RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 22/09/2016. Eduarda de Lima Graciano Belem Aspirado de medula óssea e plasma rico em plaquetas, associados ou não à terapia com laser em baixa intensidade no reparo ósseo. Estudo histomorfométrico e imunoistoquímico ARAÇATUBA - SP 2016 Eduarda de Lima Graciano Belem Aspirado de medula óssea e plasma rico em plaquetas, associados ou não à terapia com laser em baixa intensidade no reparo ósseo. Estudo histomorfométrico e imunoistoquímico Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba - UNESP, para a obtenção do Título de MESTRE EM ODONTOLOGIA (Área de Periodontia). Orientadora: Prof a Adj. Maria José H. Nagata Coorientador: Prof. Titular Valdir G. Garcia Coorientador: Prof. Ass. Dr. Edilson Ervolino ARAÇATUBA - SP 2016 Catalogação na Publicação Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação - FOA / UNESP Belem, Eduarda de Lima Graciano B428a Aspirado de medula óssea e plasma rico em plaquetas associados ou não à terapia com laser de baixa intensidade no reparo ósseo: estudo histomorfomérico e imunoistoquímico / Eduarda de Lima Graciano Belem. -- Araçatuba, 2016. 87 f. : 8 il. + CD-ROM. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba. Orientadora: Profa. Maria José Hitomi Nagata Coorientador: Prof. Valdir Gouveia Garcia Coorientador: Prof. Edilson Ervolino 1.Medula óssea. 2. Plasma Rico em Plaquetas. 3. Terapia a laser de baixa intensidade. 4.Ratos. I. T. Black D6 CDD 617.601 Dedicatória Aos meus amados pais, Sandra e Francisco Mãe, A senhora dedicou a sua vida para que eu e meus irmãos tivéssemos uma execelente educação, senso crítico e respeito ao próximo. Deixou seus sonhos para sonhar o nosso! Você sempre foi meu porto seguro e minha melhor amiga. Mesmo sem entender, respeitou a minha escolha de fazer mestrado, e, mesmo à distancia sempre se fez presente, incentivando-me a não desistir dos meus sonhos. Meu maior objetivo de vida é dar orgulho a senhora e poder retribuir toda a dedicação que me ajudaram a chegar até aqui. Pai, Com o senhor aprendi, que se uma pessoa quer alcançar seus objetivos, deve se dedicar integralmente aquilo. O senhor é exemplo de trabalho e dedicação. Tívemos algumas divergências ao longo desses últimos anos, mas fico muito feliz por conseguirmos nos aproximar mais na relação pai e filha neste último semestre. Aprendemos juntos a sermos pessoas melhores e a nos respeitarmos, espero que um dia o senhor consiga ter a mesma relação com meus irmãos. Obrigada pelo incentivo em ser uma profissional cada vez melhor e por proporcionar condições para que eu concluísse mais esse sonho. “Antes de sermos pais e mães, somos seres humanos, passíveis de falhas e erros.... então, a única coisa que podemos aconselhar aos nossos filhos, através de experiência já vivenciada, é como não repetirem os nossos erros.” Cláudia Belucci Aos meus irmãos André e Fernanda Passamos por um momento muito difícil em nossas vidas, tivemos que amadurecer muito rápido, cicatrizes que levaremos para sempre. O importante é que conseguimos passar por tudo sempre unidos. Somos irmãos, amigos e, por vezes, pais um do outro. Vocês estiveram com nossa família quando eu não pude estar, e por isso sou muito grata a vocês! Tenho muito orgulho dos adultos que estão se tornando, pessoas que respeitam o próximo e suas diferenças. Vocês sonharam este sonho comigo, agora é a minha vez de ver e ajuda-los a conquistarem os de vocês. “Ter uma irmão é ter, para sempre, uma infância lembrada com segurança em outro coracão.” Tati Bernardi Agradecimentos Especiais À minha orientadora Professora Dra. Maria José Hitomi Nagata Agradeço a senhora pela oportunidade de realizar o mestrado, pelo acolhimento no Programa de Pós- graduação em Odontologia, e pela orientação durante este período. Através da senhora eu conheci os aspectos mais importantes do cenário mundial de pesquisa, e melhorei meu senso crítico profissional. A senhora me orientou a realizar da melhor maneira os procedimentos clínicos, sempre valorizando muito os pacientes, alimentando assim, o meu desejo de oferecer o melhor tratamento a eles. Orientou-me também a ser rigorosa com minhas atividades acadêmicas, sempre com muito comprometimento e dedicação. Agradeço imensamente pela paciência com que lidou com minha inexperiência. Com dedicação integral da senhora este trabalho pôde ser concluído com alto rigor de qualidade. Muito obrigada! “Um professor é a personificada consciência do aluno; confirma-o nas suas dúvidas; explica-lhes o motivo de sua insatisfação e lhe estimula a vontade de melhorar.” Thomas Mann Ao meu coorientador Professor Dr. Valdir G. Garcia Agradeço imensamente ao senhor por nos oferecer um olhar de experiência sobre a vida acadêmica, e valorizar em nós, os sentimentos mais bonitos, como a alegria e a vontade de viver. O senhor quando chega em nosso laboratório leva um alto