0 

 

 

 

 

 

 

DAIANE DE JESUS 

 

 

 

 

 

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, ANTI-INFLAMATÓRIA, 

CITOTOXICIDADE E GENOTOXICIDADE DO EXTRATO 

GLICÓLICO DE Betula pendula Roth (BÉTULA) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2016 

 



   1 

DAIANE DE JESUS 

 

 

 

 

 

 

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, ANTI-INFLAMATÓRIA, 

CITOTOXICIDADE E GENOTOXICIDADE DO EXTRATO GLICÓLICO 

DE Betula pendula Roth (BÉTULA) 

 

 

 

 

 

Dissertação apresentada ao curso de Odontologia do Instituto de Ciências 

e Tecnologia, UNESP – Univ Estadual Paulista, Campus de São José dos 

Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE, 

pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área 

Microbiologia / Imunologia. 

 

 

 

 

Orientadora: Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira 

 

 

 

 

São José dos Campos 

2016 

 



Apresentação gráfica e normatização de acordo com: 
Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para
Normalização de Trabalhos Acadêmicos do ICT. Rev. São José dos
Campos: ICT/UNESP; 2016.

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática,
 ICMC/USP com adaptações - STATi e STI do ICT/UNESP. Dados fornecidos pelo autor.

AUTORIZAÇÃO

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer
meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.

São José dos Campos, 26 de fevereiro de 2016 
E-mail: daianej1@gmail.com 

Assinatura: ______________________________

Jesus, Daiane de 
   Atividade antimicrobiana, anti-inflamatória, citotoxicidade e
genotoxicidade do extrato glicólico de Betula pendula Roth (bétula)
/ Daiane de  Jesus. - São José dos Campos : [s.n.], 2016.
   80 f. : il.

   Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal) - Pós-graduação em
Biopatologia Bucal - Instituto de Ciência e Tecnologia de São José
dos Campos, UNESP - Univ Estadual Paulista, 2016.
   Orientador: Luciane  Dias de Oliveira.
   

   1. Extratos vegetais. 2. Betula. 3. Ação antimicrobiana. 4. Anti-
inflamatórios. 5. Citotoxicidade Imunológica. I. Dias de Oliveira,
Luciane , orient. II. Instituto de Ciência e Tecnologia de São José
dos Campos, UNESP - Univ Estadual Paulista. III. Universidade
Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho'. IV. UNESP - Univ
Estadual Paulista. V. Título.



   2 

 

 

 

 

 

BANCA EXAMINADORA 

 

 

Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira (Orientadora) 

Instituto de Ciências e Tecnologia 

UNESP – Univ Estadual Paulista  

Campus de São José dos Campos 

 

 

Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge 

Instituto de Ciências e Tecnologia 

UNESP – Univ Estadual Paulista  

Campus de São José dos Campos 

 

 

Profa. Dr. Marcos Roberto Furlan 

Departamento de Ciências Agrárias 

UNITAU – Universidade de Taubaté 

Campus de Taubaté 

 

 

São José dos Campos, 26 de fevereiro de 2016. 

 

 

 

 

 



   3 

DEDICATÓRIA 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A Deus, 
A minha mãe (in memorian) 

Ao meu pai 
As minhas irmãs 

Ao meu noivo 
 

 



   4 

AGRADECIMENTOS 

 

 

 

 

Agradeço primeiramente a Deus por me providenciar esta oportunidade e 

novo rumo na minha vida profissional e por me dar saúde, força e 

sabedoria para ser capaz de cumprir esta missão. 

 

Aos meus pais Antonio de Jesus e Maria Aparecida Alves de Jesus (in 

memorian) pelo amor, suporte e pela boa educação e criação que me 

deram. 

 

Agradeço as minhas irmãs Viviane Aparecida de Jesus e Vanessa de 

Jesus pelo carinho e incentivo aos meus estudos.  

 

Ao meu noivo Milton Fernando Viegas Júnior pelo amor, compreensão e 

apoio.  

 

Ao Instituto de Ciências e Tecnologia ICT da Unesp de São José dos 

Campos por oferecer o Programa de Pós-Graduação em Biopatologia 

Bucal de excelente qualidade. 

 

A minha querida orientadora Professora Dra. Luciane Dias de Oliveira por 

ter me aceitado como orientanda, por todo apoio, ajuda e suporte técnico, 

moral e financeiro para concretizar o projeto do meu mestrado. Pela 

amizade, carinho e confiança no meu trabalho e pelos incentivos em 

participar dos eventos acadêmicos. Lu você é um exemplo de pessoa e 

profissional, te admiro muito! Obrigada por tudo! 

 

 



   5 

A todos os professores do Programa de Biopatologia Bucal do ICT/ 

UNESP, em especial ao Professor Titular Dr. Antonio Olavo Cardoso 

Jorge e à Professora Adjunta Dra. Juliana Campos Junqueira pela 

dedicação e esforço em busca de melhorias para os alunos e para o 

Programa e pelo empenho com qual lecionam os créditos de 

Microbiologia e Imunologia tão importantes para nossa formação, aprendi 

muito com vocês.  

 

A todos os meus amigos de pós-graduação pelo convívio harmonioso e 

amigável. Pelos conselhos, apoio moral e técnico, dicas, ajuda em 

diversos aspectos, pelas conversas, encontros e “comes e bebes”  que 

fizeram esses dois anos passar muito rápido e de forma muito agradável.  

 

Aos meus queridos amigos Jonatas Rafael de Oliveira e Isabela 

Amêndola que foram meus parceiros nesta minha trajetória de mestrado.  

O Jonatas é meu consultor de assuntos acadêmicos, com muita 

paciência, cuidado e dedicação me ensinou todas as técnicas que 

utilizaria no meu projeto e me deu muitas dicas de como escrever 

resumos, trabalhos e artigos e me incentivou a participar dos encontros 

acadêmicos. A Isa não mediu esforços para me ajudar, principalmente 

nos inúmeros biofilmes que fizemos durante o mestrado. Sempre otimista 

e simples, com uma boa conversa e carinhosa. Meu mestrado não seria 

completo sem vocês, muito obrigada! 

 

A todos os funcionários que nos ajudam em diversos assuntos e facilitam 

nossas vidas, em especial aos técnicos de laboratórios Domingos e 

Sérgio e à secretária Vanessa.  

 

E à Capes pela concessão da Bolsa de Mestrado.  

 

 

 



   6 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Deus quer, o homem sonha, a obra nasce”. 

