UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU UNESP Utilização de técnicas de engenharia de tecidos para validação do uso do scaffold de quitosana em ampliação vesical de coelhos Regina Avelina de Moraes da Silva Botucatu 2012 Regina Avelina de Moraes da Silva Utilização de técnicas de engenharia de tecidos para validação do uso do scaffold de quitosana em ampliação vesical de coelhos Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, para obtenção do Título de Mestre em Pesquisa e Desenvolvimento – Biotecnologia Médica. Orientadora: Prof. Dra. Elenice Deffune Co-orientador: Prof. Dr. José Carlos Souza Trindade Filho Botucatu - SP 2012 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Silva, Regina Avelina de Moraes da. Utilização de técnicas de engenharia de tecidos para validação do uso do scaffold de quitosana em ampliação vesical de coelhos./ Regina Avelina de Moraes da Silva. – Botucatu : [s.n.], 2012 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Elenice Deffune Co-orientador: José Carlos Souza Trindade Filho Capes: 90400003 1. Biotecnologia. 2. Quitosana. 3. Bexiga. 4. Regeneração (Biologia) Palavras-chave: Medicina regenerativa; Bexiga, Membrana de Quitosana, Engenharia de tecidos, Biomaterial. Dedico essa dissertação a Deus, à toda minha família e aos animais utilizados Em primeiro lugar agradeço a Deus, por estar presente em todos os momentos de minha vida, seja me protegendo, guiando, confortando ou escutando. À Dra. Elenice Deffune, minha orientadora.Visionária, é sinônimo de competência, intelectualidade e sabedoria ímpares.Com certeza é alguém que me proporcionou um valioso crescimento profissional e pessoal, me instigando a correr atrás de novos desafios e perspectivas de vida.Como pessoa é um exemplo da mais pura perseverança e garra, não se abatendo por mais inesperados que sejam os obstáculos. É uma vencedora nata. Agradeço por todos os ensinamentos, pelas oportunidades, pela confiança depositada e pela contribuição na lapidação de mais uma importante etapa em minha vida. Além de orientadora é alguém por quem tenho profundo carinho, admiração e respeito. Mais uma vez, o meu muito obrigado. Foi um prazer fazer parte de sua equipe. Nossa equipe. Ao Dr.José Carlos Souza Trindade Filho, meu co-orientador, pelo apoio, contribuição, disponibilidade e incentivo sempre demonstrados em relação à pesquisa proposta neste trabalho e ao meu desenvolvimento profissional.Obrigada. À Dra. Rosana Rossi-Ferreira, pelo acolhimento em todos os momentos solicitados, pelo conforto de suas sábias palavras, pelos ensinamentos diários, sejam eles pessoais ou profissionais, pelo otimismo transparecido, pelo exímio exemplo de profissionalismo e pela confiança depositada em mim.O carinho, respeito e admiração também são inquestionáveis.Muito obrigada. À Priscila Murador,”meu braço direito”. Exemplo de honestidade,dedicação e disciplina. Alguém que me mostrou a importância de sempre se priorizar nossas virtudes. Não só profissionalmente, mas em matéria pessoal, foi incessantemente zelosa comigo.É, sem dúvida, uma pessoa muito querida, da qual a amizade vou levar ao longo da vida. À Michele Janegitz Acorci Valério por ser um modelo de generosidade e competência.Obrigada pela disponibilidade, pela transmissão de seu conhecimento, pelos muitos ensinamentos pessoais e conselhos profissionais.Com carinho, agradeço a oportunidade de poder ter convivido com uma pessoa de tamanha serenidade, amabilidade e capacidade de subjugar os problemas. À Josy Campanhã Vicentini de Oliveira. Obrigada pela paciência, pelo pronto auxílio sempre que solicitado, pela sua amizade e competência demonstrados. Seu profissionalismo e disciplina são evidentes. Além disso é uma pessoa de grande generosidade por quem tenho muito carinho. À Thaiane Cristine Evaristo. Primeiramente agradeço pela sua amizade, conselhos, companhia, momentos de descontração, de desabafos e de ensinamentos. É alguém cuja sensibilidade e solidariedade imperam. Além de possuir um coração imenso é sinônimo de disciplina, organização, competência, perseverança e caprichosidade o que a faz brilhar e servir de “molde” aos outros. Tenho um carinho gigante. Muito Obrigada por tudo. À Flávia Cilene Maciel da Cruz Alves por me auxiliar na estruturação do trabalho, por transmitir sua competência e doar sua experiência sempre que solicitado.Muito obrigada. À Helga Caputo Nunes. Alguém que em tão pouco tempo me identifiquei,afinal somos muito parecidas, tornando-se uma pessoa muito querida. Muito obrigada pela sua amizade, pela companhia e pelo interesse sempre presente em quais fossem os assuntos ou circunstâncias. Sua ambição em aprender e sua curiosidade peculiar te levarão ao sucesso certamente. Ao Andrei Moroz, pelo auxílio na execução do trabalho, pelos ensinamentos prestados e pelas sugestões pertinentes.O meu muito obrigado. À toda equipe do Laboratório de Engenharia celular.Tanto os que já passaram quanto os que vem chegando são pessoas que me ajudaram a desenvolver o espírito do verdadeiro trabalho em equipe, me ensinando tudo o que foi indagado, jamais deixando de oferecer assistência, sendo sempre solícitos. Com certeza a união do trabalho em equipe é o que determina nosso sucesso, pois ninguém tarabalha sozinho. Muito obrigada: Alexandro Fagner Ferreira, Aline Aparecida Del´Vescovo, Aline Garcia Aun, Ana Carolina Paisan, Ângelo Biasi Govone, Aparecida Vitória Gonçalves de Souza, Armando de Mattos Carvalho, Daniel Bassetto Jesuíno, Fátima Regina Guimarães, Flávia Ribeiro Nogueira, Gabriel Alves dos Santos, Gabrielle Reinoldes Bizarria Guilherme, Henrique de Souza Vieira, Juliana Ravelli Baldassare Martins, Juliane Campos Inácio, Leandro Garcia Alvarado, Luciana Jesuina Barbosa,Matheus Bertanha, Mariele Gobo de Oliveira,Ondina Silvia Cotrim,Paula Scatena,Regiane Marques Castro Olimpio, Renan Padron Almeida, Renato Colenci,Simone da Silva Ferreira, Wilson Rodrigo Alves Carvalho, Woner Mion. Ao Carlos Roberto Gonçalves Lima, Ednelson Henrique Bianchi e José Lucas de Carvalho, pela dedicação, disponibilidade e paciência em todas as coletas de bexiga e procedimentos histológicos realizados. À todos os colegas de pós-graduação pela companhia encontrada às sextas- feiras.Obrigada pelos momentos de descontração proporcionados, os quais tornaram nossas sextas em 2011 muito agradáveis. À Prof. Dra. Maria Aparecida Custódio Domingues do Departamento de Patologia pela atenção prestada na avaliação dos resultados e pelo pronto auxílio. À equipe do Departamento de Patologia, em especial: Claudiney Jurandir Figueira, Marcos Roberto Franchi e José Carlos Pedroso de Lima. À equipe do Departamento de Química e Bioquímica do IBB. Em especial, Profª Dra. Margarida Juri Saeki e Murillo Longo pela ajuda na primeira parte da produção da membrana de quitosana. À equipe da pós-graduação e aos funcionários da biblioteca, pela paciência em minhas inúmeras visitas durante a composição deste trabalho. Aos funcionários do Hemocentro: Cléo, Esmite, Rita e Parré. Sempre muito prestativos e solícitos.Em especial à Janice pela competência e eficiência. Às funcionárias responsáveis pela limpeza do hemocentro: Ednéia Aparecida Santos Inácio e Rosana Alves Alcantara. Aos professores da pós-graduação por compartilharem seu amplo conhecimento. Especialmente à Dra. Maria Inês Pardini pela oportunidade de participação no programa de pós- graduação em Pesquisa e Desenvolvimento; à Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto; ao Dr. Carlos R. Padovani; à Dra. Izolete Ap. Thomazini Santos; à Dra. Márjore de Assis Golim; à Dra. Valéria Alves da Silva. Aos meus pais, Felisberto Pedro da Silva e Teresinha de Moraes da Silva, os pilares de sustentação da minha vida. Exímios exemplos de honestidade, perseverança, determinação, caráter e generosidade. Dois seres humanos maravilhosos que sempre apoiam minhas decisões, por mais confusas e inconstantes que possam ser, por terem a certeza que obterei sucesso, sejam elas quais forem. Obrigada por sempre enfatizarem a importânica do estudo, do amor e da união, proporcionando as bases do meu desenvolvimento como pessoa e profissional.Obrigada pelo incessante, profundo e zeloso amor de vocês. Amo-os incondicionalmente. Aos meus irmãos, Raphael Eduardo e Júlia Renata. Sempre juntos, estou certa de que o elo que nos une é transcendental. E é isso que faz com que sejamos unidos, companheiros, amigos e irmãos. Amo vocês. Ao meu avô José e minhas avós Elvira e Maria, por serem um motivo a mais para eu acordar todos os dias e me sentir abençoada. Vocês são o espelho do que eu almejo ser em minha vida e do amor que eu vou demonstrar perante a família que construirei um dia, assim como vocês o fizeram comigo. O amor que sinto por vocês é profundo e infinito. À minha família por inteiro. A qual foi, é e sempre será responsável pelo meu caráter e virtudes. Agradeço aos meus tios Adão Fernando, Maurício, meu padrinho Ângelo José, às minhas tias Guida, Márcia, Vilma, Rosana, minha madrinha Hilda aos meus primos e primas; Ricardo André, Karla Júlia, Marcelo Eduardo, Rodrigo, Bruna Fernanda, Ana Carolina, Feliphi, Fernanda, Bárbara Elvira e Arthur Guilherme. Aos queridos Miguel, Rosângela e Victória, por serem considerados por mim parte integral da minha família, sempre presentes em minhas conquistas e, portanto, também tendo uma parcela de responsabilidade pelo que sou hoje. Obrigada, amo vocês. À Letícia, Renata, Daniel, César e Márcia, pelos momentos de descontração desfrutados juntos, e pela sempre agradável e indispensável companhia de vocês. Vocês também fazem parte da família. À minha segunda família, minha república, que deixará saudades por representar uma fase responsável por uma das experiências mais marcantes,intensas, inovadoras e desafiadoras da minha vida. Todos os momentos estarão guardados no meu coração. Amo cada um do seu jeito; em especial: Vanessa Nóbrega (Mixinga); Ana Carolina Saad (Prof); Mariana Acciaris (Pistolão); Tamara Haramita (Raitec); Natasha Castro (Flácida); Camila Lima (Moskete); Natália Hanna (Montana); Maria Júlia Ferreira (Joelminha); Gabriela Bertti (Premonição); Patrícia Bellete (Made-in), Pedro Bisson (Xú), Fernando Careli de Carvalho(Bongô), Eduardo Tachlitsky(Reservado),Stefanni Rico(Waka), Bruna Azevedo Belão(Susto),Beatriz Della Terra Garrido (Tchubi), Gabriela Daolio(Milka). Ao Pedro Ernesto Baseio. Obrigada por apoiar minhas decisões e acompanhá- las. Pela sua presença, pela sua amizade, conselhos, pela sua paciência comigo, compreensão e pelo seu amor. Seu coração é imenso. Muito obrigada por tudo meu amor. A todos os integrantes da minha querida bateria, pelos momentos imprescindíveis de descontração, união, alegria e música. À toda turma da Biomedicina XLIII Em especial: Denise Reis (Diarista); Mariana Nars (Massa); Marianna Bartelega (Kafa) e Martina Correa (Isva). Aos animais sacrificados para a realização deste trabalho. À todas as demais pessoas que me ajudaram de alguma maneira, direta ou indiretamente. Meu muito obrigado. “A vida só pode ser compreendida olhando-se para trás; mas só pode ser vivida olhando-se para frente.” Soren Kierkergaard Figura1: Aspecto histológico da bexiga corado com H&E. Em 1, células superficiais relaxadas. Em 2, epitélio de transição. Em 3, células basais. Em 4, capilares. Em 5, tecido de conexão.....................................................................................................................................28 Figura2: Os diferentes epitélios que, juntos, constituem o urotélio........................................29 Figura3: Tecido muscular liso de