UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ENGENHARIA CÂMPUS DE ILHA SOLTEIRA VICTOR HUGO CRUZ TOLERÂNCIA DE ADUBOS VERDES ASSOCIADOS A INOCULANTES MICROBIANOS EM SOLO COM TEBUTHIURON Ilha Solteira 2023 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA VICTOR HUGO CRUZ TOLERÂNCIA DE ADUBOS VERDES ASSOCIADOS A INOCULANTES MICROBIANOS EM SOLO COM TEBUTHIURON Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP como parte do requisito obrigatório para obtenção do título de Mestre em Agronomia. Especialidade: Sistemas de Produção Orientador: Prof. Dr. Paulo Renato Matos Lopes Ilha Solteira 2023 AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço imensamente à Santíssima Trindade pelo dom da vida e inteligência; À minha família, Jucileia Cristina Cruz, Luiz Carlos da Cruz, Vilma de Campos Cruz, Ana Carolina de Campos Cruz, Daniele Santina da Cruz Araújo, Laércio Esquerdo, Igor Fabiano Araújo e demais familiares pelo apoio em todos os momentos difíceis que passei; Ao meu orientador, Prof. Dr. Paulo Renato Matos Lopes pela paciência, confiança, preocupação, e em especial, pela sua amizade; Aos membros da banca do Exame Geral de Qualificação e da Defesa de Dissertação, Prof. Dr. Leandro Tropaldi (FCAT/Unesp) e Prof. Dr. Leonardo Gomes de Vasconcelos (UFMT); Aos professores da FCAT/Unesp, especialmente ao Prof. Evandro Pereira Prado; Aos Prof. Dr. Vitor Correa de Mattos Barretto, Prof. Dr. Ronaldo Cintra Lima, Prof. Dr. Ronaldo da Silva Viana que contribuíram significativamente com este trabalho; Aos funcionários da FCAT/Unesp, Alan Roger Cenerine Carvalho, Fábio Ribeiro da Silva, Arnaldo Carneiro da Silva, Mirian Alves de Faria, Heloísa Noemi Bello, Gustavo Faccin, Andréia da Silva Pepeliskof e Carlos Eduardo Gandolfi por todo o suporte técnico e amizade; Ao meu melhor amigo Bruno Rafael de Almeida Moreira, pelos conselhos, companheirismo, diversos momentos felizes e também pela análise na íntegra de dados do meu experimento; Aos meus melhores amigos, Edivaldo Wilson de Lima, Yanca Araujo Frias e Artur Bernardeli Nicolai, pelos conselhos, companheirismo e diversos momentos felizes; Aos meus amigos e membros do GAIA (FCAT/Unesp) e de outros grupos pesquisas, em especial a Thalia Silva Valério, Munick Beato Aragão e Alexandre Ninhaus Silveira; Aos meus melhores amigos de infância e adolescência, Denis Henrique Catelan Cardoso, Jennifer Natsumi Yamamoto, Gustavo Fávaro Lopes e Carla Alves pelos conselhos, incentivos e diversos momentos felizes; À FAPESP (Processo 2021/01884-6) por todo suporte financeiro; Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia – Sistema de Produção da FEIS/Unesp, pela oportunidade; Á Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), que financia o Programa de Pós-Graduação em Agronomia; À empresa MicroGreen - Soluções Biotecnológicas, por ceder os inoculantes microbianos; e Enfim, agradeço a todos e todas que contribuíram direta ou indiretamente pelo desenvolvimento da pesquisa! “Religião e ciência andam juntas. Como disse antes, a ciência sem religião é manca e a religião sem ciência é cega. Elas são interdependentes e têm um objetivo comum – a busca da verdade” Albert Einstein RESUMO O intuito dessa pesquisa foi avaliar a tolerância e a capacidade de fitorremediação da mucuna-cinza (Mucuna pruriens L. var. Pruriens) e feijão- de-porco (Canavalia ensiformis L.) associado a inoculantes microbianos em solo com o herbicida tebuthiuron. A pesquisa foi executada entre setembro/2021 e março/2022, sob delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial triplo, com sete replicatas, resultando no total 126 unidades experimentais. Foram considerados os seguintes fatores: (1º) Tebuthiuron: ausência ou dose recomendada (TBT); (2º) Inoculante microbiano: ausência, líquido (Liq) ou sólido (Sol); 3º (Plantas): ausência, mucuna-cinza (MP) ou feijão-de-porco (CE). Como espécie sentinela foi utilizada a crotalária (Crotalaria juncea). Ao longo do período experimental foram avaliados a altura e a biomassa seca da planta. O potencial ecotoxicológico das amostras de solo também foi avaliado temporalmente por meio do índice de germinação de sementes de alface. Os dados de biomassa seca foram avaliados por meio da análise de variância (ANOVA a 5% de probabilidade) e teste de comparação de médias (Tukey a 5% de probabilidade). Para a elaboração do modelo não- linear de Gompertz utilizou-se os dados de altura (MP, CE e crotalária) e o índice de germinação da alface. As análises estatísticas foram realizadas através dos softwares R, GraphPad Prism e Microsoft Excel® 2019. A longo prazo, a atenuação natural pode dissipar paulatinamente o herbicida tebuthiuron do solo, e isso é perceptível nos bioensaios ecotoxicológicos, pois foram obtidos resultados satisfatórios no índice de germinação final (0,96) e e na velocidade de crescimento (k=0,0314). A M. pruriens foi tolerante ao herbicida tebuthiuron, em virtude do seu rápido estabelecimento (k = 0,109) quando comparado a C. enformis (k = 0,069). Além disso, essa espécie pode ser considerada uma fitorremediadora do herbicida tebuthiuron, em virtude dos resultados obtidos no cultivo de C. juncea (taxa específica de crescimento = 0,0330; biomassa seca: 3,52 g) e bioensaios ecotoxicológicos (velocidade de crescimento =0,0632), quando comparado aos tratamentos com C. ensiformis. Consequentemente, os resultados mostraram que C. ensiformis tem maior dependência da bioaumentação do que M. pruriens. Assim, notou-se que o efeito fitotóxico em C. juncea foi reduzido em CE + Liq/Sol + TBT (CE + Liq + TBT = 6,27 g > CE + Sol + TBT = 6,21 g), além de ser observado melhor desempenho vegetal de L. sativa em CE + Sol + TBT (k = 0,0480) e CE +Liq + TBT (k = 0,0422). Portanto, os achados dessa pesquisa evidenciam que o cultivo de potenciais fitorremediadores associado a bioaumentação podem reduzir os efeitos antagônicos do herbicida tebuthiuron no ecossistema, seja ele edáfico ou aquático. Palavras-chave: bioaumentação, ecotoxicidade, feijão-de-porco, fitorremediação, mucuna-cinza. ABSTRACT The aim of this research was to evaluate the tolerance and capacity of phytoremediation of velvet bean (Mucuna pruriens L. cv. Pruriens) and jack bean (Canavalia ensiformis L.) associated with microbial inoculants in soil with the herbicide tebuthiuron. The research was carried out between September/2021 and March/2022, under completely randomized design, in a triple factorial scheme, with seven replicates, resulting in 126 experimental units. The following factors were considered: (1º) Tebuthiuron: absence or recommended dose (TBT); (2º) Microbial inoculant: absence, liquid (Liq) or solid (Sol); (3º) Plants: absence, velvet bean (MP) or jack bean (CE). Sunn hemp (Crotalaria juncea) was used as sentinel species. Throughout the experimental period, plant height and dry biomass were evaluated. The ecotoxicological potential of the soil samples was also evaluated temporally throughout of the lettuce seed germination index. The dry biomass data were evaluated using analysis of variance (ANOVA at 5% probability) and comparison of average test (Tukey at 5% probability). For the elaboration of the Gompertz non-linear model, the data of plant height and dry biomass were evaluated (MP, CE and sunn hemp), and the germination index of lettuce were used. Statistical analyses were performed using R, GraphPad Prism and Microsoft Excel® 2019 software. In the long term, natural attenuation can gradually dissipate the herbicide tebuthiuron from the soil, and this is noticeable in the ecotoxicological bioassays, as satisfactory results were obtained in the final germination index (0.96) and growth speed (k=0.0314). M. pruriens was tolerant to the herbicide tebuthiuron due to its rapid establishment (k = 0.109) when compared to C. ensiformis (k = 0.069). Furthermore, this species can be considered a phytoremediator of the herbicide tebuthiuron due to the results obtained in C. juncea cultivation (specific growth rate = 0.0330; dry biomass: 3.52 g) and ecotoxicological bioassays (growth velocity = 0.0632) when compared to treatments with C. ensiformis. Consequently, the results showed that C. ensiformis has greater dependence on bioaugmentation than M. pruriens. Thus, to note that the phytotoxic effect on C. juncea was reduced in CE + Liq/Sol + TBT (CE + Liq + TBT = 6.27 g > CE + Sol + TBT = 6.21 g), and better plant performance of L. sativa was observed in CE + Sol + TBT (k = 0.0480) and CE +Liq + TBT (k = 0.0422). Therefore, the findings of this research show that the cultivation of potential phytoremediators associated with bioaugmentation can reduce the antagonistic effects of the herbicide tebuthiuron in the ecosystem, whether edaphic or aquatic. Keywords: bioaugmentation, ecotoxicity, jack bean, phytoremediation, velvet bean. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Tonalidades referentes aos níveis toxicológicos dos pesticidas padronizados pelo IBAMA........................ 24 Figura 2 - Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas de Dracena. (A) Imagem importada de um satélite; e (B) Fachada da faculdade......................................... 39 Figura 3 - Produtos adquiridos para instalação experimental. (A) Herbicida tebuthiuron; (B) Inoculante líquido; e (C) Inoculante sólido.................................................. 40 Figura 4 - Sementes das espécies potencialmente fitorremediadoras. (A) M. pruriens e (B) C. ensiformis.................................................................... 41 Figura 5 - Sementes de C. juncea............................................... 42 Figura 6 - Sementes de L. sativa................................................. 42 Figura 7 - Insumos agrícolas utilizados na correção do solo. (A) Calcário; (B) Ureia, superfosfato simples e cloreto de potássio; (C) Mistura dos insumos agrícolas no solo; e (D) Umedecimento do solo.............................................................................. 44 Figura 8 - Separação de vasos para inoculação microbiana...... 45 Figura 9. - Aplicação do herbicida tebuthiuron............................ 46 Figura 10 - Experimento com as espécies vegetais. (A) Sementes de C. ensiformis e M. pruriens (B) Semeadura nos vasos. (C) Cultivo das espécies vegetais em DIC.......................................................... 47 Figura 11 - Imagem meramente ilustrativa mostrando o desenvolvimento de M. pruriens entre 0 DAS e 14 DAS........................................................................... 48 Figura 12 - Plantas sendo removidas dos vasos, pesadas e secadas. (A) Lavagem das plantas de C. juncea; (B) Planta de M. pruriens dentro da bandeja; (C) Planta de M. pruriens vista longitudinalmente; (D) Conferência do comprimento da M. pruriens; (E) 49 Aferição da biomassa fresca de M. pruriens; e (F) Plantas dispostas em estufa para secagem..................................................................... Figura 13 - Metodologias para extração do solubilizado de solo. (A) Coleta do solo; (B) Adição de 25 g de solo em frascos Erlenmeyer; (C) Adição de água deionizada em frascos Erlenmeyer; (D) Homogeneização da solução; e (E) Extrato aquoso formado...................... 51 Figura 14 - Preparo dos bioensaios ecotoxicológicos. (A) Disposição de 10 sementes de L. sativa em placas de Petri com papel filtro qualitativo; (B) Adição de 2,0 mL do solubilizado nas placas de Petri; (C) Solução de sulfato de zinco pronto para ser adicionado na placa referente ao Controle Positivo; (D) Bancada laboratorial com equipamentos utilizados no preparo dos bioensaios; e (E) Placas de Petri prontas para serem destinadas à BOD............................................................................ 52 Figura 15 - Triângulo textural do solo………………………………. 