astral, que é muito importante para nos manter firmes em direção às nossas metas! Com muita simplicidade nos acolhe frente às preocupações que surgem durante a nossa vida de pós-graduação. No senhor encontramos um modelo de pesquisador, que tem sede do conhecimento e vê possibilidades em todas as coisas para se pesquisar e conquistar novos entendimentos. O senhor sempre esteve disposto a nos ajudar. Durante uma fase deste trabalho, tivemos um problema com o equipamento de laser e o senhor cuidou pessoalmente de resolver para que não houvesse atraso e prejudicasse o andamento dos experimentos. Só tenho a agradecê-lo por tudo e desejar que o senhor continue sendo essa pessoa agradável de se conviver! Ao meu coorientador Professor Drº. Edilson Ervolino Agradeço imensamente por poder contar com o senhor como meu coorientador e pela compreensão em todos os momentos do mestrado. O senhor é um exemplo de professor realmente comprometido com o aprendizado dos alunos, no qual todos querem se espelhar! É um pesquisador extremamente qualificado e isso é resultado do comprometimento com que o senhor realiza todas as coisas. Este trabalho não poderia ser realizado sem o seu empenho em fazer todas as coisas da melhor maneira. Muito obrigada por tudo professor! “A tarefa essencial do Professor é despertar a alegria de trabalhar e de conhecer.” Albert Einstein À querida Professora Drª. Suely Mogami Bonfim Agradeço pelo empenho em realizar essa pesquisa. Através do mestrado eu tive a satisfação de conhecê-la e em pouco tempo me identifiquei com a sua maneira tranquila de conduzir as coisas, tornando os experimentos momentos agradáveis. A senhora sempre foi muito receptiva com as nossas idéias e dúvidas, facilitando o desenvolvimento em cada metodologia. A senhora foi uma mãe enquato estava longe da minha família. Sempre esteve disposta a ouvir e aconselhar mesmo em assuntos pessoais. Vou levá-la para sempre emmeu coração! Muito obrigada! “Ser Professor é ser condutor de almas e de sonhos...” Gabriel Chalita À querida Professora Drª. Elenice Deffune Que bom que a vida nos deu a oportunidade de conhecer a senhora e formar uma parceria durante a execução deste trabalho. A senhora é exemplo de ser humano digno e de respeito ao próximo. Sempre esteve disposta a nos orientar e ensinar. Que a sua vida seja repleta de luz e sabedoria. Muito obrigada! “Ser professor é semear em terreno sempre fértil e se encantar com a colheita.” Gabriel Chalita À amiga Carol Você acompanhou meu desenvlvimento desde a iniação científica. Fico muito feliz de saber que o mestrado não foi só um momento de aperfeiçoamento profissional, mas também um momento de desenvolvimento pessoal, pois a relação que mantivemos foi nos dois sentidos muito satisfatória. Mais que uma companheira, você foi para mim uma amiga, que com sua experiência me ajudou a lidar com todos os obstáculos que tive durante este período. Cada vez que te conheço mais tenho certeza que você nasceu para a docência. Faz tudo com rigor de qualidade e ensina com prazer. Muitíssimo obrigada! “Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina” Cora Coralina À amiga Eliana Você foi àquela pessoa de confiança com a qual eu podia compartilhar minhas confidências, sem medo de não ser compreendida. Somos dupla desde a Graduação, quanta coisa já passamos né? Partilhamos felicidades, vitórias, choros, ansiedade e o mais importante amadurecemos muito! Você é exemplo de determinação, garra e muita fé. Quase que você me converteu! Amiga, dizer apenas “obrigada” por tudo que você fez por mim, por toda ajuda dispensada seria pouco... Minha gratidão será eterna! Saiba que, onde quer que você esteja, pode contar comigo com a mesma intensidade que pude contar com você incondicionalmente quando precisei... Você é uma amiga que estará pra sempre no meu coração! Muito obrigada por tudo! Que nesta nova jornada que está por vir você tenha muita luz, sabedoria e sucesso! Você merece! “A amizade desenvolve a felicidade e reduz o sofrimento, duplicando a nossa alegria e dividindo a nossa dor.” Joseph Addison Agradecimentos Pela minha formação profissional. . . Ao Professor Dr. Álvaro Francisco Bosco A presença do senhor sempre alegrou nossas quartas-feiras e sua experiência profissional me estimulou a procurar cada vez mais, oferecer o melhor tratamento para os meus pacientes. O olhar compreensivo e descontraído com que o senhor nos olhava durante as cirurgias, me fazia se sentir mais tranquila e segura e é nisto que consiste o ensinar. Muito obrigada professor! À Professora Drª. Letícia Theodoro Agradeço por cuidar com muita dedicação do departamento da Pério e por ter atuado com muita compreensão com cada um de nós no dia-a-dia. Que a senhora continue sempre essa pessoa entusiasmada com tudo que faz, e assim alcance todas as suas metas. pude acompanhar com a senhora uma forma muito dinâmica de