases separadas, enquanto nanoemulsões têm uma energia livre superior. Os dois estados são separados por uma energia de ativação (Ea). O nível dessa diferença de energias é determinado principalmente por fenômenos físico- químicos que impedem a aproximação das gotículas no sistema, através da repulsão hidrodinâmica e coloidal (por exemplo, estérica e eletrostática) e interações entre gotículas. A taxa à qual uma nanoemulsão reverte para as fases separadas também é determinada pela C a p í t u l o 1 | 17 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica frequência com que as gotículas de óleo entram em contato umas com as outras, o que depende do mecanismo principal responsável pelos contatos entre partículas (tais como o movimento Browniano ou forças gravitacionais) (MCCLEMENTS, 2012). 1.5 SURFACTANTES Os agentes de superfície (geralmente referidos como surfactantes) são moléculas anfipáticas que consistem de uma porção hidrófoba não polar, geralmente um hidrocarboneto ou fluorocarboneto de cadeia linear ou ramificada contendo entre 8 – 18 átomos de carbono, ligados a uma porção polar ou iônica (hidrofílica). A porção hidrofílica pode, por conseguinte, ser não-iônica, iônica ou zwiteriônica, acompanhada de contra-íons nos últimos dois casos. A cadeia de hidrocarboneto interage fracamente com as moléculas de água em um meio aquoso, enquanto que o grupo de cabeça polar ou iônico interage fortemente com as moléculas de água através de interações dipolo ou íon-dipolo. É está forte interação com as moléculas de água que torna os agentes surfactantes solúveis em água. No entanto, a ação cooperativa de dispersão e de ligação de hidrogênio entre as moléculas de água tende a apertar a cadeia de hidrocarboneto para fora da água e, portanto, essas cadeias são referidas como hidrofóbicas (TADROS, 2005). Um surfactante é definido como uma substância que reduz a tensão superficial entre óleo-água ou ar-água, aumentando assim a emulsificação e a estabilidade da emulsão. Muitos lipídeos polares nativos e proteínas identificam-se com esta definição. Surfactantes alimentícios, por outro lado, não afetam o processo de emulsificação de forma significativa, mas têm outras funções relacionadas com as propriedades interfaciais que afetam a estabilidade da emulsão. Além disso, os emulsionantes alimentícios têm outras funções em alimentos, tais como a modificação de cristalização de gordura, interações com os componentes de hidratos de carbono, ou agir como substâncias de formação de película, controlando oxigênio ou transporte da umidade, sendo que essas propriedades não estão relacionadas com a definição clássica de um surfactante (FLEMMING VANG; NIELS, 2003). C a p í t u l o 1 | 18 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica Alguns surfactantes naturais como a lecitina da gema do ovo e várias proteínas do leite são usados para a preparação de muitos produtos alimentícios como maionese, cremes, molhos para saladas, sobremesas, etc. Além desses materiais, os lipídeos polares como monoglicerídeos foram introduzidos como agentes emulsionantes nas matrizes alimentícias. Dessa forma, o estudo da formação das emulsões, suas estruturas e propriedades são essenciais para sua aplicação em alimentos (KRALOVA; SJOBLOM, 2009). O valor de Equilíbrio Hidrofílico-Lipofílico (EHL) de um surfactante dá uma indicação útil da sua solubilidade nas fases de óleo e/ou água e pode ser utilizado para prever o tipo de emulsão que irá ser formada (DAVIS, 1994). Um surfactante com baixo EHL, entre 3 – 6, é predominantemente solúvel em óleo, estabiliza emulsões W/O e forma micelas reversas em óleo. Um surfactante com alto EHL, entre 8 – 18, é hidrofílico, dissolve preferencialmente em água, estabiliza emulsões O/W e pode formar micelas em água. Um surfactante com um EHL intermediário, entre 6 – 8, não tem preferência por água ou óleo (BECHER, 1977; WALSTRA, 2005). Portanto, para a formação de uma ME, o surfactante escolhido deve:  Levar a tensão interfacial para um valor muito pequeno para auxiliar no processo de dispersão durante a preparação da microemulsão;  Proporcionar uma película flexível, que pode facilmente deformar-se ao redor das pequenas gotículas;  Ter o caráter hidrofílico-lipofílico apropriado para proporcionar a curvatura correta para a região interfacial do tipo desejado de microemulsão: O/W, W/O ou bicontínua. Essas condições são alcançadas de várias formas, por exemplo, usando uma combinação de um surfactante aniônico ou catiônico de elevado EHL com