Universidade Estadual Paulista “Júlio De Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Câmpus Araraquara “Aplicação da espectrofotometria de fluorescência para identificação de inibidores de proteases em plantas de Cerrado e Mata Atlântica: uma ferramenta enzimática moderna para a busca de novos hits biologicamente ativos.” Barbara Marcondes Abissi Araraquara-SP 2012 Barbara Marcondes Abissi “Aplicação da espectrofotometria de fluorescência para identificação de inibidores de proteases em plantas de Cerrado e Mata Atlântica: uma ferramenta enzimática moderna para a busca de novos hits biologicamente ativos.” Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista para obtenção do grau de Farmacêutica- Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro Co-orientador: Dr. Otavio Flausino Jr Araraquara – SP 2012 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 09 1.1 Proteases Como Modelo Farmacológico.............................................. 09 1.2 Produtos Naturais Inibidores de Proteases.......................................... 11 2. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 17 2.1 Amostras................................................................................................... 17 2.1.1 Responsáveis pelas amostras.................................................. 17 2.2 Reagentes................................................................................................. 17 2.3 Ensaio Enzimático................................................................................... 18 2.4 Protocolos experimental e análise por espectrometria de fluorescência.................................................................................................. 18 2.4.1 – Forma de análise dos resultados........................................... 18 2.5 Espectrofotômetro.............................................................................. 19 3. RESULTADOS....................................................................................................... 20 3.1 Ensaios de inibição de proteases por meio da espectrometria de fluorescência.................................................................................................. 20 3.1.1 Resultados com inibidores utilizados como padrão.............. 20 4. DISCUSSÃO.......................................................................................................... 40 5. CONCLUSÃO......................................................................................................... 45 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 46 ANEXO...................................................................................................................... 51 RESUMO O presente trabalho de conclusão de curso reporta os resultados obtidos durante o estágio de Iniciação Científica realizado no Núcleo de Biossíntese, Bioensaios e Ecofisiologia de Produtos Naturais do Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da UNESP-Araraquara. Foram realizados ensaios de triagem de substâncias naturais, semissintéticas e sintéticas com atividade inibitória sobre a protease aspártica pepsina e a protease serínica subtilisina. As amostras foram obtidas de extratos vegetais e de fungos endofíticos e foram testadas tanto substâncias puras naturais como diterpenos clerodânicos, cromenos, peptídeos e amidas bem como derivados sintéticos do ácido caféico, ferúlico, alcalóides piridínicos, entre outros resultantes das pesquisas realizadas por pesquisadores do NuBBE. Resultados mostraram que os ensaios de inibição da pepsina e da subtilisina apresentaram seletividade para os diferentes tipos de substâncias testadas. Ainda mais, foi possível observar diferenças nos resultados obtidos com os enantiômeros dos cromanos e dos cromenos. As substâncias que apresentaram maiores porcentagens de inibição foram os cromenos, os derivados do ácido cafeico, do ácido ferúlico e do ácido benzóico, as amidas, bem como os diterpenos clerodânicos. Alguns destes resultados foram publicados em revistas indexadas (Flausino et al., 2009; López et al., 2010; Oliveira et al., 2011) e outros estão sendo preparados para publicação. LISTA DE FIGURAS Figura 01 Superposição do sítio de ligação de proteases serínicas (mostrando a tríade catalítica serina (SER) – histidina (HIS) – aspartato (ASP) e seus respectivos inibidores. Subtilisina (branco) e proteinase A (laranja) em complexo com um inibidor sintético (amarelo) e com a quimostatina (vermelho)........................... 11 Figura 02 Estrutura molecular de derivados cumarínicos de ocorrência natural e do produto sintético Tipranavir (Aptivus®), produzido pela Boehringer Ingelheim, derivado da fenprocumona, um metabólito secundário acumulado em várias espécies de Angipospermae............................................................................. 13 Figura 03 Estrutura esquemática do sítio ativo da protease aspártica do vírus HIV mostrando os dois resíduos de Asp e os dois resíduos de Ile em complexo com o um inibidor benzopirano, a fenprocumona.............................................. 14 Figura 04 Estrutura do ácido rododauricromânico A isolado de Rhododendron dauricum, um cromano natural com potente atividade sobre a protease aspártica do HIV................................................................................................ 14 Figura 05 Mecanismo de ação postulado para a inativação da -quimotripsina, uma protease serínica, por derivados cumarínicos................................................ 16 Figura 06 Estrutura dos cromanos isolados de Peperomia obtusifolia testados nos ensaios de inibição de proteases aspárticas e serínicas................................... 21 Figura 07 Estrutura das substâncias isoladas de Piper gaudichandianum testadas nos ensaios de inibição de proteases aspárticas e serínicas................................... 23 Figura 08 Estrutura química geral das casearinas (10 – 12) e da caseargrewiina F (13) isoladas de Casearia sylvestris......................................................................... 25 Figura 09 Estrutura do diacetato do ácido caféico (14) e estrutura geral dos derivados ácido cafeico (15 – 22)...................................................................................... 