bexiga.................................................................................29 Figura4: Estrutura química da quitina e quitosana..................................................................32 Figura5: Fonte: Roman, P.et al, 2007 em Gobo-Oliveira, 2011. Em “A”, conteúdo intra- plaquetário. Em “B”, plaquetas inativas. Em “C”, ativação plaquetária ocorrida na adesão com formação de pseudópodes e liberação dos fatores de crescimento...........................................34 Figura6: Mecanismos de morte celular. Adaptado de Guilherme, G. R. B.; 2009..................36 Figura7: Vias de morte celular. Adaptado de Bertanha, 2011.................................................38 Figura8: Fonte www.celldeath.de , acessado em 15/01/12. Esquema geral de morte celular por apoptose (linha acima: a célula perde suas organelas e torna-se progressivamente picnótica) e necrose (linha abaixo: formação de poros na membrana que permitem a entrada de líquido de forma não controlada, aumento do volume celular, destruição das organelas intracelulares, desintegração da membrana celular).................................................................39 Figura9: Ilustração da exposição das PS. No lado esquerdo, na célula viável, a PS encontra-se na membrana citoplasmática interna. No lado direito, PS externalizadas para o lado externo da membrana, na célula em apoptose............................................................................................39 Figura10: Laboratório convencional ou standard (LAC)........................................................46 Figura11: Área Limpa – screening..........................................................................................46 Figura12: Área Limpa- Ambiente de Microscopia Figura Dissociação Mecânica da bexiga com cell scrapper......................................................................................................................46 Figura13: Área Limpa-Área de manipulação Estéril...............................................................46 Figura14: Dissociação Mecânica da bexiga com cell scrapper...............................................49 Figura15: Pellet de células da bexiga retiradas por dissociação mecânica..............................49 Figura16: Enzima Colagenase.................................................................................................50 Figura17:Etapas da dissociação enzimática: obtenção dos fragmentos de tecido e deposição em meio Hepes contendo enzima colagenase...........................................................................51 Figuras18 e 19: Quadrantes da câmara e câmara de Neubauer...............................................52 Figuras20 e 21: Na primeira, células de músculo liso em início de adesão. Aumento de 100x. Na segunda, células de músculo liso em confluência de 80%. Aumento de 100x. Ambas em contraste de fase ph1.................................................................................................................52 Figura22: Ampolas na caixa (gaveta) de criopreservação. Compõem o Banco de Células presente no LEC........................................................................................................................54 Figura23: Quitosana comercial - Chitosan from shrimp shells, practical grade ………….....55 Figura24: Etapas do preparo da membrana de quitosana – Departamento de Química e Bioquímica IBB Unesp.............................................................................................................56 Figura25: Quitosana líquida acrescida de hormônio plaquetário............................................57 Figura26: Em cima, membranas em fase de secagem e adição de Na OH. Embaixo, membrana pronta para uso........................................................................................................59 Figura27: Membranas esterilizadas pelo sistema Sterrad®.....................................................60 Figura28: Na esquerda, meio Agar Saboraud em placa de Petri. Na direita, “plaqueamento” de C. albicans sobre o meio de cultura.....................................................................................62 Figura29: Implante dos segmentos de membrana in vivo. Em “A”, incisões no dorso dos animais. Em “B”, marcação das membranas com fio azul. Em “C”e “D”, implante das membranas nos segmentos. Em “E”, sutura. Em “F”, cirurgia finalizada................................70 Figura30: Procedimento cirúrgico piloto do implante de membrana in vivo...........................71 Figura31: Na esquerda, células em início de adesão. Aumento de 100x. Na direita, células em confluência de 80% após alguns dias de cultura. Aumento de 100x........................................75 Figura32: Células de músculo liso em terceira passagem. Aumento de 100x.........................75 Figura33: Resultado da CF para células expressando CD90 em sua superfície. Animais 1 e 2.................................................................................................................................................77 Figura34: Resultado da CF para células expressando CD90 em sua superfície. Animais 3 e 4.................................................................................................................................................78 Figura35: Resultado da CF para células expressando CD90 em sua superfície. Animal 5.................................................................................................................................................79 Figura36: Células não marcadas representam o controle negativo. Aumento de 50 e 100x, respectivamente.........................................................................................................................80 Figura37: Células marcadas em marrom confirmam o fenótipo de músculo liso. Na esquerda, células marcadas com o anticorpo HHF35. Na direita, células marcadas com o anticorpo HDIC 1 a 4.Aumento de 50 e 100x, respectivamente...............................................................80 Figura38: Células marcadas em marrom confirmam o fenótipo de músculo liso. Células marcadas com o Alpha-Smooth Muscle Actin (alpha-SMA) Antibody Aumento de 200x........81 Figura39: Halos de inibição de crescimento de C. albicans após 48h de incubação...............83 Figura40:Adesão celular ao scaffold, sem fator promotor da adesão. Filtros usados: Em verde, FITC 200X. Em azul, DAPI 200X. Em vermelho, TxRed 200X..................................85 Figura41: Adesão celular ao scaffold, com fator promotor da adesão. Filtros usados: Em verde, FITC 200X. Em azul, DAPI 200X. Em vermelho, TxRed 200X..................................85 Figura42: Resultado da citometria de fluxo utilizando Anti-Caspase-3..................................86 Figura43: Resultado da citometria de fluxo para o teste de Anexina/PI: controles negativos...................................................................................................................................88 Figura44: Resultado da CF para o teste de Anexina/PI: subgrupo “Quitosana 3%”...............89 Figura45: Resultado da CF para o teste de Anexina/PI: subgrupo “Quitosana 4%”..............90 Figura46: Resultado da CF para o teste de Anexina/PI: subgrupo “Quitosana Dopada 3%”............................................................................................................................................91 Figura47: Resultado da CF para o teste de Anexina/PI: subgrupo “Quitosana Dopada 4%”............................................................................................................................................92 Figura48: Resultado da CF para o teste de Anexina/PI: subgrupo “Quitosana 4% em maior concentração (20g de quitosana/1L de ácido)”.........................................................................93 Figura49: Resultado da CF para o teste de Anexina/PI: subgrupo “Quitosana Dopada 4% em maior concentração” (20g de quitosana/1L de ácido)”.............................................................94 Figura50: Processo inflamatório pós – operatório...................................................................95 Figura51: Implante dorsal da membrana, in vivo. Na esquerda, implante após sete dias no coelho1. Na direita, implante após sete dias no coelho2..........................................................95 Figura52: Implante dorsal da membrana, in vivo após 14 dias. Na esquerda, coelho 1. Na direita, coelho2..........................................................................................................................96 Figura53: Implante dorsal da membrana, in vivo após 21 dias. Na esquerda, coelho 1. Na direita, coelho 2 com formação de abscesso do lado esquerdo do implante.............................96 Figura54: Resultados histologia coelho 1.Coloração H&E.Aumento 100X...........................98 Figura55: Resultados histologia coelho 2. Coloração H&E.Aumento 100X..........................99 Figura56: Piloto do implante in vivo do segmento de membrana em bexiga. Aspecto macroscópico..........................................................................................................................102 Figura57: Resultado histologia piloto implante in vivo: Bexiga. Em “A”, membrana de quitosana ao meio.Aumento de 100x. Em “B”, aumento de 50x.Coloração H&E.................103 Figura58:Etapas de construção do modelo envolvendo os princípios da Terapia celular propriamente dita....................................................................................................................113 Tabela1: Fatores de crescimento liberados pelas plaquetas.Gobo-Oliveira, 2011. Modificado................................................................................................................................34 Tabela2: “Publicações sobre “Ampliação Vesical”, “Engenharia Tecidual em Bexiga” e Engenharia Tecidual, Bexiga e Quitosana” na base de dados Pubmed, outubro 2011.............40 Tabela3: Publicações sobre “Ampliação Vesical”, “Engenharia Tecidual em Bexiga” e “Engenharia Tecidual, Bexiga e Quitosana” na base de dados Scopus, outubro, 2011............41 Tabela4: Grupos estudados e suas características....................................................................58 Tabela5: Nomenclatura implante dorso...................................................................................69 Tabela6: Resultado do ensaio antimicrobiano em laboratório.................................................82 Tabela7: Resultado do ensaio antimicrobiano ambiental.........................................................83 Tabela8: Respostas da detecção da exposição das FS por citometria de fluxo usando Anexina-V e PI. Adaptado de Guilherme, G. 2006..................................................................87 Tabela9: Avaliação histomorfológica das amostras in vivo...................................................100 Gráfico1: Resultados referentes à apoptose induzida pela via das caspases nos testes em “Quitosana pura” e “Quitosana contendo solução de glutaraldeído 0,25%”.Os resultados são expressos em média ± desvio-padrão......................................................................................104 Gráfico2: Resultados referentes à necrose celular, expressa pelo PI, quando em contato com as membranas dos subgrupos elencados no estudo. Os resultados são expressos em média ± desvio-padrão.........................................................................................................................105 Gráfico3: Resultados referentes à viabilidade celular quando em contato com a membrana de