trabalhar, que certamente será sempre lembrada por mim na vida profissional. Muito obrigada! Ao Professor Dr. Juliano Milanezi Agradeço por todo o acompanhamento na pós-graduação, em especial, pelas clínicas de pós- graduação em que o senhor nos orientou desde as técnicas empregadas nas cirurgias, até a maneira como agir com o paciente. Sou muito grata pelo conhecimento adquirido durante esses anos. Quando eu crescer quero ser tão boa cirurgiã quanto o senhor! Muito obrigada por tudo! Ao Professor Dr. Wilson Roberto Poi Tivemos maior contato durante o meu curso de mestrado, pudemos construir uma amizade que vai além do professor/aluna. O senhor é uma pessoa de muita luz e sabedoria. Sempre vou lembrar- me de um dia durante uma aula da disciplina de “Metodologia do Ensino”, que o senhor veio à minha carteira, pegou na minha mão e perguntou se estava tudo bem, mesmo eu estando quientinha no meu canto, como sempre faço. No dia eu falei que estava tudo bem, mesmo estando muito preocupada com alguns problemas pessoais. Achei uma sensibilidade de sua parte perceber o aluno como um todo. Sem dúvidas o senhor é um grande exemplo de Mestre! Muito obrigada por tudo! Ao Professor Dr. Michel Messora Agradeço pelo suporte, pois o senhor sempre esteve muito disposto a nos ajudar e mesmo distante sempre se esforçou em esclarecer nossas dúvidas. Muito obrigada! À Professora Drª. Rita de Cássia Dorneles Agradeço por sempre poder contar com os equipamentos do laboratório da senhora e por estar sempre disposta a ajudar em qualquer momento. Muito obrigada! Ao Dr. Renato Murakawa e equipe COIE Odontologia O tempo que fiquei na COIE Odontologia foi muito curto, mas de grande aprendizado. Dr. Renato, com você pude redescubrir a beleza da clínica geral, aprender o dia-a-dia da clínica e acompanhar seus procedimentos sempre feitos com muita qualidade e respeito ao paciente. Vou levar para sempre os conhecimentos adquiridos ao seu lado. Muito obrigada por tudo! E muito obrigada a equipe da COIE que sempre me recebeu muito bem. Muito sucesso a todos! "Quando a gente ensina, a gente continua a viver na pessoa que foi ensinada!” Rubem Alves À pós-doutoranda Natália Campos Agradeço por toda a ajuda que me concedeu, principalmente no final do mestrado, onde eu com minha inexperiência necessitei de um olhar compreensivo a me ensinar a fazer as coisas e você esteve lá me orientando em tudo!Muito obrigada! Aos colegas da Periodontia Paula, Vivian, Márcio, Alessandra, David, Natália, Nayara, Joílson e todos os alunos de iniciação científica Cada um de vocês participou desse período de minha vida e em cada momento me transmitiram ensinamentos que levarei para a vida toda. Que cada um possa alcançar seus objetivos! Ao Dr. Stephen Fucini Agradeço pelos aprendizados valiosos, principalmente na área clínica. O tempo que estivemos juntos foi pequeno, mas de grande valor, pois o senhor não mediu esforços para me dar o máximo de atenção e transmitir os valores clínicos adquiridos através de sua experiência. Nunca esquecerei dos ensinamentos transmitidos! Thank you very much! Ao Sr. Odair Agradeço pelo carinho com que o senhor cativa as pessoas! O senhor é uma pessoa cheia de vida e alegria que transmite sentimentos muito bons e por isso é querido por todos. Muito obrigada! À Supervisora Técnica da Biblioteca Ana Cláudia Agradeço pela receptividade, cuidado e atenção em me ajudar. Desejo muita luz e sabedoria em sua trajetória. Muito obrigada por tudo! Aos porteiros Márcio e Willian Obrigada por cada momento discontraído compartilhado. Pela preocupação quando eu ficava até tarde e também aos finais de semana no laboratório. Sei que torceram juntos para que tudo desse certo. Desejo a vocês muita felicidade e saúde. Daqui a pouco serão as filhas de vocês correndo atrás dos seus sonhos e enchendo vocês de orgulho. Muito obrigada por tudo! “Unir-se é um bom começo. Manter a união é um progresso. Trabalhar em conjunto é uma vitória.” Henry Ford Pelo amor e pela amizade incondicionais Ao meu amor Otávio Se hoje eu cheguei até aqui, certamente foi motivada e impulsionada por seu amor, apoio, doação e companheirismo... Com você, pude aprender o verdadeiro significado do amor. Obrigada por ter compartilhado sua família, por compreender minhas ausências, pela paciência e por querer sempre o melhor de mim e para mim. Você tem o dom de me fazer bem pelo simples fato de estar presente em minha vida. Obrigada por estar sempre ao meu lado. Amo você! “O amor só é lindo, quando encontramos alguém que nos transforme no melhor que podemos ser.” Autor desconhecido Aos meus sogros Jorge e Sandra, cunhados Letícia, Flávio e Nayara. À família Rodrigues e agregados, Dona Gê, Sr Acássio, Tia Kátia, Tio Junior, Tia Dé, Tio Ataíde, Tia Yara, Luiza, Laís, Carol, Daniel e Bento Agradeço por terem me acolhido como membro de uma família tão bonita. Pela amizade, pelo