1 .yah ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEÍNAS RELACIONADAS ÀS TENEURINAS NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE PRIMATAS NÃO-HUMANOS (Sapajus spp) E RATOS (Rattus norvegicus) KELLY REGINA TORRES DA SILVA Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Prof. Dr. Cláudio Aparecido Casatti BOTUCATU – SP 2016 Campus de Botucatu PG-BGA Instituto de Biociências de Botucatu 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEÍNAS RELACIONADAS ÀS TENEURINAS NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE PRIMATAS NÃO-HUMANOS (Sapajus spp) E RATOS (Rattus norvegicus) KELLY REGINA TORRES DA SILVA Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Prof. Dr. Cláudio Aparecido Casatti BOTUCATU – SP 2016 Campus de Botucatu Instituto de Biociências de Botucatu PG-BGA 3 4 KELLY REGINA TORRES DA SILVA ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEÍNAS RELACIONADAS ÀS TENEURINAS NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE PRIMATAS NÃO-HUMANOS (Sapajus spp) E RATOS(Rattus norvegicus) Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de Concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Orientador: Prof. Dr. Cláudio Aparecido Casatti Comissão examinadora: __________________________ Prof. Dr. Cláudio Aparecido Casatti Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Odontologia de Araçatuba- UNESP/Araçatuba. __________________________ Prof. Dr. Edilson Ervolino Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Odontologia de Araçatuba- UNESP/Araçatuba. __________________________ Prof. Dr. Rogério Leone Buchaim Universidade de São Paulo, Faculdade de Odontologia de Bauru- USP/Bauru. __________________________ Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências- UNESP/Botucatu. __________________________ Profa. Dra. Camila Contin Diniz de Almeida Francia Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências- UNESP/Botucatu. 2016 5 Dedicatória À Deus Dedico toda a minha vida, pois sem Ele nada existiria. Aos meus pais Dedico esta conquista aos meus queridos pais Osmar Torres, exemplo de força e coragem, e a minha mãe Sônia Ap. F. Torres, exemplo de fé e doçura, que sempre estiveram ao meu lado oferecendo o melhor da vida: o amor. Em especial dedico a minha mãezinha que infelizmente não está mais conosco, mas tenho certeza que todas as conquistas que tive e terei sempre foram e serão regadas das suas preciosas orações e interseções que me fazem caminhar ao lado de Deus. Por meio dela Deus me concedeu a vida que foi expressa pelo meu primeiro suspiro e através do seu último suspiro Deus me permitiu vê-la partir. Saudades para sempre. Ao meu esposo Ao meu amado esposo André V. da Silva presente nas etapas mais importantes da minha vida, sejam elas repletas de alegria ou tristeza. Sem seu carinho, amor, ajuda e paciência sei que não conseguiria alcançar muitos dos nossos sonhos. Obrigada por cada momento de nossas vidas. 6 Agradecimentos À minha família que é o alicerce de tudo. Em especial ao meu irmão Cléber, cunhada Maria Lucia e sobrinha Isabella por todo apoio, incentivo e amor e a minha sogra Terezinha e meu sogro Sebastião por todo carinho. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por ter proporcionado o auxílio à pesquisa (2012/03067-6) e a bolsa de estudo (2012/08833-9) para o desenvolvimento deste projeto de pesquisa. Ao programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada do Instituto de Biociências de Botucatu (IBB) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP). Ao meu orientador prof. Dr. Cláudio Aparecido Casatti. Palavras não serão suficientes para agradecer toda a ajuda e aprendizado oferecido. Por meio de seus conhecimentos consegui completar o ciclo acadêmico da graduação ao doutorado e através da sua compreensão e apoio pude enfrentar os obstáculos que apareceram no decorrer destas etapas. Muito obrigada. Aos professores e funcionários do departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, em especial prof. Dr. Edilson Ervolino, prof. Dr. José Américo de Oliveira e a profa. Dra. Alaíde Gonçalves e aos técnicos Eliseide, Sandra, André e Arnaldo pela sincera amizade que se iniciou desde a minha graduação. Destaco meus agradecimentos ao prof. Dr. José Américo de Oliveira pela contribuição neste trabalho e pelo zelo e esforço para manter o núcleo de procriação de macacos-prego da referida Faculdade. 7 Ao professor do Instituto de Biociências de Botucatu (IBB) prof. Dr. José de Anchieta e a professora da Faculdade de Medicina de Botucatu profa. Dra. Patrícia Reis por sempre nos oferecerem ajuda através de sugestões e uso do laboratório. Aos funcionários do Instituto de Biociências de Botucatu (IBB) em especial ao David Muller da secretaria de pós-graduação obrigada pela eficiência e prestatividade e a Shelly Carvalho do Centro de Microscopia Eletrônica muito obrigada pelo auxílio durante o uso do Confocal. À Casa de Estudantes mantida pela Associação Botucatuense de Cultura Japonesa zelosamente administrada pela Sra. Raquel e Juliana. Muito obrigada pela acolhida durante as estadias necessárias para o desenvolvimento deste trabalho e pelas agradáveis companhias dos moradores: Laura, Stéphani, Juliana, Vanessa e Catarine. Aos alunos de graduação da Faculdade de Odontologia de Araçatuba que me acompanharam nesta trajetória Luan, Hayumi, Isabella e Camila e aos amigos de pós-graduação do Instituto de Biociências de Botucatu Gestter e Nicole muito obrigada pela força, companheirismo e pelos bons momentos de convivência. 8 Epígrafe “Há pessoas que desejam saber só por saber, e isso é curiosidade; outras, para alcançarem fama, e isso é vaidade; outras, para enriquecerem com a sua ciência, e isso é um negócio torpe; outras, para serem edificadas, e isso é prudência; outras, para edificarem os outros, e isso é caridade". Santo Agostinho “Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o que era antes”. Marthin Luther King 9 RESUMO Estudo da distribuição das proteínas relacionadas às teneurinas no sistema nervoso central de primatas não-humanos (Sapajus spp) e ratos (Rattus norvegicus). Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2016. As teneurinas (TENs) representam uma família de proteínas transmembrana preservada entre as espécies, presente principalmente no sistema nervoso central (SNC). Nos vertebrados essa família é composta por quatro homólogos, denominados de teneurina-1 a -4 (Ten-1, Ten-2, Ten-3 e Ten-4). Estudos mostraram a presença das TENs em vias motoras, olfatórias e visuais, especialmente durante a neurogênese em aves e roedores. A análise da distribuição neuroanatômica das TENs em primatas poderia ampliar o conhecimento destas proteínas, contribuindo com achados funcionais recentes. Portanto, os propósitos deste estudo foram: 1) avaliar a distribuição dos neurônios que exibem imunorreatividade relacionada às TENs-“like immunoreactivity” (TENs-LI), em particular Ten-2-LI, Ten-3-LI e Ten-4-LI no SNC do primata não- humano (Sapajus spp); 2) realizar análise comparativa dos sítios de distribuição da proteína Ten-3 entre o SNC de primatas (Sapajus spp) e roedores (Rattus norvegicus), uma vez que a Ten-3 apresentou distribuição significante no SNC de primatas; 3) correlacionar a distribuição das TENs com seus ligantes endógenos denominados de latrofilinas (LPHNs-1, 2 e 3) em áreas do SNC de primatas. Para isso, cortes coronais do SNC de macacos (n=3) e de ratos (n=4) foram submetidos à técnica de imuno-histoquímica e analisados em microscopia de luz ou confocal. Os resultados demonstraram a distribuição de neurônios e fibras nervosas exibindo TENs-LI em todo o neuroeixo de primatas. Neurônios exibindo Ten-2-LI estiveram principalmente no tronco encefálico, como notado nos núcleos facial, oculomotor e coclear. Neurônios exibindo Ten-4-LI foram evidentes no tronco encefálico como núcleo de Edinger-Westphal, núcleo oculomotor e núcleos vestibulares; entretanto, a distribuição de fibras Ten-4-LI foi significante em alguns tratos do tronco encefálico, tais como no trato solitário e trato espinal do nervo trigêmeo. A distribuição dos neurônios e fibras nervosas Ten-3-LI foram difusamente distribuídas ao longo do SNC, sendo que esta imunomarcação se assemelhou a neuropeptídios secretores nos neurônios e fibras nervosas presentes nos núcleos hipotalâmicos, tais como no núcleo paraventricular e supra-óptico. Os resultados para Ten-3-LI em ratos foram em sua maioria correspondentes aos verificados em primata embora sendo neste último mais abrangente. A correlação da distribuição entre LPHNs e TENs em territórios do SNC de primatas evidenciou que a LPHN-1 e Ten-3-LI estiveram em áreas e neurônios correspondentes como núcleo paraventricular, supra-óptico e medula espinal. Estes resultados demonstraram que as TENs estão conservadas no SNC de primatas, apresentando imunomarcações associadas a membrana plasmática, assim como similar a neuropeptídios secretores, sugerindo que esta família de proteínas seja capaz de exercer outras funções, além da interação intercelular. As áreas que apresentaram correlação entre TENs e LPHNs no SNC de primatas reforçam a possível interação destas proteínas como tem sido sugerido na literatura e contribui para futuras perspectivas funcionais. Palavras-chave: Sistema Nervoso Central; Macaco; Ratos; Teneurinas. 10 ABSTRACT Distribution of teneurin-related proteins in the central nervous system of non-human primates (Sapajus spp) and rats (Rattus norvegicus). Thesis (Doctoral degree) – Botucatu Biosciences Institute, São Paulo State University, Botucatu, 2016. Teneurins (TENs) represent a transmembrane protein family preserved along animal species, mainly in the central nervous system (CNS). This protein family is constituted by four homologues, named as teneurin 1 to 4 (Ten-1, Ten-2, Ten-3 and Ten-4). Previous studies pointed out presence of TENs in motor, olfactory and visual systems in chicken and rodents, especially during neurogenesis. The neuroanatomic distribution analysis of TENs in the primate brain could provide additional information on this protein system, as well as support functional data from recent studies. Therefore, the purposes of the present study were: 1) to evaluate the distribution of neurons exhibiting TENs-like immunoreactivity (TENs-LI), in particular, Ten- 2-LI, Ten-3-LI and Ten-4-LI in the CNS of non-human primates (Sapajus spp); 2) to comparatively analyze the main brain regions exhibiting Ten-3-LI between primates (Sapajus spp) and rodents (Rattus norvegicus), since Ten-3-LI showed significant distribution in the CNS of primates; 3) To correlate TENs- LI neurons with latrophilins (LPHNs-1, 2 and 3), an endogenous TENs ligand, in the CNS of primates. For this purpose, coronal histological sections of the CNS of non-human primates (n=3) and rats (n=4) were submitted to immunohistochemistry techniques and analyzed under light or confocal microscopes. Neurons and nerve fibers exhibiting TENs-LI were observed in all parts of the CNS in primates. Neurons showing Ten-2-LI were present mainly in the brainstem, such as facial, oculomotor and cochlear nuclei. Neurons exhibiting Ten-4-LI were evident in the brainstem such Edinger-Westphal nucleus, oculomotor and vestibular nuclei; whereas immunoreactive nerve fibers were significant in the brainstem tracts, such as solitary and trigeminal nerve tracts. The distribution of neurons and nerve fibers exhibiting Ten-3-LI were widely distributed in the CNS and a particular immunolabeling pattern similar to a secretory neuropeptide was present in hypothalamic nuclei, especially in paraventricular and supraoptic nuclei. Ten-3-LI distribution in the rat CNS was quite similar to that in primates; however, the latter showed a more pronounced and exuberant immunolabeling . In relation to LPHNs and TENs collocalization in the CNS of primates, the main data showed LPHN-1 and Ten-3-LI colocalization in neurons from paraventricular and supraoptic nuclei as well as in the spinal cord. These data demonstrated that TENs are preserved in the CNS of non-human primates, showing immunolabeling associated with the plasmatic membrane or similar to secretory neuropeptides, suggesting that the TENs system can exert other functions besides cellular interaction among neurons. The colocalization between TENs and LPHNs in the CNS of primates reinforces the possible interaction of these proteins, as suggested in recent studies. Keywords: central nervous system; monkeys; rats; teneurins. 