PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA 

 

 

 

“EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO ANAERÓBIO SOBRE 

A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA 

CAPTAÇÃO DE GLICOSE E VIA PROTEOLÍTICA 

DEPENDENTE DE ATP NO MÚSCULO ESQUELÉTICO 

DE RATOS DIABÉTICOS” 

 

 

Rogério de Oliveira Batista 

 

 

Presidente Prudente 
2014 

 
 



 
 

 
 

 

 

 

“EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO ANAERÓBIO SOBRE 

A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA 

CAPTAÇÃO DE GLICOSE E VIA PROTEOLÍTICA 

DEPENDENTE DE ATP NO MÚSCULO ESQUELÉTICO 

DE RATOS DIABÉTICOS” 
 

 

Rogério de Oliveira Batista 

 
 
Dissertação apresentada ao Programa 
de Pós Graduação em Fisioterapia da 
Faculdade de Ciências e Tecnologia – 
FCT/UNESP Campus de Presidente 
Prudente, para obtenção do título de 
Mestre em Fisioterapia. 

 

 

Orientadora: Profª Drª Patrícia Monteiro Seraphim 

 

 

 
Presidente Prudente 

2014 
 
 
 



 
 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

FICHA CATALOGRÁFICA 
 

 
Batista, Rogério. 

B337e Efeitos do exercício físico de salto sobre as proteínas 
relacionadas à captação de glicose e via proteolítica dependente de 
ATP no músculo gastrocnêmio de ratos diabéticos induzidos por 
administração de aloxana / Rogério de Oliveira Batista. - Presidente 
Prudente : [s.n], 2013 

00 f. 
 
Orientador: Patrícia Monteiro Seraphim 
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, 

Faculdade de Ciências e Tecnologia 
Inclui bibliografia 
 
1. Diabetes mellitus e treinamento. 2. Ubiquitina-proteassoma. 3. 

Metabolismo Celular. I. Seraphim, Patrícia Monteiro. II. Universidade 
Estadual Paulista. Faculdade de Ciências e Tecnologia. III. Título. 

 
 

 

 

 

 

 



 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

DEDICATÓRIA 
 

. 
Dedico este trabalho à minha mãe Maria Machado de Oliveira: 

mulher, mãe e amiga que jamais deixou de me apoiar mesmo sem 

entender muitas escolhas que fiz. Pelo exemplo diário e pelo Amor 

que só quem possui uma mãe assim pode sentir 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 
 

 

AGRADECIMENTOS 

 

Agradeço primeiramente a DEUS - esta energia que me guia 

todos os dias, que me dá forças pra lutar e seguir em frente. E pela vida que a 

mim foi proporcionada. 

À minha irmã Rosemeire de Oliveira Batista que sempre esteve 

presente em minha vida, que sempre me encorajou a viver com intensidade e 

determinação sem perder as raízes.  

Às minhas sobrinhas-filhas Nathália de Oliveira Rodrigues e 

Nayara de Oliveira Rodrigues, extensões da minha família e crianças que 

ontem me fizeram sorrir e hoje mulheres que me fazem refletir como o tempo é 

precioso demais para ser desperdiçado. 

A Cláudio Roberto Batista pelo apoio dado durante 4 anos de 

convivência e intensa reciprocidade, que Deus te ilumine meu amigo. 

À Patrícia Monteiro Seraphim orientadora, professora e 

conselheira que me proporcionou experiências únicas, que confiou a mim a 

responsabilidade de desenvolver um projeto diferenciado e por ter investido na 

realização deste trabalho. 

À Professora Rosa Maria Barilli Nogueira pelos incentivos, pelos 

ensinamentos e por ter realizado uma parte de extrema importância deste 

trabalho junto ao Biotério Central. 

Ao Professor Ubiratan Fabres Machado pela autorização em 

utilizar seu laboratório para o processo de extração de proteínas. 

À Patrícia Ebersbach pelos ensinamentos, paciência e empenho 

em auxiliar no processo de extração realizado no Instituto de Ciências 

Biomédicas da Universidade de São Paulo. 

Aos alunos de graduação em Medicina Veterinária da 

Universidade do Oeste Paulista – Angelita da Silva e Kaique Marques pelo 

auxílio e pelos momentos de aprendizado e colaboração. 



 
 

 

Aos funcionários do Biotério Central da Universidade do Oeste 

Paulista – UNOESTE – William, Moisés, Dionísio, Lucas, Matheus e Sidmar 

que foram parceiros de trabalho e pesquisa. 

Aos membros que constituíam o Grupo de Pesquisa em Fisiologia 

– GPFis: Bruna Brasil Brandão, Danilo Antônio Corrêa Pinto Junior, Beatriz de 

Novais Oliveira Trombetta e Lidiane Monteiro Souza que foram companheiros, 

amigos e professores nesta árdua tarefa de pesquisar e tornar possível a 

realização de ideias e projetos. Que me apoiaram com sua atenção, amizade, 

paciência e muita dedicação. 

Aos membros da atual formação do GPFis: Rafael Junges 

Moreira, Laís Regina Rossi, Lucas Agostini, Thaís Batista Dutra, Armando Neto 

e Tamara Gouveia por estes 2 anos de convivência e aprendizagem. Pelo 

apoio na realização deste projeto, pelos ensinamentos e amizades 

conquistadas. 

Aos alunos do curso de graduação em Educação Física (2º ano – 

2013) matutino da FCT UNESP de Presidente Prudente pela realização do 

estágio em docência e pelas experiências que pude desenvolver em pouco 

tempo de convivência. 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Determinação, coragem e autoconfiança são fatores decisivos para o sucesso. 

Se estamos possuídos por uma inabalável determinação conseguiremos superá-los. 

Independentemente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e 

despidos de orgulho.” 

 

 

 

(Dalai Lama) 

  



 
 

 

SUMÁRIO 

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ........................................................ 9 

1. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................ 16 

1.1. Introdução .............................................................................................. 16 

1.2. Mecanismos fisiológicos responsáveis pela captação de glicose ...... 17 

1.4. A via proteolítica dependente de ATP – ubiquitina-proteassoma ....... 24 

1.5. A relação existente entre a UPS e o Fator Nuclear-κB (NF-κB) ......... 27 

2. OBJETIVO .................................................................................................... 30 

3. PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS ..................................................... 30 

3.1. Procedimento experimental ................................................................ 30 

3.2. Protocolo de treinamento de salto no meio líquido ............................ 32 

3.3. Coleta do material .............................................................................. 33 

3.4. Quantificação do RNAm do gene Slc2a4, Gapdh, UBb, E214kDa, 

Trim63, NFκB e Prkaa2. ............................................................................ 34 

3.5. Verificação da integridade do RNA total e obtenção do cDNA ........... 35 

3.6. Reação em Cadeia da Polimerase para amplificação dos genes. ..... 36 

3.7. Preparação das amostras para o Western Blotting (quantificação de 

proteínas para o transportador de glicose GLUT4) ................................... 37 

3.8. Western Blotting – método para quantificação de proteínas .............. 38 

3.9. Imunodetecção (Immunoblotting) – ECL (Enhanced 

Chemiluminescence) ................................................................................. 39 

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................ 41 

5. RESULTADOS ......................................................................................................... 41 

6. DISCUSSÃO ............................................................................................................ 53 

7. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 59 



 
 

 

8. ANEXOS ................................................................................................................... 60 

REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 63 

 

 
 
 
 
 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 
 

 

 
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 
 
 
ADA – Associação Americana de Diabetes 

AICAR – 5-Aminoimadazole-4-Carboxamide-1 

AMPK – Proteína cinase ativada por AMP 

APS – Persulfato de Amônio 
ATP – Adenosina Trifosfato 

cDNA – Ácido Desoxirribonucleico (complementar) 

CE – Controle Exercitado 

CS – Controle Sedentário 

DE – Diabetes Exercitado 

DEPC – Dietilpirocarbonato 

DM – Diabetes Mellitus 

dNTP – Deoxynecleotide 

DS- Diabetes Controle 

DTT – Ditiotreitol 

EtBr – Brometo de Etídio 

GLUT – Transportador de Glicose 

HCl – Ácido Clorídrico 

IRS – Substrato do Receptor de Insulina 

Lys – Lisina 

MgCl2 – Dicloreto de Magnésio 

mRNA – Ácido Ribonucléico mensageiro 

MT – Membranas Totais 

MuRF-1 – Muscle Ring Finger -1 

NaCl – Cloreto de Sódio 

NF-kB- Nuclear Factor-κB 

NPH – Neutral Protamine Hagedorn 

OMS – Organização Mundial de Saúde 

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 

PI3K – Fosfatidilinositol 3- kinase 

PKB – Proteina B kinase 

ROS – Espécies Reativas de Oxigênio 



 
 

 

rpm – rotações por minuto 

RT – Transcriptase Reversa 

SDS – Dodecil Sulfato de Sódio 

SDS-PAGE – Docedil Sulfato de Sódio – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida 

TNFα – Fator de Necrose Tumoral α 

UI – Unidades Internacionais 

UPS – Sistema Ubiquitina Proteassoma 

UV – Ultravioleta 

  



 
 

12 
 

RESUMO  
 
Palavras-chave: Ubiquitina-proteassoma, Diabetes, Exercício Anaeróbio, 
Metabolismo 
 