um agente co- surfactante de baixo EHL ou um surfactante com ligações duplas de composição molecular apropriada (SURABHI et al., 2010). O auto empacotamento do surfactante leva à formação de uma gama de estruturas diferentes, das quais algumas são mostrados na Figura 1.1. C a p í t u l o 1 | 19 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica Figura 1.1 – Estruturas que podem ser formadas no auto empacotamento do surfactante. Fonte: Holmberg et al. (2003). Na Figura 1.1, cada tipo de forma descreve: (a) Micelas esféricas com um interior composto de cadeias de hidrocarboneto e superfície de grupos de cabeça polar de frente para a água. As micelas esféricas são caraterizadas por quantidades baixas de surfactante (parâmetro crítico de empacotamento) e uma curvatura espontânea fortemente positiva. O núcleo de hidrocarboneto tem um raio perto do comprimento da cadeia de alquilo estendida; (b) Micelas cilíndricas com um interior composto de cadeias de hidrocarboneto e superfície de grupos de cabeça polar de frente para a água. A seção transversal do núcleo de hidrocarboneto é similar às micelas esféricas. O comprimento micelar é altamente variável de modo que essas micelas são polidispersas; C a p í t u l o 1 | 20 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica (c) Bicamadas de surfactante que formam cristais líquidos lamelares para sistemas surfactante-água de um núcleo de hidrocarboneto com uma espessura de 80% do comprimento de duas cadeias de hidrocarboneto estendidas; (d) Micelas reversas ou invertidas que têm um núcleo de água cercado por grupos de cabeça polar do surfactante. As cadeias acila, juntamente com um solvente não polar formam o meio contínuo. Como micelas "normais", eles podem crescer em cilindros; (e) Uma estrutura bicontínua com as moléculas de agente surfactante agregados em filmes ligados, caracterizadas por duas curvaturas de sinal oposto. A curvatura média é pequena (zero para uma estrutura de superfície mínima); (f) As vesículas são construídas a partir de camadas duplas semelhantes às da fase lamelar e caracterizam-se por dois compartimentos distintos de água, com uma formação do núcleo e um meio externo. 1.6 CLASSIFICAÇÃO GERAL DE SURFACTANTES 1.6.1 Surfactantes aniônicos Formam a classe de surfactantes mais amplamente utilizados em aplicações industriais, devido a seu baixo custo de fabricação, sendo utilizados em praticamente todo tipo de detergente. Para uma ótima detergência da cadeia hidrofóbica, um grupo alquilo linear deve estar contido na faixa de 12 a 16 dos átomos de carbono da cadeia. Os grupos hidrofílicos utilizados mais comumente são carboxilas, sulfatos, sulfonatos e fosfatos (TADROS, 2005). 1.6.2 Surfactantes catiônicos Os surfactantes catiônicos mais comuns são os compostos de amônio quaternário (JUNGERMAN, 1970; RUBINGH, 1991), com a fórmula geral R’R”R’”R””N+X-, onde X- normalmente é de íons cloreto e R representa grupos alquilo. Eles geralmente são compatíveis C a p í t u l o 1 | 21 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica com a maioria dos íons inorgânicos e água dura, mas são incompatíveis com metassilicatos e fosfatos altamente condensados. Eles também são incompatíveis com materiais proteicos semelhantes. Catiônicos são geralmente estáveis a mudanças de pH, tanto ácida como alcalina. São incompatíveis com a maioria dos agentes surfactantes aniônicos, mas são compatíveis com os não-iônicos. Os surfactantes catiônicos são insolúveis em óleos de hidrocarbonetos (TADROS, 2005). 1.6.3 Surfactante anfotérico (zwiteriônicos) Estes são agentes surfactantes que contêm tanto grupos catiônicos quanto aniônicos (BUESTEIN; HILITON, 1982). A característica principal dos surfactantes anfotéricos é a sua dependência do pH da solução em que são dissolvidos. Em soluções de pH ácido, a molécula adquire uma carga positiva e comporta-se como um agente surfactante catiônico, ao passo que em meio alcalino, as soluções de pH tornam-se negativamente carregadas e se comportam como um surfactante aniônico. Um pH específico pode ser definido em que ambos os grupos iônicos mostram igual ionização (o ponto isoelétrico da molécula). Anfotéricos são muitas vezes referidos como moléculas zwiteriônicas. Eles são solúveis em água, mas a solubilidade mostra um mínimo no ponto isoelétrico. Anfóteros mostram uma excelente compatibilidade com outros agentes surfactantes, formando micelas mistas. Eles são quimicamente estáveis tanto em ácidos quanto em álcalis (TADROS, 2005). 