11 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. ANÁLISE DO MODELO ESTRUTURAL DAS TENEURINAS (TENS). . ......................................................... 19 FIGURA 2. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-2 (TEN-2-LI) ATRAVÉS DOS ANTICORPOS COMERCIAIS R&D SYSTEMS® E SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY® NA REGIÕES HIPOCAMPAIS E CEREBELARES DO SAPAJUS SPP.. ........................................................................................... 37 FIGURA 3. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-3 (TEN-3-LI) ATRAVÉS DOS ANTICORPOS COMERCIAIS NOVUS BIOLOGICALS® E SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY® NAS REGIÕES HIPOCAMPAIS E CEREBELARES DO SAPAJUS SPP.. ............................................................................. 38 FIGURA 4. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS E FIBRAS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-4 (TEN-4-LI) ATRAVÉS DOS ANTICORPOS COMERCIAIS R&D SYSTEMS® E SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY® NAS REGIÕES HIPOCAMPAIS E CEREBELARES DO SAPAJUS SPP.. ...................................................................... 39 FIGURA 5. ILUSTRAÇÃO DO SÍTIO DE RECONHECIMENTO DOS ANTICORPOS ANTI-TENS... ..................................... 40 FIGURA 6. TESTE DE ADSORÇÃO DO ANTICORPO PRIMÁRIO PARA TEN-2 E TEN-3.. ................................................ 42 FIGURA 7. DISTRIBUIÇÃO DOS PROLONGAMENTOS (DENDRITOS/SEGMENTO INICIAL DE AXÔNIO) E CORPOS NEURONAIS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-2 (TEN-2-LI). ............................................... 43 FIGURA 8. REPRESENTAÇÃO DA DENSIDADE DE FIBRAS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-4 (TEN- 4-LI). ............................................................................................................................................................. 44 FIGURA 9. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-2 (TEN-2-LI) EM REGIÕES TELENCEFÁLICAS.. ..................................................................................................................... 45 FIGURA 10. DISTRIBUIÇÃO DE PROLONGAMENTOS E CORPOS NEURONAIS TEN-2-LI EM ÁREAS DIENCEFÁLICAS E DO TRONCO ENCEFÁLICO DO SAPAJUS SPP.. .................................................................................................... 46 FIGURA 11. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS E PROLONGAMENTOS NEURONAIS TEN-2-LI NA MEDULA ESPINAL DO SAPAJUS SPP.. ................................................................................................................................................. 48 FIGURA 12. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS E CORPOS NEURONAIS TEN-4-LI EM REGIÕES TELENCEFÁLICAS DO PRIMATA NÃO-HUMANO SAPAJUS SPP.. ......................................................................................................................... 50 FIGURA 13. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS NERVOSAS TEN-4-LI EM REGIÕES TELENCEFÁLICAS DO PRIMATA NÃO- HUMANO SAPAJUS SPP.. .................................................................................................................................. 51 FIGURA 14. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS NERVOSAS E CORPOS NEURONAIS TEN-4-LI EM REGIÕES DIENCEFÁLICAS E MESENCEFÁLICAS DO PRIMATA NÃO-HUMANO SAPAJUS SPP.. ........................................................................ 52 FIGURA 15. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS E CORPOS NEURONAIS TEN-4-LI NO TRONCO ENCEFÁLICO DO PRIMATA NÃO- HUMANO SAPAJUS SPP.. .................................................................................................................................. 54 FIGURA 16. DISTRIBUIÇÃO DE PROLONGAMENTOS E CORPOS NEURONAIS TEN-4-LI NO CEREBELO DO PRIMATA NÃO-HUMANO SAPAJUS SPP.. ......................................................................................................................... 55 FIGURA 17. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS E FIBRAS TEN-4-LI NA MEDULA ESPINAL DO SAPAJUS SPP.. ... 56 FIGURA 18. REPRESENTAÇÃO DA DENSIDADE DE FIBRAS NERVOSAS TEN-3-LI.. ................................................... 58 FIGURA 19. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS NERVOSAS TEN-3-LI EM REGIÕES TELENCEFÁLICAS DO PRIMATA NÃO- HUMANO SAPAJUS SPP.. .................................................................................................................................. 60 FIGURA 20. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS E CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NA ZONA LATERAL DO HIPOTÁLAMO DO PRIMATA NÃO-HUMANO SAPAJUS SPP.. .......................................................................................................... 62 FIGURA 21. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS NERVOSAS E CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NA ZONA PERIVENTRICULAR DO HIPOTÁLAMO DO PRIMATA NÃO-HUMANO SAPAJUS SPP.. ............................................................................... 62 FIGURA 22. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS NERVOSAS E CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI EM NÚCLEOS HIPOTALÂMICOS DO PRIMATA NÃO-HUMANO SAPAJUS SPP.. ..................................................................................................... 63 FIGURA 23. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS TEN-3-LI NO TRONCO ENCEFÁLICO DO PRIMATA NÃO-HUMANO SAPAJUS SPP.. ............................................................................................................................................................... 64 FIGURA 24. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS E CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NO TRONCO ENCEFÁLICO DO PRIMATA NÃO- HUMANO SAPAJUS SPP. . ................................................................................................................................. 65 FIGURA 25. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS E FIBRAS TEN-3-LI NA MEDULA ESPINAL DO SAPAJUS SPP. .... 67 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087578 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087578 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087578 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087579 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087579 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087579 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087580 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087580 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087580 file:///C:/Users/SEVEN/Desktop/TESE%20FINAL%20KELLY%20CD.doc%23_Toc453087582 12 FIGURA 26. DISTRIBUIÇÃO DE CÉLULAS ENDÓCRINAS TEN-3 (TEN-3-LI) NA HIPÓFISE DO SAPAJUS SPP.. .............. 68 FIGURA 27. DESENHO ESQUEMÁTICO MOSTRANDO O ENCÉFALO DO SAPAJUS SPP EM CORTE SAGITAL. ................. 70 FIGURA 28. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS NERVOSAS E CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NO TELENCÉFALO DE RATOS.. 71 FIGURA 29. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS E CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NO DIENCÉFALO DE RATOS.. .................... 72 FIGURA 30. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS E CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NO TRONCO ENCEFÁLICO DE RATOS......... 73 FIGURA 31. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NO TRONCO ENCEFÁLICO DE RATOS. . .................... 73 FIGURA 32. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NO CEREBELO DE RATOS.. ...................................... 74 FIGURA 33. DISTRIBUIÇÃO DE FIBRAS NERVOSAS E CORPOS NEURONAIS TEN-3-LI NA MEDULA ESPINAL DE RATOS. ...................................................................................................................................................................... 75 FIGURA 34. DISTRIBUIÇÃO DE CÉLULAS ENDÓCRINAS TEN-3 (TEN-3-LI) NA HIPÓFISE DE RATOS.. ....................... 75 FIGURA 35. DESENHO ESQUEMÁTICO DO ENCÉFALO DE RATTUS NORVEGICUS (A) E SAPAJUS SPP (B) EM CORTE SAGITAL MOSTRANDO OS TERRITÓRIOS QUE APRESENTAM CORPOS NEURONAIS IMUNORREATIVOS PARA TEN- 3. . ................................................................................................................................................................. 76 FIGURA 36. DISTRIBUIÇÃO DA LATROFILINA-1 (LPHN-1) EM TERRITÓRIOS TELENCEFÁLICOS DO SAPAJUS SPP.. .. 80 FIGURA 37. DISTRIBUIÇÃO DA LATROFILINA-1 (LPHN-1) EM TERRITÓRIOS DIENCEFÁLICOS E DA MEDULA ESPINAL DO SAPAJUS SPP. ............................................................................................................................................ 81 FIGURA 38. DISTRIBUIÇÃO DA LATROFILINA-2 (LPHN-2) EM TERRITÓRIOS TELENCEFÁLICOS E DA MEDULA ESPINAL DO SAPAJUS SPP. A. .......................................................................................................................... 82 FIGURA 39. COLOCALIZAÇÃO DA TEN-3 E LPHN-1 EM NÚCLEOS HIPOTALÂMICOS DO SAPAJUS SPP. .................... 83 FIGURA 40. COLOCALIZAÇÃO DA TEN-3 E LPHN-1 NA MEDULA ESPINAL DO SAPAJUS SPP.. ................................. 83 FIGURA 41. ESQUEMA DA LOCALIZAÇÃO E DA INTERAÇÃO ENTRE TENS E LPHNS NA MEMBRANA NEURONAL.. . 98 LISTA DE TABELAS TABELA 1. ANTICORPOS PRIMÁRIOS ANTI-TENEURINAS (TENS) E ANTI-LATROFILINAS (LPHNS) OBTIDOS COMERCIALMENTE E EMPREGADOS NO PRESENTE ESTUDO. . ......................................................................... 32 TABELA 2. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS E PROLONGAMENTO NEURONAIS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-2 (TEN-2-LI) NO SNC DO SAPAJUS SPP.. ............................................................................................. 49 TABELA 3. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS E FIBRAS NERVOSAS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-4 (TEN-4-LI) NO SNC DO SAPAJUS SPP.. ............................................................................................. 57 TABELA 4. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS NEURONAIS E FIBRAS NERVOSAS COM IMUNORREATIVIDADE RELACIONADA À TEN-3 (TEN-3-LI) NO SNC DO SAPAJUS SPP.. ............................................................................................. 69 TABELA 5. DISTRIBUIÇÃO DE CORPOS E FIBRAS NERVOSAS IMUNORREATIVAS À TEN-3 NO SNC DE RATTUS NORVEGICUS TRATADOS COM COLCHICINA.. .................................................................................................. 