A literatura aponta que no diabetes mellitus, a expressão gênica de proteínas 

envolvidas no UPS (ubiquitine-proteasome system) encontra-se acima dos 

níveis basais, ocasionando degradação de proteínas miofibrilares. Sabe-se que 

a enzima de conjugação E214kDa e ubiquitina ligase E3 - MuRF1 (Muscle Ring 

Finger-1) podem ser consideradas como biomarcadores de tal via. Os modelos 

de animais diabéticos apresentam maior expressão de NFkB (fator nuclear 

kappa B), o qual tem papel importante na regulação da transcrição do gene do 

GLUT4. O exercício físico configura-se como método terapêutico no tratamento 

do diabetes mellitus. A contração muscular melhora a captação de glicose na 

musculatura esquelética, translocando o GLUT4 via proteína cinase ativada por 

5´-AMP (AMPK). Objetivo: Avaliar o efeito de seis semanas de treinamento de 

salto sobre conteúdo proteico de GLUT4, e expressão gênica (mRNA) dos 

genes Slc2a4 (proteína GLUT4), UBb (Ubiquitina), E214kDa, Trim63 (proteína 

MuRF1), NFkB p105 e Prkaa2 (proteína AMPKα2) no músculo gastrocnêmio de 

ratos diabéticos. Materiais e Métodos: Estabelecemos 4 grupos crônicos: DEC 

(Diabetes Exercício), DSC (Diabetes Sedentário), CEC (Controle Exercício) e 

CSC (Controle Sedentário). O treinamento consistiu de 3 séries de 12 saltos 

em meio líquido com carga equivalente a 50% do peso corporal durante 6 

semanas, 3 vezes/semana. Os grupos DE e CE foram submetidos ao Teste de 

Tolerância a Insulina (ITT), coleta de urina e mensuração da glicemia sérica.  A 

eutanásia ocorreu por administração intraperitoneal de anestésico para coleta 

de tecidos e sangue. A expressão gênica foi quantificada pela técnica de RT-

PCR e conteúdo proteico por Western Blotting. Para a análise estatística 

utilizamos o teste ANOVA one-way, com post-hoc (Tukey) quando necessário 

sendo p< 0,05. Resultados: Observou-se redução no peso de tecido adiposo 

dos animais diabéticos quando comparados aos controles. A musculatura 

gastrocnêmio estava reduzida nos animais diabéticos sedentários em 

comparação a todos os demais grupos. A musculatura glicolítica (EDL) se 

comportou de maneira semelhante com os animais diabéticos sedentários 

exprimindo os menores valores. A musculatura oxidativa (Sóleo) no grupo DEC 



 
 

13 
 

estava reduzida em comparação ao grupo CEC; o grupo DSC manteve 

considerável proteólise em relação a todos os demais grupos. O peso corporal 

total foi inferior nos diabéticos em relação aos controles. O ITT comprovou 

melhora na sensibilidade à insulina dos diabéticos. A glicemia pós treino 

apresentou considerável queda nos animais diabéticos exercitados após o 

período de treinamento. Para o gene Slc2a4 observou-se aumento 

estatisticamente significante nos animais diabéticos. Constatamos aumentos no 

gene UBb em ambos os modelos sedentários, e redução nos grupos 

exercitados. O grupo DEC apresentou os menores valores de expressão do 

gene E214kDa. O gene Trim63 apresentou-se elevado no grupo DSC em 

comparação a todos os demais grupos. O conteúdo proteico de GLUT4 esteve 

aumentado apenas no grupo CEC em comparação a todos os demais grupos. 

Conclusão: O treino adotado promoveu ganho de massa muscular, melhora 

no perfil glicêmico e na sensibilidade à insulina, e exerceu efeito inibidor à 

proteólise na musculatura mista de animais diabéticos e controle. Entretanto 

efeitos sobre poliúria e conteúdo proteico de GLUT4 permaneceram 

inalterados.  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 
 

14 
 

ABSTRACT 
 

Keywords: Ubiquitin-proteasome, Diabetes, Exercise Anaerobic, Metabolism 

 

The literature suggests that in diabetes mellitus, the gene expression of proteins 

involved in UPS (ubiquitine - proteasome system) lies above baseline levels, 

causing degradation of myofibrillar proteins. It is known that E214kDa 

conjugating enzyme and ubiquitin ligase E3 - MuRF1 (Muscle Ring Finger -1) 

may be regarded as biomarkers of this pathway. The models of diabetic animals 

shows increased expression of NFkB (Nuclear Factor kappa B), which plays an 

important role in the regulation of GLUT4 gene transcription. Exercise appears 

as a therapeutic method in the treatment of diabetes mellitus. Muscle 

contraction improves glucose uptake in skeletal muscle GLUT4 translocating 

protein kinase pathway activated by 5' - AMP (AMPK). Objective: To evaluate 

the effect of six weeks of jumping on GLUT4 protein content of training, and 

gene expression (mRNA) of Slc2a4 (GLUT4 protein), UBB (Ubiquitin), E214kDa, 

Trim63 (MuRF1 protein) , NFkB p105 gene and Prkaa2 (AMPKα2) protein in the 

gastrocnemius muscle of diabetic rats . Materials and Methods: We 

established chronic 4 groups: DEC (Diabetes Exercise), DSC (Diabetes 

Sedentary), CEC (Control Exercise) and CSC (Control Sedentary). The training 

consisted of 3 sets of 12 jumps liquid mean supporting load equivalent to 50% 

of body weight for 6 weeks. DE and EC groups were submitted to the Insulin 

Tolerance Test (ITT), urine collection and measurement of serum glucose. 

Euthanasia was by intraperitoneal administration of anesthesia to collect blood 

and tissue. Gene expression was quantified by RT - PCR and protein content 

by Western blotting. For statistical analysis the one-way ANOVA test with post-

hoc (Tukey) when necessary with p < 0.05. Results: We observed a reduction 

in weight of adipose tissue of diabetic animals compared with controls. The 

gastrocnemius muscle was reduced in sedentary diabetic animals compared to 

all other group. The glycolytic muscle (EDL) behaved similarly with sedentary 

diabetic animals expressing the lowest values. The oxidative muscle (Soleus) in 

DEC group was reduced compared to the CEC group, the DSC group 

maintained considerable proteolysis compared to all other groups. The total 

body weight was lower in diabetics than in controls. The ITT demonstrated 



 
 

15 
 

improvement in insulin sensitivity in diabetics. The post-training glucose showed 

significant decrease in diabetic animals exercised after the training period. For 

the Slc2a4 gene showed a statistically significant increase in diabetic animals. 

We found increases in the UBB gene models in both sedentary and reduction in 

exercise groups. The DEC group had the lowest values of gene expression 

E214kDa. The Trim63 gene is presented in high DSC group compared to all 

other groups. The protein content of GLUT4 was increased only in the CEC 

group compared to all other groups. Conclusion: The training adopted 

promoted gain muscle mass, improved glycemic control and insulin sensitivity, 

and exerted inhibitory effect on proteolysis in mixed muscles from diabetic and 

control animals. However effects on polyuria and GLUT4 protein content 

remained unchanged. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

16 
 

1. REFERENCIAL TEÓRICO 

 
1.1. Introdução 

 
 
 

A prática de atividade física para os portadores de diabetes mellitus (DM), 

induz a adaptações fisiológicas que promovem benefícios adicionais de 

extrema importância para melhorar a qualidade de vida. Segundo estudos, a 

prevenção vem por meio do estilo de vida, (TUOMILEHTO et al., 2001). A 

atividade física regular é recomendada para pacientes com DM e hipertensão 

arterial sistêmica (HAS), em virtude de efeitos benéficos sobre o risco 

cardiovascular, controle metabólico e prevenção das complicações crônicas 

das doenças (IRIGOYEN et al., 2003). Exercícios padronizados foram por 

muito tempo reconhecidos no tratamento do diabetes mellitus tipo 2, que 

resulta em uma variedade de adaptações fisiológicas e metabólicas (ZANUSO 

et al., 2010). Entretanto, os mecanismos intracelulares pelos quais a atividade 

física melhora o perfil glicêmico em pacientes diabéticos permanecem apenas 

parcialmente conhecidos (PÁDUA et al, 2009). 

O diabetes mellitus, ou DM, de acordo com Tavares et al., (2007), 

atualmente, configura-se em um crescente problema de saúde pública, que por 

sua vez, acomete a população idosa em virtude do aumento da expectativa de 

vida. O diabetes mellitus, ainda, contribui para a incapacidade funcional em 

idosos, fato corroborado por Alves et al., (2007), que consideraram tal 

associação envolver múltiplos fatores, pois esta doença está relacionada, 

sobretudo, a complicações vasculares e neuropáticas que, consequentemente, 

afetam a capacidade funcional. 



 
 

17 
 

Tavares et al., (2008), assinalam o diabetes mellitus como 

disfunção que apresenta alta taxa de morbi-mortalidade e perda na qualidade 

de vida. Constitui-se, ainda, em uma das principais causas de insuficiência 

renal, amputação de membros inferiores e cegueira. Mathias e Jorge, (2004), 

apontam um censo conduzido entre 1986 e 1988 em nove capitais em uma 

amostra da população adulta entre 30 e 69 anos de idade. A média geral da 

prevalência do DM para essas áreas foi de 7,6%, variando de 2,7% para a 

população de 30 a 39 anos, até 17,4% para a população de 60 a 69 anos.  

Segundo a classificação apresentada pelas diretrizes da 

Sociedade Brasileira de Diabetes, (2007), a DM é categorizada com o avanço 

dos estudos, de acordo com a epidemiologia, a fisiopatologia e a genética. 

Baseada nas classificações da Organização Mundial de Saúde (OMS) e a 

Associação Americana de Diabetes (ADA), a Sociedade Brasileira de Diabetes 

apresenta as seguintes classificações: Diabetes Mellitus tipo 1, tipo 2, 

gestacional e outros tipos. Em qualquer um dos tipos, a principal consequência 

desta disfunção envolve alteração na captação de glicose em células adiposas 

e musculares. 