1.6.3.1 Lecitina A lecitina é um surfactante zwiteriônico, muito usado como emulsificante em alimentos (HASENHUETTL; HARTEL, 1997). É solúvel em óleos minerais, mas insolúvel em óleos vegetais não aquecidos. É também altamente insolúvel, mas dispersível em água (USHIKUBO; CUNHA, 2014). As lecitinas são constituídas por fosfolípidos e esfingolípidos (esfingosina e fitoesfingosina) e são extraídas de produtos como soja, trigo, aveia, ovos, entre outros (KRALOVA; SJOBLOM, 2009). Essa mistura de lipídios confere à lecitina características como temperatura de transição do estado gel para o líquido cristalino, nas bicamadas de lecitina, ao redor de -5 °C. A adição de óleo em lecitina/água tende a desestabilizar a fase lamelar, favorecendo a formação de emulsões (LIN et al., 2009). C a p í t u l o 1 | 22 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 1.6.4 Surfactantes não-iônicos Os surfactantes não iônicos mais comuns são os baseados em óxido de etileno, referindo-se como surfactantes etoxilados. Vários tipos podem ser distinguidos: álcool etoxilado, alquil fenol etoxilado, ácidos graxos etoxilados, ésteres graxos de sorbitano, aminas etoxiladas e copolímeros de óxido de etileno e de óxido de propileno (por vezes referidos como surfactantes poliméricos), etc. (SCHICK, 1966; SCHONFELDT, 1970; SCHICK, 1987). 1.6.4.1 Ésteres de sorbitano e seus derivados etoxilados (Spans e Tweens) Ésteres de ácidos graxos de sorbitano, conhecidos comercialmente como Spans, e seus derivados etoxilados, conhecidos como Tweens, são talvez os surfactantes não-iônicos mais usados. Os ésteres de sorbitano são produzidos fazendo reagir o sorbitol com um ácido graxo a uma temperatura elevada (> 200°C). O sorbitol desidrata a 1,4-sorbitano e, em seguida, a esterificação ocorre. Se um mol de ácido graxo se faz reagir com um mol de sorbitol, obtém- se um monoéster (alguns diésteres também são produzidos como subprodutos). Os derivados etoxilados de Spans (Tweens) são produzidos pela reação de óxido de etileno em qualquer grupo hidroxilo restante do grupo de éster de sorbitano. Alternativamente, o sorbitol é etoxilado, seguido de esterificação. No entanto, o produto final tem propriedades tensoativas diferentes para os Tweens. Os ésteres de sorbitano são insolúveis em água, mas solúveis na maior parte dos solventes orgânicos (baixo EHL). Os produtos etoxilados são geralmente solúveis em água e têm números de EHL relativamente elevados. Uma das principais vantagens dos ésteres de sorbitano etoxilados e seus derivados é seu uso como aditivos alimentares. Eles também são amplamente utilizados em alguns cosméticos e preparações farmacêuticas. 1.6.4.2 Monooleato de Sorbitano (Span 80) O monooleato de sorbitano (EHL: 4,3) é uma mistura de ésteres parciais de sorbitol mono e dianidridos de ácido oleico (Figura 1.2) como constituinte principal e 1,4- monooleato de sorbitano, sorbitano dioleato e sorbitano trioleato em menor quantidade (FAO, 2013). C a p í t u l o 1 | 23 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica Os surfactantes Span são eficazes na redução da tensão interfacial, sendo que pesquisas realizadas nos derivados 80 e 83 indicaram que possuem características de viscoelasticidade interfacial apreciável (OPAWALE; BURGESS, 1998). Figura 1.2 – Fórmula química do Span 80. Fonte: Ushikubo e Cunha (2014). 1.6.4.3 Polissorbato 80 (Tween-80) O Polissorbato 80 (EHL: 15), mostrado na Figura 1.3 é um surfactante estável, não- iônico hidrofílico. Geralmente, é empregado para obter emulsões do tipo óleo em água (O/W), atuando com melhores resultados em associação com dois ou mais surfactantes (MADHI et al., 2011). Figura 1.3 – Fórmula química do Tween 80: polioxietileno (20) sorbitano mono oleato. Fonte: Madhi et al. (2011). C a p í t u l o 1 | 24 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 1.6.4.4 Poliglicerol–poliricinoleato (PGPR) O poliricinoleato de poliglicerol (PGPR) (EHL: 1,5 – 2,0) é um surfactante oligomérico e não-iônico (Figura 1.4a) produzido por esterificação de ácidos graxos de óleo de rícino (Figura 1.4b) com poliglicerol (USHIKUBO; CUNHA, 2014). O PGPR é um agente surfactante água em óleo. A adição de quatro partes de PGPR para 30 partes de óleo vegetal permite que 70 partes de água sejam dispersas no óleo. Devido à presença da cadeia hidrofílica longa de poliglicerol com a sua excelente capacidade de ligação de água, o PGPR é um dos mais poderosos surfactantes de emulsões água em óleo disponível para utilização em alimentos. Produz emulsões estáveis de água em óleo, mesmo em conteúdos muito elevados de água, tais como 80% (WILSON et al., 1998). Figura 1.4 – (a) Fórmula química do PGPR, na qual R é um hidrogênio, ácido ricinoleico ou ácido polyricinoleico (b) Fórmula química do ácido ricinoleico. Fonte: Ushikubo e Cunha (2014). 