27 Figura 10 Estrutura geral dos derivados sintéticos do ácido ferúlico testados nos ensaios de inibição de proteases...................................................................... 30 Figura 11 Estruturas químicas das amidas isoladas de Piper tuberculatum (32 – 47), testadas nos ensaios de inibição das proteases pepsina e subtilisina.............. 33 Figura 12 Estrutura do ácido benzóico (49) e seus derivados biossintetizados (i.e. geranilização) (50 – 54) a partir de extratos enzimáticos de folhas de Piper crassinervium (López et al., 2010)..................................................................... 36 Figura 13 Estruturas químicas dos derivados piridínicos sintéticos (55 – 59), testados nos ensaios de inibição de proteases................................................................ 38 LISTA DE TABELAS Tabela 01 Efeito inibitório (%) de benzopiranos utlizados como padrão sobre a atividade enzimática das proteases subtilisina e pepsina.................................................. 20 Tabela 02 Resultados (% Inibição) obtidos no ensaio de inibição de proteases com os cromanos isolados de Peperomia obtusifolia (1 - 6)........................................... 22 Tabela 03 Resultados (% Inibição) obtidos no ensaio de inibição de proteases com os cromenos isolados de Piper gaudichadianum (7 – 9)........................................ 24 Tabela 04 Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com os diterpenos clerodânicos (10 – 13) isolados de Casearia sylvestris.................... 26 Tabela 05 Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com o diacetato do ácido cafeico e com os derivados sintéticos do ácido cafeico....... 28 Tabela 06 Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com os derivados sintéticos do ácido ferúlico................................................................. 32 Tabela 07 Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com as amidas isoladas de Piper tuberculatum (32 – 47).............................................. 35 Tabela 08 Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases do ácido benzóico (49) e seus derivados biossintetizados (i.e. geranilização) (50 – 54) a partir de extratos enzimáticos de folhas de Piper crassinervium............ 37 Tabela 09 Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com os derivados piridínicos sintéticos (55 – 59). 39 9 1. INTRODUÇÃO 1.1. Proteases Como Modelo Farmacológico A subtilisina Carlsberg (SUB), também conhecida como alcalase (Tovar-Pérez et al, 2009), é uma protease serínica isolada de Baccilus licheniforme enquanto a pepsina (PEP) é uma protease aspártica que desempenha importante função no processo digestivo dos vertebrados. Ambas são objeto de várias pesquisas para seleção de novos inibidores de potencial terapêutico, estudos de mecanismo de ação, relação estrutura - atividade (REA) (Tovar-Pérez et al, 2009; Micheelsen et al., 2008; Takahashi et al., 2008; Marcinkeviciene et al., 2002) e para o desenvolvimento de novas técnicas analíticas para estudos de atividade enzimática (Hirata et al., 2003; Gomes et al., 2003). Em termos farmacológicos a SUB está relacionada a outras proteases serínicas como a do vírus do Hepatite C, a enzima conversora de angiotensina (ECA), a trombina e a elastase. A PEP, além de ser alvo de interesse farmacológico para o tratamento de doenças gástricas, pode também ser usada como ferramenta para o estudo de especificidade ligante/receptor para proteases aspárticas como a do HIV, a renina, a plasmepsina (de espécies de Plasmodium, parasita causador da malária) e a - secretase (relacionada com o desenvolvimento da Doença de Alzheimer) (Babine e Bender, 1997). A utilização da SUB e PEP como modelo farmacológico molecular para outras proteases da mesma família têm como objetivo a automatização e triagem farmacológico, facilitando a manipulação do ensaio enzimático. Adicionalmente, por serem mais estáveis podem eventualmente diminuir os custos do ensaio, pois substituem enzimas de difícil produção. Este modelo farmacológico está validado e tem 10 suporte científico na teoria da evolução convergente (Gold et al., 2007; Marcinkeviciene et al., 2002). De acordo com esta teoria, as proteases de uma mesma família (serínica ou aspártica, por exemplo) evoluem a partir de uma mesma enzima ancestral desenvolvendo suas características estruturais específicas, mas mantendo os mesmos resíduos de ácidos aminados em seu sítio catalítico (figura 1, p. 11). A partir daí as proteases podem ser divididas em subfamílias, como as “tipo-subtilisina” e “tipo-tripsina” que fazem parte da família das proteases serínicas. Além disso, estas duas famílias de proteases selecionadas para estudo no presente trabalho (serínica e aspártica) foram amplamente estudadas quanto ao mecanismo de ação de diferentes inibidores peptidomiméticos e os não-peptidomiméticos, como os derivados de benzopiranos (cromenos e cumarinas) e as piperidinas (Micheelsen et al., 2008; Moose et al., 2007; Wouters et al., 2002; Pouchet et al. 2000; Thairisvong et al., 1994). Desta forma, a relação estrutura atividade (REA) envolvendo estes dois sistemas é bastante estudada e muitos dados estão disponíveis na literatura científica. 11 Figura 1 – Superposição do sítio de ligação de proteases serínicas (mostrando a tríade catalítica serina (SER) – histidina (HIS) – aspartato (ASP) e seus respectivos inibidores. Subtilisina (branco) e proteinase A (laranja) em complexo com um inibidor sintético (amarelo) e com a quimostatina (vermelho). Retirado de Gold et al., 2002. 