RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta TESE será disponibilizado somente a partir de 21/12/2022. 1 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Efeito de compostos naturais bioativos sobre o metabolismo lipídico e a produção de estresse oxidativo durante a replicação do vírus da hepatite C em cultura celular – VHCcc Moema de Souza Santana Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição para obtenção do título de Doutor em Alimentos e Nutrição. Área de Concentração: Ciências Nutricionais. Orientador: Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa. Araraquara 2020 2 Efeito de compostos naturais bioativos sobre o metabolismo lipídico e a produção de estresse oxidativo durante a replicação do vírus da hepatite C em cultura celular – VHCcc Moema de Souza Santana Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição para obtenção do título de Doutor em Alimentos e Nutrição. Área de Concentração: Ciências Nutricionais. Orientador: Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa. Araraquara 2020 3 4 5 Agradecimentos Pessoais Agradeço a Deus pelo cuidado sem fim durante todo meu caminho em busca da realização dos meus sonhos. Aos meus pais Pedro Jackson e Geraldina Batista pelo dom da vida e pelos exemplos de caráter, dignidade e força. Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa pelo acolhimento, generosidade e exemplo de honestidade, ética e amor pela ciência. Ao amor da minha vida Iuri Lima Aiura pelo companheirismo, carinho e apoio e à minha querida sogra pela força e alegria. Aos amigos fieis que cultivei em Araraquara em especial a Rute Lopes, Carla Cruz, Rafael Fulindi e Carolina Ribeiro pelo companheirismo, apoio e convívio amoroso. A todos os colegas de laboratório e de curso por todo apoio e companheirismo durante o desenvolvimento do projeto e cursada das disciplinas. Aos amigos e aos familiares que deixei na Bahia e que fazem presentes mesmo em distância, me dando a força necessária para prosseguir diante da certeza de apoio e de aconchego no retorno para casa. 6 Agradecimentos À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (processo: 2017/04500-9) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES (Código de Financiamento 001; Processo: 250 - 10/2017) pelas bolsas concedidas. Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa pela orientação no planejamento e execução desse trabalho. A minha colega Rute Lopes pelo apoio incondicional e acolhimento durante todas as etapas de realização desse trabalho. Aos docentes da Pós-graduação em Alimentos e Nutrição pelo ensino, dedicação e conhecimento compartilhado. À sessão de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição pela disponibilidade, apoio e eficiência nas orientações. 7 “Toda caminhada começa no primeiro passo. A natureza não tem pressa segue seu compasso, inexoravelmente chega lá.” (Santanna. A natureza das coisas, 2007). 8 Resumo Introdução: As complicações relacionadas à cronicidade de hepatite C estão associadas com o aumento do estresse oxidativo promovido pelo Vírus da Hepatite C (VHC), que causa danos ao DNA, alterações na peroxidação lipídica e está associadada a morte celular. O resvetrarol (RVT) apresenta ampla ação antioxidante, e potencial de síntese de derivados. O f- resveratrol, derivado RVT com a adição de uma molécula de fluor apresenta atividade antioxidante promissora. A taurina (TAU) destaca-se pala ação que desempenha na estabilidade da membrama plasmatica, a reprodução, a imunidade. Objetivo: Avaliar o efeito do RVT, do F-RVT e da TAU sobre o perfil de morte celular e a replicação do VHC. Métodos: Trabalho desenvolvido utilizando células Huh-7.5 e células Huh-7.5 expressando estavelmente o replicon subgenômico SGR-JFH1. Os CNBs analisados foram o RVT, F-RVT e TAU. A viabilidade células foi analisada por meio do ensaio colorimétrico de MTT. O mecanismo de apoptose e necrose foi analizado por citometria de fluxo. A quantificação de RNA do VHC, nas células SGR-JFH1 sem tratamento e pós-tratamento, foi realizada por ensaio de PCR em tempo real. Aplicou-se o modelo de análise de variância. Foi aplicado d.m.s. do teste de Tukey a nível de 5% de probabilidade. Resultados: O controle positivo (H2O2) apresentou expressiva citotoxicidade, morte celular de aproximadamente 80% nas células SGR- JFH1 e de 95% nas