1.7 CO-SURFACTANTE Um co-surfactante é uma molécula anfifílica que se acumula substancialmente com o surfactante na camada interfacial. Normalmente, um surfactante de EHL muito baixo é usado com um surfactante de EHL elevado para modificar o EHL global do sistema. Ao contrário do surfactante, o co-surfactante pode não ser capaz de formar estruturas auto associadas como micelas por conta própria. Vários tipos de moléculas, incluindo agentes surfactantes não iônicos e álcoois podem funcionar como co-surfactante em um determinado sistema. A quantidade de um co-surfactante em um sistema é geralmente menor do que a do surfactante C a p í t u l o 1 | 25 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica e, muitas vezes, serve para modificar o valor de EHL global do sistema (NARANG et al., 2007). Em adição ao seu efeito sobre a fluidez interfacial, o co-surfactante também influencia o empacotamento geométrico do surfactante e, consequentemente, altera a curvatura das películas interfaciais. Assim, a seleção do surfactante e do co-surfactante é crítica para a formação da ME, assim como também para a solubilização das MEs. Outras variáveis, tais como a natureza química do óleo, salinidade e temperatura também influenciam na curvatura da película interfacial, fluidificando a região do hidrocarboneto da película interfacial (SURABHI et al., 2010). 1.7.1 Propilenoglicol (PG) Propilenoglicol (Figura 1.5) é um diol da classe dos glicóis, com origem sintética para uso em alimentos, bebidas, cosméticos, produtos farmacêuticos e outras áreas. O propilenoglicol é um dos co-surfactantes mais populares utilizados em emulsões (LAWRENCE; REES, 2000), funcionando como um álcool de cadeia curta, reduzindo a temperatura de percolação (KALE; ALLEN, 1989; VAN BOMMEL et al., 2005). Figura 1.5 – Fórmula química do propilenoglicol. 1.8 ÓLEO DE SOJA Os óleos vegetais se caracterizam por ter propriedades únicas (por ser biodegradáveis e renováveis) e são amplamente utilizados como matérias-primas nas indústrias de alimentos, medicina, cosmética e de biocombustíveis (LATHI; MATTIASSON, 2007). Devido à crise C a p í t u l o 1 | 26 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica energética e às questões ambientais, é significativo buscar abordagens alternativas para utilização de óleos vegetais. Óleos vegetais tradicionais com função de lubrificação, tais como óleo de rícino, pinhão manso e soja, foram estudados por ser capazes de produzir microemulsões isotrópicas com líquidos iônicos, bem como o comportamento da fase de óleos vegetais em microemulsões líquidas iônicas têm sido relatado (WANG et al., 2014). Os óleos vegetais em geral são compostos principalmente por triglicerídeos, formados pela esterificação de uma molécula de glicerol com até três moléculas de ácido graxo. O óleo de soja comercial é composto principalmente por uma mistura de glicerídeos formados por diversos ácidos graxos saturados, como o palmítico (9,0 – 14,5%), esteárico (2,5 – 5,0%), araquídico (traços), behênico (traços), lignocérico (traços), ácidos graxos mono-insaturados, como o palmitoleico (traços) e o oleico (18,0 – 34,0%), e ácidos graxos poli-insaturados, como o linoleico (45,0 – 60,0%) e o linolênico (3,5 – 8,0%) (MALACRIDA; JORGE, 2003). 1.9 TEORIAS DA FORMAÇÃO DA MICROEMULSÃO E ESTABILIZAÇÃO Para a formação de uma ME, é necessário que exista a mistura de dois líquidos imiscíveis. Inicialmente, quando esses líquidos são agitados mecanicamente, um deles é disperso no interior do outro (fase contínua). Se um surfactante for adicionado ao sistema, o mesmo tende a se estabilizar, formando um sistema homogêneo com a formação de uma fase interna, dispersa ou descontínua. Sem a adição do surfactante, o sistema tende a sofrer separação de fases e será possível visualizar novamente os dois líquidos separados. Sob o aspecto físico-químico, a formação de uma ME é um pouco diferente das emulsões, pois, além desses sistemas serem transparentes e termodinamicamente estáveis, apresentam um tamanho de gotículas nanométrico (DAMASCENO et al., 2011). A teoria da solubilização considera MEs como sistemas de micelas inchadas, ou seja, soluções com água solubilizada ou hidrocarbonetos solubilizados em sistemas de uma fase. A teoria