carinho e por compartilharem minhas vitórias. Também agradeço pelo bem precioso que uniu nossas vidas. Dona Gê muito obrigada por colocar meu nome em suas orações, a senhora é exemplo de dedicação, amor e fé. Muito obrigada por serem minha família enquanto estava longe da minha. “As melhores e as mais lindas coisas do mundo não se pode ver nem tocar. Elas devem ser sentidas com o coração.” Charles Chaplin Aos amigos Bárbara, Bruno e Sr. Nilton Flumian Vai ser difícil agora sem o salário que o Nilton me paga para ser amiga de vocês (brincadeira). Fomos companheiros de casa, de vida, de alegria, de aprendizado, de frustações e da luta em busca dos sonhos... Vocês são as pessoas de mais fácil convivência com quem já dividi os meus dias em toda minha vida! Agradeço a vocês pela amizade e apoio. Meninos, o pai de vocês é maravilhoso nunca se esqueçam disso! Muitíssimo obrigada por tudo! “A amizade é o conforto indescritível de nos sentirmos seguros com uma pessoa, sem ser preciso pesar o que se pensa, nem medir o que se diz.” George Eliot Aos amigos Giovanni, Diego Watanabe e Diego Parisati Vocês sempre estiveram dispostos a renovar o astral com momentos de alegria mesmo quando estava sem forças para seguir em frente! A amizade de vocês é especial demais para mim! Obrigada pela convivência agradável e pela disponibilidade incansável. “Não importa quanta seriedade a vida exija de você, cada um de nós precisa de um amigo brincalhão para se divertir.” William Shakespeare Aos meus queridos amigos Renan, Miwa,Laiane Natália, Pamela Maiara, Sheila, Bruno Iyda e Bárbara Comitre Aprendemos a viver sem cobranças, aproveitando a liberdade para nutrir a saudade que torna nossa amizade tão especial! Ainda que estivéssemos distantes, vocês se fizeram presentes em todos os momentos importantes da minha vida, comemoraram minhas vitórias e me deram apoio nos momentos de dificuldade. As circunstâncias da vida me fizeram ter poucos, mas verdadeiros amigos como vocês, com quem eu sei que sempre posso contar. A alegria com que vocês compartilham comigo minhas conquistas é rara. Peço desculpas pelas longas ausências em que eu tive que me dedicar integralmente ao meu curso e agradeço por compreenderem que isso fazia parte da minha caminhada para realização de um sonho. " Nenhum caminho é longo demais quando um amigo nos acompanha.” Autor desconhecido À minha querida psicóloga Claudia Belazi Agradeço por além de me ajudar com seu trabalho, tenha se tornado uma amiga. Comecei o tratamento há 3 anos e meio e quanta coisa consegui melhorar né? Você torce pelas minhas conquistas, se emociona com meus progressos e me ensinou a ser uma pessoa melhor. Muito obrigada por tudo! “Aqueles que passam por nós não vão sós. Deixam um pouco de si... Levam um pouco de nós...” Antoine de Saint-Exupéry Pela possibilidade de realização do Curso de Mestrado À Faculdade de Odontologia de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, na pessoa de . Diretor Dr. Wilson Roberto Poi e Vice-Diretor Dr. João Eduardo Gomes Filho Ao Programa de Pós-graduação em Odontologia, nas pessoas de sua Coordenador Prof. Dr. André Luiz Fraga Briso, Vice-Coordenador Prof. Dr. Celso Koogi Sonoda e de todo corpo docente. À Valéria, Cristiane e Lilian, da Seção Técnica Acadêmica Pelo excelente trabalho, por toda atenção dispensada, pela disposição em sempre nos atender e pela grande competência e eficiência. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, pela concessão da Bolsa de Mestrado à pós-graduanda Eduarda de Lima Graciano Belem. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, pela concessão da Bolsa de Mestrado (Processo № 2014/02094-5) a pós-graduanda Eduarda de Lima Graciano Belem. A todos os funcionários da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP. Aos alunos de Pós-Graduação do Departamento de Ciências Básicas, da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, pelo acolhimento. Aos funcionários do Biotério da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, em especial o Sr. Camilo pela disponibilização dos animais deste experimento. Ao funcionário Arnaldo pela a ajuda na manutenção dos animais deste experimento. A todos os alunos de graduação pela convivência tão agradável e enriquecedora! A todos os pacientes, pela confiança depositada em cada atendimento. Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para realização desse trabalho... Aos amigos não tenham sido mencionados de maneira individual, mas que torcem por mim e que compartilham minhas vitórias... A todos que, de alguma forma, tenham feito parte da minha vida, enriquecendo o caminho trilhado em minha jornada... ...Minha sincera Gratidão “O êxito da vida não se mede pelo caminho que você conquistou, mas sim pelas dificuldades que você superou” Abraham Lincoln Resumo Belem ELG. Aspirado de medula óssea e plasma rico em plaquetas, associados ou não à terapia com laser em baixa intensidade no reparo ósseo. Estudo histomorfométrico e imunoistoquímico [dissertação]. Araçatuba: UNESP – Univ. Estadual Paulista; 2016. Este estudo avaliou a influência do aspirado de medula óssea (AMO) e do plasma rico em plaquetas (PRP) associados ou não à terapia com laser em baixa intensidade (LLLT) no reparo ósseo de defeitos de tamanho crítico (DTC), criados cirurgicamente em calvárias de ratos. 