células Huh-7.5. Os compostos apresentaram tendência de indução de apoptose precoce pelos tratamentos com os CNBs nas células Huh-7.5 e nas SGR-JFH1 para as concentrações testadas. Houve ausência de influencia dos tratamentos com os CNBs sob o padrão de necrose das células Huh-7.5 e nas SGR-JFH1 para as concentrações testadas. Verificou-se ainda redução da carga viral intracelular como efeitos dos tratamentos com RVT, F-RVT e TAU em 1 dia em tratamentos. Conclusão: Os compostos estudados apresentaram efeito sobre a indução de apoptose precoce e sobre a redução da carga viral intracelular do VHC. Palavras-Chave: VHC, Hepatite C, estresse oxidativo e apoptose. 9 Abstract Introduction: Complications related to the chronicity of hepatitis C are associated with increased oxidative stress promoted by the Hepatitis C Virus (HCV), which causes DNA damage, changes in lipid peroxidation and is associated with cell death. Resvetrarol (RVT) has a broad antioxidant action and derivatives synthesis potential. The f-resveratrol derivative RVT with the addition of a fluoride molecule presents promising antioxidant activity. Taurine (TAU) stands out for the action it plays on the stability of the plasma membrane, reproduction, immunity. Objective: To evaluate the effect of RVT, F-RVT and TAU on cell death profile and HCV replication. Methods: The study was developed using Huh-7.5 cells and Huh-7.5 cells expressing the SGR-JFH1 subgenomic replicon. The viability analysis of the cells was analyzed by means of the MTT colorimetric assay. Apoptosis and necrosis mechanism analysis was performed by flow cytometry. The quantification of HCV RNA was performed in SGR-JFH1 cells without treatment and after treatment. The variance analysis model was applied. The contrast between means was done by the d.m.s. of the Tukey test at 5% probability level. Results: The positive control (H2O2) presented expressive cytotoxicity, cellular death approximately 80% in SGR-JFH1 cells and 95% in Huh-7.5 cells. The compounds presented the tendency to induction of early apoptosis by the treatments with NBCs in the Huh-7.5 cells and in the SGR-JFH1 for the concentrations tested. There was no influence of the treatments with the NBCs under the necrosis pattern in the Huh-7.5 cells and in the SGR-JFH1 for the concentrations tested. There was also a reduction of intracellular viral load as effects of treatments with RVT, F-RVT and TAU in 1 day in treatments and absence of influence on extracellular viral load in the same period. Conclusion: The compounds studied had an effect on the induction of apoptosis Precose in Huh-7.5 cells and SGR-JFH1 cells and on the reduction of intracellular viral load of HCV. Palavras-Chave: VHC, Hepatite C, estresse oxidativo e apoptose. 10 Lista de abreviaturas e sigla CCL-5 Ligante do Receptor de Quimiocina 5 CNBs Compostos Naturais Bioativos ERONs Espécies Reativas de Oxigênio e Nitrogênio F-RVT F-Resveratrol IL-8 Interleucina 8 HCC Carcinoma Hepatocelular Huh-7.5 Provenientes de Hepatocarcinoma Humano PPAR Proliferadores de Peroxisoma OMS Organização Mundial da Saúde NO Óxido Nítrico SREBP Proteína Reguladora do Elemento Regulador do Esterol RVT Resveratrol TAU taurina VHC Vírus da Hepatite C 11 Lista tabelas e quadros Introdução. Quadro 1. Combinações medicamentosas preconizadas para o tratamento da Hepatite C no Brasil. 21 Capitulo 1. Table 1. Natural bioactive compounds (NBCs) with biological or anti- hepatitis C virus activities. 44 Capitulo 2. Table 1. Summary of signaling pathways involved in hepatic lipid processing and resulting metabolic effects. 65 Capitulo 3. Tabela 1. Concentrações inibitórias médias de resveratrol e f- resveratrol para as linhagens celulares Huh-7.5 e SGR-JFH1. 93 Capitulo 4. Tabela 1. Concentrações inibitórias médias de taurina para as linhagens celulares Huh-7.5 e SGR-JFH1. 114 12 Lista de figuras Introdução Figura 1. Esquema visual do ciclo de replicação do Vírus da Hepatite C. 18 Figura 2. Estrutura molecular do resveratrol. 23 Figura 3. Estrutura molecular do f-resveratrol. 24 Figura 4. Estrutura molecular da taurina. 25 Capitulo 1. Figura 1. Viral and host chronicity factors involved in hepatitis C progression. 34 Capitulo 2. Figura 1. The role of cell signaling molecules regarding steatosis. 72 Figura 2. Cell signaling pathways involved in lipid metabolism. 