77 13 LISTA DE ABREVIATURAS µm - micrômetro 10N -núcleo motor dorsal do nervo vago 11N - núcleo acessório 3N - núcleo oculomotor 3V - terceiro ventrículo 4(F1) - área 4 do córtex (motor primário) 7N - núcleo facial 9n - núcleo do nervo glossofaríngeo A1 - área noradrenérgica A1 aa - aminoácidos AD - núcleo talâmico anterodorsal AMPO - núcleo pré-óptico anteromedial APir - área de transição amigdalopiriforme APT - núcleo pré-tectal anterior Arc - núcleo arqueado ArcL - núcleo arqueado lateral ArcM - núcleo arqueado medial AHiMC - área amigdalohipocampal B - núcleo basal (Meynert) BLVM - núcleo basolateral da amígdala parte ventromedial BMPC - núcleo basomedial da amígdala parte parvicelular Ca +2 - cálcio CA1 - camada CA 1 (corno de Ammon 1) da formação hipocampal CA2 - camada CA 2 (corno de Ammon 2) da formação hipocampal CA3 - camada CA 3 (corno de Ammon 3) da formação hipocampal CA4 - camada CA 4 (corno de Ammon 4) da formação hipocampal Cd - núcleo caudado CeI - núcleo motor dorsal do nervo vago cp - pedúnculo cerebral CRF - fator liberador da corticotropina CRN - neurônios da raiz coclear Cu - núcleo cuneiforme DC - núcleo coclear dorsal DLG - núcleo geniculado lateral dorsal DMD - núcleo hipotalâmico dorso medial parte dorsal DMV - núcleo hipotalâmico dorsomedial parte ventral DPGi - núcleo paragigantocelular dorsal ECu - núcleo cuneiforme externo ECu - núcleo cuneiforme EGF - fator de crescimento epidermal EGP - globo pálido externo EW - núcleo de Edinger-Westphal f - fórnice FAK - quinase de adesão focal FITC- isotiocianato de fluoresceína GDP - guanosina difosfato Gi - núcleo reticular gigantocelular Gr - núcleo grácil GrCb - camada granular do cerebelo GrDG - camada granular do giro denteado H2 - fascículo lenticular campo 2 H2O – água HBD- domínio ligante de hormônio ( “hormone-binding domain”) HCl - ácido clorídrico HDB - núcleo horizontal da banda diagonal ICj - ilhas de Calleja icp - pedúnculo cerebelar inferior Ig - imunoglobulina IGP - globo pálido interno IntA - interpósito parte anterior IOA - núcleo olivar inferior subnúcleo A IP - núcleo interpeduncular IPul - núcleo pulvinar inferior Lat - núcleo cerebelar lateral LEC - domínios de lectina LH - hipotálamo lateral LPAG- substância cinzenta periaquedutal lateral LPBV - núcleo parabraquial lateral parte ventral 14 LPHN-1 - latrofilina 1 LPHN-2 - latrofilina 2 LPHN-3 - latrofilina 3 LPHNs - latrofilinas LRt - núcleo reticular lateral LRtS5 - núcleo reticular lateral parte subtrigeminal LSD - núcleo septal lateral dorsal LSI - núcleo septal lateral intermédio LSV - núcleo septal lateral parte ventral LTu - núcleo tuberal lateral LV- ventrículo lateral MCLH - núcleo magnocelular do hipotálamo lateral MD - núcleo talâmico mediodorsal MDC - núcleo talâmico mediodorsal parte central Me5 - mesencefálico trigeminal Med - núcleo cerebelar medial MG - núcleo geniculado medial mlf - fascículo longitudinal medial Mo5 - núcleo motor do trigêmeo MoCb - camada molecular do cerebelo MVe - núcleo vestibular medial NaCl - cloreto de sódio OLF- domínios de olfactomedina opt - trato óptico ox - quiasma óptico PaM - núcleo paraventricular do hipotálamo magnocelular PaMD - núcleo paraventricular do hipotálamo parte magnocelular divisão dorsal PaMP – núcleo paraventricular do hipotálamo parte parvicelular divisão medial PaP - núcleo paraventricular do hipotálamo parvicelular PaPD - núcleo paraventricular do hipotálamo parte parvicelular divisão dorsal PBP - núcleo parabraquial pigmentado PBS - tampão fosfato de sódio PF - núcleo parafasciular do tálamo Pk - camada de Purkinje do cerebelo PoDG- camada polimófica do giro denteado Pu - putame PV - núcleo paraventricular do tálamo PVP - núcleo paraventricular do tálamo parte posterior Re - núcleo reuniens RGCs - células ganglionares da retina RMC - núcleo rubro RRF - campo retrorubral Rt – núcleo reticular do tálamo SC - colículo superior SCh - núcleo supraquiasmático scp - pedúnculo cerebelar superior SIB - substância innominata SN - substância negra SNC- sistema nervoso central SNL - substância negra parte lateral SNR - substância negra reticular SO - núcleo supra-óptico Sol - núcleo solitário sol -trato solitário SolD - núcleo solitário subnúcleo dorsal sp5 - trato espinal do nervo trigêmeo SpVe - núcleo vestibular espinal STh - núcleo subtalâmico STLV - núcleo da estria terminal divisão lateral parte ventral STMA - núcleo da estria terminal divisão medial parte anterior STMP - núcleo da estria terminal divisão medial parte posterior TCAPs - peptídeos associados ao terminal carboxila das teneurinas Ten-1 - teneurina-1 Ten-2 - teneurina-2 Ten-2-LI – teneurina-2 “like immunoreactivity” (imunorreatividade relacionada à teneurina-2) 15 Ten-3 - teneurina-3 Ten-3-LI – teneurina-3 “like immunoreactivity” (imunorreatividade relacionada à teneurina-3) Ten-4 - teneurina-4 Ten-4-LI – teneurina-4 “like immunoreactivity” (imunorreatividade relacionada à teneurina-4) TENs - teneurinas VCA - núcleo coclear ventral anterior VCo - núcleo amigdalóide cortical ventral VP - pálido ventral VTA - área tegmental ventral YD - tirosina e ácido aspártico ZI - zona incerta 16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 18 1.1 Descoberta das teneurinas ............................................................................................ 18 1.2 Estrutura e função das teneurinas .............................................................................. 19 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 24 Objetivo 1: ........................................................................................................................... 24 Objetivo 2: ........................................................................................................................... 24 Objetivo 3: ........................................................................................................................... 24 3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 25 3.1 Animais .......................................................................................................................... 25 3.2 Processamento histológico do sistema nervoso central (SNC) .................................. 26 3.3 Imuno-histoquímica pelo método de imunoperoxidase e imunofluorescência indireta ................................................................................................................................. 29 3.4 Coloração pela técnica de Nissl .................................................................................... 33 3.5 Análise dos resultados, aquisição e edição de imagens .............................................. 33 4 RESULTADOS ................................................................................................................... 35 4.1 Imuno-histoquímica: procedimentos controles .......................................................... 35 4.2 Resultados do objetivo 1: ............................................................................................ 43 Distribuição da teneurina-2 e teneurina-4 no SNC de primatas não-humano (Sapajus spp) ........................................................................................................................................ 43 4.3 Resultados do objetivo 2 ............................................................................................... 58 Distribuição da teneurina-3 no SNC de primatas não-humano (Sapajus spp) e ratos (Rattus norvegicus) .............................................................................................................. 58 4.4 Resultados do objetivo 3 ............................................................................................... 78 Correlação da distribuição das teneurinas e latrofilinas em áreas do SNC de primatas não-humano (Sapajus spp) ................................................................................................. 78 5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 84 5.1 Considerações metodológicas ....................................................................................... 84 17 5.2 Distribuição das teneurina-2 e teneurina-4 no SNC de primatas não-humano (Sapajus spp) ........................................................................................................................ 88 5.3 Distribuição da teneurina-3 no SNC de primatas não-humano (Sapajus spp) e ratos (Rattus norvegicus) .............................................................................................................. 93 5.4 Correlação da distribuição das teneurinas e latrofilinas em áreas do SNC de primatas não-humano (Sapajus spp) ................................................................................. 96 6 CONCLUSÕES ................................................................................................................. 100 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 101 ANEXOS ............................................................................................................................... 107 Introdução 18 1 INTRODUÇÃO 1.1 Descoberta das teneurinas As teneurinas (TENs) são proteínas transmembrana principalmente distribuídas no sistema nervoso central (SNC). A descoberta destas proteínas ocorreu através de estudos que visavam encontrar proteínas homólogas as tenascinas em invertebrados, uma vez que as tenascinas são proteínas da matriz extracelular exclusiva de vertebrados (BAUMGARTNER e CHIQUET-EHRISMANN, 1993; BAUMGARTNER et al., 1994; CHIQUET- EHRISMANN, 2004). Estes estudos mostraram a existência de uma nova família de proteínas transmembrana denominada de teneurinas (TENs), com alguns poucos domínios homólogos aos das tenascinas, além de alta conservação e expressão entre as espécies, principalmente no SNC. Nos invertebrados as TENs são compostas por um ou dois membros (denominados de ten-1 em nematelmintos e ten-a e ten-m nos artrópodes) e por quatro membros nos vertebrados (denominados de teneurina-1 a -4) (MINET et al., 1999; OOHASHI et al., 1999; MINET e CHIQUET-EHRISMANN, 2000; ZHOU et al., 2003; DRABIKOWSKI et al., 2005; TUCKER e CHIQUET-EHRISMANN, 2006; TUCKER et al., 2007). Várias denominações e abreviaturas tem sido empregada referente às TENs, tanto em vertebrados como em invertebrados, uma vez que estas foram descobertas por laboratórios independentes (CHAND, 2013). Recentemente, foram propostas as abreviaturas Ten-1, Ten-2, Ten-3 e Ten- 4 para as proteínas de humanos e camundongos, as quais são oriundas dos respectivos genes das teneurinas 1 a 4 (ISHII et al., 2015; MOSCA, 2015). Portanto, neste presente trabalho foi padronizado o uso das abreviaturas da TENs propostas por ISHII et al. (2015) e MOSCA (2015). Entretanto, ressaltamos que é verificada na literatura abreviaturas sinônimas para descrever esta família como ten-m1 a ten-m4, Odz1 a Odz4 e neurestina (MINET et al., 1999; MINET e CHIQUET-EHRISMANN, 2000; TUCKER et al., 2007). Um aspecto interessante que também ampliou o interesse pelo estudo das TENs foi a descoberta que na região carboxi-terminal das TENs, presente nos vertebrados, há sequências de aminoácidos com identidade com a família de peptídeos do fator liberador da corticotropina (CRF) sendo esses denomidados de TCAPs (Teneurin C-terminal-Associated Peptides) (QIAN et al., 2004; LOVEJOY et al., 2009; CHEN et al., 2013). Além disso, foi constatado que esta sequência carboxi-terminal das TENs podem ser liberadas na forma de peptídeos bioativos devido a existência de potenciais domínios de clivagem (Figura 1) ou Introdução 19 pode ser transcrita separadamente a partir do último éxon do gene de cada TENs (LOVEJOY et al., 2006). Figura 1. Análise do modelo estrutural das teneurinas (TENs). O modelo esquemático apresentado é referente à Ten-1 e ilustra a constituição e a organização dimérica homotípica, semelhante para as demais teneurinas (TENs). A seta mostra o sítio de clivagem localizado na região carboxi-terminal que poderia resultar na liberação dos TCAPs. Esse modelo também é similar aos outros membros das TENs. Ilustração extraída e adaptada de Lovejoy et al., 2006. 