96 ratos foram divididos em 6 grupos: C, PRP, AMO, LLLT, PRP/LLLT e AMO/LLLT. Um DTC de 5 mm de diâmetro foi criado na calvária de cada animal. No grupo C, o defeito foi preenchido com coágulo sanguíneo somente. Nos grupos PRP e AMO, o defeito foi preenchido com PRP e AMO, respectivamente. No grupo LLLT, o defeito recebeu aplicação da LLLT (InGaAlP), foi preenchido com coágulo sanguíneo e irradiado novamente. Nos grupos PRP/LLLT e AMO/LLLT, o defeito recebeu aplicação da LLLT, foi preenchido com PRP ou AMO, respectivamente e irradiado novamente. Os animais foram submetidos à eutanásia aos 10 ou 30 dias pós-operatórios. Foram realizadas análises histomorfométrica e imunoistoquímica. A área de osso neformado (AON) foi calculada como porcentagem da área total do defeito original. Foram realizadas reações imunoistoquímicas para detecção do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), proteínas morfogenéticas ósseas 2/4 (BMP- 2/4) e osteocalcina (OCN). As células PCNA-positivas, BMP-2/4-positivas e OCN-positivas foram quantificadas. Os dados foram analisados estatisticamente. Aos 10 dias pós- operatórios, o grupo AMO apresentou AON significativamente maior que o grupo C. Aos 30 dias pós-operatórios, o grupo AMO apresentou AON significativamente maior que os grupos C e LLLT, bem como números significativamente maiores de células BMP-2/4-positivas e OCN-positivas que o grupo C. Dentro dos limites deste estudo, pode-se concluir que a terapia com AMO promoveu a regeneração óssea em defeitos de tamanho crítico em calvárias de ratos, tanto aos 10 dias como aos 30 dias pós-operatórios. Palavras-chave: Medula óssea. Plasma rico em plaquetas. Terapia a laser de baixa intensidade. Células-tronco. Regeneração óssea. Ratos. Abstract BELEM, ELG. Bone marrow aspirate and platelet-rich plasma combined or not with low- level laser therapy on bone healing. A histomorphometric and immunohistochemical study [dissertation]. Araçatuba: UNESP – Univ. Estadual Paulista; 2016. This study evaluated the influence of bone marrow aspirate (BMA) and platelet-rich plasma (PRP) combined or not with low-level laser therapy (LLLT) on bone healing in surgically created critical-size defects (CSD) in rat calvaria. 96 rats were divided into 6 groups: C, PRP, BMA, LLLT, PRP/LLLT and BMA/LLLT. A 5 mm diameter CSD was created in the calvarium of each animal. In Group C, the defect was filled by blood clot only. In groups PRP and BMA, the defects were filled with PRP and BMA, respectively. In Group LLLT, the defect received laser irradiation (InGaAlP laser), was filled with blood clot and irradiated again. In groups PRP/LLLT and BMA/LLLT, the defect received laser irradiation (InGaAlP laser), was filled with PRP or BMA, respectively, and irradiated again. Animals were euthanized at either 10 or 30 days postoperative. Histomorphometric and immunohistochemical analyses were performed. Newly formed bone area (NFBA) was calculated as a percentage of the total area of the original defect. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), bone morphogenetic protein 2/4 (BMP-2/4) and osteocalcin (OCN) immunohistochemical staining were performed. PCNA-positive, BMP-2/4-positive and OCN- positive cells were quantified. Data were statistically analyzed. At 10 days postoperative, Group BMA presented significantly greater NFBA than control. At 30 days postoperative, Group BMA presented significantly greater NFBA than control and Group LLLT, as well as significantly higher numbers of BMP-2/4-positive and OCN-positive cells than control. Within the limits of this study, it can be concluded that the treatment with BMA promoted bone regeneration in critical-size rat calvarial defects at both 10 and 30 days postoperative. Keywords: Bone marrow. Platelet-rich plasma. Laser therapy, low-level. Stem cells. Bone regeneration. Rats. Lista de Figuras Figura 1 - Células, isoladas da medula óssea de ratos, plaqueadas para verificação da capacidade de aderência ao plástico das mesmas. 