UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL TPTF E TPTF/QT: NOVOS MARCADORES ARRITMOGÊNICOS E DE SOBREVIDA EM CÃES COM DOENÇA MIXOMATOSA DA VALVA MITRAL Beatriz de Carvalho Pato Vila Médica Veterinária 2020 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL TPTF E TPTF/QT: NOVOS MARCADORES ARRITMOGÊNICOS E DE SOBREVIDA EM CÃES COM DOENÇA MIXOMATOSA DA VALVA MITRAL Discente: Beatriz de Carvalho Pato Vila Orientador: Prof. Dr. Marlos Gonçalves Sousa Co-orientador: Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária. Área: Clínica Médica Veterinária 2020 DADOS CURRICULARES DA AUTORA BEATRIZ DE CARVALHO PATO VILA – nascida em 22 de fevereiro de 1994 em São Paulo, filha de Sonia Vieira de Carvalho Pato Vila e José Antonio Pato Vila. Iniciou sua graduação em medicina veterinária em fevereiro de 2011 na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Campus Jaboticabal, concluindo-a em dezembro de 2015. Durante o período de graduação realizou diversos estágios extracurriculares envolvendo clínica médica, cirurgia, patologia clínica, cardiologia e oncologia de pequenos animais e equinos em clínicas privadas, centro diagnóstico privados, hospitais universitários, e no Jockey Club de São Paulo. De 2012 a 2013 foi trainee de projetos de medicina veterinária da empresa júnior Consultoria Agropecuária Júnior (CAP Jr), e foi diretora de projetos de medicina veterinária da mesma empresa júnior de 2013 a 2014. Realizou projeto de iniciação científica financiado pela FAPESP entre 2014 e 2015 e com duração de 1 ano e meio, envolvendo imunodetecção de p53 e HER2 em carcinoma espinocelular de cães e gatos, sob orientação da Profa. Dra. Rosemeri de Oliveira Vasconcelos. Foi residente entre 2016 e 2018 no Programa de Aprimoramento Profissional em Medicina Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) UNESP – campus de Jaboticabal, na área de Clínica Médica de Pequenos Animais, sob orientação do Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho. Em 2018, ingressou no programa de mestrado em Medicina Veterinária (Clínica Médica Veterinária) com ênfase em Cardiologia Veterinária e Clínica Médica de Pequenos Animais sob orientação do Prof. Dr. Marlos Gonçalves Sousa e co-orientação do Prof. Dr. Aparecido Antonio na UNESP Campus Jaboticabal. EPÍGRAFE “Todos nós estamos conectados uns com os outros e com todas as criaturas vivas em todos os níveis, do macro ao micro, do social ao celular. A separação que nós sentimos na caminhada, é ilusão. A realidade é que compartilhamos muito mais do que jamais compreendemos, tanto na mente quanto no corpo. Nós estamos profunda e espontaneamente interligados com os demais e com a natureza.” Elizabeth Blackburn e Elissa Epel DEDICATÓRIA Dedico o presente trabalho a todos os meus familiares e amigos, que me incentivaram a seguir meu coração e iniciar este caminho lindo; aos meus orientadores que me guiaram durante toda a trajetória; aos colegas médicos veterinários e animais que participaram da construção deste trabalho e que poderão se beneficiar das informações aqui transmitidas. Dedico também ao meu filho da espécie canina, que foi meu primeiro e mais profundo contato com o mundo animal, e que me fez ter certeza desde pequena de que minha vocação é - não só amar, mas também - cuidar de anjos de quatro patas. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente à Deus, que me concedeu vida, saúde, força e colocou anjos ao meu redor durante toda a minha trajetória. Agradeço a todas as formas de amor e energia que me protegem e me guiam. Serei eternamente grata aos meus pais, José Antonio e Sonia; meu irmão Guilherme; meus avós Atílio, Alice, Tetê e Aloízio; minha “titia” Glauce e meu “padinho” Waldir por me apoiarem desde a minha primeira lembrança como ser humano. Fui criada por seres de luz que me deram muito mas muito amor, e me ensinaram a fazer isso com os outros também. Obrigada por acreditarem em mim, por me darem todo o suporte para o meu crescimento pessoal e profissional, por nunca me deixarem na mão. Obrigada por me educarem, cuidarem de mim com tanto carinho, e me estimularem a ser cada vez melhor. Se eu não tivesse a confiança e incentivo que vocês me deram, não estaria escrevendo estas palavras hoje. Amo muito cada um de vocês! Agradeço imensamente aos meus dois mentores dessa área em que me vejo cada dia mais apaixonada, a Cardiologia. Me sinto extremamente honrada em aprender com os melhores cardiologistas veterinários do nosso país: professor Marlos e professor Camacho. Muito obrigada professor Marlos, meu orientador, pela oportunidade que me concedeu para realizar este sonho incrível; por me permitir fazer parte da família #TeamCardioUFPR; por todo o tempo, dedicação e paciência tirando minhas dúvidas, corrigindo meus trabalhos e respondendo minhas mensagens; por me ensinar tanto e por trazer conhecimento de melhor qualidade, de forma clara, leve e brilhante; pelas oportunidades e experiências ímpares que me proporcionou, que impulsionaram mais ainda a minha vontade de aprender; por ser um exemplo de profissional que eu almejo ser um dia; e, claro, por todas as calorias que comemos durante os deliciosos tours gastronômicos em Jaboticabal e em Curitiba. Sou uma grande admiradora do senhor!! Muito obrigada professor Camacho, meu co-orientador, por ter sido o melhor professor que eu tive durante toda a graduação; por ter feito meus olhos brilharem durante sua explicação na aula sobre ICC e despertar em mim uma vontade de me aprofundar mais sobre essa especialidade maravilhosa; por ter aberto as portas do serviço de Cardiologia desde o meu primeiro estágio no 3º ano (de onde não saí mais); por ser meu orientador durante a residência e me ajudar a fazer estágio no serviço de cardiologia da Universidade de Cornell, que foi fascinante e surreal; por me aconselhar a ser orientada pelo professor Marlos e co-orientada pelo senhor, mesmo com o senhor sabendo que ia se aposentar; pelos ensinamentos quando discutimos os casos da rotina; por me dar voto de confiança para atender no setor de Cardiologia e para ajudar nos cursos de cardiologia e de clínica médica que o senhor é responsável, nos quais eu aprendo cada dia mais. Tenho um respeito imensurável pelo senhor e serei eternamente grata por ter me permitido fazer parte do serviço de Cardiologia da UNESP de Jaboticabal, o qual eu tenho muito orgulho. Agradeço aos membros da banca de defesa, professora Mirela e professora Ruthnéa, e aos membros da banca de qualificação do meu mestrado, professora Annelise e Dr. Roberto, por terem aceito nosso convite e por todo tempo, dedicação e energia para nos ajudarem a lapidar esse trabalho. As sugestões, críticas e elogios de vocês contribuem muito para o meu aprendizado e são de grande valia para eu poder melhorar cada vez mais minha apresentação e minha escrita. Agradeço muito às minhas Cardiogirls queridas, Rapha, Jais e Tamy, que me acodem em todas as frustrações, tiram minhas dúvidas, me aconselham, são o meu ombro amigo e me encorajam! Vocês não são apenas colegas de profissão, mas amigas que estiveram do meu lado em momentos difíceis, mas também em ótimos momentos, como gordices e viagens em cursos e congressos! Obrigada por terem se tornado, não só minhas grandes amigas, mas além de tudo, professoras maravilhosas da “cardiobaby”. Gostaria de agradecer meu grande amigo Bruno (Xambs), por servir como exemplo pra mim há tantos anos. Quando eu estava terminando a graduação, meu sonho era virar residente da CMPA igual você; quando eu estava terminando a residência, meu sonho era fazer mestrado na cardiologia igual você! Não posso deixar de mencionar as incontáveis vezes em que você me ajudou tirando dúvidas e me aconselhando não só sobre cardiologia e clínica, mas tantas vezes sobre minha vida pessoal, e isso não tem preço. Se tudo der certo, estaremos juntos futuramente pra eu te atazanar mais ainda, migo!! Agradeço também aos meus queridos colegas Murillo (Jabuka) e os #TeamCardioUFPR: Má, Vini, Bru N., Matheus, Bru B., Julio, Té, Monica, Luisa e Fran. Vocês não têm ideia do quanto admiro todos vocês!! Cada um de vocês, mesmo sem querer, me ensinou não só sobre cardiologia, mas sobre acolhimento, companheirismo, dedicação, união. Obrigada por todos os ensinamentos de cardiologia na rotina, nos Journal Clubs, nos cursos e também pelos ensinamentos da vida real nos restaurantes e barzinhos! Gostaria de agradecer em especial minha amiga Marcela, que me recebeu pela primeira vez em sua casa (sem nem me conhecer direito!!) em Curitiba no começo do meu mestrado, e que acabou se tornando uma irmã pra mim. Passei a admirar imensamente ela quando descobrí seu coração gigante, sua alegria, sua inteligência e dedicação em tudo o que faz! E obviamente depois que ela fez panquequinhas de banana e pipoca pra mim, aí o amor multiplicou mais ainda. Quando crescer, quero ser igualzinha a você! Agradeço também às pessoas que foram grandes inspirações pra mim lá no comecinho, desde a época da graduação (e até hoje): Roberto, Evandro, Edna, Fábio, Alejandro, Michelli, Fernando, Beth, Jorge, Vivian. Observando e aprendendo com vocês através de aulas, de cursos e da rotina, o meu sonho de me aprofundar nesse universo fantástico da cardiologia nasceu, se amplificou e se fortaleceu. Obrigada por serem grandes cardiologistas e me inspirarem a me tornar uma também! Agradeço também ao meu namorado e melhor amigo, Caio, por estar ao meu lado todos os dias; por me incentivar a sonhar cada vez mais alto; por entender e me apoiar nas minhas “ausências” nos infinitos cursos e congressos que participo; por ter até me ajudado a tabular alguns dados depois de ver meu leve desespero (rs); por me dar