76 Capitulo 3. Figura 1. Viabilidade celular das células Huh-7.5 e SGR-JFH1 após tratamento com H2O2 1 mmol L-1 (CP). 94 Figura 2. Ensaio de apoptose por citometria de fluxo. 95 Figura 3. Análise do índice de apoptose precoce em células Huh-7.5 e SGR-JFH1 após tratamento com resvetratrol e f-resveratrol. 96 Figura 4. Análise do índice de necrose em células Huh-7.5 e SGR- JFH1 após tratamento com resveratrol e f-resvaratrol. 97 Figura 5. Análise quantitativa por RT-qPCR da carga viral de RNA do VHC em sobrenadante de células SGR-JFH1. 98 Figura 6. Análise quantitativa por RT-qPCR da carga viral de RNA do VHC meio intracelular e no sobrenadante de células SGR-JFH1. 99 Capitulo 4. Figura 1. Análise quantitativa por RT-qPCR da carga viral de RNA do VHC meio intracelular e no sobrenadante de células SGR-JFH1 após tratamento com taurina. 115 Figura 2. Análise do índice de apoptose precoce em células Huh-7.5 e SGR-JFH1 após tratamento com taurina. 116 Figura 3. Análise do índice de necrose em células Huh-7.5 e SGR- JFH1 após tratamento com taurina. 117 13 Sumário Introdução. 14 Capítulos 27 Capítulo 1. Natural Bioactive Compounds As Adjuvant Therapy For Hepatitis C Infection. 28 Abstract 29 Graphical Abstract 29 Introduction 30 Methods 35 Results and discussion 35 Conclusion 46 Funding 46 References 46 Capítulo 2. Central cellular signaling pathways involved with the regulation of lipid metabolism in the liver: a review. 62 Abstract 63 Introduction 63 Methods 64 Lipids and cell signaling pathways 65 Conclusion 77 Acknowledgements 77 References 77 Capítulo 3. Efeito do resveratrol e derivado sobre a morte celular e replicação do Vírus da Hepatite C. 83 Resumo 84 Introdução 84 Metodos 84 Resultados 93 Discussão 100 Conclusão 102 Referências 102 Capítulo 4. Avaliação do potencial antioxidante da taurina sob a modulação da morte celular e replicação do vírus da hepatite C. 106 Resumo 107 Introdução 108 Metodos 108 Resultados 114 Discussão 118 Conclusão 119 Referências 119 Considerações Finais 120 14 Introdução 15 Hepatites virais: breve histórico A história das hepatites virais remonta vários milênios. Existem relatos de ocorrência de icterícia entre na população chinesa há mais de cinco mil anos. Além disso, a descrição de casos de icterícia de origem infecciosa relacionada a problemas hepáticos foi descrita por Hipócrates. No entanto, somente no século XVIII introduziu-se o termo hepatite para designação da sintomatologia destas doenças (REUBEN, 2002). A observação da sintomatologia e vias de transmissão das hepatites foi foco de interesse da ciência por anos, e sabe-se que a suspeita da transmissão destas por via parenteral foi descrita pela primeira vez em 1895, devido ao desenvolvimento de quadro de icterícia em 14,8% dos indivíduos vacinados contra a varíola por meio de vacina produzida a partir de linfa humana. A sintomatologia da doença manifestou-se de dois meses a oito meses após a aplicação da vacina, caracterizando-se por fadiga, anorexia, queixas digestivas, icterícia e por intenso prurido cutâneo. No entanto, o estabelecimento da transmissão das hepatites por inoculação parenteral, ocorreu apenas em 1937, com a ocorrência de casos de icterícia sintomáticos de dois a sete meses após a inoculação de vacina contra febre amarela preparada com adição de soro humano para fins de estabilização (REUBEN, 2002; ALTER, 2003). A ocorrência de quadro de icterícia a partir de outras vias de contaminação (via fecal-oral, através de água ou alimentos contaminados), com período de incubação mais curto (sete a 10 dias exposição) também foram descritas ao longo dos anos, corroborando com a hipótese de que a sintomatologia das hepatites variava de acordo com diferentes agentes etiológicos (REUBEN, 2002; ALTER, 2003). Dessa forma, esforços passaram a ser dispendidos no sentido de isolar os agentes infecciosos das hepatites. O vírus da hepatite B foi o primeiro a ser descoberto (BLUMBERG et al., 1965). Posteriormente o vírus da hepatite A foi isolado (FEINSTONE et al.,1973) e em 1989, a partir de estudos de biologia molecular, identificou-se o genoma do agente viral 16 responsável por 80 a 90% das hepatites pós-transfusionais não-A e não- B16. Tal agente foi denominado de vírus da hepatite C. (CHOO et al., 1989). Relêvancia epidemiológica e formas de infecção da