7 dias de cultura: células com aspecto fibroblastóide aderidas ao plástico e células autofluorescentes não aderidas (A); 14 dias de cultura: células com prolongamentos maiores, citoplasma mais abundante e menor autofluorescência (B); 21 dias de cultura: células com citoplasma abundante, com aspecto fibrilar e presença de matriz extracelular (C). Aumento original de 400x. 45 Figura 2 - Células isoladas da medula óssea de ratos submetidas a diferentes meios indutores, para a verificação da capacidade de diferenciação das mesmas em tri-linhagem. Controle negativo (A). Diferenciação adipogênica: intensa trama de células fibroblastoídes, com presença evidente de vacúolos com lipídeos no interior. Coloração citoquímica Oil red O ® (B). Diferenciação condrogênica: células arredondadas, citoplasmas abundantes, núcleos bem corados e um discreto aro mais claro perinuclear formando núcleos isogênicos. Coloração com Azul de Toluidina (C). Diferenciação osteogênica: depósitos exagerados de cálcio em marrom. Aspecto de tapete celular confluente, sem espaços livres com deposição de cálcio de forma heterogênea, porém uniformemente distribuído em toda cultura. Coloração com Alizarin red ® (D). Aumento original 200x. 47 Figura 3 - Visões panorâmicas dos defeitos cirúrgicos aos 10 dias pós- operatórios. Fotomicrografia dos grupos Controle (A); PRP (B); AMO (C); LLLT (D); PRP/LLLT (E) e AMO/LLLT (F). H&E. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: C, controle; PRP, plasma rico em plaquetas; AMO, aspirado de medula óssea; LLLT, terapia com laser em baixa intensidade. 50 Figura 4 - Visões panorâmicas dos defeitos cirúrgicos aos 30 dias pós- operatórios. Fotomicrografia dos grupos Controle (A); PRP (B); AMO (C); LLLT (D); PRP/LLLT (E) e AMO/LLLT (F). H&E. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: C, controle; PRP, plasma rico em plaquetas; AMO, aspirado de medula óssea; LLLT, terapia com laser em baixa intensidade. 51 Figura 5 - Médias e desvios-padrão da Área de Osso Neoformado (AON), com comparações inter-grupos aos 10 dias pós-operatórios. 52 Figura 6 - Médias e desvios-padrão da Área de Osso Neoformado (AON), com comparações inter-grupos aos 30 dias pós-operatórios. 53 Figura 7 - Imunomarcações para PCNA, BMP-2/4 e OCN no defeito cirúrgico, aos 10 dias pós-operatórios. Fotomicrografias mostrando células PCNA-positivas (cabeça de seta preta) nos grupos Controle (A) e AMO (B). Fotomicrografias mostrando células BMP-2/4-positivas (cabeça de seta vermelha) nos grupos Controle (C) e AMO (D). Fotomicrografias mostrando células OCN-positivas (cabeça de seta azul) nos grupos Controle (E) e AMO (F). Barra de escala = 40 μm. Abreviaturas: C, controle; AMO, aspirado de medula óssea; PCNA, antígeno nuclear de proliferação celular; BMP-2/4, proteína 55 morfogenética óssea 2/4; OCN, osteocalcina; TO, tecido ósseo; TC, tecido conjuntivo; VS, vaso sanguíneo. Figura 8 - Imunomarcações para PCNA, BMP-2/4 e OCN no defeito cirúrgico, aos 30 dias pós-operatórios. Fotomicrografias mostrando células PCNA-positivas (cabeça de seta preta) nos grupos Controle (A) e AMO (B). Fotomicrografias mostrando células BMP-2/4-positivas (cabeça de seta vermelha) nos grupos Controle (C) e AMO (D). Fotomicrografias mostrando células OCN-positivas (cabeça de seta azul) nos grupos Controle (E) e AMO (F). Barra de escala = 40 μm. Abreviaturas: C, controle; AMO, aspirado de medula óssea; PCNA, antígeno nuclear de proliferação celular; BMP-2/4, proteína morfogenética óssea 2/4; OCN, osteocalcina; TO, tecido ósseo; TC, tecido conjuntivo; VS, vaso sanguíneo. 56 Lista de Tabelas Tabela 1 - Porcentagens médias (± desvios-padrão) de células positivas para cada marcador nas amostras de AMO dos grupos AMO e AMO/LLLT aos 10 e 30 dias pós-operatórios. 48 Tabela 2 - Médias e desvios-padrão das células PCNA-positivas, BMP2/4-positivas e OCN-positivas aos 10 dias pós-operatórios, com comparação inter- grupos. 57 Tabela 3 - Médias e desvios-padrão das células PCNA-positivas, BMP2/4-positivas e OCN-positivas aos 30 dias pós-operatórios, com comparação inter- grupos. 57 Lista de Anexos Anexo A - Certificado da Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) 73 Anexo B - Normas para publicação segundo o periódico Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 74 Lista de Abreviaturas e Siglas µl = Microlitro µm = Micrometro AMO = Aspirado de Medula Óssea ANOVA = Análise de Variância AON = Área de Osso Neoformado AT = Área Total BMP-2/4 = Protéina Morfogenética óssea 2/4 BRONJ = Osteonecrose dos maxilares realacionada ao uso de bisfisfonatos C = Controle CA = Califórnia CAPES = Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CEUA = Comissão de Ética no Uso de Animais cm 2 = Centímetro quadrado CMN = Células Mononucleares CTH = Células-Tronco Hematopoiéticas CTM = Células-Tronco Mesenquimais DAB = Tetracloridrato de Diaminobenzodina DMSO = Dimetril Sulfóxido DTC = Defeito de Tamanho Crítico EDTA = Ácido Etinodiaminotetracético et al. = et alii FAPESP = Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FC = Fatores de Crescimento Fig. = Figura g = Grama H&E = Hematoxilina e Eosina InGaAlP = Índio-Gálio-Alumínio-Fósforo J = Joule J/cm 2 = Joule por Centímetro Quadrado kg = Quilograma LLLT = Terapia com Laser em Baixa Intensidade LMN = Linfomononuclear mg = Miligrama MIF = Média