termodinâmica propõe que a energia livre de formação de microemulsão, ΔGm, consiste de diferentes termos, como a energia livre interfacial, energia de interação entre as gotas, e um termo entrópico. Quando ΔGm atinge um valor de zero ou ligeiramente negativo, a C a p í t u l o 1 | 27 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica formação da ME pode ser facilitada. Independentemente do mecanismo de estabilização, a redução da energia livre interfacial a um valor muito baixo é crítico no sentido de facilitar a formação da ME (FLANAGAN; SINGH, 2006). A energia livre de superfície pode ser definida pela Equação 1.2 a temperatura, volume e número de moles constantes. Essa equação mostra que ΔG varia diretamente com a área interfacial e que se a tensão interfacial entre as fases aquosa e oleosa, γi, for negativa, ΔG será < 0 e a emulsificação espontânea será possível (OLIVEIRA et al., 2004). 2 1 iG G G S     (1.2) Quando aumenta o número de moléculas por unidade de área, elas começam a se comprimir, umas ao lado das outras, desenvolvendo uma pressão lateral bidimensional (π). A análise do filme mostra que a tensão de superfícial (γi) na interface diminui proporcionalmente com o aumento da pressão. Esse fenômeno pode ser expresso pela Equação 1.3, a qual mostra que quando a repulsão entre as espécies do filme (pressão π) exceder γO/A, γi será negativa: 0 i A     (1.3) Desse modo, a variação da energia (γi × ΔS) torna-se favorável à expansão espontânea da interface. A pressão do filme (πG) fica, então, compensada por uma tensão muito menor (γφ), descrita pela Equação 1.4: 0 G aA            (1.4) onde, (γO/A)a e πG, representam a tensão interfacial original entre óleo e água após o potencial químico do surfactante em cada fase ter sido equalizado por partição, e a pressão no filme antes da curvatura, respectivamente. Essa sequência de fatos leva a um mecanismo de curvatura do filme que é aplicável não somente para a formação de microemulsões O/W e W/O, mas também para a magnitude da curvatura do filme. A pressão total no filme é igual à soma das pressões de cada lado. Assim, πG representa a pressão transiente inicial, resultante da pressão gradiente devido a πo e πA através do filme e π é a soma de πo e πA (OLIVEIRA et al., 2004). C a p í t u l o 1 | 28 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica Consequentemente, com o aumento da área interfacial por um aumento de π, a 𝛾𝑖 se aproxima de zero, favorecendo a dispersão de uma fase na outra. Esse resultado indica que os surfactantes de caráter muito hidrofílicos ou lipofílicos são inapropriados para a formulação de MEs; mesmo com ajuda de co-surfactantes, a tensão interfacial não diminuirá suficientemente para a formação de um sistema microemulsionado (HO et al., 1996). 1.10 TIPOS DE MICROEMULSÕES A mistura dos componentes da fase aquosa, fase oleosa, surfactante e co-surfactante, na região da ME em um diagrama de fases, é capaz de formar diferentes estruturas internas. A estrutura formada é influenciada pelas propriedades físico-químicas dos componentes utilizados e da razão entre os componentes. Apenas em MEs muito diluídas é possível a formação de uma estrutura de micela intumescida (de água ou óleo) regular (O/W) ou reversa (W/O). 1.10.1 Microemulsões W/O A microemulsão W/O (Figura 1.6) é formada quando se dispersa água em uma fase contínua de hidrocarboneto, sendo normalmente situada em direção da região rica em óleo. Nesta região são gerados agregados conhecidos como micelas esféricas reversas ou invertidas, as quais minimizam a energia de superfície, sendo esta a forma mais comum (EKWALL et al., 1971; CONSTANTINIDES; YIV, 1995; MALIK et al., 2012). C a p í t u l o 1 | 29 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica Figura 1.6 – Microemulsão W/O. Fonte: Malik et al. (2012). 1.10.2 Microemulsões O/W Uma microemulsão de óleo em água é uma dispersão coloidal, termodinamicamente estável, que consiste em partículas esferoides pequenas (composta de óleo, surfactante, e possivelmente co-surfactante) dispersos num meio aquoso. As moléculas de surfactante numa microemulsão de óleo em água estão organizadas de modo que suas caudas não polares se associam umas com outras formando um núcleo hidrofóbico, uma vez que este reduz a área de contato termodinamicamente desfavorável entre os grupos não polares e a água. Os grupos de cabeça hidrófilos das moléculas de surfactante sobressaem na fase aquosa envolvente. A molécula de óleo pode ser incorporada no interior hidrofóbico das micelas com um núcleo separado ou entre as caudas do surfactante (Figura 1.7 a, b). Se as moléculas de óleo têm alguns grupos polares, então elas podem ser incorporadas nas micelas de tal forma que interagem com os grupos polares da cabeça polar do surfactante ou sobressair a uma certa distância na água (CONSTANTINIDES; YIV, 1995; MALIK et al., 2012). C a p í t u l o 1 | 30 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica Figura 1.7 – Microemulsões O/W: (a) moléculas de óleo incorporadas na cauda do surfactante; (b) moléculas de óleo incorporadas como núcleo hidrofóbico. Fonte: McClements (2012). 