56 Figura 16 - Efeitos fitotóxicos em tratamentos e tempos da M. pruriens. (A) 10 DAS; (B) 20 DAS; e (C) 30 DAS............................................................................. 58 Figura 17 - Efeitos fitotóxicos em diferentes tratamentos e tempos do C. ensiformis. (A) 30 DAS; (B) 40 DAS; e (C) 60 DAS.................................................................. 59 Figura 18 - Exemplo de uma curva de Gompertz juntamente com seus parâmetros e forma de interpretação......... 60 Figura 19 - Desenvolvimento cinético de M. pruriens (MP) e C. ensiformis (CE) como potenciais fitorremediadores do herbicida tebuthiuron (TBT) no solo com inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) a partir do modelo de Gompertz.................................................. 62 Figura 20 - Produção de biomassa seca de M. pruriens (MP) e 65 C. ensiformis (CE) em solo associado ou não com tebuthiuron (TBT) e/ou inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) após 70 DAS........................................... Figura 21 - Desenvolvimento cinético da altura de C. juncea como espécie bioindicadora em solo com tebuthiuron (TBT) e inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) a partir do modelo de Gompertz. Ref – solo controle de referência sem adubo verde e inoculantes................................................................. 68 Figura 22 - Desenvolvimento cinético de C. juncea como espécie bioindicadora em solo com tebuthiuron (TBT) e inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) a partir do modelo de Gompertz.................................... 69 Figura 23 - Produção de biomassa fresca e seca de C. juncea em solo associado ou não com tebuthiuron (TBT), inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) e/ou as diferentes plantas M. pruriens (MP) e C. ensiformis (CE) após 63 DAS. Ref – solo controle de referência sem adubo verde e inoculantes.................................. 73 Figura 24 - Desenvolvimento cinético do índice de germinação de L. sativa nos bioensaios de ecotoxicidade em amostras de solo com tebuthiuron (TBT) e inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) a partir do modelo de Gompertz. Ref – solo controle de referência sem adubo verde e inoculantes................. 77 Figura 25 - Desenvolvimento cinético do índice de germinação de L. sativa nos bioensaios de ecotoxicidade em amostras de solo com tebuthiuron (TBT) e inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) a partir do modelo de Gompertz.................................................. 78 Figura 26 - Dinâmica de efeitos aleatórios (tebuthiuron) e fixos (adubos verdes – M. pruriens e C. ensiformis; e inoculantes microbianos – líquido e sólido) sobre a 81 taxa específica do índice de germinação (IG) de L. sativa nos bioensaios de ecotoxicidade nas amostras de solo........................................................ LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Principais estados produtores de cana-de-açúcar no Brasil.................................................................... 21 Tabela 2 - Herbicidas utilizados em áreas produtoras de cana- de-açúcar.................................................................. 23 Tabela 3 - Espécies vegetais em áreas de cana-de-açúcar que o herbicida tebuthiuron pode controlar.............. 25 Tabela 4 - Características físico-químicas do herbicida tebuthiuron................................................................. 26 Tabela 5 - Espécies testadas para fitorremediar o herbicida tebuthiuron em solos agrícolas.................................. 30 Tabela 6 - Espécies eficientes na fitorremediação do herbicida tebuthiuron em solos agrícolas.................................. 31 Tabela 7 - Espécies sensíveis ao herbicida tebuthiuron............ 34 Tabela 8 - Identificação dos tratamentos conforme a sua sigla........................................................................... 43 Tabela 9. - Análise química do solo antes e após o pré-cultivo de C. ensiformis e M. pruriens................................... 57 Tabela 10 - Parâmetros dos modelos cinéticos de Gompertz para a altura de M. pruriens (MP) e C. ensiformis (CE) como potenciais fitorremediadores de tebuthiuron (TBT) no solo com inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq).................................................. 63 Tabela 11 - Parâmetros dos modelos cinemáticos do tipo Gompertz para a altura de C. juncea como espécie bioindicadora em do tebuthiuron (TBT) no solo com M. pruriens (MP) e C. ensiformis (CE) e inoculantes líquido (Liq) ou sólido (Sol)........................................ 70 Tabela 12 - Parâmetros dos modelos cinéticos de Gompertz para o índice de germinação de L. sativa nos bioensaios de ecotoxicidade em amostras de solo com tebuthiuron (TBT) e inoculantes sólido (Sol) ou 79 líquido (Liq) associados ou não às diferentes plantas, tanto para a M. pruriens (MP) e C. ensiformis (CE).......................................................... SUMÁRIO 1 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 20 1.1 Cana-de-açúcar: panorama histórico e econômico ............................................ 20 1.2 Plantas daninhas: efeitos prejudiciais e métodos de controle ........................... 21 1.2.1 Herbicidas: panorama de utilização e tipos de classificação .................... 22 1.2.2 Tebuthiuron: características e riscos ambientais ........................................ 24 1.3 Despoluição ambiental: métodos remediatórios de pesticidas ......................... 27 1.3.1 Biorremediação: contextualização e benefícios ambientais ...................... 27 1.3.2 Fitorremediação: contextualização, vantagens e desvantagens .............. 28 1.3.3 Bioaumentação: contextualização, vantagens e desvantagens ............... 32 1.4 Comportamento ambiental de pesticidas: contextualização.............................. 33 1.4.1 Cultivo de plantas bioindicadoras: contextualização e espécies utilizadas 34 1.4.2 Bioensaios ecotoxicológicos: contextualização, inferências metodológicas 35 2 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 38 2.1 Objetivo Geral ........................................................................................................... 38 2.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 38 3 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 39 3.1 Local e período de experimentação ...................................................................... 39 3.2 Solo ............................................................................................................................. 39 3.3 Herbicida tebuthiuron e inoculantes microbianos ................................................ 40 3.4 Espécies vegetais ..................................................................................................... 41 3.4.1 Potenciais fitorremediadores .......................................................................... 41 3.4.2 Planta bioindicadora ......................................................................................... 41 3.4.3 Organismo-teste ............................................................................................... 42 3.5 Delineamento experimental .................................................................................... 42 3.6 Preparação das unidades experimentais ............................................................. 44 3.6.1 Correção da fertilidade e acidez do solo....................................................... 44 3.6.2 Inoculação microbiana ..................................................................................... 44 3.6.3 Pulverização do herbicida ............................................................................... 45 3.7 Semeadura das espécies vegetais ........................................................................ 46 3.8 Avalições nos experimentos ................................................................................... 47 3.8.1 Espécies vegetais ............................................................................................. 47 3.8.2 Bioensaios ecotoxicológicos ........................................................................... 50 3.9 Análise de dados ...................................................................................................... 52 3.9.1 Tratamento prévio dos dados ......................................................................... 52 3.9.2 Análise de variância e teste de comparação de médias ............................ 53 3.9.3 Modelagem de Gompertz ................................................................................ 53 3.9.4 Análise multivariada do índice de germinação ............................................ 54 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 56 4.1 Caracterização química do solo ............................................................................. 56 4.2 Desenvolvimento de mucuna-cinza e feijão-de-porco ........................................ 58 4.2.1 Parâmetros morfométricos: altura .................................................................. 58 4.2.2 Acúmulo de biomassa ...................................................................................... 63 4.3 Desenvolvimento de crotalária ............................................................................... 65 4.3.1 Parâmetros morfométricos: altura .................................................................. 65 4.3.2 Acúmulo de biomassa ...................................................................................... 71 4.4 Bioensaios ecotoxicológicos ................................................................................... 73 4.4.1 Índice de germinação ....................................................................................... 73 4.4.2 Análise multivariada do índice de germinação ............................................ 80 5 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 82 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 83 18 1 INTRODUÇÃO O tebuthiuron (1-(5-tert-butyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-1,3-dimethylurea) é um herbicida sistêmico, não seletivo, pertencente à família das fenilureias, que tem sido frequentemente aplicado em canaviais (FANG; SHEN; CHEN, 2012; QIAN et al., 2017). Quando este herbicida é diretamente pulverizado no solo, sua ação pré-emergente pode ser capaz de eliminar plantas de folhas estreitas e largas (ROMAN et al., 2005), através da inibição da fotossíntese (HUSSAIN et al., 2015), por meio do bloqueio do fluxo de transporte de elétrons no fotossitema II nas membranas dos tilacóides. No entanto, características físico- químicas pertencentes a este herbicida, tais como alta solubilidade em água (2,50 g L1), fácil disseminação entre os perfis edáficos e elevada persistência ambiental (até 18 meses), podem causar contaminação dos ecossistemas aquáticos e terrestres (PPDB, 2023), afetando negativamente organismos não- alvos (SARAPIROM et al., 2022). Por tais motivos, a implementação da biorremediação é necessária (FERREIRA et al., 2022). A biorremediação é uma técnica que usufrui de atividades biológicas para eliminar quaisquer pesticidas, seja ele em meio aquoso ou sólido (LUO et al., 2017). Nesse sentido, a atenuação natural executada pela microbiota indígena é a principal via de dissipação dos herbicidas do fotossistema II (MERCURIO et al., 2015). Embora esta técnica seja naturalmente eficaz para degradar os pesticidas, algumas adversidades bióticas ou abióticas podem interferir negativamente na eficiência da taxa de degradação, sendo necessária o uso estratégias suplementares (ZANGANEH et al., 2022). Segundo Lima et al. (2022), a fitorremediação é uma das estratégias mais úteis para remediar solos contaminados com herbicida tebuthiuron. Espécies vegetais como Canavalia ensiformis L., Cajanus cajan (L.) Millsp, Mucuna pruriens L. var. Pruriens, Pennisetum