de Intensidade de Fluorêncencia ml = Mililitros nm = Nanômetro OCN = Osteocalcina PBS = Tampão Fosfato Salino PCNA = Antígeno Nuclear de Proliferção Celular PDGF = Fator de Crescimento Derivado das Plaquetas pH = Potêncial Hidrogeniônico PRP = Plasma Rico em Plaquetas rpm = Rotação por Minuto s = Segundo SF = Soro Fetal TC = Tecido Conjuntivo TGF-β = Fator de Crescimento Transformador Beta TKW = Teste de Kruskall-Wallis TO = Tecido Ósseo UI = Unidade Internacional UNESP = Universidade Estadual Paulista USP = Universidade de São Paulo VS = Vaso Sanguíneo W = Watts Lista de Símbolos β = Beta @ = Arroba n = Tamanho da amostra P = Probabilidade do valor do teste ºC = Graus Celsius % = Por cento G = Gravidade x = Vezes < = Menor > = Maior = = Igual * = Asterisco ® = Marca Registrada TM = Trade Mark + = Mais - = Menos § = Inciso Sumário Manuscrito para publicação 30 Página de título 31 Resumo 32 Introdução 33 Materiais e Métodos 35 Resultados 44 Discussão 58 Agradecimentos 63 Referências 63 Anexos 73 Manuscrito para publicação* Segundo as normas do periódico Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology – Anexo B 31 Aspirado de medula óssea e plasma rico em plaquetas associados ou não à terapia com laser em baixa intensidade no reparo ósseo Eduarda de Lima Graciano Belem, DDS a ; Maria José Hitomi Nagata, DDS, PhD a a Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada, Faculdade de Odontologia de Araçatuba, UNESP – Univ. Estadual Paulista, Araçatuba, São Paulo, Brasil. Autora responsável pela correspondência: Maria José Hitomi Nagata Telefone: +55 18 3636 3271 Fax: +55 18 3636 3332 Rua: José Bonifácio, 1193 CEP: 16015-050 - Araçatuba, SP, Brasil E-mail: mjnagata@foa.unesp.br mailto:mjnagata@foa.unesp.br 32 RESUMO Este estudo avaliou a influência do aspirado de medula óssea (AMO) e do plasma rico em plaquetas (PRP) associados ou não à terapia com laser em baixa intensidade (LLLT) no reparo ósseo de defeitos de tamanho crítico (DTC), criados cirurgicamente em calvárias de ratos. 96 ratos foram divididos em 6 grupos: C, PRP, AMO, LLLT, PRP/LLLT e AMO/LLLT. Um DTC de 5 mm de diâmetro foi criado na calvária de cada animal. No grupo C, o defeito foi preenchido com coágulo sanguíneo somente. Nos grupos PRP e AMO, o defeito foi preenchido com PRP e AMO, respectivamente. No grupo LLLT, o defeito recebeu aplicação da LLLT (InGaAlP), foi preenchido com coágulo sanguíneo e irradiado novamente. Nos grupos PRP/LLLT e AMO/LLLT, o defeito recebeu aplicação da LLLT, foi preenchido com PRP ou AMO, respectivamente e irradiado novamente. Os animais foram submetidos à eutanásia aos 10 ou 30 dias pós-operatórios. Foram realizadas análises histomorfométrica e imunoistoquímica. A área de osso neformado (AON) foi calculada como porcentagem da área total do defeito original. Foram realizadas reações imunoistoquímicas para detecção do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), proteínas morfogenéticas ósseas 2/4 (BMP- 2/4) e osteocalcina (OCN). As células PCNA-positivas, BMP-2/4-positivas e OCN-positivas foram quantificadas. Os dados foram analisados estatisticamente. Aos 10 dias pós- operatórios, o grupo AMO apresentou AON significativamente maior que o grupo C. Aos 30 dias pós-operatórios, o grupo AMO apresentou AON significativamente maior que os grupos C e LLLT, bem como números significativamente maiores de células BMP-2/4-positivas e OCN-positivas que o grupo C. Dentro dos limites deste estudo, pode-se concluir que a terapia com AMO promoveu a regeneração óssea em defeitos de tamanho crítico em calvárias de ratos, tanto aos 10 dias como aos 30 dias pós-operatórios. Palavras-chave: Medula óssea; plasma rico em plaquetas; terapia a laser de baixa intensidade, células-tronco; regeneração óssea; ratos. 33 1 INTRODUÇÃO A despeito da complexidade do alvo para o reparo, as estratégias de engenharia tecidual geralmente envolvem a utilização de células, arcabouços biocompatíveis e fatores biologicamente ativos [1,2]. Nos últimos anos, tem-se observado um interesse crescente no potencial terapêutico de células derivadas da medula óssea para aplicações da engenharia tecidual. Estudos recentes têm avaliado a terapia envolvendo cultivo de células-tronco mesenquimais (CTM) derivadas da medula óssea com o objetivo de promover o reparo ósseo [3-5]. O cultivo de CTM é uma abordagem promissora, porém requer instalações especiais, consome tempo e é oneroso, o que poderia torná-lo desvantajoso na prática clínica. Com o objetivo de simplificar o uso dessas células para que seu potencial terapêutico possa ser melhor explorado, o aspirado de medula óssea (AMO) tem sido proposto como uma fonte viável de CTM [6-8]. O AMO contém uma porcentagem de células hematopoiéticas, endoteliais e CTM significativamente maior que o sangue periférico [9]. Somente poucos estudos in vivo avaliaram o uso do AMO no reparo ósseo como