Fernando Pessoa 

 

 



   7 

SUMÁRIO 

 

 

  

 

 

RESUMO ....................................................................................................... 9 

ABSTRACT ................................................................................................. 10 

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................... 11 

2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................... 14 

2.1 Betula pendula Roth (Bétula) ............................................................ 14 

2.2 Micro-organismos alvos da pesquisa .............................................. 16 

2.2.1 Leveduras do gênero Candida .......................................................... 16 

2.2.2 Bactérias ............................................................................................. 19 

2.3 Avaliação das atividades antimicrobiana e anti-inflamatória de 

extratos vegetais ....................................................................................... 22 

3 PROPOSIÇÃO ......................................................................................... 27 

4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 28 

4.1 Avaliação da atividade antimicrobiana ............................................ 28 

4.1.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e 

Concentração Microbicida Mínima (CMM) ................................................. 27 

4.1.2 Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato em biofilmes ....... 30 

4.2 Avaliação da citotoxicidade ............................................................... 33 

4.2.1 Análise da viabilidade celular pelo teste MTT ................................... 34 

4.2.2 Ensaios de citotoxicidade pela produção de citocinas IL-1β e TNF-α 

por macrófagos ............................................................................................ 36 

4.2.2.1 Ensaio imunoenzimático ELISA………………………..……………37 

4.3 Avaliação da genotoxicidade (teste de micronúcleos) .................. 38 

4.4 Avaliação da atividade anti-inflamatória .......................................... 39 

4.5 Análise estatística ............................................................................... 41 

  



   8 

5 RESULTADOS ..................................................................................... 42 

5.1 Atividade antimicrobiana ................................................................ 42 

5.1.1 Culturas planctônicas ...................................................................... 42 

5.1.2 Biofilmes ......................................................................................... 44 

5.2 Citotoxicidade .................................................................................. 48 

5.3 Genotoxicidade ................................................................................ 52 

5.4 Atividade anti-inflamatória .............................................................. 53 

6 DISCUSSÃO ......................................................................................... 58 

7 CONCLUSÃO ....................................................................................... 67 

8 REFERÊNCIAS .................................................................................... 68 

ANEXO  ... ............................................................................................... 80 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



   9 

Jesus D. Atividade antimicrobiana, anti-inflamatória, citotoxicidade e 
genotoxicidade do extrato glicólico de Betula pendula Roth (bétula) 
[dissertação]. São José dos Campos (SP): Instituto de Ciência e 
Tecnologia, UNESP – Univ Estadual Paulista; 2016. 

 
 
 

RESUMO 
 
 
 
 

Visando o potencial terapêutico do extrato glicólico de B. pendula em 
tratamentos de infecções bacterianas e fúngicas e de doenças 
inflamatórias, foram avaliadas suas atividades antimicrobiana, anti-
inflamatória, citotóxica e genotóxica. A atividade antimicrobiana do extrato 
foi analisada em Candida albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. 
guilliermondii, C. krusei, C. tropicalis, Staphylococcus aureus, 
Streptococcus mutans, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa com 
a determinação das Concentrações Inibitória Mínima e Microbicida 
Mínima (CIM e CMM) em culturas planctônicas e posteriormente testado 
sobre biofilmes monotípicos. A atividade citotóxica foi avaliada em cultura 
de macrófagos de camundongo (RAW 264.7) e fibroblastos gengivais 
humanos (FMM-1) após exposição de 5 min e 24 h ao extrato, com o 
teste MTT e teste imunoenzimático (ELISA) que quantificou a produção 
das citocinas IL-1β e TNF-α produzidas por RAW 264.7. A genotoxicidade 
do extrato foi avaliada pelo teste de micronúcleos. A atividade anti-
inflamatória foi avaliada nos sobrenadantes coletados de culturas de RAW 
264.7 estimuladas com LPS de E. coli e expostas aos extratos (5 min e 24 
h) pela quantificação de citocinas IL-1β, TNF-α e IL-10 por ELISA e óxido 
nítrico (ON) pelo método de Griess. A análise estatística foi realizada por 
ANOVA e teste de Tukey, com significância de 5%. O extrato teve ação 
antimicrobiana em todos biofilmes, com redução acima de 39,5% em 5 
min e acima de 78% em 24 h. A viabilidade celular foi satisfatória em 
concentrações abaixo de 50 mg/mL em 5 min tanto para FMM-1, quanto 
para RAW 264.7, contudo em 24 h concentrações acima de 3,13 e 12,5 
mg/mL foram citotóxicas para RAW 264.7 e FMM-1, respectivamente. Não 
houve indícios de ação genotóxica do extrato. A atividade anti-inflamatória 
foi evidenciada pela redução significativa na produção de TNF-α e ON nos 
grupos tratados. Conclui-se que o extrato de bétula tem potencial como 
agente antimicrobiano e anti-inflamatório.  
 
 
Palavras-chave: Extratos vegetais. Betula. Ação antimicrobiana. Anti-
inflamatórios. Citotoxicidade Imunológica. Genotoxicidade.                

 



   10 

Jesus D. Antimicrobial and anti-inflammatory activity, cytotoxicity and 
genotoxicity of Betula pendula Roth (Birch) glycolic extract [dissertation]. 
São José dos Campos (SP): Institute of Science and Technology, UNESP 
– Univ Estadual Paulista; 2016. 
 
 
 

ABSTRACT 
 
 
 
 

In order to verify the therapeutic potential of glicolic extract of B. pendula 
on the threatment of bacterial and fungical infection and on inflammatory 
diseases, its antimicrobial, anti-inflammatory actions, cytotoxic and 
genotoxic effects were evaluated. The antimicrobial activity of the extracts 
was tested on Candida albicans, C. dubliniensis, C. glabrata,                      
C. guilliermondii, C. krusei, C. tropicalis, Staphylococcus aureus, 
Streptococcus mutans, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa 
with determination of Minimum Inhibitory and Minimum Microbicide 
Concentrations (MIC and MMC) in planktonic growth, following of test in 
monotypic biofilms. The cytotoxic activity was evaluated in mouse 
macrophages (RAW 264.7) and human gingival fibroblast (FMM-1) after 
exposure of 5 min and 24 h to extract, through the MTT test and by 
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) to quantify the production 
of the cytokines IL-1β and TNF-α by RAW 264.7. The genotoxicity of the 
extracts was evaluated by micronucleus test. The anti-inflammatory 
activity was evaluated in RAW 264.7 stimulated with LPS from E. coli, after 
the period of exposure to the extract (5 min and 24 h) the supernatant was 
removed to quantify pro-inflammatory (IL-1β and TNF-α.) and anti-
inflammatory (IL-10) cytokines by ELISA and nitric oxide (NO) by Griess 
method. Statistical analysis was performed by ANOVA and Tukey's test, 
with significance level of 5%. The extract has shown antimicrobial activity 
with reduction above of 39.5% of biofilm in 5 min and more than 78% in 24 
h. The cell viability was satisfactory at concentrations below 50 mg/mL in 5 
min to RAW 264.7 and FMM-1, however in 24 h concentrations above 
3.13 and 12.5 mg/mL were cytotoxic to RAW 264.7 and FMM-1, 
respectively. There was no evidence of genotoxic action of the extract. 
The anti-inflammatory activity was evidenced by the significant reduction 
in the production of TNF-α and NO in the treated groups. It concludes that 
the birch extract has potential as antimicrobial and anti-inflammatory 
agent. 

 

 
Keywords: Plant extracts. Betula. Anti-infective Agents. Anti-inflammatory 
agents. Citotoxicity, Immunologic. Genotoxicity. 