typhoides (Burm.f.) Stapf & C.E.Hubb e Stizolobium aterrimum Piper & Tracy mostraram ser tolerantes ao tebuthiuron e suficientemente capazes de remediar solos contaminados com o tal herbicida (BELO et al., 2007; FERREIRA et al., 2021b; MENDES et al., 2021; PIRES et al., 2008). Sendo assim, alguns autores definiram que a fitorremediação pode ser dividida em 7 categorias, tais como fitoextração, rizofiltração, fitoestabilização, rizodegradação, rizodegradação, fitovolatilização, 19 fitoestimulação e fitodegradação (AMMERI et al., 2022; PARWEEN et al., 2018; SUSARLA; MEDINA; MCCUTCHEON, 2002). No entanto, a fitorremediação pode não ser tão eficiente quanto o esperado, sendo necessário o uso de estratégias combinadas, como por exemplo a bioaumentação (ANDREOLLI et al., 2015; LOPES et al., 2022). Na bioaumentação, cepas microbianas de fungos ou/e bactérias são adicionadas no solo para aumentar a taxa de degradabilidade dos pesticidas (ANDREOLLI et al., 2015). Os microrganismos devem ser caracterizados por tais funcionalidades: alta resistência às concentrações elevadas de pesticidas; adaptabilidade às condições de estresse, bem como alterações de pH e variações de temperatura; baixa ou nenhuma competição com a microbiota nativa; e principalmente; eficiente na degradação de pesticidas (AYOTAMUNO; KOGBARA; AGORO, 2009; KHAN et al., 2013). Portanto, a combinação de fitorremediação e bioaumentação pode aumentar a degradabilidade de pesticidas no solo, diminuindo, portanto, as limitações de cada técnica. Além disso, utilizar plantas bioindicadoras e realizar bioensaios ecotoxicológicos podem ser úteis para avaliar o nível de toxicidade ambiental que o tebuthiuron oferece ao ecossistema após o processo de biorremediação (ROCHA et al. 2018; FERREIRA et al., 2021b). Contudo, poucos estudos foram encontrados na literatura que relaciona técnicas de fitorremediação e bioaumentação para remover pesticidas, principalmente o herbicida tebuthiuron. As pesquisas normalmente focam na sua dispersão em sistemas aquáticos e nos efeitos agudos ou crônicos causados em diversos animais (CCANCCAPA et al., 2016; MERCURIO et al., 2015; MERCURIO et al., 2016 Logo, esta pesquisa teve como proposta de estudo: o cultivo e avaliação da tolerância dos potenciais fitorremediadores; o cultivo e avaliação de efeitos fitotóxicos do herbicida na planta bioindicadora (Crotalaria juncea L. cv. Comum) após a biorremediação; e a realização de bioensaios ecotoxicológicos com sementes de Lactuca sativa L. antes, durante e após a biorremediação, para monitoramento ambiental da molécula estudada.. 20 1 REVISÃO DE LITERATURA 1.1 Cana-de-açúcar: panorama histórico e econômico Pertencente à família Poaceae, a cana-de-açúcar (Saccharum spp) é uma gramínea perene oriunda da Ásia tropical (GENTILE et al., 2015; SINGH et al., 2015). Essa espécie possui um caule longo e espesso, que possui a capacidade de alcançar cinco metros de altura e seis centímetros de diâmetros (SILVA et al., 2022). Devido ao seu mecanismo fotossintético do tipo C4, essa gramínea é capaz de transformar de forma eficiente fontes luminosas em energia bioquímica, possibilitando acumular altos teores de açúcares solúveis, como a sacarose e frutose (SINGH et al., 2020), cujas características são essenciais ao setor sucroenergético (SILVA, 2016). Além disso, a cana-de-açúcar pode se adaptar às distintas condições climáticas e fisiográficas (RODRIGUES et al., 2022), fatores estes, que a torna uma importante cultura agrícola, sendo cultivada em mais de 200 países ao redor do mundo (HUANG et al., 2020). Embora seja compreendido que o principal objetivo da cana-de-açúcar é a obtenção de açúcar e etanol, tal cultura produz subprodutos de valor agregado como bagaço, torta de filtro, vinhaça, melaço, entre outros resíduos, que podem ser utilizados na agricultura e agroindústria (GENTILE et al., 2015; MEHNAZ, 2013). Portanto, tais produtos e subprodutos da cana-de-açúcar torna-a matéria-prima chave em países subdesenvolvidos, proporcionando crescimento sócio-ecônomo-ambiental (HUANG et al., 2020; SINGH et al., 2020). Em contexto global, estima-se que seu cultivo esteja distribuído em área superior a 26 milhões de hectares, sendo que o Brasil é o principal produtor, responsável 38% da produção global, seguido pela Índia e China (COSTA et al., 2021). Além disso, o setor sucroenergético brasileiro é responsável por 50% das exportações mundiais, e se articula como o segundo maior provedor de etanol, atrás somente dos Estados Unidos (MARIN et al., 2019). Em concordância a tais afirmações, segundo dados da CONAB (2020), o Brasil exportou 18, 95 milhões de toneladas de açúcar e 1,9 milhões de litros de etanol na safra 2019/2020. Nesse sentido, os canaviais brasileiros concentram-se na região Centro- Sul, com maior destaque ao estado de São Paulo (Tabela 1), em que nas 21 últimas décadas ocorreu um crescente avanço de lavouras canavieiras devido a abertura de novas áreas e pelo arrendamento de terras que eram destinadas à criação de gado (PALLUDETO et al., 2018). De acordo com Rudorff et al. (2010), a capacidade produtiva do estado de São Paulo equivale a 80% da produção indiana, além de ser superior ao somatório de outros quatro grandes produtores mundiais (China, Tailândia, Paquistão e México). Tabela 1. Principais estados produtores de cana-de-açúcar no Brasil Estado Área plantada (ha) Produção (t) São Paulo 5.540.511 425.617.093 Goiás 946.985 75.315.239 Minas Gerais 944.051 72.968.836 Mato Grosso do Sul 727.753 52.245.291 Paraná 597.198 41.658.888 Alagoas 304.748 18.702.251 Mato Grosso 297.100 23.319.052 Pernambuco 228.177 12.138.197 Fonte: Silva et al. (2022) No entanto, o lucro almejado por empresários agrícolas é definido pelos constantes e atualizados manejos adotados nos canaviais (BASSEY et al., 2021). Logo, as condições climáticas, surgimento de patógenos, pragas e plantas daninhas devem ser frequentemente monitorados (BANDOPADHYAY et al., 2018; ROGÉRIO; BORGES; MACHADO, 2020) para não reduzir a produtividade da cana de açúcar. 1.2 Plantas daninhas: efeitos prejudiciais e métodos de controle Em virtude do seu alto poder de dispersão, rusticidade e resistência (SILVA et al., 2018), as plantas daninhas são imbróglios cotidianamente enfrentado por agricultores canavieiros. Quando estão em alta densidade populacional, essas plantas podem competir com a cultura por espaço, luminosidade, nutrientes e água, além disso, algumas espécies podem exsudar substâncias fito-alelopáticas (DIAS et al., 2007; MOSSIN et al., 2019), e até mesmo serem hospedeiras de doenças ou insetos-pragas (NAZIR; JARIKO; JUNEJO, 2013). Nesse sentido, a presença abundante dessas plantas pode 22 comprometer a cana-de-açúcar em diversas esferas: altura, número de formação de perfilhos, acúmulo de biomassa, rendimento em açúcares solúveis e qualidade da planta (MENDES; SILVA, 2022). Por isso, adotar medidas prévias pode evitar que as ervas daninhas afetem severamente os canaviais. Segundo Silva et al. (2022), Verma e Chatterjee (2021), a remoção manual, cultivo entre fileira e o controle químico, bem como os herbicidas são alguns métodos popularmente conhecidos que são realizados em lavouras canavieiras. 1.2.1 Herbicidas: panorama de utilização e tipos de classificação Desde 2008, o Brasil é o maior consumidor mundial de pesticidas (RIGOTTO; VASCONCELOS; ROCHA, 2014), sendo que, de acordo com Sharma et al. (2019) a aplicação em áreas canavieiras corresponde em sua maioria a herbicidas (47,5%), seguido por inseticidas (29,5%), fungicidas (17,5%) e outros pesticidas (5,5%). Os herbicidas representam uma das ferramentas mais utilizadas no setor sucroenergético (ZHOU; WANG; LUO, 2020), em virtude de sua rapidez de ação, praticidade, eficiência, períodos de controle, com uma gama de mecanismos de ação, grupos químicos e princípios ativos (GUIMARÃES et al., 2022; VITI et al., 2021). Na Tabela 2 estão descritos quais são os herbicidas disponíveis para a cana-de-açúcar no Brasil, bem como seu mecanismo de ação, grupo químico e princípio ativo. Além dos mecanismos de ação, também há outras formas de classificação dos herbicidas baseando-se no seu modo de entrada na planta e no nível de toxicidade ambiental (AKASHE; PAWADE; NIKAM, 2018). Segundo Randika et al. (2022), o modo de entrada do herbicida teoriza o contato entre a planta-alvo e a molécula. Nesse sentido, há três tipos de entrada: sistêmico, de contato e translaminar. Por outro lado, o nível de toxicidade evidencia o quão prejudicial o pesticida pode oferecer ao ecossistema aquático ou terrestre. A Figura 1 ilustra os níveis de toxicidade ambiental dos pesticidas em diferentes colorações de acordo com IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis). 23 Tabela 2. Herbicidas utilizados em áreas produtoras de cana-de-açúcar Mecanismo de ação Grupo químico Princípio ativo Auxinas sintéticas Ácido fenoxicarboxílico 2,4-D Ácido piridinocarboxílico Picloram Inibidores da biossíntese de carotenóides Isoxazol Isoxaflutole Tricetona Mesotriona Isoxazolidinona Clomazone Inibidores da enzima Acetolactato Sintase (ALS) Pirimidinil (tio) benzoate Bispiribac-sódio Imidazolinonas Imazapic Imidazolinonas Imazapyr Triazolopirimidina Diclosulam Sulfonilureia Etoxissulfuron Sulfonilureia Flazasulfuron Sulfonilureia Halosulfuron- metil Sulfonilureia Iodosulfuron- metil Sulfonilureia Metsulfuron- metil Sulfonilureia Trifloxysulfuron- sodium Inibidores da biossíntese de ácidos graxos e lipídios Cloroacetamida Alachlor Cloroacetamida S-metolacloro Inibidores da 5-enolpiruvilshikimate-3- fosfato sintase (EPSP’s) Glicina Glifosato Inibidores do fotossistema II Triazina Ametryn Triazina Atrazina Triazinona Hexazinona Triazinona Metribuzin Ureia Diuron Ureia Tebuthiuron Inibidores da Enzima Protoporfirinogênio Oxidase (PROTOX) N-fenilftalimida Flumioxazin Éter difenílico Oxyfluorfen Oxadiazol Oxadiazon Triazolinona Amicarbazona Triazolinona Carfentrazone- ethyl Triazolinona Sulfentrazone Inibidores de mitose Dinitroanilina Pendimetalina Dinitroanilina Trifluralin Inibidores do fotossistema I Bipiridílio Paraquat Desconhecido Organoarsênicos Sodium hydrogen methylarsonate (MSMA) Fonte: adaptado de Reis et al. (2019). 24 Figura 1. Tonalidades referentes aos níveis toxicológicos dos pesticidas padronizados pelo IBAMA Fonte: Própria autoria (2023) Por isso que a disponibilidade de diferentes moléculas e a seleção prévia destas, são importantes peças na agricultura que facilitam a vida dos produtores, evitando futuros prejuízos nas lavouras canavieiras (CARVALHO et al., 2005). 1.2.2 Tebuthiuron: características e riscos ambientais Dentre diversas moléculas disponíveis no mercado, encontra-se o tebuthiuron, um herbicida inibidor do fotossistema II (FSII) indicado para controlar plantas daninhas de folhas estreitas e largas durante a sua pré- emergência (WANG et al., 2019), tal como descrito na Tabela 3. Tal herbicida é uma molécula orgânica de ação sistêmica, pertencente ao grupo químico das fenilureias (QIAN et al., 2017), que após pulverizá-lo no solo pode ser absorvido pelas raízes das plantas (LI et al., 2019), translocado e acumulado em tecidos ou órgãos vegetais (PULLAGURALA et al., 2018). Dentro do mecanismo do PSII, as moléculas de tebuthiuron ligam-se a um local específico da plastoquinona Qb sobre a proteína D1, bloqueando o transporte de elétrons da quinona Qa para a Qb (OLIVEIRA JÚNIOR, 2011). Esta ação resulta na paralização fixativa de CO2 e na produção de ATP e NADHP2 (THOMAS et al., 2020). Consequentemente, ocorre a peroxidação lipídica das membranas celulares e visualmente percebe-se o aparecimento de necroses foliar, que pode evoluir para seca e morte integral das plantas (SILVA et al., 2014). 