1.10.3 Fase bicontínua A fase bicontínua ou esponja é uma estrutura bastante complexa. Como o próprio nome sugere, nessa estrutura a água e o óleo são fases contínuas. Estruturas bicontínuas são talvez mais frequentemente observadas do que os agregados micelares discretos. Eles são encontrados em microemulsões, em mesofases e, até mesmo em soluções relativamente diluídas de surfactantes. De acordo com a Figura 1.8 pode ser observado que não há gotas isoladas, mas sim um arranjo bicontínuo de canais de óleo e água. A maior parte das microemulsões que são bicontínuas contém quantidades comparáveis de água e de óleo, e há sistemas bicontínuos que são estabilizados por apenas uma pequena quantidade de surfactante (KRESGE et al., 1992; KREILGAARD, 2002). Figura 1.8 – a) Fase bicontínua, b) corte transversal. Fonte: Malik et al. (2012). C a p í t u l o 1 | 31 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 1.11 FENÔMENO DE PERCOLAÇÃO A integridade da monocamada é frequentemente influenciada por eventos que ocorrem mediante as colisões entre gotas de microemulsão. Esperam-se alterações das várias propriedades das microemulsões, quando a fração de volume da fase dispersa (φ) é aumentada. Especialmente a condutividade elétrica é sensível à agregação das gotículas. Esse fato tem sido reportado em vários estudos em microemulsões aquosas (WEI et al., 2012; ŁUCZAK; HUPKA, 2014). O artigo publicado por Lagües et al. (1978) foi o primeiro a interpretar o aumento dramático da condutividade com a fração de volume de gotículas de uma microemulsão W/O em termos de um modelo de percolação e denominou essa situação física como percolação agitada, referindo-se ao movimento Browniano do meio. De acordo com o modelo teórico mais amplamente utilizado, é baseado na natureza dinâmica das microemulsões que consiste em duas pseudofases: uma em que a carga é transportada pela difusão da microemulsão e outra na qual a alteração dos glóbulos da fase é realizada por difusão do próprio transportador de carga no interior dos aglomerados de micelas invertidas. De acordo com essa teoria, duas abordagens (estáticas e dinâmicas) foram propostas para o mecanismo que leva à percolação (LAGOURETTE et al., 1979). A percolação estática está relacionada com o aparecimento de fases bicontínuas, onde o forte aumento na condutividade é devido a contra-íons e, em menor medida, aos íons dos surfactantes, o que pode ser justificado por um caminho de água ligado no sistema. A percolação dinâmica está relacionada com o rápido processo de fissão-fusão entre as gotículas. Canais transitórios de água se formam quando a interface de surfactante se decompõe durante colisões ou através da fusão de gotículas. Neste último caso, a condutividade é principalmente devida ao movimento de contra-íons ao longo dos canais de água. Para o modelo dinâmico de percolação, o processo global envolve a abordagem de difusão de duas gotas, o que leva a um encontro par (CAZABAT; LANGEVIN, 1981). C a p í t u l o 1 | 32 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 1.12. CLASSIFICAÇÃO DE WINSOR PARA SISTEMAS MICROEMULSIONADOS Winsor em 1948 criou um parâmetro semiquantitativo para mensurar o equilíbrio entre as características hidrofílicas e lipofílicas do surfactante em um sistema particular que é um tanto similar ao EHL (equilíbrio hidrofílico-lipofílico). Esse parâmetro, denominado Razão de Winsor (RW), pode ser modificado pela mudança na estrutura do surfactante, por ajustes na temperatura do sistema, ou pela adição de co-surfactante. Desse modo, os sistemas podem ser classificados em quatro tipos: Winsor I, II, III e IV. Esses tipos são baseados na quantidade de fases formadas em virtude da quantidade de óleo e/ou água em excesso (Figuras 1.9 e 1.10) (WINSOR, 1948; 1950). O sistema tipo Winsor I ocorre quando uma pequena porção da fase oleosa está em equilíbrio com o sistema