quitosana, a partir do teste de AnexinaV/PI. Os resultados são expressos em média ± desvio- padrão......................................................................................................................................106 Gráfico4: Resultados referentes à apoptose celular induzida quando em contato com as membranas pertencentes aos seis subgrupos elencados. Os resultados são expressos em média ± desvio-padrão......................................................................................................................107 Gráfico5: Resultados provenientes do cruzamento entre as três variáveis: necrose, células viáveis e apoptose. Os resultados são expressos em média ± desvio-padrão.........................108 ITU- Infecções do Trato Urinário H&E- Hematoxilina e Eosina ET- Engenharia de Tecidos GA- Grau Médio de Acetilação EGF- Fator de crescimento epidérmico PDGF- Fator de crescimento derivado de plaquetas FGF- Fator de crescimento de fibroblasto TGF-β1- Fator de crescimento transformador beta IGF-1- Insulin-Like Growth Factor-1 LEC- Laboratório de Engenharia Celular ELISA- Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay FISH- Fluorescence in situ Hybridization DNA- Desoxinucleic Acid PS- Fosfatidilserinas PI- Iodeto de Propídio CF- Citometria de Fluxo OMS- Organização Mundial da Saúde UNESP- Universidade Estadual Paulista IBB- Instituto de Biociências de Botucatu FMB- Faculdade de Medicina de Botucatu FAPESP-Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo CNPq- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico BNDES- Banco Nacional do Desenvolvimento FINEP- Financiadora de estudos e projetos FNS- Fundo Nacional de Saúde LAC- Laboratório de Atividades Complementares HEPA- High-Efficiency Particulate Air EPIs- Equipamentos de Proteção individual COBEA- Colégio Brasileiro de Experimentação Animal PVPI- Polivinilpirrolidona-iodo HEPES- Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid EC- Engenharia Celular PBS- Phosfate-Buffered Saline POP- Procedimento Operacional Padrão MC- Meio de Cultura DMEM F12- Dulbecco’s Modified Minimal Essential Médium SFB- Soro Fetal Bovino CO2- Dióxido de Carbono EDTA- Ethylenediamine tetraacetic acid DMSO- Dimetilsulfóxido Anti-CD90- Anti-rat cross reacting with rabbit ICQ- Imunocitoquímica GD- Grau de desacetilação kDa- Kilo Daltons PM- Peso Molecular Na OH- Hidróxido de Sódio pg/dl- picogramas/ decilitro H2O2- Peróxido de Hidrogênio CTM- Célula-Tronco Mesenquimal NK- Natural Killer Utilização de técnicas de Engenharia de Tecidos para validação do uso do scaffold de quitosana em ampliação vesical de coelhos Introdução: Levando-se em consideração avanços tecnológicos na área médica, a engenharia de tecidos (ET) surgiu como um capítulo do livro da Medicina Regenerativa a qual se caracteriza pelo desenvolvimento e manipulação de moléculas, células, tecidos, ou órgãos, desenvolvidos em laboratório, para apoiar ou substituir a função de partes do corpo defeituosas ou danificadas. Dentre os principais desafios está a abordagem dos chamados biomateriais ou scaffolds, que atuam como substratos adesivos para as células implantadas, propiciando suporte físico tridimensional e auxílio no crescimento de um tecido organizado, como é o caso do polímero constituído de quitosana. A quitosana é um polissacarídeo derivado da quitina, o qual apresenta propriedades inerentes dos biomateriais, sendo aqui apresentado sob a forma de membrana. Assim, foram aliadas técnicas derivadas da biotecnologia para a viabilização do uso desse biomaterial, in vivo, à demanda existente por alternativas visando restabelecer as funções vesicais para então,posteriormente, se constituir a materialização da Ampliação vesical. Objetivos: 1) Propor o interfaceamento das áreas de urologia e de Engenharia de Tecidos visando à aplicabilidade do scaffold de quitosana em bexiga. 2) Padronizar critérios necessários para o devido emprego da membrana in vivo. Material e Métodos: Foram produzidos dois grupos de membranas divididos em três subgrupos cada, elencados em função da concentração de ácido usado para diluição do polímero, quantidade de quitosana em gramas e acréscimo ou não de fatores de crescimento de plaquetas, sendo os subgrupos diferenciados pela denominação “Membranas não Dopadas” e “Dopadas”. Amostras de células de tecido muscular liso de bexiga foram retiradas de coelhos e submetidas a testes de caracterização por imunocitoquímica (ICQ) e citometria de fluxo (CF) para posterior implante nos scaffolds. Em relação às membranas, foi proposta a padronização dessas, com diferentes composições, esterilização pelo método Sterrad®, realização de ensaios de adesão, de citotoxicidade celular com kit de Caspase-3 e Anexina-V/ Iodeto de Propídio (PI) por CF, de atividade antimicrobiana, atividade antifúngica, de avaliação da toxicidade residual ao organismo, piloto do implante na bexiga, in vivo, e análise estatística dos dados pelo programa Graphpad Instat®. Resultados e Discussão: Foi possível padronizar a produção dos seis subgrupos distintos de membrana. O fenótipo de músculo liso foi confirmado pelas caracterizações por ICQ e CF. Os ensaios de adesão mostraram a união celular junto ao scaffold com e sem fator promotor de adesão, validando a característica de adesividade da membrana. De forma geral, foi confirmada a ausência de citotoxicidade, necrose e apoptose celular induzida pela exposição às membranas pelos testes de Anexina- V/PI e Caspase-3, sendo apenas a amostra contendo solução de glutaraldeído 0,25% em sua composição considerada altamente tóxica. O estudo das atividades antimicrobianas e antifúngicas apresentou o obstáculo da ausência de uma metodologia pré-estabelecida específica para testes no polímero usado. No entanto, apresentou-se satisfatório. Já os ensaios realizados in vivo, a avaliação da toxicidade residual e piloto do implante em bexiga de coelho, mostraram um possível caráter imunogênico do polímero, tendo em vista uma importante resposta inflamatória observada. Conclusões: Os seis subgrupos de membranas estudados se apresentaram como uma alternativa eficaz para uso como biomaterial, in vitro, porém, observa-se a necessidade de um estudo aprofundado do potencial imunogênico dos polímeros para a posterior aplicação clínica desses, corroborando com os achados da literatura. Palavras-chave: Medicina regenerativa, Engenharia de tecidos, biomaterial, membrana de quitosana, ampliação vesical. Utilization of Tissue Engineering Techniques to validate the use of Chitosan scaffold in rabbit bladder augmentation Introduction: Due to medicine technological advances, tissue engineering (TE) has emerged as a Regenerative Medicine chapter, characterized by the development and manipulation of molecules, cells, tissues, and organs, cultivated in laboratory to support or replace body´s defective or damaged functions or parts. One of the main challenges is the approach of the biomaterials or scaffolds, responsible to guide and explore living tissue interactions between synthetic materials to optimize processes such as fixation, recognition, and colonization. As adhesive substrates for cells implanted; they provide tridimensional physical support assisting an organized tissue growth. Chitosan polymer is a polysaccharide derived from chitin that demonstrates inherent properties of biomaterials, presented here in a membrane form. Therefore, biotechnological techniques to validate the use of this biomaterial in vivo were allied to the demand for alternatives in order to restore bladder function, instigating bladder augmentation materialization. Objectives: 1) Propose to interface Urology and TE in order to apply the Chitosan scaffold in bladder. 2) Standardize necessary criteria for the proper membrane use in vivo. Material and Methods: Each one of the two groups of membranes produced was divided into three subgroups, listed according to the addition or not of Platelet Growth Factors. They were called “doped membranes” and “no doped membranes”, respectively. Rabbit´s bladder smooth muscle cells samples were removed and characterized by immunocytochemistry (ICC) and flow cytometry (FC) techniques for subsequent implant in the scaffolds. In relation to the membranes, it was proposed a standardized production of the different subgroups; sterilization by the Sterrad® method; adhesion test; evaluation of cellular cytotoxicity using Caspase-3- and Annexin V /Propidium iodide (PI) Kit for FC; antimicrobial and antifungal activity; in vivo evaluation of residual toxicity; in vivo bladder implant first trial; and statistical analysis by GraphpadInstat® software. Discussion and Results: It was possible to standardize six distinct membrane subgroups production. Smooth muscle phenotype was confirmed by ICC and FC characterizations. The adhesion assays showed cellular attachment to the scaffolds with and without adhesion promoting factor, validating the adhesive membrane characteristic. There were no cytotoxicity, necrosis and apoptosis after membrane exposure, however the sample containing glutaraldehyde 0.25% solution was considered highly toxic. The determination of the membrane´s antimicrobial/ antifungal properties was difficult to evaluate, since there was no pre-established method to test this specific polymer, however, they performed satisfactorily. Both, “in vivo evaluation of residual toxicity” and “in vivo bladder implant first trial” showed a possible polymer´s immunogenic feature characterized by an important inflammatory response. Conclusions: The six membrane subgroups studied were presented as an effective in vitro biomaterial. However, it is imperative to define the real immunogenic risks before this scaffold can be fully employed as a new tool in Regenerative Medicine. Key words: Regenerative Medicine, Tissue Engineering, Biomaterial, Chitosan membrane, Bladder Augmentation. Sumário I- Introdução.................................................................................................................................26 I.1-Aspectos Gerais.......................................................................................................26 I.2-Bexiga: Embriologia, Anatomia e Histologia.........................................................28 I.3-Engenharia Tecidual................................................................................................29 I.4-Biomaterial..............................................................................................................30 I.5-Quitosana.................................................................................................................31 I.6-Fatores de Crescimento das Plaquetas.....................................................................33 I.7-Vias de Morte Celular.............................................................................................36 I.8-Relevância do Tema................................................................................................40 II- Objetivos...................................................................................................................................43 II.1- Objetivo Geral.......................................................................................................43 II.2- Objetivos Específicos............................................................................................43 III- Material e Métodos...................................................................................................................45 III.1- Instalações............................................................................................................45 