hepatite C A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que aproximadamente 71 milhões de pessoas estejam infectadas pelo vírus da hepatite C (VHC) mundialmente, e que o número de mortes relacionadas a essa infecção alcance 400 mil pessoas por ano (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2018). Os dados epidemiológicos no Brasil para hepatites virais são escassos e muitas vezes divergentes, pois apesar de se tratar de uma doença de notificação compulsória, o sistema informacional conta como principal fonte notificadora os bancos de sangue e hemocentros que estão situados em áreas geográficas restritas, o que dificulta a estimativa precisa para a população geral (CARVALHO et al., 2014; MARTINS et al., 2010). No entanto, estima-se que cerca de 700 mil indivíduos são sorreagentes anti- VHC no Brasil (BENZAKEN et al., 2018). As principais formas de infecção com o VHC são a transfusão de sangue de indivíduos infectados, o compartilhamento de material para uso de drogas (seringas, agulhas, cachimbos, entre outros) e de higiene pessoal (lâminas de barbear e depilar, escovas de dente, alicates de unha ou outros objetos perfurocortantes), a confecção de tatuagem ou colocação de piercings com objetos contaminados, a transmissão vertical (transferência do vírus da mãe infectada para o filho durante a gestação e/ou parto) e sexo sem camisinha com indivíduo infectado (forma mais rara de infecção) (MARTINS et al., 2010). A infecção pelo VHC pode ser aguda ou crônica. A hepatite C aguda geralmente é assintomática e progride para a cura espontânea em 15 a 45% dos casos. No entanto, existem casos de persistência da infecção e de evolução para hepatite C crônica (55 a 85% dos casos). Os mecanismos responsáveis pela persistência da infecção pelo VHC não foram ainda completamente elucidados, mas, sabe-se que o dano hepático produzido na 17 cronicidade dessa doença pode ocasionar fibrose hepática, cirrose, falência hepática e/ou carcinoma hepatocelular (HCC) (BURKE & COX, 2010). Assim, a infecção pelo VHC constitui-se como a principal causa de hepatopatias crônicas (60%) e maior causa de indicação de transplante de fígado no mundo, visto que, de 5 a 20% dos indivíduos infectados pelo vírus desenvolvem cirrose em até 30 anos da infecção. Além disso, de 1 a 5% indivíduos infectados falecem em decorrência da doença, por cirrose ou em decorrência do HCC (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2016; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2018). Heterogenineidade genética e ciclo do VHC O VHC pertence à família Flaviviridae (gênero Hepacivirus) e é constituído por RNA com genoma fita simples de polaridade positiva. O RNA viral codifica uma extensa poliproteína, composta por aproximadamente 3.000 aminoácidos, que distingue-se em proteínas estruturais, o capsídeo (core) e as glicoproteínas de envelope E1 e E2, e em proteínas não estruturais (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) que são responsáveis pela replicação viral (CHAMPEIMONT et al., 2016; DUBUISSON & COSSET, 2014). O processo de replicação viral do VHC ocorre nos hepatócitos e permite a caracterização de 6 genótipos e 67 subtipos (identificados por letras minúsculas segundo ordem de descoberta) desse vírus, no entanto, durante o processo de replicação pode ocorrer variações na inclusão de nucleotídeos dentro de um mesmo genótipo e subtipo do VHC. Tais variações, denominadas quasispecies, ocorrem devido à replicação imperfeita do vírus e do surgimento de pequenas e constantes mutações espontâneas durante a replicação viral e contribuem para aabsorvância grande diversidade e variabilidade gênica do VHC (MESSINA et al., 2015; SMITH et al., 2014). A entrada do VHC na célula é um processo altamente orquestrado, que envolve fatores virais e da célula hospedeira. A primeira etapa do ciclo de vida do vírus é a ligação da partícula viral à célula hospedeira, para a 18 qual há uma interação específica entre receptores na superfície da célula hospedeira (Glicosaminoglicanos, Receptores Lipoproteína de Baixa Densidade, Tetraspanina - CD81, Scavenger Receptor – SR-BI, Claudin – CLDN e Occludin - OCLN) e glicoproteínas virais de adesão (E1 e E2 do envelope) que induz a endocitose e entrada de partículas de VHC através da membrana plasmática celular (WHIDBY et al., 2009). Após a entrada