carinho e apoio em todos os momentos difíceis e vibrar comigo em todas as conquistas. Obrigada por todo amor e companheirismo! Te amo muito! Agradeço ao meu filho de quatro patas, que está grudado comigo há 17 anos (passei mais tempo da minha vida com ele do que sem ele), que foi minha primeira experiência em medicar e cuidar de um animal, que vai comigo para praticamente todos os lugares que eu vou. Agradeço pela oportunidade de criar esse vínculo tão forte e especial com um ser que só consegue dar carinho e amor (e às vezes raiva quando levo no hospital, afinal ele é um Poodle idoso ranzinza!). Sou eternamente apaixonada e grata por tê-lo em minha vida! Agradeço aos professores, funcionários, pós graduandos e residentes do HV. Se eu fosse nomear todos os que gostaria, ficaria escrevendo até o ano que vem! Mas todos foram muito importantes para eu ter chegado até aqui. Cada “bom dia”, cada sorriso, cada caso atendido em conjunto, cada emergência, cada conversa no corredor, cada abraço, cada conselho... Todos pequenos momentos fizeram parte do meu dia-a-dia e me ajudaram a me transformar na pessoa que sou hoje. Muito obrigada meus amigos Amanda (Mandija), Letícia (Alpaca), Danielle (Fogs), Andréa (Pocotó), Pauline, Izabela, Rodolpho, Grazi, por estarem ao meu lado desde a graduação ou residência e trazerem alegria, risadas, carinho e paz para os meus dias. Levarei vocês no coração para sempre! Agradeço também às minhas amigas-irmãs Rachel, Michelly, Rafaela e Morany, por me apoiarem em tantos momentos há mais de 15 anos (inclusive assistirem minha primeira aula online mesmo sem entender nada rs). Vocês são parte da minha família e sou muito grata por ter vocês na minha vida! Agradeço também aos meus queridos pacientes e suas famílias, que possibilitaram que eu aprendesse na prática cada componente do exame clínico, eletrocardiograma, ecocardiograma, Holter, mas que, além de tudo, me ensinaram a olhar para o paciente como indivíduo. E enxergar que, além de meu paciente, ele é o filho de quatro patas de alguém. Sou muito grata pela confiança e carinho de todas estas famílias, e pela oportunidade de conhecer melhor o universo da clínica e cardiologia através destes animais. Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo fomento da bolsa de estudos, e ao programa de pós-graduação em Medicina Veterinária por permitir a minha formação profissional e a realização deste sonho. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. i SUMÁRIO Página CERTIFICADO COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS..........................ii TÍTULO E RESUMO..........................................................................................iii PALAVRAS-CHAVE..........................................................................................iii TITLE E ABSTRACT..........................................................................................iv KEYWORDS......................................................................................................iv LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................v CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS.....................................................1 Introdução.......................................................................................................1 Revisão de Literatura.......................................................................................2 Referências...................................................................................................10 CAPÍTULO 2 - TPTE AND TPTE/QT: NOVEL ARRHYTHMOGENIC AND SURVIVAL MARKERS FOR DOGS WITH MYXOMATOUS MITRAL VALVE DISEASE............................17 Introduction/objectives...................................................................................17 Animals, materials and methods....................................................................18 Results………………………………………………………………………….….22 Discussion………………………………………………………………………....35 Conclusions……………………………………………………………………..…40 References………………………………………………………………………...40 Footnotes…………………………………………………………………………..48 APÊNDICE A…………………………………………………………………...……50 ii iii TPTF E TPTF/QT: NOVOS MARCADORES ARRITMOGÊNICOS E DE SOBREVIDA PARA CÃES COM DOENÇA MIXOMATOSA DA VALVA MITRAL RESUMO – Introdução / Objetivos: Nos últimos anos, novos marcadores, como o intervalo entre o pico e o final da onda T (Tptf) e a relação Tptf/QT, vêm demonstrando alta sensibilidade a arritmias e mortalidade ventriculares. Analisamos esses e outros parâmetros de repolarização ventricular, como intervalo QT, intervalo QT corrigido para frequência cardíaca (QTc) e dispersão QT (QTd) em cães com doença mixomatosa valvar mitral (DMVM). Além disso, investigamos sua relação com a progressão da doença, parâmetros ecocardiográficos e arritmias ventriculares, e avaliamos seu valor prognóstico com o desenvolvimento de sinais clínicos ou mortalidade como desfecho final. Animais, materiais e métodos: Foram obtidos dados epidemiológicos, clínicos, ecocardiográficos e eletrocardiográficos de 236 cães com DMVM e 15 cães saudáveis. Informações prognósticas e de sobrevida também foram registradas no grupo DMVM. Todos os índices de repolarização ventricular foram medidos em dez derivações eletrocardiográficas. Resultados: Com exceção do intervalo QT, a maioria dos marcadores de repolarização aumentou com a frequência de arritmias e com a progressão da DMVM. Os parâmetros que melhor identificaram arritmias ventriculares (AUC> 0,7) foram Tptf (aVR, rV2, média rV2-V10, média rV2-V4) e Tptf/QT (II, aVR, rV2). Na análise de sobrevida, os marcadores estatisticamente significativos com as maiores diferenças na sobrevida mediana foram Tptf/QT (rV2, aVR) e Tptf (máximo de qualquer derivação, máximo rV2-V10). Conclusão: Tptf e Tptf/QT são bons marcadores não invasivos para estratificação de risco clínico em cães com DMVM. Palavras-chave: Arritmia ventricular, Cão, Eletrocardiografia, Mortalidade, Repolarização iv TPTE AND TPTE/QT: NOVEL ARRHYTHMOGENIC AND SURVIVAL MARKERS FOR DOGS WITH MYXOMATOUS MITRAL VALVE DISEASE ABSTRACT – Introduction/Objectives: In the last few years, novel markers such as the interval between the peak and the end of T wave (Tpte) and Tpte/QT ratio have been shown to have high sensitivity for ventricular arrhythmias and mortality. We analyzed these and other parameters of ventricular repolarization, such as QT interval, QT interval corrected for heart rate (QTc) and QT dispersion (QTd) in dogs with myxomatous mitral valve disease (MMVD). Additionally, we investigated their relationship with the progression of the disease, echocardiographic parameters and ventricular arrhythmias, and assessed their prognostic value with development of clinical signs or mortality as the final outcome. Animals, materials and methods: Epidemiological, clinical, echocardiographic and electrocardiographic data was obtained from 236 dogs with MMVD and 15 healthy dogs. Prognostic and survival information was also recorded for the MMVD group. All ventricular repolarization indices were measured in ten lead electrocardiographic recordings. Results: With the exception of QT interval, most repolarization markers increased along with the frequency of arrhythmias, and with the progression of MMVD. The parameters that best identified ventricular arrhythmias (AUC >0.7) were Tpte (aVR, rV2, average rV2-V10, average rV2-V4) and Tpte/QT (II, aVR, rV2). In survival analysis, statistically significant markers with the highest differences in median survival were Tpte/QT (rV2, aVR) and Tpte (maximum of any lead, maximum rV2-V10). Conclusion: Tpte and Tpte/QT are good noninvasive markers for clinical risk stratification in dogs with MMVD. Keywords: Canine, Electrocardiography, Mortality, Repolarization, Ventricular arrhythmia v LISTA DE ABREVIATURAS ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine APC Atrial premature complex AUC Area under the curve CHF Congestive heart failure DMVM Doença mixomatosa da valva mitral DR Dispersão da repolarização E Peak velocity of early diastolic transmitral flow ECG Electrocardiographic E:A Ratio of early to late transmitral flow FA Fibrilação atrial FS Fractional shortening HR Heart rate ICC Insuficiência cardíaca congestiva LA:Ao Ratio of the left atrial to aortic root diameters LVIDdN Left ventricular internal dimension at end-diastole normalized for body weight LVIDsN Left ventricular internal dimension at end-systole normalized for body weight MMVD Myxomatous mitral valve disease QTc Intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca QTc QT interval corrected by heart rate QTcd QTc dispersion QTd Dispersão do intervalo QT QTd QT dispersion ROC Receiver operating characteristic SCD Sudden cardiac death SQTC Síndrome do QT curto SQTL Síndrome do QT longo Tp Pico da onda T vi Tpte T wave peak-end interval Tptf Intervalo entre o pico e o final da onda T Tf Final da onda T Tpte/QT Ratio of Tpte and QT intervals Tptf/QT Razão entre os intervalos Tptf e QT 1 CAPÍTULO 1 – Considerações gerais Introdução A doença mixomatosa da valva mitral (DMVM) é a doença cardíaca mais comum na espécie canina (Smith et al., 2015). Esta cardiopatia possui maior prevalência em machos e em cães de raças pequenas, como Cavalier King Charles Spaniel e Poodle (Mattin et al., 2015). A DMVM é causada por uma degeneração progressiva e espessamento difuso da valva mitral, levando à coaptação incompleta dos folhetos e à regurgitação valvar (Serfass et al., 2006). Embora muitos cães com DMVM permaneçam assintomáticos durante anos, a progressão da regurgitação mitral pode causar insuficiência cardíaca congestiva (ICC) e arritmias, levando alguns