III.2- Animais................................................................................................................47 III.3- Técnicas de Engenharia de Tecidos.....................................................................47 III.4- Membrana de Quitosana......................................................................................55 III.5- Modelo de membrana celularizada......................................................................63 III.6- Modelo in vivo.....................................................................................................68 III.7-Análise estatística.................................................................................................72 IV- Resultados e Discussão.............................................................................................................74 IV.1- Técnicas de Engenharia de Tecidos...................................................................74 IV.2- Membrana de Quitosana......................................................................................82 IV.3- Modelo de membrana celularizada......................................................................84 IV.4- Modelo in vivo.....................................................................................................95 IV.5- Análise estatística..............................................................................................104 V- Conclusões..............................................................................................................................110 VI- Perspectivas.............................................................................................................................112 VII- Referências...........................................................................................................................115 Anexos 26 I. Introdução I.1- Aspectos Gerais A bexiga é o órgão responsável pelo armazenamento de urina sob baixas pressões, sendo que a função vesical encontra-se adequada quando os períodos de armazenamento e esvaziamento do trato urinário inferior estão preservados. Para que o reservatório vesical esteja em condições ideais, este deve manter-se com adequada complacência e ser facilmente esvaziado1. Várias patologias adquiridas ou congênitas, malignas ou benignas, promovem alterações funcionais e ou anatômicas, que se tornam empecilhos ou impossibilitam a função de reservatório da bexiga. Tais alterações podem levar à redução da capacidade vesical, elevação de sua pressão e, como conseqüência, do trato urinário superior, resultando em perda de função2. Os pacientes com baixa capacidade e complacência vesical ou com elevadas pressões de micção podem ser, inicialmente, submetidos ao tratamento clínico. Nesse caso, o cateterismo intermitente limpo associado à terapêutica farmacológica seria uma alternativa para o controle adequado da pressão, da preservação da função renal e a melhora da continência 3. No entanto, nos casos em que terapias conservadoras não são efetivas são recomendadas alternativas terapêuticas como a ampliação vesical ou derivação urinária. A ampliação vesical objetiva o desenvolvimento de um reservatório com capacidade adequada, baixa pressão de enchimento, que não promova alterações hidroeletrolíticas, apresente mínima morbidade operatória e capacidade de esvaziamento completo sem resíduos4. A ampliação vesical tem como funções: preservar o rim, adquirir continência urinária, impedir infecções do trato urinário (ITU) e promover um esvaziamento vesical voluntário e completo. Quando esse órgão possui pouca capacidade de armazenamento em seu interior, a urina desce dos rins e fica presa , aumentando a pressão nos ureteres: canais que transportam a urina produzida nos rins para a bexiga. Portanto, quando a urina cai na bexiga e tem pouco espaço para preencher, ela fica acumulada nos ureteres e até mesmo nos rins, aumentando a pressão e causando dor. Essa pressão de urina pode causar lesões sérias e irreversíveis ao rim, originando a insuficiência renal e até mesmo sendo necessário a hemodiálise ou o transplante renal5. Logo, a cirurgia para aumento da capacidade da bexiga torna-se muito importante para os doentes que perderam a função de armazenamento adequado de urina. A cirurgia também tem a função de aumentar a auto-estima dos pacientes que possuem incontinência urinária, além da função de evitar danos maiores ao nosso corpo. Isto porque após a cirurgia, esse 27 paciente será capaz de conseguir segurar por maior tempo a urina e, muitas vezes, não precisará do uso de fraldas e poderá freqüentar lugares que antes ele evitava como shopping ou parques. Portanto, essa cirurgia torna-se muito importante para a inclusão social. Podemos então perceber que os benefícios desse tipo de vertente cirúrgica são diversos, quando indicada para o caso específico de cada paciente pelo seu urologista 5. A enterocistoplastia, no momento, é o único método largamente utilizado na prática médica, para ampliação vesical. A primeira enterocistoplastia de aumento, ou ampliação vesical, foi realizada no homem, em 1889 por Von Mikulicz. Até a década de 80 do século XX esta cirurgia era realizada muito raramente e essencialmente no tratamento de bexigas acometidas pela tuberculose. A partir de então, esta técnica vulgarizou-se no tratamento de muitas doenças da bexiga, e para tal, contribuiu em maior conhecimento da patofisiologia (funcionamento) do aparelho urinário, para o desenvolvimento de diversas outras técnicas úteis na urologia. Nesse método, segmentos gastrointestinais como íleo , colon e estômago, podem ser utilizados, por isso, o nome enterocistoplastia de aumento pode ser utilizado também, pois “entero” provém de intestino e “cisto” de bexiga. O termo “plastia” quer dizer reconstrução. Originalmente, as ampliações vesicais eram realizadas em doentes com bexigas de pequena capacidade. Outras indicações incluem cistite intersticial, cistite pós- quimioterapia, extrofia vesical e após múltiplas cirurgias vesicais, como em crianças com malformações ao nascimento. Mais recentemente, a ampliação vesical foi introduzida no tratamento da instabilidade do músculo da bexiga (bexiga neurogênica), com o objetivo de diminuir as contrações e aumentar a capacidade de armazenamento de urina da mesma 5. Muitas são as técnicas utilizadas pelos urologistas para essa cirurgia, gerando resultados e tendo funções diferentes. Entratanto, apesar do sucesso da técnica, esta pode levar a alterações diversas. Pode-se observar, agressão ao trato gastrointestinal, devido à ressecção de segmento, podendo levar a alterações hidroeletrolíticas (acidose hiperclorêmica) bem como alterações nutricionais no paciente, abscessos, aderências peritoniais, produção abundante de muco, fístula entérica, colonização bacteriana e até mesmo câncer 5. Cartwright e Snow (1989) propõem outras técnicas e procedimentos para a auto- ampliação vesical. Realizando a excisão parcial do músculo detrusor da cúpula vesical, permanecendo a mucosa vesical intacta. Esta técnica formaria uma proposta de grande divertículo, propiciando um reservatório com boa capacidade e baixa pressão 2. A enterocistoplastia é uma cirurgia invasiva, de grande porte. A literatura médica aponta uma mortalidade de 0 a 2%, com complicações médicas pós-operatórias em torno de 28 5% dos casos. Porém, o sucesso dessa cirurgia variou entre 58 a 95%, segundo questionários aplicados aos próprios pacientes submetidos a ela. Logo, podemos notar que os benefícios da ampliação vesical são muitos, sendo pequena a quantidade de complicações associadas a esse procedimento5. I.2 Bexiga: Embriologia, Anatomia e Histologia A bexiga deriva do seio urogenital e do Mesênquima Esplâncnico adjacente. 6 Macroscopicamente, é um órgão oco o qual tem a função de servir como reservatório para a urina. No indivíduo adulto possui a capacidade de 350 a 450 ml. Quando vazia, fica localizada atrás da sínfise pubiana e é um órgão pélvico em grande parte. Quando cheia, eleva-se acima da sínfise e pode ser facilmente palpada. 7 Histologicamente é composta por quatro túnicas: serosa, submucosa, mucosa e muscular. Apresenta ainda, um tecido epitelial especial, internamente: o urotélio ou epitélio de transição especializado, o qual atapeta a superfície interna da bexiga e vias urinárias, parte da uretra e reveste a pelve renal. A mucosa dos ureteres e da bexiga é constituída por uma lâmina própria de tecido conjuntivo frouxo e epitélio de transição. 8 (Figuras 1,2). Figura 1: Aspecto histológico da bexiga corado com H&E. Em 1, células superficiais relaxadas. Em 2, epitélio de transição. Em 3, células basais. Em 4, capilares. Em 5, tecido de conexão. Sob o epitélio, há uma camada submucosa bem desenvolvida formada de tecido conjuntivo e elástico. O músculo detrusor, apresenta-se externamente à submucosa, e é constituído de uma mistura de fibras musculares lisas (Figura 3) dispostas ao acaso em sentido longitudinal, espiral e circular, sem nenhuma orientação específica ou formação de camada, exceto próximo ao meato interno, onde o músculo detrusor forma camadas distintas: longitudinal interna, circular média e longitudinal externa. 7 1 2 3 4 5 Fonte: Adaptado de: HTTP://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/ corepages/epithelia/images/blad042he.jpg Acessado em26/01/10. 29 Figura 2: Os diferentes epitélios que, juntos, constituem o urotélio. Figura 3: Tecido muscular liso de bexiga. I.3 Engenharia Tecidual A Engenharia de Tecidos (ET) é apenas um capítulo do vasto livro da Medicina Regenerativa a qual se caracteriza pelo desenvolvimento e manipulação de moléculas, de células, de tecidos, ou órgãos desenvolvidos em laboratório para apoiar ou substituir a função de partes do corpo defeituosas ou danificadas. Embora o cultivo de células ex-vivo vem sendo realizado há muitos anos, a real possibilidade de crescimento de tecidos tridimensionais complexos, reproduzindo literalmente o design e função desses, é um desenvolvimento considerado recente. Pesquisadores têm trabalhado por décadas no cultivo de células e tecidos fora do organismo humano para a geração de tecidos do próprio paciente em quantidade e qualidade necessárias para a terapêutica7. Desde meados da década de 80, a engenharia celular é considerada um campo de pesquisa independente com uma cooperação interdisciplinar entre os especialistas9. A ET visa o cultivo de todo tipo de tecido ex vivo. No caso de tecidos humanos, esta inclui o fígado, músculos, ossos, cartilagem, músculos do coração, nervos, vasos sanguíneos, ilhotas de pâncreas, e mais. Os princípios da ET englobam a retirada de um número mínimo de células do paciente, por técnica de biópsia; expansão celular em laboratório; implantação das células no biomaterial desejado, ou ainda, na presença de fatores de crescimento e diferenciação. As células que estiverem providas com as condições e sinais adequados para sua viabilidade irão secretar determinados componentes de matriz extracelular para criar, de fato, um tecido vivo que pode ser então usado como tecido substituto a ser reimplantado no sítio defeituoso do paciente10. Fonte:http://magicnumbers- parussolo.blogspot.com/2011/06/siste ma-urinario.html acesso em: 10 novembro de 2011. Fonte:http://bloganatomiahumana.blog spot.com acesso em: 17 novembro de 2011. 