microemulsionado, apresentando um excesso de óleo na porção superior do sistema, formando um sistema bifásico. No tipo Winsor II, também bifásico, uma pequena porção da fase aquosa está em equilíbrio com o sistema microemulsionado, apresentando um excesso de água na porção inferior do sistema. No tipo Winsor III, o sistema homogêneo está em equilíbrio com excesso tanto de óleo quanto de água, formando um sistema trifásico e, finalmente, o tipo Winsor IV ocorre quando não há excesso de fase aquosa ou oleosa, formando um sistema homogêneo e monofásico. Figura 1.9 – Sistema de classificação de Winsor mostra as possíveis fases óleo e água em sistemas de microemulsões. Fonte: Flanagan e Singh (2006). C a p í t u l o 1 | 33 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica O sistema tipo Winsor IV é o foco principal durante a preparação de um sistema microemulsionado, pois a adição de co-surfactantes além de diminuir o valor do EHL (ou aumentar a RW) dos surfactantes empregados, também ajusta a conformação geométrica do surfactante na interface para facilitar a formação da ME (TAN et al., 2011). Figura 1.10 – Diagrama de fases ternário da mistura de água e óleo-surfactante representando a classificação de Winsor e estruturas internas prováveis. Fonte: Metha e Kaur (2011). 1.13. CARACTERIZAÇÃO DE MICROEMULSÕES Diversas técnicas podem ser utilizadas para a caracterização das MEs. A literatura postula que técnicas experimentais diferentes podem ser usadas para obter informações sobre a dinâmica e estrutura desses sistemas (KAHLWEIT et al., 1987). C a p í t u l o 1 | 34 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica A caracterização de microemulsões pode ser dividida em duas áreas principais, caracterização macroscópica e caracterização microscópica. Viscosidade, condutividade e medidas dielétricas fornecem informações úteis em nível macroscópico. A presença de micelas inversas (MACKEBEN et al., 2001) e a transição entre estruturas (AMAR et al., 2004) implica uma mudança na viscosidade (FLANAGAN; SINGH, 2006). As medidas de condutividade podem dizer se há ME contínua em óleo ou contínua em água, assim como determinar fenômenos de percolação (WEI et al., 2012; CHEN; ZHAO, 2014). Dentre as técnicas mais difundidas em nível microscópico, tem-se a microscopia de luz polarizada para verificar a isotropia do sistema; o espalhamento de raios-X (FANUN, 2011) em baixos ângulos e de nêutrons para determinar o diâmetro da gotícula ou da fase dispersa; além dos métodos espectroscópicos, como ressonância magnética nuclear (HATHOUT; WOODMAN, 2012), para determinar a estrutura. 1.13.1 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) A ressonância magnética nuclear (RMN) permite elucidar a organização da estrutura de uma ME a partir de medidas de autodifusão de todos os componentes. Dentro de uma micela, o movimento molecular das caudas de hidrocarbonetos (de translação, reorientação e a flexibilidade da cadeia) é quase tão rápido como em um hidrocarboneto líquido. Em uma micela inversa, as moléculas de água e os contra-íons são também altamente móveis. Para muitos sistemas surfactante-água, há uma separação espacial distinta entre os domínios hidrofóbicos e hidrofílicos. A passagem de espécies entre diferentes regiões é um evento improvável e ocorre muito lentamente. Portanto, o estudo da auto-difusão em distâncias macroscópicas deveria revelar se o processo é rápido ou lento, dependendo das propriedades geométricas da estrutura interna. Por exemplo, uma amostra que é contínua em água e descontínua em óleo deverá exibir rápida difusão dos componentes hidrofílicos, enquanto que os componentes hidrofóbicos difundirão lentamente. Em uma estrutura bicontínua se esperaria uma rápida difusão de todos os componentes (TADROS, 2005). C a p í t u l o 1 | 35 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 1.13.2 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos As técnicas de espalhamento de raios-X e de nêutrons são baseadas na análise do espalhamento da radiação produzida por uma fonte como raios-X ou nêutrons ao interagir com partículas presentes numa amostra. Essas ferramentas permitem obter informação sobre o tamanho, a forma e a orientação de componentes no sistema que não precisam ser de longo alcance ou de ordem cristalino. Em experimentos de espalhamento, a radiação dispersa pela amostra de interesse é tipicamente medida sobre um detector bidimensional; no caso de dispersores isotrópicos, depois de ser calculada a média radial, a intensidade é plotada contra a magnitude de espalhamento do vetor q, que descreve a relação entre o incidente e os vetores de onda dispersos e é definida como na Equação 1.5: 4 sinq     (1.5) Em que θ é a metade do ângulo através do qual a radiação é dispersa e λ é o comprimento de onda da radiação incidente (MARTÍNEZ-SANZ et al., 2015). 