cães à morte (Serfass et al., 2006; Crosara et al., 2010). Por este motivo, a detecção precoce do risco arritmogênico e de mortalidade pode auxiliar na determinação de prognóstico e na escolha de melhores opções terapêuticas para estes pacientes. Acredita-se que o aumento da dispersão da repolarização (DR), ou seja, a perturbação do padrão normal ordenado de recuperação ventricular possa predispor a arritmias ventriculares. Desta forma, é importante entender os sinais contidos em ST-T durante a avaliação eletrocardiográfica que possam indicar alguma falha (Kors et al., 2008). Vários marcadores eletrocardiográficos de repolarização ventricular já foram propostos como indicadores de risco em vários contextos clínicos, como intervalo QT (Tse e Yan, 2017), intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca (QTc) (Surawicz, 1987) e dispersão do QT (QTd) (Elming et al., 1998). Recentemente novos índices vêm se destacando por apresentarem uma maior sensibilidade à arritmogênese ventricular, como intervalo entre o pico (Tp) e o final (Tf) da onda T (Tptf) (Tse et al., 2017) e razão Tptf/QT (Castro-Torres et al., 2015). Apesar de a sensibilidade e a aplicabilidade do intervalo Tptf e da razão Tptf/QT já terem sido demonstradas em uma vasta diversidade de condições fisiopatológicas (Vehmeijer et al., 2019; Xue et al., 2019; Li et al., 2019; Afsin et al., 2017; Yılmaz et al. 2018; Taşolar et al. 2014; Ünal et al., 2018; Cetin et al., 2020), a maioria destes 2 estudos avaliou o comportamento destes parâmetros eletrocardiográficos em humanos. As pesquisas conduzidas em outras espécies, incluindo os cães, envolvem modelos animais, e não doenças de ocorrência natural (Opthof et al., 2007; Picirillo et al., 2012; Yoon et al., 2019; Antzelevitch et al., 2000; Sicouri e Antzelevitch, 1991; Di Diego et al., 2003) . Visto a grande prevalência da DMVM na espécie canina (Smith et al., 2015) e sua capacidade de induzir arritmias mesmo nas fases iniciais da doença (Crosara et al., 2010; Carvalho et al., 2018), o objetivo deste trabalho foi investigar a relação entre os índices de repolarização ventricular e o risco arritmogênico em cães com esta cardiopatia. Também verificamos se estes parâmetros podem ser utilizados como indicadores de prognóstico e mortalidade. Além disso, foi avaliado se existe correlação com parâmetros ecocardiográficos e intervalo R-R, e se eles aumentam com a progressão da doença. Revisão de literatura A DMVM canina já foi proposta como um modelo animal do prolapso valvar mitral em humanos por apresentar similaridades macroscópicas e microscópicas, além de manifestar uma progressão semelhante (Pedersen e Häggström, 2000). As alterações macroscópicas na DMVM são caracterizadas como opacidade e espessamento, e podem se desenvolver nos dois folhetos da valva mitral. Inicialmente essas anormalidades são observadas apenas no terço distal dos folhetos valvares, que progridem para um espessamento difuso e nodular generalizado. Nas cordas tendíneas, as anormalidades macroscópicas incluem deformação e alongamento destas estruturas (Fox, 2012; Häggström et al., 2004). As alterações morfológicas causadas pela degeneração valvar mitral culminam numa aposição ineficaz dos folhetos e, consequentemente, regurgitação de sangue para o átrio esquerdo durante a sístole ventricular (Connell et al., 2012; Petric, 2015) Inicialmente, a regurgitação mitral leve não induz alterações aparentes no tamanho e função cardíaca. As lesões valvares degenerativas podem progredir, culminando em um maior espessamento das cordoalhas tendíneas e das cúspides da 3 valva mitral, e no desenvolvimento de prolapso dos folhetos valvares para dentro do átrio esquerdo durante a sístole ventricular (Muzzi et al., 2009). A progressão das lesões valvares promove piora da insuficiência mitral, sobrecarga de volume e, consequentemente, remodelamento atrioventricular esquerdo (Keene et al., 2019; Ruaengsri et al., 2018). A princípio, o estiramento ventricular esquerdo gerado pelo aumento da pré- carga leva a uma maior força de contração devido à Lei de Frank-Starling. Com a progressão do remodelamento, da disfunção miocárdica e da redução do débito cardíaco, ocorre a ativação de mecanismos compensatórios neuro-hormonais (Erling e Mazzaferro, 2008). Primeiramente, ocorre a estimulação do sistema nervoso simpático e, mais tardiamente, a ativação do sistema renina-angiotensina- aldosterona. Estes mecanismos são recrutados na tentativa de manter a pressão arterial sistêmica e a homeostase cardiovascular, porém a longo prazo podem gerar consequências deletérias (Erling e Mazzaferro, 2008). Alguns efeitos como vasoconstrição, taquicardia e retenção hídrica gerados pelos mecanismos compensatórios acarretam na progressão da ICC e predispõem o desenvolvimento de arritmias (Serfass et al., 2006; Crosara et al., 2010; Carvalho et al., 2018) Arritmia cardíaca é definida como uma variação da frequência cardíaca e/ou ritmo normal que não é fisiologicamente justificada (Antzelevitch e Burashnikov, 2011). Os mecanismos responsáveis pelas arritmias cardíacas são geralmente divididos em três categorias principais: (1) anormalidades na formação do impulso, (2) anormalidades na condução do impulso e (3) anormalidades na formação e condução do impulso. As anormalidades na formação do impulso são subdivididas em: automaticidade normal diminuída, automaticidade normal aumentada, automaticidade anormal e atividade deflagrada. As anormalidades na condução do impulso são subdivididas em bloqueios de condução e reentrada (Santilli et al., 2020b). Um exemplo de anormalidade na formação do impulso é a maior estimulação simpática e menor estimulação parassimpática que ocorre em cães em fases avançadas da DMVM (Oliveira et al., 2014; Rasmussen et al., 2012). Esse fator é refletido na avaliação por eletrocardiograma e Holter-24h, onde observa-se maiores valores de frequência cardíaca mínima e média, menores índices variabilidade da 4 frequência cardíaca, poucas pausas entre batimentos cardíacos consecutivos e duração mais curta das pausas em cães com ICC (Oliveira et al., 2014; Rasmussen et al., 2012). Distúrbios entre o tônus simpático e o vagal sob o coração devem ser diagnosticados o mais cedo possível, pois essa condição pode predispor à instabilidade elétrica cardíaca e à morte súbita (Carney et al., 2005). A fibrilação atrial (FA) é uma consequência da associação de anormalidades de formação e de condução do impulso (Santilli et al., 2020c). Além de ser a taquiarritmia supraventricular mais comum em cães, sua presença é associada a um menor tempo de sobrevida (Jung et al., 2016; Domanjko Petrič, Hozjan, Blejec, 2007). Os mecanismos propostos para explicar a indução e manutenção da FA incluem: descargas rápidas de foco ectópico (causado por atividade deflagrada) e reentrada funcional. A reentrada funcional é caracterizada por um circuito que se desenvolve ao redor de uma região central formada por tecido refratário (Santilli et al., 2020b). Fatores que promovem a reentrada incluem dispersão da refratariedade, período refratário atrial curto, fibrose e dilatação atrial (Santilli et al., 2020c). Por este motivo, a susceptibilidade à FA é significativamente maior em cães com sobrecarga de volume e fibrose atrial esquerda, características observadas em pacientes nas fases avançadas de DMVM (Ruaengsri et al., 2018; Jung et al., 2016; Janus et al., 2016). Um indicador de prognóstico em cães com FA é a frequência da resposta ventricular, que é influenciada pelo sistema nervoso autônomo nas propriedades de condução do nó atrioventricular. Geralmente a frequência ventricular é menor quando a FA é uma anormalidade isolada, e maior quando está associada a doenças cardíacas estruturais avançadas e ICC (Santilli et al., 2020c). Pedro et al. (2007) demonstraram que para cada aumento de 10 bpm na média da FC de cães com FA, o risco de mortalidade aumenta em 35%. Cães em fases avançadas de DMVM também possuem um maior risco de desenvolvimento de arritmias ventriculares (Crosara et al., 2010; Carvalho et al., 2018). Reentrada é o mecanismo eletrofisiológico mais comumente associado às taquicardias ventriculares, porém automaticidade anormal e atividade deflagrada também podem ocorrer. Anormalidades eletrolíticas, desequilíbrio do sistema autonômico e estresse na parede miocárdica devido sobrecarga de volume e de 5 pressão são os fatores moduladores mais comuns para desencadear uma taquicardia ventricular. Entre eles, a elevação do tônus simpático possui o papel principal no início e na manutenção de arritmias. A ativação do sistema adrenérgico aumenta a automaticidade celular e a atividade deflagrada, e pode promover a dispersão da refratariedade no miocárdio ventricular (Santilli et al., 2020a). Anormalidades mecânicas no miocárdio também podem causar alterações heterogêneas na repolarização ventricular, levando ao aumento ou à redução da duração do potencial de ação (ou período refratário), dependendo da natureza e do momento em que ocorre o estímulo (Kohl et al., 1998). Este fenômeno, conhecido como feebdback eletromecânico, expõe como mudanças na carga de enchimento ventricular em corações com disfunção ventricular alteram a eletrofisiologia cardíaca e aumentam a DR, favorecendo a arritmogênese deflagrada e de reentrada (James et al., 2002; de Bakker et al., 1998). A DR tem sido associada a arritmias com grande risco de óbito (Han e Moe, 1964; Surawicz, 1997). Dois mecanismos já foram propostos para explicar a arritmogênese na presença de grandes diferenças regionais no tempo de repolarização. Primeiro, um batimento prematuro iniciado no tecido com repolarização precoce é conduzido em direção ao tecido