do vírus na célula hospedeira, há a liberação do RNA viral fita simples positiva no citoplasma. A fita de RNA positiva é replicada em fita negativa que é usada para a síntese de outras fitas positivas por intermediário replicativo. Assim, este genoma pode ser empregado em tradução de novas proteínas do vírus, replicação de maiores quantidades de RNA e montagem de novas partículas virais infecciosas (BARTENSCHLAGER et al., 2010; LINDENBACH & RICE, 2013). A figura 1 apresenta o esquema visual do ciclo de replicação do VHC. Figura 1. Esquema visual do ciclo de replicação do Vírus da Hepatite C. Legenda: Particulas virais ligam-se ao hepatócito por meio de interação especifica entre as glicoproteínas do envelope e os receptores da membrana célular. As partículas vírais são interiorizadas por meio de endocitose. No citoplasma ocorre liberação do genoma viral após 19 o desnudamento da partícula. A tradução ocorre no RER (retículo endoplasmático rugoso), assim uma lipoptroteina é clivada em proteínas estruturais e não estruturais. As proteínas não estruturais participam da replicação viral e as estruturais fazem parte da estrutura do capsídeo e compõem as glicoproteínas do envelope. Ocorre então a montagem e a maturação das partículas virais e posteriormente a liberação destas da célula hospedeira. Fonte: Oliveira, 2007, com adaptações. O ciclo de vida do VHC está intimamente relacionado ao metabolismo lipídico desde os processos de entrada e replicação viral até a montagem e liberação das partículas infecciosas. Assim, os processos relacionados com o aumento da lipogênese, da redução da degradação de lipídios no fígado e da redução da exportação desses metabólitos do tecido hepático para o organismo podem ser desencadeados pelo VHC, com o objetivo de aumentar a disponibilidade de constituintes necessarios à sua replicação e montagem (CHANG, 2016). Alguns autores destacam que a inibição da proteína reguladora do elemento regulador do esterol (SREBP), da enzima ácido graxo sintase, da síntese de triacilglicerídeos e da síntese de colesterol e de seus produtos (geranilgeranil) inibem a replicação do VHC (XIANG et al., 2015; SYED et al., 2011). A redução da degradação de lipídios no fígado pelo VHC relaciona-se com a redução da via de β-oxidação de ácidos graxos na mitocondria, induzida pelo vírus, o que resulta em baixa combustão lipídica e a inibição da atividade da proteína trifuncional mitocondrial (AMAKO et al., 2015). Além disso, a proteina de core do VHC tem o potencial de aumentar a atividade de receptores ativados por proliferadores de peroxisoma (PPAR), acentuando a desregulação na β-oxidação lipídica e a depossição de gordura no técido hepatico (CHANG, 2016). As partículas virais infecciosas, depois de formadas, são liberadas causando danos ao tecido hepático resultante de processo inflamatório caracterizado por um infiltrado inflamatório com diferentes populações de células imunes (WHIDBY et al., 2009). O processo inflamatório e os mecanismos da doença no tecido hepático, na hepatite C, ainda não estão bem definidos, mas sugere-se que exista a liberação de citocinas quimiotáticas pelas células endoteliais. Essas citocinas, entre as quais 20 destacam-se a Interleucina 8 (IL-8) ou ligante 8 da quimiocina e o ligante do receptor de quimiocina 5 (CCL-5), pelo grande potencial quimiotraente de neutrófilos e super expressão na infecção crônica pelo VHC, recrutam linfócitos específicos para o fígado e aumentam a inflamação através das interações entres as células endoteliais e os leucócitos (FIERRO et al., 2015). O processo inflamatório na hepatite C pode ainda sofrer influência da liberação de óxido nítrico (NO) por macrófagos, neutrófilos e células endoteliais. O NO é um importante mediador pleiotrópico da inflamação e pode levar o tecido a uma lesão inflamatória potencial agravada pela liberação das espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERONs), os quais aumentam ainda mais a expressão de citocinas (ex. IL-8 e CCL-5) e moléculas de adesão endotelial, amplificando a cascata de inflamação e gerando o estresse oxidativo ao tecido hepático. Assim, o estresse oxidativo (marcado por um aumento de oxidantes e uma diminuição da capacidade antioxidante das células) surge como importante mecanismo bioquímico envolvido na patogênese hepática induzida pelo