1.14 MICROENCAPSULAÇÃO A microencapsulação é a tecnologia utilizada na indústria alimentar por mais de 60 anos como um meio de oferecer uma barreira efetiva a ingredientes sólidos e líquidos contra interações ambientais e/ou químicas até sua liberação desejada (REINECCIUS, 1994). Quase todos os materiais que necessitam ser protegidos, isolados, liberados lentamente ao longo do tempo, ou liberados em um determinado momento, podem ser encapsulados. Esses ingredientes alimentares que podem beneficiar-se do encapsulamento incluem aromas, ácidos, álcalis, tampões, lipídeos, enzimas, microrganismos, adoçantes artificiais, vitaminas, minerais, conservantes, antioxidantes, agentes de reticulação, agentes de fermentação, corantes e nutrientes (REINECCIUS, 1994; RISCH, 1995). Tais microcápsulas podem apresentar dimensões que variam desde frações de mícron até vários milímetros, em diferentes formas, dependendo dos materiais e métodos utilizados em sua preparação (SHAHIDI; HAN, 1993; AZEREDO, 2005; SANTOS et al., 2005; MADENE et al., 2006). C a p í t u l o 1 | 36 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 1.14.1 Microencapsulação por coacervação complexa O termo coacervação vem do latim “co” e “acervus” significando “união” e “agregação” de partículas e foi usado primeiramente por Bungenberg de Jong e Kruyt em (1928) para descrever o fenômeno de separação espontânea de fases que ocorre quando polieletrólitos são misturados em um meio aquoso (VANDERGAER, 1973; TOLSTOGUZOV, 1991; THIES, 1995; MENGER et al., 2000; DUCEL et al., 2004; STRAUSS; GIBSON, 2004). A coacervação é um fenômeno de interação baseado na complexação que ocorre como resultado da mistura de soluções de biopolímeros com cargas opostas, formando complexos que, por repulsão do solvente precipitam, formando duas fases, sendo uma delas chamada de “rica em polímeros” contendo o coacervado precipitado e outra chamada “pobre em polímeros”, na qual permanece o solvente da solução (TOLSTOGUZOV, 1991; REMUNAN- LOPEZ; BODMEIER, 1996; SCHMITT et al., 1998; WANG et al., 1999; WANG et al., 2000). O processo baseia-se na formação de uma emulsão (quando a fase dispersa é um líquido) ou dispersão (quando a fase dispersa é um sólido) do recheio na solução da mistura polimérica. Com a alteração das condições do meio para promover a coacervação (pH, força iônica, temperatura) ocorre a deposição do complexo ao redor dessas estruturas, formando um filme ou matriz sólidos, responsáveis pela retenção, proteção e liberação controlada do recheio (BACHTSI; KIPARISSIDES, 1996). Os biopolímeros ideais para serem empregados na coacervação complexa são aqueles que apresentam propriedades coloidais hidrofílicas, densidades de cargas adequadas e cadeias lineares. Alguns exemplos de biopolímeros passíveis de serem utilizados são: gelatinas, alginatos, albuminas, caseína, ágar, gomas e pectinas (VANDERGAER, 1973; THIES, 1995). Diversos sistemas de materiais de parede já foram avaliados no processo de coacervação complexa, mas o mais estudado e compreendido é o sistema gelatina/goma arábica (GOUIN, 2004). A coacervação complexa utilizando o par gelatina/goma arábica só é possível em pH abaixo do ponto isoelétrico da gelatina. É nesse pH que a gelatina se torna positivamente carregada, enquanto a goma arábica continua negativamente carregada. O material a ser C a p í t u l o 1 | 37 ____________________________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica encapsulado é emulsionado na gelatina e então a goma é adicionada ao sistema. O pH é ajustado para que se forme o coacervado e a temperatura é reduzida para que as paredes da microcápsula se formem e ocorra separação de fase, após o que as partículas podem ser separadas e manuseadas. Por fim, as microcápsulas são coletadas e secas (SCHERI et al., 2003). As micropartículas coacervadas são frequentemente desidratadas, para que se estenda o tempo de estocagem das mesmas e para que se torne viável seu uso em produtos desidratados (BURGESS; PONSART, 1998). Vários autores têm usado a encapsulação de princípios ativos de grau alimentício por coacervação complexa com o propósito de manter ou melhorar as características próprias destes. No