25 Tabela 3. Espécies vegetais comuns em áreas de cana-de-açúcar com indicação de controle por tebuthiuron. Nome comum Espécie Amendoim-bravo Euphorbia heterophylla L. Beldroega Portulaca oleracea L. Capim-braquiária Urochloa decumbens L. cv. Basilisk Capim-carrapicho Cenchrus echinatus L. Capim-colchão Digitaria sanguinalis L. Scop. Capim-colonião Panicum maximum Jacq. (PANMA) Capim-marmelada Urochloa plantaginea (Link) Hitchc. Capim-pé-de-galinha Eleusine indica. (L.) Gaertn Carrapicho-rasteiro Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze Caruru-de-mancha Amaranthus viridis L. Corda-de-viola Ipomoea aristolochiaefolia G.Don. Falsa-serralha Emilia sonchifolia (L.) DC EX.Winght Guanxuma Sida rhombifolia L. Guanxuma-branca Sida glaziovii. L. K. Schum. Malva-branca Sida Cordifolia L. Picão-branco Galinsoga parviflora Cav. Picão-preto Bidens pilosa L. Poaia-branca Richardia brasiliensis (Gomes) Trapoeraba Commelina benghalensis L. Fonte: COMBINE 500 SC (2019) Apesar das vantagens agronômicas, o uso indiscriminado do tebuthiuron pode causar sérios danos ambientais. Conforme a Tabela 4, o herbicida é altamente solúvel em água (MERCURIO et al., 2016) e pode facilmente ser transportando entre os perfis do solo (ROSSETTO; SANTIAGO, 2022). Por isso, a sua pulverização é recomendada em períodos que com menor probabilidade de ocorrer precipitações (COMBINE 500 SC, 2019). Além disso, tal molécula se apresenta com índice reduzido de sorção no solo devido ao seu baixo Kd (MATALLO et al., 2005), cuja característica que sustenta a biodisponibilidade e mobilidade do herbicida, porém facilita na percolação ou lixiviação do produto em ecossistemas aquáticos e terrestres (IBAMA, 2019; TONIÊTO et al., 2016; QIAN et al., 2017). 26 Tabela 4. Características físico-químicas do herbicida tebuthiuron Características Componentes Estrutura molecular Nome IUPAC 1-(5-tert-butyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-1,3- dimethylurea Fórmula molecular C9H16N4OS Massa molecular 228,32 g mol-1 Ponto de fusão 162-164 °C Solubilidade em água (Sw) 2,50 g L−1 a 20 °C Pressão de vapor 3,0 x 10-7 mm Hg a 25 °C Coeficiente de partição octanol/água (log Kow) 1,79 Efeito residual 12 a 18 meses Constante de dissociação (pKA) 1,20 Coeficiente de sorção (Kd) 0,1 e 0,7 mL g−1 Fonte: PubChem (2021) Outros parâmetros que podem intensificar a dispersão de tebuthiuron no ambiente são a textura edáfica e o teor de carbono no solo. De acordo com Pierri et al. (2022) e Teixeira et al. (2018), a sorção do herbicida é maior em solos argilosos quando comparado a solos arenosos em função do alto teor de carbono orgânico. Um estudo que avaliou o potencial de lixiviação do tebuthiuron em solos arenosos, mostrou que o herbicida é capaz de lixiviar em profundidade superior a 60 cm, indicando risco de contaminação em águas subterrâneas (SOUZA et al., 2001). Segundo Bandeira et al. (2019) e Domene et al. (2012), a toxicidade ambiental dos pesticidas podem ser mais intensa em solos arenosos do que em solos argilosos. Somado a isso, o período residual do respectivo pesticida é longo (Tabela 4), cuja característica é vantajosa no controle de plantas daninhas, porém pode intoxicar culturas utilizadas na rotação com a cana-de-açúcar (MEHDIZADEH et al., 2019; WANG et al., 2012). Além disso, o tebuthiuron é uma grande ameaça à saúde dos agricultores nas etapas de manuseio e pulverização do produto. Outro fator complicador pertinente a este herbicida é o 27 risco à segurança alimentar, pois os resíduos de tebuthiuron podem ser acumulados nos tecidos dos seres e transferidos posteriormente a níveis mais elevados das teias alimentares, prejudicando assim, os ecossistemas (GARCÍA-DELGADO et al. 2020; SILVA et al., 2019; YERA et al., 2020). 1.3 Despoluição ambiental: métodos remediatórios de pesticidas Para atenuar a perturbação ambiental provocada pelo tebuthiuron, diversos métodos de remediação foram elaborados e executados por centros de pesquisas ambientais. Na literatura podem ser encontrados vários modos de remediação, tais como descrito abaixo. Quanto ao local de ação: a) Ex situ: tratamento de pesticidas distante do ponto afetado em virtude de questões legislativas, éticas e/ou ambientais (SAM; ZABBEY, 2018; ZABBEY; SAM; ONYEBUCHI, 2017); b) In situ: tratamento de pesticidas no local afetado (KEMPA et al., 2013; ODOH et al., 2019). Quanto aos tipos de remediação: a) Físicos: radiomarcação (VITI et al., 2021), termorremediação (DAVE; GHALY, 2011), foto-oxidação, lavagem do solo, incineração (AGARWAL; LIU, 2015), solidificação, vitrificação, encapsulamento, extração eletrocinética (LIU et al., 2018), dentre outros; b) Químicos: imobilização química (LIU et al., 2018), surfactantes (ZHENG; CHAI, 2016), dentre outros; e c) Biológicos: biorremediação (LIU et al., 2018). Contudo, a remediação ex situ e os métodos físico-químicos não são apenas caros, mas também provoca efeitos colaterais ao meio ambiente e, portanto, a implementação da remediação in situ e a biorremediaçã torna-se a solução mais eficaz e econômica para a despoluição ambiental (YANG et al., 2009; WALLS, 2010). 1.3.1 Biorremediação: contextualização e benefícios ambientais A biorremediação é uma abordagem tecnológica muito útil que visa utilizar diversos agentes bióticos, como fungos (micorremediação), alga 28 (ficorremediação), bactérias (bactorremediação), plantas (fitorremediação), anelídeos (vermirremediação), biomateriais porosos (bioadsorção), entre outros, para promover a recuperação ambienta (DAS; DASH, 2014; LUO et al., 2017; ODOH et al., 2019). Tais agentes podem imobilizar o pesticida em suas estruturas (no caso da bioadsorção) ou transformá-los em moléculas inofensivas ao ambiente (ODUKKATHIL; VASUDEVAN, 2013). Além disso, pode até mesmo ocorrer a mineralização total da molécula produzindo água, (H2O), monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2) e/ou metano (CH4), através de fluxos enzimáticos (NWANKWEGU et al., 2022; SINGH; WARD, 2004). De acordo com Mercurio et al. (2016), a principal via de dissipação de herbicidas inibidores do FSII é por meio de processos microbiológico. Mecurio et al. (2015) evidenciaram que bactérias nativas podem degradar diuron, atrazina, hexazinona e tebuthiuron em ambientes aquáticos por meio de reações hidrolíticas. Tal processo denomina-se atenuação natural (LOPES et al., 2022). No entanto, para o ecossistema edáfico, investigações aprofundadas sobre as rotas de metabolização microbiológica do herbicida tebuthiuron são escassas. Uma justificativa para isso é o alto grau de resistência do herbicida a processos microbiológicos com risco significativo e prolongado a organismos não-alvos (DAM et al., 2004). Ainda assim, trabalhos recentes elencados a atenuação natural mostraram que o microbioma é eficientemente capaz de dissipar paulatinamente o herbicida tebuthiuron (FARIA et al., 2019ª, b; LIMA et al., 2022; NANTES et al., 2022; NEVES et al., 2021). 1.3.2 Fitorremediação: contextualização, vantagens e desvantagens Embora a atenuação natural seja capaz de dissipar os pesticidas, o processo microbiológico pode ser demorado e, em alguns casos ineficaz, sendo necessária a complementação com demais estratégias de biorestauração, bem como a fitorremediação. Este processo utiliza plantas para remover, imobilizar ou decompor moléculas nocivas ao ambiente (GARCIA et al., 2018). A popularidade de tal estratégia é devido a sua fácil adoção em ambientes contaminados (BHARDWAJ; RAJPUT; MISRA, 2019), expressando uma abordagem estritamente correta do ponto de vista econômico e ecológico 29 (BROWN et al., 2017), além da maioria das plantas evitarem poluições secundárias (WEI et al., 2021). De acordo com Cheng et al. (2017) e Sarapirom et al. (2022), a fitorremediação pode ser dividida em mecanismos, tais como fitoextração, fitofiltração, fitoestabilização, fitovolatilização, fitodegradação e rizodegradação: a) Fitoextração: as plantas são capazes de absorver e acumular os pesticidas em seus órgãos e tecidos; b) Fitofiltração: absorção e acúmulo de pesticidas, principalmente em sistemas radiculares; c) Fitoestabilização: a imobilização de pesticidas ocorre por meio de exsudados vegetais ou pelas próprias raízes, reduzindo a disponibilidade da molécula no solo; d) Fitovolatilização: as plantas absorvem os pesticidas e libera-os na atmosfera. Durante este processo, a molécula pode ser transformada em um algo mais inofensivo ao ambiente; e) Fitodegradação: as plantas são capazes de absorver e metabolizar os pesticidas por meio de processos enzimáticos; f) Rizodegradação: os vegetais absorvem e degradam os pesticidas nos sistemas radiculares em conjunto com a comunidade microbiana edáfica. Tais órgãos sorvem e estabilizam os pesticidas e quando inativos adicionam matéria orgânica ao ambiente, o que pode aumentar a sorção das moléculas, estimulando indiretamente atividade microbiana. Portanto, antes de implementar qualquer esquema fitorremediador, é preciso ter um pré-conhecimento das espécies que serão utilizadas (JUWARKAR; JAMBHULKAR, 2008). Segundo Arreghini et al. (2017) e Wei et al. (2021), os potenciais fitorremediadores devem possuir as seguintes características: 1. Tolerar altas concentrações dos pesticidas; 2. Rápida taxa de crescimento; 3. Alta produção de fitomassa; 4. Sistema radicular medianamente profundo; 5. Resistente à déficits hídricos, pragas e doenças; 6. Fácil descarte, colheita ou processamento; 30 7. Pouca ou nenhuma necessidade de fertilização; 8. Repulsivo à herbívoros e/ou onívoros, para evitar contaminações nas teias alimentares e; 9. Melhoria na qualidade química, física e biológica do solo. Diante desses pré-requisitos, ao longo de décadas diversos autores testaram espécies vegetais (leguminosas, gramíneas e arbóreas) para avaliar a sua eficiência em remediar solos que estejam contaminados com o herbicida tebuthiuron (Tabela 5). Tabela 5. Espécies testadas para fitorremediar o herbicida tebuthiuron em solos agrícolas Nome comum Nome científico Categorização Burra-leiteira Chamaesyce hyssopifolia L. Gramínea Caruru-roxo Amaranthus hybridus L. Gramínea Crotalária Crotalaria juncea L. cv. Comum Leguminosa Crotalária Crotalaria spectabilis (Roth.) Leguminosa Embaúba-prateada Cecropia hololeuca (Miq.) Arbórea Erva-de-santa-luzia Chamaesyce hirta L. Gramínea Feijão-de-porco Canavalia ensiformis L. Leguminosa Feijão-guandu Cajanus cajan (L.) Millsp Leguminosa Girassol Helianthus annuus L. Gramínea Lab-lab Dolichos lablab L. Leguminosa Milheto Pennisetum typhoides (Burm.f.) Stapf & C.E.Hubb Gramínea Milheto Pennisetum glaucum L. R.Br. Gramínea Mucuna-anã Mucuna deeringiana L. Leguminosa Mucuna-cinza Mucuna pruriens L. var Pruriens Leguminosa Mucuna-preta Stizolobium Aterrimum Piper & Tracy Leguminosa Nabo Raphanus raphanistrum L. Leguminosa Pau-pólvora Trema micranta L. Arbórea Tremoço-branco Lupinus albus L. Leguminosa Xique-xique Crotalaria incana L. Leguminosa Fonte: Própria autoria (2023). Nota-se que na maioria desses estudos, as espécies leguminosas foram as que mais se destacaram na fitorremediação do herbicida (Tabela 6). Tais 31 plantas são normalmente utilizadas como adubos verdes para recuperação ambiental, tanto no quadro florístico ou faunístico (TOZSER; MAGURA; SIMON, 2017; WONG, 2003). Tabela 6. Espécies eficientes na fitorremediação do herbicida tebuthiuron em solos agrícolas Nome científico Categorização Autores Cecropia hololeuca (Miq.) Arbórea Bicalho e Langenbach (2013) Pennisetum glaucum (L.) R.Br. Gramínea Ferreira et al. (2021b) Mucuna pruriens L. cv Pruriens Leguminosa Ferreira et al. (2021b) Canavalia ensiformis L. Leguminosa Mendes et al. (2021) Stizolobium aterrimum Piper & Tracy Leguminosa Mendes et al. (2021) Stizolobium aterrimum Piper & Tracy Leguminosa Pires et al. (2003) Canavalia ensiformis L. Leguminosa Pires et al. (2005) Lupinus albus L. Leguminosa Pires et al. (2005) Fonte: Adaptado pelo próprio autor (2023). Apesar dos inúmeros benefícios agronômicos e ambientais supracitados, a fitorremediação também tem suas desvantagens, como: a) longo período de despoluição ambiental (MAHAR et al., 2016); b) lenta taxa de crescimento das plantas (MAHAR et al., 2016); c) dificuldade de imobilização de alguns pesticidas (ODOH et al., 2019); d) em casos severos, não é recomendado a sua implementação (ODOH et al., 2019; SARAPIROM et al., 2022); e) sazonalidade de cultivo (ODOH et al., 2019; SARAPIROM et al., 2022); f) morte de genótipos não adaptados ao ambiente (MENDES et al., 2021); g) desafiador aos sistemas de produção na entressafra (FERREIRA et al., 2021b; MENDES et al., 2021), e; h) realização de pesquisas a longo prazo para encontrar plantas que possam lidar com os pesticidas (WEI et al., 2021). Portanto, para corrigir esses inconvenientes e melhorar a eficiência do processo remediativo, muitos pesquisadores têm aprimorado métodos 32 consorciados, bem como o pool in situ de microrganismos em solo contaminado com herbicidas (GIROLKAR; THAWALE; JUWARKAR, 2021; RAIMONDO et al., 2020), cuja técnica denomina-se bioaumentação (LOPES et al., 2022). 