1.2. Produtos Naturais Inibidores de Proteases Entre os 877 novos protótipos (New Chemical Entities – NCE) de baixo peso molecular introduzidos no mundo como fármacos durante o período de 1981-2002, 61% são substâncias derivadas ou tendo sua estrutura baseada em produtos naturais (Newman e Cragg, 2007). Muitos estudos com substâncias extraídas de plantas apresentam atividade inibitória sobre vários tipos de proteases: as cumarinas, os terpenóides, as xantonas, os alcalóides e os flavonóides possuem ação sobre a HIV-1 PR (Whang et al., 2004; Notka et al., 2004; Yust et al., 2004; Zhang et al., 2005); os derivados de catequinas, as flavonas, os flavonóis e os estilbenóides (Shimmyo et al., 2008; Jeon et al., 2007; Jeon et al., 2003) sobre a β-secretase, as lactonas- terpenoídicas, as catequinas (Siedle, et al., 2002; Demeule et al., 2000) e os peptídeos ASP 12 cíclicos (Matthew et al., 2008) sobre a elastase, entre muitas outras substâncias naturais com atividade inibitória sobre diferentes proteases. Apesar de um número expressivo de inibidores peptidomiméticos existentes no mercado farmacêutico com relativa eficácia, o interesse por novos inibidores de baixo peso molecular é grande, pois os fármacos disponíveis no mercado apresentam alta hidrolificidade e baixa biodisponibilidade (Martins et al, 2009). A descoberta de inibidores de proteases a partir de substâncias naturais tem se mostrado um importante recurso na produção de substâncias com eficácia terapêutica. O exemplo mais citado é o desenvolvimento dos fármacos inibidores da protease do vírus HIV a partir da fenprocumona (figura 2, p. 13). Os trabalhos de REA (figura 3, p. 14) levaram o grupo de Thairisvongs a desenvolver o primeiro inibidor não- peptidomimético com atividade anti-HIV, o tipranavir (Aptivus® - Boehringer Ingelheim) (Thairisvongs et al, 1994; Tuner et al, 1998). 13 Figura 2. Estrutura de derivados cumarínicos de ocorrência natural e do produto sintético tipranavir (Aptivus®), produzido pela Boehringer Ingelheim, derivado da fenprocumona, um metabólito secundário acumulado em várias espécies de angiosperma. A partir destes trabalhos iniciais que estabeleceram o mecanismo de ação dos benzopiranos sobre as proteases aspárticas, muitos outros estudos foram realizados com a intenção de se descobrir novos inibidores deste tipo de enzimas. Kashiwada e colaboradores (2001) demonstraram que os cromanos prenilados (figura 4, p. 14) isolados de Rhododendron dauricum também apresentam potente atividade inibitória sobre proteases aspárticas e que seus isômeros exibem diferente perfil de inibição de acordo com sua conformação estrutural. O O O O O H O O O O H O H O O O N H S N C F 3 O O O O O H Cumarina (1,2 - be nzopirona) Dicumarol ( R,S ) Varfarina fenprocumona Tipranavir 14 Figura 3 – Estrutura esquemática do sítio ativo da protease aspártica do vírus HIV mostrando os dois resíduos de Asp e os dois resíduos de Ile em complexo com o um inibidor benzopirano, a fenprocumona. Retirado de Thaisrisvongs et al., 1994. Figura 4 – Estrutura do ácido rododauricromânico A isolado de Rhododendron dauricum, um cromano natural com potente atividade sobre a protease aspártica do HIV (Kashiwada et al. 2001). O O O OH O H H H Br 15 O aumento da atividade biológica devido à presença de substituintes prenilados tem se mostrado evidente também para outros tipos de substâncias naturais como os flavonóides, benzofenonas e polifenóis (Poerwono et al, in press; Martins et al., 2009; Yasaki et al, 2009). Cheenpracha e colaboradores (2006) demonstraram que a prenilação da hidroxipanduratina A, uma dihidrochalcona, é essencial para a sua atividade inibitória de protease. Adicionalmente, um grande número de inibidores de algumas proteases serínicas como a quimotripsina e a elastase foram publicados, a saber: as enol-lactonas, - lactanas, isocumarinas substituídas, metilídrocumarinas, entre outras (Pochet et al., 2000). Uma proposta para a atividade dos derivados benzopiranos é a presença do grupo lactônico, o qual pode reagir com o resíduo ativo da serina (figura 5, p. 16). Após a abertura do anel e a eliminação de HX, a metil-quinona eletrofílica resultante pode formar ligação covalente com os resíduos nucleofílicos como Histidina 57 (His-57) e Metionina-192 (Met-192), localizadas no sítio ativo da protease. Pochet e colaboradores (2000) discutem que a natureza do substituinte na posição 3 influencia a potência inibitória dos benzopiranos sobre as proteases serínicas. Estes resultados reportados na literatura demonstram que a postulação teórica do mecanismo de ação de algumas substâncias sobre as proteases, é de grande utilidade nos estudos de REA e “drug based design”. 16 Figura 5 – Mecanismo de ação postulado para a inativação da -quimotripsina, uma protease serínica, por derivados cumarínicos (retirado de Pochet et al., 2000). 17 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Substâncias Foram testadas substâncias de outros projetos desenvolvidos no NuBBE, do departamento de Química Orgânica do Instituto de Química de Araraquara (UNESP). Algumas substâncias já foram caracterizadas quimicamente e outras ainda estão em fase de identificação. As amostras foram testadas em diferentes concentrações (0,0001 a 50 M). É importante ressaltar que algumas substâncias apresentam fluorescência quando excitadas, dificultando a análise dos resultados, desta forma, as concentrações testadas variam de acordo com as necessidades. 2.1.1 Responsáveis pelas amostras: 1-9: Dr. João Marcos Bastista Junior 10-13: Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos 14-31: Dr. Luís Octávio Regasini 32-47: Dr. Fernando Cotinguiba 49-54: Dra. Sílvia Noeli Lopêz 55-59: Msc. Marilia Valli 2.2 Reagentes Substrato fluorogênico Arg-Glu-(EDANS)-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Lys- (DALBCYL)-Arg (EDANS-DABCYL), subtilisina Carlsberg, pepsina, cumarina, dicumarol, varfarina e DMSO grau espectrofotométrico (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO, EUA). 18 2.3 Ensaio Enzimático Enzimas, substratos, inibidores padrão e solução tampão: pepsina (1,7 nM), substrato fluorogênico EDANS-DABCYL (2 M), , tampão acetato 0,1 M (pH 4,4). subtilisina Carlsberg (37 nM), substrato fluorogênico EDANS-DABCYL (2 M), tampão fosfato 0,1 M (pH 7,5). As soluções enzimáticas foram preparadas no dia do experimento e armazenadas a – 80º C. As soluções tampão foram armazenadas a 8 º C. 2.4 Protocolo experimental e análise por espectrometria de fluorescência Foi utilizado o mesmo procedimento para todos os ensaios com as diferentes proteases. Inicialmente a enzima foi incubada com a amostra a ser testada por uma hora em solução tampão. Em seguida 20 L desta mistura foi transferida para as micro- placas pretas opacas e 80 L do substrato foi adicionado para dar início à reação enzimática por um período de cinco minutos (volume final 100 L). O intervalo entre as leituras dependeu da quantidade de amostras testadas e foi no máximo de um minuto. A intensidade de fluorescência foi medida em um comprimento de onda de 360 nm de excitação e de 460 nm de filtro de emissão. A temperatura foi controlada em 37 ºC. 2.4.1 – Forma de análise dos resultados Foram