com repolarização tardia e falha em se propagar para o último até se recuperar do período refratário (bloqueio unidirecional) (Allessie et al., 1976; Gough et al., 1985). Como consequência, o impulso viaja ao redor do tecido refratário e entra novamente no tecido onde o impulso se originou. Segundo, as diferenças nos tempos de repolarização geram uma corrente elétrica que flui intracelularmente do tecido com atraso em direção ao tecido com repolarização precoce, que despolariza o último. Se o potencial limite de ativação for alcançado, inicia-se um batimento prematuro espontâneo e, consequentemente, uma arritmia. Esse mecanismo para arritmogênese focal foi denominado “reentrada da fase 2” (Lukas, Antzelevitch, 1996). A DR ventricular vem sendo estudada há mais de 5 décadas (Han e Moe, 1964). Diversos estudos já demonstraram que o miocárdio ventricular é eletricamente heterogêneo e é composto por pelo menos três células eletrofisiologicamente e funcionalmente distintas: células epicárdicas, M e endocárdicas (Antzelevitch et al., 6 1999; Antzelevitch et al., 1995; Anyukhovsky et al., 1999). A célula M (Moe maçônica do meio do miocárdio) foi descoberta no início dos anos 90 e foi nomeada em memória de Gordon K. Moe (Anyukhovsky et al., 1999). Os três tipos principais de células miocárdicas ventriculares diferem em relação às características de repolarização das fases 1 e 3. As células epicárdicas e as células M, mas não as endocárdicas, geralmente exibem fase 1 mais proeminente, devido a uma grande corrente de efluxo transitória sensível a 4-aminopiridina (4-AP) (Ito), dando ao potencial de ação um pico e uma cúpula ou configuração entalhada (Antzelevitch e Burashnikov, 2011). Estas características já foram demonstradas em diversas espécies, incluindo cães (Liu et al., 1993), gatos (Furukawa et al., 1990) e humanos (Nabauer et al., 1996). Outro diferencial das células M é capacidade de seu potencial de ação prolongar desproporcionalmente em relação ao potencial de ação das outras células do miocárdio ventricular como resposta a uma desaceleração da frequência cardíaca e/ou em resposta a agentes prolongadores da duração do potencial de ação (Antzelevitch et al., 1991; Sicouri e Antzelevitch, 1991; Anyukhovsky et al., 1996). No cão, a base iônica para esses recursos da célula M inclui a presença de uma menor corrente retificadora retardada de ativação lenta (IKs) (Liu e Antzelevitch, 1995), uma corrente tardia de sódio maior (INa tardia) (Zygmunt et al., 2001) e uma corrente de troca Na-Ca maior (INCx) (Zygmunt et al., 2000). A distribuição de células M dentro da parede ventricular já foi investigada no coração canino. Embora as células de transição sejam encontradas em toda a parede do ventrículo esquerdo canino, as células M que apresentam os potenciais de ação mais longos são localizadas no subendocárdio profundo até o meio do miocárdio na parede anterior (Yan et al., 1998), no subepicárdio profundo até o meio do miocárdio na parede lateral (Sicouri e Antzelevitch , 1991) e em toda a parede na região da via de saída do ventrículo direito (Antzelevitch et al., 1999). As células M também estão presentes nas camadas celulares profundas das estruturas endocárdicas, incluindo músculos papilares, trabéculas e septo interventricular (Sicouri e Antzelevitch, 1995). As diferenças no tempo de repolarização dos três tipos predominantes de células do miocárdio contribuem de maneira proeminente para a inscrição da onda T no eletrocardiograma. Os gradientes de voltagem que se desenvolvem como 7 resultado da diferença temporal da repolarização das fases 2 e 3 nos três tipos de células dão origem a gradientes de voltagem opostos em ambos os lados da região M, que são em parte responsáveis pela inscrição da onda T (Yan e Antzelevitch, 1998). No caso de uma onda T positiva, as células epicárdicas são as primeiras a repolarizar e as células M são as últimas. A repolarização completa do potencial de ação epicárdico coincide com o pico da onda T (Tp) e a repolarização das células M é coincidente com o final da onda T (Tf) (Yan e Antzelevitch, 1998). Portanto, a duração do potencial de ação epicárdico determina o intervalo entre a onda Q e Tp, enquanto a duração do potencial de ação das células M determina o intervalo entre a onda Q e Tf. Consequentemente, o intervalo entre o pico e o final da onda T (Tptf) nas derivações precordiais do eletrocardiograma fornece um índice de DR transmural (Antzelevitch et al., 1999). O intervalo Tptf vem ganhando popularidade após diversos trabalhos demonstrarem associação entre este parâmetro prolongado e arritmogênese ventricular e morte súbita cardiogênica (Zhao et al., 2012; Smetana et al., 2011; Erikssen et al., 2012). Tse et al. (2017) analisaram 33 estudos relacionados a Tptf envolvendo 155.856 pessoas, com trabalhos referentes a populações em diversas condições clínicas (ICC, cardiopatia isquêmica, síndrome de Brugada, hipertensão, embolismo pulmonar, doença de Chagas, distúrbio de condução intraventricular, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia isquêmica), além de trabalhos com populações generalizadas. Todos os estudos apontaram uma associação positiva entre o prolongamento do Tptf e taquicardia/fibrilação ventricular ou morte súbita cardiogênica. A razão entre o intervalo Tptf e o intervalo QT (Tptf/QT) possui uma vantagem substancial em comparação a outros marcadores de repolarização ventricular, como os intervalos Tptf, QT e QTd, pois não precisa ser corrigida pela frequência cardíaca (Castro-Torres et al., 2015; Zhao et al., 2012) e não é afetada pela variação interindividual. Em indivíduos de espécies evolutivamente diferentes ou da mesma espécie com frequências cardíacas diferentes, as alterações no intervalo Tptf e QT ocorrem de forma proporcional e paralela, no entanto, a razão Tptf/QT permanece 8 constante. Isso melhora a relação sinal/ruído e fornece informações exclusivas que preveem a arritmogênese. Além disso, acredita-se que este marcador seja um índice mais sensível de arritmogênese, pois fornece uma estimativa da DR em relação à duração total da repolarização (Gupta et al., 2008). A amplificação da DR espacial dentro do miocárdio ventricular já foi associada à arritmogênese em humanos cardiopatas com diferentes canalopatias hereditárias e adquiridas, incluindo taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, e as síndromes de Brugada (Letsas et al., 2010), do QT curto (SQTC) (Watanabe et al., 2010) e do QT longo (SQTL) (Lubinski et al.,1998; Yamaguchi et al., 2003). Embora apresentem fenótipos e etiologias distintas, a consequência eletrofisiológica é similar: o aumento da DR transmural. O aumento da heterogeneidade de repolarização na SQTL é causado pelo prolongamento da duração do potencial de ação das células M (Antzevelich e Oliva, 2006). Pacientes com esta canalopatia possuem intervalo Tptf mais prolongado do que pacientes saudáveis (Lubinski et al., 1998). Na SQTL, a razão Tptf/QT também se mostrou um preditor de Torsade de Pointes melhor do que os intervalos QTd e QTc (Yamaguchi et al., 2003). Da mesma forma, pacientes com SQTC apresentam Tptf mais longo do que pacientes com QT curto sem histórico de arritmias, e do que pacientes saudáveis (Watanabe et al., 2010). Na SQTC, o aumento da DR transmural é resultado da redução da duração do potencial de ação das células epicárdicas ou endocárdicas (Antzevelich e Oliva, 2006). Na síndrome de Brugada, o intervalo Tptf e a razão Tptf/QT já foram associados a maior risco de taquicardia ou fibrilação ventricular (Letsas et al., 2010). A abreviação da duração do potencial de ação das células epicárdicas nesta síndrome causa amplificação da DR espacial (Antzevelich e Oliva, 2006). Em modelos caninos de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, já foi demonstrado que ectopias originadas no epicárdio, caracterizadas como pós-despolarizações tardias induzidas por atividade deflagrada, são associadas ao aumento do intervalo Tptf e da DR transmural. Esta atividade extrassistólica pode promover substrato para o desenvolvimento de taquiarritmias reentrantes que originam taquicardia/fibrilação ventricular polimórfica rápida (Nam et al., 2005). 9 Além da associação com cardiopatias elétricas hereditárias, a heterogeneidade de repolarização ventricular também é descrita como uma causa subjacente de maior risco arritmogênico e de mortalidade em diversas cardiopatias estruturais. O intervalo Tptf pode ser utilizado como um fator de risco independente para morte súbita cardiogênica em adultos com doenças cardíacas congênitas (Vehmeijer et al., 2019). Este parâmetro também é um preditor independente de taquicardia ou fibrilação ventricular e de mortalidade em pacientes com implante de cardioversor desfibrilador e ICC (Xue et al., 2019). Li et al. (2019) demonstraram uma associação linear significativa entre o intervalo Tptf e os parâmetros ecocardiográficos relação E/A e a onda A, indicando que o acoplamento eletromecânico da DR é um possível mecanismo de disfunção diastólica. A aplicabilidade do intervalo Tptf como potencial ferramenta prognóstica também foi demonstrado em pacientes com calcificação anular mitral (Afsin et al., 2017), cardiomiopatia hipertrófica (Shimizu et al., 2002), estenose severa de valva mitral (Dural et al., 2017), infarto agudo do miocárdio (Erikssen et al., 2012), aumento da espessura de tecido adiposo epicárdico (Kaplan et al., 2015) e crianças com extrassístoles ventriculares de diversas etiologias (Wei et al., 2013). Apesar de os marcadores de repolarização ventricular serem correlacionados a diversas patologias envolvendo diretamente o sistema cardiovascular, eles também já foram