 

1.2. Mecanismos fisiológicos responsáveis pela captação de glicose 

 

A insulina é um dos principais estimuladores da captação de 

glicose em células adiposas e musculares. A sinalização intracelular da insulina 

começa com sua ligação a um receptor específico de membrana, uma proteína 

heterotetramérica com atividade cinase intrínseca, composta por duas 

subunidades α e duas subunidades β, denominado receptor de insulina (IR), 



 
 

18 
 

(PAULI et al., 2009). A captação de glicose ocorre via difusão facilitada 

mediada por uma família de proteínas transportadoras relacionadas 

estruturalmente, expressas de maneira tecido específica e nomeadas GLUT1 a 

GLUT7. O GLUT4 se expressa exclusivamente em insulino-sensíveis como o 

tecido adiposo, muscular esquelético e muscular cardíaco, e está normalmente 

associado a vesículas específicas relacionadas ao sistema de Golgi (GAZOLA, 

BAZOTTE e SOUZA, 2001). Contudo, trabalhos publicados em 2010 relatam a 

presença de 13 membros diferentes de GLUTs, denominados GLUT1 a 

GLUT12 e HMIT (transportador de mioinositol com H+ acoplado). Dentre as 

isoformas, o GLUT4 é o principal transportador expresso no músculo 

esquelético, e a translocação do GLUT4 de um local intracelular para a 

membrana plasmática e túbulos T é um mecanismo maior pelo qual ambos, 

insulina e exercício, aumentam o transporte de glicose no tecido (JESSEN e 

GOODYEAR, 2006). 

Pauli et al., (2009) corroboram que a ativação do IR resulta em 

fosforilação em tirosina de diversos substratos, incluindo substratos do receptor 

de insulina 1 e 2 (IRS-1 e IRS-2). A fosforilação das proteínas IRS promove 

ativação de sítios de ligação para outra proteína citosólica, denominada 

fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K), promovendo sua ativação. Dentre suas ações, 

a ativação da PI3K aumenta a fosforilação em serina da proteína quinase B (ou 

Akt), e isso permite o transporte de glicose no músculo e no tecido adiposo, 

através da translocação da proteína GLUT4 para a membrana celular. 

Importante ressaltar que a molécula de insulina não é responsável 

unicamente pela captação da glicose, mas todo o processo químico em 

cascata que é desencadeado pela sua ligação ao seu receptor específico de 



 
 

19 
 

membrana. Em adição à estimulação aguda do transporte de glicose, a 

ativação da AMPK desempenha um papel importante na capacidade para 

transporte de glicose induzindo um aumento na expressão de GLUT4 no 

músculo esquelético, (OJUKA, et al., 2002). 

Jessen e Goodyear, (2005), consideram a AMPK um membro de uma família 

de proteínas cinases que consistem de 12 moléculas que se estendem de 

plantas a mamíferos. Pádua et al., (2009), definem a AMPK como uma enzima 

importante para a manutenção energética intracelular, especificamente durante 

situações de estresse, como o exercício físico ou privação alimentar. A AMPK é 

uma molécula heterotrimérica que contém uma subunidade catalítica α e duas 

subunidades regulatórias β e γ. Hardie, (2003), complementa essa informação 

ao afirmar que, cada subunidade existe como isoformas alternadas codificadas 

por 2 ou 3 genes (α1, α2, α3, β1, β2, γ1, γ2, e γ3), e todas as 12 diferentes 

combinações de isoformas parecem formar diferentes complexos. Em adição, a 

atividade da AMPK é aumentada por certos hormônios, tais como leptina e 

adiponectina, e por agentes farmacológicos, incluindo 5-aminoimadazole-4-

carboxamide-1 ribonucleoside (AICAR) e metformina. Estes agentes são 

utilizados no tratamento em modelos animais e/ou humanos resistentes á 

insulina e suas complicações, (TAO et al, 2010). A AMPK fosforilada ativa vias 

que geram o aumento de ATP, tais como a oxidação de ácidos graxos ao 

mesmo tempo em que desativa as vias anabólicas que consomem o ATP, 

como a síntese de ácidos graxos, (ROPELLE, PAULI e CARVALHEIRA, 2005). 

A importância de se compreender as especificações de tais estruturas no 

processo de captação da glicose no músculo esquelético se dá pelo fato de 

que em indivíduos diabéticos, a via de translocação do GLUT4 ativada por 



 
 

20 
 

AMPK representa um importante mecanismo fisiológico para a homeostase da 

glicose, o qual se encontra deficiente no processo de sinalização da insulina. 

Diferentes autores reportaram que a ativação da AMPK induzida pela 

contração muscular está envolvida com a captação de glicose em modelos 

experimentais e em seres humanos, através do aumento da translocação do 

transportador de glicose (GLUT4) para a membrana celular.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Entretanto, a prática de exercícios físicos por pessoas diabéticas sem 

controle glicêmico adequado ocasionaria os seguintes problemas: hipoglicemia, 

hiperglicemia e cetoacidose para diabéticos do Tipo 1, complicações cardíacas, 

inclusive morte súbita, sangramento da retina, perda de proteínas na urina, 

oscilação excessiva, para cima ou para baixo, da pressão sistólica, 

desenvolvimento de úlceras nos pés e danos ortopédicos, especialmente em 

Fonte: Jessen e Goodyear, 2005 



 
 

21 
 

pessoas com neuropatias periféricas (MONTEIRO et al., 2009), a falta de 

controle glicêmico, também, pode acelerar o aparecimento de doenças 

cardiovasculares, renais e oftálmicas, resultando em risco elevado de 

morbidade e mortalidade (MORO et al., 2012). Nesse sentido, a monitorização 

adequada da glicemia e a supervisão de um profissional devidamente 

capacitado são fatores determinantes para uma prática de atividade física 

promotora de uma melhor qualidade de vida e sem riscos. A incidência de 

diabetes mellitus relaciona-se inversamente com o grau de atividade física. Isso 

é mais bem documentado para pacientes com alto risco de desenvolver 

diabetes. Exercícios físicos regulares (exemplo: 30min/dia de exercícios 

aeróbios em intensidade moderada, 60% do VO2máx) podem reduzir o risco da 

intolerância à glicose pela metade e os riscos de diabetes em até três quartos 

(SIXT et al., 2004). 

 

 

1.3. Protocolos de treinamento e análises de parâmetros fisiológicos 
em ratos diabéticos 

 
 

Em um estudo desenvolvido por Lahaye et al., (2011), animais diabéticos 

expostos a um protocolo de treinamento combinado (constituído por corrida em 

esteira adaptada para roedores, 25m.min-1, 60 minutos, 5 dias/semana durante 

8 semanas) com insulinoterapia apresentaram poucas alterações sem 

diferença estatística em parâmetros como peso corporal (419,2±15,7g e 

395,2±14,6g) e concentrações de glicose sanguínea entre os animais tratados 

com insulina e os que receberam insulina mais o treinamento em esteira 

rolante (11,8±0,8mmol.L-1 e 12,6±0,8mmol.L-1), porém, o treinamento físico 



 
 

22 
 

atenuou a hipertrofia cardíaca observada em animais diabéticos. Tais achados 

foram corroborados por Silva et al., (2004), que não observaram diferença 

estatística nas concentrações circulantes de glicose de ratos diabéticos por 

administração de streptozotocina e submetidos ao treinamento em meio líquido 

com carga equivalente a 5% do peso corporal, 1 hora/dia, 5 dias/semana 

durante 8 semanas.  

Em estudo recente utilizando um programa para ratos diabéticos induzidos 

por streptozotocina, Liang, et al., (2012), comprovaram que a liberação de 

galanina induzida por exercício aumenta a expressão gênica de RNAm de 

GLUT4 em adipócitos. O treinamento consistiu de nado em tanque sendo 1 

hora/dia, 5 dias/semana por 4 semanas. O exercício pode significativamente 

modular a sinalização da insulina através da expressão de proteínas 

relacionadas à captação de glicose, como o GLUT4, Proteína B kinase - PKB e 

PI3K na musculatura de ratos diabéticos expostos a exercícios de natação por 

4 semanas, conforme (CAO, et al., 2010). 

O exercício em esteira diminuiu as concentrações séricas do Fator de 

Necrose Tumoral alfa (TNF-α) em 6%, do Fator quimiotático neutrófilo induzido 

por citocina 2 alpha/beta (CINC-2α/β) em 9%, da Interleucina (IL)-1β em 34%, 

da Interleucina 6 (IL-6) em 86%, da Proteína C Reativa (CRP) em 41%, além 

de reduzir em 40% as concentrações circulantes de ácidos graxos. O estímulo 

aplicado foi de 3 semanas de exercício em esteira  a 60% do VO2max, 30 

minutos por dia, 6 dias por semana, (BELOTTO et al., 2010). 

Animais em diferentes estágios do diabetes apresentaram glicemia 

controlada ou até mesmo prevenção no início da doença, em protocolo de 

corrida de 1hora/dia em 5 dias consecutivos, a 16/22 minutos por 5 semanas 



 
 

23 
 

ou 12/16 minutos por 7 semanas, Hwang, et al., (2011), o que corrobora os 

dados apresentados por Nam, et al., (2011), relativos à aplicabilidade deste 

mesmo protocolo de exercícios em esteira na prevenção do diabetes mellitus. 

As alterações decorrentes de diabetes severa também podem ser 

modificadas mediante aplicação de um protocolo de exercício aeróbio em 

esteira. Al-Jarrah et al., (2010). 

Rogatto et al., (2004), analisaram as respostas metabólicas agudas de 

ratos Wistar ao exercício intermitente de saltos. O exercício consistiu de saltos 

em meio líguido com 50% de carga do peso corporal (PC), sendo, 4 séries de 

10 saltos com 1 minuto de intervalo entre as séries. A ADA - Associação 

Americana de Diabetes, (2004), preconiza que a realização de exercício físico 

interfere sobre o metabolismo de carboidratos e lipídeos, tendo em vista a 

mobilização dos estoques de glicogênio muscular e hepático e o aumento das 

concentrações de glicose e AGL. 