30 I. 4 Biomaterial O homem busca cada vez mais por melhorias na qualidade de vida com foco em possível aumento da longevidade. Esta busca instiga o desenvolvimento de alternativas para o reparo e substituição de tecidos vivos, sejam eles vitimados por lesões, traumas ou patologias. Nesta ótica, a possibilidade de introdução de materiais sintéticos no corpo, os biomateriais, aparece como uma opção pertinente. O desafio dos biomateriais se resume fundamentalmente na necessidade de explorar e guiar interações entre tecidos vivos e materiais sintéticos visando otimizar processos tais como biofixação, bioreconhecimento e biocolonização. Os scaffolds biodegradáveis são utilizados na engenharia de tecidos como substratos adesivos para as células implantadas, proporcionando suporte físico e auxiliando o crescimento dessas células, constituindo um tecido organizado. Além do mais, o scaffold ideal deve-se apresentar biologicamente compatível às células semeadas e ter uma força biomecânica suficiente11. O sucesso de trabalhos desenvolvidos com biomateriais não só viabiliza a fixação do dispositivo no local de implantação, mas também permite a manipulação de mecanismos intracelulares responsáveis pela reprodução celular, produção e distribuição de fatores de crescimento e de mediadores de respostas imunológicas e inflamatórias os quais são indispensáveis ao favorecimento e à regeneração do tecido anfitrião12, englobando não apenas o desenvolvimento de compostos a serem utilizados como substitutos de tecidos lesados, mas também o entendimento das interações destes com o organismo receptor sendo, portanto, biocompatíveis e funcionais 13. Apresentar propriedades físicas e biológicas compatíveis com os tecidos vivos hospedeiros, de modo a estimular uma resposta adequada dos mesmos, caracteriza a biocompatibilidade. Os materiais sintéticos utilizados para estes fins podem ser produtos metálicos, poliméricos sintéticos ou naturais, compósitos, cerâmicas, destacando-se o colágeno purificado, as fibras protéicas, os polissacarídeos e os tecidos tratados 14. Tais polímeros podem ainda ser classificados como bioestáveis ou permanentes e bioabsorvíveis ou temporários. Os bioestáveis são materiais utilizados na substituição, por tempo indeterminado, de um tecido lesado, devendo possuir, portanto, características mecânicas e físico-químicas compatíveis com tal função. Os materiais bioabsorvíveis são aqueles degradados tanto in vitro quanto in vivo sendo, portanto, utilizados como dispositivos temporários15 como é o caso da quitosana. 31 Na ampliação vesical, os suportes biológicos, fabricados a partir de materiais sintéticos como o plástico, foram utilizados sem sucesso. Mais recentemente, tem sido testada matriz vesical acelular em animais experimentais revelando resultados promissores, evidenciando que células autólogas combinadas com biomateriais apropriados podem fornecer, no futuro, soluções funcionais e bem-sucedidas para sérios distúrbios clínicos16. I. 5 Quitosana A quitosana é um polissacarídeo derivado da quitina, biopolímero presente nas carapaças dos crustáceos, nos exoesqueletos dos insetos e nas paredes celulares de fungos 17. Apresentam em maior proporção, na cadeia polimérica, unidades de β – (1-4) – 2 – desóxi – D – glicose e, um menor número de unidades de β – (1-4) – 2 – acetamido – 2 – desóxi - D – glicose da quitina, caracterizando-a como um copolímero composto por unidades repetidas de quitosana e quitina alternadamente18. Depois da celulose, a quitina é o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza, sendo o composto principal presente no exoesqueleto de crustáceos e insetos; sua presença ocorre também em nematóides e parede celular de fungos e leveduras19. A quitosana pode ser obtida a partir da quitina por meio da desacetilação com ácido acético, estando naturalmente presente também em alguns fungos, como os pertencentes aos gêneros Mucor e Zygomicetes20. De acordo com o grau médio de acetilação (GA), parâmetro empregado para caracterizar o conteúdo médio de unidades N-acetil-D-glicosamina de quitina e quitosana, pode-se obter diversas quitosanas variando-se, assim, suas propriedades físico-químicas, como solubilidade, pka e viscosidade21. A quitosana com elevado grau de desacetilação é de difícil obtenção, pois, à medida que este aumenta a possibilidade de degradação do polímero também aumenta22. A Figura 4 representa as estruturas químicas da quitina e quitosana. 32 Figura 4: Estrutura química da quitina e quitosana. O emprego de quitina e quitosana e a pesquisa por novas aplicações tem aumentado exponencialmente em diversas áreas, como na agricultura e indústrias de alimentos, mas especialmente, na indústria farmacêutica, no desenvolvimento de cosméticos e biomateriais, tais como géis, filmes e membranas poliméricas 23. A quitosana possui grande aplicabilidade no campo da engenharia biomédica e de biomateriais, devido à sua habilidade em acelerar a cicatrização de lesões cutâneas. Apresenta propriedades favoráveis de biocompatibilidade e bioatividade. Alguns estudos indicam propriedades antimicrobianas (bactericida, bacteriostática, fungicida e fungistática). Seus metabólitos residuais também são atóxicos tornando-a, um material de grande potencial de aplicação na área médica-farmacêutica24. Experimentos utilizando aplicações tópicas de quitosana através de pomadas e bandagens mostraram que este biopolímero promove uma rápida cicatrização de ferimentos e abscessos infectados por Staphylococcus. Tais aplicações diminuíram o tempo de coagulação, que é de fundamental importância na cicatrização de ferimentos ou em procedimentos cirúrgicos25. Contudo, mesmo com a intensa pesquisa na área de biomateriais, nota-se a existência de poucos trabalhos na literatura científica, enfocando a produção de membranas, contendo simultaneamente quitina e quitosana (assim como outros agentes ativos em sua composição). São poucas as informações detalhadas sobre as condições para a obtenção e utilização destas membranas, os fatores que influenciam nas características físicas, químicas, mecânicas e biológicas destes materiais, resultados comparativos entre as características de membranas densas e porosas bem como da padronização nos métodos de caracterização destes biomateriais. Diante da escassez destas informações, este trabalho objetiva o Fonte: http://cvnaturplas.dnsalias.com/materi ais-naturais/polimeros-biodegradaveis- de-origem-natural/principais- aplicacoes-de-polimeros- Acesso em 18/11/2011. 33 interfaciamento das áreas de urologia e de engenharia de tecidos visando a aplicabilidade do biomaterial ou scaffold de quitosana em bexiga. 1.6 Fatores de Crescimento das plaquetas As plaquetas são fragmentos anucleados formados a partir da fragmentação de longas e finas protrusões do citoplasma de megacariócitos. Possuem a forma discóide e, quando ativadas, modificam para pseudópode. No ser humano saudável, há entre 150.000 a 400.000 plaquetas/mm3 de sangue, agindo na hemostasia através da adesão, secreção, agregação e atividade prócoagulante e também estão envolvidas na resposta imune, na cicatrização tecidual e nas metástases por via hematogênica. 26 Seu diâmetro é de 1,5 a 3,0µm e o seu tempo médio de vida é de cinco dias, sendo depois desse período destruída no baço. Em seu citoplasma há inúmeras proteínas de grande relevância clínica, sendo a plaqueta dividida estruturalmente em: 1-Zona periférica, 2- Zona sol gel, 3- Zona das organelas. Possui 3 tipos de grânulos: lisossomas, grânulos densos e os grânulos α, onde se encontram os fatores ou moduladores do crescimento 27,28 (Figura 5). 34 Figura 5: Fonte: Roman, P.et al, 2007 em Gobo-Oliveira, 2011. Em “A”, conteúdo intra-plaquetário. Em “B”, plaquetas inativas. Em “C”, ativação plaquetária ocorrida na adesão com formação de pseudópodes e liberação dos fatores de crescimento. Os fatores de crescimento são polipeptídeos que estimulam a proliferação celular. Atuam como reguladores e desreguladores da atividade celular, enzimas, fatores angiogênicos e anti-angiogênicos indutores de expressão gênica, entre outras atividades, como o aumento rápido do número de células-tronco e a promoção de sua atividade durante a agressão aos tecidos. Diversos fatores de crescimento têm sido relatados como participantes do processo de reparação tecidual, incluindo o EGF, PDGF, FGF, TGF-β1 e IGF-1.29,30 A tabela1 a seguir evidencia alguns dos mais expressivos fatores de crescimento liberados pelas plaquetas. Tabela 1: Fatores de crescimento liberados pelas plaquetas. Fonte: Gobo-Oliveira, M. 2011. Modificado. Os PDGF atuam aumentando as quantidades de colágeno, a vascularização tecidual, promovem a proliferação de fibroblastos e estimulam produção de tecido de granulação. O FATORES DE CRESCIMENTO PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas EGF Fator de crescimento epidérmico VEGF Fator de crescimento celular endotelial vascular TGF-β Fator de crescimento transformador beta C C A B C 35 EGF induz o crescimento de tecido epitelial e promove também a angiogênese. O VEGF estimula a angiogênese, a permeabilidade vascular e a mitogênese. O TGF-β é uma proteína envolvida no controle e diferenciação celular apresentando três isoformas bem conhecidas: TGF-�1, TGF-�2 e TGF-�3. Atua em processos imunes, nas fases iniciais da oncogênese, no controle da apoptose entre outras ações. É um fator estimulante da produção de fibrinogênio estimulando a quimiotaxia fibroblástica, intensificando a produção de colágeno, proteoglicanos e fibronectina. Desta forma, estabiliza os vasos recém formados pela intensificação da produção de proteínas da Matriz Extra Celular (MEC). Portanto, esses fatores de crescimento tornam a cicatrização mais rápida e eficiente, favorecendo a integração de enxertos, a reparação tecidual e auxiliando na regeneração do tecido lesionado. 30, 31, 32, 33. Roback et al, 2008 34 publicam a indicação do uso tópico de plaquetas em áreas de reconstrução cirúrgica, pois o produto estimula a angiogênese e promove reparação tecidual mais rápida. Estudos já desenvolvidos pelo Laboratório de Engenharia Celular (LEC) do Hemocentro de Botucatu têm mantido uma linha de pesquisa com base na purificação dos hormônios derivados de plaquetas para a composição de uma matriz de gel laminar de uso tópico, a qual se evidencia o estímulo à e cicatrização. Além disso, os hormônios extraídos dos grânulos plaquetários são usados na constituição de um scaffold tridimensional para a incorporação de células. 35,36 Navarro, 2008 37 demonstra a relação entre a concentração de plaquetas humanas e fatores de crescimento como o PDGF e VEGF. Para concentrado de plaquetas com volume médio de 45-60 ml, concentração média de 5,5 X 10 10 plaquetas, pH entre 6,4 e 7,4 a concentração média de PDGF pelo método ELISA é 100 vezes maior que o VEGF (PDGF = 35.000pg/dl e o de VEGF de 350pg/dl). Levando-se em consideração as observações citadas e tendo em vista a inexistência de kits para a determinação de fatores de crescimento (PDGF e VEGF) específicos para coelhos; o já estabelecido mapeamento da homologia coelho-homem pela metodologia FISH, em trabalho publicado por Korstanje et al.38 e o fato da aplicação do produto para o coelho ocorrer em uma única vez, não havendo exposições repetitivas, optou-se pelo uso de plaquetas humanas neste protocolo de pesquisa. 