VHC, uma vez que o equilíbrio entre a geração de ERONs e das defesas antioxidantes é fundamental para a homeostase do hepatócito e um desequilíbrio entre esses agentes pode gerar dano aos hepatócitos, endotélio, células de Kupffer e células estreladas levando à inflamação, isquemia, apoptose, necrose e dano ao DNA, com consequente desenvolvimento do HCC (CAPONE et al., 2012; DIESEN & KUO, 2010; MING-JU, et al., 2011). O desequilíbrio entre os sistemas antioxidante e pró-oxidante, com predomínio da ação oxidante, promove também alterações na peroxidação lipídica. A peroxidação lipídica é definida como uma reação de oxirredução em cadeia dos ácidos graxos poliinsaturados das membranas celulares. Essa reação altera a permeabilidade, fluidez e integridade das membranas celulares e está associada com a formação de produtos citotóxicos e morte celular (FRANÇA et al., 2013). 21 Tratamento antiviral e mecanismos de ação No Brasil, a lista de medicamentos disponíveis para hepatite C foi ampliada nos últimos anos em decorrência dos avanços no tratamento dessa infecção, destacando atualmente as diferentes combinações terapêuticas antivirais com ação direta sobre a replicação viral para diferentes subtipos do VHC (MINISTÉRIO DE SAÚDE, 2019). Dessa forma, as alternativas terapêuticas para o tratamento da hepatite C, com registro no Brasil e incorporadas ao Sistema Único de Saúde (SUS), apresentam efetividade terapêutica mensurada pela resposta virológica sustentada. A resposta virológica sustentada pode então ser comparada entre os esquemas propostos em casos de situações clínicas semelhantes, permitindo a análise da oferta dos esquemas terapêuticos no SUS baseada na observação da relação custo-minimização, ou seja, priorização das alternativas que implicam um menor impacto financeiro ao sistema, sem deixar de garantir o acesso a terapias seguras e eficazes às pessoas com hepatite C. Esta estratégia permite a ampliação do acesso ao tratamento medicamentoso a todos os pacientes infectados pelo VHC (MINISTÉRIO DE SAÚDE, 2019). Entre os medicamentos de uso isolado disponíveis no país podemos citar o daclatasvir, um inibidor do complexo enzimático ns5a, o simeprevir, que apresenta ação inibitória de protease NS3/4A e o sofosbuvir, um análogo de nucleotídeo que inibe a polimerase do VHC. As combinações medicamentosas preconizadas para o tratamento da Hepatite C, os mecanismos de ação dos fármacos e os efeitos adversos potenciais que estas combinações apresentam estão apresentadas no quadro 1. Quadro 2. Combinações medicamentosas preconizadas para o tratamento da Hepatite C no Brasil. Medicamento Mecanismo de Ação Efeitos Adversos Ombitasvir Inibidor do complexo enzimático NS5A Insônia, náusea, prurido na pele, astenia, fadiga e anemia. Odasabuvir Inibidor não nucleosídico da polimerase NS5B 22 Veruprevir Inibidor de protease NS3/4ª Ritonavir Potencializador farmacocinético Ledipasvir Inibidor do complexo enzimático NS5A Náusea, diarreia, constipação, dispepsia, vômito, dor abdominal, dor abdominal superior, boca seca, fadiga, irritabilidade, astenia, diminuição do apetite, mialgia, cefaleia, tontura, distúrbios da atenção, problemas de memória, insônia, ansiedade, depressão, distúrbios do sono, purido e angioedema. Osofosbuvir Análogo de nucleotídeo que inibe a polimerase do VHC Elbasvi Inibidor do complexo enzimático NS5A Náusea, dor abdominal, dor no abdomen superior, constipação, diarreia, boca seca, vômito, astenia, redução do apetite, artralgia, fadiga, cefaleias, mialgia, tontura, ansiedade, depressão, insônia, irritabilidade, alopecia e prurido. Grazoprevir Inibidor de protease NS3/4ª Fonte: Ministério de Saúde, 2019. Nota-se, que apesar dos avanços no tratamento da hepatite C, nos últimos anos, os medicamentos disponíveis possuem tolerância relativa, apresentando uma ampla gama de efeitos adversos severos e eficácia variável, de acordo com os diferentes genótipos virais envolvidos na infecção (BUTT et al., 2016; KUMTHIP & MANEEKARN, 2015; LIU et al., 2016). Assim, diante da gravidade de hepatite C e do grande impacto dessa infecção à saúde pública, diversas pesquisas têm sido realizadas com a finalidade de conhecer os processos metabólicos relacionados à patogênese da hepatite C e de desenvolver produtos que possam exercer atividade no processo inflamatório (diretamente