comparados os resultados obtidos com o ensaio padrão (enzima + tampão + substrato) e com as amostras experimentais (enzima + amostra + substrato). Para todas as amostras testadas foram realizados ensaios “branco” (10 L amostra + 19 90 L tampão) para medida da fluorescência basal, detecção de autofluorescência das substâncias e determinação da sensibilidade de operação do espectrofotômetro. Todos os ensaios foram feitos em triplicata e a partir dos valores de intensidade de fluorescência foram calculados a média das triplicatas, o desvio padrão (DV) e o desvio padrão relativo (DVR) (DV x 100/ média) para cada leitura (ver exemplo em anexo 1, p. 52 - 55). Foram considerados válidos os resultados com DVR abaixo de 10 %. O cálculo da porcentagem de inibição foi realizado de acordo com a fórmula abaixo: Onde: %I = porcentagem de inibição MA = média das leituras no ensaio feito com a amostra MP = média das leituras no ensaio padrão 2.5 Espectrofotômetro As medidas de atividade inibitória sobre as proteases por meio da espectrometria de fluorescência foram realizadas em um leitor de microplacas com multidetecção SynergyTM HT (Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, Vermont, USA). As intensidades de fluorescência medidas foram analisadas por meio do software de análise de dados KC4TM (Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, Vermont, USA) e com o auxílio de um Microsoft Windows XP. 20 3. RESULTADOS 3.1 Ensaios de inibição de proteases por meio da espectrometria de fluorescência 3.1.1 Resultados com inibidores utilizados como controle positivo Como pode ser observado na tabela 1 (p. 20), as benzopironas testadas aqui como inibidores padrão apresentaram significativa atividade inibitória sobre as proteases quando testadas na concentração de 1 g/mL, corroborando os dados da literatura (Pochet et al., 2000; Thairisvong et al., 1994). A varfarina e o dicumarol (66 e 64 % inibição, respectivamente) mostraram-se mais potentes do que a cumarina (52 % inibição) no teste com a subtilisina. Por outro lado, no teste com a pepsina, a cumarina apresentou acentuada atividade inibitória (78 %), enquanto o dicumarol e a varfarina apresentaram atividade moderada (60 e 48 % inibição). Estes resultados corroboram os dados da literatura (Thairisvong et al., 1994). Tabela 1 – Efeito inibitório (%) de benzopiranos utlizados como padrão sobre a atividade enzimática das proteases subtilisina e pepsina. Inibidor padrão (concentração = 1 g/mL) Subtilisina Pepsina % Inibição cumarina 52 78 varfarina 66 48 dicumarol 64 60 21 Na tabela 2 (p. 22) estão representados os resultados obtidos com a mistura racêmica dos cromanos isolados de Peperomia obtusifolia e seus enantiômeros puros 1 – 3 (figura 6, p.21). A mistura racêmica (1) apresentou atividade inibitória de 32,60 % com a concentração de 10 μg/mL. Quanto testados isoladamente nesta mesma concentração, os enantiômeros mostraram diferente perfil de inibição. O enantiômero S (2) apresentou perfil semelhante ao observado para a mistura racêmica com 31,55 % de inibição, enquanto que o enantiômero 3 apresentou inibição de 14,14 %. Os cromanos 4 – 6 não apresentaram atividade inibitória, mesmo quanto testados na maior concentração (10 μg/mL) com nenhuma das amostras testadas, ou seja, mistura racêmica e enantiômeros purificados (tabela 2, p. 22). Figura 6 - Estrutura dos cromanos isolados de Peperomia obtusifolia testados nos ensaios de inibição de proteases aspárticas e serínicas Cromanos R1 Descrição da substância 1 COOH Mistura racêmica 2 COOH Enantiômero S 3 COOH Enantiômero R 4 H Mistura racêmica 5 H Enantiômero S 6 H Enantiômero R 22 Tabela 2 – Resultados (% Inibição) obtidos no ensaio de inibição de proteases com os cromanos isolados de Peperomia obtusifolia (1 - 6) em diferentes concentrações ( g/mL). Pepsina Substância 50 25 10 1 1.10-1 1.10-2 1.10-3 1.10-4 1 nd nd 32,60 29,90 21,07 15,53 6,12 5,90 2 nd nd 31,55 15,07 13,28 4,53 0 4,78 3 nd nd 14,14 7,92 6,23 5,77 2,47 Nd 4 nd nd 0 1,82 0 0 0 Nd 5 nd nd 22,83 19,65 8,30 0 3,66 2,62 6 nd nd nd 3,56 10,65 2,49 2,32 3,25 Subtilisina 1 86,71 51,65 34,32 13,42 0,45 0 nd Nd 2 54,12 46,90 35,45 31,64 26,82 19,64 nd Nd 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 24,40 15,24 16,49 17,13 16,32 4,40 nd Nd 5 nd nd nd 52,31 28,77 3,70 nd Nd 6 nd nd 16,74 28,34 4,79 4,82 nd Nd nd = não determinado 23 Os ensaios de inibição da pepsina com a mistura racêmica isolada de Piper gaudichandianum e seus cromenos prenilados (7 – 9) (figura 7, p. 23) apresentaram resultados diferentes (tabela 3, p. 24) dos observados com os cromanos. Somente a mistura racêmica (7) apresentou moderada atividade de 29,04 % com a concentração de 10 μg/mL. Os enantiômeros isolados, (8) e (9), não apresentaram atividade como pode ser observado na tabela 3 (p. 24). Figura 7 – Estrutura das substâncias isoladas de Piper gaudichanianum testadas nos ensaios de inibição de proteases aspárticas e serínicas. Substância Descrição da substância 7 Mistura racêmica 8 Enantiômero puro S 9 Enantiômero puro R 24 Tabela 3 – Resultados (% Inibição) obtidos no ensaio de inibição de proteases com os cromenos isolados de Piper gaudichandianum (7 – 9) em diferentes concentrações ( g/mL) Pepsina Substância 50 25 10 1 1.10-1 1.10-2 1.10-3 1.10-4 7 nd Nd 29,04 29,49 9,80 0,74 9,86 8,71 8 nd Nd 0,92 1,61 0 0 0 0 9 nd 26,86 0,97 3,21 2,44 0 0 0 Subtilisina 7 37,88 31,86 26,21 11,70 9,70 7,31 nd nd 8 0 0 nd 0,64 0 5,70 nd nd 9 0 0 8,10 0 10,48 0 nd nd nd = não determinado Comparativamente, os resultados obtidos no ensaio com a protease serínica subtilisina mostraram que os cromanos e cromenos também apresentaram atividade inibitória sobre esta enzima (tabelas 2 e 3, respectivamente). A mistura racêmica (1) e o enantiômero puro S, (2), inibiram a atividade da subtilisina em 86 e 54 % com a maior concentração testada (50 μg/mL). O enantiômero R (3) não alterou a atividade enzimática da subtilisina (tabela 2, p. 22). Os resultados obtidos com o cromenos (7 – 9) (tabela 3, p. 24) foram diferentes dos observados nos ensaios com a pepsina. Mesmo com a concentração de 50 μg/mL estes compostos não inibiram a atividade da subtilisina. Os resultados obtidos com os cromanos e cromenos nos ensaios de inibição das proteases pepsina e subtilisina corroboram trabalhos da literatura (Garino et al., 2005; Pochet et al., 2000) que mostram a interação do núcleo benzopirano destas substâncias e o sítio ativo das proteases aspárticas e serínicas. 