terapia única [8,10,11], ou combinado com enxertos ósseos ou biomateriais, [6-8,12,13] demonstrando resultados promissores. Estudos in vitro que avaliaram o efeito da terapia com laser em baixa intensidade (LLLT) sobre as CTM demonstraram que a LLLT promoveu o aumento da proliferação destas celulas [14-17] e induziu sua diferenciação em osteoblastos [17]. Assim, considerando-se o grande potencial das CTM na engenharia tecidual e medicina regenerativa e o uso do AMO como rica fonte destas células, bem como os significativos efeitos bioestimulatórios da LLLT, um estudo pioneiro foi desenvolvido por nosso grupo de pesquisa, onde a associação AMO/LLLT foi avaliada no reparo de defeitos de tamanho crítico (DTC) em calvária de ratos [10]. Neste estudo, foram avaliados 4 grupos experimentais: controle, AMO, LLLT e AMO/LLLT. Foram realizadas análise histomorfométrica da área de osso neoformado (AON) e análise 34 imunoistoquímica para avaliação das proteínas envolvidas no processo de reparo ósseo. Concluiu-se que a combinação AMO/LLLT aumentou significativamente a formação óssea quando comparados ao controle, ou a cada tratamento isoladamente. A regeneração óssea é um processo complexo, que in vivo, requer a apresentação altamente coordenada de estímulos bioquímicos para promover os vários estágios da angiogênese e osteogênese [18]. Esses processos envolvem sinais moleculares mediados principalmente por fatores de crescimento (FC) e citocinas. As plaquetas contêm diversos FC e citocinas que desempenham papel fundamental na inflamação e reparo ósseo [19-21]. Além disso, também secretam fibrina, fibronectina e vitronectina, que atuam como moléculas de adesão para migração celular mais eficiente [22]. Em 1998, Marx et al. [23] propuseram o uso do plasma rico em plaquetas (PRP) autólogo como técnica economicamente viável para obter-se alta concentrações de FC, no intuito de otimizar o processo de cicatrização de enxertos ósseos. Após os resultados favoráveis obtidos por Marx et al. [23], outros pesquisadores avaliaram os efeitos do PRP associado a enxertos de osso autógeno, demonstrando resultados positivos muito promissores em relação à formação e maturação ósseas [24-27]. Contudo, em alguns outros estudos, a adição de PRP não resultou em benefícios adicionais no reparo de enxertos de osso autógeno [28-30]. Possíveis explicações para esses resultados controversos são os empregos de diferentes protocolos de preparo e aplicação do PRP [27,31,32]. Além da utilização do PRP combinado a diferentes tipos de enxertos ósseos e biomateriais, outra modalidade terapêutica relatada foi a associação do PRP à LLLT. Martins et al. [33] avaliaram os efeitos de 3 diferentes terapias nos resultados da cicatrização de osteonecrose dos maxilares relacionada ao uso dos bisfosfonatos (BRONJ) em pacientes com câncer: 1) terapia farmacológica; 2) terapia farmacológica com cirurgia e 3) terapia farmacológica com cirurgia associadas ao PRP e à LLLT. A associação de PRP e LLLT aos tratamentos convencionais para BRONJ melhorou significativamente a cicatrização desta lesão. Portanto, 35 esta terapia combinada merece ser melhor investigada, uma vez que ambos podem agir sinergicamente no processo de cicatrização [33], pois estudos prévios in vitro demonstraram que o processo de secreção de plaquetas e a liberação de substâncias armazenadas nos grânulos específicos podem ser potencializadas pela ação do laser [34,35]. Tanto a utilização do AMO como a do PRP apresentam vantagens e desvantagens na prática clínica. A técnica do AMO envolve o trabalho de uma equipe multidisciplinar e ambiente especializado para sua obtenção, o que torna seu custo relativamente alto, enquanto que a técnica do PRP apresenta menor complexidade de realização e custo mais baixo, mas ainda há muitas controvérsias sobre sua real efetividade clínica. Além disso, a associação destes biomateriais à LLLT abre um rol de novas modalidades terapêuticas que necessitam ser melhor investigadas. Até o presente, somente informações fracionadas estão disponíveis na literatura científica sobre o AMO, o PRP e suas associações com a LLLT. O propósito deste estudo foi avaliar a influência do aspirado de medula óssea e do plasma rico em plaquetas associados ou não à terapia com laser em baixa intensidade no reparo ósseo de defeitos de tamanho crítico criados cirurgicamente em calvárias de ratos. 63 7 REFERÊNCIAS 1. A. Atala,F.K. Kasper, A.G. Mikos,Engineering complex tissues, Sci. Transl. Med. 14 (2012) 160rv12, doi: 10.1126/scitranslmed.3004890. 2. P. Kasten, J. Vogel, F. Geiger, P. Niemeyer, R. Luginbühl, K. Szalay, The effect of platelet-rich plasma on healing in critical-size long-bone defects, Biomaterials 29 (2008) 3983-3992, doi: 10.1016/j.biomaterials.2008.06.014. 3. A.I. Hoch, V. Mittal, D. Mitra, N. Vollmer, C.A. Zikry, J.K. 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