relacionado à doença induzida pelo VHC) apresentando alta eficiência, boa tolerância pelo organismo dos portadores dessa doença e resistência aos mecanismos de evasão por mutabilidade do vírus. Compostos naturais bioativos Nesse cenário, destaca-se o esforço aplicado no desenvolvimento de compostos naturais bioativos (CNBs), na forma de coadjuvantes terapêuticos, de forma a atuar sinergicamente com os tratamentos já estabelecidos, interferindo direta ou indiretamente em diferentes etapas da 23 inflamação para potencializar os resultados terapêuticos. Os CNBs podem ser definidos como uma classe de produtos naturais (puros ou misturados) derivados de alimentos que apresentam benefícios contra doenças, e podem ser alimentos funcionais, suplementos dietéticos, nutrientes isolados, produtos fitoterápicos ou alimentos processados (SILVA et al., 2015; LOVELACE & POLYAK, 2015). Entre os CNBs vale destacar o resveratrol (RVT), um polifenol natural com estrutura de estilbeno e peso molecular de 228,25g/mol (Figura 2). Este composto apresenta baixa estabilidade frente à oxidação, fotosensibilidade e a solubilidade aquosa reduzida, no entanto, possui efeito biológico amplo, apresentando efeitos anit-envelhecimento (promoção de longevidade e atenuação contra doenças neurodegenerativas como doença de Alzheimer), atividades antimutagênica/antitumorais, anticarcinogênica, antiagregante plaquetária, anti-inflamatórias, antioxidantes e antivirais, além de um importante papel na prevenção de doenças cardiovasculares (GAMBINI et al., 2015; KULKARNI & CANTÓ, 2015). Figura 2. Estrutura molecular do Resveratrol. Fonte: Elaborado pelo autor. A atividade biológica do RVT está relacionada à inibição da COX, e consequente promoção de efeitos de quimioprotetores para prevenção do câncer, redução do estresse oxidativo e regulação de mediadores inflamatórios. A inbição da clicoxigenase também suprime o NF-κB e inibe a replicação viral, pela redução da expressão gênica e da síntese de proteínas virais. Descata-se ainda o potencial de regulação de angiogênege do RVT e O H O H O H 24 possível relação deste potencial com a prevenção de câncer (GAMBINI et al., 2015; KULKARNI & CANTÓ, 2015). A inibição da formação da placa de ateroma, por sua vez, associa-se a atuação do RVT pela melhora que este composto produz no perfil lipídico e na função cardíaca, na modulação da inflamação (redução da produção de várias citocinas angiogênicas, incluindo IL-8) e no aumento da produção de oxido nítrico endotelial com consequente vasodilatação e efeito cardioprotetor, além disso, o RVT também regula positivamente o nível da glicose e o metabolismo do tecido adiposo (KULKARNI & CANTÓ, 2015; ABBA et al., 2015). Especificamente em relação à atividade do RVT na terapia contra VHC, os resultados são considerados ser inconsistentes, uma vez que, existem evidências indicando efeito inibidor do RVT na replicação viral pela supressão da expressão da proteína NS3 (LEE et al, 2016) e descrição de atividade do RVT no aumento da replicação do VHC (CARREÑO, 2014). Considerando a grande atividade biológica do RVT como agente oxidante e o potencial deste para síntese de derivados diversos. Torna-se oportuno citar o desenvolvimento de um composto derivado do RVT a partir da adição da molécula de flúor. Este composto com peso molecular de 299,13 g/mol, denominado f-resveratrol (F-RVT), foi desenvolvido pelo Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos (Lapdesf) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, sob a coordenação do Prof. Dr. Jean Leandro dos Santos e da Profa. Dra. Chung Man Chin. A estrutura molecular do F-Resveratrol pode ser observada na figura 3. Figura 3. Estrutura molecular do f-resveratrol. Fonte: Elaborado pelo autor, apartir de informações do laboratório desenvolvedor. 