estudados em outras disfunções orgânicas que podem resultar em consequências deletérias ao organismo como um todo, sendo também indicadores de prognóstico nestas condições. Yılmaz et al. (2018) constataram redução estatisticamente significativa dos valores de Tptf após transplante renal em humanos nefropatas em estágio terminal, indicando um menor risco de arritmias ventriculares e FA após o procedimento. Taşolar et al. (2014) relataram que parâmetros de repolarização ventricular, incluindo o intervalo Tptf e a razão Tptf/QT, são maiores em indivíduos fumantes em comparação com aqueles que não fumam. Além disso, eles mostraram uma correlação significativa com a quantidade de cigarros fumados. Ip et al. (2020) revelaram que, além do cigarro de tabaco, o cigarro eletrônico com nicotina também causa efeitos adversos nos índices de repolarização ventricular. Na literatura atual há muitos trabalhos que evidenciam a relação entre estes marcadores de repolarização ventricular e diversos distúrbios sistêmicos, como sepse (Ozdemir et al., 10 2016), diabetes mellitus (Tokatli et al., 2016), doença celíaca (Demirtas et al., 2017), HIV (Ünal et al., 2018; Cetin et al., 2020), hipotireoidismo (Gürdal et al., 2017), psoríase (Çetin et al., 2020), convulsão (Dagar et al., 2020), deficiência de vitamina D (Bagrul e Atik, 2019), o que sugere um maior risco de arritmogênese ventricular nestas afecções. Referências Afsin A, Yilmaz M, Deger S, Tasolar H, Yasar E, Pekdemir H (2017) Evaluation of the Tp-e interval and Tp-e/QT ratio in patients with mitral annular calcification. Ann Clin Lab Res 5:199. 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CAPÍTULO 2 - Tpte and Tpte/QT: novel arrhythmogenic and survival markers for dogs with myxomatous mitral valve disease¹ Introduction/objectives: Heart disease is an important cause of sudden death in dogs, accounting for 21.9% of all cases1. Sudden cardiac death (SCD), often caused by ventricular arrhythmia, is also a concern in human cardiovascular medicine and accounts for almost half of deaths in people with structural heart disease2. SCD poses a similar risk in dogs with arrhythmias secondary to various structural heart conditions3. Crosara et al.4 monitored dogs with MMVD using 24-h Holter and electrocardiogram, and found supraventricular and ventricular arrhythmias in 50% and 57% of asymptomatic dogs, and in 72% and 86% of symptomatic dogs, respectively, demonstrating that arrhythmias are common in MMVD. It is known that sudden death and electrical instability in CHF may be related to increased dispersion of ventricular repolarization5 through abnormalities in ionic channel currents6. Several electrocardiographic (ECG) markers of ventricular repolarization have been proposed as risk indicators in a variety of clinical contexts, including QT interval7, QT interval corrected by heart rate (HR) (QTc)8 and QT dispersion (QTd)9. Recently, new markers such as the interval between the peak and the end of T wave (Tpte)10 and Tpte/QT ratio have shown greater sensitivity for detection of ventricular arrhythmias and proved better predictors of survival in people11. There is little information on the evaluation of ventricular repolarization parameters in dogs with myxomatous mitral valve disease (MMVD). To the best of our knowledge, our group was the first to investigate QT interval variables in dogs with MMVD12. In that study12, we demonstrated that increases in QT instability and prolongation is 18 significantly related to mortality in dogs with MMVD and can be used as prognostic surrogates. In this study, we sought to assess whether T wave indices may identify dispersion of ventricular repolarization in patients with MMVD. Our objectives were four-fold: (1) to investigate whether ventricular repolarization changes over the course of the disease; (2) to determine whether T wave indices are correlated with echocardiographic parameters; (3) to assess sensitivity and specificity of repolarization markers to predict development of arrhythmias and cardiac remodeling; and (4) to assess the prognostic aspect of T wave indices having the development of CHF or all-cause mortality as the final outcomes. Animals, materials and methods This was a retrospective, cross-sectional study, conducted at two Veterinary Teaching facilities. The study was approved by the institutional Animal Care and Use Committee (protocol 015875/18) and complied with the National Institutes of Health Guide for the Use and Care of Laboratory Animals. Animals Medical records of dogs admitted to the Cardiology sections of two Veterinary Teaching Hospitals between August 2016 and December 2017 were reviewed. Inclusion criteria were dogs diagnosed with naturally occurring MMVD confirmed by echocardiographic examination, with a good quality ECG tracing and clinical and epidemiological data available, regardless of breed, age, sex or body weight. MMVD dogs were classified according to the stage of the disease13. Patients with no mitral valve regurgitation, dogs diagnosed with congenital heart disease or other acquired 19 cardiovascular disease, or those which received antiarrhythmic treatment were not admitted into this investigation. For the control group, data from clinically healthy dogs admitted for elective procedures were selected. Clinical analyses Clinical information collected comprised breed, sex, age, body weight, presence of clinical signs, murmur characteristics, presence of pulmonary crackling, and medical therapy. Echocardiographic analyses In both teaching facilities from which data was collected, echocardiographic evaluation was performed by experienced veterinary cardiologists using echocardiography machinesa,b equipped with a range of multifrequency sector transducers, which were selected according to patient size. Echocardiograms were reviewed for ratio of the left atrial to aortic root diameters (LA:Ao), fractional shortening (FS), peak velocity of early diastolic transmitral flow (E), ratio of early to late transmitral flow (E:A), and left ventricular internal dimension at end-diastole and at end-systole, which were normalized for body weight using allometric scaling14: LVIDdN=LVIDd/body weight0.294 and LVIDsN=LVIDs/body weight0.315. ECG analyses Good quality computer-based ECG recordingsc were used for measurements. All ECG tracings were recorded continuously for at least 3 minutes, and followed recommendations described elsewhere15. 20 Several ECG parameters were obtained as follows: cardiac rhythm16; R-R interval; P- wave, PQ interval and QRS complex durations; T-wave polarity; QT interval; QTd (defined as the maximum difference between QT intervals in any two leads)9; QTc interval (calculated as QTc=QT/RR1/3) 17; QTcd (defined as the maximum difference between QTc intervals in any two leads)9; Tpte interval (defined as interval from the peak to the end of T wave)18; Tpted (defined as the maximum difference between Tpte intervals in any two leads)19; and Tpte/QT ratio20. To reduce bias, the person involved in reviewing ECG tracings (B.C.P.V) was blinded to the patient’s clinical and echocardiographic condition. Rhythm and duration of R-R, P wave, PQ interval and QRS complex were obtained in lead II. QT and Tpte (and, consequently, QTc and Tpte/QT) were measured in ten leads (I, II, III, aVR, aVL, aVF, rV2, V2, V4, V10). The values of R-R, QT and Tpte represent the average of three consecutive measurements. Also, whenever sinus arrhythmia was present, measurements were performed in duplicate in beats with higher and lower R-R intervals21. Four variables derived from Tpte were included as well: maximum of any lead, maximum of rV2-V10, average of rV2-V10 and average of rV2-V4. The peak of the T wave was defined as the time point where the T wave had the maximal amplitude, whereas the end of T wave was considered as the intersection of the tangent to the down slope of the T wave and the isoelectric line18 (Fig. 1). In the case of complex T wave morphologies (biphasic or inverted), the interval between the nadir of the first component of T wave and the end of T wave was used21. 21 Figure 1. The ‘tangent’ method for defining the end of the T wave. Prognosis and survival analysis Clients were contacted by phone and invited to answer questions about the patient’s condition; if they were still alive, the date of telephone contact was recorded; if animals had died, the date and probable cause of death was noted. Owners of asymptomatic animals were also questioned regarding manifestation of signs related to heart disease; if positive, which clinical signs and start date of these. When clients were lost to contact or information was unavailable for whatever reason, the date on which animal was last seen alive was recorded from medical records. Statistical analysis All data underwent the Shapiro-Wilk normality test. Kruskal-Wallis test followed by Dunn's post hoc test was used to check for differences in age, body weight, R-R interval and echocardiographic parameters between controls and MMVD dogs. Chi- square test was calculated to evaluate association between groups and nominal 22 categorical variables, such as sex, rhythm, polarity of T wave and presence of arrhythmias. To investigate differences in ECG markers of ventricular repolarization between the control and MMVD groups, either Kruskal-Wallis test followed by Dunn's test or an analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's multiple comparison test was performed, depending on the results of normality test. Spearman's test was used to investigate correlations between QT, QTc, Tpte, Tpte/QT, and both R-R interval and the echocardiographic parameters. For the