Pauli et al., (2009), desenvolveram um programa constituído de natação, 

no qual os ratos obesos nadaram uma 1h/dia, 8 semanas com carga 

progressivamente aumentada de 2,5% a 5% do peso corporal. Houve, portanto, 

aumento da expressão de AMPKα e ACC na musculatura esquelética, bem 

como aumento na sensibilidade à insulina. Em relação ao controle glicêmico 

mediante nado em tanque coletivo por 6 semanas, com peso equivalente a 

3,5% do peso corporal, Moura, et al., (2012) concluíram que não houve 

melhora na homeostase glicêmica de ratos diabéticos, mediante análise de 

tolerância á glicose e sensibilidade periférica à insulina, durante o teste de 

Tolerância a Glicose (GTT) e Teste de Tolerância a Insulina (TTI), 

respectivamente.  



 
 

24 
 

1.4. A via proteolítica dependente de ATP – ubiquitina-proteassoma 

 

Além das dificuldades enfrentadas por portadores de DM como 

segregação social e custo para manter medicamentos anti-hiperglicemiantes 

disponíveis, esta população, comumente, acaba sendo obrigado a conviver 

com outras complicações advindas do diabetes como a quebra de proteínas de 

maneira significativa. A sarcopenia como forma expressiva de perda da 

qualidade muscular e consequente produção de força é definida como a perda 

degenerativa e não intencional de fibras musculares esqueléticas, e, 

consequentemente, da força, associada ao estresse oxidativo e subsequente 

liberação de ROS (espécies reativas de oxigênio), além de outros fatores 

contribuintes como o envelhecimento, (LENK, K., SCHULER, G., ADAMS, V., 

2010).  

Estudos experimentais em modelos de animais diabéticos 

indicaram que o aumento na degradação de fibras musculares esqueléticas é 

uma característica típica de caquexia e ativação da via de sinalização da 

ubiquitina-proteassoma (UPS), e, tais estudos corroboram a prerrogativa de 

que este sistema desempenha importante papel na proteólise (RUTTEN, E., et 

al., 2006). Em determinadas doenças como o DM, por exemplo, a perda de 

fibras musculares é uma das complicações mais comuns, e, em tais casos, a 

degradação proteica é potencializada e a síntese proteica encontra-se 

diminuída, agravando o quadro do paciente (CHEN, et al., 2011). 

Em relação à via de sinalização da ubiquitina-proteassoma (UPS), 

podemos dividir o processo em duas etapas distintas e sucessivas: (1) a 

ligação covalente de múltiplas moléculas de ubiquitina à proteína alvo; e, (2) 



 
 

25 
 

degradação da proteína marcada pelo proteassoma 26S. Inicialmente a 

ubiquitina é ativada em seu resíduo terminal C pela enzima de ativação E1. 

Após a ativação, uma das várias enzimas E2 (enzimas de conjugação da 

ubiquitina) transferem a ubiquitina de E1 para um membro de uma família de 

proteínas ligases da ubiquitina, E3, no qual o substrato proteico é ligado.  Esta 

enzima catalisa o último passo no processo de conjugação, a ligação covalente 

da ubiquitina ao substrato. A primeira metade é transferida a um grupo ε-NO2 

de um resíduo Lys do substrato da proteína para gerar uma ligação 

isopeptídica. A primeira metade também pode estar conjugada de um modo 

linear para o resíduo N-terminal do substrato. Em reações sucessivas uma 

cadeia de poliubiquitinas é sintetizada por transferência de ubiquitinas 

adicionais ao resíduo Lys48 da molécula previamente conjugada. A cadeia 

serve, muito provavelmente, como um marcador para o reconhecimento da 

proteólise pelo proteassoma (CIECHANOVER, A., 1998). A Figura 1 a seguir 

ilustra com clareza esse processo: 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

26 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dentre as diversas enzimas que constituem as estruturas 

responsáveis pelo processo de reconhecimento e degradação de proteínas, 

destacaremos em nossos estudos duas principais: MuRF1, uma enzima ligase 

E3, e relacionada a um processo acelerado de proteólise bem como um 

Figura 1: Sistema proteolítico dependente de ATP 
Fonte: adaptado de Hasselgren e Fischer, 1999. 



 
 

27 
 

mediador molecular de atrofia muscular, muito expresso em fibras musculares 

e no músculo cardíaco (CHEN et al, 2011). Outra enzima de suma importância 

que selecionamos para nossos estudos é a E214kDa, sendo considerada uma 

enzima de conjugação, E2, e sítio de regulação na via de sinalização da 

ubiquitina-proteassoma no músculo esquelético (HOBLER et al., 1999). 

 

1.5. A relação existente entre a UPS e o Fator Nuclear-κB (NF-κB) 

 

Nos modelos experimentais, animais que recebem dose única de 

42mg/kg corpóreo de aloxana, apresentam geração de ROS (espécies reativas 

de oxigênio). Com isso, ocorre indução da atividade do NFκB, o que aumenta 

as propriedades de sua ligação ao extrato nuclear pancreático. Em muitas 

células, a proteína NFκB está localizada no citoplasma ligada a uma família de 

proteínas inibidoras, conhecidas como IκB. Tais proteínas bloqueiam o sinal 

nuclear do NFκB e ajudam a manter tal estrutura no citoplasma, (YAMAMOTO, 

2001). 

O NFκB exerce papel fundamental na transcrição de genes 

específicos no núcleo celular, onde ele é apto a interferir em diferentes genes 

alvo ao longo de um repertório de mais de 200 genes implicados na apoptose 

celular, no crescimento celular, na resposta imune e inflamação. (NOGUEIRA, 

L., et al., 2011). Uma ampla variedade de estímulos tais como produtos 

bacterianos, parasitários, vírus e produtos virais, citocinas inflamatórias, células 

T, células B, inibidores da síntese proteica, estresse oxidativo e físico e uso de 

drogas levam a uma aceleração do precursor, degradação do inibidor e 



 
 

28 
 

consequente translocação do fator heterodimérico ativo do citoplasma para o 

núcleo, onde ele exerce sua atividade transcricional (ORIAN, A., et al., 1995). 

A relação existente e sumária na ativação dos precursores 

responsáveis pela atividade do NF-κB são conhecidos como p105 e p100. Em 

muitos casos o NF-κB é um complexo heterodimérico composto de duas 

subunidades conhecidas como p50 e p65. A subunidade p50 é sintetizada a 

partir de um precursor, o p105, que é processado a uma proteína madura 

seguida de remoção do resíduo C-terminal via ubiquitinação. Possivelmente o 

segundo precursor também é ubiquitinizado para dar origem à segunda 

subunidade, (ORIAN, A., et al., 1995).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2: Via canônica e não canônica de ativação do NF-κB  
Fonte: adaptado de Vaughan e Jat, 2011 

 

Vários são os fatores transcricionais envolvidos na síntese do 

GLUT4. Entre eles, destaca-se o NFκB, como um componente estrutural 



 
 

29 
 

inibidor da transcrição gênica de GLUT4, que como citado anteriormente, é 

caracterizado como o mediador da ação de citocinas tais como o Fator de 

Necrose Tumoral α (TNF-α), Interleucina-1β e Receptor de Produtos Finais de 

Glicação Avançada (RAGE/AGER), (ALVEZ et al., 2005). Apesar do estímulo 

insulínico e da atividade contrátil promoverem a translocação da proteína 

GLUT4, seu impacto sobre o GLUT4 e os mecanismos envolvidos ainda não 

foram bem caracterizados, (SILVA, J. et al., 2005). 

Grande parte dos modelos experimentais de exercício físico tem 

sido baseado em exercícios aeróbios, de longa duração e baixa-moderada 

intensidade, o que gera dúvidas sobre os possíveis efeitos de esforços mais 

intensos e intermitentes sobre as adaptações geradas pelo treinamento. Sendo 

assim, esse estudo faz-se necessário devido à escassez de informações na 

literatura que abordam os efeitos do exercício anaeróbio no metabolismo da 

glicose e catabolismo muscular em ratos diabéticos induzidos por aloxana 

auxiliando na elaboração de novos possíveis programas de treinamento para 

portadores de diabetes mellitus tipo 1, que, ainda devido à dificuldade de 

disseminação da prática esportiva para esse público em questão, encontram-se 

à mercê apenas da insulinoterapia como principal método regulador da 

glicemia. 

 

 

 

 

 
  



 
 

30 
 

2. OBJETIVO 

 

Compreender o efeito de seis semanas de treinamento de salto 

em meio líquido sobre conteúdo proteico e expressão gênica (gene Slc2a4) da 

proteína transportadora de glicose - GLUT4 respectivamente, expressão gênica 

da Ubiquitina (gene UBb), da enzima de conjugação E214kDa, MuRF1 – 

ubiquitina ligase E3 (gene Trim63), do Fator Nuclear – NF-κB, e da proteína 

cinase ativada por AMP – (gene Prkaa2), no músculo gastrocnêmio de ratos 

diabéticos induzidos por administração de aloxana.  

 

  

3. PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS 

 

3.1. Procedimento experimental 

 

Para o procedimento experimental, inicialmente, foram obtidos 40 

ratos machos da linhagem Wistar, 2 meses de idade, peso corporal na média 

de 250 g ± 33,5g (calculados por média ± desvio padrão) que, foram divididos 

inicialmente e randomicamente em: grupo controle sedentário (CS) – 20 

animais, grupo diabético sedentário (DS) – 16 animais. Posteriormente estes 

animais foram submetidos à semana de adaptação ao treinamento (descrito no 

item 3.2) e aqueles que conseguiram nadar e se sentiram mais confortáveis 

foram alocados nos grupos exercitados, estabelecendo assim os seguintes 

grupos experimentais: grupo controle sedentário (CS) – 10 animais, grupo 



 
 

31 
 

diabético sedentário (DS) – 8 animais, controle exercitado (CE) – 10 animais, 

grupo diabético exercitado (DE) – 08 animais. 

Os animais se tornaram diabéticos após receberem uma dose 

única de Aloxana a 120 mg/kg peso corpóreo, administrada via intraperitoneal, 

conforme protocolo estipulado por Freitas et al., 2005. Após a aplicação de 

aloxana, os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas e receberam água 

com glicose durante as primeiras 24 horas. Posteriormente, os animais foram 

mantidos à temperatura média de 22 ± 2°C, com ciclos de 12 horas de 

luminosidade, sendo das 7:00 as 19:00 (período claro) e das 19:00 as 7:00 

(período escuro). Estes animais foram alimentados com ração padrão (Supra 

Lab, Alisul Ind. Alimentos LTDA, RS) e água fornecida ad libitum. Os animais 

controle receberam solução salina (NaCl 0,9%) via intraperitoneal como 

solução placebo para mimetizar o estresse provocado aos diabéticos pelo 

manuseio e introdução da agulha na região indicada. 

Para a constatação da instalação do diabetes mellitus, após 7 a 

21 dias foi avaliado o volume de urina excretado, bem como presença ou não 

de glicosúria e glicemia com valores >200 mg/dL.  A glicemia foi aferida por 

glicosímetro (Biocheck, Bioeasy Diagnostica), após corte na região distal da 

cauda para coleta de gota de sangue na glicofita. A insulina para controle 

glicêmico foi administrada via subcutânea, sendo 2UI (Unidades Internacionais) 

pela manhã (por volta das 9 horas), do tipo NPH com ação intermediária, 

considerando-se o início da ação de 1-3 horas da aplicação e pico de 8-12 

horas. 

 



 
 

32 
 

3.2. Protocolo de treinamento de salto no meio líquido 

  

Os animais passaram por um período de adaptação ao meio 

líquido seguindo o protocolo estipulado por Ribeiro et al, (2012), onde os 

animais permaneceram durante 5, 10 e 15 minutos em água rasa; 5, 10 e 15 

minutos em água profunda; 5 minutos com um colete acoplado ao tórax; e, 5, 

10 e 15 minutos com um colete contendo uma carga equivalente à 3% do peso 

corporal do animal. O protocolo de treinamento foi baseado nos estudos de 

Rogattoet al., (2004), onde os animais dos grupos exercitados realizaram uma 

sessão de atividade física que consistiu de saltos em tanque com água, com 

sobrecarga equivalente a 50% do peso corporal de cada animal, acoplado ao 

tórax. A sessão de exercícios consistiu da realização de 3 séries de 12 saltos 

com 1 minuto de intervalo entre as séries sendo 3 vezes por semana, durante 6 

semanas. Os saltos foram realizados em um tubo de PVC com 250 mm de 

diâmetro, visando limitar as alternativas do animal em seguir para outra 

direção, favorecendo o salto vertical. A contagem das repetições ocorreu cada 

vez que o animal se projetou em direção à superfície da água para respirar. A 

temperatura da água foi mantida entre 30ºC e 32ºC por ser considerada 

termicamente neutra em relação à temperatura corporal do rato, Azevedo, 1994 

apud Rogatto et al, 2004. A figura 3 a seguir ilustra com mais clareza esse 

procedimento:  

 

 

 

 



 
 

33 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.3. Coleta do material 

 

A realização dos exercícios foi de seis semanas, sendo a primeira 

semana para adaptação ao meio líquido. Os grupos CE (Controle Exercitado), 

DE (Diabético Exercitado) foram expostos ao protocolo de treinamento em 

meio líquido. Segundo Zanchi et al, 2009, o pico de expressão gênica da 

MuRF-1 ocorre 24 horas após a última sessão de treinamento resistido, o que 

nos levou a padronizar o sacrifício após 24 horas da última sessão de treino do 

período de 6 semanas de exercícios. Para o procedimento de extração foi 

adotada administração intraperitoneal de tiopental sódico (40 mg/kg PC). 

Amostras do músculo gastrocnêmio de ambos os grupos foram coletadas para 

análise, sendo, posteriormente identificados, congelados em nitrogênio líquido 

e guardados a temperatura de -80°C para um processamento subsequente. 

Todo o procedimento foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de 

Animais (CEUA) local sob o protocolo n° 02/2012 (vide ANEXOS, p.21). 

 

Figura 3: a) Instrumento para realização de saltos em tanque; b) Instrumento 
utilizado em nosso laboratório. 
Fonte: Rogatto et al., 2004. 



 
 

34 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.4. Quantificação do RNAm do gene Slc2a4, Gapdh, UBb, E214kDa, 

Trim63, NFκB e Prkaa2. 

 

As amostras de tecido musculares foram homogeneizadas em 

homogeneizador modelo OMNI TH – USA (Life technologies™ - GIBCO BRL, 

Gaithersburg, USA) com BrazolReagent® (Invitrogen) conforme especificação 

do fabricante, para obtenção do RNA total das amostras.  

A análise da concentração de RNA total foi feita utilizando-se 1 µL 

da amostra solubilizada de RNA total adicionado a 79 µL de água DPEC para 

Figura 4: Organograma do desenho experimental – randomização, indução do 
diabetes, treinamento, eutanásia e análise. 

Períodos 1/3- Animais com 2 meses de 
idade; 
 
Período 4- Animais com 2 meses e 14 dias; 
 
Período 5- Animais com 2 meses ao início 
do treinamento e aproximadamente 4 meses 
ao final; 
 
Período 6: Animais com aproximadamente 
5 meses de idade. 
 
CE: controle exercício; CS: Controle 
sedentário; DE: Diabetes Exercício; 
DS: Diabetes Sedentário 



 
 

35 
 

leitura em espectrofotômetro (Gene Quant, AmershamBiosciences, GE 

Healthcare) em 260nm. 

 

3.5. Verificação da integridade do RNA total e obtenção do cDNA 

 

Para verificar a integridade do RNA total extraído foi realizada 

uma preparação das amostras para corrida eletroforética em gel de agarose. 1 

µg de cada amostra foi acrescido a 1 µL de Brometo de Etídio (EtBr). Em 

seguida, tal mistura foi aplicada no gel de agarose 1% e corridos com tampão 

de corrida Running Buffer 1X (75V, 400mA, ̴ 45min) e verificados em UV, 

observando a presença e qualidade das duas bandas, 28S e 18S, com relação 

de 1,5/1. As imagens foram obtidas através do sistema de fotografia KODAK 

Molecular Imaging Software Version 4.0,2-User e Eletronic UV Transilluminator 

Ultra. Lum. Inc.. 

Amostras de 5 µg de RNA total que foram extraídas dos tecidos 

foram submetidos à reação de transcrição reversa com primers randômicos 

para a síntese de uma fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA). Para isto, 

foi adicionado em casa amostra: 1 µL de H2O DEPC, 4 µL de tampão da 

enzima (50mM de Tris-HCI pH 8,3, 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl2), 2 µL DTT 

(10 mM), 1 µL mistura de dNTPs (0,5 mM cada), 0,5 µL Random (0,3 µg/µL) e 

1 µL da enzima Transcriptase Reversa (200U; Invitrogen®, EUA), em volume 

final de 8,5 µL, completos com H2O DEPC. As amostras passaram por uma 

série de incubações, sendo 10 minutos a 25°C para ligação do Random, 1 hora 

a 42°C na presença de 1 µL da enzima para anelamento e extensão, 15 

minutos a 70°C para desnaturação da enzima e fim da reação. 



 
 

36 
 

 

3.6. Reação em Cadeia da Polimerase para amplificação dos genes. 

 
 

O protocolo da Reação em Cadeia de Polimerização(PCR) 

utilizado foi: alíquotas de 1µL do produto final de RT-PCR (cDNA), juntamente 

com 10pmol dos primers específicos para os genes abaixo: 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Todos os oligonucleotídeos supracitados foram submetidos à 

amplificação em 24 μL de um “mix” contendo 5,0 μL de tampão 10x Taq 

Quadro 1: Relação dos genes específicos que foram analisados e seus 
respectivos primers 



 
 

37 
 

Polimerase (Promega®), 1,5 µL de cada dNTPmix 10 mM, 1,5 µL de MgCl2 50 

mM, 0,125 µL da enzima Taq DNA Polimerase [5U/µL] (Promega®) e 15,875 

µL de água Mili-Q autoclavada. As reações de PCR foram realizadas com um 

passo inicial de desnaturação do molde de cDNA a 95°C por 2 minutos e 

posterior anelamento com temperaturas específicas para cada primer conforme 

padronização realizada, e extensão de 72°C por 45s. Por fim, o material foi 

resfriado a 4°C até a realização da eletroforese em gel de agarose. As 

incubações foram realizadas em termociclador automático Techne TC-312. 

Os produtos amplificados foram posteriormente submetidos à 

eletroforese em gel de agarose - EtBr e visualizados com iluminação UV. As 

imagens foram adquiridas em equipamento de fotovideodocumentação 

(KODAK Molecular Imaging Software Version 4.0,2-User e Eletronic UV 

Transilluminator Ultra. Lum. Inc) e para análise densitométrica das bandas 

obtidas foi utilizado o software Scion Image (Scion Corporation, Frederick, 

Maryland, EUA), apropriado para este fim. 

A expressão do RNAm para os genes Slc2a4, E214kDa, UBb, 

Pkraa2, Trim63 e NFκB p105 foi normalizada pela expressão da Gapdh 

(proteína constitutiva), calculada pela razão entre os valores da densitometria 

do gene de interesse e do gene constitutivo. 

 

3.7. Preparação das amostras para o Western Blotting (quantificação de 

proteínas para o transportador de glicose GLUT4) 

 

Para a técnica de Western Blotting foi utilizado o músculo 

esquelético gastrocnêmio em membranas totais (MT). Para isso os tecidos 



 
 

38 
 

foram homogeneizados e posteriormente centrifugados a 1000g durante 10 

minutos, 4°C. O sobrenadante foi guardado e o precipitado ressuspenso em 

mesmo tampão (1/3 do volume inicial) e submetido novamente à centrifugação 

(1000g) por 10 minutos, a 4°C. Os dois sobrenadantes foram somados e então 

submetidos à uma ultracentrifugação a 150.000g por 75 minutos, a 4°C. O 

sedimento correspondeu à fração de membranas totais (MT), foi ressuspenso 

em 600 µL de tampão de homogeneização e estocado a -20°C até a posterior 

utilização. 

 

3.8. Western Blotting – método para quantificação de proteínas 

 

Inicialmente as amostras foram submetidas à uma corrida 

eletroforética em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Com essa técnica é 

possível separarmos as proteínas segundo seu peso molecular sem que as 

unidades protéicas sejam perdidas. Foi utilizado o método citado por Gomes, 

2010, o qual envolve a utilização de dois géis contíguos, mas diferentes: o gel 

de empacotamento (staking gel – Acrilamida 5,8%; Bisacrilamida 0,16%; Tris 

0,5M pH 6,8; EDTA8mM; SDS 0,1% TEMED 0,05%; persulfato de amônio 

0,06%) e o gel de separação  (resolving gel – Acrilamida 9,7%; Bisacrilamida 

0,3%; Tris 1,5M pH 8,9; EDTA 8mM; SDS 0,125%, TEMED 0,05% persulfato 

de amônio 0,05%). 

Amostras de frações de membrana (20-30µg de proteína / lane, 

dependendo do tecido) foram solubilizadas em tampão de Laemmli (glicerol 

15%, Tris  0,05M, Bromophenol Blue 0,05%, SDS 9%, 2-Mercaptoetanol 6%) e, 



 
 

39 
 

então, submetidas a fervura sob 95°C durante 5 minutos para posterior corrida 

em gel. 

A eletroforese vertical foi iniciada sob voltagem constante em 

75mV até que ocorresse o empacotamento da amostra, o que pode ser 

observado na transição dos dois géis (aproximadamente 1 hora e 30 minutos). 

Posteriormente, foi aplicada uma corrente constante de 55mA para a corrida no 

gel de separação (aproximadamente 4 horas e 30 minutos), utilizando-se como 

tampão de corrida Tris 25mM, Glicina 190 mM, SDS 0,1%, EDTA 2mM, pH 8,3. 

Juntamente com as amostras sempre foi colocado um padrão de proteínas de 

conhecidos pesos moleculares (marcadores), o que facilitará a localização da 

proteína desejada para o estudo.  

Após a separação das frações proteicas em gel de poliacrilamida, 

foi realizada a transferência eletroforética dessas frações para uma membrana 

de nitrocelulose Hybond-C Super(GE Healthcare,  AMERSHAM Biosciences, 

UK). 

A transferência foi realizada sob corrente constante de 42mA, em 

temperatura de 40°C por 16 horas, utilizando-se como tampão de transferência 

Tris 12,5mM, Glicina 95mM, metanol 20%, pH 8,3. A qualidade da transferência 

foi verificada corando-se o gel pós-transferência com azul brilhante de 

Comassie. 

 

3.9. Imunodetecção (Immunoblotting) – ECL (Enhanced 

Chemiluminescence) 

 



 
 

40 
 

Após a transferência eletroforética, foi iniciado o processo de 

imunodetecção. Primeiramente, realizou-se um bloqueio inespecífico com leite 

desnatado – 23g de leite em 100ml de PBS 1X (NaCl 0,8%, Na2HPO4[12H2O] 

0,115%, KCl 0,02%, KH2OPO4 0,02%) durante 1 hora em temperatura 

ambiente e, em seguida,  a membrana foi incubada com anticorpo anti- GLUT4 

(antissoro comercial de coelho – Chemicon International, Temecula, California) 

com diluição de 1:3000 em PBS 1X + BSA 8%), durante 3 horas a 37°C. 

Posteriormente a membrana recebeu uma série de 3 lavagens de 

5 minutos com 10 ml de solução de lavagem (PBS 1X + 0,1% Tween 20). Em 

seguida foi realizada uma incubação com o anticorpo secundário anti-IgG (GE 

Technologies®) de coelho, marcado com peroxidase (HRP), diluído 1:10000, 

em solução bloqueadora (1g de leite em pó + 20ml de PBS 1X + 0,05% de 

Tween 20) durante 1 hora.  A membrana foi lavada vigorosamente com solução 

de lavagem e colocada em contato com solução de detecção (H2O destilada + 

Luminol + Ácido P-Cumárico + Tris 1M [pH8,5] + Peróxido de Hidrogênio) por 1 

minuto – reação de ECL. 

Por fim, a membrana foi exposta a Hyperfilm® (IGF – Corporation, 

New Jersey, USA) por períodos de 1,5 a 3 minutos para detecção das bandas 

resultantes. Após este período o filme foi revelado com solução reveladora e 

reforçadora (KODAK), sendo evidenciados os “blots” correspondentes à 

proteína transportadora GLUT4. A normalização utilizou como parâmetro os 

blots corados com Pounceau ao final do processo de transferência para 

membrana de nitrocelulose. 

O filme foi fotografado por uma câmera do aparelho de 

fotodocumentação Gel Logic 100 (Kodak Molecular Imaging, EUA), e as 



 
 

41 
 

imagens foram analisadas por densitometria utilizando-se o software 

ScionImage for Windows (Scion Corporation, EUA). A intensidade dos “blots” e 

os resultados em cada membrana foram normalizados considerando-se 100% 

o valor obtido pelo grupo controle (GC).  

 

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 

 

A normalidade dos dados foi confirmada pelo teste 

de Kolmogorov-Smirnov. A comparação dos valores de perda percentual de 

peso corporal, sensibilidade à insulina após seis semanas de treino, da 

expressão gênica, conteúdo e fosforilação das proteínas foi realizado o teste de 

ANOVA one-way com post-hoc (Newman-Keulls) quando necessário. As 

diferenças entre os grupos foram consideradas significantes quando o valor 

de p < 0,05. O pacote estatístico utilizado foi Graph Pad Prism 5.0 for Windows. 

 

5. RESULTADOS 

 

Na Tabela 2, pode-se observar que os animais dos grupos 

crônicos (DEC, DSC, CEC e CSC) obtiveram alterações interessantes, no que 

concerne aos dados relacionados às massas de diferentes estruturas. Os 

animais dos grupos DEC e DSC apresentaram massa adiposa inferior aos 

animais do grupo CSC. O grupo DEC demonstrou ganhos de massa magra 

(músculo gastrocnêmio) superiores aos animais sedentários (DSC) e igualou 

seus parâmetros aos controles (CEC e CSC).  A musculatura glicolítica (EDL) 

se alterou ao longo do treino com maior variabilidade intergrupos, o grupo DEC 



 
 

42 
 

apresentou peso de músculo inferior ao grupo CEC; o grupo DSC, entretanto, 

demonstrou peso inferior a todos os demais grupos inclusive o grupo diabético 

treinado. O grupo CSC também obteve ao longo de 6 semanas de observação 

peso inferior ao grupo CEC. A musculatura solear no grupo DEC apresentou 

peso inferior ao grupo CEC. O DSC, como previsto demonstrou alterações 

inferiores de peso solear em relação a todos os demais grupos. Os grupos 

diabéticos (sedentário e controle) apresentaram valores de peso corporal 

absoluto reduzido em comparação aos grupos controle. 

 

Tabela 2: Demonstrativo de massa em gramas de tecido muscular e tecido 

adiposo retrorenal de ratos diabéticos induzidos e expostos ao treinamento 

anaeróbio crônico em meio líquido 

 

Demonstrativo de parâmetros morfométricos de ratos diabéticos expostos a um 

protocolo de exercício anaeróbio de 6 semanas em meio líquido. Valores expressos em 

média ± EPM; βp < 0,0008 para DEC vs CSC; € p < 0,0008 para DSC vs CSC; ξ p < 

0,0008 para CEC vs. CSC; *p< 0,001 para DSC vs. DEC, CEC e CSC; # p < 0,0003 

para DEC vs CEC, & p < 0,0004 para DSC vs DEC, CEC e CSC, ς p < 0,0004 para 

CSC vs CEC; §p < 0,0003 para DEC vs CEC; ×p < 0,0003 para DSC vs. DEC, CEC e 

 DEC DSC CEC CSC p 
Gordura (g) 0,165±0,11β 0,776±0,30€ 1,54±0,36ξ 2,27±0,24 0,0008 

Gastrocnêmio (g) 1,124±0,10 0,859±0,11* 1,43±0,06 1,32±0,05 0,001 

EDL (g) 0,113±0,009# 0,089±0,01& 0,146±0,005 0,12±0,005ς 0,0004 

Sóleo (g) 0,133±0,008§ 0,110±0,006× 0,159±0,003 0,14±0,007 0,0003 

Peso Corporal (g) 239,8±9,86£ 240,6±12,1£ 304,1±5,88¢ 340,1±12,8 0,0001 



 
 

43 
 

CSC. £ p < 0,0001 para DSC; DEC vs. CSC e CEC; ¢ p < 0,0001 para CEC vs. CSC. 

Valores expressos mediante aplicação de teste estatístico para análise paramétrica – 

ANOVA One-way com pós teste de Newman Keulls, p<0,05. 

 

Na Figura 5 é apresentado o valor do kITT (constante de 

decaimento da glicose) obtido durante o teste de tolerância à insulina dos 

grupos diabéticos exercitados e controles exercitados. Observa-se diferença 

significante na sensibilidade à ação insulínica (p < 0,0159), com o grupo 

diabético apresentando maior kITT, ou seja, maior sensibilidade à insulina. Vale 

ressaltar que estes animais, embora diabéticos, apresentavam-se sob 

insulinoterapia. 

 

 

 

 

 

 

   

 

 

 

Figura 5: Constante de decaimento da glicose sérica (kITT) analisada em 

animais diabéticos e controles expostos ao treinamento anaeróbio crônico de 6 

semanas. Valores expressos em Média ± EPM. * p < 0,0159 para DE vs CE. 

 



 
 

44 
 

Dados obtidos através das análises de glicemia sérica após 6 

semanas podem ser observados na Figura 6. O exercício anaeróbio foi eficaz 

em reduzir a glicemia sérica após 6 horas de treino, enquanto que os animais 

do grupo CEC não obtiveram alterações significativas em nenhuma etapa de 

análise. O treinamento crônico se mostrou eficaz em melhorar o perfil glicêmico 

em relação ao treinamento agudo; as alterações em modelos de diabetes 

responderam de maneira significativa aos estímulos em relação aos animais 

saudáveis. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 6: Demonstrativo de glicemia sérica de ratos diabéticos expostos a um 

protocolo de exercício anaeróbio em meio líquido de 6 semanas. Valores 

expressos em média ± EPM; & p< 0,001 para DE 6 HORAS vs. DE PRÉ e DE 

PÓS; § p < 0,0001 para CE PRÉ vs. DE PRÉ, DE PÓS e DE 6 HORAS; ** p < 

0,0001 para CE PÓS vs. DE PRÉ, DE PÓS e DE 6 HORAS; * p < 0,0001 para 

CE 6 HORAS vs. DE PRÉ, DE PÓS e DE 6 HORAS. Valores expressos 



 
 

45 
 

mediante aplicação de teste estatístico para análise paramétrica – ANOVA 

One-way com pós teste de Newman Keulls, p<0,05. 

Na Figura 7, a poliúria (excesso de urina excretada) foi 

comprovada com diferença entre os grupos DEC e DSC em relação aos grupos 

CEC e CSC com p< 0,0054. O treinamento, entretanto, não alterou tais 

variáveis entre os grupos DEC e DSC. Os dados determinam que o 

treinamento foi eficaz em reduzir a glicosúria, fato corroborado pela análise de 

glicemia sérica previamente descrita.  Demais parâmetros como cetona e 

urobilinogênio permaneceram dentro de uma faixa de normalidade intergrupos 

com exceção dos eritrócitos que se mostraram elevados no grupo DEC. A 

bilirrubina se mostrou inalterada entre os grupos DEC e CSC, porém, os dados 

ratificam alterações nos grupos DSC e CEC. Os animais DSC obtiveram 

menores valores na concentração de nitrito excretada, enquanto que os demais 

grupos quase não obtiveram alterações. Em relação aos níveis de proteína, o 

grupo DEC apresentou elevações em relação aos demais grupos. Os grupos 

exercitados (DEC e CEC) manifestaram menores concentrações de leucócitos 

em relação aos grupos sedentários (dados não apresentados). 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

46 
 

Figura 7: Demonstrativo de urina excretada ao final de 6 semanas de 

treinamento anaeróbio em meio líquido após 24 horas de isolamento em gaiola 

metabólica. Para significância estatística consideramos p inferior a 5%. Valores 

expressos em média ± EPM. * p< 0,0054 para CS vs. DE, DS; CE vs. DE, DS. 

 

Não houve alteração na expressão do gene Prkaa2 que codifica a  

proteína cinase ativada por AMP (AMPKα2) após 24 horas da última sessão de 

treino em nenhum grupo observado (Figura 8). 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

Figura 8: Demonstrativo de expressão gênica em Unidades Arbitrárias (UA) do 

gene decodificador da proteína Prkaa2, gene Prkaa2, no músculo gastrocnêmio 

de ratos diabéticos e controles expostos a treino anaeróbio de 6 semanas. 

Valores expressos em média ± erro padrão. DEC n= 6; DSC n= 6; CEC n= 6 e 

CSC n= 6. 

Na Figura 9, observa-se o padrão de expressão do gene Slc2a4 

após realização de exercício crônico. O salto em meio aquático cronicamente 



 
 

47 
 

realizado pelos diabéticos (DEC) causou aumento na expressão do Slc2a4 

comparado ao grupo que não realizou o exercício (DSC) (*p< 0,0484 para DSC 

vs DEC).  

 

 

 

. 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 9 - Conteúdo de expressão gênica expresso em Unidades Arbitrárias 

(UA) do gene que codifica a proteína transportadora de glicose 4 (GLUT4), o 

Slc2a4 em músculo gastrocnêmio de ratos Wistar diabéticos e controles 

expostos ao treinamento crônico anaeróbio de 6 semanas. Valores expressos 

em média ± EPM, *p< 0,0484 para DSC (n= 5) vs. DEC (n=5). 

 

Em contrapartida, biomarcadores de proteólise como a isoforma 

da Ubiquitina (Ubiquitina B) UBb apresentou alterações gênicas significantes 

no músculo gastrocnêmio em comparação com animais sedentários (Figura 

10), sendo, p< 0,05 para diabéticos sedentários comparados aos seus 

respectivos controles sedentários (DSC e CSC) que apresentaram valores 



 
 

48 
 

substanciais de expressão bem mais elevados. O mesmo comportamento pode 

ser observado quando comparamos os animais controles exercitados (CEC) 

aos grupos sedentários. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 10: Demonstrativo de expressão gênica (Unidades Arbitrárias) do gene 

decodificador da Ubiquitina B, Ubb, em músculo gastrocnêmio de ratos wistar 

expostos a um protocolo de treino anaeróbio em meio líquido durante 6 

semanas. * p< 0,05 para DEC (n= 5) vs. DSC (n= 5) e CSC (n= 5); **p < 0,05 

para CEC (n= 6) vs. DSC e CSC.  

 

A enzima de conjugação E214kDa considerada marcador sumário 

da via proteolítica ubiquitina-proteassoma apresentou significativas alterações 

em relação aos grupos sedentários que demonstraram níveis mais elevados de 

expressão gênica do gene decodificador desta proteína, sendo, p< 0,05 para 

DEC vs DSC e CSC (Figura 11).  



 
 

49 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 11: Demonstrativo de expressão gênica (Unidades Arbitrárias) do gene 

decodificador da enzima de conjugação E214kDa no músculo gastrocnêmio de 

ratos wistar diabéticos e controle expostos a um protocolo de treino anaeróbio 

em meio líquido durante 6 semanas. * p< 0,05 para DEC (n= 5) vs. DSC (n= 6) 

e CSC (n= 6). Valores expressos em média ± erro padrão. 

 

O treinamento surtiu alterações significativas em expressão do 

gene que codifica a proteína MuRF-1 (MuscleRingFinger), Trim63,  na 

musculatura apresentando padrão comportamental para sedentários com 

maiores níveis de expressão comparadas aos exercitados (Figura 12), sendo, p 

< 0,0191 para DSC comparado aos demais grupos (DEC, CEC e CSC). Os 

maiores níveis apresentados pelo grupo DSC comprovam a eficácia do DM em 

ativar a via ubiquitina-proteassoma em modelos de diabetes mellitus bem 

instalado e sem o tratamento insulínico e/ou acompanhamento devido de um 



 
 

50 
 

profissional em educação física para monitorar um programa de treinamento 

adequado. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 12: Demonstrativo de expressão gênica expresso em Unidades 

Arbitrárias (UA) do gene decodificador da proteína MuRF-1 (Muscle Ring 

Finger) no músculo gastrocnêmio de ratos Wistar diabéticos e controles 

expostos a um protocolo de treinamento anaeróbio em meio líquido durante 6 

semanas. Valores expressos em média ± erro padrão. * p < 0,0191 para DSC 

(n= 6) vs. DEC (n= 5), CEC (n= 7) e CSC (n= 6). 

 

Não foram constadas diferenças significativas nos níveis de 

expressão gênica do Fator Nuclear κappa B (NFkB) em nenhum grupo 

observado (Figura 13).  

 

 

 



 
 

51 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 13: Demonstrativo de expressão gênica do Fator Nuclear κB subunidade 

p105 no músculo gastrocnêmio de ratos diabéticos e controles expostos a um 

treinamento anaeróbio de 6 semanas em meio líquido. Valores expressos em 

média ± erro padrão. 

 Em relação ao conteúdo proteico de GLUT4 (Transportador de 

Glicose 4), constatamos aumentos significativos no grupo CEC com p < 0,05 

em comparação aos demais grupos (Figura 14), tal observação corrobora a 

importância da prática regular de exercício físico para melhorar o perfil 

metabólico em estruturas celulares. Entretanto, não constatamos melhoras 

deste parâmetro no grupo diabético exercício. 

 

 

 

 



 
 

52 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 14: “Imunoblotting” – imagem típica de um ensaio de Western Blotting – 

ECL. Conteúdo proteico de GLUT4 em membranas totais, sendo, *p< 0,05 para 

CEC vs. DEC, onde DEC n=5, DSC n= 4, CEC n= 5 e CSC n= 5. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

53 
 

6. DISCUSSÃO 
 

O exercício é um componente importante na melhoria dos 

sintomas deletérios do diabetes mellitus (DM) em virtude de um sistema 

complexo de adaptações estruturais que incluem melhora da sensibilidade à 

insulina, perfil glicêmico, redução da pressão arterial e risco global de doenças 

cardiovasculares e deve ser considerado como método para tratamento desta 

doença (BELOTTO, 2010, KIM, 2011, REYNA, 2013).  

Este estudo demonstra que mesmo em exposições em curto e 

longo prazo ao diabetes mellitus insulino-dependente e sem o tratamento 

insulínico adequado os animais manifestaram considerável perda de peso. Tal 

informação pode ser corroborada pela hipoinsulinemia decorrente desta 

doença, levando a um estado catabólico de proteínas e gorduras. Outro fator 

contribuinte e ratificado neste estudo está na excreção de glicose (glicosúria) 

associada à poliúria, (MOURA et al., 2012). Neste trabalho observamos 

melhora na captação de glicose pós treino em um período de 6 horas de 

intervenção, tal alteração se deve ao estado estável de adaptação ao exercício 

com consequente mobilização de proteínas intracelulares relacionadas ao 

metabolismo celular (Slc2a4) e efeito EPOC (Consumo de Oxigênio Pós 

exercício).  