 



   11 

1 INTRODUÇÃO  

 

 

 

 

As plantas, desde muito tempo, apresentam fontes de 

tratamento e cura para diversas doenças.  O uso de planta medicinal está 

intimamente associado à história da humanidade. Atualmente as plantas 

medicinais ainda são largamente utilizadas como uma alternativa para o 

tratamento de inúmeras doenças, principalmente onde os recursos 

médicos são precários ou ausentes. Espécies vegetais com ação 

terapêutica, utilizadas para fins profiláticos, curativos ou paliativos, podem 

dar origem à produção de fitoterápicos. De acordo com a legislação 

sanitária brasileira (Brasil, 2004), os fitoterápicos são medicamentos 

manufaturados cujos princípios ativos são exclusivamente oriundos de 

derivados vegetais, tais como, extrato, tintura, óleo, suco e cera, sendo 

obtidos por técnicas adequadas.  

A Organização Mundial da Saúde (OMS) reconhece que 

grande parte da população, aproximadamente 80%, em países em 

desenvolvimento utilizam plantas medicinais para tratamentos primários, 

porém recomenda-se que sejam realizados estudos científicos para 

comprovação de sua eficácia (Brasil, 2006). Muitos extratos de plantas 

apresentam diversas finalidades terapêuticas, com grandes potenciais 

para elaboração de novos fármacos. Contudo, é necessária a realização 

de estudos científicos para comprovação da eficácia dessas plantas 

diante às inúmeras atividades farmacológicas que podem apresentar, 

como ações antimicrobianas e anti-inflamatória, buscando assegurar que 

não sejam tóxicas ao organismo. 

Betula pendula Roth pertence à família Betulaceae. É 

conhecida popularmente por bétula. É uma árvore nativa de climas 

temperados na Europa e norte da Ásia (Rastogi et al., 2015) e 

 



   12 

amplamente utilizada como planta medicinal no tratamento de 

reumatismos e disfunções renais (Havlik et al., 2010), doenças 

bacterianas e inflamatórias, queda de cabelo e seborreia (Menkovic et al., 

2011). Alguns estudos relataram sua ação anti-inflamatória (Wacker et al., 

2012), anticancerígena (Gründemann et al., 2011) e antimicrobiana 

(Wojnicz et al., 2012). 

Os micro-organismos avaliados no presente estudo são 

todos de importância médica e odontológica. As espécies de Candida 

embora comensais, podem ser patógeno-oportunistas em caso de baixa 

imunidade do hospedeiro, causando-lhe infecções, denominadas 

candidoses (Rodrigues et al., 2014).  

Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa podem 

causar infecções graves e quadros de bacteriemia, além de ter a 

capacidade de desenvolver resistência a antibióticos (Anes et al., 2015; 

Hu et al., 2015). Staphylococcus aureus está relacionado à infecção 

alimentar e hospitalar (Espina et al., 2015), com crescente aumento de 

cepas resistentes à meticilina (Gerber et al., 2009). Streptococcus mutans 

é um dos agentes causadores da cárie dentária (Hasan et al., 2015).  

Estudos sobre métodos alternativos, como uso de 

extratos vegetais, para o controle de micro-organismos, são de grande 

relevância, uma vez que um dos grandes problemas na área da saúde é o 

aumento da resistência de micro-organismos aos antibióticos utilizados no 

tratamento de infecções, como os β-lactâmicos, aminoglicosídeos e 

quinolonas (Al-Dhabi et al., 2015). Micro-organismos resistentes a 

antibióticos podem provocar doenças infecciosas de difícil tratamento e 

alto índice de mortalidade (Namita, Mukesh, 2012). 

Desta forma, estudos envolvendo extratos vegetais 

representam importante campo de pesquisa, pois podem trazer diversos 

benefícios às áreas da saúde, inclusive na odontologia.  Com isso, torna-

se de interesse avaliar as atividades biológicas da bétula visando seu uso 

terapêutico e inserção em formulações de uso médico-odontológico, tais 



   13 

como medicações, irrigantes intracanais, enxaguatórios bucais, 

dentifrícios, entre outros. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



   14 

2 REVISÃO DA LITERATURA 

 

 

 

 

2.1 Betula pendula Roth (Bétula)  

 

 

Betula pendula é uma espécie do gênero Betula comum 

em regiões de clima temperado, nativa do leste Europeu e norte asiático. 

Raramente é encontrada em regiões tropicais, como o Brasil. É 

amplamente utilizada na medicina popular no tratamento de doenças de 

pele, infecções severas, inflamações e desordens urinárias (Demirci et al., 

2004).  

Diante do uso de B. pendula como planta medicinal, 

estudos tem sido direcionados a avaliar suas atividades biológicas, muitas 

vezes encontrando resultados que apoiam alguns de seus usos 

populares. Wojnicz et al. (2012) avaliaram extratos aquosos de plantas 

medicinais quanto à capacidade de influenciar nos fatores de virulência de 

E. coli. Os resultados mostraram que B. pendula foi capaz de reduzir 

significativamente a mobilidade e a formação de biofilme deste micro-

organismo.  

Gründemann et al. (2011) investigaram a capacidade anti-

proliferativa do extrato aquoso de folhas de B. pendula em linhagem 

celular de linfócitos humanos, obtendo como resultados inibição da 

proliferação e da divisão celular. Wacker et al. (2012) analisaram os 

efeitos do extrato aquoso de folhas de B. pendula sobre córnea inflamada 

de ratos e in vitro sobre cultura de células T. Os resultados mostraram 

que B. pendula inibiu a proliferação de células T por indução da apoptose 

e in vivo o extrato atrasou significativamente o aparecimento de 

opacificação da córnea, bem como  reduziu a quantidade de células 

 



   15 

CD4+, CD45+, o que permitiu inferir que B. pendula é um composto 

promissor no tratamento de doenças inflamatórias.  

B. pendula contem princípios ativos com algumas 

propriedades biológicas, como a betulina (Dehelean et al., 2012; Duric et 

al., 2013), o ácido betulínico (Duric et al., 2013) e seus derivados (Yang et 

al., 2012), treterpenos, ácido oleanólico e lupeol (Duric et al., 2013). No 

estudo de Dehelean et al. (2012), o extrato etanólico e o composto ativo 

betulina extraído do extrato da casca da árvore de B. pendula foram 

avaliados quanto aos seus efeitos sobre quatro linhagens de células de 

carcinomas humanos e sobre inflamação em ratos. Foi observada ação 

anti-proliferativa semelhante tanto do extrato como da betulina em todas 

as linhagens celulares estudadas, porém em relação ao efeito anti-

inflamatório, o extrato foi mais potente, provavelmente pela agregação 

dos efeitos de outros compostos presentes nele.  

Yang et al. (2012) avaliaram os derivados do ácido 

betulínico em cinco linhagens de células tumorais humanas: MGC-803, 

PC3, A375, Bcap-37 e A431, mostrando que esses compostos inibiram o 

crescimento de todas linhagens tumorais estudadas.  

Duric et al. (2013) avaliaram a atividade antibacteriana de 

cinco extratos metanólicos de diferentes partes da B. pendula e de seus 

compostos ativos, como betulina, ácido betulínico, ácido oleanólico e 

lupeol contra Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e 

Pseudomonas aeruginosa. Os resultados mostraram que o ácido 

oleanólico foi o composto mais eficiente contra S. aureus e B. subtilis e os 

extratos apresentaram ação contra S. aureus, B. subtilis e P. aeruginosa. 

Contudo, E. coli foi resistente a todos os extratos e compostos testados. 