1.2 Estrutura e função das teneurinas Estruturalmente todos os membros da família das teneurinas (TENs) compartilham de características comuns, exibindo peso molecular de aproximadamente 300 kDa e constituição entre 2500 a 2800 aminoácidos. A análise da identidade mostra que entre os vertebrados as TENs apresentam de 60% a 98% de sequências de aminoácidos idênticos revelando a consistente conservação filogenética destas proteínas. As TENs apresentam seu terminal carboxila e amino-terminal com orientação extracelular e intracelular, respectivamente (Figura 1); portanto, sendo classificada como uma proteína transmembrana do tipo II (OOHASHI et al., 1999; TUCKER e CHIQUET-EHRISMANN, 2006). A região intracelular é composta por aproximadamente 300-375 aminoácidos enquanto que a região transmembrana é composta por 300-400 aminoácidos hidrofóbicos. A região extracelular é constituída por aproximadamente 2300 aminoácidos apresentando domínios semelhantes ao fator de crescimento epidermal (“epidermal growth factor-like”- EGF) análogo aos das Introdução 20 tenascinas, seguido por uma região rica em cisteínas e sequências repetidas de aminoácidos tirosina e ácido aspártico (região YD) (Figura 1) (TUCKER e CHIQUET-EHRISMANN, 2006). Esta região apresenta significante identidade tanto em tamanho quanto em estrutura quando comparada às TENs de vertebrados e invertebrados (OOHASHI et al., 1999; TUCKER e CHIQUET-EHRISMANN, 2006; KENZELMANN et al., 2008). Além disso, é verificado nesta região carboxi-terminal a possibilidade das TENs formarem dímeros logo após serem transportadas para a membrana plasmática através de interações entre o segundo e o quinto domínio semelhante ao EGF (Figura 1) (LOVEJOY et al., 2006). Ensaios in vitro confirmaram que as TENs de vertebrados são capazes de formarem dímeros homotípicos e heterotípicos (FENG et al., 2002; RUBIN et al., 2002) além de serem capazes de associarem com TENs presente nas membranas celulares opostas através da interação celular homofílica e heterofílica (OOHASHI et al., 1999; RUBIN et al., 2002; MOSCA, 2015). Esta capacidade de formar diferentes tipos de dímeros e interações celulares sugere a complexidade funcional na qual as TENs possam estar envolvidas devido a formação de várias moléculas a partir de um conjunto limitado de genes (FENG et al., 2002). Além disso, estudos verificaram que os genes das TENs podem codificar “splice variants” (OOHASHI et al., 1999; SILVA et al., 2011; WOELFLE et al., 2015) devido a tradução de parte do gene que codifica as proteínas TENs assim como a possibilidade de clivagem em sítios destas proteínas gerando peptídeos relacionados as TENs como os TCAPs (QIAN et al., 2004; LOVEJOY, 2009). Estudos pioneiros verificaram que as TENs possuem papel fundamental no desenvolvimento de embriões de Drosophila melanogaster, Mus musculus e Caenorhabditis elegans sendo notado nestes estudos que animais mutantes para TENs apresentam defeitos no desenvolvimento e diferenciação embrionária, principalmente no SNC, que podem resultar na letalidade embrionária (BAUMGARTNER et al., 1994; LEVINE et al., 1994; DRABIKOWSKI et al., 2005; LOSSIE et al., 2005). Estes dados demonstram que essa família de proteínas possui alguma função indispensável na embriogênese, aparentando não possuir mecanismos compensatórios para minimizar sua ausência (BAUMGARTNER et al., 1994; LEVINE et al., 1994; DRABIKOWSKI et al., 2005; LOSSIE et al., 2005). Além dos trabalhos descreverem a presença das TENs nos tecidos neuronais e não neuronais em condições de normalidade, é verificado a expressão alterada das Ten-2 e Ten-4 em tecidos e em cultura de células tumorais humanas, sendo sugerida sua participação na proliferação das células tumorais e seu potencial uso como biomarcador tumoral (ZIEGLER Introdução 21 et al., 2012). Isto foi verificado comparando-se a expressão das TENs com tecidos e cultura de células normais, sendo constato que a expressão da Ten-2 está aumentada em tumores de origem linfática e ovariana, e a Ten-4 em tumores encefálicos oriundos de células da glia (ZIEGLER et al., 2012). Alguns estudos também apontam a participação dos membros da TENs em quadros de microftalmia, retardos mentais, anosmia, doenças neurodegenerativa como doença de Alzheimer, além de quadros de distúrbios psiquiátricos associado com prejuízos sinápticos como autismo, distúrbio bipolar e esquizofrenia (DUBOVSKY et al., 1994; VIK e YATHAM, 1998; BUERVENICH et al., 2001; TUCKER e CHIQUET- EHRISMANN, 2006; ALDAHMESH et al., 2012; BASTÍAS-CANDIA et al., 2015; MOSCA, 2015; SCHOLER et al., 2015) sugerindo futuras perspectivas clínicas (MOSCA, 2015; ALKELAI et al., 2016). Outro dado que tem subsidiado a relação da TENS com alterações neurológicas e visuais reside na localização do gene da Ten-1 na região Xq25, cujas mutações resultam em pacientes com retardo mental associados a severos danos visuais, consistente com o que tem sido descrito sobre a participação das TENs no desenvolvimento do SNC de animais de laboratório (GUSTAVSON et al., 1993; MALMGREN et al., 1993; BUERVENICH et al., 2001; LEAMEY e SAWATARI, 2014; MOSCA, 2015). Além disso, outras anormalidades mentais associadas a malformações faciais e dos membros têm sido mostradas em translocações e trissomias envolvendo o locus 5q34, que aloja o gene da Ten-2 (DUBOVSKY et al., 1994; VIK e YATHAM, 1998). Também tem sido sugerido que mutações no gene da Ten-4 aumentam a susceptibilidade a desordens bipolares (SKLAR et al., 2011; HEINRICH et al., 2013), possivelmente devido a mudanças no processamento do estado de recompensa exercido pela amígdala (HEINRICH et al., 2013), ou devido a malformações da rede neuronal resultando em prejuízos na sinalização sináptica ou no desenvolvimento glial (SUZUKI et al., 2012; SUZUKI et al., 2014). Desta forma, muitos estudos buscam associar as TENs com distúrbios neurológicos verificados em humanos devido sua predominante expressão no SNC. Entretanto, até o momento a participação dos membros das TENs em distúrbios relacionados com a via visual somente foi confirmado em quadros de microftalmia (ALDAHMESH et al., 2012). A microftalmia é uma condição clínica presente em pacientes sindrômicos ou não que acarreta na malformação do globo ocular, na qual os mesmos apresentam tamanho reduzido estando associado a quadros de cegueira (ALDAHMESH et al., 2012). Mutações no gene que codifica a Ten-3 têm sido relacionadas a quadros de microftalmia em humanos Introdução 22 (ALDAHMESH et al., 2012) sendo também verificada a participação da Ten-1 na regulação de fatores de transcrição associado à microftalmia (SCHOLER et al., 2015). Estes dados confirmam a importância de membros pertencentes à família das TENs em vias visuais outrora mencionada em modelos experimentais. A possível participação das TENs na organização sináptica foi evidenciada em Drosophila melanogaster na qual foi verificado o envolvimento das TENs na interação pré e pós-sináptica de neurônios olfatórios assim como entre motoneurônios e células musculares através de interação celular homofílica (HONG et al., 2012; MOSCA et al., 2012). Entretanto, a participação na organização sináptica através da interação heterofílica também foi sugerida principalmente após a descoberta dos ligantes endógenos das TENs denominados de latrofilinas (LPHNs) (SILVA et al., 2011). As LPHNs pertencem a uma família de receptores acoplados à proteína-G e composta por três membros (LPHN-1 a 3), sendo proposto que sua interação com as TENs ocorra pela extremidade carboxi-terminal de ambas famílias (SILVA et al., 2011; BOUCARD et al., 2014; O'SULLIVAN et al., 2014; WOELFLE et al., 2015). Isto foi evidenciado devido a específica e forte interação verificada em cultura de células hipocampais entre parte de um transcrito da Ten-2 (“splice variant”) denominada de Lasso, com a latrofilina 1 (LPHN-1) (SILVA et al., 2011). Os mecanismos moleculares das funções na qual as TENs estão envolvidas ainda são incertos, porém é sugerido que participação da Ten-4 na diferenciação neuronal, através da regulação da protrusão celular e da formação de neuritos, ocorra por meio da via de sinalização da quinase de adesão focal, conhecida como FAK (“focal adhesion kinase”) (SUZUKI et al., 2014). Além disso, foi verificada a presença de domínios de clivagem intracelular na Ten-1 e Ten-2, resultando em proteínas intermediarias que são translocados para o núcleo, onde podem atuar como fator de transcrição gênica (BAGUTTI et al., 2003; NUNES et al., 2005; SCHOLER et al., 2015). Estudos recentes verificaram os possíveis mecanismos moleculares dessa regulação gênica na qual constataram que a porção amino- terminal da Ten-1 não contêm sequência de ligação direta ao DNA necessitando interagir com outras proteínas codificantes como a proteína 1 da tríade de histidina de ligação do nucleotídeo (HINT1) para assim regular a expressão de fatores de transcrição como a glicoproteina não metastática b (GPNMB) que é um fator de transcrição associado a quadros de microftalmia (SCHOLER et al., 2015). Também foi verificado que o domínio intracelular da Ten-2 é capaz de associar a proteínas ligantes citoplasmática de ação nuclear, como o fator Introdução 23 de transcrição gênica “dedo de zinco” (“zinc-finger transcription factor”) (BAGUTTI et al., 2003). Desta forma, até o momento as funções descritas para as TENs estão relacionadas a orientação axonal (YOUNG e LEAMEY, 2009), crescimento dos neuritos (RUBIN et al., 1999; LEAMEY et al., 2008), participação na regulação da transcrição proteica (BAGUTTI et al., 2003; NUNES et al., 2005; KENZELMANN et al., 2008; SCHOLER et al., 2015), proliferação e adesão celular (RUBIN et al., 2002; KINEL-TAHAN et al., 2007; LEAMEY et al., 2008) e organização sináptica (MOSCA, 2015), porém, com mecanismos de ação ainda incertos tanto em animais em desenvolvimento quanto em adultos. Portanto, é sugerido que as TENs representem um novo e altamente conservado sistema de regulação que atua principalmente no SNC de vertebrados (BASTÍAS-CANDIA et al., 2015). A distribuição neuroanatômica dos quatro membros das TENs é descrita na literatura porém sendo os resultados incompletos, pouco detalhado e principalmente realizados durante a fase de desenvolvimento embrionário de vertebrados como camundongos, ratos, peixes e aves (RUBIN et al., 1999; MIEDA et al., 1999; OTAKI e FIRESTEIN, 1999; ZHOU et al., 2003). Sendo assim, ainda é necessário um detalhado mapeamento neuroanatômico da distribuição das TENs no SNC de vertebrados durante a fase adulta. Além disso, os dados de distribuição das TENs no SNC de primatas não-humano seriam de grande valor pois poderiam subsidiar futuros estudos e modelos funcionais envolvidos com alterações neurológicas em humanos. Objetivos 24 2 OBJETIVOS Objetivo 1: Realizar mapeamento neuroanatômico das teneurinas 2 e 4 visando suprir a ausência destes dados no sistema nervoso central (SNC) de animais adultos de uma mesma espécie de primatas não-humano (Sapajus spp), através do método da imunoperoxidase indireta. Objetivo 2: Realizar mapeamento neuroanatômico da teneurina 3 no SNC de primatas não- humano (Sapajus spp) e análise comparativa com roedores (Rattus norvegicus), através do método da imunoperoxidase indireta. Objetivo 3: Correlacionar a distribuição dos membros das TENs com as latrofilinas (LPHNs), ligantes endógenos das TENs, em áreas do SNC de primatas não-humano (Sapajus spp), através dos métodos de imunoperoxidase e dupla imunofluorescência indireta. Material e métodos 25 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais Para este trabalho foi utilizado o SNC de animais adultos da espécie de primata não-humano Sapajus spp. Inicialmente é válido salientar que a nomenclatura adotada para esta espécie foi recentemente alterada passando os animais outrora denominados de Cebus apella para Sapajus spp (ALFARO et al., 2012; IZAR et al., 2012; WHEELER et al., 2013). Isso ocorreu, pois, de modo geral, os primatas popularmente conhecidos como macacos-prego são divididos em dois grandes grupos que são os gráceis (devido ausência de pelagem em forma de crista no topo da cabeça) e robustos (presença de pelagem em forma de crista no topo da cabeça), sendo que, desde 1960 são nomeados de Cebus apella todas as espécies do grupo robusto (HILL, 1960; ALFARO et al., 2012). Porém, em 2011 foi verificada a existência de tipos distintos dentro deste grupo, sendo sugerido o gênero Sapajus para denominar o grupo robusto e Cebus o grupo grácil (ALFARO et al., 2012). Esta alteração se deve aos estudos morfológicos, genéticos, comportamentais, ecológicos e biogeográficos, os quais verificaram uma diversidade de tipos de primatas dentro do gênero Cebus que impulsionaram a colocação dos mesmos em um gênero separado. Portanto, em nosso trabalho será empregado a nomenclatura Sapajus spp para se referir ao grupo anteriormente denominado de Cebus apella como proposto na literatura (WHEELER et al., 2013). Neste estudo foram utilizados macacos machos adultos (idade entre 4 a 5 anos) da espécie Sapajus spp (n=3) que apresentavam peso corpóreo entre 2.200 a 2.700 g. Através da verificação do peso corpóreo é possível estimar a maturidade sexual desta espécie sendo constatado que para os machos a completa maturidade é atingida após 2.500g (NAGLE, 1982). O uso e fornecimento para pesquisa desses animais foram fiscalizados e orientados segundo normas e procedimentos do Núcleo de Procriação de Macacos-prego associado ao Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Odontologia – UNESP, Campus de Araçatuba, segundo a portaria 016/94 do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) de 04 de abril de 1995. Ressaltamos que o tecido nervoso do primata utilizado neste trabalho foi coletado anteriormente para a realização de outros trabalhos de pesquisa e se encontram adequadamente armazenados em sistema de congelação no setor de Morfologia do Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Material e métodos 26 Odontologia de Araçatuba – UNESP sob responsabilidade do Prof. Dr. Cláudio A. Casatti. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP (protocolo 02257- 2012, Anexo 1). Neste trabalho também foi utilizado o tecido nervoso de roedores que foram obtidos de ratos machos adultos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar (n=4) por volta dos 4 meses de idade e com peso corpóreo entre 270g a 300g. Estes animais foram obtidos do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP. Os procedimentos experimentais para o uso desta espécie foram aprovados pelo CEUA da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP (protocolo 02401-2012, Anexo 2). 3.2 Processamento histológico do sistema nervoso central (SNC) Sapajus spp Os procedimentos realizados para a obtenção do SNC do primata iniciaram com a tranquilização dos animais através da injeção intramuscular de cloridrato de cetamina (10 mg/kg, Francotar®, Virbac, SP, Brasil) seguido de anestesia profunda pela injeção intraperiotenal de tiopental sódico (30 mg/kg Thionembutal ® - Fontoveter, Brasil) e injeção intramuscular de diazepínico (0,3 mg/kg Diazepan ® - União Química Farmácia Nacional S.A., Brasil). Em seguida os procedimentos de fixação e preparo histológico do tecido nervoso seguiram os protocolos estabelecidos para o SNC de macacos (ROSENE et al., 1986; ST JOHN JL, 1997). Os animais foram perfundidos através da parte ascendente da aorta por punção cardíaca, primeiramente com solução salina (0,9%) e em seguida com soluções fixadoras constituídas de formaldeído 4% preparado em tampão acetato 0,1 M (pH 6,5, 3L) e finalmente formaldeído a 4% em tampão tetraborato de sódio 0,1M (pH 9,5, 3L). Após a perfusão o encéfalo, medula espinal e hipófise dos primatas foram transferidos para solução crioprotetora constituída de 10% de glicerol e 2% dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma Chemical, MO, USA) em tampão tetraborato de sódio 0,1 M (pH 9,5) por 3 dias a 4ºC. Uma segunda crioproteçao foi realizada através de solução crioprotetora constituída de 20% glicerol e 2% de DMSO em tampão tetraborato de sódio 0,1 M (pH 9,5) a 4ºC, durante 7 a 10 dias. A microtomia do encéfalo e da medula espinal foi realizada em micrótomo de congelamento (SM 2000R, Leica, Alemanha) com obtenção de secções de 40 µm de espessura em plano Material e métodos 27 coronal. As secções foram acondicionadas em oito séries com seis compartimentos cada contendo solução tamponada de anticongelante livre de RNase (0,5x PBS 0,1M, 30% etileno glicol e 20% glicerol) e armazenadas em congelador (freezer) a -20ºC. Séries adjacentes com cortes histológicos representativos do neuroeixo foram utilizadas para técnica de imuno- histoquímica e Nissl. Para obtenção dos cortes histológicos da hipófise do primata foi realizado o processamento histológico para inclusão em parafina através das seguintes etapas: a) desidratação em série crescente de alcoóis (70%, 80%, 90%, 100% I a 100% III – 40 minutos em cada banho em sistema de vácuo); b) banho em solução de álcool-xilol (40 minutos em sistema de vácuo); c) banho em soluções de xilol I a xilol III (40 minutos cada banho em sistema de vácuo); d) impregnação em parafina I-III (40 minutos cada banho) em estufa a 56°C; e) inclusão e emblocamento da hipófise em parafina (Histosec, Merck, Alemanha). O seccionamento da hipófise foi realizado em micrótomo automático Leica (RM2155, Leica Microsystems Inc, SP, Brazil) para obtenção de cortes com 5 μm de espessura sendo os mesmos coletados em lâminas de vidro (Brain Research Laboratories® microscope slides 25x75x1.0 mm adhesion superfrost plus). As lâminas histológicas da hipófise foram armazenadas em caixas porta-lâminas a temperatura ambiente, livre de umidade, até a realização da técnica de imuno-histoquímica. Rattus norvegicus Para obtenção do encéfalo, medula espinal e hipófise de ratos foram realizadas as seguintes etapas laboratoriais (descrição metodológica empregada no laboratório do prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta-Júnior, Departamento de Anatomia – Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP): alojamento dos animais em gaiolas (33x17x18cm) com livre acesso à água e ração, em biotério com temperatura controlada (21 a 23 o C) e ciclo claro/escuro de 12/12 horas (luzes acesas às 7:00h). Para administração do agente antimitótico colchicina (Sigma #C9754) os animais (n=2) foram previamente anestesiados com uma solução anestésica constituída de 5 ml de cloridrato de xilazina (Anasedan 2%, Ceva) a 20mg/ml (concentração final = 5mg/ml), 5 ml de cloridrato de ketamina (Dopalen 10%, Ceva) a 100mg/ml (concentração final = 25mg/ml) e 2 ml de acepromazina (Acepran® 1%, Vetnil) a 10mg/ml (concentração final = 1mg/ml), em quantidade suficiente de água Material e métodos 28 bidestilada para 20ml. A solução anestésica foi ministrada por via subcutânea na dose de 0,2ml para cada 100g de peso corporal do animal. Depois de verificada a completa anestesia dos animais, através da ausência do reflexo córneo-palpebral e reflexo de retirada da pata traseira, foi removido os pêlos da região da cabeça e ao redor da orelha. O animal foi posicionado no aparelho estereotáxico (David Kopf Instruments, #963) e seus olhos foram mantidos umedecidos com soro fisiológico durante todo o procedimento. A altura do apoio incisal do aparelho estereotáxico foi ajustada para 3,3mm abaixo da linha interauricular de forma que os pontos craniométricos Bregma e Lambda estivessem no mesmo nível (PAXINOS e WATSON, 2007). Foi realizada uma incisão sagital mediana de aproximadamente 3 cm na cabeça do animal e os tecidos que recobrem a calota craniana, inclusive o periósteo, foram divulsionados e afastados lateralmente com bastonetes de algodão expondo os ossos parietais e occipital, seguida da craniotomia. Antes do início da administração do agente antimitótico colchicina o animal foi posicionado verificando a projeção da coordenada ântero-posterior (AP) 0,0 e médio-lateral (ML) 0,0 sobre a calota craniana, no centro do triângulo formado pela sutura lambdóide como preconizado por PAXINOS e WATSON (2007). Para administração da colchicina no ventrículo lateral os animais foram posicionados segundo as coordenadas: AP: -0,72mm; ML: 2mm; dorsoventral (DV): + 4mm e a injeção de 7 µl colchicina foi realizada utilizando uma seringa de 10 µl (Hamilton 1700 series) controlada por uma bomba de microinjeção (micropump III – WPI) com ponta em aço de 60 µm de diâmetro interno. Após a remoção da micropipeta, os tecidos divulsionados foram reposicionados e a incisão fechada com grampos cirúrgicos. Decorrido 48 horas da administração da colchicina todos os animais (n=4), tanto controle quanto pré- tratado com colchicina, foram sacrificados por perfusão transcardíaca utilizando fixador histológico após sobredose anestésica de hidrato de cloral a 10% por via intraperitoneal (aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal). Previamente ao uso do fixador os animais foram perfundidos com solução salina composta por NaCl a 0,9% em água destilada (150ml, aproximadamente) acrescida de 1 ml de heparina sódica (Hepamax-S® - Blau, 5000U.I.) imediatamente antes da perfusão. A administração da solução salina com heparina foi realizada em temperatura ambiente durante 3 minutos e em quantidade suficiente para permitir um retorno vascular quase transparente. Em prosseguimento, foi administrado solução fixadora filtrada (aproximadamente 1000 ml por animal) composta de formaldeído a 4%, recém-preparada a partir de paraformaldeído (Sigma #P6148) em tampão fosfato de sódio Material e métodos 29 0,1 M, pH 7,4 em temperatura ambiente. Posteriormente o encéfalo, a medula espinal e a hipófise foram submetidos à crioproteção em solução de sacarose a 30% em tampão fosfato de sódio (PBS) 0,1M pH 7,4 por 48h. Após a crioproteção o encéfalo e a medula espinal foram cortados no plano coronal em secções seriadas de 30μm, obtidas em micrótomo de deslizamento (Leica SM2010R) equipado com platina congeladora (Physitemp, BFS-30MP). Os cortes foram recolhidos sequencialmente, em uma série de 10 frascos preenchidos com solução anticongelante (0,5x PBS, 30% etileno glicol e 20% glicerol) e armazenadas em congelador (freezer) a -20ºC. Para obtenção dos cortes histológicos da hipófise foram realizadas as etapas de processamento em parafina descrita acima para a hipófise de primata. 3.3 Imuno-histoquímica pelo método de imunoperoxidase e imunofluorescência indireta Imunoperoxidase Para a realização da técnica de imuno-histoquímica pelo método da imunoperoxidase indireta foram inicialmente testados diferentes protocolos experimentais de bloqueio da peroxidase e da avidina/biotina endógena com intuito de minimizar a marcação de fundo e facilitar a visualização de corpos neuronais e fibras imunorreativas aos membros da família das teneurinas (TENs). Estes bloqueios juntamente com os demais métodos de controle da técnica de imuno-histoquímica (teste de titulação, adsorção e omissão do anticorpo primário) contribuem para confirmar a fidelidade dos resultados de distribuição dos membros das TENs. Após a análise dos protocolos e adequação dos mesmos foi preconizado a lavagem prévia dos cortes do SNC em tampão fosfato de sódio 0,1M (PBS 0,1M, pH 7,4) por 24 horas para remoção da solução anticongelante na qual os cortes estavam armazenados. Para os cortes em parafina da hipófise foi inicialmente realizado a desparafinização e a recuperação do antígeno. Para esta etapa os cortes histológicos montados em lâminas foram mantidos em estufa por um período de 30 minutos a 56°C e submetidos a uma sequência de banhos em xilol I-III durante 5 minutos em cada banho. Após foi realizada a desidratação em álcool 100%, 95%, 70% por 2 minutos em cada banho. Em seguida foi realizada 3 lavagens de 5 minutos em PBS 0,1M e a recuperação antigênica através de calor úmido em câmara pressurizada (Decloaking Chamber – Biocare Medical, CA, USA) Material e métodos 30 utilizando tampão citrato a 1% (100x Citrate Buffer, pH 6,0 - Spring Bioscience, CA, USA) e programação de 95°C por 5 minutos e 70°C por 3 minutos. Após o resfriamento em temperatura ambiente, por um período de 2 horas, os cortes foram processados segundo o protocolo estabelecido para o método da imunoperoxidase. Para o método da imunoperoxidase, as seguintes etapas foram obedecidas: a) 3 lavagens de 10 minutos em PBS 0,1M; b) inibição da peroxidase endógena por 1hora com solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% obtida pela diluição de 0,5 ml de peróxido de hidrogênio a 30% em 50 ml de PBS-TX (PBS 0,1M acrescido de 0,3% de triton X-100); c) 3 lavagens de 10 minutos em PBS 0,1M até que não haja mais bolhas no tecido; d) inibição da avidina endógena por 30 minutos, seguida de lavagens em PBS 0,1M e do bloqueio da biotina endógena por 30 minutos (avidin/biotin kit blocking, Invitrogen, CA, USA); e) bloqueio das marcações inespecíficas por 4h através da solução contendo PBS-TX e 5% de leite em pó desnatado; f) 3 lavagens de 10 minutos em PBS 0,1M seguidas de incubação em solução contendo PBS-TX e 2% soro normal de burro por 24horas; g) incubação do anticorpo primário anti-teneurina (Ten-2, 3 e 4) e anti-latrofilina (LPHN-1, 2 e 3) (informações complementares sobre os anticorpos primários comerciais utilizados estão descritas na tabela 1) por 24 horas em temperatura ambiente. Ressaltamos que para determinação e padronização da concentração empregada do anticorpo primário foi inicialmente realizado o teste de titulação no qual foram utilizadas as seguintes concentrações iniciais 1:100, 1:500 e 1:1000 sendo a melhor concentração de cada anticorpo apresentada na tabela 1; h) Após incubação do anticorpo primário por 24 horas, seguem 3 lavagens de 10 minutos em PBS 0,1M; i) preparo da solução de anticorpo secundário biotinilado (anti-coelho, anti-cabra e anti-ovelha - Santa Cruz Biotechnology) na concentração de 1:800 em solução contendo PBS-TX e 2% soro normal de burro e incubação dos cortes nesta solução por 1 hora; j) 3 lavagens de 10 minutos em PBS 0,1M; k) incubação em solução do complexo avidina-biotina (ABC) (Vector Laboratories, CA, USA), ambas na concentração de 1:500, em solução de PBS 0,1M por 1h; l) 3 lavagens de 10 minutos em PBS 0,1M; m) Revelação da reação de imuno-histoquímica através da solução de tetracloreto de diaminobenzidina (0,05%) (Sigma Chemical, MO, USA) acrescida de peróxido de hidrogênio a 30% (0,006%) e uso opcional de sulfato-níquel-amônia (0,05%) (Fisher Scientific, NJ, USA); n) após, os cortes foram lavados em PBS 0,1M, montados em lâminas gelatinizadas, com exceção dos cortes da hipófise que já se encontravam em lâminas, e em seguida secos a temperatura ambiente por 3 dias ou em estufa Material e métodos 31 a 37°C por aproximadamente 18h, sendo posteriormente submetidos a bateria de desidratação que inicia-se com banhos de 3 minutos em álcool 50% ,70% e 95%; 3 banhos de 5 minutos em álcool 100%; banhos de 5, 10 e 15 minutos em xilol, sendo logo após as lâminas cobertas com meio de montagem (Entellan, Merck) e lamínulas de vidro. Este protocolo foi realizado nos cortes histológicos de primata e ratos, sendo que neste último a etapa de bloqueio da avidina e biotina endógena não foi necessária. Como mencionado anteriormente este protocolo também foi utilizado para estabelecer a concentração ideal do anticorpo primário, através do teste de titulação, assim como foi utilizado para determinar a especificidade do anticorpo primário empregado através do teste de adsorção e omissão do anticorpo primário. No que se refere ao teste de adsorção, foi realizada nas etapas iniciais da técnica de imunoperoxidase a ligação do anticorpo primário com a porção do antígeno a qual reconhece (peptídeo obtido comercialmente). Desta forma para os anticorpos anti-Ten-2 e anti-Ten-3 (Santa Cruz Biotechnology, TX, USA) adicionamos aos mesmos concentrações de 0,1 mg/ml a 0,001 mg/ml do respectivo antígeno Ten-2 e Ten-3 (Santa Cruz Biotechnology, TX, USA) por 24 horas em mesa agitadora a 4 ° C. Em prosseguimento, foi obedecido o protocolo de imuno-histoquímica já descrito acima iniciando com as lavagens dos cortes histológicos seguida da incubação do anticorpo primário adsorvido com seu peptídeo seguindo os passos até revelação e montagem. Este teste de adsorção não foi aplicado aos demais anticorpos comerciais testados devido a ausência de peptídeos comerciais disponíveis. No teste de omissão do anticorpo primário foram realizadas todas as etapas da técnica de imuno-histoquímica com exceção da incubação do anticorpo primário nos cortes histológicos. Material e métodos 32 Tabela 1. Anticorpos primários anti-teneurinas (TENs) e anti-latrofilinas (LPHNs) obtidos comercialmente e empregados no presente estudo. A concentração empregada de cada anticorpo foi determinada através do teste de titulação utilizando cortes histológicos do neuroeixo do Sapajus spp, demais informações foram obtidas do próprio fabricante. Imunofluorescência Para o estudo da colocalizaçao das TENs e LPHNs foi realizado o método da dupla imunofluorescência indireta utilizando séries de cortes histológicos que continham os principais locais de distribuição das TENs sendo realizada as seguintes etapas: a) lavagem dos cortes histológicos em PBS 0,1M por 24 horas para remoção da solução anticongelante na qual os cortes estavam armazenados; b) 3 lavagens de 10 minutos em PBS 0,1M; c) bloqueio das marcações inespecíficas por 1h através da solução contendo PBS-TX e 5% de leite em pó desnatado; d) 3 lavagens de 10 minutos em PBS 0,1M seguidas de incubação em solução contendo PBS-TX e 2% soro normal de burro por 24 horas; e) incubação do anticorpo primário anti-latrofilina (LPHN-1,2 e 3) utilizando as mesmas concentrações empregadas na imunoperoxidase (tabela 1) por 24 horas em temperatura ambiente; f) após incubação do Antígeno Fonte (código) Hospedeiro Concentração empregada Área de reconhecimento Teneurina-2 Santa Cruz Biotechnology (165674) cabra 1:100 amino-terminal (50-100 aa) Teneurina-3 Santa Cruz Biotechnology (136918) coelho 1:500 carboxi-terminal (1300-1350 aa) Teneurina-4 Santa Cruz Biotechnology (H-50/ 134883) coelho 1:1000 carboxi-terminal (2515-2564 aa) Teneurina-2 R&D Systems (AF4578) ovelha 1:500 amino-terminal (1-183 aa) Teneurina-3 Novus Biologicals (NBP1-20956) cabra 1:2000 carboxi-terminal (2390-2402 aa) Teneurina-4 R&D Systems (AF6320) ovelha 1:500 amino-terminal (61-340 aa) Latrofilina-1 Santa Cruz Biotechnology (34484) cabra 1:500 amino-terminal Latrofilina-2 Santa Cruz Biotechnology (47091) cabra 1:250 amino-terminal Latrofilina-3 Santa Cruz Biotechnology (47095) cabra 1:250 amino-terminal Material e métodos 33 anticorpo primário, seguem 3 lavagens de 10 minutos em PBS; g) preparo da solução de anticorpo secundário biotinilado (Santa Cruz Biotechnology, TX, USA) na concentração de 1:200 em solução contendo PBS-TX e 2% soro normal de burro e incubação dos cortes nesta solução por 1 hora; h) 3 lavagens de 10 minutos em PBS; i) incubação do tecido por 1 hora em solução contendo Cy 3 conjugado com estreptavidina (1:200, Jackson ImmunoResearch, USA); j) 3 lavagens de 10 minutos em PBS seguida da incubação do anticorpo primário anti- teneurina (Ten-2, 3 e 4) em solução contendo PBS-TX e 2% soro normal de burro por 24 horas; k) 3 lavagens de 10 minutos em PBS e incubação do anticorpo secundário conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC, Santa Cruz Biotechnology, TX, USA); l) 3 lavagens de 10 minutos em PBS, montagem do tecido em lâminas gelatinizadas, secagem em temperatura ambiente e proteção com lamínulas e meio de montagem a base de glicerol tamponado. 3.4 Coloração pela técnica de Nissl Para auxiliar no mapeamento da distribuição das TENs e LPHNs foi utilizado cortes histológicos de primatas e ratos corados pela técnica de Nissl para referência citoarquitetônica dos grupamentos neuronais. Esse método consiste na utilização de um corante básico que possui afinidade aos ácidos ribonucléicos (RNAs) que estão abundantes no citoplasma dos neurônios. Para esta técnica foi realizada as seguintes etapas: a) banhos de desidratação das lâminas com os cortes histológicos em álcool 95% por 6 minutos, álcool 100% por 9 minutos e deslipidificação em xilol por 40 minutos; b) reidratação com banhos de 6 minutos em álcool 100%, 6 minutos em álcool 95%, 3 minutos em álcool 70% e 3 minutos em álcool 50%; c) mergulho das lâminas em tionina a 0,25% por 1 minuto; d) banhos em água destilada (10 banhos); e) desidratação das lâminas como mencionado acima sendo que o tempo de cada banho nessa etapa é de 2 minutos; f) após banho em xilol as lâminas foram cobertas com meio de montagem (Entellan, Merck) e lamínulas de vidro. 3.5 Análise dos resultados, aquisição e edição de imagens As análises dos tecidos submetidos à técnica de imunoperoxidase e a técnica de Nissl foram feitas através de microscopia de luz (Leica DMR, Wetzlar, Alemanha) em campo Material e métodos 34 claro. A localização e denominação das regiões analisadas basearam-se no atlas de referência neuroanatômica para primatas não-humanos (PAXINOS et al., 2009) e roedores (PAXINOS e WATSON, 2007) e em cortes histológicos corados pela técnica de Nissl que auxiliaram na localização citoarquitetônica. Para Ten-2, 3 e 4 foram analisados na microscopia de campo claro fibras e corpos celulares imunorreativos. Baseado na metodologia de apresentação dos resultados de distribuição neuroanatômica empregada por VASCONCELOS et al. (2003), os dados do presente estudo foram dispostos em tabelas contendo a região/núcleo e a presença ou ausência da imunomarcação em corpos neuronais através do método qualitativo de distribuição. No caso de densidade de fibras nervosas imunorreativas, foi acrescentada a análise semiquantitativa, considerando o padrão de distribuição de pouco (+), moderada (++) e intensa (+++) densidade de fibras imunorreativas. A aquisição das imagens microscópicas foi realizada através de uma câmera digital (AxioCam HRc, Carl Zeiss, Alemanha) acoplada ao microscópio óptico (Scope.A1, Carl Zeiss, Alemanha) utilizando-se o software de captura de imagens AxioVision (Carl Zeiss, Alemanha). Todas as imagens capturadas através deste sistema foram editadas no programa Adobe Photoshop CS2 para melhor apresentação e organização dos resultados e somente ajustadas com relação ao brilho e contraste das mesmas quando necessário. Para análise de colocalização entre teneurinas e latrofilinas pelo método de dupla imunofluorescência as lâminas foram analisadas em microscópio confocal (modelo TCS-SP5 AOBS Tandem Scanner, LEICA, Germany) acoplado a um microscópio óptico invertido (Leica DMI 6000CS) do centro de microscopia eletrônica do Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP (Projeto Fapesp EMU 2009/54141-9). O microscópio confocal está equipado com lasers Diodo, Hélio-Neon e Argônio possibilitando as linhas de excitação de comprimento de onda de 405, 458, 476, 488, 496, 514, 543, 594, 594 e 633 nm. Foram utilizadas objetivas Planapochromat de 20x, 40x e 63x (abertura numérica 1,30) com imersão a óleo, que possibilitaram uma resolução de até ~150nm nos eixos x, y e ~300nm no eixo -z (pinholede 1 unidad Airy). Resultados 35 4 RESULTADOS 4.1 Imuno-histoquímica: procedimentos controles De modo geral, verificamos que os anticorpos de ambas as marcas comerciais apresentaram correspondência de distribuição da imunorreatividade no SNC; entretanto, os anticorpos da marca comercial Santa Cruz Biotechnology® mostrou imunorreatividade mais intensa e melhor definida. Foi observado que o anticorpo anti-Ten-2 da R&D Systems® apresentou especificidade similar com o anticorpo anti-Ten-2 da Santa Cruz Biotechnology®, mostrando territórios imunomarcados na formação hipocampal com evidente presença de corpos neuronais com imunorreatividade relacionada à Ten-2 (Ten-2-LI) localizados nas camadas CA1-CA4 na camada granular do giro denteado (GrDG) (Figura 2). No cerebelo, foram verificados que ambos os anticorpos marcaram seletivamente os neurônios da camada de Purkinje do cerebelo (Pk) (Figura 2) e dos núcleos profundo do cerebelo. Os resultados verificados para Ten-3 no hipocampo e cerebelo evidenciaram territórios e padrão de marcação totalmente distinta como constatado para o anticorpo comercial da Ten-3 da Novus Biologicals® que apresentou imunorreatividade localizada ao núcleo celular. Essa imunorreatividade foi verificada na camada granular do giro denteado do hipocampo (GrDG) e camada granular do córtex cerebelar (GrCb) (Figura 3). Por outro lado, o anticorpo para Ten-3 da Santa Cruz Biotechnology® evidenciou a presença de fibras imunorreativas com escassos corpos neuronais nas camadas CA2-CA4 e na camada polimórfica do giro denteado do hipocampo (PoDG), além de corpos neuronais imunorreativos na camada de células de Purkinje do córtex cerebelar (Pk) (Figura 3). Neurônios fracamente imunomarcados foram verificados com o uso dos anticorpos anti-Ten-4 de ambas as marcas comerciais, sendo verificada correspondência nos territórios imunomarcados. Algumas áreas ilustram esta similaridade, tais como, nos neurônios da formação hipocampal como verificado nas camadas CA1-CA4 (Figura 4) enquanto que no cerebelo verificamos que a imunorreatividade na camada de Purkinje (Pk) foi evidente para Santa Cruz Biotechnology® (Figuras 4). Além disso, através do desenho esquemático das proteínas TENs foi possível visualizar a localização do sítio de reconhecimento dos anticorpos da Santa Cruz Resultados 36 Biotechnology que foram selecionados para serem empregados no mapeamento neuroanatômico das TENs devido a melhor definição da imunorreatividade (Figura 5). Ressaltamos que nesta ilustração foi utilizada a sequência de aminoácidos de humanos uma vez que os anticorpos desta marca comercial reconhecem epítopos presentes nos domínios das TENs de humanos. Verificamos que os anticorpos anti-Ten-3 e anti-Ten-4 da marca comercial Santa Cruz Biotechnology® reconhecem aminoácidos presente na extremidade carboxi- terminal, entretanto distante do possível sítio de clivagem capaz de originar os TCAPs. Para Ten-2 verificamos que o anticorpo comercial é capaz de reconhecer os aminoácidos desta proteína voltados para a porção amino-terminal. Resultados 37 F ig u ra 2 . D is tr ib u iç ão d e co rp o s n eu ro n ai s co m i m u n o rr ea ti v id ad e re la ci o n ad a à T en -2 ( T en -2 -L I) a tr av és d o s an ti co rp o s co m er ci ai s R & D S y st em s® e S an ta C ru z B io te ch n o lo g y ® n a re g iõ es h ip o ca m p ai s e ce re b el ar es d o S a p a ju s sp p . A b re v ia tu ra s: C A 1 , ca m ad a C A 1 d o h ip o ca m p o ; C A 2 , ca m ad a C A 2 d o h ip o ca m p o ; C A 3 , ca m ad a C A 3 d o h ip o ca m p o ; C A 4 , ca m ad a C A 4 d o h ip o ca m p o ; G rC b , ca m ad a g ra n u la r d o c er eb el o ; G rD G , ca m ad a g ra n u la r d o g ir o d en te ad o ; M o C b , ca m ad a m o le cu la r d o c er eb el o ; P k , ca m ad a d e P u rk in je d o c er eb el o . . Resultados 38 F ig u ra 3 . D is tr ib u iç ão d e co rp o s n eu ro n ai s co m i m u n o rr ea ti v id ad e re la ci o n ad a à T en -3 ( T en -3 -L I) a tr av és d o s an ti co rp o s co m er ci ai s N o v u s B io lo g ic al s® e S an ta C ru z B io te ch n o lo g y ® n as r eg iõ es h ip o ca m p ai s e ce re b el ar es d o S a p a ju s sp p . F ib ra s im u n o rr ea ti v as t am b ém f o ra m e v id en te s co m o u so d o a n ti co rp o co m er ci al S an ta C ru z B io te ch n o lo g y ® . A b re v ia tu ra s: C A 4 , ca m ad a C A 4 d o h ip o ca m p o ; G rC b , ca m ad a g ra n u la r d o c er eb el o ; G rD G , ca m ad a g ra n u la r d o g ir o d en te ad o ; M o C b , ca m ad a m o le cu la r d o c er eb el o ; P k , ca m ad a d e P u rk in je d o c er eb el o ; P o D G , ca m ad a p o li m ó rf ic a d o g ir o d en te ad o . Resultados 39 F ig u ra 4 . D is tr ib u iç ão d e co rp o s n eu ro n ai s e fi b ra s co m im u n o rr ea ti v id ad e re la ci o n ad a à T en -4 (T en -4 -L I) at ra v és d o s an ti co rp o s co m er ci ai s R & D S y st em s® e S an ta C ru z B io te ch n o lo g y ® n as r eg iõ es h ip o ca m p ai s e ce re b el ar es d o S a p a ju s sp p . A b re v ia tu ra s: C A 1 , ca m ad a C A 1 d o h ip o ca m p o ; C A 2 , ca m ad a C A 2 d o h ip o ca m p o ; C A 3 , ca m ad a C A 3 d o h ip o ca m p o ; C A 4 , ca m ad a C A 4 d o h ip o ca m p o ; G rC b , ca m ad a g ra n u la r d o c er eb el o ; M o C b , ca m ad a m o le cu la r d o c er eb el o ; P k , ca m ad a d e P u rk in je d o c er eb el o . Resultados 40 Figura 5. Ilustração do sítio de reconhecimento dos anticorpos anti-TENs. Em laranja, rosa e azul estão representados os domínios intracelular, transmembrana e extracelular, respectivamente, da Ten-2, Ten-3 e Ten-4 com seus tamanhos em termos de número total de aminoácidos. A sequência analisada corresponde as TENs de humanos sendo que o número de acesso está descrito para cada teneurina. Em verde destaca-se a sequência de aminoácidos reconhecida pelos anticorpos da marca comercial Santa Cruz Biotechnology® empregado neste estudo sendo verificado que ambos estão longe do sítio de clivagem capaz de gerar os respectivos TCAPs. Além da análise da imunorreatividade advinda do uso de diferentes anticorpos primários comerciais que reconhecem regiões diferentes do mesmo antígeno também foi realizada a omissão do anticorpo primário que também é um dos métodos de controle da reação de imuno-histoquímica conhecido como controle negativo. Para tanto, séries de cortes histológicos do sistema nervoso central (SNC) foram submetidas ao protocolo da técnica de imuno-histoquímica retirando apenas a etapa de incubação do anticorpo primário. Em nossos Resultados 41 resultados verificamos que os anticorpos secundários comerciais anti-coelho, anti-cabra e anti-ovelha (Santa Cruz Biotechnology®) não resultaram em imunomarcações do SNC, confirmando a especificidade dos anticorpos secundários em reconhecer apenas os anticorpos primários empregados na técnica de imuno-histoquímica (dados não mostrados). Uma vez definido o uso dos anticorpos da marca comercial Santa Cruz Biotechnology®, uma segunda análise quanto à especificidade destes foi realizada através do teste de adsorção. Para isso foi realizado a pré-incubação do anticorpo primário, cuja concentração já havia sido padronizada na titulação, em diferentes concentrações do seu peptídeo antes da incubação nos cortes histológicos. O teste de adsorção para a Ten-2 evidenciou que houve ausência de imunorreatividade em grande parte dos territórios neuronais analisados, entretanto, mesmo nas concentrações mais elevadas do peptídeo não houve a total saturação dos sítios de ligação do anticorpo primário anti-Ten-2 nos neurônios do córtex cerebral (Figura 6). O teste de adsorção para Ten-3 não mostrou imunomarcações, como observado na região hipotalâmica que apresentou intensa densidade de fibras imunorreativas para Ten-3 e, após adsorção houve ausência desta imunomarcação (Figura 6). Com relação à Ten-4 o anticorpo comercial anti-Ten-4 fornecido pela empresa Santa Cruz Biotechnology® não possui peptídeo correspondente o que impossibilitou a confirmação da interação do anticorpo com seu peptídeo pelo método de adsorção. Resultados 42 F ig u ra 6 . T es te d e ad so rç ão d o a n ti co rp o p ri m ár io p ar a T en -2 e T en -3 . F o to m ic ro g ra fi as e m c am p o c la ro e v id en ci an d o a c am ad a p ir am id al i n te rn a d o có rt ex c er eb ra l (A -C ) e a re g iã o d o n ú cl eo a rq u ea d o p re se n te n o h ip o tá la m o ( D -F ) .N a fo to m ic ro g ra fi as d e A -C v er if ic a- se a i m u n o rr ea ti v id ad e ap ó s ad so rç ão d o a n ti co rp o p ri m ár io a n ti - T en -2 ( S an ta C ru z B io te cn o lo g y ® ). E m ( D ) é d em o n st ra d o i n te n sa i m u n o rr e at iv id ad e em f ib ra s p re se n te n o n ú cl eo ar q u ea d o p ar te l at er al ( A rc L ) o b se rv ad o e m m ai o r au m en to e m D ’. N as d em ai s fo to m ic ro g ra fi as ( E e F ) v er if ic o u -s e au sê n ci a d e im u n o m ar ca çã o q u an d o d a ad so rç ão d o a n ti co rp o p ri m ár io a n ti - T en -3 ( S an ta C ru z B io te cn o lo g y ® ). Resultados 43 4.2 Resultados do objetivo 1: Distribuição da teneurina-2 e teneurina-4 no SNC de primatas não-humano (Sapajus spp) Para o mapeamento neuroanatômico da distribuição da proteína Ten-2 e Ten-4 foi realizada a submissão de séries completas de cortes histológicos do SNC de três animais à técnica de imuno-histoquímica pelo método de imunoperoxidase indireta. O mapeamento da distribuição da proteína Ten-2 foi realizada através do uso do anticorpo comercial anti-Ten-2 (165674, Santa Cruz Biotechnology®) na concentração de 1:100, e para Ten-4 foi empregado o anticorpo comercial anti-Ten-4 (H-50/134883, Santa Cruz Biotechnology ®) na concentração de 1:1000. A distribuição de fibras (campos terminais e de passagem) com imunorreatividade relacionada à Ten-2 (teneurina-2-“like immunoreactivity”- Ten-2-LI) não foi evidente, desta maneira não foi possível adotar o padrão semi-quantitativo de distribuição de fibras como adotado para as demais TENs analisadas. Apesar da ausência de fibras Ten-2-LI a imunomarcação foi evidenciada em dendritos e porção inicial de axônio que estiveram entremados a corpos neuronais imunomarcados, como notado no núcleo facial (7N) e núcleo pálido ventral (VP) (Figura 7). A distribuição de corpos e prologamentos neuronais (dendritos e segmento inicial do axônio) Ten-2-LI são mostradas na tabela 2. Figura 7. Distribuição dos prolongamentos (dendritos/segmento inicial de axônio) e corpos neuronais com imunorreatividade relacionada à Ten-2 (Ten-2-LI). Em (A) e (B) fotomicrografias em campo claro do núcleo facial (7N) e pálido ventral (VP). Resultados 44 A distribuição de fibras nervosas Ten-4 imunorreativas (teneurina-4-“like immunoreactivity” - Ten-4-LI) mostrou-se ampla, enquanto que a presença de corpos neuronais imunorreativos foi restrita a poucas regiões, principalmente concentrada em alguns territórios do córtex cerebral, tronco encefálico e cerebelo. Para a análise da densidade de fibras foi adotado o padrão semi-quantitativo de pouca, moderada e intensa densidade (Figura 8). Na tabela 3 são mostrados os territórios neuronais imunorreativos para Ten-4 no SNC do Sapajus spp. Figura 8. Representação da densidade de fibras com imunorreatividade relacionada à Ten-4 (Ten-4-LI). Fotomicrografias em campo claro demonstrando o padrão de três densidades de fibras em diferentes regiões do sistema nervoso central do Sapajus spp. (A) +++, intensa densidade; (B) ++, moderada densidade; (C) +, pouca densidade. Abreviaturas: sol, trato solitário; MDC, núcleo talâmico mediodorsal parte central; PaMD, núcleo paraventricular magnocelular divisão dorsal. 4.2.1. Teneurina-2 no SNC do Sapajus spp Telencéfalo. Na região do córtex cerebral nota-se a presença de corpos neuronais Ten-2-LI principalmente nas células das camadas piramidal interna e externa. Este padrão de imunorreatividade mostrou associado à membrana plasmática, assim como distribuído no citosol dos perfis neuronais (Figura 9). Na área amigdaloide anterior e núcleo medial da amígdala foram constatados poucos neurônios e prolongamentos neuronais Ten-2-LI, assim como em algumas áreas dos núcleos da base como pálido ventral (Figura 7) e região septal. Uma evidente presença de corpos neuronais Ten-2-LI foi notada na formação hipocampal nas camadas CA1 a CA4 e camada polimórfica (PoDG), além de granular do giro denteado (GrDG) (Figura 9). Discreta presença de prolongamentos neuronais Ten-2-LI foram observados na CA1 a CA4. Resultados 45 Diencéfalo Tálamo e Subtálamo. Somente foram verificados corpos neuronais Ten-2-LI nos núcleos geniculado lateral (Figura 10) e medial e núcleo subtalâmico. Hipotálamo. Não foram observados resultados relevantes tanto para corpos neuronais quanto para prolongamentos imunorreativos à Ten-2, sendo apenas notada discreta imunorreatividade para corpos neuronais no núcleo supra-óptico. Figura 9. Distribuição de corpos neuronais com imunorreatividade relacionada à Ten-2 (Ten-2-LI) em regiões telencefálicas. As fotomicrografias em campo claro como verificado em (A) e (B) mostram neurônios da camada piramidal interna do córtex cerebral do Sapajus spp. As setas indicam a imunomarcação encontrada no citosol, prolongamentos neuronais e na membrana plasmática do corpo neuronal. Em (C) formação hipocampal imunomarcada com destaque na figura (D) para neurônios Ten-2-LI na camada CA4 do hipocampo. Abreviaturas: 4(F1), área 4 do córtex (motor primário); CA1, camada CA1 do hipocampo; CA2, camada CA2 do hipocampo; CA3, camada CA3 do hipocampo; GrDG, camada granular do giro denteado. Tronco encefálico. A presença de corpos neuronais Ten-2-LI foi destacada na porção mesencefálica, em particular no núcleo oculomotor (3N) (Figura 10) e núcleo rubro (RMC). Resultados 46 Nas porções de ponte e bulbo, neurônios imunorreativos foram evidentes nos núcleos cocleares, núcleo facial (7N) e núcleo acessório (11N) (Figura 10). Os demais territórios do tronco encefálico com presença de Ten-2-LI estão descritos na tabela 2. Ressaltamos que os resultados da distribuição de prolongamentos imunorreativos foram evidentes no núcleo facial (7N) e núcleo acessório (11N). Figura 10. Distribuição de prolongamentos e corpos neuronais Ten-2-LI em áreas diencefálicas e do tronco encefálico do Sapajus spp. As fotomicrografias em campo claro como verificado em (A) evidenciam neurônios Ten-2-LI no núcleo geniculado lateral dorsal (DLG), destaque dos neurônios na Figura (B); em (C) neurônios Ten-2-LI no núcleo oculomotor (3N); em (D) neurônios e prolongamentos neuronais Ten-2-LI no núcleo facial (7N), destaque em maior aumento; em (E) e (F) neurônios e prolongamentos Ten-2-LI no núcleo coclear dorsal (DC), destaque em maior aumento e núcleo acessório (11N), destaque em maior aumento. Abreviaturas: mlf, fascículo longitudinal medial. Resultados 47 Cerebelo. Corpos neuronais Ten-2-LI foram encontrados na camada de células de Purkinje (Pk) (Figura 2) e nos núcleos profundos do cerebelo. Medula espinal. A distribuição de neurônios e prolongamentos Ten-2-LI foi evidente na porção ventral de todos os segmentos da medula espinal, como constatado nas lâminas medulares V-IX (Figura 11). Hipófise. Não foi constatada imunorreatividade para Ten-2. Resultados 48 Figura 11. Distribuição de corpos e prolongamentos neuronais Ten-2-LI na medula espinal do Sapajus spp. As fotomicrografias em campo claro monstram na coluna à esquerda uma visão panorâmica dos segmentos cervical alto (A), cervical baixo (B), torácica (C), lombar (D) e sacral (E). Na coluna à direita é evidenciado em maior aumento as áreas delimitadas na coluna esquerda que mostram corpos e prolongamentos neuronais Ten-2-LI na lâmina IX de cada segmento medular. Organização citoarquitetônica de acordo com REXED (1952). Resultados 49 Tabela 2. Distribuição de corpos e prolongamento neuronais com imunorreatividade relacionada à Ten-2 (Ten- 2-LI) no SNC do Sapajus spp. Sinal de (+) presença ou ausência (-) de corpos e prologamentos neuronais Ten-2- LI. 4.2.2 Teneurina-4 no SNC do Sapajus spp Telencéfalo. Pouco a moderada densidade de fibras nervosas com imunorreatividade relacionada à Ten-4 (Ten-4-LI) estavam concentradas na área amigdaloide, na região correspondente ao núcleo central da amígdala (Ce) e área amigdalohipocampal (AHiMC), sendo que nesta área também foram encontrados corpos neuronais imunopositivos (Figura 12). Fibras nervosas imunorreativas com densidade que oscilavam de moderada a intensa estavam presentes nos núcleos da base, em particular no pálido ventral (VP) e globo pálido externo (EGP) (Figura 12). Similar disposição de fibras nervosas imunorreativas foram Resultados 50 observadas na região septal como verificado no núcleo septal lateral parte ventral (LSV), na substância inominata (SIB), nas ilhas de Calleja (ICj) e no núcleo basal (Meynert) (B) (Figuras 12 e 13). Corpos neuronais imunorreativos também foram encontrados no núcleo amigdalóide cortical ventral (VCo), no núcleo caudado (Cd), putame (Pu) e globo pálido interno (IGP). Na formação hipocampal verificamos discreta presença de corpos neuronais Ten-4-LI nas camadas CA1 a CA4 do hipocampo, além da camada granular do giro denteado (GrDG). Figura 12. Distribuição de fibras e corpos neuronais Ten-4-LI em regiões telencefálicas do primata não-humano Sapajus spp. Em (A) fotomicrografia em campo claro evidenciando a distribuição panorâmica da Ten-4 em territórios telencefálicos. Em (B) nota-se a presença de intensa densidade de fibras nervosas Ten-4-LI no pálido ventral (VP). Em (C) visão panorâmica da distribuição de fibras Ten-4-LI, evidenciando na figura (D) moderada densidade no núcleo Basal de Meynert. Em (E) é verificada a área amigdalohipocampal (AHiMC) com poucas fibras e corpos neuronais Ten-4-LI. Abreviaturas: ac, comissura anterior; CeL, núcleo amigdaloide central divisão lateral; CeM, núcleo amigdaloide central divisão medial; EGP, globo pálido externo; ic, cápsula interna. Resultados 51 Figura 13. Distribuição de fibras nervosas Ten-4-LI em regiões telencefálicas do primata não-humano Sapajus spp. Em (A) fotomicrografia em campo claro evidenciando a distribuição panorâmica da Ten-4 em territórios telencefálicos. Em (B) nota-se a distribuição de pouca densidade de fibras Ten-4-LI no núcleo septal lateral parte intermédia (LSI); enquanto distribuição moderada de fibras nervosas pode ser observada no núcleo septal lateral parte ventral (LSV), evidenciada com maior resolução em (D). Em (C) distribuição moderada a intensa de fibras nervosas Ten-4-LI na substância inominata (SIB). Abreviaturas: ICjM, ilhas de Callejas; LV, ventrículo lateral. Diencéfalo Tálamo e Subtálamo. Pouca a moderada concentração de fibras nervosas Ten-4-LI foram observadas no núcleo talâmico mediodorsal parte central (MDC) (Figura 14). Corpos neuronais Ten-4-LI foram localizados no núcleo talâmico ventral lateral (VL), núcleo reticular do tálamo (Rt) e no núcleo geniculado lateral dorsal (DLG) (Figura 14) e medial (MG) e região no núcleo subtalâmico (STh). Resultados 52 Figura 14. Distribuição de fibras nervosas e corpos neuronais Ten-4-LI em regiões diencefálicas e mesencefálicas do primata não-humano Sapajus spp. Em (A) fotomicrografias em campo claro evidenciando a distribuição panorâmica da Ten-4 nestes territórios, destacando a região do núcleo talâmico mediodorsal parte central (MDC) com pouca a moderada concentração de fibras imunorreativas. Em (B) nota-se a presença de corpos neuronais Ten-4-LI no núcleo de Edinger-Westphal (EW). Em (C) são mostrados corpos neuronais exibindo Ten-4-LI no núcleo geniculado lateral dorsal (DLG), mostrado em maior resolução em (D). Abreviaturas: 3V, terceiro ventrículo; LPAG, substância cinzenta periaquedutal lateral. Hipotálamo. Pouca a moderada densidade de fibras Ten-4-LI foram presentes na zona periventricular do hipotálamo, em particular no núcleo arqueado lateral (ArcL), núcleo arqueado medial (ArcM), núcleo paraventricular magnocelular (PaM) e parvicelular (PaP). Na zona lateral e medial do hipotálamo foram observadas poucas fibras nervosas Ten-4-LI. É interessante ressaltar que as fibras nervosas Ten-4-LI apresentaram padrão morfológico Resultados 53 característico de fibras de passagem, porém sendo constatada em poucos territórios hipotalâmicos e extra-hipotalâmicos a presença de fibras varicosas que são sugestivas de possíveis campos terminais sinápticos. Tronco encefálico. A maior concentração de corpos imunorreativos foi observada na porção mesencefálica, em particular, no núcleo interpeduncular (IP), núcleo oculomotor (3N), no colículo superior (SC), e núcleo de Edinger-Westphal (EW) (Figura 14). Na porção correspondente a ponte e bulbo, os corpos neuronais imunorreativos foram notados no complexo olivar inferior (núcleo olivar inferior subnúcleo A, IOA) (Figura 15), núcleos vestibulares, núcleos cocleares, em particular no núcleo coclear ventral anterior (VCA) (Figura 15), núcleos pontinos, campo retrorubral (RRF), núcleo paragigantocelular dorsal (DPGi), núcleo reticular gigantocelular (Gi), núcleo cuneiforme (ECu) e grácil (Gr). Em relação à distribuição de fibras nervosas Ten-4-LI foram observadas moderada a intensa densidade de fibras no trato solitário (sol), trato espinal do nervo trigêmeo (sp5), núcleo reticular lateral parte subtrigeminal (LRtS5) (Figura 15) e no núcleo do nervo glossofaríngeo (9n). Nos demais territórios do tronco encefálico foram evidenciados a presença de moderada a pouca densidade de fibras Ten-4-LI. Resultados 54 Figura 15. Distribuição de fibras e corpos neuronais Ten-4-LI no tronco encefálico do primata não-humano Sapajus spp. Em (A) fotomicrografia em campo claro demonstrando a distribuição da Ten-4-LI no núcleo coclear ventral anterior (VCA), evidenciado em maior aumento em B. Em (C) fotomicrografia em campo claro referente a distribuição panorâmica da Ten-4-LI, notando-se intensa distribuição de fibras Ten-4-LI no trato solitário (sol) em (D) e no trato espinal do nervo trigêmeo (sp5) em (F). Em (E) é mostrado corpos neuronais Ten-4-LI no núcleo olivar inferior subnúcleo A (IOA). Abreviaturas: LRtS5, núcleo reticular lateral parte subtrigeminal; Sol, núcleo solitário. Resultados 55 Cerebelo. Corpos neuronais Ten-4-LI foram observados na camada de células de Purkinje (Pk) e nos núcleos cerebelares medial, lateral e interpósito, não sendo evidente a presença de fibras imunorreativas (Figura 16). Figura 16. Distribuição de prolongamentos e corpos neuronais Ten-4-LI no cerebelo do primata não-humano Sapajus spp. As fotomicrografias em campo claro vistas em (A) e (B) mostram corpos neuronais imunorreativos na camada de células de Purkinje do cerebelo (Pk) e no núcleo cerebelar lateral (Lat). Abreviaturas: GrCb, camada granular do cerebelo; MoCb, camada molecular do cerebelo. Medula espinal. Em todas as lâminas medulares foram verificadas fibras nervosas Ten-4-LI, porém maior densi