25 10 H O 171 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 20 19 18 R1 R2 R3 R5 R4 Figura 8 – Estrutura química geral das casearinas (10 – 12) e da caseargrewiina F (13) isoladas de Casearia sylvestris. Substância Nome da substância Substituintes R1 R2 R3 R4 R5 10 Casearina B OCH3 ( ) CH3CO2 CH3CO2 CH3CO2 ( ) n-C3H7CO2 11 Casearina D OH ( ) n-C3H7CO2 CH3CO2 OH ( ) n-C3H7CO2 12 Casearina X n-C3H7CO2 ( ) n-C3H7CO2 CH3CO2 OH ( ) H 13 Caseargrewiina F n-C3H7CO2 ( ) CH3CO2 CH3CO2 OH ( ) H Na figura 8 (p. 25) está representada a estrutura geral dos diterpenos clerodânicos isolados de Casearia sylvestris e os resultados obtidos nos ensaios de inibição de proteases estão mostrados na tabela 4 (p. 26). Os valores de % de inibição mostraram que a substância (10) em 10 μg/mL apresentou potente atividade inibitória (65,48 %) sobre a pepsina. Os compostos (11 – 13) tiveram efeito inibitório de moderado a fraco, ou seja, 27,45%; 14,26% e 32,48%, respectivamente, também em 10 μg/mL. Os resultados obtidos nos ensaios realizados com a subtilisina mostraram que 26 os diterpenos clerodânicos isolados de C. sylvestris não apresentaram atividade inibitória sobre esta enzima em nenhuma das concentrações testadas (tabela 4, p. 26). Tabela 4 – Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com os diterpenos clerodânicos (10 – 13) isolados de Casearia sylvestris em diferentes concentrações ( g/mL) Pepsina Substância 50 25 10 1 1.10-1 1.10-2 1.10-3 1.10-4 10 nd nd 65,48 45,06 31,79 0,00 nd Nd 11 nd nd 27,45 21,47 7,49 7,92 nd Nd 12 nd nd 14,26 5,38 5,29 0,00 nd Nd 13 nd nd 32,48 22,38 18,91 4,96 nd Nd Subtilisina 10 7,54 1,98 0,50 0,00 0,00 nd nd Nd 11 8,27 6,59 6,82 0,00 0,00 nd nd Nd 12 0,56 0,00 0,23 0,006 0,00 nd nd Nd 13 2,06 0,52 0,00 0,00 nd nd nd Nd nd = não determinado 27 Figura 9 – Estrutura do diacetato do ácido caféico (14) e estrutura geral dos derivados ácido cafeico (15 – 22) Substância Nome da substância 14 Diacetato do ácido cafeico 15 Ácido cafeico 16 Cafeato de etila 17 Cafeato de propila 18 Cafeato de isopropila 19 Cafeato de butila 20 Cafeato de pentila 21 Cafeato de hexila 22 Cafeato de octila 28 Tabela 5 - Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com o diacetato do ácido caféico e com os derivados sintéticos do ácido cafeico em diferentes concentrações ( g/mL) Pepsina Substância 50 25 10 1 1.10-1 1.10-2 14 2,61 0 2,74 0 0 0 0 0 0 0 0 10,67 15 17,65 13,03 4,29 0 0 16 33,33 16,41 25,14 5,56 0,10 17 41,52 nd 20,55 7,20 0 18 39,57 27,31 17,94 1,71 1,68 19 27,80 21,53 17,84 0,78 0 20 16,57 0 19,36 13,35 9,79 Subtilisina 14 0 0 15 18,63 6,86 16 25,35 27,64 17 33,48 0,93 18 49,29 28,14 19 nd nd 20 41,15 32,34 21 37,75 6,76 22 32,31 25,37 nd = não determinado Obs. Nos ensaios com a subtilisina não foram testadas concentrações menores que 25 μg/mL. 29 Na tabela 5 (p. 28) estão representados os resultados (% de inibição) do diacetato do ácido cafeico e dos derivados sintéticos do ácido cafeico. Como pode ser observado, o cafeato de propila (17) apresentou moderada atividade inibitória de 41,52 % com a concentração de 50 μg/mL sobre a atividade enzimática da pepsina. Interessantemente, o cafeato de isopropila (18) também inibiu a atividade da pepsina (39,57 %) de forma semelhante ao cafeato de propila (17) e com a mesma concentração. Os outros derivados testados, o cafeato de etila (16), o cafeato de butila (19) e o cafeato de pentila (20) apresentaram fraca atividade inibitória sobre a protease aspártica pepsina, 33,33 %; 27,80 % e 16,57 %, respectivamente, mesmo com a maior concentração utilizada. O pré-screening com as concentrações de 25 e 50 μg/mL demonstrou que os derivados do ácido cafeico inibiram a atividade enzimática da subtilisina. O cafeato de isopropila (18), de pentila (20) e de hexila (21) apresentaram os maiores valores de % de inibição, 49,29 %; 41,15 % e 37,75 %, respectivamente, quando testado em 50 μg/mL. As outras substâncias apresentaram atividade de moderada a fraca (tabela 5, p. 28). 30 Figura 10 - Estrutura geral dos derivados sintéticos do ácido ferúlico testados nos ensaios de inibição de proteases. Substância Nome da substância 23 Ácido Ferúlico 24 Ferulato de butila 25 Ferulato de etila 26 Ferulato de metila 27 Ferulato de heptila 28 Ferulato de hexila 29 Ferulato de isopropila 30 Ferulato de pentila 31 Ferulato de propila Na figura 10 (p. 30) está representada a estrutura geral dos derivados sintéticos do ácido ferúlico e os resultados dos ensaios de inibição de proteases estão mostrados na tabela 6 (p. 32). Os ensaios realizados com a pepsina mostraram que com a concentração de 50 μg/mL o ácido ferúlico (23), o ferulato de butila (24) e o ferulato de etila (25) apresentaram potente efeito inibitório da atividade enzimática (96,27 %; 63,67 % e 76,70%, respectivamente). O ferulato de metila (26), nesta mesma concentração, apresentou fraca atividade inibitória (20,12 %). Os outros derivados de cadeia longa do ácido ferúlico não puderam ser testados nas concentrações de 25 e 50 μg/mL, pois 31 apresentaram altos valores de intensidade de fluorescência, sobrepondo-se à fluorescência do substrato EDANS-DABCYL. Desta forma, foram testadas concentrações no intervalo entre 0,001 – 10 μg/mL. Como podem ser observados na tabela 6 (p. 32), os derivados de cadeia longa do ácido ferúlico não apresentaram atividade inibitória significativa sobre a pepsina. O ácido ferúlico (23) e seus derivados (24 – 31) não apresentaram atividade inibitória sobre a subtilisina (tabela 6, p. 32). 32 Tabela 6 - Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com os derivados sintéticos do ácido ferúlico em diferentes concentrações ( g/mL) Pepsina Substância 50 25 10 1 1.10-1 1.10-2 1.10-3 23 96,27 32,55 24,09 10,50 7,95 7,20 24 63,67 7,25 8,27 0 0 0 25 76,70 35,32 23,11 0 0 1,03 26 20,12 7,86 11,82 0 0 0 27 Nd Nd 0 3,07 0 0 28 Nd Nd 2,88 0,85 6,33 0 29 Nd Nd 13,28 6,30 1,07 3,61 30 Nd Nd 12,86 0,64 3,65 0 31 Nd 14,04 7,64 1,22 4,48 0 Subtilisina 23 17,90 12,00 24 15,49 15,22 25 37,04 22,51 26 Nd 4,26 27 0 0 28 1,07 0 29 0 8,03 30 25,19 0,39 31 0 0 nd = não determinado Obs. Nos ensaios com a Subtilisina não foram testadas concentrações menores que 25 g/mL. 33 Figura 11 - Estruturas das amidas isoladas de Piper tuberculatum (32 – 47), testadas nos ensaios de inibição das proteases pepsina e subtilisina. 