36 Assim, unindo-se as propriedades observadas à membrana de quitosana e aquelas inerentes aos fatores de crescimento plaquetários ou “hormônios plaquetários”, a união dos dois elementos em uma membrana potencializaria as propriedades favoráveis ao reparo tecidual vesical, justificando o uso no presente estudo. I.7 Vias de morte celular O fenômeno da morte celular pode ser desencadeado por uma série de fatores ou injúrias tais como: danos de DNA, hipóxia tissular, agressão imunológica, infecciosa e tóxica, entre outros. A morte celular pode ser dividida em duas categorias: a programada, denominada fisiopatológica e a patológica (ou necrótica). A primeira é o tipo de morte onde a célula possui todo o aparato genético para a produção e/ou ativação e/ou inativação de proteínas específicas que geram uma sequência de eventos ininterruptos os quais levam a sua própria destruição. Essa pode ocorrer tanto em processos patológicos quanto em processos fisiológicos normais, sendo que pode ser dividida em três grandes grupos ou vias: morte autofágica, apoptose (dependente ou não de caspases) e outros mecanismos. A morte celular fisiopatológica do tipo autofágica (também definida como lisossomal ou “tipo II”) é sempre independente da via das caspases e caracterizada pela presença de lisossomos primários (os quais realizam a digestão de organelas e partículas intracelulares), autofagossomos e vacúolos autofágicos, nem sempre levando a morte celular. 39, 40, 41, 42,46 (Figura 6). Figura 6: Mecanismos de morte celular. Adaptado de Guilherme, G. R. B.; 2009. 37 A apoptose é a morte celular programada que possui mudanças morfológicas típicas, tais como: fragmentação nuclear, condensação da cromatina, exposição da fosfatidilserina pela membrana , perda de controle iônico, encolhimento do citoplasma, perda das organelas tornando a célula picnótica e formação de corpos apoptóticos. A ativação da via das caspases (proteínas efetoras) é observada na forma clássica, podendo a apoptose ser independente ou dependente dessas vias. Ainda sim, a apoptose dependente da via das caspases pode estar relacionada a meios extrínsecos (receptor se superfície celular) ou intrínsecos, relacionados aos mecanismos respiratórios mitocondriais (despolarização da mitocôndria) ou a mecanismos ligados ao retículo endoplasmático, não gerando resposta inflamatória. 39, 40, 41, 42, 43, 46. As caspases são proteases de cisteína que clivam substratos em um ponto específico, onde sempre há resíduos de ácido aspártico.47,48 Especificamente, a Caspase-3 é uma proteína de 32kDa que depois de clivada gera duas subunidades de 17kDa e 12kDa. É classificada como efetora da apoptose, ou seja, responsável pela clivagem proteolítica dos substratos chaves para a manutenção da sobrevivência celular. Além disso, está relacionada a modulação do sistema imune durante o desenvolvimento deste47. A morte celular fisiológica, ou seja, ocorrida por autofagia das células, determinada por alterações citoplasmáticas, posterior condensação da cromatina e diminuição do volume celular seguido da formação dos autofagossomos, 44, 45,46 pode ser medida tecnicamente de duas formas: A primeira seria a realização de testes de viabilidade e determinação da exposição das fosfatidilserinas (proteínas intrínsecas da parede interna da membrana as quais são externalizadas quando as células apresentam-se em apoptose independente da via das Caspases) 44,45,46. A segunda seria aquela em que são realizados testes mais complexos, os quais devem evidenciar o comprometimento dos receptores de morte, do retículo endoplasmático e da via respiratória mitocondrial, no caso da apoptose dependente da via das Caspases.Tal via de 38 apoptose pode ser identificada por testes de citometria de fluxo medindo a Caspase-3, que é uma protease chave ativada durante o estágio inicial da apoptose.44,45,46 (Figura 7). Figura 7:Vias de morte celular. Adaptado de Bertanha, 2011. O estudo da apoptose apresenta-se importante pois, tal fenômeno pode ser desencadeado por estímulos diversos, que podem estar presentes ou ausentes na cultura celular, como: toxinas, hormônios ou fatores tróficos, competição negativa entre células, etc. Assim, a análise de sua progressão pode contribuir para a devida correção da cultura, seja no que estiver em escassez ou excesso para as células. A segunda forma de morte celular, a patológica, é aquela que determina a necrose. Esta pode ser secundária à injúria celular, determinada pelos fatores citados anteriormente. (Figura 8). Tais modificações apresentam- se como parte de um programa de morte com regulação intracelular, que pode ser inibido ou ativado dependendo de estímulos, sejam esses fisiológicos ou patológicos. 43,46 39 Figura 8: Fonte www.celldeath.de, acessado em 15/01/12. Esquema geral de morte celular por apoptose (linha acima: a célula perde suas organelas e torna-se progressivamente picnótica) e necrose (linha abaixo: formação de poros na membrana que permitem a entrada de líquido de forma não controlada, aumento do volume celular, destruição das organelas intracelulares, desintegração da membrana celular). As anexinas são uma família de proteínas as quais se ligam a fosfolipídios aniônicos de superfície na presença de cálcio. Daí o significado do nome, que vem do grego, “trazer junto”. Elas possuem, ainda, uma região amino-terminal que varia de tamanho e sequência, o que se relaciona a propriedade de ligação aos diferentes substratos 49,50. As Anexinas possuem afinidade pelas fosfatidilserinas (PS), fosfolipídios que atuam como cofatores de variadas enzimas, e apresentam-se internalizadas na membrana citoplasmática. No entanto, existem casos específicos, de extrema importância, nos quais a exposição das FS ocorre, ou seja, são externalizadas. Seriam eles a ativação de pró- coagulantes e a presença de apoptose celular 51 (Figura 9). Célula Viável APOPTOSE NECROSE 40 Figura 9: Ilustração da exposição das PS. No lado esquerdo, na célula viável, a PS encontra-se na membrana citoplasmática interna. No lado direito, PS externalizadas para o lado externo da membrana, na célula em apoptose. Assim, a exposição das PS pela membrana plasmática das células durante a apoptose, seria outra maneira de avaliar a presença ou não da indução a apoptose celular, por vias independentes da via das caspases. Partindo-se do princípio que a Anexina-V tem alta especificidade pelas PS, um dos métodos mais confiáveis para a detecção da apoptose é a utilização da ANEXINA-V com o Iodeto de Propídio (PI) (ambos apresentam-se no mesmo kit), por CF. O uso conjugado da Anexina-V e do PI distingue a apoptose de necrose 45,49,50,52. I.8 Relevância do Tema As preocupações a cerca da reconstrução e ampliação vesical tem crescido no decorrer dos anos. Essa afirmação é justificada pela simples análise das publicações referentes à Ampliação Vesical (Bladder Augmentation) e Engenharia Tecidual em Bexiga (Bladder´s Tissue Engineering), apresentada no Pubmed. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Já os estudos relacionados à engenharia de tecidos, bexiga e Quitosana (Tissue Engineering, Bladder and Chitosan), apresentam escassas citações, constatando a necessidade do surgimento de um maior número de estudos sobre esse assunto especificadamente. A tabela 2 evidencia tais informações. Tabela 2: Publicações sobre “Ampliação Vesical”, “Engenharia Tecidual em Bexiga” e “Engenharia Tecidual, Bexiga e Quitosana”. Itens Buscados Citações encontradas Bladder Augmentation 1487 Bladder´s Tissue Engineering 486 Tissue Engineering, Bladder and Chitosan 4 Fonte: base de dados Pubmed, outubro 2011 A procura dos mesmos itens citados anteriormente em outra base de dados, o Scopus (http://www.scopus.com) mostrou o mesmo perfil demonstrado acima: Um número significante de estudos relacionados à “Ampliação Vesical” (Bladder Augmentation), uma porcentagem menor quando procurado o termo “Engenharia Tecidual em Bexiga” (Bladder´s 41 Tissue Engineering), e a mesma escassez de citações em relação ao termo “Engenharia de Tecidos, Bexiga e Quitosana” (Tissue Engineering, Bladder and Chitosan). A tabela 3 evidencia as informações. Tabela 3: Publicações sobre “Ampliação Vesical”, “Engenharia Tecidual em Bexiga” e “Engenharia Tecidual, Bexiga e Quitosana”. Itens Buscados Citações encontradas Bladder Augmentation 1834 Tissue Engineering Bladder 771 Tissue Engineering, Bladder and Chitosan 6 Fonte: base de dados Scopus, outubro, 2011. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), 17% da população economicamente ativa e até 30% da população mais idosa apresenta algum tipo de alteração vesical, sejam essas funcionais ou anatômicas53. Sendo assim, perante os dados expostos, a ET inclui-se no leque de ferramentas inovadoras disponíveis para o auxílio da resolução de problemas médicos difíceis de serem transponíveis com o uso das técnicas tradicionais. Entretanto, a existência de fatores limitantes como: a busca por estruturas tridimensionais artificiais ou homólogas as quais apresentem biocompatibilidade, ou seja, que favoreçam a adesão celular de células expandidas in vitro; ou que apresentem fatores de crescimento; propriedades antimicrobianas; baixos níveis de toxicidade; e que ainda assim compreendam um tempo satisfatório de produção em laboratório, evidenciam preocupações pertinentes. 42 II. Objetivos II.1 Objetivo Geral � Propor o interfaceamento das áreas de urologia e de Engenharia de Tecidos visando à aplicabilidade do scaffold de quitosana em bexiga. II.2 Objetivos Específicos Quanto às técnicas de engenharia de tecidos: � obter músculo liso da bexiga de coelhos; � cultivar células de músculo liso de bexiga de coelho, caracterizando-as por técnicas de Citometria de Fluxo e Imunocitoquímica; Quanto à membrana de quitosana: � desenvolver um modelo visando aplicabilidade em bexiga; � analisar Atividade Antimicrobiana e Antifúngica. Quanto ao modelo de membrana celularizada: � propor o modelo de membrana com células de músculo liso � avaliar adesividade � determinar a citotoxicidade quando em presença de células de músculo liso Quanto ao modelo in vivo: � piloto do implante da membrana em duas regiões anatômicas; � realizar avaliação histomorfológica dos implantes; 43 III. Material e Métodos III.1 Instalações Este trabalho foi realizado nos seguintes laboratórios da UNESP de Botucatu- Faculdade de Medicina de Botucatu: Laboratório Experimental de Cirurgia e Laboratório Experimental da Urologia, onde foram coletadas as amostras de tecido adiposo e bexiga dos animais; Laboratório de Citometria de Fluxo do Hemocentro, onde as células em estudo foram caracterizadas e analisadas, Instituto de Biociências de Botucatu: Laboratório de Química e Bioquímica, onde a primeira etapa da produção da Membrana de Quitosana foi realizada e Laboratório de Engenharia Celular (LEC) do Hemocentro da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), onde as demais etapas como processamento de tecidos, cultura celular e segunda etapa do preparo da membrana foram realizados. O LEC é apresentado detalhadamente a seguir: O LEC integra a seção de Biotecnologia do Hemocentro de Botucatu tendo iniciado suas atividades em dezembro de 1992. Ao longo deste período, graças às fontes de financiamento de pesquisas vigentes no país, em especial FAPESP, CNPq, BNDES, FINEP E FNS que foram entidades de suporte à pesquisa, as atividades tiveram um vertiginoso crescimento dando hoje vazão a três diferentes linhas de atuação. Tais linhas são: a) diferenciação de células-tronco de diferentes espécies, b) obtenção de anticorpos monoclonais murinos, c) produção de curativos bioativos com foco na terapêutica humana. Essas três linhas de pesquisa ocupam uma área correspondente a 1200m² classificados nas categorias: � Laboratório convencional ou standard – Laboratório de Atividades Complementares (LAC) onde são desenvolvidas tais atividades: viabilidade celular, contagem celular, técnica de ELISA, preparo de tampões, eletroforese de proteínas em gel de agarose ou poliacrilamida, purificação de proteínas pela técnica de cromatografia de afinidade, western blotting, imunodifusão (ouchterlony), imunofenotipagem, técnicas de hemaglutinação, entre outras (Figura 10). 