Foi possível observar redução significante na concentração de 

glicose sérica em comparação com animais diabéticos pré- e pós-treinamento 

(CAO, 2010), além de elevada glicemia como esperado em relação aos 

controles. A redução da glicemia nestas condições possui respaldo na maior 

captação de glicose pelos tecidos periféricos durante prática de treinamento 

tanto agudo quanto crônico, (ROGATTO, 2004) o estresse muscular ocasiona 



 
 

54 
 

ativação de proteínas intracelulares como a AMPK que estimulada atua em 

vias bioquímicas de captação de glicose e oxidação de ácidos graxos 

(PALACIOS, 2009; LIRA, 2007). Estudos recentes abordam a ativação de 

Akt/PI3k induzida por AMPK, bem como inibição da via mTOR/S6K in vitro 

(TAO, 2010) consideradas vias bioquímicas que desempenham um papel 

central no metabolismo celular. Aumentos do fluxo sanguíneo advindos do 

treinamento físico promovem melhoria no turnover de IR (Receptor de Insulina), 

consequentemente a interação bioquímica de IR com proteínas citosólicas tais 

como PI3-kinase que ativam a translocação de mais transportadores 

específicos de glicose, atuando diretamente na captação. (GOMES, 2009; 

HAWLEY, 2008).  Treinos de caráter agudo estimulam o ganho de massa livre 

de gordura que propicia melhor captação de glicose e maior capacidade de 

armazenamento e depleção dos estoques de glicogênio intracelulares 

(ZANUSO, 2010). Os animais controle, por sua vez, não obtiveram diferenças 

significativas em nenhum momento observado.  

O treinamento nesse sentido exerceu efeito hipoglicemiante 

constatado em diversos estudos com modelos experimentais e clínicos de 

diabetes (LAHAYE, 2010; HUSSEY et al., 2012), porém, poucos trabalhos têm 

focado em protocolos de treinamento anaeróbio de caráter crônico, sendo 

muitos projetos direcionados a programas de treinamento em exercícios 

aeróbios ou combinados (aeróbio + resistido) (BELOTTO, 2010; LAHAYE, 

2010, LIANG, 2012) sendo de suma importância a investigação minuciosa de 

tais intervenções sobre o perfil glicêmico e mecanismos fisiológicos que 

norteiam a melhora do quadro deletério do DM. Neste estudo verificamos que o 

treinamento de 06 semanas ocasionou melhora significante na sensibilidade à 



 
 

55 
 

insulina (Fig. 3), o que estão de acordo com o observado por Hall et al., (2013) 

que apontaram melhoras substanciais na sensibilidade à insulina em ratos 

diabéticos através de um protocolo de treino resistido de 6 semanas.  

Como o músculo gastrocnêmio é formado por um tipo de fibra 

mais prevalente à massa muscular total e representar de forma genérica 

ambos unidades motoras glicolítica e oxidativa, ele foi escolhido para ser 

avaliado em nosso estudo. Assim objetivou-se analisar o impacto do 

treinamento anaeróbio sob biomarcadores de proteólise na musculatura 

oxidativa-glicolítica (gastrocnêmio) em modelos experimentais; tendo em vista 

o aumento da ativação de proteínas proteolíticas já elucidadas na literatura: 

UbB, E214kDa, MuRF-1, MAFbx/Atrogin1 e subunidades do proteassoma como 

a PSMB4 em modelos de diabetes (RAZEGHI, 2006; CHEN, 2011). 

Constatamos redução significativa na expressão gênica de fatores bioquímicos 

proteolíticos (MuRF-1, UBb e E214kDa) ratificando, assim, a importância do 

treino como método terapêutico não-farmacológico na inibição do breakdown 

proteico miofibrilar. Em protocolos de treinamento crônico anaeróbio para 

hipertrofia em modelos experimentais foram constatadas reduções 

significativas nas expressões gênicas de MuRF-1 e Atrogin1 no músculo 

plantar de ratas saudáveis e jejuadas no grupo treinado (ZANCHI, 2009). Sabe-

se que os heterodímeros p50/p65 (NF-κB) se ligam a regiões promotoras da 

MuRF-1 no DNA induzindo a expressão desta e consequente degradação 

proteica, (PLANT et al., 2010; GLASS, 2005). Entretanto, verificamos a 

expressão gênica da subunidade p105 considerada potencializadora da 

translocação do NF-κB ao núcleo e não constatamos diferença significativa 

nestes níveis após 24 horas da última sessão de treino, entretanto, 



 
 

56 
 

consideramos tal efeito advindo do pico de expressão gênica pós treino do 

NFkB, uma vez que analisamos o conteúdo de RNAm responsável pela 

posterior síntese proteica desta estrutura. Informações concernentes à 

expressão gênica afirmam que após 3-12 horas de contração muscular de alta 

intensidade ocorrem respostas celulares referentes à transcrição gênica 

retornando a níveis basais com 24 horas, (ZANCHI, et al, 2009). 

CHEN et al., (2011), analisaram os efeitos de 8 semanas de 

exercício aeróbio sobre a expressão de MuRF-1 em ratos wistar e constataram 

que há redução na expressão gênica deste gene devido à redução do estresse 

oxidativo proporcionada pelo treinamento. Em contraste, o estresse oxidativo 

promove desequilíbrio de proteínas e enzimas que interferem na regulação de 

fatores chave para a homeostase celular. A liberação de ROS direciona as 

células musculares para um ciclo catabólico que leva à degradação muscular, 

bem como ativa a via bioquímica do Fator Nuclear κ B (NF-κB) interferindo 

diretamente na transcrição gênica de genes fundamentais para o metabolismo 

celular. (LENK, SCHULER e ADAMS 2010, YAMAMOTO e GAYNOR, 2001). 

Além disso, o estresse oxidativo desempenha um papel chave na 

potencialização de anormalidades geradas pelo diabetes, visto que a 

hiperglicemia na presença de radicais livres acarreta em autoxidação de 

glicose e glicação proteica (WAYHS, 2010). O metabolismo da aloxana 

promove geração intracelular de ROS (espécies reativas de oxigênio) que 

aliados ao diabetes potencializam o estresse oxidativo (CERETTA, 2012, 

COUGHLAN, 2009).  Em estudos realizados por Zhengtang, (2011), o exercício 

foi eficiente em reduzir o estresse oxidativo e melhorar a captação de oxigênio; 

uma vez que o estresse oxidativo possui relação direta com a resistência a 



 
 

57 
 

insulina induzida por hiperglicemia, inibindo o aumento do transportador de 

glicose GLUT4, a síntese de glicogênio e a fosforilação de fatores chave como 

IR, Akt e GSK3β.  

Estudos recentes apontam a interação entre isoformas 

específicas de PGC-1α (PGc-1α4) na regulação de vias da miostatina e IGF-1 

(Insulin Growth Factor-1) na musculatura esquelética de ratos, ambas 

reguladoras do tamanho e força musculares, (RUAS, 2012). Constatamos 

ganho de massa muscular nos modelos experimentais apresentados neste 

trabalho e consideramos de sumária importância a análise minuciosa de 

parâmetros relacionados à biogênese mitocondrial como informação 

potencializadora de nossos achados, uma vez que o PGC-1α também suprime 

fatores transcricionais da família de proteínas Forkhead incluindo FoxO3 que 

se ligam a regiões promotoras de Atrogin-1. O efeito protetor do PGC-1α, além 

disso, está no bloqueio da indução ou ação de genes específicos de atrofia 

muscular, (SANDRI, et al., 2006). 

Entretanto, mediante quantificação proteica (Western Blotting) 

observamos reduções significativas no conteúdo proteico de proteína 

transportadora de glicose (GLUT4) dos animais diabéticos em relação aos 

animais controle. A dificuldade de síntese protéica pode ser explicada pela 

ação de citocinas inflamatórias, tais como TNF-α e IL-6 que interagem 

bioquimicamente com o receptor específico de membrana (IR) e receptores 

Toll-like (Toll Like Receptors – TLR’s), ocasionando fosforilação da subunidade 

catalítica β do receptor IR e seus substratos, principalmente, IRS-1 em 

resíduos de serina o qual desativa proteínas chave para continuidade da 



 
 

58 
 

cascata de sinalização do GLUT4 e sua posterior translocação para a 

membrana, (KARAGOUNIS, et al, 2010). 

Este resultado associado pode explicar os valores de glicemia 

pós-treino e 6 horas pós-treino, os quais foram reduzidos tanto no exercício 

agudo quanto no crônico, evidenciando a importância desta ferramenta ser 

utilizada por indivíduos diabéticos. Ressalta-se que nos animais crônicos foi 

observada a manutenção de glicemia reduzida mesmo até 6 horas pós-treino 

comparada com o momento pré. Por outro lado, agudamente não se observou 

esta manutenção (dados obtidos em nosso laboratório e ainda não publicados) 

e sim um retorno da glicemia a valor pré-treino, sugerindo que quando 

praticado agudamente, o exercício já exerce seu efeito positivo sobre a 

captação de glicose, porém ele é muito mais eficiente se mantido nos 

indivíduos diabéticos em longo prazo.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

59 
 

7. CONCLUSÃO 
 

Diante do exposto nossos estudos apontam melhorias na 

captação de glicose por meio de protocolo com carga fixa em perfil glicêmico e 

massa muscular medida em gramas em modelos experimentais de diabetes. 

Entretanto, o campo científico é escasso em trabalhos com treinamento 

resistido no que tange à avaliação de parâmetros fisiológicos em modelos de 

DM, no qual nos encontramos encorajados a explorar outras vertentes dentro 

do leque de alternativas, no que diz respeito a protocolos de treino 

intermitentes de intensidade leve, moderada e/ou alta. O treinamento foi 

benéfico em promover melhorias circunstanciais em animais expostos 

cronicamente ao exercício, apesar da necessidade de análise de proteínas 

diretamente relacionadas ao metabolismo celular, biogênese mitocondrial e 

fatores transcricionais que podem potencializar nossas análises e facilitar 

estudos que viabilizem protocolos mais eficientes de treino resistido que ainda 

permanece inconsistente na literatura. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

60 
 

8. ANEXOS 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  



 
 

61 
 

 

  



 
 

62 
 

 

  



 
 

63 
 

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