34 Na figura 11 (p. 33) estão representadas as estruturas das amidas isoladas de Piper tuberculatum (32 – 47) e testadas nos ensaios de inibição de proteases. Os resultados estão apresentados na tabela 7 (p. 35). A substância 47 apresentou potente inibição sobre a atividade da pepsina tanto com a concentração de 10 μg/mL (65,03 %) e 1 μg/mL (54,12 %). Nestas mesmas concentrações, a amida 38 inibiu esta protease em 52,89 % e 37, 98 %, respectivamente, e a amida 37 apresentou atividade inibitória de 65,47 % e 33,30 %, respectivamente. A substância 39 apresentou potente atividade de 62,84 % de inibição sobre a pepsina somente com a concentração mais alta (10 μg/mL). As substâncias 35 e 42 apresentaram moderada atividade inibitória, respectivamente, de 32,41 % e 32,55 % com 1 μg/mL. Algumas amidas não puderam ser testadas com a concentração de 10 μg/mL, pois apresentaram altos valores de intensidade de fluorescência interferindo na análise dos resultados. As outras amidas isoladas de Piper tuberculatum não apresentaram atividade inibitória significativa sobre a pepsina como pode ser observado na tabela 7 (p. 35). Nos ensaios de inibição da subtilisina somente as substâncias 33 e 38 apresentaram atividade inibitória significativa de 46,59 % e 50,71 % com a concentração de 10 μg/mL. 35 Tabela 7 - Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com as amidas isoladas de Piper tuberculatum (32 – 47) em diferentes concentrações ( g/mL) Pepsina Substância 10 1 1.10-1 1.10-3 32 nd nd nd nd 33 2,25 8,89 2,67 5,29 34 53,44 16,04 0 0 35 nd 32,41 11,47 4,31 36 nd 8,95 0 0,70 37 65,47 33,30 5,47 5,90 38 52,89 37,98 14,37 16,02 39 62,84 11,38 25,56 1,73 42 nd 32,55 14,47 14,75 43 30,42 1,99 0 0 44 11,38 0,69 4,73 1,77 46 nd 3,09 0 0 47 65,03 54,12 16,54 11,95 Subtilisina 32 12,16 0 0 0 33 46,59 10,22 0 0 35 38,61 0 0 0 36 20,70 1,45 1,52 4,82 37 0,00 0,00 0,68 2,76 38 50,71 32,28 nd 18,00 39 0 0 0 1,06 41 0 0 0 0 43 10,17 11,81 nd 6,36 44 19,53 7,05 0 0 45 nd 0 0 0 46 24,60 19,93 17,69 12,52 47 nd nd nd nd nd = não determinado 36 Figura 12 – Estrutura do ácido benzóico (49) e seus derivados biossintetizados (i.e. geranilização) (50 – 54) a partir de extratos enzimáticos de folhas de Piper crassinervium (López et al., 2010). Na figura 12 (p. 36) estão representadas as estruturas do ácido benzóico (49) e de seus derivados geranilados (50 – 54). Nos ensaios realizados com a pepsina o ácido benzóico (49) mostrou potente atividade inibitória de 69,15 % e 61,47 % mesmo em baixas concentrações (0,1 e 0,01 μg/mL, respectivamente) (tabela 8, p. 37). No entanto, os derivados geranilados do ácido benzóico (50 – 54) não mostraram efeito inibitório sobre a atividade enzimática da pepsina como pode ser observado na tabela 8. Concentrações muito altas destes compostos apresentaram altos valores de intensidade de fluorescência e não puderam ser testadas neste ensaio. Por outro lado, no ensaio de inibição da subtilisina os derivados geranilados (50 – 54) apresentaram moderado efeito inibitório. As substâncias (52) e (53) inibiram a atividade desta protease serínica em 34,49 % e 38,68 %, respectivamente, na concentração de 1 μg/mL. Os outros compostos desta série de derivados do ácido 37 benzóico não apresentaram atividade inibitória significativa (tabela 8, p. 37). Estes resultados foram publicados na revista Biotechnology Resource (Lopéz et al., 2010). Tabela 8 – Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases do ácido benzóico (49) e seus derivados biossintetizados (i.e. geranilização) (50 – 54) a partir de extratos enzimáticos de folhas de Piper crassinervium (López et al., 2010) em diferentes concentrações ( g/mL) Pepsina Substância 1 1.10-1 1.10-2 1.10-3 1.10-4 49 nd 69,15 61,47 35,62 9,03 50 18,78 17,37 12,47 nd 9,42 51 11,58 11,47 nd 7,43 5,16 52 4,47 0 1,36 0 0 53 15,25 12,92 10,11 7,64 3,77 54 5,00 0 0 0 0 Subtilisina % Inibição 49 25,15 26,25 15,04 0 50 27,65 25,07 22,01 19,76 51 28,35 24,32 23,25 17,31 52 34,49 29,30 23,55 18,87 53 38,68 28,74 17,73 19,51 54 26,10 23,00 16,96 19,20 nd = não determinado 38 Figura 13 – Estruturas químicas dos derivados piridínicos sintéticos (55 – 59), testados nos ensaios de inibição de proteases. Os resultados obtidos com os derivados piridínicos sintéticos (55 – 59) (figura 13, p. 38) mostraram seletiva atividade inibitória sobre as proteases aspártica e serínica testadas (tabela 9, p. 39). Nos ensaios com a pepsina somente o derivado piridínico (56) apresentou potente atividade inibitória com as concentrações de 0,1 μg/mL (41,36 %) e 0,01 μg/mL (32,11 %). As outras substâncias não inibiram a atividade da pepsina. Por outro lado, nos ensaios com a subtilisina os derivados piridínicos (55 – 59) apresentaram potente efeito inibitório. A substância (56) também apresentou atividade inibitória sobre esta protease serínica de forma semelhante aos resultados obtidos com a pepsina, ou seja, com as mesmas concentrações, em 44,04 % e 36,10 % inibição. As substâncias (55, 58 e 59) também tiveram efeito inibitório sobre a subtilisina de 43,68 %; 45,41 % e 39,41 %, na concentração de 0,1 μg/mL. 39 Tabela 9 - Resultados (% Inibição) obtidos nos ensaios de inibição de proteases com os derivados piridínicos sintéticos (55 – 59) em diferentes concentrações ( g/mL) Pepsina Substância 1.10-1 1.10-2 1.10-3 1.10-4 55 23,81 14,30 5,86 8,59 56 41,36 32,11 29,89 15,82 57 17,91 17,40 3,34 0 58 28,26 10,22 19,59 17,49 59 23,49 7,26 0,85 2,00 Subtilisina 55 43,68 34,95 25,43 0 56 nd 44,04 36,10 33,17 57 30,45 25,42 12,14 22,29 58 45,41 29,90 21,73 8,47 59 39,41 34,64 16,14 14,17 nd = não determinado 40 4. DISCUSSÃO Os resultados obtidos no presente trabalho reforçaram os dados obtidos anteriormente e reportados na literatura. Os cromanos isolados de Peperomia obtusifolia mostraram moderada atividade inibitória tanto sobre a protease aspártica pepsina como sobre a protease serínica subtilisina. É interessante notar que os enantiômeros puros isolados apresentaram diferente perfil de atividade como pode ser observado na tabela 2 (p. 22). Somente o enantiômero S (2), apresentou atividade inibitória sobre as proteases testadas. A ausência de atividade do enantômero R sugere que a esteroquímica da cadeia lateral dos cromanos 2 e 