Estudo da Resposta Imunológica induzida por Arnica montana L. Márcia Faria Marques 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Câmpus de Araraquara Estudo da Resposta Imunológica induzida por Arnica montana L. Márcia Faria Marques Orientadora: Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos Tese apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Universidade Estadual Paulista-UNESP para a obtenção do título de Doutor em Análises Clínicas. Araraquara/2006 3 SUMÁRIO LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS LISTA DE FIGURAS E TABELAS RESUMO ABSTRACT I- INTRODUÇÃO-------------------------------------------------------------------------11 1.1- Fitoterapia -----------------------------------------------------------------------12 1.2-Homeopatia------------------------------------------------------------------------13 1.3- Arnica montana Linné----------------------------------------------------------16 1.4- Resposta Imunológica----------------------------------------------------------19 II- OBJETIVOS----------------------------------------------------------------------------28 III- MATERIAIS E MÉTODOS----------------------------------------------------------30 3.1- Arnica montana------------------------------------------------------------------31 3.2 -Animais ---------------------------------------------------------------------------31 3.3 –Obtenção do exsudato peritoneal------------------------------------------32 3.4- Obtenção de células esplênicas --------------------------------------------32 3.5 – Determinação da viabilidade celular -------------------------------------33 3.6 - Determinação de H2O2 -------------------------------------------------------34 3.7 - Determinação de NO ---------------------------------------------------------35 3.8 - Determinação de citocinas---------------------------------------------------37 3.9 - Análise estatística--------------------------------------------------------------39 IV- RESULTADOS-------------------------------------------------------------------------40 V- DISCUSSÃO---------------------------------------------------------------------------56 VI- CONCLUSÕES -----------------------------------------------------------------------76 VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS----------------------------------------------78 VIII- ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------106 4 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS AM - Arnica montana L. AM1 - Tintura-mãe de arnica BH4 - Tetrahidrobiopterina CH - Centesimal Hahnemaniana Con-A - Concanavalina A ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay IFNγ - Interferon-γ iNOS - Óxido Nítrico Sintase LPS - Lipopolissacarídeo de E. coli sorotipo 0111:B4 MLC - Meio Livre de Células MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio NF- κβ - Fator Nuclear-κβ NO - Óxido Nítrico PBS - Phosphate Buffered Saline PEC - Células do Exsudato Peritoneal PMA - Phorbol Myristate Acetate RNI - Reativo Intermediário do Nitrogênio ROI - Reativo Intermediário do Oxigênio RPMI-1640 - Roswell Park Memorial Institute - série 1640 TNF-α - Fator de Necrose Tumoral-α 5 LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1-Christian Friedrich Samuel Hahnemann Figura 2- Exemplos de plantas conhecidas popularmente como Arnica. A) Arnica montana Linné; B) Lychnophora ericoides Less; C) Heterotbeca inuloides Cass. Figura 3 –Estrutura química do ácido cafeico. R3=OH Figura 4 e 5 – Estrutura química da quercetina. R=OH e R’ =H Figura 6 – Viabilidade das células do exsudato peritoneal (PEC) de camundongos Swiss frente às preparações fitoterápicas de Arnica montana. Figura 7 - Viabilidade das células do exsudato peritoneal (PEC) de camundongos Swiss frente às preparações homeopáticas de Arnica montana. Figura 8- Produção de peróxido de hidrogênio por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana. Figura 9- Inibição da produção de peróxido de hidrogênio por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana. Figura 10- Produção de óxido nítrico (NO) por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas de Arnica montana. Figura 11- Produção e inibição de óxido nítrico (NO) por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações homeopáticas de Arnica montana. Figura 12- Produção de TNF-α por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas de Arnica montana L. 6 Figura 13- Produção de TNF-α por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações homeopáticas de Arnica montana L. Figura 14- Produção de interferon gama (IFN-γ) por células esplênicas cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L. Figura 15- Produção de interleucina 4 (IL-4) por células esplênicas cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L. Figura 16- Produção de IL-6 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L. Figura 17- Produção de IL-1 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L. Figura 18- Produção de IL-12 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana. Tabela 1. Efeito inibitório das preparações homeopáticas de Arnica montana na produção de NO em cultura de macrófagos estimulados por LPS. Tabela 2. Efeito inibitório das preparações homeopáticas de Arnica montana na produção de TNF-α em cultura de macrófagos estimulados por LPS. 7 RESUMO 8 A resposta imunológica engloba amplo contexto envolvendo várias células, sendo o macrófago uma das mais importantes na resposta imune-celular. Os macrófagos peritoneais quando ativados liberam mais de cem compostos ao meio extracelular, entre eles os compostos reativos de oxigênio e de nitrogênio, além das citocinas: fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ) e interleucinas (IL-1, 4, 6 e 12). Existem vários estímulos à membrana macrofágica que podem desencadear a liberação de NO, contribuindo para uma ação antimicrobiana, inflamatória, vasodilatadora, neurotransmissora, ou até mesmo de citotoxicidade ou inibição/ativação linfocitária e da agregação de plaquetas. Atualmente há uma forte tendência em se estudar produtos naturais quanto à capacidade de atuação no sistema imunológico. Os medicamentos homeopáticos, conhecidos há mais de 210 anos, visam à ativação das próprias defesas do organismo para eliminar a doença. Estudos baseados em cultivos obtidos de macrófagos podem ser úteis para um melhor entendimento da resposta imunológica. Considerando a importância farmacológica de Arnica montana L. (Asteraceae), planta originária das regiões montanhosas do norte da Europa, este estudo avaliou a liberação de H2O2, NO, TNF-α, IFN-γ e IL-1, 4, 6 e 12 no sistema imunológico através de macrófagos peritoneais expostos a preparações fitoterápicas e homeopáticas desta planta. Os resultados mostraram que a Arnica montana L. foi capaz de promover a liberação de NO, TNF-α, IFN-γ e IL-6. As preparações homeopáticas também apresentaram um efeito inibitório na produção de NO e TNF-α induzida pelo LPS. A análise dos resultados deste trabalho sugere que a Arnica montana L. pode modular a ativação dos macrófagos. 9 ABSTRACT 10 The immunological response includes wide context involving several cells, being the macrophage one of the most important in the cellular immune response. The peritoneal macrophages when activated they liberate more than a hundred compound to the environment extracellular, among them compound reactive of the oxygen and nitrogen and the tumoral necrosis factor -α (TNF-α), gamma-interferon and interleukynes. The nitric oxide (NO) it is synthesized by several cellular types through isoforms of the enzyme nitric oxide synthase (NOS). The enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS) it produces NO starting from activators mechanisms macrophages. Several incentives to the membrane macrophagical that can unchain the liberation of NO, contributing to actions antibacterial, inflammatory, vasodilatation, neurotransmission, or even of citotoxicity or inhibition/activation of lymphocytes. Now there is a strong tendency in studying natural products with relationship to the capacity of performance in the immune system. Macrophages are involved in many different processes but their main function is to provide a defense line against microbial invasion and tumor cells. Once homeopathic medications are aimed at activation of the body’s own defense mechanisms to fight an existing disease, assays based in macrophages culture may be useful to enlighten some questions. Considering the pharmacological importance of Arnica montana L. this study evaluated the action of NO in the immune system through peritoneal macrophages exposed to the preparations of this plant. The results showed that some of the tested preparations were capable to promote the liberation of NO, TNF-α, INF-γ e IL-6 in cultures of peritoneal macrophages murine. A relationship among the synthesis of NO and TNF-α was observed. Analyzing the results, it is suggested that preparations of Arnica montana L. can modulate macrophage activation. 11 I - INTRODUÇÃO 12 1.1 FITOTERAPIA A palavra fitoterapia é derivada do grego, onde phytos significa planta. Esse termo foi introduzido mundialmente, pelo médico francês Henry Leclerc. O uso das plantas para tratar diversos transtornos da saúde é uma das formas terapêuticas mais antigas e de maior tradição. Os fitoterápicos têm sido, no caso do Brasil e de muitos países, o suporte da indústria farmacêutica genuinamente nacional de pequeno e médio porte (DI STASI, 1996). Multiplicam-se a cada dia o interesse e o consumo de medicamentos naturais, sobretudo os de origem vegetal. Esta crescente utilização das plantas medicinais, por vezes de forma indiscriminada e até mesmo abusiva, exige estudos farmacológicos e toxicológicos para melhorar a forma de utilização dos medicamentos fitoterápicos a serem empregados no tratamento de inúmeras patologias (PANIZZA, 1997). O interesse em relação às plantas medicinais favorece a valorização dessa forma de terapêutica popular que serve de modelo para muitos fármacos sintetizados (PRANDO & COLATRELLA, 1984). O uso de produtos naturais como matéria prima para a síntese de fármacos tem sido amplamente relatado ao longo do tempo. A etnofarmacologia está inserida no contexto da etnobiologia, estudando o complexo conjunto de relações das plantas e animais com a sociedade humana, do presente e do passado. A abordagem etnofarmacológica oferece a oportunidade de descobrir protótipos, ou seja, novas estruturas com novas atividades (MALONE, 1983). 13 1.2 HOMEOPATIA A busca por analgésicos e antinflamatórios mais eficazes e menos tóxicos tem sido uma constante no meio científico. Várias terapias têm sido avaliadas com diferentes resultados. Entre estas terapias encontra-se a Homeopatia, descrita primeiramente pelo filósofo Hipócrates na antiga Grécia, que em 450 a.C. acreditava no princípio da similitude, no qual semelhante pode curar semelhante. Mas foi em 1796 que Christian Friedrich Samuel Hahnemann (Figura 1), um médico alemão decepcionado com a medicina da época, criou os princípios de um novo tipo de medicamento, publicando a obra “Ensaios sobre um novo princípio para descobrir as virtudes curativas das substâncias medicamentosas”, onde descreveu os fundamentos desta especialidade da Medicina. Sendo esta obra o marco de fundação da Homeopatia (REBOLLO, 1994). Figura 1-Christian Friedrich Samuel Hahnemann A palavra homeopatia também deriva do grego, língua em que “homoios” quer dizer “igual” e “pathos” significa doença. A homeopatia foi introduzida no Brasil por um discípulo francês de Hahnemann, Benoit-Jules Mure, que aqui chegou em 1840. A homeopatia é a arte de curar doentes por meio de medicamentos que, dados ao homem são, em doses ponderáveis, provocam sintomas semelhantes aos que se 14 propõe a curar no doente. Esta terapêutica baseia-se em três princípios: a lei dos semelhantes, a experimentação no homem são e o emprego das pequenas doses. A Lei dos Semelhantes ou "Similia similibius curantur ou curentur", ou seja, o semelhante tratado pelo semelhante. Assim, um determinado medicamento dado a indivíduos aparentemente sadios, produz um conjunto de sinais e sintomas. Este mesmo medicamento, em pequenas doses, produzirá a cura em doentes que tenham os sinais e sintomas semelhantes àqueles apresentados anteriormente (BERNSTEIN, 1998). O segundo princípio baseia-se na Experimentação no Homem Sadio ou "Experientia in homine sano", que corresponde à experimentação no homem são, utilizado por Hahnemann. Ela é a base para se escolher um medicamento, possibilitando dessa forma que as manifestações sintomáticas do doente e da droga se combinem fortalecendo e excitando os mecanismos de defesa do organismo em direção ao restabelecimento da saúde. O outro princípio está na desconcentração da matéria-prima de origem do medicamento homeopático (Doses Mínimas ou "Doses minimae"). As doses mínimas atuam suavemente, sem agredir, estimulando os mecanismos naturais de defesa (BERNSTEIN, 1998). A idéia das dinamizações e diluições altas se tornaria um dos principais alvos de estudo no sistema homeopático. Hahnemann e outros cientistas precursores entendiam que deveria haver um limite físico para a diluição de uma substância original, a partir do qual não haveria mais qualquer resíduo da substância original. Contudo, diluições altíssimas, foram usadas na medicina homeopática com sucesso. A questão acerca da diluição e da dinamização não só se tornaria um dos principais pontos de controvérsia entre a homeopatia e a medicina convencional moderna, como ainda é uma das principais áreas de conflito dentro da comunidade homeopática propriamente dita (JONHNNAS, 1996). 15 Assim, Hahnemann passou a pesquisar substâncias que provocassem os mesmos sintomas da doença que se pretendia curar, administrando-as em seus pacientes e com o intuito de evitar os efeitos da agravação medicamentosa ao diminuir a toxicidade das drogas através da diluição das mesmas, Hahnemann passou a notar que, após agitações vigorosas e ritmadas, os medicamentos passavam a ter seus efeitos potencializados, surgindo assim o princípio da dinamização homeopática. Reconhecida como especialidade médica há 25 anos, há 13 pela área farmacêutica e há cinco anos pela medicina veterinária e odontologia, a homeopatia enfrenta nos dias de hoje o desafio de provar em bases científicas o seu funcionamento, apesar de não haverem dúvidas a respeito de sua efetividade clínica por parte dos pacientes e médicos. Isso se justifica pelo fato de seus princípios de diagnóstico e tratamento diferirem do modelo químico-farmacológico convencional. A pesquisa clínica usual para avaliação dos efeitos medicamentosos não funciona para medicamentos homeopáticos, uma vez que burla um princípio homeopático que é tratar o indivíduo em vez da doença. Desde a sua criação, o tratamento homeopático procura tratar a pessoa como um todo, buscando um conjunto de sintomas existentes no paciente, procurando promover o auto-equilíbrio, ou seja, a equalização da homeostasia. Através da física quântica é possível comprovar que a conformação das moléculas de solvente é alterada quando uma insignificante porção de soluto é adicionada a uma solução que é dinamizada. Com a dinamização algum tipo de informação existente na substância ativa diluída é transferida para o solvente usado no preparo do remédio, o que atribui a este solvente característica do soluto, justificando o efeito de um remédio tão 16 pouco concentrado. Assim, a dinamização pode alterar pontes de hidrogênio, ligações dipolo-dipolo além de forças intermoleculares mais fracas, podendo formar grupos de moléculas de solvente denominadas “clusters”, o que pode confirmar a teoria Hahnemaniana de que informações do soluto podem ser repassadas para o solvente na dinamização do medicamento. As indicações do medicamento homeopático Arnica montana estão bem estabelecidas nas Matérias Médicas Homeopáticas, por ser um dos mais conhecidos remédios homeopáticos. KINOUCHI (1986) como exemplo, a emprega externamente na forma de tintura-mãe e, internamente em várias dinamizações. 1.3 ARNICA Planta originária das regiões montanhosas do norte da Europa, de terras silicosas, o cultivo da Arnica montana L. no Brasil é de adaptação muito difícil. Por aqui, existem muitas plantas chamadas popularmente de arnica, mas na verdade são espécies diferentes (Figura 2) e não têm a mesma aplicação terapêutica. Desde a Idade Média, os efeitos antinflamatórios da Arnica montana L. são conhecidos, bem como sua aplicação na cicatrização de ferimentos graças às suas propriedades regeneradoras de tecidos (VALENTOVA, 1990). 17 A B C Figura 2- Exemplos de plantas conhecidas popularmente como Arnica. A) Arnica montana Linné; B) Lychnophora ericoides Less; C) Heterotbeca inuloides Cass. Arnica montana Linné pertence à família das Asteraceae e apresenta como sinonímia Caltha alpina, Chrysanthemun latifoliun, Doronicum austricum quartum, Nardus celtica, Panacea lepsorum, Ptarnica Montana. Popularmente, a arnica recebeu diversos nomes: quina-dos-pobres, tabaco-dos-alpes, tabaco-da-montanha, erva-dos- pregadores, veneno de leopardo, etc (VESSLY, 2000). Arnica montana é um arbusto perene com rizomas (caules subterrâneos) e raízes perenes, com caules (talos) aéreos que se renovam a cada ano. Sua altura varia de 20 a 70 cm. As folhas chegam a ter 7cm de comprimento com quatro folhas ovais agrupadas em roseta. As flores são abundantes, de cor amarelo-ouro ou alaranjada, com pétalas ovaladas e pontudas que exalam um suave perfume. Os frutos são pardos e aquênio (LASRWAL, 1998). A arnica é o grande remédio do traumatismo, com ação sobre músculos, tecido celular, cérebro e vasos sanguíneos (partes do corpo mais sujeitas a traumatismos), está indicada para tratar machucados, contusões musculares, artrite, dores reumáticas, no tratamento das varizes e no pós-operatório por reduzir o edema. Em aplicações mais específicas, é também indicada para combater febres, hemorragias, desinterias, infecções 18 renais, inflamações oculares, problemas circulatórios e cardíacos. No tratamento à oleosidade e queda excessiva dos cabelos, rachaduras e hematomas na pele; o uso externo de tinturas e cataplasmas de arnica está limitado à pele íntegra. A variedade dos produtos a base de arnica existentes no mercado explica a diversa empregabilidade desta planta, como sabonetes para limpeza de partes contundidas, conservando a pele macia e elástica, fazendo desaparecer as rachaduras e asperezas; pasta dental e água dentifrícia; óleo tônico capilar; óleo e pomada para fricção muscular; etc. Apresenta em sua composição química lactonas sesquiterpênicas como helenalina sob a forma de ésteres (acetato, metacrilato, isobutirato) e dihidrohelenalina, seus ésteres (arnicolídeos) e tetrahidrohelenalina. Além de flavonóides, óleo essencial que contém timol e derivados como timolmetileter, hidroxitimolmetileter e o isobutirato de timol, ácidos fenólicos, polifenóis, ácido cafeico (Figura 3) e um complexo formado por caroteno e manganês (POZETTI, 1991). A eficiência da arnica para tratar ferimentos, especialmente aqueles com hematomas, é comprovada pela presença de uma substância chamada quercetina (Figura 4), capaz de aumentar a resistência dos vasos e a irrigação sangüínea nos locais feridos, diminuindo o coágulo e eliminando o hematoma. Outra substância, a inulina, funciona como um analgésico, aliviando a dor. 19 Figura 3 –Estrutura química do ácido cafeico. R3=OH Figura 4 –Estrutura química da quercetina. R=OH e R’ =H 1.4 RESPOSTA IMUNOLÓGICA A inflamação é fundamentalmente uma resposta de defesa do organismo, visando destruir, amenizar ou circunscrever a ação do agente agressor. Nesse processo encontramos o macrófago em estado ativado, onde sua capacidade de fagocitar e exercer atividades antimicrobianas e citotóxicas está aumentada por sofrer uma série de alterações morfo-funcionais (ROITT et al.,1999; SELIGMANN, 2003). A interação celular entre macrófagos e linfócitos durante a resposta imunológica desencadeia nos macrófagos, mudanças bioquímicas e alterações na expressão de genes, por estímulos inflamatórios sucessivos à membrana macrofágica; alterando suas propriedades de locomoção, aderência, fagocitose e de síntese de enzimas e substâncias antimicrobianas, citotóxicas, pró-inflamatórias, vasodilatadoras e imunomoduladoras. (NATHAN & HIBBS, 1991). 20 Em resposta à ativação por mediadores inflamatórios, os macrófagos aumentam o seu conteúdo enzimático e a secreção de produtos biologicamente ativos no meio extracelular, liberando mais de 100 compostos; entre os numerosos produtos secretados, além de várias citocinas, estão também compostos inorgânicos com alto grau de reatividade química como os intermediários reativos do oxigênio (ROI), incluindo o peróxido de hidrogênio (H2O2) e do nitrogênio (RNI), incluindo o óxido nítrico (NO) (BABIOR, 1978; FRIEDL et al., 2004). O ânion superóxido (O2 -), produzido a partir da redução do oxigênio, é subseqüentemente convertido a peróxido de hidrogênio (H2O2) com a ajuda da enzima superóxido dismutase (SOD). Nos locais de atividade fagocítica e inflamação, quando há biossíntese excessiva, o H2O2, em altas concentrações, pode destruir estruturas biológicas, ocasionando lesões irreversíveis como a quebra de fita de DNA e/ou perturbação no citoesqueleto da membrana, levando à morte celular (PICK & KEISARI, 1980; HAMPTON et al., 1998). No processo inflamatório, os macrófagos ativados sintetizam nitrito (NO2 -) e nitrato (NO3 -), formas estáveis oxidadas do NO, cuja produção reflete o grau de inflamação, e conseqüentemente indica uma medida dos efeitos de drogas na terapia antiinflamatória. O óxido nítrico é formado através da oxidação do átomo de nitrogênio do aminoácido L- arginina pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) que é dependente dos cofatores NADPH, FMN, FAD, Ca+2 e tetrahidrobiopterina (BH4), formando como reação intermediária a NG- Hidroxil-L-arginina e como produtos finais a L-citrulina e o NO (IYENGAR et al., 1987). O óxido nítrico (produto celular) é um radical livre altamente solúvel que exerce efeito fisiológico e proteção imunológica. Está envolvido em uma ampla série de 21 processos fisiológicos: como fator de relaxamento derivado do endotélio concede resistência vascular e controle da pressão sanguínea, diminui a resistência renal e aumenta a filtração glomerular; também transmite os sinais nervosos de um neurônio a outro em diversas áreas do cérebro, além de atuar como vasodilatador nas terminações nervosas parassimpáticas do pênis, produzindo a ereção e possivelmente pode também estar envolvido em alguns dos mecanismos de memória (RANG et al., 1997; XIE et al., 2002). Como molécula reguladora no sistema imunológico, o NO sinaliza em diversos tecidos, é um mediador citotóxico/citostático para as células tumorais e agentes infecciosos intracelulares, contribuindo para a manutenção da homeostasia imunológica, devido ao seu papel no fenômeno de supressão da célula T (MONCADA et al., 1991). A produção de NO por diferentes células durante a resposta imunológica é controlada por diversos mecanismos (BASU, 2006). Em adição ao papel protetor do NO, há um mecanismo dependente da liberação de citocinas com função autócrina, tal como o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e parácrina, como o interferon-γ (IFN-γ), que regulam a ativação de macrófagos, modulando sua função fagocitária e a síntese de mediadores pró- inflamatórios, assim como também a indução da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) (NUSSLER & BILLIAR, 1993). A expressão da isoforma NO induzível pode ocasionar na superprodução de NO, que exerce efeitos citotóxicos potentes em células normais por afetar o metabolismo energético, alterando o sistema redox e danificando o DNA, implicando assim, em patologias imunoinflamatórias em que altos níveis deste óxido são tecido-destrutivos (VANE et al., 1994). 22 O NO é altamente reativo e reage com muitas macromoléculas e, também, com o ânion superóxido (O2 -) (produto do sistema de redução do oxigênio), formando o radical peroxinitrito (ONOO-), um oxidante potente que medeia alguns dos efeitos citotóxicos do NO em locais de atividade fagocítica e inflamação, quando há biossíntese excessiva (ABBAS et al., 2000). O NO aumenta a produção mitocondrial de espécies reativas de oxigênio, esses radicais reagem entre si, podendo formar outros oxidantes com capacidade para nitrar resíduos fenólicos de proteínas, como a enzima succinato desidrogenase e conduzir à disfunção mitocondrial (PODEROSO et al., 1998). A capacidade dos macrófagos ativados em liberarem mediadores tóxicos consome grandes quantidades de energia e muitas vezes provocam dano tecidual, mas é importante na defesa do hospedeiro porque lhe permite destruir grandes patógenos extracelulares que não consegue ingerir. A estreita regulação da atividade dos macrófagos pelas células Th1 possibilita a distribuição específica e efetiva desse potente meio de defesa do hospedeiro, ao mesmo tempo em que minimiza a agressão tecidual e o consumo de energia (JANEWAY et al., 2000). A ativação dos macrófagos requer um sinal indutivo inicial a partir de linfócitos T, identificado como IFN-γ que particularmente em combinação com a interleucina-2 (IL-2) e/ou TNF-α, participam do mecanismo que desencadeia a produção de NO. Por outro lado, o próprio NO atua como um inibidor da produção das citocinas liberadas pelas células Th1 (TNF-α, IL-2, IL-12 e IFN-γ), ou seja, o NO é capaz de inibir a sua própria produção, por interferir na liberação das citocinas que promovem a sua produção. Efeito esse não observado sobre as células Th2 que liberam principalmente TGF- β, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, sugerindo que este mecanismo de regulação pode, em alguma 23 circunstância, modular a resposta imune, contribuindo para a manutenção da homeostasia imunológica (BINGISSER et al., 1998). Citocinas são frequentemente agrupadas em famílias de acordo com suas funções similares ou de acordo com a sua estrutura proteica (HOLLOWAY, 2001). São elas as hematopoietinas, os interferons (IFN), as quimiocinas, e a família do fator de necrose tumoral (TNF). Membros da família TNF atuam como trímeros, a maioria dos quais ligados à membrana e muito distintos das outras citocinas por suas propriedades. Apesar disso, eles compartilham algumas propriedades importantes com as citocinas solúveis: eles são sintetizados de novo no momento do reconhecimento do antígeno pela célula T, afetando o comportamento da célula-alvo (JANEWAY et al., 2000). A partir do perfil das células Th0 existe uma dicotomia que se efetua seja no sentido de um perfil Th1, seja no sentido de um perfil Th2. O perfil Th1 está essencialmente implicado na resposta imunológica celular caracterizada por um infiltrado rico em neutrófilos e em macrófagos e pela formação de granulomas. O perfil Th2 está implicado nas respostas imunológicas alérgicas e é caracterizado por infiltrados ricos em eosinófilos e pelo aumento da síntese da IgE (REINHERZ & SCHOLOSSMAN, 1981). TNF-α, produzido por macrófagos, é uma citocina que apresenta efeito estimulante no crescimento de fibroblastos, aumenta a capacidade do interferon-γ em induzir a expressão de antígeno em algumas células tumorais, suprime a atividade da lipase lipoproteica, ativa neutrófilos, ativa células Natural Killer (NK) em humanos e facilita a proliferação de células B humanas (SHALABY et al., 1985). 24 O TNF-α estimula os fagócitos mononucleares a secretarem quimiocinas que contribuem para a resposta inflamatória. O TNF reduz a perfusão tecidual por relaxar o tônus da musculatura lisa vascular, atuando diretamente sobre as células dos músculos lisos e por agir também na produção de vasodilatadores como o NO, por indução da NOS. Diversas ações específicas do TNF-α podem contribuir para seus efeitos letais nas concentrações extremamente elevadas. A super produção de TNF-α em vários processos inflamatórios agudos, causa disfunção em órgãos como o fígado; por outro lado, a diminuição nessa produção ou a neutralização da ação do TNF-α ou da IL-12 e IFN-γ leva a um aumento na suscetibilidade para infecções (GANTINER et al., 1996). A interleucina-12 (IL-12), descoberta em 1989, é um heterodímero que apresenta em sua estrutura cadeias polipeptídicas, a p-40 e a p-35. A IL-12 é liberada por células B ativadas, monócitos, células dendríticas, neutrófilos e macrófagos. A atividade de IL-12 abrange múltiplos efeitos sobre as células NK (proliferação celular, liberação de citocinas e aumento da citotocixidade) e exerce importante função na ativação da resposta Th1(resposta imune-celular) por favorecer a diferenciação das células Th em Th1, com conseqüente indução da produção de IFN-γ. IFN-γ é um importante mediador na resistência viral, fúngica, bacteriana e parasitária, por estimular as funções efetivas dos macrófagos nos momentos iniciais da invasão do patógeno, controlando rapidamente a infecção (TRINCHIERI, 1995). Estudos recentes demonstram que a IL-12 é uma chave promotora da imunidade celular e da resistência inicial a infecções, um potente estimulador da defesa do organismo contra uma variedade de patógenos. A síntese de IL-12 pode resultar em uma resposta excessiva do sistema imunológico, causando dano tecidual e morte, como 25 observado em doenças autoimunes e no choque séptico. Identificar e caracterizar os produtos envolvidos na indução e na inibição da síntese de IL-12 é uma importante área de investigações constantes que possibilita a produção de imunoterápicos. A interleucina-12 (IL-12) é o principal mediador da resposta imune inata a microorganismos intracelulares e um indutor chave da imunidade mediada por células, a resposta adaptativa contra estes microorganismos. É produzida principalmente por macrófagos ativados e células dendríticas (GAZZINELLI et al., 1993). É uma proteína heterodimérica composta por duas subunidades denominadas p35 e p40 (o que representa aproximadamente seus pesos moleculares). A IL-12 é muito importante para a iniciação de uma seqüência de respostas envolvendo macrófagos, células NK e linfócitos T, e participa de uma ligação importante entre a imunidade natural e adaptativa. A IL-12, juntamente com o TNF-α, são co- estimuladores para a produção de IFN-γ (TRIPP et al., 1993), direcionando para uma resposta Th1. Na rede de mediadores que constitui a resposta imunológica, o IFN-γ, produzido pelos linfócitos, é a principal citocina ativadora de macrófagos e possui funções essenciais na imunidade inata e na imunidade específica mediada por células. O IFN-γ aumenta a ação microbicida de macrófagos pela estimulação da síntese de intermediários reativos do oxigênio e de óxido nítrico (DRAPIER et. al., 1988). As células Th1 possuem marcadores de membrana CCR5 e LAK3 e as Th2 possuem o CCR3, elas apresentam função regulatória uma sobre as outras. O IFN-γ inibe a expressão das citocinas produzidas por células Th2 (FUSS & STROBER, 1998). 26 A regulação dos perfis Th1/Th2 ainda é pouco conhecida, existe um equilíbrio com sobreposição dos dois perfis, pois um perfil Th1 pode estar implicado em uma resposta alérgica e um perfil Th2 pode provocar a formação de granulomas. Existe também um equilíbrio entre as citocinas inflamatórias e as antiinflamatórias (SALEM, 2005). A IL-6, liberada pelos macrófagos, é uma citocina multifuncional, envolvida na regulação da resposta imune, na hematopoese, na inflamação (AKIRA et al., 1990), na produção de plaquetas, na ativação dos osteoclastos, na produção de imunoglobulinas, na diferenciação de células T e de células neuronais, na proliferação de queratinócitos e das células mesangiais (NAKA et al., 2002); tem funções tanto na imunidade inata quanto na adaptativa (TRIPP et al., 1993). A IL-6 foi originalmente identificada como fator de diferenciação das células B e uma de suas principais funções é a indução da produção de anticorpos por estas células (AKIRA et al., 1990). A IL-1 é produzida por macrófagos ativados e atua juntamente com o TNF- α como um mediador da resposta inflamatória e da imunidade inata. Existem duas formas de IL-1, denominadas de IL-1α e IL-1β, que têm homologia de menos de 30% entre si, mas ligam ao mesmo receptor celular e medeiam as mesmas atividades biológicas. Também atua como pirogênio endógeno (DINARELLO, 1988). A IL-1 é o protótipo de citocina multifuncional. É uma citocina pró-inflamatória potente, que pode gerar a síntese de PGE2, atua em células B ativadas por antígenos para induzir sua proliferação e/ou diferenciação em células produtoras de anticorpos, sinergisticamente com outros fatores como IL-6 e IL-2 (AKIRA et al., 1990). 