44 � Área Limpa classificada 10.000. Essa área possui ar filtrado sob pressão positiva com filtros HEPA, apresenta vestiário específico com ducha na entrada e colocação de equipamentos de proteção individual (EPIs) de circulação interna para diferenciar de aventais de circulação convencional em corredores ou em outros laboratórios. Após a passagem pelo vestiário próprio encontra-se a área comum equipada e em funcionamento denominada de screening (Figura 11) que serve de ante-sala aos três laboratórios de cultura celular com ar filtrado individualizado (L1, L2 e L3). Em todos os laboratórios de cultura existem dois ambientes diferenciados: microscopia (Figura 12) seguida da área de manipulação estéril propriamente dita onde fundamentalmente encontram-se a capela de fluxo laminar Classe IIA e banho-maria além de insumos plásticos estéreis para cultura (Figura 13). No L1 são desenvolvidas atividades relacionadas à diferenciação de células-tronco; no L2 obtenção e caracterização de anticorpos monoclonais murinos e no L3 produção dos curativos bioativos. Figura 13: Área Limpa-Área de manipulação Estéril. Figura 10: Laboratório convencional ou standard (LAC). Figura 12: Área Limpa- Ambiente de Microscopia. Figura11: Área Limpa – screening Fotos: Arquivo Pessoal, 2010. 45 III.2 Animais Para a aplicação da ET em bexiga, foi proposta a utilização de coelhos considerando a experiência da equipe de cirurgia, know-how do bioterista e dimensões de tamanho médio da bexiga que permitiria menor gasto financeiro com insumos usados em cultura, acrescidos ao fato de que outras linhas de pesquisa com células-tronco são desenvolvidas pela equipe em coelhos. Assim, o estudo foi conduzido com modelo em coelhos da raça New Zealand, provenientes do Biotério Central da UNESP – Campus Botucatu. Sendo que os animais utilizados apresentavam peso superior a 2,5 e inferior a 4,0 Kg. A utilização desses animais foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal, previamente estabelecidos pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), como consta no protocolo 868- 2011. Os animais foram mantidos no Biotério da Cirurgia Experimental em gaiolas (um por gaiola) com dimensões de 55 X 55 X 55 cm. A temperatura ambiente foi mantida em torno de 20ºC. Eles receberam ração normal para coelhos (Nutricoelhos, Purina Nutrimentos Ltda.) água ad libitum durante todo o tempo do estudo, e foram mantidos sob os cuidados de técnicos especializados. Os animais utilizados para a etapa de retirada das bexigas foram coelhos de experimentos dos alunos da pós - graduação, com eutanásia previamente agendada e sem complicações ou empecilhos que pudessem interferir nessa pesquisa. Desta forma, nessa etapa, nenhum animal precisou ser sacrificado exclusivamente para a pesquisa. A obtenção das bexigas foi realizada no mesmo tempo anestésico com intuito de minimizar o estresse cirúrgico dos animais. Anestesia utilizada foi Cloridrato de Ketamina 35-50mg/Kg + Cloridrato de Xilazina 5-10mg/Kg de peso vivo administrada via intramuscular. III.3 Técnicas de Engenharia de Tecidos Esta etapa da pesquisa envolveu: obtenção da bexiga de coelho e cultivo de células de músculo liso de bexiga, caracterizando-as por técnicas de citometria de fluxo e imunocitoquímica; 46 III.3.1 Obtenção das bexigas A primeira etapa do trabalho consistiu na retirada da bexiga dos animais para posterior expansão das células de músculo liso desse órgão com a finalidade de se realizar testes de citotoxicidade, indução de apoptose e necrose quando em contato com a membrana de Quitosana. Para tanto, os animais foram colocados em decúbito dorsal com os membros imobilizados sendo realizada tricotomia da região abdominal e anti-sepsia com Povidine Iodine (PVPI, 10% iodo ativo, Made Care – produtos hospitalares Ltda.), utilizando-se campo oftálmico estéril para delimitar a região cirúrgica. A seguir, foi realizada a abertura da cavidade abdominal, por meio de laparotomia mediana, com 2,5cm de extensão, que se iniciou a 2,0cm do púbis. A incisão da pele foi realizada com bisturi e o músculo reto abdominal foi divulsionado, na linha média, abrindo- se, a seguir, o peritônio. O afastamento das bordas cirúrgicas permitiu a localização intracavitária da bexiga, que, após a liberação romba de tecido adiposo, aderido em sua porção lateral e medial, foi exteriorizada pela incisão. A seguir, foi realizada a cistectomia total da bexiga. O órgão foi então lavado com solução fisiológica para retirada do excesso de urina presente, e então colocado em recipiente estéril contendo meio de cultura HEPES, específico para transporte de tecidos. O material foi levado para o LEC para devido processamento. III.3.2 Isolamento das células musculares da bexiga A etapa levou em consideração a Engenharia Celular (EC) aplicada ao tecido vesical de coelhos. Após a remoção cirúrgica das bexigas, essas foram preservadas em 0,1M Phosfate-Buffered Saline (PBS), ph 7,2 suplementado com 1% de Gentamicina (Merck®), ou meio HEPES (Invitrogen™) com a mesma concentração de gentamicina para preservação da integridade do tecido durante o transporte deste. A amostra foi transferida para o LEC, onde foram feitos os procedimentos para o processamento do tecido em questão e a obtenção das células do tecido muscular liso. O processamento do órgão foi feito de acordo com as normas padronizadas nos Procedimentos Operacionais Padrão (POP) do LEC. Em relação ao processamento das bexigas, essas foram lavadas três vezes com solução fisiológica estéril e meio HEPES contendo 100µL de antibiótico e antimicótico (Invitrogen™) para cada 10 mL de MC. 47 Após essa etapa, a bexiga foi separada em dois fragmentos de mesmo tamanho para serem processadas as etapas seguintes: dissociação mecânica e enzimática. � Dissociação Mecânica das células do Músculo Liso A dissociação mecânica foi realizada com o auxílio de uma ferramenta de trabalho denominada cell scrapper (Figura 14). Atuando como uma forma de apoio em uma das mãos e realizando uma espécie de varredura das células na outra, o cell scrapper é responsável pela remoção das células do tecido de forma mecânica. Em seguida, o conteúdo celular desprendido foi aspirado com o auxílio de uma seringa e colocado em tubo Falcon BD® para centrifugação. Centrifugou-se o conteúdo a 1200rpm por 10 minutos, obtendo-se um pellet de células (conjunto de células sedimentadas no fundo do tubo). (Figura 15). O sobrenadante foi aspirado e o pellet homogeneizado em 1mL do meio de cultura DMEM F12 (Dulbecco’s Modified Minimal Essential Médium) Invitrogen™. Retirou-se alíquota de 30µL do pellet para realizar viabilidade e contagem celular em câmara de Neubauer. O restante do conteúdo celular presente no tubo foi semeado em cultura e as células foram mantidas em estufa de 37�C em uma atmosfera úmida controlada a 5% de CO2 e 95% de ar. � Dissociação Enzimática Figura 14: Dissociação Mecânica da bexiga com cell scrapper. Figura 15: Pellet de células da bexiga retiradas por dissociação mecânica. Fotos: Arquivo Pessoal, 2010 48 A dissociação enzimática é a técnica mais utilizada internacionalmente. Tem a finalidade de extrair células de um determinado tecido, com auxílio de uma solução de enzimas específica. No caso, foi utilizada a Colagenase® tipo II - Gibco® (Figura16), que realizou um debridamento químico decompondo as fibras de colágeno que sustentam o tecido, deixando as células em exposição55. Com o auxílio de pinça e tesoura estéreis foi realizada a retirada de pequenos fragmentos da camada superficial da bexiga. O material foi pesado e colocado em solução de meio HEPES e Colagenase® em tubo Falcon BD® (Figura 17). A proporção usada entre peso do tecido; HEPES e enzima foi de 1: 2: 4, respectivamente em gramas, mL e mg. Após a adição do tecido à solução contendo a enzima, todo o conteúdo foi mantido em estufa de 37�C em uma atmosfera úmida controlada a 5% de CO2 e 95% de ar, por 15 horas para a devida ação do produto. Fonte: http://www.biodee.net/ProductDetail acesso em 13 novembro 2011. Figura 16: Enzima Colagenase®. 49 Figura17: Etapas da dissociação enzimática: Em “A e B”, obtenção de tecido muscular liso. Em “C”, bexiga íntegra e fragmentos a serem trabalhados. Em “D”, fragmentos em meio de cultura. Fotos: Arquivo Pessoal, 2012 Decorridas 15 horas de atuação enzimática, essa foi desativada com a deposição de meio de cultura contendo Soro Fetal Bovino (SFB). O material contendo SFB foi centrifugado novamente a 1200rpm por 10 minutos para a remoção da enzima por completo. O conteúdo celular ao fundo do tubo foi homogeneizado em um 1 mL de meio de cultura e alíquota de 30 µL retirada para contagem e viabilidade celular em câmara de Neubauer. III.3.3 Contagem celular A contagem de determinado conteúdo celular em câmara de Neubauer, (Figuras 18 e 19) objetiva verificar a viabilidade celular e o número estimado de células/mL de meio de cultura (MC), para então se semear em cultura as mesmas em frascos de 25 ou 75 cm2 de superfície (Nunc®), dando seguimento à expansão da cultura de células em estudo. O MC utilizado no A B C D 50 presente estudo foi DMEM F12, suplementado com aminoácidos essenciais (Invitrogen™), aminoácidos não essenciais (Invitrogen™), antibiótico / antimicótico (Invitrogen™) e SFB (Invitrogen™)35. Figuras 18 e 19: Quadrantes da câmara e câmara de Neubauer. III.3.4 Cultura Celular As células permaneceram na Área Limpa em estufa a 37ºC, atmosfera úmida controlada a 5% de CO2 e 95% de ar (Thermo Class 100®) (Figuras 20 e 21). No monitoramento por microscopia invertida (microscópio Axiovert 200®, Zeiss™), ao apresentar confluência de 80 a 100%, as células foram destacadas dos frascos de cultura com 0,25% da enzima tripsina/1mm de EDTA (Invitrogen™). Após tripsinização foi realizada contagem em câmara de Neubauer e viabilidade celular. As células foram colocadas novamente em cultura em frascos de 75cm2(Nunc®). Quando necessário, após a terceira passagem em tripsina as células foram crio preservadas em Dimetilsulfóxido (DMSO) (LGC Biotecnology ™) 10% SFB, e colocadas em nitrogênio líquido a -196ºC 35. Figuras 20 e 21: Na primeira, células de músculo liso em início de adesão. Aumento de 100x. Na segunda, células de músculo liso em confluência de 80%. Aumento de 100x. Ambas em contraste de fase ph1. Fotos: Arquivo pessoal 2011 Fonte: http://www.molecularlab.it acesso em 19 dezembro 2011 51 III.3.5 Criopreservação do Tecido A Criopreservação é um processo de congelamento de células ou tecidos biológicos a temperaturas muito baixas para manter a integridade destes. Células em cultura, mantidas por longos períodos, podem apresentar alterações morfológicas e funcionais. Devidamente congeladas, as células podem ser preservadas por períodos maiores sem alteração em suas características e em sua viabilidade. O banco de células é uma espécie de estoque que contém células idênticas criopreservadas de uma mesma cultura original, que garante que o Laboratório tenha uma reserva reprodutível de células. Além disso, um estoque de células garante a minimização dos riscos de se perder uma cultura por acidentes como contaminações microbianas, ou possíveis falhas em equipamentos essenciais em cultura celular como as incubadoras de CO2. As células a serem congeladas devem estar livres de contaminação e com viabilidade acima de 90%. As condições ótimas de criopreservação diferem para cada tipo de linhagem celular e estas, devem ser tratadas com um agente crioprotetor para suportarem o processo de congelamento e descongelamento. O agente crioprotetor utilizado foi o DMSO (LGC Biotecnology ™), o qual age na permeabilidade da membrana plasmática, permitindo que a água saia do interior das células à medida que ocorre o resfriamento. Assim, este impede que os cristais de gelo formados em baixas temperaturas rompam a membrana celular e levem as células à morte55. No caso das células de músculo liso, após a dissociação mecânica e/ou enzimática da parede externa da bexiga, as células foram lavadas com meio HEPES e centrifugadas a 1200rpm por 10 minutos. Houve então a formação do pellet no fundo do tubo. Em seguida, as células foram ressuspendidas em SFB adicionado de 10% DMSO (v/v). A amostra foi homogeneizada, transferida para criotubo, devidamente identificado, e rapidamente armazenada à –80ºC. Após sete dias no freezer à –80ºC as ampolas contendo as células foram transferidas para containers de nitrogênio líquido. Assim, as ampolas congeladas foram registradas no Banco de Células do LEC para posterior utilização nas demais etapas do trabalho.