25 Apesar de não ter sua atividade biologica completamente elucidada, acredita-se no efeito potencial do F-RVT sobre o VHC por sua capacidade antioxidante e efeito sobre PPAR. A taurina (TAU) ou ácido 2-aminoetanossulfônico é aminoácido condicionalmente essencial que contem enxofre e deriva-se dos aminiacidos cisteina e metionina. Este composto, de peso molecular de 125,15 g/mol, difere-se dos demais aminoácidos pela presença de um grupamento sulfônico (-SO3) ao invés do grupamento carboxílico (COOH) (IKUBO et al., 2011). Figura 4. Estrutura molecular da taurina. Fonte: Elaborado pelo autor. A TAU não participa da síntese proteica, no entanto, constitui-se como um dos aminoácidos mais abundantes do organismo humano, destacando- se pelo desempenho de funções fisiologicas importantes no metabolismo energético, no sistema nervoso central e na retina, nos músculos esqueléticos e nos ossos (modulaçao de cálcio), no coração e nos intestinos. Além disso, o composto apresenta ação sobre a estabilidade da membrama plasmatica, a reprodução, a imunidade (IKUBO et al., 2011; MENZIE et al., 2014; MURAKAMI, 2015). Entre efeitos da TAU destaca-se seu potencial antioxidante e anti- inflamatório. Esses efeitos estão relacionados à capacidade da TAU de estabilizar as biomembranas, reduzindo a peroxidação de lipídica das mesmas e eliminando espécies reativas de oxigênio (IKUBO et al., 2011). A 26 TAU apresenta também efeitos de neuromodulação, neuroproteção e modulação do metabolismo da glicose (MENZIE et al., 2014; MURAKAMI, 2015). Diante do potencial destes CNBs faz-se necessário desvendar e caracterizar detalhadamente os possíveis mecanismos de ação de tais CBNs como inibidores do ciclo de replicação viral e do processo inflamatório induzido pelo VHC. Desse modo, propõe-se a realização desse estudo com o objetivo de avaliar e a influência dos CNBs (RVT, F-RVT e TAU) sobre o estresse oxidativo em células provenientes de hepatocarcinoma humano (Huh-7.5), transfectadas ou não com o replicon subclone genômico do vírus da hepatite C, SGR-JFH1 (Japanese fulminant hepatitis-1, genótipo 2a). Para tanto, buscou-se i) determinar o perfil de citotoxicidade in vitro induzido pelos CNBs nas células Huh-7,5 e SGR-JFH1, ii) avaliar o potencial de inibição da carga viral induzidos pelos compostos bioativos e iii) avaliar o potencial de indução de apoptose e necrose dos CNBs nas células Huh-7,5 e SGR-JFH1 por citometria de fluxo. Esse trabalho será apresentado em quatro capítulos. Os dois primeiros capítulos são artigos de revisão, sendo o primeiro relacionado à utilização CNBs como possibilidade de adjuvantes terapeuticos na infecção por hepatite C e o segundo relacionado às vias de sinalização celular envolvidas na regulação do metabolismo lipídico no fígado. Os dois últimos artigos, por sua vez, buscam responder aos objetivos do trabalho (descritos no paragrafo anterior). Deste modo buscou-se sistematiza a pesquisa desenvolvida e os resultados encontrados segundo CNB de interesse. Assim, capitulo 3 estará relacionado aos CNBs RVT e F-RVT e o capitulo 4 a TAU. Vale salientar que as normas de formatação de cada um dos cápitulos seguem as orientações das revistas para as quais os artigos foram ou serão enviados. 27 Considerações Finais 28 Ao conduzir esse trabalho buscamos oferecer aos pesquisadores/profissionais de área da saúde/nutrição e afins dados sistematizados sobre a ação de CNBs sobre a hepatite C, destacando possíveis mecanismos de ação antioxidante, antiviral, antitumoral destes compostos (capitulo 1) e as vias relacionadas ao metabolismo lipídico que podem estabelecer interface com estresse celular, inflamação, esteatose, homeostase de lipídios e glicose, diferenciação celular, resistência à insulina, função hepática e distúrbios metabólicos e complicações resultantes (capitulo 2). Buscou-se ainda, avaliar os efeitos de CBNs, nomeadamente RVT, F- RVT e TAU, sobre apoptose, proliferação ou viabilidade celular em células Huh-7.5 e células Huh-7.5 expressando SGR JFH1, apresentando compostos com potencial interessante para modificação do perfil de morte celular e a redução de carga viral, na perceptiva intracelular, resultados expressivos com período de incubação de 24 horas, e extracelular, resultados que sugerem a necessidade de amplicação do período de incubação para consolidação dos resultados. 29 Referências 30 ABBA, Y. et al. Antiviral Activity of Resveratrol against Human and Animal Viruses. Adv Virol. v. 2015, p. 1-7, 2015. doi:10.1155/2015/184241. ALTER HJ. The unexpected outcomes of medical research: serendipity and the Australia antigen. J Hepatol. v. 39, p. 149-152, 2003. AMAKO, Y. et al. Hepatitis C virus attenuates mitochondrial lipid β-oxidation by downregulating mitochondrial trifunctional-protein expression. J Virol. v. 89, p. 4092-4101, 2015. 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