interpretation of the Spearman correlation magnitude, the following classification was adopted: correlation coefficients <0.3 (poor), 0.3 to 0.5 (fair), 0.6 to 0.8 (moderately strong) and >0.8 (very strong)23. Receiver operating characteristic (ROC) curves were constructed to evaluate sensitivity and specificity of repolarization markers to differentiate (a) MMVD dogs with ventricular arrhythmias identified during electrocardiography from those without arrhythmias; and (b) to distinguish patients with dilated hearts from those without remodeling. Lastly, Kaplan-Meier curves and the log-rank test were used to evaluate the prognostic value of the studied ECG markers for the development of clinical signs attributable to CHF (for stages B1 and B2) and the all-cause mortality (for all dogs) as the final outcomes. All analyzes were performed using statistical softwaresd,e with default settings. Statistical significance was defined as p <0.05. Results Animals A total of 236 dogs with MMVD met the inclusion criteria and were recruited for this study. When clinical and echocardiographic data were analyzed, 145/236 (61.4%) animals were classified as stage B1, 16/236 (6.7%) as stage B2 and 75/236 (31.8%) 23 as stage C. In the control group, information was collected from 15 clinically healthy animals. Although mixed breed dogs (n=70) formed the majority of cases, several breeds were represented in the MMVD group, including Poodle (n=65), Maltese (n=11), English Cocker Spaniel (n=10), Yorkshire Terrier (n=10), Lhasa Apso (n=9), Shih tzu (n=9), Dachshund (n=8), Beagle (n=7), Miniature Pinscher (n=6), Brazilian Terrier (n=4), Labrador (n=4), Schnauzer (n=4), Pekingese (n=3), Pointer (n=2), Pug (n=2), as well as Afghan Hound, American Bully, Basset Hound, Bichon Frise, Border Collie, American Bulldog, Chihuahua, Dalmatian, Papillon, German Shepherd, Pit Bull, and German Spitz (n=1 each). The control group was composed of mixed breed dogs (n=4), Poodle (n=2) and Chow Chow, English Cocker Spaniel, Labrador, Belgian Shepherd, Miniature Pinscher, Samoyed, Shih tzu, Yorkshire Terrier, and Border Collie (n=1 each). Clinical and echocardiographic features Cough was the most common clinical sign (50%), followed by exercise intolerance (21.0%), cyanosis (10.3%), dyspnea (8.1%), syncope (6.2%), weight loss (1.3%) and ascites (0.4%). On physical examination, the most commonly auscultated murmurs heard best over the left cardiac apex (mitral) were grade 2/6 in B1 dogs, 3/6 in B2 dogs and 4/6 in C dogs. The majority of B1 and B2 dogs did not have murmur heard over the right cardiac apex (tricuspid location), however in stage C dogs a grade 3/6 tricuspid murmur was commonly auscultated. Also, pulmonary crackling was present in 9% of dogs. At the first appointment, 67 (28%) dogs were receiving angiotensin- converting enzyme inhibitors, 45 (19%) furosemide, 22 (9.3%) spironolactone, 13 (5.5%) pimobendan, 5 (2.1%) sildenafil, 2 (0.8%) amlodipine, while 38 dogs (16%) were receiving other drugs. Comorbidities were present in 78 (53.8%) of the stage B1 24 dogs, 9 (56.3%) of the stage B2 dogs and 29 (38.7%) of the stage C dogs. Other clinical and echocardiographic features are summarized in Table 1. Although no statistical difference existed between the groups with regard to sex and FS, significant differences were documented for age, body weight, LVIDdN, LVIDsN, LA:Ao, E and E:A. In the advanced stages of the disease, dogs were significantly older, had lower weights, greater remodeling of cardiac chambers and volume overload. Table 1. General and echocardiographic features of healthy dogs and dogs with myxomatous mitral valve disease. Control (n=15) B1 (n=145) B2 (n=16) C (n=75) p Females (n) 6 (40%) 86 (59.31%) 6 (37.5%) 44 (58.67%) 0.2016* Age (years) 8.67a (4-13) 10ab (4-16) 11ab (5-15) 11.78c (2-19) <0.0001** Weight (kg) 19.16a ±13.83 8.5a (5.85-13) 8.437ab ±4.991 7.15b (465- 9.650) 0.0045** LVIDdN (cm) 1.385a ±0.2326 1.381a ±0.1742 1.718b (1.694-1.837) 1.829b ±0.2837 <0.0001** LVIDsN (cm) 0.7826ab ±0.1609 0.7132a (0.6328- 0.8007) 0.9192b ±0.1382 0.8745b (0.7311- 0.965) <0.0001** LA:Ao 1.128a ±0.1498 1.378b ±0.1984 1.881c ±0.3026 1.98c (1.76- 2.3) <0.0001** FS (%) 70a (63-75) 49.5a (41-71) 52.94a ±12.2 50a (45-61) 0.0876** E (m/s) 0.6507a ±0.1332 0.6950a (0.59-0.79) 0.9447b ±0.2129 1.158b ±0.4061 <0.0001** E:A 0.9853ab ±0.3155 0.865a (0.7425- 1.2) 1.337bc ±0.3911 1.24c (1-1.6) <0.0001** Results are presented as mean ± standard deviation or median (interquartile interval). Age are presented in the form of mean or median (minimum – maximum). Values followed by the same letter do not differ from each other by Dunn's test (p>0,05). *: Chi-square test; **: Kruskal-Wallis test and Dunn test; E: Peak velocity of early diastolic transmitral flow; E:A: Ratio of early-to-late transmitral flow peak velocities; FS: Fractional shortening; LA:Ao: Ratio of the left atrial dimensions to the aortic annulus dimension; LVIDdN: left ventricular end diastolic diameter normalized for body weight; LVIDsN: left ventricular end systolic diameter normalized for body weight. 25 ECG features Duration of R-R interval, P wave and QRS complex differed between groups. Even though the presence of arrhythmias was observed in all groups, including the controls, in dogs with MMVD rhythm and proportion of arrhythmias were significantly associated with severity of disease (Table 2). Supraventricular arrhythmias were observed in one (6.7%) control dog (atrial premature complex [APC]), eight (5.5%) stage B1 dogs (seven with APC, two with paroxysmal supraventricular tachycardia), two (12.5%) stage B2 dogs (one with APC and one with paroxysmal supraventricular tachycardia), fifteen (20%) stage C dogs (twelve with APC, eight with paroxysmal supraventricular tachycardia). Ventricular arrhythmias were observed in one (6.7%) control animal, three (2.1%) B1 animals, three (18.8%) B2 animals and ten (13.3%) C animals. All ventricular arrhythmias were isolated ventricular beats, except for one patient in group C in which bigeminy was documented. 26 Table 2. Electrocardiographic features related to rhythm, R-R interval, P wave, PQ interval and QRS complex duration, T-wave polarity and prevalence of arrhythmias in healthy dogs and dogs with myxomatous mitral valve disease. Control (n=15) B1 (n=145) B2 (n=16) C (n=75) p SA (n) 5 (33.33%) 85 (58.62%) 11 (68.75%) 27 (36%) <0.0001* SR (n) 10 (66.67%) 59 (40.69%) 4 (35%) 36 (48%) ST (n) 0 (0%) 1 (0.69%) 1 (6.25%) 11 (14.67%) RR (ms) 517.1ab ±188.4 531a (460-653.5) 543.7ab ±179.9 485b (362-582) 0.0079** P (ms) 40ab (40-50) 43a (40-47) 47ab ±3.863 47b (43-50) 0.0002** PQ (ms) 88.2a ±18.33 92.02a ±16.47 89.07a ±14.94 93 a (83-107.3) 0.3017** QRS (ms) 56.13ab ±5.63 55a (52-60) 55ab (50-62) 58.88b ±6.387 0.0174** Positive T wave (n) 7 (46.67%) 41 (28.27%) 7 (43.75%) 16 (21.33%) 0.1070* Negative T wave (n) 5 (33.33%) 79 (54.48%) 8 (50%) 46 (61.33%) Arrhythmia (n) 2 (13.33%) 9 (6.2%) 4 (25%) 23 (30.67%) 0.0001* Results are presented in the form of mean ± standard deviation or median (interquartile interval). Values followed by the same letter do not differ from each other by Dunn's test (p>0,05). *: Chi-squared test; **: Kruskal-Wallis test and Dunn test; P: P wave duration; PQ: PQ interval duration; QRS: QRS complex duration; RR: interval between two successive R waves; SA: Sinus arrhythmia; SR: Sinus rhythm; ST: Sinus tachycardia Although most ECG tracings were of sufficient quality to allow unbiased readings, QT and Tpte measurements (and consequently QTc and Tpte/QT) were not performed in ECG leads with significant artifacts or flat T waves, which included a minimum of 2 cases (0.8%) for aVR up to a maximum of 34 cases (13.5%) for aVL. Additionally, some leads were not recorded in some patients. rV2 was absent in eight (3.2%) exams, V2 in nine (3.6%) exams, V4 in eleven (4.4%) exams and V10 in 124 (49.4%) exams. 27 Ventricular repolarization markers vs disease stages Table 3 shows the results obtained for each ECG marker of ventricular repolarization. Except for measurements derived from QT, most repolarization markers increased with the progression of the disease. Nonetheless, Tpte and Tpte/QT measured in leads II, III, aVR and V10, and QTcd were similar between groups. Of note, the majority of significant differences were documented between stage B1 and stage C dogs. Table 3. Electrocardiographic indices of ventricular repolarization in healthy dogs and dogs with myxomatous mitral valve disease. Control B1 B2 C p QT (ms) I 179a ±16.73 185a ±17.58 182.2a ±15.9 186a ±16 0.551* II 182.7a ±21.32 189a ±17.55 190a ±16.02 189.6a ±18.68 0.285* III 181.8a ±21.66 189.6a ±16.51 183.9a ±20.73 189.2a ±18.4 0.468* aVR 181.5a ±20.88 188.6a ±18.23 189.3a ±14.3 188.8a ±17.98 0.5177* aVL aVF 178.8a 181.1a ±24.9 ±21.65 187.9a 188.6a ±17.30 ±17.92 188.2a 187.4a ±18.24 ±22.97 190a 190.8a ±17.64 ±18.77 0.245* 0.3544* rV2 185.3a ±18.69 192.4a ±17.5 191.3a ±18.29 193.2a ±16.98 0.4626* V2 187.9a ±18.04 193.8a ±17.96 189.1a ±16.97 194.9a ±17.6 0.4259* V4 187a (165- 191) 190.6a ±18.16 193.1a ±18.7 191.8a ±17.77 0.3553** V10 175a (161.5- 193) 187.5a ±16.87 183.8a ±17.86 184a (173.5- 192.8) 0.3097** QTd 15a (12-24.5) 18a (13-23) 20.5a (15.5-25) 16a (12.5-22) 0.358** QTc (ms) I 226.9ab ±25.64 225.3a (211.9- 238.3) 222.a (214.1- 241) 237.9b ±17.24 0.0001** II 230.3ab (212.- 245.) 230.4a (219- 241.) 229.2ab (218.1- 249.) 239.6b (228.