1.3.3 Bioaumentação: contextualização, vantagens e desvantagens Tal estratégia utiliza microrganismos, seja ele autóctones, alóctones ou geneticamente modificados para aumentar a biodegradação dos pesticidas no ambiente (DAS; DASH, 2014; GOSWAMI et al., 2018). A popularidade da bioaumentação dá-se pela simplicidade de seu uso (LIU et al., 2018), com custo relativamente baixo, gerando mínimo impacto ambiental (REHAN et al., 2014). Segundo Nwankwegu et al. (2022), o processo de bioaumentação inicia- se através da identificação, seleção e reprodução de microrganismos existentes no local contaminando. Concluída essas etapas, a inoculação microbiana pode ser realizada. Outra forma de acelerar o processo biorremediatório é a inserção de microrganismos selvagens no local contaminado com pesticidas (PERRUCHON et al., 2017). Ambas as situações são permitidas nessas áreas, desde que ocorre desequilíbrio ecológico no ecossistema. Na literatura científico-ambiental não há relatos da prática de bioaumentação em solo com o herbicida tebuthiuron, no entanto, foram encontrados alguns estudos que identifica quais microrganismos atuam na biodegradação desse herbicida, além de possíveis rotas metabólicas formadas. De acordo com Sheldon et al. (1996), o gênero bacteriano gram-positivo Streptomyces tem a capacidade de degradar o tebuthiuron. Mostafa e Helling (2003) também descobriram que os gêneros bacterianos Methylobacterium, Rhodococcus, Paenibacillus e Microbacterium podem dissipar tal pesticida. Os sistemas de cultivo e também influenciam na taxa degradativa do herbicida. Esta afirmação pode ser comprovada por Lima et al. (2022), no qual os autores selecionaram potenciais microrganismos degradadores de tebuthiuron em diferentes de produção canavieira (cultivo convencional e plantio direto). Por meio do balanço respiratório, os autores concluíram que a 33 integração microbiana dos dois cultivos elevou a taxa degradativa do respectivo herbicida. Complementarmente, foram encontrados outros estudos envolvendo a bioaumentação associado ou não com a fitorremediação em solo com herbicidas do mesmo grupo químico do tebuthiuron (fenilureias). Yan et al. (2018) combinaram Arabidopsis thaliana L. com um gênero de alfaproteobactérias denominado Sphingobium, para mineralizar o intermediário de isoproturon (IPU; o PH típico). Houve benefícios mútuos nessa combinação, pois os exsudados da planta “nutriram” as cepas microbianas, e em troca, tal comunidade protegeu a planta da fitotoxicidade do herbicida, elevando assim, a eficiência de remoção do pesticida. Alba, Esmeralda e Jaime (2022) concluíram que o bioaumento de Ochrobactrum anthropi potencializou a remoção do herbicida diuron. Trabalhando com essa mesma molécula, Duc et al. (2022) potencializou a sua degradação por meio de três cepas bacterianas (Bacillus subtilis, Acinetobacter baumannii e Pseudomonas sp.) oriundas de áreas de produção canavieira. Apesar desses celebres benefícios, a bioaumentação possui algumas possui limitações que dificultam a recuperação quimio-ambiental do local afetado, tais como variação da biodisponibilidade do pesticida, dispersão limitada dos microrganismos inoculados na matriz do solo (SARAPIROM et al., 2022), rápida diminuição da viabilidade microbiana, possível formação de metabólicos mais tóxicos que a molécula original durante a biorremediação (SINGH; WARD, 2004), possibilidade de competição por nutrientes entre o inoculado e a microbiota nativa (SINGH, 2018), alterações edafoclimáticas (temperatura, pH, oxigenação, umidade, potencial redox, salinidade, entre outros) (NWANKWEGU et al., 2022; RANDIKA et al., 2022). Portanto, cada estratégia possui variabilidades funcionais ao efetuar a restauração ambiental e, para solucionar esses gargalos operacionais, a combinação da fitorremediação e bioaumentação torna-se fundamental para uma depuração ambiental mais eficaz. 1.4 Comportamento ambiental de pesticidas: contextualização Embora as estratégias de biorremediação sejam soluções sustentáveis à recuperação ambiental, a dissipação dos pesticidas não pode ser comprovada 34 somente por um único método analítico, pois algumas moléculas possuem elevada persistência no ambiente (SILVA et al., 2019). Além disso, durante os processos remediatórios os pesticidas podem ser convertidos em compostos intermediários mais tóxicos do que a molécula original (HESHMATI et al., 2020; NAG; RAIKWAR, 2011; ROCHA et al., 2018). Associado às diversas normativas que delimitam a quantidade residual de pesticidas na água e no solo, os efeitos deletérios das moléculas antes, durante e após a biorremediação devem ser mensurados, visto que essas análises auxiliam na tomada de decisão sobre os procedimentos a serem adotados em função de tal contaminação (PANICO et al., 2022). Os métodos mais comuns realizados por centros de pesquisas são o cultivo in situ de plantas bioindicadoras e a realização de bioensaios ecotoxicológicos utilizando organismos-teste. 1.4.1 Cultivo de plantas bioindicadoras: contextualização e espécies utilizadas Normalmente, o cultivo de plantas bioindicadoras (também denominada planta sentinela) se inicia após o término da biorremediação. Se a planta demostrar efeitos fitotóxicos em suas estruturas vegetais, pode ser um indício da presença do pesticida no ambiente. Através de ensaios preliminares, foram encontradas algumas espécies sensíveis a este herbicida como descrito na tabela na Tabela 7. Tabela 7. Espécies sensíveis ao herbicida tebuthiuron Nome comum Nome científico Autores Alface Lactuca sativa L. Ferreira et al. (2021ª) Amendoim Arachis hypogaea L. Ferreira et al. (2021ª) Aveia Avena sativa L. Ferreira et al. (2021ª) Aveia-preta Avena strigosa L. Pires et al. (2005) Braquiária Urochloa brizantha (Hochst.) Stapf. Ferreira et al. (2021ª) Crotalária Crotalaria juncea L. cv. Comum Pires et al. (2008) Pepino Cucumis sativus L. Faria et al. (2018) Soja Glycine max (L.) Merr. Pires et al. (2006) Sorgo Sorghum bicolor (L.) Moench. Ferreira et al. (2021b) Fonte: Adaptado pelo próprio autor (2023). 35 Sendo assim, Pires et al. (2005) compreenderam que apenas o fitorremediador feijão-de-porco conseguiu diminuir o efeito fitotóxico de tebuthiuron em plantas de aveia-preta, proporcionando maior altura às elas. Pires et al. (2006) e (2008) em vossos trabalhos, revelaram que o cultivo prévio de feijão-de-porco, tremoço-branco e mucuna-preta garantiram à soja e crotalária maior altura de plantas, alta produção de biomassa e menor fitotoxicidade em suas estruturas vegetais. Já nos estudos de Ferreira et al. (2021b), a mucuna-cinza e o milheto em associação com a vinhaça como fonte de carbono, podem descontaminar o solo eficazmente possibilitando o desenvolvimento saudável da planta bioindicadora crotalária na presença de tebuthiuron residual. 1.4.2 Bioensaios ecotoxicológicos: contextualização, inferências metodológicas Através dos bioensaios ecotoxicológicos, é possível estimar o grau de periculosidade ambiental dos pesticidas (ou seus metabólitos secundários) em organismos vivos. Porém, antes de realizar qualquer bioensaio ecotoxicológico é preciso definir as etapas experimentais. Ao longo de décadas, vários autores como Aragão e Araújo (2006), Azevedo e Chasin (2004), Boock e Neto (2000), Martinez et al. (2019), Sobrero e Ronco (2004) pré-definiram as conduções dos experimentos: o primeiro passo é escolher o organismo a ser testado, podendo ele ser animal ou vegetal. Preferencialmente, este organismo tem que ser sensível ao contaminante, além de apresentarem fácil manejo e rápida obtenção de resultados; após a seleção do organismo-teste, determina-se a duração da sua exposição ao contaminante, como curta (aguda), intermediária (sub-crônica) e longa (crônica); posteriormente, são criterizados as principais vias de entrada dos pesticidas, tais como órgãos, tecidos ou células-alvo; por fim, são realizadas avaliações nos organismos testados: a) animais: reprodução, mecanismos de sobrevivência, metabolização, alimentação, alterações morfológicas internas ou externas (PELOSI; RÖMBKE, 2016; SŁAWSKI; SŁAWSKA, 2020); b) vegetais: fitointoxicação, normalidade de germinação, desenvolvimento aéreo e radicular (VECHIA et al., 2021). 36 Salienta-se que durante a preparação experimental, o estabelecimento dos grupos-controle é imprescindível à obtenção e análise de dados. Um deles é a utilização do controle negativo, no qual o grupo amostral reflete à condição saudável, sem manifestação de efeitos deletérios. Além disso, a fim de facilitar a comparação de resultados e possibilitar uma visão holística sobre tal molécula, metodologias e avaliações foram padronizadas por várias instituições, tais como a “Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE)”, a “Organização Internacional de Normalização (©)”, “Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT)”, “Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA)” entre outros. Logo, os experimentos ecotoxicológicos conduzidos com a mesma molécula em diferentes situações e/ou localidades podem ser comparados entre si. Ao longo da revisão de literatura foram encontrados alguns trabalhos que vinculam o uso de estratégias de biorremediação do herbicida tebuthiuron e bioensaios ecotoxicológicos. Faria et al. (2019a) avaliaram a toxicidade do solo de manejo convencional em áreas de cana-de-açúcar, antes, durante e após o processo de atenuação natural. Os autores concluíram que a dose indicada pelo produto comercial não afetou negativamente o desenvolvimento do organismo-teste (alface). A explicação mais plausível, de acordo com os próprios autores é que talvez o solo de cultivo convencional utilizado nos ensaios experimentais possua material nutritivo (fertilizantes sintéticos, vinhaça e detritos vegetais) que pode ter contribuído positivamente na eficiência da atenuação natural. Resultados semelhantes também foram encontrados por Neves et al. (2021) testando amostras de solo oriundo da produção orgânica. Segundo esses autores, a presença da vinhaça foi o fator determinante para a redução da toxicidade de amostras de solo em sementes de alface. Por outro lado, Ferreira et al. (2021b) validaram a eficácia da fitorremediação (mucuna-cinza e milheto) e bioestimulação (vinhaça) através da germinação normal de sementes de alface. Os resultados de Nantes et al. (2022) mostraram que a atenuação natural em conjunto com a vinhaça foi capaz de reduzir a toxicidade do herbicida tebuthiuron e do inseticida tiametoxam no solo, pois houve o aumento 37 no índice de germinação das sementes de alface ao longo das análises temporais. De acordo com o experimento de Lima et al. (2022), as amostras de solo contendo consórcio entre inóculos microbianos do sistema convencional e plantio direto, mineralizaram eficazmente o tebuthiuron, fazendo com que as sementes de alface tivessem maior porcentagem de germinação, além de estarem saudáveis ao longo do processo biorremediativo. Em concordância ao cenário contextualizado, a combinação das técnicas de biorremediação e testes de verificação toxicológica é fundamental para compreender a dinâmica dos pesticidas no ambiente, e por fim, acelerar a recuperação ambiental em agroecossistemas, como as áreas de produção intensiva de cana-de-açúcar. Durante a investigação do estado-da-arte das metodologias de remoção de tebuthiuron em solos agrícolas, não foram encontrados trabalhos publicados que utilização a combinação da fitorremediação e bioaumentação para tal fim, o que torna essa pesquisa original e inédita. Além disso, o presente trabalho está fundamentado dentro dos “Objetivos de Desenvolvimento Sustentável da ONU, em especial ao 02 (Fome zero e agricultura sustentável), ao 12 (Consumo e produção responsável) e ao 15 (Vida terrestre). 