3 é essencial para a atividade inibitória. Ainda mais, considerando que as substâncias 4 – 6 não apresentaram efeito sobre as proteases, pode-se dizer que a carbonila na posição 6 participa da interação ligante-enzima, tanto nos ensaios com a pepsina como com a subtilisina. A mistura racêmica do cromeno 7, isolada de Piper gaudichandianum também apresentou efeito inibitório nos ensaios realizados (tabela 3, p. 24). Interessantemente, somente no ensaio de inibição da subtilisina pode- se observar efeito do enantiômero S (8). Por outro lado, observou-se um fraco efeito inibitório da mistura racêmica (7) e do enantiômero R (9) com a concentração de 25 μg/mL nos experimentos com a pepsina. Um estudo de REA é necessário para explicar como a esteroquímica destas substâncias interfere na interação ligante-enzima. Tem sido proposto que a prenilação de substâncias aumenta a potência da atividade biológica (Martins et al., 2009; Yasaki et al, 2009). Ainda mais, a interação de benzopiranos como cromenos, cromanos e cumarinas já está bem estudada quanto à 41 REA (figuras 1 e 2, p. 11 e 13) (Pochet et al., 2000; Thairisvong et al., 1999) o que poderá auxiliar em estudos futuros. Os resultados obtidos com o ácido benzóico (49) (tabela 8, p. 37) mostraram que a geranilização (inserção de unidades de isoprenos) desta substância por meio de extratos enzimáticos feitos a partir das folhas de Piper crassinervium melhoraram a atividade da substância 49 sobre a subtilisina (Lopes et al., 2010). Os derivados geranilados 53 e 52 apresentaram moderado efeito inibitório de 34,49 % e 38,68 % com a concentração de 1 μg/mL. Por outro lado, a inibição de 69% da atividade da pepsina observada com a substância 49 perdeu-se após a inserção da geranila. Isto pode estar relacionado com a atividade seletiva de inibição destas substâncias sobre proteases serínicas. Um estudo de modelização computacional poderá futuramente sugerir como se dá a interação destas substâncias geraniladas com a protease subtilisina. Estes resultados foram publicados na revista Biotechnology Resource (Lopes et al., 2010). Ainda discutindo os resultados obtidos com substâncias isoladas de espécies de Piper, os dados obtidos com as amidas isoladas de Piper tuberculatum mostraram potente atividade inibitória das substâncias 38, 39 e 47 sobre a protease aspártica pepsina (tabela 7, p. 35). Para as substâncias de cadeia lateral curta, pode-se dizer que a ciclização observada na substância 34 melhorou significativamente a atividade desta série. Para as substâncias com o grupo ciclo-hexânico substituído observou-se atividade inibitória somente para a substância 37. Em relação às substâncias 38 e 39 pode-se dizer que o aumento da cadeia lateral pela inserção de um grupo diênico melhorou a atividade desta série de substâncias. As substâncias 40 e 41 apresentaram problemas durante a realização dos ensaios e uma comparação mais detalhada não foi possível. Muitos trabalhos tem mostrado que as ligações amídicas desempenham 42 importante papel na interação entre alguns inibidores não-peptidomiméticos sobre proteases aspárticas e serínicas (Takeuchi et al., 2008; Buisson et al, 2006; Bowman e Chmielewski, 2004; De Clerq, 2004). Interessantemente, as amidas naturais não inibiram a atividade da subtilisina com as concentrações testadas. Alguns trabalhos mostraram que as amidas podem aumentar a atividade de proteases serínicas (Hiwasa et al., 1996), o que pode estar relacionado com os altos valores de fluorescência observados quando concentrações maiores foram testadas, o que dificultou a análise destes resultados. Na tabela 4 (p. 26) estão listados os dados com os diterpenos clerodânicos 10 – 13, chamados de casearinas, que corroboram nossos resultados anteriores, publicados na revista Brazilian Journal of Pharmacognosy (Flausino et al, 2009). Nestes resultados, tanto o extrato bruto de Casearia sylvestris como uma fração enriquecida de casearinas inibiram a atividade da pepsina de forma seletiva (Flausino et al, 2009). Os resultados obtidos com as substâncias isoladas mostraram que a casearina B (10) (figura 8, p. 25) apresentou potente efeito inibitório seletivo sobre esta protease aspártica, mas não sobre a subtilisina. Tobey e colaboradores sugerem que a pepsina pode ser considerado um alvo farmacológico para o tratamento de doenças gástricas, como refluxo esofágico e gastrite (Tobey et al., 2001). Os resultados do presente estudo sugerem que as casearinas 10 – 13 podem estar relacionadas com o efeito observado com o extrato bruto de Casearia sylvestris, o que pode justificar seu uso popular para o tratamento de distúrbios gástricos. Algumas estruturas químicas dos diterpenos isolados de C. rupestris ainda precisam ser definidas para posterior publicação dos resultados. 43 Os derivados sintéticos do ácido cafeico (figura 9, p. 27), o cafeato de propila (17) e o cafeato de isopropila (18), apresentaram atividade inibitória moderada e seletiva sobre a pepsina (tabela 5, p. 28). A triagem realizada mostrou que nenhum dos derivados sintéticos do ácido cafeico 14 – 22 inibiram a atividade da subtilisina. São poucos os trabalhos publicados na literatura reportando atividade inibitória do ácido cafeico e derivados naturais ou sintéticos. Park e colaboradores (2005) detectaram atividade inibitória do ácido cafeico sobre metaloproteases com concentrações próximas às utilizadas no presente trabalho (10 – 50 μg/mL). Os derivados sintéticos do ácido ferúlico (figura 10, p. 30) também apresentaram potente atividade inibitória sobre a pepsina, mas não sobre a subtilisina (tabela 6, p. 32). O ácido ferúlico (23), o ferulato de etila (25) e o ferulato de butila (24) apresentaram potente atividade inibitória sobre a pepsina, a qual se perdeu com o aumento da cadeia alquila. Não foram observados resultados significativos sobre a protease serínica subtilisina. Interessantemente, alguns trabalhos tem mostrado que o ácido ferúlico (23) inibiu a atividade de algumas proteases serínicas como a trombina e a tripsina (Monien et al, 2006; Lee e Lin, 1998). Os ensaios realizados com os derivados piridínicos sintéticos (55 – 59) (tabela 9, p. 39) mostraram potente atividade inibitória destas substâncias (em escala de nanomolares) o que corrobora os dados da literatura que demonstraram atividade de piperidinas substituídas, tanto em