- 252.3) 0.0001** III 227.9ab (216.9- 239.7) 229.5a (220.6- 242.2) 229.2a ±24.25 242b ±18.04 0.0002** aVR 231.4ab (214.9- 237.6) 230a (218.5- 241.8) 230.5ab (216.5- 257.9) 242b ±17.41 <0.0001** aVL 230ab (223.1- 236.5) 228.9a (217.5- 238.3) 236.7ab ±30.15 242.3b ±17.98 <0.0001** aVF 226.9a (217.8- 236.6) 229.1a (217.8- 241.7) 233.4ab ±26.99 241.8b (232- 257.8) <0.0001** rV2 233.9ab (221.8- 233.9) 232.5a (222.6- 246.9) 238ab ±29.35 247b ±17.69 <0.0001** V2 231.1ab (222.4- 246.4) 235.3a (223.8- 247.5) 226.1a (215.9- 242.3) 249.2b ±17.71 <0.0001** V4 228.2ab (217.2- 247.3) 231.4a (218.7- 245.8) 231.8ab (221.2- 242.9) 240.9b (233.8- 251.5) 0.0003** V10 223a ±13.5 229.1a ±16.55 238.9ab ±36.43 241.4b (230.7- 253.3) 0.0079** QTcd 19.09a ±6.14 22.77a ±45.22 27.68a (18.18- 70.18) 21.12a (17.99- 27.78) 0.5017** 28 Tptf (ms) I 24.83ab ±5.24 25a (22-28) 27.13ab ±5.22 27b (24-34) 0.0047** II 25a (23-40) 27a (23-30) 26.5a (24-30.5) 28a (25-36) 0.1374** III 28.43a ±7.122 25a (22.5-31) 28.13a ±7.004 26a (24-33) 0.4003** aVR 25a (21-30) 26a (23-29) 27.5a (24.25- 30) 27a (24.75- 33.5) 0.1010** aVL 25.31ab ±3.401 25a (22-28) 28.64ab ±5.472 29b (25-35) <0.0001** aVF 26.07ab ±5.313 25a (23-31) 26.5ab (23.25- 30.75) 28b (25-36) 0.0109** rV2 33ab ±5.085 30a (27-33) 35b (30-40) 33b (30-37) <0.0001** V2 32ab (30-35) 31a (27-35) 34.67ab ±9.371 35.83b ±8.559 0.0018** V4 30ab (27-34.5) 27a (23-33) 34.29ab ±10.26 30.5b (25.25- 37) 0.0041** V10 28.18a ±6.242 28a (25-33) 32.83a ±7.195 28a (25.75- 33.25) 0.5389** Tptfd 16.07ab ±6.584 15a (11-20) 18.38ab ±9.605 19.37b ±8.672 0.0166** Maximum of any lead 36.8ab ±5.99 36a (32-40) 40.69ab ±9.279 42.49b ±9.045 <0.0001** Maximum of rV2-V10 35.67ab ±6.499 35a (30-38) 41b ±9.196 39b (34-46) <0.0001** Average rV2-V10 31.63ab ±4.547 29.89a ±4.082 35.26b ±7.069 33.67b ±5.112 <0.0001* Average rV2-V4 32.26ab ±4.687 29.33a (26.67- 33) 35.1b ±7.356 34.03b ±5.227 <0.0001** Tptf/ QT I 0.1398ab ±0.03112 0.1350a (0.1187- 0.1515) 0.1501ab ±0.03196 0.1506b (0.1304- 0.1847) 0.0047** II 0.1545a ±0.03825 0.14371a (0.1237- 0.1631) 0.1308a (0.1241- 0.1813) 0.15a (0.1362- 0.1840) 0.1027** III 0.1575a ±0.03811 0.1366a (0.1210- 0.1637) 0.1356a (0.1214- 0.1851) 0.1485a (0.1287- 0.16969) 0.1225** aVR 0.1471a ±0.02849 0.1406a (0.1237- 0.1539) 0.1503a ±0.03099 0.1469a (0.1336- 0.1753 0.1127** aVL 0.1434ab ±0.02388 0.1344a (0.12- 0.1514) 0.1533ab ±0.03241 0.1557b (0.1333- 0.1832) 0.0003** aVF 0.1474ab ±0.03956 0.1377a (0.1202- 0.1650) 0.1522ab ±0.03443 0.1515b (0.1404- 0.1860) 0.0122** rV2 0.1786a ±0.02523 0.1537b (0.1387- 0.1784) 0.1895a ±0.04446 0.1765a (0.1561- 0.1925) <0.0001** V2 0.177ab (0.154- 0.1849) 0.1616a (0.14- 0.1855) 0.1829ab ±0.04611 0.1839b ±0.04126 0.0022** V4 0.1737ab ±0.03325 0.1477a (0.1257- 0.1683) 0.1756ab ±0.04325 0.1634b (0.14- 0.1855) 0.0009** V10 0.1591a ±0.03288 0.15a (0.1292- 0.1734) 0.1813a ±0.05067 0.1613a (0.1298- 0.1929) 0.5598** Results of obtained parameters are presented in the form of mean ± standard deviation or median (interquartile interval). Values followed by the same letter do not differ from each other (p>0.05) by Dunn's or Tukey's test, according to data distribution.*: ANOVA, followed by Tukey test; **: Kruskal- Wallis test followed by Dunn's test; QTc: QT interval corrected by heart rate; QTcd: QTc dispersion; QTd: QT dispersion; Tpte: T wave peak-end interval; Tpte/QT: Ratio of Tpte and QT intervals 29 Ventricular repolarization markers vs echocardiographic parameters and R-R interval QT measurements obtained in all leads showed moderately strong positive correlation with R-R interval, and poor negative correlation with FS. However, no other echocardiographic parameter significantly correlated with QT. On the contrary, QTc obtained in all leads showed fair negative correlation with R-R interval and poor to fair positive correlation with all echocardiographic parameters, except FS. Tpte obtained in leads I, aVL, rV2, V2, and V4, the maximum of any lead, the maximum of rV2-V10, the average of rV2-V10 and the average of rV2-V4 showed poor to fair positive correlation with LVIDdN, LVIDsN and LA:Ao. A poor positive correlation was also found to exist between some Tpte indices and both E and E:A. Similarly, Tpte/QT obtained in leads I, aVL, aVF, rV2 and V4 showed poor to fair positive correlation with LVIDdN, LA:Ao, FS, E while negative correlation was documented with R-R interval. Tpte/QT obtained from aVL showed poor positive correlation with E:A, as did LVIDsN and Tpte/QT obtained from V2 and V4 (Table A available in Supplemental Material on-line). Ventricular repolarization markers vs Cardiac remodeling and arrhythmias Area under the curve (AUC) >0.7 was used as the cut-off criteria for acceptable sensitivity and specificity24. Evaluation of ROC curves for identification of cardiac remodeling using QT, QTc, Tpte and Tpte/QT failed to show any AUC >0.7 (data not shown). For investigation of arrhythmias of ventricular origin, ECG parameters in which an AUC >0.7 was obtained were Tpte and Tpte/QT. The highest odds ratios for development of ventricular arrhythmias were calculated for Tpte (average rV2-V10), Tpte (average rV2-V4), Tpte/QT (rV2), Tpte (rV2) and Tpte/QT (aVR). Cut-off values 30 for each ECG parameter and its respective sensitivity, specificity, accuracy, and odds ratio for development of ventricular arrhythmias are listed in Table 4. ROC curves are shown in Figure 2. Table 4. Cut-off, sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), accuracy (%), odds ratio and p value of electrocardiographic parameters with an AUC >0.7 to differentiate dogs with mitral myxomatous valve disease with and without ventricular arrhythmia. Cutoff Sensitivity (%) Specificity (%) PPV Accuracy (%) Odds Ratio p Tpte aVR > 32.50 38.89 83.98 0.16 80.72 3.34 0.0042 > 24.50 88.89 31.60 0.09 35.74 3.7 > 29.50 55.56 72.73 0.14 71.49 3.33 Tpte rV2 > 32.50 81.25 61.43 0.13 62.76 6.9 0.0042 > 34.50 68.75 73.99 0.16 73.64 6.26 > 39.50 31.25 91.93 0.22 87.87 5.18 Tpte average rV2- V10 > 32.13 93.33 64.91 0.16 66.67 27.75 0.0020 > 36.58 62.50 87.72 0.26 86.07 11.9 > 35.29 68.75 82.89 0.22 81.97 10.66 Tpte average rV2- V4 > 32.50 93.75 62.72 0.15 64.75 25.24 0.0015 > 36.50 68.75 85.96 0.26 84.84 13.48 > 35.17 75.00 82.02 0.23 81.56 13.68 Tpte/QT II > 0.1458 77.78 53.04 0.11 54.84 3.95 0.0050 > 0.1681 61.11 75.65 0.16 74.60 4.88 > 0.2041 22.22 89.57 0.14 84.68 2.45 Tpte/QT aVR > 0.1444 72.22 58.01 0.12 59.04 3.59 0.0033 > 0.1690 44.44 81.39 0.16 78.71 3.5 > 0.1980 33.33 91.77 0.24 87.55 5.58 Tpte/QT rV2 > 0.1663 87.50 53.81 0.12 56.07 8.16 0.0090 > 0.1821 68.75 72.65 0.15 72.38 5.84 > 0.2141 25 95.54 0.29 90.79 7.1 PPV calculated as TP/(TP+FP). Accuracy was calculated as (TP+TN)/(TP+TN+FP+FN). Average: Tpte average; FN: false negative; FP: false positive; TN: true negative; TP: true positive; Tpte: T wave peak- end interval; Tpte/QT: Ratio of Tpte and QT intervals 31 Figure 2. ROC curves constructed to assess sensitivity and specificity of ventricular repolarization markers for differentiation of dogs with and without myxomatous mitral valve disease presenting ventricular arrhythmias. AUC: Area under the curve; Average: average of Tpte values; ROC: Receiver operating characteristic curve; Tpte: T wave peak-end interval; Tpte/QT: Ratio of Tpte and QT intervals 32 Ventricular repolarization markers vs Prognosis and survival Owners of 87 asymptomatic animals (stages B1 and B2) were contacted and only 13 of these dogs had developed clinical signs attributable to CHF. The low proportion of patients (<50%) that reached this end-point impairs the construction of an accurate Kaplan-Meier curve (data not shown). Nonetheless, survival information was obtained from the owners of 139 dogs with MMVD (all stages), of which 69 (50%) died. The most common causes of death were cardiovascular disease (n=22; 31.9%), neoplasia or complications associated with chemotherapy or surgery to remove tumors (n=21; 30.4%) and unknown cause (n=19; 27.5%). The most frequent cardiovascular complication was CHF (n=14), followed by SCD (n=4) and cardiorenal syndrome (n=4). Ventricular repolarization parameters associated with all-cause mortality are shown in Table 5, along with its respective cut-off, and median survival times. The increase in all significant indices was associated with increased mortality, with the exception of QT aVL and Tpted (Figure 3). For instance, Tpte/QT rV2, when a cutoff value of 0.2141 is applied, shows a median difference of 587 days in survival time, with a hazard ratio of 2.551. Similarly, Tpte rV2 also has a median difference of 255 days with a hazard ratio of 2.627 when a cutoff value of 39.5 ms is applied. Indices that demonstrated the greatest differences in mean survival time according to the cut-off point were Tpte/QT (aVR), Tpte/QT (rV2), Tpte (maximum of any lead) and Tpte (maximum rV2-V10). It is important to emphasize that hazard ratios were derived from the log-rank comparison and not from Cox proportional hazards models. The Kaplan-Meier curves obtained for the significant findings are shown in Figure 4. 33 Table 5. Cut-offs, median survival times and p values of surrogates of ventricular repolarization obtained in dogs with myxomatous mitral valve disease. Cutoff value Median survival of dogs < cutoff (days) Median survival of dogs > cutoff (days) Difference in median survival time (days) p QT aVL (ms) 199.5 929 1196 267 0.0143 QTc II (ms) 260.4 1004 872 132 0.0074 QTc aVR (ms) 254.5 1223 872 315 0.0038 Tpte aVF (ms) 38.5 979 752 227 0.0149 Tpte rV2 (ms) 39.5 1094 839 255 0.0017 Tpted (ms) 25.5 965 983 18 0.0497 Tpte maximum of any lead (ms) 49 1004 531 473 0.0066 Tpte maximum of rV2-V10 (ms) 46.5 1117 752 365 0.0243 Tpte/QT aVR 0.198 1118 531 587 0.0002 Tpte/QT aVF 0.2021 1150 991 159 0.0111 Tpte/QT rV2 0.2141 1118 531 587 0.023 QTc: QT interval corrected by heart rate; Tpte: T wave peak-end interval; Tpte/QT: Ratio of Tpte and QT intervals Figure 3. Forest plot showing the hazard ratio and 95% confidence of intervals of ventricular repolarization markers for the risk of death in dogs with mitral myxomatous valve disease. QTc: QT interval corrected by heart rate; Tpte: T wave peak-end interval; Tpte/QT: Ratio of Tpte and QT intervals QTc: QT interval corrected by heart rate; Tpte: T wave peak-end interval; Tpte/QT: Ratio of Tpte and QT intervals 34 Figure 4. Kaplan-Meier curves constructed to investigate ventricular repolarization markers as surrogates of mortality in dogs with myxomatous mitral valve disease. QTc: QT interval corrected by heart rate; Tpte: T wave peak-end interval; Tpte/QT: Ratio of Tpte and QT intervals 35 Discussion In this study, we investigated the applicability of ECG-derived repolarization markers in dogs with MMVD. The electrocardiogram is a noninvasive, widely available and cheap ancillary method that allows the identification of cardiac rhythm disturbances. Characteristics of T wave reflect myocardial repolarization, and might be useful as surrogates for development of arrhythmias and survival. However, to the best of our knowledge, no prior veterinary study has evaluated how Tpte performs in a naturally occurring canine disease. Our results showed that Tpte and Tpte/QT are good markers to predict ventricular arrhythmias and all-cause mortality in dogs with MMVD, especially when compared with other surrogates of ventricular repolarization such as QT and QTc. It has been more than 3 decades since the description of the M cell that reframed understanding that regional differences exist in the electrical properties of the ventricular myocardium. Canine models developed for studying ventricular action potentials first identified electrophysiologically distinct mid-myocardial cells, termed M cells, which were found to exhibit unique repolarization properties compared to the cells in the endocardium and epicardium25. Although M cells are similar to epicardial and endocardial cells histologically, they appear to be an electrophysiological and pharmacological hybrid between Purkinje and ventricular cells. The hallmark of the M cell is the characteristic of prolongation of its action potential relative to the action potential of other ventricular myocardial cells in response to heart rate slowing and to action potential duration-prolonging agents26. In 1998, Yan and Antzelevitch studied the behavior of epicardial, endocardial and M cells in the formation of the T wave in dogs, and demonstrated that the repolarization of the epicardium cells (the first to 36 repolarize) coincides with the peak, while the repolarization of M cells (the last to repolarize) coincides with the end of the T wave. Therefore, it was demonstrated, for the first time, that Tpte interval represents the surface ECG manifestation of dispersion of repolarization across the ventricular wall, hereafter referred to as repolarization heterogeneity27. Although the consensus is that Tpte reflects dispersion of ventricular repolarization, there is disagreement about whether this dispersion is transmural28 or global 18, 29-31. Tpte is considered to be more representative of transmural dispersion in precordial leads, since they measure the electric field through the ventricular wall. The direction of these leads is radially outward from the "center" of the heart, the center of the Einthoven triangle. However, bipolar limb leads do not look across the ventricular wall and therefore, although Tpte intervals measured in these leads may provide a transmural dispersion index, they are more likely to reflect global dispersion, including apicobasal and interventricular repolarization dispersion32. The use of Tpte and Tpte/QT as indices of arrhythmogenesis and mortality in people with cardiac disease has been well recognized in the medical literature, even in subjects with normal QT intervals20. In a study that recruited people with hypertrophic cardiomyopathy, Shimizu and colleagues33 showed that Tpte/QT, but not QTc, was significantly higher in patients who developed SCD or ventricular tachycardia. Of note, Tpte/QT was also shown to be a stronger predictor of mortality in human patients with acute myocardial infarction during the first year after the event, as compared to QT34. People with severe mitral valve stenosis had increased Tpte and Tpte/QT, and these parameters reduced significantly after correction by balloon valvuloplasty35. Conversely, that same study documented no difference in QT and QTc between 37 healthy subjects and patients with mitral valve stenosis either before or after valvuloplasty. Tpte and Tpte/QT were also shown to be useful for clinical risk stratification in people with mitral annular calcification36. Prolongation of Tpte and Tpte/QT is likely to represent a period of potential vulnerability to re-entrant ventricular arrhythmias20. Except for QT, most of the ventricular repolarization indices evaluated in this investigation increased along with the frequency of arrhythmias, and with the progression of MMVD (Table 3). In CHF, sympathetic nervous system stimulation leads to increased dispersion of ventricular repolarization, resulting in increased Tpte interval37. In addition to sympathetic stimulation, increased calcium influx and reduced potassium outflow may also cause temporal heterogeneity of Tpte, therefore posing a higher risk of malignant ventricular arrhythmias in CHF patients38. While arrhythmias were observed in all stages of MMVD, supraventricular and ventricular extrasystoles were more frequent in the more advanced stages. This finding has been reported in other studies of MMVD dogs4, 12, 39. The exact mechanism for development of arrhythmias in MMVD dogs has not yet been elucidated, but it is likely to be multifactorial4. Supraventricular arrhythmias in dogs with MMVD have been associated with increased mitral valve prolapse40 and enlargement of the left atrial chamber4. Ventricular arrhythmias have been associated with ventricular dilation and stretching with increased myocardial wall tension41, myocardial hypoxia42, intramyocardial arterial stenosis, myocardial interstitial fibrosis and poor systolic function43. None of the studied parameters produced an AUC >0.7 when used to investigate cardiac remodeling. However, the positive correlations found between either Tpte, Tpte/QT or QTc and the echocardiographic parameters may reflect the 38 role played by cardiac remodeling and congestion on myocardial electrical activity. Mechanical overload can alter myocardial electrophysiological properties and increase repolarization abnormalities and inhomogeneity44. This phenomenon, known as mechanoelectrical feedback, has already been demonstrated in canine ventricles and suggests that myocardial stretch might initiate arrhythmias and that the susceptibility to stretch-induced arrhythmias is enhanced by ventricular dilatation41. QT interval was the only parameter to positively correlate with R-R interval. It is well described in human and veterinary literature that QT interval changes with HR. While higher HR (shorter R-R) are associated with shorter QT intervals, lower HR (higher R- R intervals) results in a prolonged QT45,46. Moreover, it is recognized that QT interval changes lag behind HR changes, resulting in the appearance of “hysteresis” in QT/RR interval plots47. For this reason, correction for this effect is necessary for meaningful QT interval assessment. Fridericia’s correction method has been thought to result in a low accuracy error compared to other methods48. In this study QT (any lead), QTd and QTcd failed to differentiate healthy and MMVD dogs and showed no reasonable sensitivity and specificity as surrogates for augmented ventricular arrhythmogenesis. Nonetheless, QT (aVL) was demonstrated to be a good prognostic marker in survival analyses. Surprisingly, a better prognosis was observed in patients with longer QT. We hypothesize that the moderately strong positive correlation found between QT values and R-R intervals may explain this result, since R-R intervals were significantly associated with the degree of the disease. Even though QTc (all leads) differed between groups and correlated positively with the majority of echocardiographic parameters, it was not a good predictor for arrhythmias. Similarly, a study with Boxers showed that neither QT interval nor QTd correlated with 39 indicators of disease severity for familial ventricular arrhythmias, including the number of ventricular premature complexes, or complexity of arrhythmias49. Several methods have been published for determination of Tpte (leads II, V2, V5, average V1-V6, average V4-V6, maximum of V1-V6, maximum of any lead, automated 12SL method) and most of them have proven utility for risk stratification. However, a lack of standardization of this measurement limits its use in clinical practice50. Since veterinary literature related to ventricular repolarization markers is still very scarce, measurements in all leads in this investigation were essential to evaluate its potential applicability in a clinical setting. In veterinary practice, most measurements are performed in lead II, but the results of this research show that assessment of ventricular repolarization is best done in aVR and precordial leads to determine electrical instability and mortality. In our study, the best markers for ventricular arrhythmias and survival were Tpte and Tpte/QT obtained from leads aVR and rV2, as well as Tpte (maximum of any lead, maximum of rV2-V10, average rV2-V10 and average rV2-V4). In clinical practice, parameters obtained from either aVR or rV2 have the advantage of requiring only a single