Não foram encontrados na literatura estudos que avaliam 

a ação de B. pendula sobre biofilmes fúngicos, bem como o uso do 

extrato glicólico desta planta. Portanto, os resultados do presente trabalho 

colaboram com o conhecimento científico desta espécie vegetal 

expandindo a possibilidade de seu uso terapêutico. 



   16 

2.2 Micro-organismos alvos da pesquisa 

 

 

2.2.1 Leveduras do gênero Candida 
 

 

As leveduras do gênero Candida são organismos fúngicos 

comensais que compõem a microbiota do ser humano saudável e podem 

ser encontradas em mucosa oral, genital e nos tratos gastrointestinal e 

urinário (Tsai et al., 2013). Contudo, algumas espécies são oportunistas e 

sob determinadas situações do hospedeiro, como uso de 

imunossupressores ou de antibióticos de amplo espectro, imunidade 

comprometida, rompimento da barreira da mucosa, radio e quimioterapia, 

podem ocasionar infecções, normalmente candidoses oral e urogenital. 

Em alguns casos pode ocorrer candidemia, infecção sistêmica com alto 

potencial de mortalidade causada por Candida spp., geralmente em 

pacientes hospitalizados (Giri, Kiindo, 2012; Rodrigues et al., 2014). 

A patogenicidade das espécies de Candida também está 

associada a determinados fatores de virulência, como a capacidade de 

formar hifas, que pode favorecer a invasão nos tecidos do hospedeiro; de 

aderir e formar biofilme em superfícies bióticas e abióticas; e de produzir 

enzimas hidrolíticas, como proteases e fosfolipases (Silva et al., 2012). 

Vários agentes antifúngicos para o tratamento de candidoses estão 

disponíveis comercialmente, como a nistatina, anfotericina B, clotrimazol, 

miconazol, itraconazol, fluconazol e cetoconazol. No entanto, esses 

fármacos podem produzir efeitos adversos, como, por exemplo, gosto 

amargo, reações alérgicas e seleção de células resistentes (Ferreira et 

al., 2015). Neste cenário, observa-se a necessidade de se investigar 

outros compostos que apresentem atividade antifúngica, como os extratos 

vegetais, com menores efeitos tóxicos. 



   17 

São conhecidas aproximadamente 200 espécies do 

gênero Candida, dessas, as espécies C. albicans, C. glabrata,                 

C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei e C. lusitaniae são mais 

comumente associadas à infecções em humanos (Sankari et al., 2015). 

Todavia, C. albicans ainda apresenta a maior importância médica por 

predominar nos casos de candidemia e candidoses (Zarrin, 

Mahmoudabadi, 2009). 

C. albicans é o fungo predominante tanto na microbiota de 

indivíduos saudáveis, quanto em infecções fúngicas, sendo responsável 

por causar cerca de 90% de candidose vulvovaginal e de 50 a 60% das 

candidoses invasivas (Tsai et al., 2013). Além disso, C. albicans vem se 

destacando como um dos principais agentes de infecções nosocomiais 

sendo considerada a terceira maior causa de infecções de alto nível de 

mortalidade, relacionadas com uso de cateter intravascular (Chen HF, 

Lan, 2015). O sucesso na colonização e na infecção de C. albicans se 

deve principalmente pela capacidade de mudar sua morfologia, uma vez 

que, se encontra na forma de levedura, quando comensal ou para se 

disseminar no organismo, e de hifa ou pseudo-hifa, para invadir os tecidos 

do hospedeiro, bem como se aderir e formar biofilme com produção de 

enzimas hidrolíticas (Tsai et al., 2013).  

C. albicans é uma das principais espécies do gênero 

Candida de interesse médico, contudo há outras espécies com 

semelhante relevância, como C. dubliniensis que, embora seja menos 

frequente que C. albicans, já foi isolada do sangue de pacientes com 

infecção nosocomial. C. dubliniensis foi encontrada em 1995 em 

pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida na cidade de 

Dublin, Irlanda (Sullivan et al., 1995). C. dubliniensis se assemelha 

fenotipicamente a C. albicans, como na formação de tubo germinativo e 

clamidoconídeos (McMillan et al., 2014). Uma característica relevante de 

C. dubliniensis é a capacidade de adquirir resistência aos compostos 



   18 

azólicos por meio da atividade aumentada das bombas de efluxo, das 

modificações da enzima alvo destes fármacos e das alterações na via de 

biossíntese do ergosterol, componente importante da membrana 

citoplasmática de levedura (Sullivan et al., 2005). 

Nas últimas duas décadas, o número de infecções 

fúngicas causadas por Candida não-albicans vem aumentando 

significativamente e a principal espécie neste contexto é C. glabrata, a 

qual já se sabe ser responsável por cerca de 15% das infecções 

sistêmicas causadas por Candida (Rodrigues et al., 2014). C. glabrata se 

caracteriza por ser a única espécie de Candida conhecida que não forma 

pseudohifas em temperaturas acima de 37 ºC (Fidel et al., 1999), bem 

como não foi relatada a formação de hifa ou pseudo-hifa em cepas 

clínicas isoladas de infecções (Kaur et al., 2005). Contudo, C. glabrata 

possui outros fatores de virulência que favorece a sua invasão no 

hospedeiro, como a capacidade de adesão e formação de biofilme e 

secreção de enzimas hidrolíticas (Kaur et al., 2005; Rodrigues et al., 

2014). 

Outra espécie de Candida que vem ganhando importância 

clínica é C. guilliermondii por ser considerada um patógeno emergente, 

uma vez que esta espécie é propensa a desenvolver resistência aos 

agentes antifúngicos mesmo durante o tratamento (Papon et al., 2013). 

Além disso, está presente em 1 a 3% das candidemias, na maioria das 

vezes em pacientes com câncer (Pfaller et al., 2006), sendo de grande 

importância estudar tratamentos alternativos para este micro-organismo. 

C. guilliermondii é de interesse também em biotecnologia, já que em 

condições de limitação de ferro pode superproduzir riboflavina, um 

composto de inúmeras aplicações, como corante alimentar e composto 

vitamínico.  

C. krusei é outra espécie de Candida não-albicans de 

interesse médico por corresponder a 1 a 5% das causas de candidemias 

e apresentar resistência intrínseca ao fluconazol (Schuster et al., 2013). 



   19 

Huong et al. (2013) analisaram 135 amostras de biópsia de estômago de 

pacientes saudáveis e com doenças gastrointestinais devido à 

colonização por Candida spp. E verificaram que C. krusei estava presente 

em 20% de pacientes com hemorragia, 52% com úlcera e em 100% com 

gastrite, não sendo detectada em pacientes saudáveis. C. albicans apesar 

de ser a espécie de fungo mais comum no trato gastrointestinal de 

indivíduos saudáveis, não foi detectada em pacientes com distúrbios 

estomacais, ao contrário de C. krusei que se mostrou mais adaptada para 

colonizar o estômago desses pacientes. 

C. tropicalis também se destaca na área da saúde por 

causar cerca de 30% das infecções por Candida não-albicans e 

apresentar alta mortalidade, aproximadamente 50%, em paciente com 

saúde debilitada. A preocupação com esta levedura se deve também ao 

aumento de sua resistência a antifúngicos, como o voriconazol e 

fluconazol (Mesa-Arango et al., 2013).  Em um estudo epidemiológico 

conduzido no Brasil, C. tropicalis foi a segunda espécie de Candida mais 

frequentemente recuperada em casos de candidemia. Além disso, parece 

que C. tropicalis apresenta maior potencial de disseminação em 

indivíduos neutropênicos quando comparada a C. albicans e outras 

Candida não-albicans (Colombo et al., 2007). 