38 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Avaliar a tolerância e capacidade de fitorremediação da mucuna-cinza (Mucuna pruriens L. var. Pruriens) e feijão-de-porco (Canavalia ensiformis L.) associado a inoculantes microbianos em solo com o herbicida tebuthiuron. 2.2 Objetivos específicos Avaliar o desenvolvimento dos potenciais fitorremediadores mucuna- cinza e feijão-de-porco em solo com inoculante líquido ou sólido e tebuthiuron; Avaliar o desenvolvimento da planta bioindicadora crotalária após o experimento biorremediatório. Determinar o potencial ecotoxicológico das amostras de solo dos tratamentos antes, durante e após o experimento biorremediatório utilizando sementes de alface como organismo-teste. Quantificar a concentração de tebuthiuron no solo antes e após o experimento biorremediatório. Ajustar modelos matemáticos relacionando a presença ou ausência de plantas, herbicidas e inoculantes microbianos. 39 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Local e período de experimentação A pesquisa foi executada entre setembro/2021 e março/2022, na Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas (FCAT) – Câmpus de Dracena, Universidade Estadual Paulista (UNESP), tal como ilustrado na Figura 2. Figura 2. Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas de Dracena. (A) Imagem importada de um satélite; e (B) Portaria da faculdade. Fonte: Google Imagens (2023). O experimento de biorremediação e o cultivo de planta bioindicadora foram realizados em uma estufa agrícola do GAIA (Grupo de Ação em Impactos Ambientais) situado na Latitude-Oeste 21.457273 e Longitude-Sul 51.556369. Os bioensaios ecotoxicológicos foram desenvolvidos no laboratório também pertencente ao GAIA. 3.2 Solo O solo classificado previamente como Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico foi adquirido de um estabelecimento da região de Dracena especializado na comercialização de produtos agrícolas e afins. Ressalta-se que nele não há indícios de qualquer tratamento fitossanitário nos últimos anos. Após a sua aquisição, o solo foi encaminhado para a estufa agrícola, para que, posteriormente, algumas amostras fossem secas, peneiradas em 40 malha de 2,0 mm e acondicionadas em recipientes plásticos hermeticamente fechados para caracterização química. Além disso, ao final do período experimental, também foram coletadas amostras de solo para possível análise química. Tais informações foram disponibilizadas na Tabela 9. Estas determinações foram realizadas no Laboratório de Fertilidade do solo, do Departamento de Fitossanidade, Engenharia Rural e Solos, da Faculdade de Engenharia (FE) – Câmpus de Ilha Solteira/UNESP. 3.3 Herbicida tebuthiuron e inoculantes microbianos O herbicida tebuthiuron (Figura 3A) obtido por meio do produto comercial COMBINE® 500 SC – Dow AgroSciences Industrial Ltda. (Lote: 041- 14-2000). Os inoculantes (Figura 3B e 3C) foram cedidos pela empresa MICROGREEN® Soluções Biotecnológicas Ltda., cuja aplicação é para a restauração da microbiota em solos agrícolas. Nesse sentido, utilizou-se inoculante líquido, que possui maior concentração de indivíduos bacterianos e inoculante sólido, com quantidade elevada de espécimes fúngicas. Figura 3. Produtos adquiridos para instalação experimental. (A) Herbicida tebuthiuron; (B) Inoculante líquido; e (C) Inoculante sólido. Fonte: Própria autoria (2021) 41 3.4 Espécies vegetais 3.4.1 Potenciais fitorremediadores A mucuna-cinza e o feijão-de-porco foram escolhidos conforme a sua capacidade de remediar solos com pesticidas, principalmente o herbicida tebuthiuron, além de seu elevado potencial agrícola em melhorar a qualidade do solo, sendo que tais plantas, normalmente são utilizados como adubos verdes na rotação de cultura com a cana-de-açúcar (FERREIRA et al., 2021b; MADALÃO et al., 2016). As sementes dessas plantas foram adquiridas no estabelecimento agrícola SEMENTES PIRAÍ® Ltda., pela marca BR SEEDS (lote 01 para a mucuna-cinza e lote 19-1-20 para feijão-de-porco). Figura 4. Sementes das espécies potencialmente fitorremediadoras. (A) M. pruriens e (B) C. ensiformis L. Fonte: Própria autoria (2023) 3.4.2 Planta bioindicadora As razões pelas quais escolheu-se a crotalária como planta bioindicadora fundamentam-se na elevada sensibilidade que esse vegetal possui quando o herbicida está presente, além da mesma ser cultivada no período que corresponde à reforma de canaviais (PIRES et al., 2008). As sementes dessa espécie foram adquiridas na Sementes Piraí®. 42 Figura 5. Sementes de C. juncea. Fonte: Própria autoria (2023) 3.4.3 Organismo-teste Para avaliação da toxicidade do solo, utilizou-se sementes de alface como organismo-teste de acordo com as recomendações de Sobrero e Ronco (2004). As sementes foram adquiridas em estabelecimento comercial da região de Dracena pelo produto Feltrin Sementes® (variedade: Alface Americana; Lote: 00831020000030). Figura 6. Sementes de L. sativa Fonte: Própria autoria (2023) 3.5 Delineamento experimental A pesquisa foi planejada e conduzida em um delineamento inteiramente casualizado, com sete replicatas, sob esquema fatorial triplo, resultando no 43 total 126 unidades experimentais. Nesse sentido, foram considerados os seguintes fatores: 1º Fator: ausência ou presença da dose recomendada de tebuthiuron (2 níveis); 2º Fator: ausência de inoculantes microbianos, presença da dose recomendada de inoculante líquido ou inoculante sólido (3 níves); 3º Fator: ausência de plantas potencialmente fitorremediadoras, presença de mucuna-cinza ou feijão-de-porco (3 níveis). Para facilitar a identificação dos tratamentos na apresentação dos resultados, os fatores de variação (herbicida, inoculante e planta) foram nomeados com siglas, tal como descrito na Tabela 8. Tabela 8. Identificação dos tratamentos conforme a sua sigla Tratamento Herbicida Inoculante Planta T1 - - - T2 - - MP T3 - - CE T4 - Liq - T5 - Liq MP T6 - Liq CE T7 - Sol - T8 - Sol MP T9 - Sol CE T10 TBT - - T11 TBT - MP T12 TBT - CE T13 TBT Liq - T14 TBT Liq MP T15 TBT Liq CE T16 TBT Sol - T17 TBT Sol MP T18 TBT Sol CE Legenda: TBT – Tebuthiuron; Liq – Inoculante líquido; Sol – Inoculante sólido; MP – Mucuna pruriens; CE – Canavalia ensiformis. Fonte: Própria autoria (2023) 44 3.6 Preparação das unidades experimentais Ressalta-se que o preparo do solo nos vasos com diferentes configurações e os ensaios laboratoriais foram realizados conforme metodologia proposta Faria et al (2019a, b), Ferreira et al. (2021b), Lima et al. (2022), Nantes et al. (2022) e Neves et al. (2021). 3.6.1 Correção da fertilidade e acidez do solo Antes da instalação experimental, realizou-se a correção da acidez e fertilidade de 504 kg de solo por meio da aplicação de calcário (454 g), ureia (10 g), superfosfato simples (56 g) e cloreto de potássio (13 g) (Figura 7), para que posteriormente, vasos de aproximadamente 4 L fossem completamente preenchidos. Figura 7. Insumos agrícolas utilizados na correção do solo. (A) Calcário; (B) Ureia, superfosfato simples e cloreto de potássio; (C) Mistura dos insumos agrícolas no solo; e (D) Umedecimento do solo. Fonte: Própria autoria (2023). 3.6.2 Inoculação microbiana Os inoculantes microbianos líquido (Liq) e sólido (Sol) foram adicionados e incorporados ao solo de acordo com as recomendações do fabricante. Sendo 45 assim, o inoculante sólido foi colocado na proporção 0,36 g vaso-1 e o líquido aplicado a 50 mL vaso-1. A aplicação de ambos os inoculantes foi realizada diretamente nos vasos de acordo com seus tratamentos. Figura 8. Separação de vasos para inoculação microbiana. Fonte: Própria autoria (2021). 3.6.3 Pulverização do herbicida Após três dias da incorporação do inoculante no solo, realizou-se a pulverização do herbicida COMBINE® na dose 2,0 L p.c. ha-1 (1000 g i.a. ha-1), cujo dose é recomendado para solos de textura arenosa. As aplicações do produto ocorreram por meio de um pulverizador laboratorial constituído por 4 pontas de jato plano XR 11002 com pressão de 2 bar (vazão de 0,65 L min-1), tal como ilustrado na Figura 9. Seguindo as recomendações do fabricante, o tebuthiuron (TBT) foi pulverizado na velocidade de 5 km h-1, com altura da barra de 0,75 m em relação ao topo dos vasos proporcionando um volume de aplicação de 156 L ha-1. Durante pulverização, houve o monitoramento integral das condições ambientais do local, sendo que a temperatura e umidade registrada foi de 27,2ºC e 63%. É importante salientar que os tratamentos com ausência de tebuthiuron tinham o mesmo volume de água aplicado naqueles com a adição desses compostos. 46 Figura 9. Aplicação do herbicida tebuthiuron Fonte: Própria autoria (2021). 3.7 Semeadura das espécies vegetais Sete dias após a aplicação do herbicida, efetuou-se a semeadura de três sementes de feijão-de-porco (CE) e mucuna-cinza (MP) em cada vaso de acordo com o delineamento experimental, tal como ilustrado na Figura 10A e 10B. As plantas foram mantidas até o período de florescimento que corresponde 70 dias após a semeadura (DAS) (Figura 10C). Após a retirada das espécies potencialmente fitorremediadoras, foi feito a semeadura de três sementes de crotalária em todas as unidades experimentais (vasos), sendo que a planta sentinela foi cultivada até o período de florescimento que corresponde aproximadamente 70 DAS. Destaca-se que os vasos foram irrigados diariamente com objetivo de garantir boas condições de desenvolvimento aos vegetais. O sistema de irrigação da estufa agrícola foi composto por microaspersores verticalmente suspensos que funcionavam automaticamente 4 vezes por dia durante 50 minutos. 47 Figura 10. Experimento com as espécies vegetais. (A) Sementes de C. ensiformis e M. pruriens (B) Semeadura nos vasos. (C) Cultivo das espécies vegetais em DIC. Fonte: Própria autoria (2021). 3.8 Avalições nos experimentos 3.8.1 Espécies vegetais Em todas as espécies vegetais (mucuna-cinza, feijão-de-porco e crotalária) mensurou-se semanalmente o desenvolvimento das plantas coletando dados de altura em cm com auxílio de uma trena (Figura 11). 48 Figura 11. Imagem meramente ilustrativa mostrando o desenvolvimento de M. pruriens entre 0 DAS e 14 DAS. Fonte: Própria autoria (2021) Aos 70 DAS, as plantas (mucuna-cinza, feijão-de-porco e crotalária) de cada tratamento foram retiradas cuidadosamente das unidades experimentais, lavadas e, em seguida, foram acondicionados em uma estufa de circulação forçada de ar a 65 ºC por 72 horas, para que posteriormente, ocorresse coleta de informações sobre a biomassa seca (g). (Figura 12). 49 Figura 12. Plantas sendo removidas dos vasos, pesadas e secadas. (A) Lavagem das plantas de C. juncea; (B) Planta de M. pruriens dentro da bandeja; (C) Planta de M. pruriens vista longitudinalmente; (D) Conferência do comprimento da M. pruriens; (E) Aferição da biomassa fresca de M. pruriens; e (F) Plantas dispostas em estufa para secagem. Fonte: Própria autoria (2021). 