27 A ativação dos macrófagos é um fenômeno complexo e quando ativados apresentam capacidade aumentada de destruir certos microrganismos. Os macrófagos respondem a vários microrganismos pela secreção de IL-12, que induz a produção local de IFN-γ pelas células NK e linfócitos T. O IFN-γ ativa os macrófagos a destruir os microrganismos fagocitados por estimular a síntese de intermediários reativos do nitrogênio e oxigênio (STARK et al., 1998). A importância do sistema imunológico para a sobrevivência humana, aliada à grande utilização de plantas medicinais pela população e à procura de substâncias naturais pelas indústrias farmacêuticas motivam o desenvolvimento de estratérgias, tanto químicas quanto biológicas, para a descoberta de novas substâncias ativas. 28 II - OBJETIVOS 29 Devido à ampla empregabilidade de Arnica montana tanto como medicamento fitoterápico, como homeopático no tratamento de diversas patologias, o objetivo geral deste estudo foi avaliar a resposta imunológica frente as preparações fitoterápicas e homeopáticas de arnica a partir de sua tintura-mãe e ainda, avaliar o cultivo de macrófagos como modelo biológico para o estudo de outros medicamentos homeopáticos. Os objetivos específicos são: � Determinar a citotoxicidade de Arnica montana L. � Avaliar a resposta do efeito das dinamizações homeopáticas 6CH, 12CH e 30CH da arnica sobre culturas de macrófagos e, de células esplênicas de camundongos, através da determinação de citocinas (TNF-α, IFN-γ, IL-1, IL-4, IL-6 e IL-12) e dos reativos intermediários de oxigênio (H2O2) e de nitrogênio (NO). � Caracterizar uma atividade moduladora dos mecanismos de amplificação e/ou supressão dessa resposta. 30 III – MATERIAIS E MÉTODOS 31 3.1. Arnica montana As preparações dos medicamentos homeopáticos 6CH, 12CH e 30CH seguiram rigorosamente a 2ª edição da Farmacopéia Homeopática Brasileira de 1997. (ver anexo) Através de múltiplos frascos para as diluições e o emprego das 100 sucussões manuais ou mecânicas, obtém-se a dinamização e a cada etapa concluída, uma potência. Para as três primeiras dinamizações, para a escala centesimal, foi empregado etanol com o mesmo título etanólico da tintura-mãe. E, para as preparações intermediárias, assim como para as de estoque, foi empregado etanol 70% (p/p). Para as potências aqui estudadas, 6CH, 12CH e 30CH foi utilizado etanol 5% (p/p). As preparações fitoterápicas foram obtidas por diluições em meio de cultura RPMI-1640, a partir da tintura-mãe AM1, obtendo-se AM2 (1:2), AM3 (1:10), AM4 (1:100), AM5 (1:104), AM6 (1:106), AM7 (1:1012), AM8 (1:1024) e AM9 (1:1060). 3.2. Animais Foram utilizados camundongos Swiss, machos, pesando entre 25 e 30 gramas com 6-8 semanas de idade, provenientes do Biotério da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP. Os animais receberam ração e água ad libitum, mantidos em gaiolas com condições estáveis de ambiente 23°C, ±56% de umidade relativa do ar e ciclos de 12 horas claro/escuro. 32 3.3. Obtenção das células do Exsudato Peritoneal (PEC) Os animais foram inoculados previamente com 3,0 mL de tioglicolato de sódio (Difco) a 3%, por via intraperitoneal, 3 dias antes da coleta das células. Após 72 horas de estímulo, os animais foram mortos individualmente através da inalação de clorofórmio, e seu peritôneo exposto, em fluxo laminar horizontal (Veco), para a retirada do lavado peritoneal, injetando 5 mL de tampão fosfato (PBS) estéril, pH 7,0 a 4 oC, na porção mediana superior do abdomem, após leve massagem manual. O material obtido foi dispensado em tubo cônico estéril (Corning, Inc.) para o preparo da suspensão celular. As células do exsudato peritoneal foram lavadas três vezes, sucessivamente, com 5 mL de PBS em centrífuga (Fanem) a 200 x g/5 minutos. As células foram ressuspendidas em RPMI- 1640 (Sigma) contendo 5% de soro fetal bovino, 2-Mercaptoetanol a 2x10-5 M, Penicilina 100 U/mL, Estreptomicina 100 U/mL e L-Glutamina 2mM; designado como meio completo RPMI-1640-C. Para contagem celular, 10µL da suspensão celular foi diluída em 90µl de líquido de Lazarus em câmara hemocitométrica de Neubauer (Boeco, Germany). A suspensão celular foi ajustada à concentração de 2x106 células/mL para a determinação do peróxido de hidrogênio ou a 5x106 células/mL de RPMI-1640C para os demais testes. 33 3.4 Obtenção das células esplênicas Os animais foram mortos individualmente através da inalação de clorofórmio, e seu peritôneo exposto, em fluxo laminar horizontal (Veco), para a retirada do baço que foi pinçado em placa de Petri estéril contendo 3,0 mL de BSS (Balanced Salt Solution), pH 7,0 a 4 oC. O material obtido foi dispensado em tubo cônico estéril (Corning, Inc.) para o preparo da suspensão celular. As células esplênicas foram lavadas 3 vezes com 5 ml de BSS em centrífuga (Fanem) a 200 x g/5 minutos. As células foram resuspendidas em RPMI-1640 (Sigma) contendo 5% de soro fetal bovino, 2-Mercaptoetanol a 2x10-5 M, Penicilina 100 U/ml, Estreptomicina 100 U/ml e L-Glutamina 2mM, designado como meio completo RPMI-1640-C. Para contagem celular, em câmara hemocitométrica de Neubauer (Boeco, Germany), foi utilizado azul de Trypan 0,04%. A suspensão celular foi ajustada à concentração de 5x106 células/mL para a determinação do IFN-γ e da IL-4. 3.5 Determinação da viabilidade celular O potencial tóxico das preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L., foi determinado segundo a capacidade que têm as células vivas de clivar o anel tetrazólio presente no sal brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT) pela ação de enzimas desidrogenases presentes na mitocôndria, formando cristais de formazana (MOSMANN, 1983). Após o contato por 24 horas de 100µL da cultura de macrófagos peritoneais a 5x106 células/mL (item 3.3) com 100µl de cada preparação medicamentosa de Arnica montana L. (6CH, 12CH, 30CH, AM1, AM2, AM3, AM4, AM5, 34 AM6, AM7, AM8 e AM9), o meio livre de células (MLC) foi desprezado e 100µl de uma solução de MTT a 0,5mg/mL diluído em RPMI-1640 foram adicionados à placa de cultura e incubados por 3 horas em estufa (Forma Scientific, Inc.) com tensão constante de 5% de CO2 a 37oC ± 1°C. Após incubação, os cristais de formazana formados pelas células viáveis foram solubilizados com 100µL de isopropanol. A leitura da absorbância foi feita a 540nm, utilizando um filtro de referência de 620nm, em espectrofotômetro UV/visível automático (Multiskan Ascent, Labsystems). 3.6 Determinação da Liberação do Peróxido de Hidrogênio A produção de H2O2 foi determinada segundo o método descrito por Pick & Keisari (1980), e adaptado por Pick & Mizel (1981). A suspensão de células do exsudato peritoneal foi ajustada na concentração de 2x106 células /ml em solução de vermelho de fenol 0,56 mM; peroxidase de raiz forte, tipo II (0,01 mg/mL, Sigma); tampão fosfato de potássio 10 mM a pH 7,0; NaCl 140 mM e dextrose 5,5 mM. Dessa suspensão celular, 100µL foram transferidos para as escavações de uma placa de cultura de fundo plano com 96 cavidades (Corning, Inc.). A seguir foram acrescentados 50µl das preparações medicamentosas de Arnica montana L. a serem testadas. As amostras foram ensaiadas em quadruplicata para cada animal, com controle negativo constituído somente por meio RPMI – 1640-C e com controle positivo contendo 50 µl de zymosan a 10mg/ml (parede celular do fungo Saccharomyces cerevisae). A placa foi incubada por uma hora a 37oC ± 1°C em atmosfera úmida com tensão constante de 5% 35 de CO2. Após esse tempo, a reação foi interrompida pela adição de 50 µl de NaOH 5 N. A absorbância foi determinada em leitor de ELISA automático, com filtro de 620 nm, contra branco constituído de solução de vermelho de fenol e NaOH 5 N. Os resultados foram expressos em nanomoles de H2O2/2x105 células peritoneais/cavidade, a partir de uma curva padrão previamente estabelecida, constituída de concentrações molares conhecidas de H2O2 em tampão vermelho de fenol. Para a determinação do efeito inibitório da produção de H2O2 foram utilizadas as células do exsudato peritoneal na concentração de 2 x 106 células/mL. Após a aderência, os macrófagos foram incubados na presença de 50µL de Phorbol Myristate Acetate (PMA) (0,2µM) e 50µL das preparações fitoterápicas e homeopáticas, durante 1 hora em estufa à 37oC± 1°C com tensão constante de 5% de CO2. A produção de H2O2 foi medida espectrofotometricamente através do método de Pick e Keisari (1980) como descrito anteriormente. 3.7 Determinação da Liberação de Óxido Nítrico O óxido nítrico foi quantificado pelo acúmulo de nitrito (NO2 -) em meio de cultura, medido espectrofotometricamente usando o reagente de Griess (GREEN et al., 1982), composto por dicloro N-(1-Naftil)-etilenodiamino (Merck), sulfanilamida (Merck) e ácido ortofosfórico (Mallinckrodt Chemical). Da suspensão de células do exsudato peritoneal ajustada a 5x106 células/ml de RPMI – 1640-C, foram retirados 100µl e acondicionados em placa estéril de fundo plano com 96 cavidades (Corning, Inc.). A seguir foram acrescentados 100µl das preparações medicamentosas de Arnica montana L. a serem 36 testadas. Em outras cavidades foram adicionados 100µl da solução de lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli sorotipo 0111:B4 a 10µg/ml (Sigma) como controle positivo, ou 100µl de meio RPMI-1640-C como controle negativo. A placa foi incubada em estufa (Forma Scientific, Inc.) a 37 0C ± 1°C com tensão constante de 5% CO2 por 24 horas. Após esse período foram transferidos 50µL de MLC para uma nova placa e adicionados 50 µL do reagente de Griess. Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, a leitura foi feita em espectrofotômetro UV/visível automático (Multiskan Ascent, Labsystems), com filtro de 540 nm. Os resultados foram expressos em micromoles de NO/5x105 células peritoneais/orifício, a partir de uma curva padrão previamente estabelecida, constituída de concentrações molares conhecidas de NaNO2 (Merck) em RPMI – 1640. Para a realização do teste de inibição da produção de NO, foram utilizadas as células do exsudato peritoneal, na concentração de 5 x 106 células/mL. Após a aderência, os macrófagos foram incubados em presença de 100µL de solução de LPS (1µg/mL) e 100µL das preparações fitoterápicas e homeopáticas. A incubação foi feita por 24 horas em estufa a 37oC ± 1°C com tensão constante de 5% de CO2. A produção de NO foi medida espectrofotometricamente através do acúmulo de nitrito no meio de cultura com a utilização do reagente de Griess de acordo como descrito anteriormente. 37 3.8 Determinação da liberação de citocinas A partir das suspensões de células peritoneais e esplênicas ajustadas a 5x106 células/ml, obtidas conforme itens 3.3 e 3.7, foram distribuídas alíquotas de 1,0 mL em placas de cultura de tecidos de 24 cavidades e adicionado 34 µl de cada preparação medicamentosa ou do controle positivo (LPS a 10 µl/mL ou ConA a 0,5 µg/mL) ou ainda de meio de cultura como controle negativo. As placas foram incubadas em estufa (Forma Scientific, Inc.) a 37 0C com tensão constante de 5% CO2 por 24 horas. Após esse período, as placas sofreram centrifugação refrigerada (Hettich, Inc.) a 4°C por 10 min a 4000 rpm. Os sobrenadantes obtidos foram aliquotados em ependorffs e armazenados em frezzer - 80°C para posterior dosagens das citocinas. As citocinas IFN-γ e IL-4 foram quantificadas nos sobrenadantes das culturas de células esplênicas e as citocinas TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-12 (p-40) foram quantificadas nos sobrenadantes das culturas de células peritoneais, através do teste imunoenzimático ELISA (Kit DuoSet®, R&D Systems) de captura para cada citocina. As placas de 96 cavidades (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, Va) foram adsorvidas com um anticorpo de captura monoclonal, obtido de rato, anti-citocina de camundongo, na concentração adequada para cada citocina em solução salina tamponada de fosfatos, pH 7,2 (PBS) (100 µl/cavidade) e incubadas “overnight” à temperatura ambiente. Após este período as placas foram lavadas com solução salina tamponada de fosfatos, pH 7,2 contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T) e bloqueadas com 300 µl/cavidade de soro albumina bovina (BSA) a 1% em PBS (PBS/BSA), à temperatura ambiente por 60 minutos e lavadas 3 vezes com PBS-T. Após lavagem foram adicionados 100 µL do padrão de 38 citocinas ou dos sobrenadantes das culturas de células a serem testados. As placas foram incubadas à temperatura ambiente novamente por 120 minutos, lavadas 3 vezes com PBS- T. Em seguida, foram adicionados 100 µl do anticorpo monoclonal anti-citocina de camundongo marcado com biotina (1,5 µg/cavidade; Phar Mingen) diluído à concentração adequada para cada citocina em diluente de reagente (1% BSA, 0,05% tween 20 em PBS, pH 7,2). As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 120 minutos e lavadas 3 vezes com PBS-T e adicionados 100 µl/cavidade do conjugado peroxidase-estreptavidina diluído 1/200 em diluente reagente e as placas foram incubadas novamente à temperatura ambiente por 20 minutos. Após este tempo as placas foram então lavadas 3 vezes com PBS- T e em seguida foi adicionado 100µl do substrato (tetrametilbenzidina a 0,4 mM em tampão fosfato cítrico 10 mM, pH 5,5 e 1,2 mM de H2O2) a cada cavidade. A reação foi interrompida adicionando-se 50µl de H2SO4 2N em cada cavidade. A absorbância foi lida a 450nm em espectrfotômetro UV/visível para microplacas (Multiskan Ascent, Labsystems), e as concentrações das citocinas foram quantificadas utilizando-se uma curva padrão previamente estabelecida com quantidades conhecidas dos padrões de cada citocina, obtendo os resultados em pg/mL. 39 3.9 Análise estatística Todos os resultados obtidos nesse estudo foram submetidos à análise estatística. Para a análise neste trabalho, utilizou-se média de cinco animais divididos em experimentos independentes. O programa estatístico Microcal Origin 5.0 foi utilizado através do teste-t de Student para amostras não paramétricas em todos os testes, considerando o nível de significância de 5% (α=0,05) para pesquisas biológicas, ou seja, as diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. Os resultados foram expressos como média±desvio padrão de no mínimo cinco experimentos realizados em triplicatas para a análise da produção de todas as citocinas e compostos reativos. 40 IV - RESULTADOS 41 4.1 Determinação da viabilidade celular A determinação da viabilidade celular foi realizada em células do exsudato peritoneal de camundongos. As células foram mantidas em cultivo por 24 horas em meio de cultura RPMI-1640C. Os resultados obtidos foram expressos em percentual de viabilidade como média ± desvio padrão de 5 animais. A Figura 6 mostra que as três primeiras diluições da tintura-mãe de Arnica montana L. AM1, AM2 e AM3 apresentam elevada citotoxicidade, apresentando índices baixos de viabilidade celular quando comparadas ao controle negativo de meio RPMI- 1640C (100%). A porcentagem de viabilidade dos macrófagos em contato com a tintura- mãe de Arnica montana L. (AM1) foi de apenas 5%; as diluições seguintes AM2 (1:2) e AM3 (1:10) ainda apresentaram citotocixidade, onde 8% e 29% dos macrófagos permaneceram viáveis na presença dessas diluições, respectivamente. Enquanto que as demais preparações fitoterápicas AM4 (1:100), AM5 (1:104), AM6 (1:106), AM7 (1:1012), AM8 (1:1024) e AM9 (1:1060) obtiveram índices entre 69% a 98% de viabilidade. Entretanto, todas as preparações homeopáticas apresentaram índices altos de viabilidade, todos superiores a 96% como mostrados na Figura 7. 42 0 25 50 75 100 125 A M 1 A M 2 A M 3 A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 R P M I V ia bi li da de c el ul ar ( % ) Figura 6 – Viabilidade das células do exsudato peritoneal de camundongos Swiss frente às preparações fitoterápicas de Arnica montana L. As células do exsudato peritoneal foram cultivadas em presença das diluições (AM1, AM2, AM3, AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) provenientes da tintura-mãe de Arnica montana. RPMI equivale a 100% de viabilidade. Os valores obtidos referem-se a 5 experimentos realizados em triplicata e expressos em percentual (%) como média ± desvio padrão. *p<0,05 comparado com o RPMI. 0 25 50 75 100 125 6 C H 12 C H 30 C H L P S So l. H id ro al . R P M I V ia bi li da de c el ul ar ( % ) Figura 7 - Viabilidade das células do exsudato peritoneal de camundongos Swiss frente às preparações homeopáticas de Arnica montana. As células do exsudato peritoneal foram cultivadas em presença das preparações homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) provenientes da tintura-mãe de Arnica montana L., ou na presença de LPS, bem como do meio RPMI contendo 5% de álcool etílico. Os valores obtidos referem-se a 5 experimentos realizados em triplicata e expressos em percentual (%) como média ± desvio padrão. *p<0,05 comparado com RPMI. * * * * * ** 43 4.2 Determinação de H2O2 A determinação da liberação de peróxido de hidrogênio H2O2 foi realizada em sobrenadantes obtidos da cultura de células do exsudato peritoneal, após 1 h de incubação com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana L., onde o controle negativo é constituído por solução de vermelho de fenol e o controle positivo por zymosan a 10µg/ml. Embora o peróxido de hidrogênio (H2O2) proveniente da explosão oxidativa mitocondrial dos macrófagos realize papel fundamental na atividade bacteriana destas células; as células do exsudato peritoneal dos camundongos Swiss em contato com as preparações fitoterápicas e homeopáticas não apresentaram capacidade de produção de H2O2 quando comparado ao zymosan (157,63 ± 12,91), dados mostrados na Figura 8. A Figura 9 também mostra que nenhuma das preparações fitoterápicas e homeopáticas exerceram influência na produção do peróxido de hidrogênio induzido pelo PMA. Foram calculadas as porcentagens de inibição, através de comparação com o controle positivo, nos experimentos onde as preparações fitoterápicas e homeopáticas apresentaram efeitos inibitórios sobre a produção de H2O2. A equação abaixo foi utilizada para o cálculo: % inibição = 100 – (A . 100/B), onde A é o valor obtido pela preparação teste e B representa o valor obtido pelo controle positivo da reação. 44 0 50 100 150 200 Z M C N A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 6 C H 12 C H 30 C H C on ce nt ra çã o de H 2O 2 (n m ol s/ 2x 10 c él ul as ) ------------fitoterápica------- --homeopática- Figura 8- Produção de peróxido de hidrogênio por células do exsudato peritoneal cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação. Como controle positivo usou-se zymosan (ZM a 10µg/ml). A concentração de H2O2 foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em nmols como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. p<0,05 comparado ao ZM. 0 10 20 30 40 50 P M A C N A M 4 + P M A A M 5 + P M A A M 6 + P M A A M 7 + P M A A M 8 + P M A A M 9 + P M A 6 C H + P M A 12 C H + P M A 30 C H + P M A C on ce nt ra çã o de H 2O 2 (n m ol s/ 2x 10 cé lu la s) --------fitoterápica-------- --homeopática- Figura 9- Verificação do efeito inibitório da produção de peróxido de hidrogênio por células do exsudato peritoneal cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação. Como controle positivo usou-se o PMA 0,2µM. A concentração de H2O2 foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em nmols como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos p<0,05 comparado ao PMA. 45 4.3 Determinação de NO A determinação do NO pelo reagente de Griess foi realizada em sobrenadantes obtidos da cultura de células do exsudato peritoneal com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana L., onde o controle negativo é constituído por meio RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da reação. Das preparações fitoterápicas, apenas AM4 (32,09±0,97), AM5 (29,21±0,87) e AM6 (11,49±0,43) foram capazes de promover liberação de óxido nítrico, com valores significativos quando comparado ao LPS (67,07 ± 3,63) (Figura 10). A Figura 11 mostra que não houve liberação de NO pelas preparações homeopáticas 6CH, 12CH e 30CH, mas quando em adição ao LPS foram capazes de reduzir a produção de NO em 13,91%; 11,85%; 7,26%; respectivamente em cultura de células do exsudato peritoneal de camundongos (Tabela 1). 46 0 25 50 75 L P S C N A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 C on ce nt ra çã o de N O (m m ol s N O /5 x1 0 cé lu la s) Figura 10- Produção de óxido nítrico por células do exsudato peritoneal cultivadas com preparações fitoterápicas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação. O meio RPMI-1640-C foi usado como controle negativo da reação (CN), como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. A concentração de NO foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em µmols como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. *p<0,05 comparado ao LPS 0 25 50 75 L P S C N 6 C H 12 C H 30 C H 6 C H + L P S 12 C H + L P S 30 C H + L P S C on ce nt ra çã o de N O (m m ol s N O /5 x1 0 cé lu la s) ---------------produção---------- ---inibição--- Figura 11- Produção e inibição de óxido nítrico por células do exsudato peritoneal cultivadas com preparações homeopáticas de Arnica montana. As células peritoneais obtidas de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação com meio RPMI-1640-C, usado também como controle negativo da reação (CN). Como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. A concentração de NO foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em µmols como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. * p<0,05 comparado ao LPS * * * * * * 47 Tabela 1. Efeito inibitório das preparações homeopáticas de Arnica montana na produção de NO em cultura de macrófagos estimulados por LPS. Preparações média ± desvio padrãoa % de inibição RPMI + LPS 6CH + LPS 67,07 ±3,63 57,74 ±2,61 0 13,91% 12CH + LPS 59,12±3,25 11,85% 30CH + LPS 62,20± 2,68 7,26% ap<0,05 comparado à média ± desvio padrão de LPS (67,07±3,63) Foram calculadas as porcentagens de inibição, através de comparação com os controles, nos experimentos onde as preparações homeopáticas apresentaram efeitos inibitórios sobre a produção de NO. A equação abaixo foi utilizada para o cálculo: % inibição = 100 – (A . 100/B), onde A é o valor obtido pela preparação teste e B representa o valor obtido pelo controle positivo da reação. 4.4 Determinação de TNF-α 48 A determinação do Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) foi realizada em sobrenadantes obtidos da cultura de células do exsudato peritoneal com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana; onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da reação. Das preparações fitoterápicas, apenas AM4 (53,50±5,17), AM5 (49,97±6,05) e AM6 (44,82±3,88) foram capazes de promover liberação de TNF-α, com valores significativos quando comparado ao LPS (172,48 ± 5,59), conforme mostrado na Figura 12. A Figura 13 mostra que houve baixa liberação de TNF-α pelas preparações homeopáticas 6CH (11,09 ±0,83), 12CH (9,87±0,96) e 30CH (9,22± 0,78), mas quando em adição ao LPS foram capazes de reduzir a produção de TNF-α em cultura de células do exsudato peritoneal de camundongos (Tabela 2). 49 0 50 100 150 200 250 L P S C N A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 C on ce nt ra çã o de T N F (p g/ m L ) Figura 12- Produção de TNF-α por células do exsudato peritoneal cultivadas com preparações fitoterápicas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação com meio RPMI-1640-C, usado também como controle negativo da reação (CN). Como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. A concentração de TNF-α foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. *p<0,05 comparado ao LPS 0 50 100 150 200 250 L P S C N 6 C H 12 C H 30 C H 6 C H + L P S 12 C H + L P S 30 C H + L P S C on ce nt ra çã o de T N F (p g/ m L ) -----------------produção---------- -----inibição--- Figura 13- Produção de TNF-α por células do exsudato peritoneal cultivadas com preparações homeopáticas de Arnica montana L. As células peritoneais obtidas de camundongos Swiss foram cultivadas em placas de microtitulação com meio RPMI- 1640-C, usado também como controle negativo da reação (CN). Como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. A concentração de TNF-α foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. *p<0,05 comparado ao LPS (159,62 ± 5,59) * * * * * * 50 Tabela 2. Efeito inibitório das preparações homeopáticas de Arnica montana na produção de TNF-α em cultura de macrófagos estimulados por LPS. Preparações média ± desvio padrão % de inibição RPMI + LPS 159,62 ± 5,59 0 6CH + LPS 131,33 ±7,64a 17,70b 12CH + LPS 127,48±6,21a 20,10 b 30CH + LPS 132,76± 7,90a 16,80 b ap<0,05 comparado à média ± desvio padrão de RPMI+LPS bResultado comparado aos valores do controle positivo LPS 51 4.5 Determinação do IFN- γ A determinação de IFN-γ foi realizada nos sobrenadantes das culturas de células esplênicas de camundongos Swiss com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana; onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e ConA 0,5µg/ml como controle positivo da reação. Das preparações fitoterápicas, apenas AM4 (4,88±0,86), AM5 (3,74±1,35) e AM6 (1,68±0,61) foram capazes de promover liberação de IFN-γ. As preparações homeopáticas 6CH (1,39 ±0,93), 12CH (1,30±0,62) e 30CH (2,79± 0,58) também promoveram pequena liberação de IFN-γ, com valores significativos quando comparado a ConA 0,5µg/ml (10,53 ± 1,41), dados mostrados na Figura 14. 0 5 10 15 C on A C N A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 6 C H 12 C H 30 C H C on ce nt ra çã o de I F N -g (p g/ m L ) --------fitoterápica-------- --homeopática- Figura 14- Produção de interferon gama (IFN-γ) por células esplênicas cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana L. As células esplênicas foram obtidas de camundongos Swiss e cultivadas em placas de microtitulação com meio RPMI-1640-C, usado também como controle negativo da reação. Como controle positivo usou-se ConA a 0,5µg/ml. A concentração de IFN-γ foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. *(p<0,05 comparado com ConA) * * * * * * 52 4.6 Determinação da IL-4 A determinação de IL-4 foi realizada nos sobrenadantes das culturas de células esplênicas de camundongos Swiss com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana L.; onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e ConA 0,5µg/ml como controle positivo da reação. Conforme Figura 15, o contato com as preparações fitoterápicas e homeopáticas não induziu a liberação de IL-4. 0 3 6 9 12 C on A C N A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 6C H 12 C H 30 C H C on ce nt ra çã o IL -4 ( pg /m L ) --------fitoterápica-------- --homeopática- Figura 15- Produção de interleucina-4 por células esplênicas cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana. As células esplênicas foram obtidas de camundongos Swiss e cultivadas em placas de microtitulação com meio RPMI-1640-C, usado também como controle negativo da reação (CN). Como controle positivo usou-se ConA a 0,5µg/ml. A concentração de IFN-γ foi obtida através de uma reta padrão previamente estabelecida. Os resultados foram expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. *p<0,05 comparado com ConA 53 4.7 Determinação de IL-6 A determinação de IL-6 foi realizada nos sobrenadantes das culturas de células peritoneais aderentes com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana L.; onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da reação. Das preparações fitoterápicas, apenas AM4 (209,74±86,12), AM5 (162,36±39,86), AM6 (87,94±43,00) e AM7 (69,74±31,26) foram capazes de promover liberação de IL-6. As preparações homeopáticas 6CH (51,16 ±16,79), 12CH (52,44±17,38) e 30CH (48,23± 14,04) também promoveram a liberação de IL-6, quando comparado a LPS 10µg/ml (428,12 ± 81,82), dados mostrados na Figura 16. 0 120 240 360 480 600 L P S C N A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 6 C H 12 C H 30 C H C on ce nt ra çã o de I L -6 (p g/ m L ) --------fitoterápica-------- --homeopática- Figura 16- Produção de IL-6 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana. As células peritoneais foram obtidas de camundongos Swiss. O meio RPMI-1640-C foi usado como controle negativo da reação (CN) e como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. Os resultados foram expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. *p<0,05 comparado com LPS 54 4.8 Determinação de IL-1 A determinação de IL-1 foi realizada nos sobrenadantes das culturas de células peritoneais aderentes com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana L.; onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da reação. Nenhuma das preparações testadas é capaz de promover a liberação de IL-1 (Figura 17). 0 50 100 150 200 L P S C N A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 6C H 12 C H 30 C HC on ce nt ra çã o IL -1 ( pg /m L ) --------fitoterápica-------- --homeopática- Figura 17- Produção de IL-1 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana. As células peritoneais foram obtidas de camundongos Swiss. O meio RPMI-1640-C foi usado como controle negativo da reação (CN) e como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. Os resultados foram expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. *p<0,05 comparado com LPS 55 4.9 Determinação de IL-12 A determinação de IL-12 foi realizada nos sobrenadantes das culturas de células peritoneais aderentes com as preparações fitoterápicas (AM4, AM5, AM6, AM7, AM8 e AM9) e homeopáticas (6CH, 12CH e 30CH) obtidas de Arnica montana; onde o controle é constituído por meio RPMI-1640C e LPS 10µg/ml como controle positivo da reação. Nenhuma das preparações testadas foi capaz de promover a liberação de IL-12 (Figura 18). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 L P S C N A M 4 A M 5 A M 6 A M 7 A M 8 A M 9 6C H 12 C H 30 C H C on ce nt ra çã o IL -1 2( pg /m L ) Figura 18- Produção de IL-12 por células do exsudato peritoneal (PEC) cultivadas com preparações fitoterápicas e homeopáticas de Arnica montana. As células peritoneais foram obtidas de camundongos Swiss. O meio RPMI-1640-C foi usado como controle negativo da reação (CN) e como controle positivo usou-se LPS a 10µg/ml. Os resultados foram expressos em pg/mL como a média ± desvio padrão de triplicata de cinco experimentos. *p<0,05 comparado com LPS 56 V - DISCUSSÃO 57 A pesquisa laboratorial com medicamentos homeopáticos é muito escassa e enfrenta ainda questionamentos sobre a metodologia aplicada. O uso de modelos com plantas ou animais permite a observação de respostas diretas, as quais eliminam a subjetividade em relação ao efeito placebo, sendo esta a principal crítica aos estudos com humanos (HAMMAN, 2003). O emprego de plantas medicinais de ação supostamente inofensiva à saúde pode muitas vezes ser responsável por resultados desastrosos, já que, ocasionalmente, uma mesma planta pode apresentar tanto uma ação terapêutica quanto tóxica, conforme dose e modo de preparo (ANKE et al., 2004). O não cumprimento dos limites de uso dos fitoterápicos representa cada vez mais um risco para a saúde humana. Estudos multidisciplinares, associando fitoquímicos e farmacológicos, tornam-se cada vez mais importantes para a definição dos potenciais terapêuticos e tóxicos de extratos vegetais (MACIEL et al., 2002). A ativação de macrófagos e células T por estresse oxidativo e a secreção de citocinas pró-inflamatórias contribuem significativamente para a progressão da ativação do sistema imunitário e inflamação (HULLAN et al., 2003). A resposta inflamatória consiste da liberação seqüencial de mediadores e do recrutamento de leucócitos circulantes (HANADA, 2002). Durante o processo inflamatório as células apresentadoras de antígenos como macrófagos e células dendríticas exercem um papel principal nos mecanismos pró- inflamatórios, garantindo a eliminação da causa infectiva, tóxica ou alérgica, sendo muito importante para a homeostase e integridade do tecido (GOERDT, 1999). 58 No entanto, é obrigatório que o processo inflamatório, uma vez induzido, não aumente progressivamente, mas sim, seja regulado e diminuído para permitir a cura. A ação descontrolada de enzimas proteolíticas e o processamento de mediadores químicos e radicais livres podem agravar a situação em alguns casos. Há muito tempo que pesquisas sobre a biologia da inflamação têm sido focadas sobre ações pró-inflamatórias de fagócitos mononucleares, incluindo processamento e apresentação de antígeno e secreção de citocinas (GOERDT, 2004). Os ensaios de citotoxicidade medem a concentração de substâncias capazes de interagir com estruturas e vias bioquímicas celulares que podem ter algum reflexo in vivo. Nesse trabalho, determinou-se a viabilidade dos macrófagos peritoneais após contato com as preparações de Arnica montana L. A definição da viabilidade celular, nos ensaios realizados, tem como conseqüência assegurar a capacidade de uma resposta imune-celular. Entre as preparações testadas, utilizando 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- brometo de difenil-tetrazólio (MTT), as que apresentaram maior potencial de toxicidade, ou seja, menor porcentagem de viabilidade celular foram a tintura-mãe AM1 (5%) e as menores diluições estudadas AM2 (8%) e AM3 (29%) (Figura 6). Esta metodologia é baseada na redução de um sal de tetrazólio amarelo solúvel por enzimas microssomais e também pela enzima succinato desidrogenase mitocondrial das células viáveis. Essa redução gera a formazana, um produto insolúvel de cor púrpura que se acumula nas células devido à sua incapacidade de atravessar a membrana celular (MOSMANN, 1983). Esse dado é justificado na literatura pela presença de compostos como lactonas sesquiterpênicas (helenalina), que possuem conhecida atividade alergizante e tóxica conferida pela dupla ligação no núcleo β-lactona de helenalina (CAPASSO et al., 59 2000; SIEDLE, 2003; JOHANSSON, 2002), óleos esssencias, taninos e alcalóides pirrolizidínicos (tusilagina, isotusilagina) com conhecida ação citotóxica e carcinogênica (MARTINS et al, 2000; AGRAWAL, 1985), são responsáveis por causarem dermatite de contato, hepatotoxicidade, irritação gastrintestinal (SIMÕES et al., 1986), dispnéia e falha cardíaca (a helenalina apresenta efeito inotrópico por ação simpaticomimética indireta) (PERIS et al., 1995). Diversas substâncias isoladas de vegetais considerados medicinais possuem atividades citotóxica ou genotóxica e mostram relação com a incidência de tumores (AMES, 1983). Estudos farmacológicos mostraram que os diterpenos transformados pelo citocromo P450 em metabólitos hepatotóxicos, podem causar apoptose em hepatócitos de ratos pela captura de tióis e aumento da concentração de cálcio, com ativação das enzimas transglutaminase e endonuclease dependentes de cálcio (FAU et al., 1997). Como exemplo de planta que contém substâncias com conhecidos efeitos tóxicos pode ser citada o confrei (Symphytum officinale L.), utilizada na medicina tradicional como cicatrizante, devido à presença da alantoína, mas também possui alcalóides pirrolizidínicos os quais são comprovadamente hepatotóxicos e carcinogênicos (BUCKEL, 1998). A arruda (Ruta graveolens L.), que pode provocar aborto, fortes hemorragias, irritação da mucosa bucal e inflamações epidérmicas, é outro importante exemplo. Estudos também apontam um possível efeito adverso abortivo da espinheira-santa (Maytenus ilicifolia L.), planta medicinal de comprovada baixa toxicidade e ação anti- ulcerogênica, antiinflamatória e antinoniceptiva (OLIVEIRA, 1991). 60 Com relação à determinação de viabilidade celular com as preparações homeopáticas, foi observado um perfil não citotóxico (Figura 7), como pressuposto por essas preparações derivarem de diluições infinitesimais, sendo esta a intenção original de Hahnemann: usar o processo de diluição para reduzir os efeitos tóxicos dos medicamentos (JONAS, 1996). Assim, o tratamento homeopático permite ao indivíduo restabelecer a saúde e prevenir a doença sem, no entanto, produzir os efeitos colaterais experimentados por muitos dos tratamentos convencionais (ULLMAN, 1995). Vários estudos utilizando culturas de macrófagos peritoneais frente a produtos naturais como Davilla elliptica St. Hill. (CARLOS et al., 2005), Echinacea purpurea N. (BURGER et al., 1997), Platycodon grandiflorum H. (CHUL et al., 2001), Panax ginseng L. (SONG et al., 2002), demonstraram eficácia quanto à capacidade de resposta dessa célula. O macrófago é uma célula que se encontra presente em todos os tecidos do organismo e apresenta funções importantes no sistema imunológico. A ingestão de partículas estranhas e seu processamento levam à ativação do sistema imunológico através da apresentação de antígenos aos linfócitos (outra célula de grande importância na resposta imunológica), da secreção de substâncias (como citocinas e quimiocinas) capazes de regular o sistema imunológico e da elaboração de substâncias capazes de destruir outras células e organismos (ABBAS et al., 2000). Nosso estudo investigou o efeito de Arnica montana L. em preparações fitoterápicas e homeopáticas de acordo com o grau de citotoxicidade de todas as preparações testadas. Nesse sentido foram utilizadas as diluições AM4, AM5, AM6, AM7, AM8, AM9 e as homeopáticas 6CH, 12CH e 30CH para verificar os efeitos sobre as células 61 mediadoras da resposta imunológica, macrófagos e linfócitos, através da determinação da liberação de H2O2, NO, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-1e IL-12. O sistema imunológico é um considerável mecanismo de defesa no organismo. Seu papel não é apenas o de proteger contra infecções microbianas, mas também atua na prevenção do câncer, inibindo o crescimento de células tumorais (HUANG, 1999). Os macrófagos ativados são capazes de secretar mais de cem produtos biologicamente ativos, dentre eles enzimas, componentes do complemento, fatores de coagulação, espécies reativas de nitrogênio como o NO, citocinas, etc (PARSLOW et al., 2000). Entre os produtos secretados pelos macrófagos, estão os reativos intermediários do oxigênio e nitrogênio (ZWILLING E EISENSTEIN, 1994). Espécies reativas do oxigênio podem ter papéis diferentes na célula, dependendo de suas concentrações relativas e também do acesso aos sítios celulares (RAMASARMA, 1990). Um severo “stress” oxidativo está associado com disfunções celulares, resultando na ativação de mecanismos de reparo, apoptose e até necrose das células (FORMAN e TORRES, 2001). A determinação de H2O2 liberado nos sobrenadantes das culturas de células do exsudato peritoneal baseou-se na oxidação do vermelho de fenol mediado pela peroxidase de raiz forte. As principais vantagens desse método são as pequenas quantidades de reagentes e células utilizados, a sensibilidade e reprodutibilidade, o grande número de materiais possíveis de serem testados e especialmente a velocidade e conveniência oferecida pelo leitor de ELISA automático. 62 A enzima NADPH oxidase presente na membrana plasmática e responsável pela conversão do oxigênio (O2) ao ânion superóxido (O2. -) e depois a H2O2 pela SOD (HAMPTON et al., 1998), pode ser rapidamente ativada por estímulos como os agonistas que interagem com receptores específicos na superfície celular de macrófagos, como partículas opsonizadas, cadeias de peptídeos de microrganismos (zymosan) e também pode ser ativada pelos agonistas de proteína quinase C como o PMA (“phorbol myristate acetate”). Os ensaios imunológicos realizados neste trabalho mostraram a não produção de H2O2 quando comparada ao controle positivo da reação (zymosan) para as preparações fitoterápicas e homeopáticas (Figura 8). Este estudo também mostrou que nenhuma das preparações teve ação na produção ou inibição do peróxido de hidrogênio induzida pelo PMA (Figura 9). O H2O2 é gerado em condições fisiológicas, em pequenas quantidades e é rapidamente utilizado ou degradado, mas longas exposições a altas concentrações deste mediador podem destruir estruturas biológicas e levar a um dano celular irreversível. O H2O2 é tóxico para as células e é também responsável pela morte das bactérias fagocitadas (RAMASARMA, 1990). Estudos mostram que o H2O2 suprime a resposta imunológica, levando à atividade imunossupressora de linfócitos esplênicos de ratos quando induzidos por LPS (LEE & YEA, 2000). Por outro lado, Nascimento et al. (1998) verificaram que a atividade antitumoral de macrófagos não depende da liberação de H2O2. Estudos sobre a ativação de macrófagos peritoneais pela determinação da liberação de H2O2 frente a diversos produtos naturais obtidos de plantas como Paepalanthus sp (MOREIRA el al., 2000), Styrax 63 camporum Pohl (MARQUES, 2003), Alchornea ssp (BARROS, 2004), Davilla elíptica St. Hill (CARLOS, 2005) são cada vez mais freqüentes e categorizados como potentes agentes moduladores da resposta imunológica. A ativação de macrófagos é acompanhada pelo aumento de diversas propriedades, como aumento da capacidade de aderência, fagocitose e produção de compostos reativos e citocinas (SELIGMANN, 2003), o que lhes confere poder microbicida e tumoricida (BASU, 2006). Macrófagos podem executar esta função de uma maneira direta, envolvendo a liberação de produtos como radicais de oxigênio e nitrogênio e TNF-α que são prejudiciais aos microrganismos e para células tumorais. Ou ainda, eles podem ter uma ação indireta nestas atividades pela secreção de citocinas, as quais sinalizam outras células como os linfócitos T, ou por processamento e apresentação de antígenos, regulando o sistema imunológico e envolvendo-se no processo infeccioso, na modulação da resposta imune e na inflamação (HONG et al., 2005). O NO é uma molécula mensageira envolvida na regulação de diversos processos fisiológicos, incluindo a contração da musculatura lisa, a reatividade plaquetária, a neurotransmissão central e periférica e as ações citotóxicas de células imunológicas. Essa molécula é crucial para muitas funções fisiológicas e a sua liberação inapropriada está ligada a numerosas patologias (HOBBS et al., 1999). Embora a produção e ação do NO sejam evidentes durante o processo inflamatório, a rede de seus efeitos é ainda parcialmente conhecida. Sabe-se que o tempo da sua síntese em resposta a diversos estímulos, bem como os níveis de sua produção, seu estado de oxidação e a presença ou não de certos mediadores definem um efeito citotóxico pró-inflamatório ou antiinflamatório (ROTTERBERG & ÖRN, 1997). 64 A determinação de NO foi realizada nesse trabalho, segundo a capacidade que o NO tem de sofrer rápida degradação oxidativa em solução aquosa, formando nitrito (NO2 -), que é determinado pelo reagente de Griess. A reação acontece primeiramente com a sulfanilamida (reação de diazotização) em meio ácido, formando um composto que reage com o naphtiletilenodiamino, formando em seguida um derivado azo colorido prontamente monitorado em espectroscopia de UV/Visível com absorbância máxima em 548nm a pH 2.0. O meio ácido favorece a reação de diazotização, melhorando o rendimento na leitura espectrofotométrica (MALINSKI, 1996). Os resultados obtidos nesse trabalho (Figura 10) mostram que as preparações fitoterápicas AM4, AM5 e AM6 foram capazes de promover a liberação de NO em cultura de macrófagos peritoneais, resultado este não obtido pelas preparações homeopáticas. Portanto foi verificada a presença de inibição das mesmas em presença de LPS (Figura 11). As preparações fitoterápicas e homeopáticas notoriamente atuam de maneira diferente, enquanto que a primeira estimula, a segunda inibe. Portanto, na estimulação de macrófagos por essas diferentes preparações de arnica nota-se que as preparações homeopáticas agem exatamente ao contrário das preparações fitoterápicas (mas de acordo com o seu princípio de similitude), reduzindo, mesmo que discretamente, níveis altos de NO produzido pela estimulação do LPS. Segundo este princípio, uma droga atua de forma terapêutica quando produz em uma pessoa saudável, sintomas semelhantes aos de uma pessoa doente. Assim, uma pessoa intoxicada com arsênico, por exemplo, pode ser tratada com arsenicum, preparação homeopática derivada de diluições deste mesmo mineral (BOERICKE, 1997). 