diferentes proteases aspárticas como serínicas (Ismail et al., 2008; Iserloh et al.; 2008; Marcinkeviciene et al., 2002; Oefener et al., 1998). Nos ensaios com a pepsina a substância (56) inibiu potentemente a atividade enzimática com as concentrações de 0,1 μg/mL (41,36%) e 0,01 μg/mL (32,11%). Esta mesma substância apresentou também atividade inibitória sobre a atividade da 44 subtilisina, também com as mesmas concentrações, e com mesma potência, ou seja, 44,04 % (com 0,1 μg/mL) e 36,10 % (com 0,01 μg/mL). As substâncias 55, 58 e 59 mostraram efeito inibitório sobre a protease serínica subtilisina de 43,68 %, 45,41 %; e 39,41 %, respectivamente. Outras substâncias desta série de derivados piperidínicos sintéticos serão testados para posterior análise da REA utilizando-se os dados já existentes na literatura (Ismail et al., 2008; Iserloh et al.; 2008; Marcinkeviciene et al., 2002; Oefener et al., 1998) bem como em análises experimentais de “Docking”. 45 5. CONCLUSÃO Em conclusão, os resultados obtidos com os ensaios de inibição de proteases aspárticas e serínicas utilizando-se a pepsina e a subtilisina como modelos farmacológicos moleculares: corroboram dados da literatura; mostram que o presente trabalho apresenta predictibilidade de constructo (por homologia) e farmacológica; e pode ser utilizada como triagem de substâncias naturais e sintéticas, e ainda utilizado para o desenvolvimento de novas substâncias mais potentes. 46 REFERÊNCIAS Babine, R.E., Bender, S.L. Molecular recognition of protein-ligand complexes: aplication to drug design. Chem. Rev. 1997, 97: 1359-1472. Bowman, M.J.; Chmielewski, J. 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Planilha de exemplo da análise dos resultados [média + desvio padrão (DP) + desvio padrão relativo (DPR)] obtidos com a substância (1) no ensaio de inibição da pepsina. Padrão 1a 2a 3a Média DP DPR 3508 2668 2635 2937 494,7 16,8 4218 3434 3297 3649,7 496,9 13,6 4723 4003 3928 4218 438,9 10,4 5417 4560 4456 4811 527,4 10,9 5948 4942 4909 5266,3 590,6 11,2 6188 5419 5311 5639,3 478,2 8,5 6559 5701 5663 5974,3 506,7 8,5 6763 6114 5879 6252 457,9 7,3 7052 6382 6136 6523,3 474,1 7,3 7214 6618 6508 6780 379,8 5,6 7336 6723 6728 6929 352,5 5,1 7463 6959 7016 7146 276 3,9 7449 7241 7058 7249,3 195,6 2,7 7661 7361 7324 7448,7 184,8 2,5 7880 7596 7520 7665,3 189,7 2,5 8011 7758 7641 7803,3 189,1 2,4 7997 7742 7805 7848 132,8 1,7 média total = 4911 52 Continuação anexo 1 Substância 1 - 10 μg/mL 1a 2a 3a Média DP DPR 1941 2913 2292 2382 492,2 20,7 1994 2976 2412 2460,7 492,8 20 2033 3149 2476 2552,7 561,9 22 2196 3238 2572 2668,7 527,7 19,8 2169 2987 2706 2620,7 415,6 15,8 2121 3033 2832 2662 479,2 18 2222 3003 2903 2709,3 424,9 15,7 2280 2918 2811 2669,7 341,7 12,8 2326 2820 2820 2655,3 285,2 10,7 2363 2888 2885 2712 302,2 11,1 2436 2946 2771 2717,7 259,1 9,5 2502 2770 2857 2709,7 185 6,8 2688 2865 2941 2831,3 129,8 4,6 2703 2921 2978 2867,3 145,1 5,1 2718 2993 3021 2910,7 167,4 5,7 2813 3011 3035 2953 121,8 4,1 2877 3086 3140 3034,3 138,9 4,6 média total = 652,3 % I = 86,72 Substância 1 - 1 μg/mL 1a 2a 3a Média DP DPR 2264 2302 2370 2312 53,7 2,3 2544 2603 2757 2634,7 109,9 4,2 2723 2782 2684 2729,7 49,3 1,8 2875 3057 2945 2959 91,8 3,1 3359 3258 3273 3296,7 54,5 1,6 3577 3495 3351 3474,3 114,4 3,3 3758 3686 3209 3551 298,4 8,4 3922 3793 3235 3650 365,1 10 4053 3805 3366 3741,3 347,9 9,3 4264 3893 3605 3920,7 330,4 8,4 4412 3959 3765 4045,3 332 8,2 4512 4051 3819 4127,3 352,7 8,5 4581 4210 3981 4257,3 302,8 7,1 4808 4387 4045 4413,3 382,1 8,6 4737 4373 4191 4433,7 278 6,3 4890 4399 4330 4539,7 305,3 6,7 5090 4562 4406 4686 358,5 7,6 média total = 2374 % I = 51,66 53 Continuação anexo 1 Substância 1 - 0,1 μg/mL 1a 2a 3a Média DP DPR 2305 1975 2205 2161,7 169,2 7,8 2674 2301 2721 2565,3 230,1 8,9 3062 3008 3180 3083,3 87,9 2,8 3344 3289 3518 3383,7 119,5 3,5 3660 3625 3778 3687,7 80,2 2,2 3814 3949 4155 3972,7 171,7 4,3 4065 4117 4282 4154,7 113,3 2,7 4235 4322 4610 4389 196,3 4,5 4435 4456 4737 4542,7 168,6 3,7 4612 4620 4892 4708 159,4 3,4 4679 4610 5036 4775 228,6 4,8 4783 4785 5175 4914,3 225,7 4,6 4816 4984 5317 5039 254,9 5,1 4996 4964 5416 5125,3 252,2 4,9 5054 4974 5415 5147,7 234,9 4,6 5177 5207 5530 5304,7 195,7 3,7 5211 5272 5678 5387 253,8 4,7 média total = 3225,3 % I = 34,32 Substância 1 - 0,01 μg/mL 1a 2a 3a Média DP DPR 2846 2659 2519 2674,7 164,1 6,1 3428 3174 3137 3246,3 158,4 4,9 3946 3709 3761 3805,3 124,6 3,3 4467 4186 4221 4291,3 153,1 3,6 4733 4574 4612 4639,7 83 1,8 5106 4972 5087 5055 72,5 1,4 5395 5200 5373 5322,7 106,8 2 5589 5586 5567 5580,7 11,9 0,2 5954 5722 5780 5818,7 120,7 2,1 6061 5987 5968 6005,3 49,1 0,8 6216 6119 6199 6178 51,8 0,8 6348 6217 6374 6313 84,1 1,3 6447 6339 6555 6447 108 1,7 6544 6420 6566 6510 78,7 1,2 6528 6485 6740 6584,3 136,5 2,1 6682 6659 6774 6705 60,8 0,9 6860 6896 7023 6926,3 85,6 1,2 média total = 4251,7 % I = 13,42 54 Continuação anexo 1 Substância 1 - 0,001 μg/mL 1a 2a 3a Média DP DPR 2633 2431 2594 2552,7 107,1 4,2 3180 3154 3294 3209,3 74,5 2,3 3687 3616 3923 3742 160,7 4,3 4116 4220 4324 4220 104 2,5 4496 4614 4828 4646 168,3 3,6 4747 5049 5247 5014,3 251,8 5 5213 5471 5584 5422,7 190,2 3,5 5473 5707 5906 5695,3 216,7 3,8 5675 6033 6236 5981,3 284 4,7 5985 6249 6533 6255,7 274 4,4 6273 6568 6733 6524,7 233 3,6 6358 6796 6931 6695 299,5 4,5 6560 6906 7189 6885 315 4,6 6635 7089 7205 6976,3 301,2 4,3 6851 7224 7400 7158,3 280,3 3,9 6996 7371 7504 7290,3 263,4 3,6 6978 7570 7776 7441,3 414,3 5,6 média total = 4888,7 % I = 0,45 Substância 1 - 0,0001 μg/mL 1a 2a 3a Média DP DPR 3327 2530 2998 2951,7 400,5 13,6 4073 3202 3646 3640,3 435,5 11,9 4456 3889 4277 4207,3 289,8 6,9 5313 4427 4854 4864,7 443,1 9,1 5459 4886 5342 5229 302,7 5,8 5770 5275 5778 5607,7 288,1 5,1 5782 5674 6295 5917 331,8 5,6 6765 5943 6499 6402,3 419,4 6,5 6807 6211 6834 6617,3 352,1 5,3 7399 6537 7077 7004,3 435,6 6,2 7299 6662 7258 7073 356,5 5 7776 7022 7371 7389,7 377,3 5,1 7699 7188 7659 7515,3 284,2 3,8 8000 7436 7980 7805,3 320 4,1 8081 7540 8070 7897 309,2 3,9 7994 7788 8197 7993 204,5 2,5 7892 7840 8261 7997,7 229,5 2,9 média total = 5046 % I = -2,74 CAPA FOLHA DE ROSTO SUMÁRIO RESUMO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS 1. INTRODUÇÃO 2. MATERIAL E MÉTODOS 3. RESULTADOS 4. DISCUSSÃO 5. CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXO