RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 29/09/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS ARARAQUARA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA CAIO DE AZEVEDO LIMA BIORREFINARIA DE RESÍDUO CÍTRICO VISANDO A OBTENÇÃO DE COLORANTES NATURAIS MICROBIANOS PARA APLICAÇÃO INDUSTRIAL Araraquara 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS ARARAQUARA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA CAIO DE AZEVEDO LIMA BIORREFINARIA DE RESÍDUO CÍTRICO VISANDO A OBTENÇÃO DE COLORANTES NATURAIS MICROBIANOS PARA APLICAÇÃO INDUSTRIAL Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientadora: Profª. Drª. Valéria de Carvalho Santos Ebinuma Araraquara 2021 Lima, Caio de Azevedo. L732b Biorrefinaria de resíduo cítrico visando à obtenção de colorantes naturais microbianos para aplicação industrial / Caio de Azevedo Lima. – Araraquara: [S.n.], 2021. 77 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Área de concentração: Ciências. Orientadora: Valéria de Carvalho Santos Ebinuma. 1. Biorrefinaria. 2. Subproduto cítrico. 3. Colorantes naturais. 4. Enzimas. 5. Talaromyces amestolkiae. I. Ebinuma, Valéria de Carvalho Santos, orient. II. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030081P7 Esta ficha não pode ser modificada UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Biorefinaria de resíduo cítrico visando a obtenção de colorantes naturais microbianos para aplicação industrial TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTOR: CAIO DE AZEVEDO LIMA ORIENTADORA: VALÉRIA DE CARVALHO SANTOS EBINUMA Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA, área: Análises Clínicas pela Comissão Examinadora: Profa. Dra. VALÉRIA DE CARVALHO SANTOS EBINUMA (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Profa. Dra. FERNANDA PERPETUA CASCIATORI (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia Química / Universidade Federal de São Carlos Prof. Dr. FERNANDO MASARIN (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Araraquara, 29 de setembro de 2021 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA-JAÚ, KM 1 - CP 502, 14800903 http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/biociencias-e-biotecnologias-aplicadas-a-farmacia/CNPJ: 48.031.918/0025-00. DEDICATÓRIA A Deus força maior, Aos espíritos benfeitores, A minha Família: minha mãe Selma, meu pai Celso, Dedico. EPÍGRAFE “É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.” (Theodore Roosevelt) AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus, causa primeira de todas as coisas, que me permitiu vivenciar essa experiência. Aos meus mentores espirituais e espíritos benfeitores pelas boas energias e influências positivas na minha vida. Aos meus pais Selma e Celso por tudo que me proporcionaram. Vocês são os alicerces responsáveis por essa conquista e eu sempre serei eternamente grato. Agradeço principalmente pelo amor incondicional e pelos esforços imensuráveis para que eu pudesse realizar meus objetivos. Amo vocês eternamente. Aos meus familiares, pelo amor, incentivo е apoio incondicional. À orientadora Profa. Dra. Valéria Ebinuma, pela confiança, apoio, incentivo e disponibilidade sempre apresentada ao longo de todo este trabalho. Obrigado por ter me fornecido uma oportunidade valiosa de trilhar meu caminho no desenvolvimento de ciência de qualidade. A minha querida professora e amiga Dra Glauciane Coelho, pelo imenso carinho, amor e paciência. Aos docentes, técnicos e demais funcionários do Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia pelo apoio, paciência e disponibilidade durante a realização deste trabalho. Aos meus amigos “Anormais”, em especial meu querido Davi, Kamila, Tácia, Marco, Rainy e Dayse. Obrigado por todo o amor, por toda paciência, companhia e risadas. Aos meus amigos de Tuparetama, em especial Henrique e Érika, meus irmãos de coração, obrigado pelos momentos de desabafo, conselhos, carinho e sinceridade. Aos meus amigos de Araraquara, Dona Terezinha e Marcos, por terem me acolhido desde o início e me ajudarem em diversos momentos. Aos meus amigos, em especial a minha irmã e companheira Laura que dividiu esta aventura acadêmica comigo e me auxiliou em diversos momentos. Aos amigos de laboratório, Fernanda, Gabi, Ariane, Vitória, Flávio, Milca, Graci, Heitor, Rodney, Rafael e Victor por todos os momentos, por toda a aprendizagem, amizade, sinceridade e companhia. Aos companheiros do grupo de pesquisa BioPPul, obrigado pela paciência, auxílio e disponibilidade durante a realização deste trabalho. Agradecimento especial a Faculdade de Ciências Farmacêuticas FCF e a Universidade Estadual Paulista UNESP por ter oportunizado essa conquista. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior (CAPES), À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela importante contribuição financeira para a realização deste projeto. Durante esta aventura acadêmica, diversas pessoas contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho a quais eu serei eternamente grato a cada uma delas. Sumário RESUMO............................................................................................................ 9 ABSTRACT ...................................................................................................... 10 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 11 2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 13 2.1 Biorrefinaria ............................................................................................ 13 2.2 Biomassa e Subprodutos Agroindustriais ............................................... 15 2.2.1 Agroindústria brasileira e Indústria cítrica ........................................ 17 2.2.2 Biorrefinaria de subprodutos cítricos ................................................ 19 2.2 Colorantes .............................................................................................. 25 2.2.1 Colorantes naturais microbianos ...................................................... 27 2. OBJETIVO GERAL ...................................................................................... 31 2.1 Objetivos Específicos: ......................................................................... 31 3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 32 3.1 Material ................................................................................................... 32 3.2 Caracterização química do subproduto cítrico ........................................ 32 3.2.1 Extração do Limoneno ..................................................................... 32 3.2.2 Quantificação do Limoneno por CG/GC ........................................... 32 3.2.3 Extração de pectina .......................................................................... 33 3.2.4 Composição química ........................................................................ 34 3.2.5 Hidrólise ácida .................................................................................. 34 3.2.6 Determinação do teor de cinzas ....................................................... 35 3.3 Produção do colorante vermelho ............................................................ 35 3.3.1 Microrganismo .................................................................................. 35 3.3.2. Preparo do inóculo .......................................................................... 35 3.3.3 Preparo do meio de cultivo ............................................................... 36 3.4 Métodos Analíticos ................................................................................. 39 3.4.1 Concentração de biomassa .............................................................. 39 3.4.2 Análise de Açúcares por CLAE/HPLC .............................................. 39 3.4.3 Quantificação de Colorantes Naturais .............................................. 39 3.4.4 Determinação de Atividades Enzimáticas ........................................ 40 3.5. Estatística ............................................................................................ 41 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 42 4.1 Análise química do subproduto cítrico .................................................... 42 4.2 Produção do colorante vermelho ............................................................ 44 4.3 Produção de enzimas celulolíticas por Talaromyces amestolkiae .......... 50 5. PERSPECTIVAS FUTURAS ........................................................................ 53 6. CONCLUSÃO .............................................................................................. 54 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 55 8. APÊNDICE ................................................................................................... 74 RESUMO Considerando que o Brasil é um país com alta geração de resíduos agroindustriais, estudos acerca do aproveitamento de tais resíduos, principalmente, para obtenção de produtos de valor agregado, são de grande interesse. Assim, a produção de colorantes naturais fúngicos utilizando subproduto de baixo custo, como compostos provenientes do processamento da indústria cítrica, ganha importância com vista para o desenvolvimento de biorrefinaria para produção desse bioproduto em escala industrial. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar a aplicação de um subproduto da indústria cítrica como fonte de carbono para a produção de colorantes por Talaromyces amestolkiae em cultivo submerso em agitador orbital. Inicialmente, o subproduto cítrico foi caracterizado quanto a composição química, contendo compostos como a lignina (21,6 %m.m-1), hemicelulose (13,5 %m.m-1) celulose (11,9 %m.m-1). A produção dos colorantes naturais vermelhos foi realizada inicialmente aplicando diferentes fontes de carbono (glicose, xilose e pectina) e fonte de nitrogênio (glutamato monossódico-GMS) comerciais. Posteriormente, a produção dos colorantes foi avaliada utilizando o subproduto cítrico não-tratado e pré-tratado (remoção de pectina), e suplementado com as fontes de carbono e nitrogênio comerciais supracitadas. A melhor condição de produção de colorantes vermelhos observada foi empregando glicose e xilose comercial, 10,0 e 5,0 g.L-1, respectivamente, com 25 g.L-1 de GMS em cultivo submerso à 150rpm/30°C/168h, atingindo em torno de 16,1 UA500nm. Na presença do resíduo cítrico, a máxima produção observada foi com 56,0 gramas de subproduto cítrico tratado por litro de meio de cultivo, chegando a 4,27 UA500nm. Avaliou-se também a produção de enzimas celulolíticas durante o cultivo e obteve-se um máximo de, aproximadamente, 0,20 UI.mL-1 para endo-glucanase; 0,87 UI.mL-1 para xilanase e 2,90 UI.mL-1 para β- glucosidase ao se empregar subproduto cítrico pré-tratado. Esses resultados revelam o potencial de resíduos agroindustriais da indústria cítrica para a geração de colorantes naturais através do conceito de biorefinaria, contribuindo para o desenvolvimento sustentável e fortalecimento dos bioprocessos. Palavras-chave: Biorrefinaria, subproduto cítrico, colorantes naturais, enzimas, Talaromyces amestolkiae. ABSTRACT Considering agrobusiness is the largest economic sector in Brazil and it generates a high amount of residues, studies about the use of agro-industrial residues, mainly to obtain high added value products, are of great interest. So, the production of natural fungal colorants using a low-cost by-product, such as wastes from the citrus industry, plays an important role to the development of biorefineries for the production of this bioproduct on an industrial scale. Thus, this work aims to study the application of a citrus industry by-product of as carbon source for the production of colorants by Talaromyces amestolkiae in submerged culture in orbital shaker. Initially, the citrus by-product was characterized in terms of chemical composition, containing as major compounds lignin (21.6 %m.m-1), hemicellulose (%13.5 m.m-1) cellulose (11.9 %m.m- 1). The production of natural red colorants was firstly carried out by applying different commercial carbon (glucose, xylose and pectin) and nitrogen (monosodium glutamate, GMS) sources. Subsequently, the production of colorants was evaluated using the untreated, pretreated (pectin removal) citrus by-product and supplemented with the aforementioned sources of carbon and nitrogen. The best condition for the production of red colorants using commercial glucose and xylose, 10.0 and 5.0 g. L-1, respectively, and GMS (25 g. L-1) in submerged culture at 150rpm/30°C/168h, was around 16.1 UA500nm. In the presence of citrus waste, the maximum production observed was with 56.0 grams of treated citrus by-product per liter of culture medium, achieving 4.27 UA500nm. The production of cellulolytic enzymes during cultivation was also evaluated and a maximum of, approximately, 0.20 UI.mL-1 for endo-glucanases; 0.87 IU.ml-1 for xylanase and 2.90 UI.mL-1 for β-glucosidase was obtained using pretreated citrus by- product. These results reveal the potential for application of agro-industrial residues that, through the biorefinery concept, acquire a noble destination as the generation of high commercial value biomolecules, namely natural colorants contributing to sustainable development and strengthening of bioprocesses. Keywords: Biorefinery, citrus by-product, natural colorants, enzymes, Talaromyces amestolkiae. 11 1 INTRODUÇÃO O desenvolvimento de plantas industriais projetadas para extrair moléculas valiosas de subprodutos agroindustriais emergiu a partir da necessidade de aproveitamento desta biomassa (BRAGA et al., 2017) e se tornou mais evidente, principalmente, entre as décadas de 1980 e 1990 com o surgimento do termo Biorrefinaria, o qual, posteriormente, emergiu como um campo promissor para a área de bioprocessos (LEXICO-OXFORD, 2021; MERRIAM-WEBSTER, 2021; KAMM et al., 2016). Uma Biorrefinaria pode ser descrita de diferentes formas, porém, uma definição ampla que contempla o sentido geral é que, “Biorrefinaria é uma instalação que integra processos e equipamentos para realizar a conversão de matéria orgânica em combustíveis, energia, produtos químicos e/ou produtos de alto valor agregado” (NREL, 2017; BERNTSSON et al., 2013). Atrelado a isso, o uso de recursos renováveis como matéria-prima pode favorecer sistemas que aplicam a economia circular por manter o carbono da biomassa no processo por mais tempo (TEIGISEROVA et al., 2019; BELTRÁN-RAMÍREZ et al., 2019). Considerando os subprodutos agroindustriais que apresentam grande potencial de valorização no mercado, pode se destacar os resíduos do processamento de cítricos, predominantemente detritos de sumo de laranja. A indústria cítrica desempenha papel importante na economia global e gera grande quantidade de subprodutos (CIRIMINNA et al., 2015). Entre esses subprodutos, a sobra do processamento do suco de laranja é um material que pode conter compostos de interesse industrial e/ou comercial, como açúcares fermentescíveis, polissacarídeos, flavonóides, polifenóis e óleos essenciais (ZEMA et al., 2018a). Devido a riqueza de moléculas presentes neste resíduo, a destinação para processos de bioconversão por microrganismo se lança como uma alternativa nobre com o intuito de se obter bioprodutos de valor e interesse comercial. Assim, a produção e/ou extração de moléculas com base no conceito de biorrefinaria é relevante, especialmente no contexto de biorrefinarias cítricas em larga escala nos países produtores de citros (CIRIMINNA et al., 2018). A matéria orgânica do subproduto cítrico pode ser empregada para a produção de biomoléculas como, por exemplo, os colorantes naturais (KANTIFEDAKI et al., 2018). Os colorantes naturais, também conhecidos como biocolorantes, tem atraído crescente atenção, principalmente, das indústrias farmacêutica e de alimentos, por 12 serem biodegradáveis, além da possibilidade de apresentarem propriedades farmacológicas como, atividade antimicrobiana, antioxidante, imunossupressora, antiviral, anticancerígena e redutora de colesterol (CAROCHO et al., 2014; SHARMA et al., 2011; DOWNHAM; COLLINS, 2000). Essas vantagens somadas à crescente preocupação da população com a saúde e o meio ambiente faz com que estes compostos ganhem destaque no mercado (MARTINS et al., 2016; BALAKRISHNAN et al., 2016; ZHANG, 2016; OPLATOWSKA-STACHOWIAK et al., 2015; AMCHOVA et al., 2015;). Em relação ao mercado de total de colorantes, uma pesquisa realizada pela Grand View Research, Inc. estima para 2025 um valor acerca de US$ 37,49 bilhões. Deste total, os colorantes naturais são estimados em, aproximadamente, US$ 2,0 bilhões com uma taxa composta de crescimento anual (CAGR, do inglês “Compound Annual Growth rate”) de 4,9% até 2025. Entre as fontes produtoras de colorantes, os microrganismos destacam-se devido a facilidade de produção, algumas espécies não produzem compostos tóxicos e os colorantes produzidos são mais estáveis que outras congêneres naturais (FRISVAD et al., 2013). Assim, diversas linhagens têm sido estudadas, tais como Aspergilus, Penicillium e Talaromyces (DUFOSSÉ, 2014; SANTOS-EBINUMA et al., 2013). Dentre o gênero Talaromyces, a espécie T. amestolkiae não produz substâncias tóxicas e biossintetiza colorantes azafilonas provenientes da via dos policetídeos com cores amarela, laranja e vermelha, sendo um candidato promissor para produção e aplicação em diferentes matrizes (DE OLIVEIRA et al., 2020b; DE OLIVEIRA et al., 2019; ZACCARIM et al., 2019). Diante do exposto, o presente trabalho pretende avaliar o potencial do subproduto cítrico, por meio do conceito de biorrefinaria, como fonte de carbono na obtenção de produtos de valor agregado, nomeadamente, colorantes naturais e enzimas celulolíticas, por meio do cultivo submerso de Talaromyces amestolkiae. Os resultados deste trabalho contribuem para o desenvolvimento sustentável através do uso de subprodutos agroindustriais e fortalecimento do desenvolvimento de bioprocessos. 54 6. CONCLUSÃO Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o subproduto cítrico detém polissacarídeos que podem ser utilizados como fonte de carbono para produção de diversas biomoléculas, especificamente, enzimas celuloliticas e colorantes naturais por bioconversão empregando o microrganismo T. amestolkiae. O microrganismo produziu colorantes em todas as condições estudadas, tanto com subproduto não-tratado quanto no subproduto tratado (sem pectina). Portanto, este trabalho evidenciou a versatilidade deste microrganismo e a capacidade de aplicação do T. amestolkiae na biorrefinaria e bioprocessos, valorizando o subproduto cítrico por meio da biotransformação e produção de diversas biomoléculas de interesse comercial e industrial. 55 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADEEL, S.; HUSSAAN, M.; REHMAN, F.; HABIB, N.; SALMAN, M.; NAZ, S.; AKHTAR, N. Microwave-assisted sustainable dyeing of wool fabric using cochineal-based carminic acid as natural colorant. Journal of Natural Fibers, p. 1–9, 2018. AHMED, I.; ZIA, M. A.; HUSSAIN, M. A.; AKRAM, Z.; NAVEED, M. T.; NOWROUZI, A. Bioprocessing of citrus waste peel for induced pectinase production by Aspergillus niger; its purification and characterization. Electronic Journal of Environmental Agriculture. Food Chemistry. v. 9, p.148–154, 2016. AKOGOU, F. U.; KAYODÉ, A. P.; DEN BESTEN, H. M.; LINNEMANN, A. R. Extraction methods and food uses of a natural red colorant from dye sorghum. 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