65 O objetivo da homeopatia é estimular os mecanismos de cura do próprio corpo. A meta da terapia homeopática é promover e orientar a reação de autocura inata do corpo. Os remédios não são dados para eliminar a causa de uma doença ou para vencer um determinado agente patológico. Não é o medicamento em si que cura a doença, mas a reação dos mecanismos de cura do corpo ao medicamento que leva à melhora. Portanto, agentes que modulem a atividade do NO podem ser de considerável valor terapêutico. Em particular aqueles capazes de reduzir a formação de NO, podem ser benéficos em estados patofisiológicos onde a produção excessiva de NO é um fator contribuinte, como é o caso das doenças inflamatórias (HOBBS et al., 1999). O conhecimento existente do papel do NO nos estados fisiológicos e patofisiológicos abriu uma gama de possibilidades, especialmente no entendimento dos mecanismos de ação de medicamentos que modulam a ação desse mediador. A ativação da iNOS leva à produção de níveis micromolares de NO, quantidade muito maior do que o nível nanomolar gerado pela enzima constitutiva eNOS ou nNOS (ACHIKE e KWAN, 2003). Grande atenção tem sido dada à molécula de óxido nítrico atualmente, sendo que vários experimentos utilizando extratos, frações ou substâncias puras obtidas de plantas mostraram interferir com a produção de óxido nítrico. O extrato padronizado de Gingko biloba L. (EGb 761) inibiu a produção de NO e a expressão da iNOS em macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS e IFN-γ (KOBUCHI et al., 1997). Alicina e ajoeno, dois composto obtidos do alho (Allium sativum L.) inibiram a produção de NO e a expressão da iNOS em macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS (DIRSCH et al., 1998; PAN, 2000). 66 Resultados de diversos experimentos indicam a possibilidade de que a produção de NO em excesso diminui a expressão da proteína iNOS para prevenir autotoxicidade celular. Um possível mecanismo para esse “feedback” inibitório da síntese da proteína iNOS pelo NO pode ser atribuído a fosforilação mediada por NO de uma molécula regulatória chave na maquinaria transducional, o NF-κB (HAN et al,2001). Os flavonóides como o picnogenol extraído da Pinus maritma apresentam efeitos biológicos na modulação da síntese de iNOS ou mesmo de espécies reativas de nitrogênio (PAKER et al, 1999). De forma semelhante os flavonóides presentes em Silybum marianum L. são capazes de ativar uma resposta inflamatória, mas promovem supressão da função dos linfócitos T quando baixas doses são administradas em camundongos (JOHNSON et al., 2003). Diterpenóides de Sideritis javalambrensis foram isolados por Heras & Hoult (1994), que atribuíram a esses compostos a propriedade antiinflamatória e gastroprotetora desta planta utilizada tradicionalmente na Espanha. Em trabalho semelhante, o extrato aquoso de Spiraea prunifolia, largamente usado na medicina chinesa, também apresentou a capacidade de promover um efeito inibitório sobre a síntese de NO (HONG-SEOB el al., 1999). Outros estudos mostram que extratos obtidos de Polygonum tinctorium Aiton são capazes de inibir a síntese de NO em macrófagos peritoneais murinos (ISHIHARA et al., 2000). Resultados semelhantes foram obtidos por Kim et al. (2001), onde compostos extraídos de Scutellaria baicalensis N. apresentaram efeitos antiinflamatórios também por inibir a produção de NO e prostaglandina E2 em macrófagos. A inibição da produção de NO foi acompanhada pela supressão da iNOS. 67 O produto natural epigallocatequina gallate, obtido do chá verde com atividade antiinflamatória, antioxidativa e anticarcinogênica tem se mostrado um eficiente inibidor da expressão do gene de iNOS (CHAN et al. 1997). Da mesma maneira alguns efeitos antiinflamatórios dos extratos do fruto de Evodia rutaecarpa Hook foram examinados por Chiou et al. (1997) através da produção de NO em macrófagos murinos, cujos resultados indicaram uma inibição na produção de NO mesmo em presença de IFN-γ e LPS, que são considerados potentes ativadores dessa molécula, indicando assim uma interferência na síntese da iNOS. Atualmente, existe uma forte tendência em se estudar compostos naturais que possam participar na modulação do sistema imunológico, demonstrado pela liberação de mediadores por macrófagos. Diferentes classes de substâncias têm sido relatadas como sendo agentes imunoestimulantes. Outro dado aqui obtido, mostra a liberação de TNF-α por macrófagos peritoneais induzidos pelas preparações fitoterápicas de Arnica montana L. AM4, AM5 e AM6; as mesmas responsáveis pela liberação de NO (Figura 12). Assim, observa-se uma relação entre as sínteses de NO e TNF-α. Pois o aumento da produção de NO se deve, entre outros fatores, à indução de mediadores pró-inflamatórios como TNF-α. Por outro lado, as preparações homeopáticas, apesar de não promoverem a liberação de NO, conseguiram influenciar na produção de TNF-α, liberando baixas concentrações deste mediador e, quando em associação ao LPS, diminuíram sua produção estabelecida por esse agente estimulante, portanto inibindo-o (Figura 13). Deste modo, as preparações homeopáticas podem atuar no equilíbrio da produção de TNF-α. E como já detalhado anteriormente, as 68 preparações homeopáticas apresentam características que divergem do mecanismo de ação farmacológica de um fitoterápico. No início da cascata de ativação, duas quinases conhecidas como IκKα e IκKβ são ativadas para formar um dímero (IκK) que fosforila uma proteína inibidora conhecida como IκB. Essa proteína está ligada em um complexo no citosol, com o fator de transcrição NFκB e inibe sua ação, retendo-o naquele local. Quando o dímero IκB é fosforilado, ele dissocia-se do complexo e é rapidamente degradado por proteossomas. Após a remoção de IκB, o NFκB entra no núcleo e liga-se a vários promotores, ativando genes que contribuem para a imunidade adaptativa e para a secreção de citocinas pró- inflamatórias. O próprio gene para o IκB também é ativado, sendo rapidamente sintetizado, inativando o sinal NFκB (JANEWAY et al., 2000). Isso explica porque muitos genes que respondem a ativações por LPS, incluindo TNF-α, compartilham seqüências gênicas reconhecidas por NFκB para a ativação da expressão de algum outro gene como o da iNOS. Um grande número de compostos naturais parece interferir com a cascata que leva à ativação do NF-κB. O efeito de muitos extratos brutos obtidos de fontes naturais pode ser agora explicado baseando-se no fato dessas plantas conterem agentes reguladores do NF-κB, como os diterpenóides e as lactonas sesquiterpênicas. A sinalização envolvida na inibição da síntese de citocinas é complexa e existem muitas abordagens que podem efetivamente regular a expressão de TNF-α (PALLADINO et al., 2003). O efeito antiinflamatório do extrato aquoso de Lonicera japonica Thumb. foi investigado por Lee et al. (2001). Os autores verificaram inibição das sínteses de iNOS, TNF-α e NF-kappaBp65 e da degradação de l-kappaBalfa; sugerindo que esta planta possa 69 atuar como agente terapêutico em doenças inflamatórias através de uma regulação seletiva da ativação de NF-kappaB. A redução na produção de TNF-α e de NO em cultura de macrófagos tratados com curcumina, uma substância extraída da planta Curcuma longa L., foi observada por Chan et al. 1998 que atribuíram esse fato à inibição do fator de transcrição nuclear NF-kβ, através da prevenção da degradação do IκB que possui papel chave na expressão de muitos genes relacionados com a inflamação. Rao & Ghosh (1999) também atribuíram a não produção desses mediadores à inibição do mecanismo de transcrição comum aos seus genes, para isso utilizaram cultura de macrófagos murinos tratados com quercetina, o principal componente ativo da planta Rhododendron cinnabarium N. O TNF-α atua em sinergismo com o IFN-γ na ativação macrofágica, especialmente na indução de NO (JANEWAY et al, 2000). A produção de NO por macrófagos peritoneais de ratos tratados com rIFN-γ ocorreu concomitantemente com a liberação de TNF-α favorecida por Sinomenium acutum Rehder (KIM et al., 1999) e por Taraxacum officinale Weber (KIM & CHUNG 1999). Do mesmo modo, resultados condizentes foram observados em estudo do extrato de Ulmi radicis, onde os dados sugerem que a capacidade do extrato em aumentar a produção de NO em macrófagos peritoneais de ratos primeiramente tratados com IFN-γ é devido à liberação de TNF-α induzida pelo próprio extrato (KIM & LEE, 1999). Interação de proteínas de membrana com proteínas solúveis como as citocinas, anticorpos, complemento e receptores sobre as células, representam os elementos de comunicação da conversa cruzada das células do sistema imunitário (TRINCHERI, 1997). 70 O IFN-γ foi originalmente definido como um agente com ação antiviral, mas suas propriedades incluem a regulação de vários aspectos da resposta imune, como a estimulação da atividade microbicida dos macrófagos, estimulação da apresentação de antígenos pelas moléculas do complexo de histocompatibilidade principal, coordenação e as interações entre os leucócitos e o endotélio, efeitos na proliferação celular e na apoptose, bem como na estimulação e repressão de vários genes cuja significância funcional ainda permanece obscura (BOEHM et al., 1997). As citocinas presentes durante a expansão de células T influenciam na capacidade das células Th em diferenciar-se em células Th1 ou Th2 (TRINCHERI, 1997). Esta dicotomia na resposta imune pode ser classificada didaticamente em resposta celular ou humoral. A produção de citocinas como IFN-γ e IL-12 leva à resposta celular tipo Th1, enquanto a IL-4, por exemplo, leva a resposta humoral do tipo Th2 (DREDGE et al., 2002). Os macrófagos podem influenciar características Th1/Th2 da imunidade e responder a ativação das células T e B através de interação celular e produtos solúveis como IFN-γ, IL- 4 e anticorpos que regulam atividades fagocíticas e microbicidas (GORDON, 1998). O IFN-γ e IL-4 têm papéis importantes na efetivação das respostas Th1 e Th2 respectivamente, e essas citocinas possuem ainda a função de serem antagonistas uma da outra (PALUDAN et al., 1999). O desequilíbrio da resposta imune Th1/Th2 muitas vezes é responsável pelo agravamento de uma doença