50 3.8.2 Bioensaios ecotoxicológicos O monitoramento do potencial ecotoxicológico dos tratamentos foi realizado utilizando sementes de alface como organismo-teste nos tempos: 0 (inicial da mucuna-cinza e feijão-de-porco), 20, 40, 60, 70 (final da mucuna- cinza e feijão-de-porco) e 140 DAS (final da crotalária). Nesse sentido, realizou-se cinco replicatas a partir do extrato aquoso (solubilizado) do solo, de acordo com a NBR 10006 (ABNT, 2004). O método baseou-se na dissolução de 25g de solo em 100 mL de água deionizada em frascos Erlenmeyer 250 mL. Posteriormente, esses frascos foram lacrados com plástico filme de PVC, agitados por cinco minutos em velocidade baixa (120 rpm) e incubadas em uma BOD sem iluminação interna a 20± 2 °C por 7 dias. As práticas metodológicas estão ilustradas na Figura 13. Em seguida, segundo a metodologia experimental de Sobrero e Ronco (2004), realizou-se a aplicação de 2,0 mL do solubilizado em placas de Petri contendo papel filtro e 10 sementes de alface. As placas foram envolvidas com plástico filme de PVC para evitar perda de umidade, e estas, posteriormente, incubadas em uma BOD com iluminação interna controlada (fotoperíodo de 12 horas diárias de luz) a 20± 2 °C por 5 dias. Controles positivo (CP) e negativo (CN) também foram preparados utilizando sulfato de zinco a 0,05 M e água deionizada, respectivamente, para testar a sensibilidade das sementes (Figura 14). Por fim, coletou-se informações em relação a germinação das sementes, alongamento do hipocótilo e da raiz. Através desses dados foi possível calcular o índice de germinação total das sementes de alface, conforme demonstrado na Equação 1 de Labouriau e Agudo (1987): 𝐼𝐺 = 𝐺% × 𝑅% 100 Equação 1 em que, IG = Índice de germinação; G% = germinação de sementes em relação ao CN; e R% = alongamento da raiz em relação ao CN. 51 Figura 13. Metodologias para extração do solubilizado de solo. (A) Coleta do solo; (B) Adição de 25 g de solo em frascos Erlenmeyer; (C) Adição de água deionizada em frascos Erlenmeyer; (D) Homogeneização da solução; e (E) Extrato aquoso formado. Fonte: Própria autoria (2021). 52 Figura 14. Preparo dos bioensaios ecotoxicológicos. (A) Disposição de 10 sementes de L. sativa em placas de Petri com papel filtro qualitativo; (B) Adição de 2,0 mL do solubilizado nas placas de Petri; (C) Solução de sulfato de zinco pronto para ser adicionado na placa referente ao Controle Positivo; (D) Bancada laboratorial com equipamentos utilizados no preparo dos bioensaios; e (E) Placas de Petri prontas para serem destinadas à BOD. Fonte: Própria autoria (2021). 3.9 Análise de dados As análises de dados foram realizadas através dos programas estatísticos R Project, GraphPad Prism e Microsoft Excel® 2019. 3.9.1 Tratamento prévio dos dados Inicialmente, todos os dados foram submetidos ao teste de homocedasticidade e normalidade, por meio dos métodos estatísticos de Bartlett e Shapiro-Wilk. 53 3.9.2 Análise de variância e teste de comparação de médias Os dados de biomassa seca total avaliados por meio de estatísticas descritivas vinculadas à análise de variância (ANOVA a 5% de probabilidade) e teste de comparação de médias (Tukey a 5% de probabilidade). 3.9.3 Modelagem de Gompertz Caracterizado como modelo não-linear, a curva sigmoide de Gompertz permite visualizar o desenvolvimento das plantas em séries temporais. Sendo assim, através de variáveis vegetais e parâmetros estatísticos é possível determinar o momento exato em que tal espécie se mantém parcialmente ou totalmente estável (POMMERENING; MUSZTA, 2016). Em virtude de sua fácil e didática interpretação, além da confiabilidade nos resultados gerados, a modelagem de Gompertz já foi aplicada em alguns estudos recentes do GAIA (Grupo de Ação em Impactos Ambientais) para a avaliar biorremediação de solos agrícolas com pesticidas (FERREIRA et al., 2021b; LIMA et al., 2022; NANTES et al., 2022). Portanto, como objetos de estudo para elaboração dos modelos foram utilizados dados de altura de plantas (mucuna-cinza, feijão-de-porco e crotalária) e, também o índice de germinação de sementes (alface). Dessa forma, a função de sigmoide de Gompertz foi ajustada para prever o que se poderia esperar em períodos superiores 0, 70, 140 e/ou 360 DAS. Nesse sentido, no modelo de Gompertz com três parâmetros cinéticos, ou seja, α, β e κ foram utilizados, pois permitiram elaborar curvas não-lineares com diferentes formatos, angulações e séries temporais (Equação 2). Além disso, para adequação de tal modelo utilizou-se os critérios de informação Akaike (AIC), Bayesiano (BIC) e o coeficiente de determinação ajustado (r2). 𝑓𝑥 = 𝛼𝑒−𝛽𝑒−𝑘𝑥 Equação 2 em que, 𝑓𝑥 = altura ou índice de germinação; 𝑥 = tempo, em dias; 𝛼 = assíntota superior ou máximo desenvolvimento de altura e do índice de germinação; 𝛽 = ponto de inflexão; 54 𝑘 = taxa de crescimento específico; 𝑎𝑘𝑒−1 = taxa de crescimento absoluto; e 𝑒 = número de Euler. 3.9.4 Análise multivariada do índice de germinação A análise multivariada consiste em um conjunto de métodos estatísticos que utiliza informações coletadas de várias origens, simultaneamente, para simplificar/facilitar a interpretação do fenômeno que está sendo estudado, ou encontrar padrões entre variáveis e até mesmo prever efeitos/mudanças que tal atributo terá sobre o outro. Uma das análises multivariadas que é bastante utilizada em estudos biológicos é o modelo linear misto (DEMIDENKO, 2004; FAUSTO et al., 2008; RESENDE et al., 2001). Este método estatístico analisa simultaneamente os parâmetros populacionais (efeitos fixos) e coeficientes individuais (efeitos aleatórios) dentro de um experimento, parametrizando a dependência entre as variáveis repetidamente coletadas em um mesmo período temporal (LUCAMBIO, 2008). Porém, antes de elaborar ou interpretar este modelo, é preciso compreender melhor o que são os efeitos fixos e aleatórios dentro de um experimento: a) Efeitos fixos: todos os níveis de um determinado fator que esteja presente no experimento ou análise. Ou seja, são informações compartilhadas por todos os indivíduos (BORGES et al. 2010; FREITAS et al., 2014). b) Efeitos aleatórios: níveis de um fator do conjunto amostral que não presentes em sua totalidade. Ou seja, são específicos de um dos indivíduos (BORGES et al. 2010; FREITAS et al., 2014). Em concordância a tais explicações, nessa pesquisa, avaliou-se a dependência entre os fatores por meio do modelo linear misto. A composição para a elaboração de tal modelo encontra-se descrito na Equação 3 (WINTER, 2013): 55 𝛾 = 𝛼 + 𝛽 + ∑((𝑡𝑖 × 𝑓𝑖1) + (𝑡𝑖 × 𝑓𝑖2)) + 𝜀 Equação 3, em que, y = representa os termos aleatórios (adubo verde e inoculante); α = intercepto global do modelo; β = efeito aleatório (tebuthiuron); ti = tempo em DAS; fi1 = efeito fixo1 (adubo verde); fi2 = efeito fixo2 (inoculante); e ε = resíduo. 56 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Caracterização química do solo Como descrito na seção anterior, a caracterização física e química do solo foi realizada e os resultados estão descritos na Figura 15 e Tabela 9. Figura 15. Triângulo textural do solo. Fonte: Própria autoria (2023). A Figura 15 ilustra a classe textural do solo utilizado no experimento, que no qual se enquadrou como franco arenoso em virtude dos valores resultantes de sua análise: 140 g kg-1 (14%) de argila, 795 g kg-1 (79,5%), 64 g kg-1 (6,4%) de silte. Em contraste, tais resultados podem indicar maiores benefícios à infiltração de água e desenvolvimento radicular dos vegetais (alta porosidade). Todavia, também podem contribuir na lixiviação de pesticidas hidrofílicos, com baixa capacidade de aderência em grânulos arenosos, como exemplo, o herbicida tebuthiuron. Por isso que a dose recomendada de pesticidas em solos arenosos é menor do que em argilosos. Caso a recomendação da bula do fabricante não for seguida corretamente, a contaminação de mananciais, lençóis freáticos, entre outros, pode ocorrer. 57 Tabela 9. Análise química do solo antes e após o pré-cultivo de C. ensiformis e M. pruriens. Atributos Unidade Antes Após Situação pH - 4,0 7,5 Aumentou Matéria Orgânica g dm-3 4,0 10 Aumentou Potássio mmolc dm-3 0,3 1,6 Aumentou Cálcio 6 51 Aumentou Magnésio 2 23 Aumentou Hidrogênio + Alumínio 33 8 Reduziu Alumínio3+ 13 0 Reduziu Fósforo mg dm-3 1 6 Aumentou Enxofre 7 - Não detectado Boro 0,10 0,02 Reduziu Cobre 0,1 0,2 Aumentou Ferro 4 2 Reduziu Manganês 1,8 1,2 Aumentou Zinco 0,1 0,3 Aumentou Soma de bases 8 75,6 Aumentou Capacidade de troca catiônica 41 83,6 Aumentou Saturação por bases % 20 90 Aumentou Saturação por alumínio 61 0 Reduziu Fonte: Própria autoria (2021) Como descrito na Tabela X, pós a correção química e o cultivo de mucuna-cinza e feijão-de-porco, os atributos químicos do solo melhoraram, pois ocorreu um aumento numérico dos parâmetros nutricionais, exceto do Alumínio3+, cujo elemento é fitotóxico e inibe o crescimento radicial (ECHART; CAVALLI-MOLINA, 2001). As boas práticas agrícolas bem como, a correção química do solo e o cultivo de adubos verdes podem promover o aumento de microrganismos capazes de fixar o nitrogênio atmosférico (SAGRILO et al., 2009). Em virtude de tais atividades, as plantas e a comunidade microbiana liberam alguns ácidos 58 orgânicos essenciais à solubilização de nutrientes e ao aumento da CTC (Capacidade de Troca Catiônica), e em consequência disso, os teores tóxicos de alumínio são reduzidos (CALEGARI, 2006). Nesse sentido, para execução da remediação de pesticidas em solos agrícolas, recomenda-se o uso de, não apenas plantas tolerantes à molécula alvo, mas também que elas sejam capazes de restaurar os atributos químicos, físicos e biológicos do sistema. 4.2 Desenvolvimento de mucuna-cinza e feijão-de-porco 4.2.1 Parâmetros morfométricos: altura Nas Figura 16 e 17 ilustram os efeitos deletérios do herbicida tebuthiuron nas plantas potencialmente fitorremediadoras (M. pruriens e C. ensiformis). Percebe-se que ambas as espécies sofreram bastante com a fitotoxicidade, apresentando clorose, e posteriormente, necrose em seus órgãos vegetais (folhas, parte dos caules). Figura 16. Efeitos fitotóxicos em tratamentos e tempos da M. pruriens. (A) 10 DAS; (B) 20 DAS; e (C) 30 DAS. Fonte: Própria autoria (2022) 59 Figura 17: Efeitos fitotóxicos em diferentes tratamentos e tempos do C. ensiformis. (A) 30 DAS; (B) 40 DAS; e (C) 60 DAS. Fonte: Própria autoria (2022). Na Figura 19, que ilustra o desenvolvimento cinético dos potenciais fitorremediadores (M. pruriens e C. ensiformis) associados ou não aos inoculantes, observa-se que ao longo de 0 a 50 DAS, o crescimento de MP foi mais rápido que CE, pois a inclinação da curva desse primeiro tratamento foi menor. Portanto, compreende-se que quanto mais inclinada a curva do gráfico, maior quantidade de tempo para que o crescimento vegetal alcance o seu ápice (Figura 18). Além de análises gráficas, existem outros parâmetros listados na Tabela 10 que podem comprovar a superioridade de uma planta: ápice de crescimento (α); ponto de “virada” da curva (β); taxa de crescimento específico (k) (Figura 18). Em relação aos valores da taxa de crescimento, compreende-se que quanto mais próximos de 1, mais rápido também será o crescimento vegetal, e tal situação pode ser visualizada em MP (k=0,113) e CE (k= 0,075). 60 Figura 18. Exemplo de uma curva de Gompertz juntamente com seus parâmetros e forma de interpretação. Fonte: Própria autoria (2023). Além disso, a interação planta-inoculante, não alterou completamente o comportamento das curvas, pois os tratamentos com MP obtiveram crescimento mais rápido que a CE. Por outro lado, foi constatado que MP + Sol cresce mais rápido que MP + Liq e/ou MP, resultados estes, diferentemente obtidos pela outra espécie testada (C. ensiformis), no qual CE + Liq cresceu mais rápido que CE + Sol e/ou CE. Em relação aos efeitos do herbicida (Figura 19), nota-se que houve redução de altura dos potenciais fitorremediadores quando se compara as com plantas-referência. Contudo, a associação MP + TBT manteve-se superior a CE + TBT em vários parâmetros, tais como rápido estabelecimento; valores de α e k também foram superiores (51,69> 20,27; 0,109> 0,069). A sensibilidade de C. ensiformis perante o tebuthiuron já foram relatados por Belo et al. (2007) e Ferreira et al. (2021b), evidenciando que tal planta talvez seja intolerante e pouco capaz de fitorremediar solo com este herbicida. Já os ensaios experimentais de Pires et al. (2005) e Mendes et al. (2021) demonstraram que a C. ensiformis pode suportar e até mesmo degradar o tebuthiuron, pois na rizosfera dessa planta existem microrganismos que podem auxiliar na degradação do herbicida. Tais resultados diferem dos encontrados nessa presente pesquisa em virtude de alguns fatores: localização da condução experimental, tipo de solo utilizado, umidade edáfica e aérea ar, temperatura ambiental, frequência de 61 luminosidade que podem interferir diretamente na eficiência de fitorremediação dos contaminantes; além disso, os autores não testaram a M. pruriens, espécie essa, que também mostrou resultados positivos à fitorremediação em outras pesquisas, tal como evidenciado por Ferreira et al. (2021b). Por isso que ao testar e escolher potenciais fitorremediadores é importante levar em consideração os fatores edafoclimáticos e observar o comportamento de tal espécie diante do pesticida (MADALÃO et al., 2017). Outro fator que demonstrou importante relevância nos tratamentos com o tebuthiuron foi a inoculação microbiana, pois a presença dos inoculantes atenuou os efeitos de sensibilidade nas espécies vegetais, condicionando rapidez em seu crescimento e/ou maior altura. Esses apontamentos podem ser perceptíveis em plantas de C. ensiformis, pois apenas CE + TBT obteve resultados inferiores aos demais tratamentos dessa mesma espécie. Em alguns casos, os efeitos dos inoculantes foram distintos nas plantas. A interação MP + Sol + TBT apresentou uma inclinação da curva ligeiramente maior que MP + Liq + TBT e, além disso, também se constatou menor taxa de crescimento - k - (MP + Sol + TBT = 0,100 < MP + Liq + TBT = 0,227), indicando desenvolvimento mais lento dessa associação. Apesar disso, a altura máxima alcançada por MP + Sol + TBT foi maior (α = 76,63). No que diz a respeito da C. ensiformis, a associação CE + Liq + TBT garantiu maior taxa de crescimento específico (k= 0,071), no entanto, apenas CE + Sol + TBT proporcionou altura máxima (α = 84,52). Testes elencados à remediação combinada entre planta-microrganismos também trouxeram resultados positivos. Um experimento desenvolvido a campo por Zhang et al. (2020), mostrou que a aplicação do inóculo sólido bacteriano denominado Cupriavidus sp. YNS-85 associado com a espécie vegetal Panax notoginseng pode remediar solos contaminados com o fungicida pentacloronitrobenzeno. Tal experimento de campo evidenciou que as plantas apresentaram um bom desenvolvimento vegetativo na presença do fungicida, indicando que o inoculante diminuiu a sua sensibilidade perante a tal molécula e também auxiliou na co-remediação. Já uma combinação entre a espécie vegetal Phaseolus vulgaris L. e cepas de Trichoderma sp., conseguiu remover aproximadamente 80% do herbicida atrazina no solo em 40 dias (MADARIAGA-NAVARRETE et al., 2017). 62 Figura 19. Desenvolvimento cinético de M. pruriens (MP) e C. ensiformis (CE) como potenciais fitorremediadores do herbicida 1 tebuthiuron (TBT) no solo com inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) a partir do modelo de Gompertz. 2 Os hemisférios ocidental e oriental representam as diferentes plantas, respectivamente, MP e CE. Já os hemisférios norte e sul demonstraram o efeito da adição 3 dos inoculantes e/ou do herbicida tebuthiuron, respectivamente. Fonte: Própria autoria (2022) 4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 A ltu ra [ cm ] Tempo [DAS] MP MP + Liq MP + Sol 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 A ltu ra [ cm ] Tempo [DAS] CE CE + Liq CE + Sol 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 A ltu ra [ cm ] Tempo [DAS] MP MP + TBT MP + Liq + TBT MP + Sol + TBT 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 A ltu ra [ cm ] Tempo [DAS] CE CE + TBT CE + Liq + TBT CE + Sol + TBT 63 Tabela 10. Parâmetros dos modelos cinéticos de Gompertz para a altura de M. pruriens (MP) e C. ensiformis (CE) como potenciais fitorremediadores de tebuthiuron (TBT) no solo com inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq). Tratamentos Complexidade Adequacidade α β k r² AIC BIC MP 72,72 15,49 0,113 0,72ns 63,96 65,17 MP + TBT 51,69 4,76 0,109 0,94* 63,96 65,17 MP + Liq 77,66 32,71 0,170 0,97* 69,10 70,31 MP + Sol 80,31 38,14 0,143 0,99** 56,33 57,54 MP + Liq +TBT 61,58 144,19 0,227 0,89* 78,80 80,01 MP + Sol + TBT 76,63 9,15 0,100 0,93* 75,82 77,04 CE 31,64 2,72 0,075 0,97* 46,29 47,50 CE + TBT 20,27 2,13 0,069 0,93* 44,71 45,92 CE + Liq 43,10 2,73 0,075 0,97* 53,67 54,88 CE + Sol 40,90 2,62 0,068 0,97* 50,41 51,62 CE + Liq + TBT 34,26 2,51 0,071 0,96* 49,03 50,24 CE + Sol + TBT 84,52 2,81 0,022 0,94* 60,08 61,29 Os parâmetros α, β e k denotam a assimetria superior, o ponto de inflexão e a decadência exponencial da taxa de crescimento específico, respectivamente; β = 1 mantém o decréscimo relativo com o tempo constante; β > 1 acelera o decréscimo relativo com o tempo; β < 1 desacelera o decréscimo relativo com o tempo; r2, coeficiente de determinação; AIC, Akaike Information Criterion (Critério de Informação Akaike); BIC, Bayesian Information Criterion (Critério de Informação Bayesiana); Código significativo: * valor de p < 0,05; ** valor de p < 0,01; ns valor de p > 0,05. Fonte: Própria autoria (2021). 4.2.2 Acúmulo de biomassa Complementarmente, os resultados descritos na Figura 20 indicaram que o acúmulo de biomassa seca de M. pruriens e C. ensiformis associados ou não com outros fatores de variação (inoculantes microbianos e herbicida) ao final do ciclo experimental (70 DAS). De maneira geral, a presença dos inoculantes sem o herbicida tebuthiuron aumentou o acúmulo de biomassa quando se compara com os outros tratamentos (apenas MP ou CE, neste caso). Em contrapartida, a adição isolada do herbicida deturbou o sistema, 64 reduzindo a produção de fitomassa de ambas as espécies, principalmente em MP + TBT, apesar da mesma ter obtido maior altura após 70 DAS. O herbicida afeta fotossíntese no decorrer do desenvolvimento vegetal. Se tal processo é prejudicado, não há eficiência na produção biomassa, deixando a planta vulnerável o que pode inviabilizar o processo de fitorremediação (CAMARGO et al., 2011). Abdulrahman e Oladele (2017) explicaram que, quando a planta consegue se desenvolver sem estresses intensos, ocorre maior absorção de soluções nutritivas com consequente acúmulo elevado de biomassa, aumentando a sua capacidade de tolerar e remediar solos contaminados. Nesse sentido, torna-se mais eficiente a metabolização de poluentes em substâncias menos tóxicas (SAIER; TREVORS, 2010). Quando se compara a ação dos inoculantes na presença ou ausência de herbicida no acúmulo de biomassa de M. pruriens, percebe-se que o inoculante líquido foi que mais contribuiu na produção fitomassa na presença de tebuthiuron, fornecendo melhor suporte à planta em comparação ao inoculante sólido, que foi afetado por tal pesticida, diminuindo seu efeito “fitoprotetor”. Estes resultados são contrários da C. ensiformis, pois a inoculação microbiana não aumentou a produção de fitomassa na presença do herbicida tebuthiuron, mesmo que esses inoculantes tenha contribuído nos valores elevados de altura. Apesar dos resultados demonstrarem que a M. pruriens apresenta um enorme potencial para despoluir solo contendo o herbicida tebuthiuron, utilizar apenas variáveis como altura e acúmulo de biomassa para avaliar a eficiência da fitorremediação podem não ser muito confiáveis, pois existem inúmeros fatores não controlados que altera a biodisponibilidade e o comportamento ambiental do herbicida (CHRISTOFFOLETI et al., 2009). Portanto, o cultivo de plantas bioindicadoras e a realização de bioensaios ecotoxicológicos são formas complementares de avaliar o processo de descontaminação ambiental (OLIVEIRA et al., 2014). 65 Figura 20. Produção de biomassa seca de M. pruriens (MP) e C. ensiformis (CE) em solo associado ou não com tebuthiuron (TBT) e/ou inoculantes sólido (Sol) ou líquido (Liq) após 70 DAS Legenda: letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística pelo teste Tukey a 5% na comparação dentre a mesma espécie vegetal. Fonte: Própria autoria (2022). 4.3 Desenvolvimento de crotalária 4.3.1 Parâmetros morfométricos: altura O cultivo de uma planta bioindicadora (também denominada planta sentinela) pode indicar se mesmo após a biorremediação ainda existe resíduos de pesticidas no solo (OLIVEIRA et al., 2014). Portanto, nesse experimento foi cultivado C. juncea logo após o ensaio de biorremediação e tais resultados podem ser visualizados nas Figura 21 (sem cultivo prévio de plantas) e 22 (com cultivo prévio de plantas), além da Tabela 11. Em se tratando da Figura 21, o solo referência (Ref), que não houve algum cultivo prévio de plantas, inoculantes e herbicida, garantiu um tímido desenvolvimento para espécie bioindicadora, ficando apenas atrás do tratamento com inoculante (Liq), que apresentou uma taxa de crescimento mais rápida (k=0,0582) e maior altura (α=324,99) em aproximadamente 60 DAS, tal como descrito na Tabela 11. Por outro lado, o inoculante sólido (Sol) pouco contribuiu no desenvolvimento da C. juncea, sendo comprovado pelo longo período de crescimento da planta (k=0,0302) até o alcance máximo em altura, que também foi inferior (α= 69,95). Já a presença apenas do herbicida (TBT) reduziu a velocidade de crescimento da espécie bioindicadora, e tal fato pode ser visualizado na Figura b b b ab a b ab b a a b b 0 4 8 12 16 20 M P M P + T B T M P + L iq M P + S ol M P + L iq + T B T M P + S ol + T B T C E C E + TB T C E + Li q C E + S ol C E + Li q + TB T C E + S ol + T B T M as sa s ec a (g ) 66 19, em que a curvatura está muito inclinada, além da taxa de crescimento específico (k) também ter um valor mais baixo (0,0115) do que os demais tratamentos. Porém, mesmo que o crescimento de C. juncea seja lento, o tratamento TBT pode alcançar uma altura máxima superior a 100 cm, valor este, maior que o Sol e Liq + TBT, sendo que esses dois tiveram curvas de crescimento semelhantes. Um panorama diferente foi evidenciado pelo inoculante sólido, que conseguiu atenuar o efeito fitotóxico do tebuthiuron na planta sentinela. Hipoteticamente, pode-se argumentar que para essa situação, os microrganismos do inoculante sólido exprimiu sua função no experimento em virtude da adição do tebuthiuron no solo, servindo como colaborador na remediação juntamente com atenuação natural. Porém, nesse respectivo trabalho não foi identificado quais microrganismos podem ter contribuído na biorremediação. Na literatura até o momento, apenas os microorganismos Methylobacterium, Microbacterium, Paenibacillus, Rhodococcus (MOSTAFA; HELLING, 2003) e Streptomyces (SHELDON et al., 1996) já tiverem sua capacidade de degradar o tebuthiuron. Paralelamente, o cultivo prévio de M. pruriens e C. ensiformis (Figura 22) também influenciou diretamente no desenvolvimento da espécie sentinela. Neste caso, CE foi o tratamento que melhor beneficiou no desenvolvimento da planta sentinela em comparação a aqueles com MP. Essa afirmação pode ser visualizada na Tabela 11, em que os parâmetros α e k de CE são maiores que MP (178,13>156,35; 0,0149>0,0106). De acordo com especialistas, a M. pruriens é popularmente conhecida pela ótima capacidade de proteger o solo e, também pelos seus efeitos alelopáticos em plantas, dificultando o seu desenvolvimento no solo (ERASMO et al., 2005). Então, possivelmente, as substâncias liberadas pela espécie