 
 

2.2.2 Bactérias 
  

 

Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa que está 

presente na microbiota intestinal em humanos. A maioria das cepas não 

são patogênicas, porém alguns sorotipos podem causar infecções graves 

como bacteriemia, meningite, infecção alimentar e no trato urinário (Anes 

et al., 2015). E. coli é o principal agente de bacteriemias, responsável por 

cerca de 30% de todos os casos (Livermore, 2012). O estudo de 



   20 

Lautenbach et al. (2010) demonstrou que, durante o tratamento com 

antibióticos, 50% dos isolados de E. coli exibiu superprodução na bomba 

de efluxo da membrana celular, o que indica ser um importante 

mecanismo de resistência dessa bactéria.  

Pseudomonas aeruginosa é outra bactéria Gram-negativa 

patógeno-oportunista, frequentemente relacionada a infecções 

hospitalares e representa a principal causa de mortalidade em pacientes 

com fibrose cística (Mai-Prochnow et al., 2015). P. aeruginosa é capaz de 

adquirir resistência a múltiplos grupos de agentes antimicrobianos, como 

os β-lactâmicos, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas, dificultando e 

encarecendo o tratamento de suas infecções (Hu et al., 2015). A alta taxa 

de resistência a antibióticos se deve em grande parte a sua capacidade 

de formar biofilme. P. aeruginosa produz ao menos três tipos diferentes 

de exopolissacarídeos, os quais constituem importantes componentes da 

matriz do biofilme que protegem as células de substâncias 

antimicrobianas (Toyofuku et al., 2012). 

As bactérias Gram-negativas possuem características 

específicas que, segundo alguns autores (Li, Nikaido, 2009; Livermore, 

2012), lhes conferem maior resistência a antibióticos em relação às 

bactérias Gram-positivas. A parede de bactérias Gram-negativas possui 

uma membrana externa formada de fosfolipídeos contendo 

lipopolissacarídeos que, além de ser um fator de virulência dessas 

bactérias, funciona como uma barreira à entrada de moléculas grandes e 

hidrofóbicas e dificulta a entrada de outras moléculas (Livermore, 2012).  

Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva que 

faz parte da microbiota normal da nasofaringe e da pele de humanos. 

Contudo, é um patógeno oportunista e em alimentos contaminados ou em 

contaminação hospitalar, por exemplo, pode provocar infecções severas 

como fasciíte necrosante, endocardites e pneumonia (Espina et al., 2015). 

Gerber et al. (2009) demonstraram que, entre 2002 e 2007, houve um 

aumento maior que três vezes de infecções causas por S. aureus 



   21 

resistente à meticilina (MRSA) e que este micro-organismo representa a 

causa de 51% de todas as infecções por Staphylococcus spp. O 

crescente aumento de cepas MRSA evidencia a importância de se 

estudar novos compostos que sejam eficazes no seu tratamento.  

Streptococcus mutans também é uma bactéria Gram-

positiva. É um dos agentes causadores de cárie dentária de superfície 

lisa. Metaboliza os carboidratos da dieta alimentar e produz ácidos que 

reduz o pH da saliva levando a desmineralização dos dentes. A habilidade 

de S. mutans de produzir ácido (acidogênica) e tolerá-lo (acidúrica) lhe 

conferem a capacidade cariogênica (Hasan et al., 2015).  Ao colonizar a 

cavidade oral, S. mutans estabelece o biofilme cariogênico. Desse modo, 

sua virulência tem sido atribuída à versatilidade em se adaptar a 

condições adversas e formar biofilme junto com outras espécies 

(Burnside, Rajagopal, 2011). Adicionalmente, foi demonstrado que           

S. mutans organizado em biofilme é mais tolerante ao pH ácido, em 

comparação a culturas planctônicas, característica fundamental para o 

desenvolvimento da cárie (Krzyściak et al., 2014). A lesão de cárie 

representa um grande problema de saúde pública que pode causar 

grandes prejuízos econômicos e em regiões subdesenvolvidas levar a 

perda precoce dos dentes (Guo et al., 2015).  

Inúmeras bactérias Gram-positivas têm potencial de 

causar mortalidade, muitas delas são encontradas em ambientes 

hospitalares, como estafilococos, enterococos, estreptococos e 

clostrídeos (McClay et al., 2015). Essas bactérias possuem uma parede 

celular mais espessa, constituída de multicamadas de peptideoglicanos e 

ácidos teicóicos, ambos importantes para manter a integridade celular, 

além de proteger a célula bacteriana do sistema imune do hospedeiro e 

de antibióticos. Por estes motivos, estes componentes costumam ser alvo 

de agente antimicrobianos (Czarny et al., 2014). O ácido teicóico também 

é considerado um fator de virulência, uma vez que auxilia a bactéria na 

adesão e formação de biofilme, processos essenciais para a colonização 



   22 

e infecção no hospedeiro (Brown et al., 2013). 

De acordo com a literatura, pode-se verificar a 

importância do estudo e uso terapêutico de novas substâncias 

antimicrobianas, uma vez que muitos micro-organismos patogênicos 

desenvolvem resistência aos antimicrobianos convencionais. Desta forma, 

o estudo do extrato glicólico de bétula sobre fungos do gênero Candida, 

bactérias Gram-negativas e Gram-positivas pode revelar um promissor 

agente antimicrobiano. 

 

 

2.3 Avaliação das atividades antimicrobiana e anti-inflamatória de 
extratos vegetais 
 

 

Sabe-se que muitos micro-organismos se tornam cada 

vez mais resistentes a determinadas substâncias devido à pressão 

seletiva frente ao uso dos antimicrobianos (Galan et al., 2013). A fim de 

se encontrar fármacos alternativos para o tratamento de doenças 

causadas por micro-organismos, recentemente diversos estudos estão 

sendo realizados no propósito de avaliar a ação antimicrobiana de 

extratos vegetais. 

Oliveira JR et al. (2013) avaliaram a atividade 

antimicrobiana de extratos glicólicos de Equisetum arvense L., Glycyrrhiza 

glabra L., Punica granatum L. e Stryphnodendron barbatiman Mart. contra               

S. aureus, Staphylococcus epidermidis, S. mutans, C.  albicans,               

C. tropicalis e C. glabrata e analisaram a citotoxicidade destes extratos 

em cultura de macrófagos (RAW 264.7). Todos os extratos foram efetivos 

contra os micro-organismos avaliados e o extrato de G. Glabra exibiu a 

menor citotoxicidade.  

Al-Massarani e El-Dib (2015) avaliaram o potencial 

antimicrobiano do extrato etanólico e aquoso da planta saudita Alhagi 

graecorum contra 19 cepas de micro-organismos patogênicos em culturas 



   23 

planctônicas e também analisaram sua citotoxicidade em cinco linhagens 

de células humanas. Obtiveram alta atividade antimicrobiana do extrato 

etanólico, o que não ocorreu com o extrato aquoso, que não apresentou 

efeito para nenhuma das cepas testadas, mostrando a importância de se 

avaliar o extrato não alcoólico, pois muitas vezes é o álcool que apresenta 

a ação antimicrobiana. Além disso, o extrato etanólico apresentou 

considerável citotoxicidade contra as linhagens celulares estudadas.  

Shetty et al. (2013) também compararam a atividade 

antimicrobiana do extrato alcoólicos e aquoso de alho contra patógenos 

periodontais. O extrato aquoso obteve a concentração inibitória mínima 

(CIM) de 16,6 µg/mL contra Porphyromonas gingivalis, sendo mais 

eficiente que o extrato alcoólico cuja CIM apresentou-se maior que 62,5 

µg/mL. Porém, Aggregatibacter actinomycetemcomitans se mostrou 

resistente para ambos os extratos.  

Agyare et al. (2013) investigaram as propriedades 

antimicrobianas de extratos etanólicos das folhas e cascas do caule de 

Funtumia elastica sobre E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, Bacillus subtilis, 

C. albicans, Aspergillus flavus e Aspergillus niger. Os extratos 

apresentaram atividade antimicrobiana, com CIM variando de 125 a 1750 

µg/mL. Donia et al. (2014) verificaram ação antimicrobiana do extrato 

alcóolico de Emex spinosa para S. aureus, Streptococcus pyogenes e B. 

subtilis, mostrando que o extrato teve ação efetiva contra os micro-

organismos analisados. Snowden et al. (2014) avaliaram diversos extratos 

de plantas que foram historicamente sugeridos com propriedades 

antimicrobianas contra S. aureus e os resultados demonstraram que os 

extratos mais efetivos foram de Salvia officinalis, Eucalyptus globulus, 

Coleus forskohlii, Coptis chinensis e Larrea tridentata. 

Pieri et al. (2012) estudaram o efeito bacteriostático do 

óleo de copaíba contra S. mutans, encontrando inibição de crescimento 

bacteriano em baixa concentração do fitoterápico (0,78 µL/mL). Malolo et 

al. (2015) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato metanólicos de 



   24 

Helichrysum foetidum e Helichrysum mechowianum e de seus compostos 

isolados sobre o crescimento de Bacillus subtilis e Cladosporium 

cucumerinu, mostrando que tanto os extratos quanto seus compostos 

isolados apresentaram alto potencial de inibição de crescimento nas 

espécies analisadas.  

Teodoro et al. (2015) avaliaram a atividade antifúngica do 

extrato aquoso de Buchenavia tomentosa contra cepas clínicas e padrão 

de Candida albicans e não-albicans, obtendo valores de CIM entre 0,2 a 

25 mg/mL, sendo mais efetivo contra espécies não-albicans, tanto para 

cepas padrão, quanto clínicas. Neste mesmo estudo foi verificado que o 

extrato apresentou baixa citotoxicidade em células de fibroblastos até a 

concentração de 25 mg/mL. 

Contudo, poucos estudos avaliaram a eficácia de 

fitoterápicos em micro-organismos organizados em biofilmes, onde podem 

apresentam resistência até mil vezes maior que em células planctônicas 

da mesma espécie (Venkatesan et al., 2015).  

Esta resistência das bactérias organizadas em biofilmes 

foi verificada por Lee (2013) ao avaliar os efeitos antimicrobianos de 

extratos metilalcoólicos vegetais de Cudrania tricuspidata, Sophora 

flavescens, Ginkgo biloba e Betula schmidtii, em S. mutans planctônico e 

em biofilme. Como resultados, S. mutans em cultura planctônica mostrou 

susceptibilidade a todos os extratos, porém em biofilme a sensibilidade foi 

maior ao S. flavescens.  

Albuquerque et al. (2013) analisaram o efeito antiaderente 

do extrato hidroalcoólico de Lippia sidoides sobre S. mutans, Streptoccus 

sanguinis e Lactobacillus casei. O extrato demonstrou efeito antiaderente 

até a concentração 1:16 para os micro-organismos estudados, porém não 

foi avaliada a ação do extrato sobre o biofilme já formado. O estudo de 

Oliveira SA et al. (2014) avaliaram os efeitos antimicrobianos de óleos 

essenciais de Citrus limonum e Citrus aurantium em biofilmes mistos de 

C. albicans, Enterococcus faecalis e E. coli. Os autores constataram que 



   25 

ambos os óleos essenciais apresentaram redução microbiana significativa 

para todos os micro-organismos no biofilme.  

Em relação aos estudos de avaliação da atividade anti-

inflamatória de extratos vegetais, muitos têm utilizado cultura de 

macrófagos de camundongo (RAW264.7), como Huang et al. (2013) que 

analisaram os efeitos anti-inflamatórios do extrato etanólico da raiz de 

Pendulous monkshood em macrófagos de camundongos estimulados por 

lipopolissacarídeo (LPS) e os resultados demonstraram o potencial 

terapêutico deste extrato nas doenças inflamatórias, já que houve uma 

diminuição significativa na produção de óxido nítrico (ON) e do estresse 

oxidativo intracelular. De modo similar, Chen X et al. (2015) analisaram a 

ação do extrato etanólico de Ainsliaea fragans na liberação de 

mediadores inflamatórios de RAW264.7 estimulado por LPS e verificaram 

que o extrato inibiu a expressão de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) 

e interleucina-6 (IL-6), bem como a produção de ON. 

 Yoon et al. (2013) investigaram a atividade anti-

inflamatória do extrato metanólico da raiz de Evodia lepta em macrófagos 

(RAW 264.7) estimulados com LPS, analisando a produção de ON e 

prostaglandina E2 (PGE2). Os resultados demonstraram que este extrato 

diminuiu a produção de ON e PGE2, de maneira dose-dependente. Gwon 

et al. (2013) demonstraram que a fração hexano de Sargassum fulvellum 

inibiu a produção de ON por macrófagos (RAW 264.7) estimulados por 

LPS, de maneira dose-dependente, bem como diminuiu a produção de 

citocinas pró-inflamatórias.  Oyungerel et al. (2013) investigaram o efeito 

do extrato de Magnolia sieboldii na produção de citocinas pró-

inflamatórias por macrófagos de camundongo estimulados por LPS. 

Concluíram que o extrato tem capacidade imunorregulatória, já que 

reduziu significativamente a produção de ON e de interleucina 1 beta (IL-

1β), IL-6, TNF-α e COX-2.  

Sripanidkulchai e Junlatat (2014) investigaram a atividade 

farmacológica do extrato etanólico de Phyllanthus emblica e verificaram 



   26 

que este extrato suprimiu a expressão de genes pró-inflamatórios, 

ciclooxigenase-2 (COX-2), óxido nítrico sintetase induzível (iNOS), TNF-α, 

interleucina 16 (IL-16) e IL-6 induzidos por LPS em macrófagos (RAW 

264.7), também de maneira dose dependente. O estudo de Jeong et al. 

(2015) verificou que o extrato metanólico de Liriodendron tulipifera 

suprimiu a produção de TNF-α em macrófagos de camundongo 

estimulados por LPS, o que sugere regulação da resposta anti-

inflamatória por este extrato. Liu et al. (2015) avaliaram a atividade anti-

inflamatória do extrato etanólico de Clematis terniflora in vivo, induzindo 

inflamação em ratos, e in vitro, utilizando RAW 264.7. Os resultados 

mostraram que o extrato teve ação anti-inflamatória favorável em ratos, o 

que provavelmente foi relacionado à capacidade do extrato de inibir a 

liberação de ON e PGE2, evidenciada nas células RAW 264.7 induzidas 

por LPS. 

Estes estudos demonstram que o modelo in vitro da 

cultura de células RAW 264.7 é eficiente na avaliação do extrato vegetais 

em relação ao efeito anti-inflamatório, pela quantificação de moduladores 

inflamatórios, sendo interessante também analisar os efeitos citotóxicos, 

genotóxicos e anti-inflamatórios do extrato de bétula nesta linhagem 

celular. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



   27 

3 PROPOSIÇÃO 

 

 

 

 

Este trabalho se propôs a: 

 

a) avaliar a atividade antimicrobiana do extrato 

glicólico de B. pendula Roth sobre C. albicans, 

C. dubliniensis, C. glabrata, C. guilliermondii,  

C. krusei, C. tropicalis, E. coli, P. aeruginosa,       

S. aureus e S. mutans em culturas planctônicas 

e em biofilmes monotípicos; 

b) avaliar a citotoxicidade do extrato de bétula em 

culturas de macrófagos de camundongo (RAW 

264.7) e de fibroblastos gengivais humanos 

(FMM-1); 

c) avaliar a genotoxicidade do extrato em 

macrófagos (RAW 264.7); 

d) avaliar a atividade anti-inflamatória do extrato 

em macrófagos (RAW 264.7) estimulados por 

lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



   28 

4 MATERIAL E MÉTODOS  

  

 

 

 

O extrato glicólico de folhas de bétula (B. pendula Roth) 

foi doado pela empresa Mapric (São Paulo, SP) a 200 mg/mL em 

propilenoglicol com o devido laudo (ANEXO A). 

 

 

4.1 Avaliação da atividade antimicrobiana  

 

 

A avaliação da atividade antimicrobiana do extrato foi 

realizada sobre cepas de referência (ATCC – American Type Culture 

Collection) de C. albicans (ATCC 18804), C. dubliniensis (ATCC 

MYA646), C. glabrata (ATCC 9030), C. guilliermondii (ATCC 6260), C. 

krusei (ATCC 6258), C. tropicalis (ATCC 13803), E. coli (ATCC 25922), P. 

aeruginosa (ATCC 15442), S. aureus (ATCC 6538) e S. mutans (ATCC 

35688). As cepas foram provenientes do Laboratório de Microbiologia e 

Imunologia do Curso de Odontologia do ICT – UNESP.  

 

 

4.1.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e 
Concentração Microbicida Mínima (CMM)  
 

 

Para a determinação da CIM foi utilizado o método de 

microdiluição em caldo, segundo Clinical and Laboratory Standards 

Institute (CLSI), normas M7-A9 (Cockerill III et al., 2012) para bactérias e 

M27-S4 (CLSI, 2012) para leveduras.  

 



   29 

Para tanto, os micro-organismos que estavam 

armazenados a -70 ºC, foram reativados em meio de cultura ágar 

Sabouraud-dextrose (Himedia, Mumbai, Índia) para as leveduras e ágar 

Brain Heart Infusion (BHI – Himedia, Mumbai, Índia) para as bactérias, 

incubados por 24 h a 37 °C para todas as cepas e com 5% CO2 para S. 

mutans. Os inóculos foram preparados a partir da adição de colônias 

destes micro-organismos em solução fisiológica estéril (NaCl 0,9%) e 

padronizados em espectrofotômetro (B582, Micronal, São Paulo, Brasil) 

para o número de 107 UFC/mL (unidades formadoras de colônia por 

mililitro) para as bactérias e 106 UFC/mL para as leveduras, de acordo 

com os comprimentos de onda e as densidades ópticas presentes no 

Quadro 1.  A concentração final em cada poço para as bactérias foi de 5 x 

104 UFC/mL, conforme Cockerill III et al. (2012). As leveduras ainda 

passaram por diluições de 1:50 e depois 1:20 em meio RPMI 1640 (com 

glutamina, sem bicarbonato e com indicador vermelho de fenol) (Himedia, 

Mumbai, Índia), para alcançar a concentração no poço de 2,5 x103 

UFC/mL sugerida por Clinical and Laboratory Standard Institute (2012). 

 

 

Quadro 1 – Comprimentos de onda () e densidades ópticas (DO) 
utilizados no espectrofotômetro para padronização dos micro-organismos 
 

Micro-organismo  (nm) DO 

Candida spp 530 0,284 

P. aeruginosa 630 0,09* 

E. coli 590 0,362 

S. aureus 490 0,447 

S. mutans 398 0,560 

*108 UFC/mL, houve diluição de 1/10 para resultar em 107 UFC/mL. 

 

 



   30 

O teste foi realizado em microplacas de 96 poços (TPP, 

Zollstrasse, Suiça), onde foram adicionados 100 µL de meio de cultura, 

100 µL do extrato, apenas na primeira coluna de poços da microplaca, de 

onde partiram uma série de 10 diluições seriadas à base de 2, e por 

último os inóculos padronizados, no volume de 5 µL para as bactérias e 

de 100 µL para leveduras. 

 Foi realizado o controle positivo de crescimento somente 

com o meio de cultura e o inóculo, e o controle negativo com o meio de 

cultura e o extrato. Os meios utilizados foram caldo Müeller Hinton 

(Himedia, Mumbai, Índia) para as bactérias, e meio RPMI 1640 (com 

glutamina, sem bicarbonato e com indicador vermelho de fenol) (Himedia, 

Mumbai, Índia) tamponado com MOPS [ácido 3- (N-morfolino) 

propanosulfônico (Sigma – Aldrich, St. Louis, EUA) pH 7,0 ± 0,1, para as 

leveduras.  

Após incubação de 24 h a 37 °C (com 5% de CO2 para     

S. mutans) a CIM foi determinada no primeiro poço (da direita para a 

esquerda) da microplaca que não apresentou turvações que indicassem 

crescimento microbiano.  

Para determinação da CMM do extrato foi necessário 

inocular em ágar BHI ou Sabouraud-dextrose 100 µL da CIM e das 

concentrações acima subsequentes.  Após 48 h de incubação a 37 ºC, em 

placas onde não foi observado crescimento de colônias, foi determinada a 

CMM do extrato. Para os micro-organismos nos quais não foi possível 

determinar a CIM e CMM, foi feita a leitura em leitor de placa no 

comprimento de onda 630 nm afim de se obter a redução do crescimento 

nas diferentes concentrações do extrato. 

O mesmo teste foi realizado para o propilenoglicol, que é 

o controle do veículo do extrato.  