(Figura 22) 52 Figura 22: Ampolas na caixa (gaveta) de criopreservação. Compõem o Banco de Células presente no LEC. Foto: Arquivo Pessoal 2010 III.3.6 Caracterizaçãopor citometria de fluxo A CF consiste numa técnica que avalia as características físico-químicas das células, individualmente, as quais são submetidas à passagem por um sistema fluido, sendo detectadas por sensores eletrônicos e ópticos. A caracterização das células foi realizada após a terceira passagem em cultura, sendo usado o anticorpo Anti-CD90(anti-rat cross reacting with rabbit) Biolegend®. A ausência no mercado de anticorpos específicos para o reconhecimento dos antígenos existentes nas células de coelhos, demandou a utilização de tal anticorpo. No entanto, o fabricante alega a reação cruzada com células de coelho. III.3.7 Caracterização por Imunocitoquímica Etapa realizada no Departamento de Patologia da FMB. A imunocitoquímica (ICQ) foi feita em células após terceira passagem em cultura, utilizando os anticorpos “HHF 35” ,“1 A 4” e. O protocolo utilizado para a realização da técnica de ICQ envolveu a recuperação antigênica com solução Trilogy (Cell Marque 920P) pelo método de calor em banho-maria por 20 minutos. Após este procedimento uma incubação com anticorpos primários (Anti- Human Muscle Actin, clone HHF35 – Dako – M0635 e Alpha-Smooth Muscle Actin (alpha- SMA) Antibody Sigma™para a confirmação do fenótipo célula de músculo liso por 18 horas em geladeira à 4oC, foi realizada. Posteriormente, nova incubação com anticorpo secundário (Anti-Mouse) e terciário (Amplificador). Utilizou-se kit de detecção por polímeros Hidef (Cell Marque 954D) por 10 minutos cada um, e posterior revelação com cromógeno 3,3- diaminobenzidina (Spring BGDAB-999). A contra-coloração foi realizada com Hematoxilina. Células tronco mesenquimais, isoladas de tecido adiposo de coelhos foram utilizadas como controle negativo. 53 III.4 Membrana de Quitosana III.4.1 Preparo da Quitosana: parte I A primeira dentre as duas partes da etapa de produção da Membrana de Quitosana foi realizada no Departamento de Química e Bioquímica do IBB. Foi utilizada Quitosana comercial da marca Sigma - Aldrich® - Chitosan from shrimp shells, practical grade com 50 KDa de peso molecular. (Figura 23) Figura 23: Quitosana comercial - Chitosan from shrimp shells, practical grade. Foto: Arquivo Pessoal 2011 A produção da Quitosana consistiu na desacetilação da mesma pela adição de ácido acético em diferentes concentrações de acordo com o grau de desacetilação (GD) desejado, variando assim suas propriedades físico-químicas: viscosidade, dureza56. A viscosidade, solubilidade, elasticidade e resistência ao rasgo, são dependentes do peso molecular (PM) do polímero em questão 57, podendo este variar de 50 a 2000 kDa 58 . Segundo Khan, 2001 é mostrado que a cristalinidade da membrana aumentou com a diminuição no PM de Quitosana, sendo também demonstrado que, quanto menor o PM, maior a pureza do polímero e menor o potencial alergênico do composto59. Após a adição do ácido, com o auxílio de um aparelho misturador a 180rpm a Quitosana foi diluída, ao longo de 24h ininterruptamente. Decorrida a primeira fase do preparo a Quitosana apresentou aspecto viscoso e foi mantida em geladeira à temperatura de 54 15ºC. As preparações dopadas foram mantidas em geladeira a 4ºC. A figura 24 exemplifica a etapa I da produção. Figura 24: Etapas do preparo da membrana de Quitosana – Departamento de Química e Bioquímica IBB UNESP. Fotos: Arquivo Pessoal 2011 No presente trabalho foram produzidos dois grupos subdivididos em seis subgrupos distintos designados de “A” a “F” de acordo com os interesses em termos de concentração e posterior aplicação cirúrgica da membrana. Os subgrupos A, B e C apresentaram as membranas “puras”, ou seja, sem adição de fatores de crescimento ou hormônios plaquetários, sendo que em A e B, 15g de Quitosana em pó foi diluída em 1L de ácido acético a 3% e 4% respectivamente; e no grupo C, de maior concentração de Quitosana, 20g de pó foram diluídos em ácido acético a 4%. 55 Nos grupos D, E e F além da Quitosana diluída da mesma maneira que nos grupos A, B e C, foi acrescido a esses hormônio plaquetário na quantidade de 10% do volume total de Quitosana de cada grupo (Figura 25), o que corresponde a 58.333,33pg/dl de PDGF e 583,33pg/dl de VEGF. As membranas tratadas com hormônios plaquetários foram denominadas de membranas “dopadas”. Figura 25: Quitosana líquida acrescida de hormônio plaquetário. Fotos: Arquivo Pessoal, 2011 A concentração de Quitosana utilizada foi estabelecida com a finalidade de se estudar sua possível ação antimicrobiana, sua toxicidade (indução de apoptose e necrose celular) e sua morfologia. Assim, foram utilizadas duas concentrações, sendo uma menor e uma maior para verificar se o aumento da concentração de Quitosana influenciaria o resultado dos testes mencionados. Os diferentes grupos estão listados na tabela 4. 56 Grupo Nomenclatura utilizada Concentração de Ácido Acético usada Quantidade de Quitosana em gramas Quantidade de Ácido em Litros Concentração Final A Quitosana 3% 3% 15 1L 3% em massa B Quitosana 4% 4% 15 1L 4% em massa C Quitosana 4% com maior concentração 4% 20 1L 4% em massa D Quitosana Dopada 3% 3% 15 1L 3% em massa E Quitosana Dopada 4% 4% 15 1L 4% em massa F Quitosana Dopada 4% com maior concentração 4% 20 1L 4% em massa Tabela 4: Grupos estudados e suas características. III.4.1.2 Preparo da Quitosana: parte II A segunda parte do preparo da membrana de Quitosana foi realizada no LEC. Em capela de fluxo laminar, a Quitosana ainda líquida foi colocada em placas de Petri de vidro para secagem. Em temperatura ambiente há uma mudança conformacional do polímero, o qual devido à perda da umidade se solidifica. A evaporação de uma solução de Quitosana espalhada sobre uma placa de vidro é a técnica mais simples para a preparação de filmes de Quitosana e, geralmente, produz um filme flexível e resistente, sem acarretar nenhum custo adicional à sua produção60. No entanto, o procedimento só se complementa, ao adicionar sobre as membranas, já secas, uma solução de Hidróxido de Sódio (Na OH) 0,5N. O Na OH 57 nessa concentração é utilizado para neutralizar o excesso de ácido acético da membrana, deixando seu pH próximo de 7,0, garantindo assim uma certa plasticidade à mesma, tornando- a maleável. Além do mais, a adição do Na OH é realizada com a finalidade de se controlar a porosidade do polímero, sendo as membranas consideradas “densas” quando em contato por 24h com a solução e “porosas” quando a exposição limita-se a 48h61. (Figura 26). Figura 26: Em cima, membranas em fase de secagem e adição de Na OH. Embaixo, membrana pronta para uso. Fotos: Arquivo Pessoal 2011 58 III.4.2 Analisar atividade antimicrobiana e antifúngica A análise da atividade antimicrobiana e antifúngica foi realizada após procedimentos de esterilização da membrana seca. � Esterilização das Membranas de Quitosana O processo de esterilização deve ter capacidade de inativar uma ampla variedade de microorganismos, incluindo os esporos bacterianos resistentes. A esterilização se diferencia da desinfecção por ser capaz de destruir todas as formas de microorganismos. Tratando-se de seres vivos, todos os instrumentos e objetos que penetram nos tecidos ou vasos sanguíneos, ou que entram em contato com as mucosas, membranas ou feridas, devem ser esterilizados62. O método escolhido para tal foi o Sistema Sterrad® de Esterilização (Figura 27), o qual age a baixas temperaturas, (excluindo a hipótese de derretimento da membrana como no caso de autoclaves convencionais) utilizando vapor de peróxido de hidrogênio (H2O2), sem deixar resíduos tóxicos. O H2O2 é bactericida, viruscida, tuberculiscida, esporocida e fungicida. Age por meio da produção de radicais livres que lesam membranas lipídicas, DNA e outros componentes celulares essenciais63. 59 Figura 27: Membranas esterilizadas pelo sistema Sterrad®. Foto: Arquivo Pessoal, 2011 � Atividade antimicrobiana da membrana Com o intuito de avaliar as propriedades inerentes à membrana, propôs-se a realização de ensaios antimicrobianos e antifúngicos. A hipótese do comportamento da membrana retrata que o grupo aminocatiônico da Quitosana age sobre os grupos aniônicos dos fungos e bactérias, causando a inibição do crescimento. 64 O ensaio antimicrobiano foi realizado no Hospital Estadual de Bauru – Dr. Arnaldo Prado Curvêllo. Foram realizados dois tipos de testes sendo o primeiro feito em condições estéreis e o segundo em exposição ambiental. � Teste realizado em capela de fluxo laminar classe IIA Foram utilizadas membranas provenientes de cada um dos seis subgrupos elencados. As cepas utilizadas em ambos os testes foram Staphylococcus aureus ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, (cepas consideradas mais comuns em infecções hospitalares, de corrente sanguínea, pele, e dispositivos). Os controles negativos demonstraram crescimento de 100.000 unidades formadoras de colônias para S. aureus. Na amostra contendo a cepa P. aeruginosa não houve crescimento. As membranas foram transferidas para placas de Petri estéreis, sendo utilizada uma placa para cada membrana. Para a verificação de contaminação bacteriana foi utilizado um inóculo de cada bactéria de 0,01mL colocado sobre cada membrana, com a quantidade estimada de 106 bactérias nesse volume. O tempo de exposição à bactéria foi de 60 minutos em estufa a 37ºC. Após esse tempo, foi colocada salina estéril em cada placa com auxilio de uma seringa e agulha para lavar as membranas, na sequência essa salina foi recuperada e semeada em meio Agar sangue. As placas foram deixadas em estufa a 37ºC por 24 horas e após esse tempo foi feita a verificação de crescimento e posterior contagem de colônias. � Teste de exposição ambiental 60 Para o teste de exposição ambiental, procedimento semelhante foi realizado, sendo que as placas com as membranas foram deixadas à temperatura ambiente sobre a bancada por 60 minutos. Após esse tempo os procedimentos foram iguais ao descrito no teste realizado em capela de fluxo laminar classe IIA. � Atividade Antifúngica da membrana A avaliação antifúngica da membrana foi realizada no Departamento de Microbiologia do IBB. 65 O microrganismo utilizado foi Levedura Candida albicans (ATCC 10231) e o método usado foi o Método Agar Difusão para C. albicans. O meio de cultura foi o Agar Saboraud (DifcoTM), preparado com 6,5g do meio para 100 mL de água destilada, autoclavados a 120ºC por 15 minutos. O meio líquido foi distribuído em placas de Petri (20 mL por placa de 90x15mm) esterilizadas, incubadas em estufa a 37ºC por 24h. Os microorganismos (C.albicans) foram repicados em meio Ágar BHI