 
 

 



   31 

4.1.2 Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato em biofilmes  
 

 

Os biofilmes foram formados em poços de microplacas de 

96 poços (TPP, Zollstrasse, Suiça). Para tanto, após reativação, colônias 

dos micro-organismos foram transferidas para caldo BHI (Himedia, 

Mumbai, Índia) para bactérias e em Yeast Nitrogen Base (YNB – Himedia, 

Mumbai, Índia) suplementado com 100 mM de glicose para fungos e 

esses inóculos incubados em estufa a 37 °C por 24 h. Depois desse 

período, a suspensão microbiana foi centrifugada (358 xg/10 min), o 

sobrenadante descartado e o pellet ressuspendido em solução fisiológica 

estéril (NaCl 0,9%) para lavagem do micro-organismo. Após novo 

processo de centrifugação, a suspensão microbiana foi padronizadas em 

espectrofotômetro (B582, Micronal, São Paulo, Brasil) a 107 UFC/mL em 

solução fisiológica estéril (NaCl 0,9%) de acordo com os comprimentos de 

onda e densidades ópticas presentes no Quadro 1, exceto para as 

espécies de Candida, cuja densidade óptica foi de 0,381. 

 Em seguida, foram acrescentados 200 µL/poço desta 

suspensão nos poços da microplaca. Após incubação (37 °C) de 90 min 

sob agitação (75 rpm), para aderência inicial, o sobrenadante foi 

descartado e acrescentado meio de cultura, sendo BHI para bactérias e 

YNB para Candida spp. Em seguida as placas voltaram para incubação a 

37 °C sob agitação (75 rpm), exceto S. mutans que foi incubado a 37 °C 

com 5% de CO2 sem agitação. O biofilme foi formado por 48 h, no 

entanto, após 24 h de incubação, o meio foi substituído por meio fresco.  

Após este período, os biofilmes foram lavados com 

solução salina estéril (NaCl 0,9%) e colocados em contato com o extrato 

por 5 min ou 24 h, em três concentrações pré-determinadas em ensaios 

piloto (Quadro 2), totalizando 60 grupos experimentais para a avaliação 

antimicrobiana em biofilmes.  

 



   32 

Quadro 2 – Relação dos 60 grupos experimentais na avaliação da 
atividade antimicrobiana do extrato glicólico de B. pendula 

 

Micro-

organismos 

5 min – 

Concentração do 

extrato em mg/mL 

24 h – Concentração do 

extrato em mg/mL 

C. albicans 25 12,5 6,25 25 12,5 6,25 

C. dubliniensis 25 12,5 6,25 25 12,5 6,25 

C. glabrata 25 12,5 6,25 25 12,5 6,25 

C. guillermondii 100 50 25 25 12,5 6,25 

C. krusei 100 50 25 25 12,5 6,25 

C. tropicalis 100 50 25 25 12,5 6,25 

E. coli 200 100 50 100 50 25 

P. aeruginosa 200 100 50 100 50 25 

S. aureus 200 100 50 100 50 25 

S. mutans 200 100 50 100 50 25 

 

 

Solução salina estéril (NaCl 0,9%) e o meio de cultura 

foram utilizados como controle positivo de crescimento para o tratamento 

de 5 min e 24 h, respectivamente. Posteriormente, estas soluções foram 

descartadas, o biofilme foi lavado três vezes com solução fisiológica 

estéril (NaCl 0,9%), permanecendo 200 µL em cada poço para a 

desagregação do biofilme com o auxílio do homogeneizador ultrassônico 

(SONICS Vibra-Cell™), com potência de 25% por 30 s.  

Após, a suspensão obtida foi diluída de forma seriada e 

20 µL foram inoculados em gotas únicas em meio sólido (BHI ou 

Sabouraud-dextrose), em triplicata (Figura 1). Após incubação de 48 h a 

37 °C, foram contadas as unidades formadoras de colônia (UFC) obtidas 

em cada gota e após calcular a média, o valor foi multiplicado por 50 e 

pela diluição utilizada, para se encontrar o número de UFC/mL. 



   33 

 

 
Figura 1 – Crescimento de colônias de P. aeruginosa nas gotas semeadas em ágar. 

 

Foram realizados 3 experimentos independentes, com 4 

repetições cada, totalizando n=12 para cada grupo experimental e para os 

controles positivos de crescimento.  

Os resultados foram transformados em log10 para 

comparação estatística entre os grupos.  A porcentagem de redução do 

grupo tratado (T) foi calculada utilizando os resultados dos grupos 

controle (C) como referência, com a seguinte fórmula: 

 

% Redução = (Média UFC/mLC – UFC/mLT)/ Média UFC/mLC x 100 

 

 

4.2 Avaliação da citotoxicidade  

 

 

A avaliação da citotoxicidade do extrato glicólico de bétula                                                              

foi realizada em culturas de camundongo RAW 264.7 por meio do teste 

colorimétrico MTT, que analisou a viabilidade celular pela atividade de 

esterases celulares, após exposição de 5 min ou 24 h, e pelo teste 

imunoenzimático ELISA que quantificou a produção de citocinas (IL-1β e 

TNF-α).  



   34 

A avaliação da citotoxicidade pelo teste MTT também foi 

realizada em células de fibroblastos gengivais humanos FMM-1, 

provenientes do Banco de Células da Faculdade de Odontologia da USP. 

A cultura de RAW 264.7 é proveniente do Banco de 

Células do Rio de Janeiro – Associação Técnico Científica Paul Ehrlich 

(APABCAM – RJ). Ambas as culturas celulares foram cultivadas em meio 

de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM – LGC Biotecnologia, Cotia, 

Brasil), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Invitrogen, 

Nova York, EUA) e mantidas em frascos de cultivo celular (TPP, Suíça), 

incubadas em estufa à temperatura de 37 °C, com 5% de CO2.  

O meio de cultura foi trocado a cada 48 h.  As células 

foram utilizadas nos testes quando foi observado estado de 

subconfluência, caracterizado pela ocupação de mais de 70% do frasco. 

Para tanto, a monocamada de células foi desagregada do assoalho do 

frasco de cultura com auxílio de um varredor celular, as células 

suspendidas foram centrifugadas por 5 min a 504 xg (Centrífuga Hermle 

z300k, Alemanha). Foi aplicado o teste de exclusão pelo azul de Trypan, 

para ser quantificado o número de células viáveis no contador celular 

automatizado (Countess Cell, Invitrogen, Nova York, EUA). 

 

 

4.2.1 Análise da viabilidade celular pelo teste MTT  
 

 

Foi realizada análise da atividade metabólica das células 

viáveis pelo método de redução do brometo de 3(4,5-dimetiltiazol-2-yl)2,5-

difeniltetrazólio (MTT) em formazina por esterases celulares. A solução de 

MTT foi preparada a partir da suspensão de 0,5 mg do pó de MTT (Sigma 

Aldrich Co., Alemanha) em 1 mL de Phosphate Buffer Saline (PBS) 

(Cultilab, Brasil) estéril.  



   35 

Em microplacas de 96 poços (TPP, Zollstrasse, Suiça) 

foram adicionados 200 µL de meio DMEM + 10% SFB contendo 2 x 104 

células viáveis. Estas placas foram incubadas (37 °C, com 5% de CO2) 

por 24 h para que ocorra aderência celular nos poços da microplaca. Em 

seguida, o sobrenadante foi descartado e acrescentados 200 µL/poço de 

10 concentrações do extrato diluído de forma seriada na base 2 no meio 

DMEM. Para a cultura FMM-1, as concentrações testadas foram aquelas 

capazes de causar redução nos biofilmes. Foram utilizados poços-

controles, contendo apenas células com meio de cultura. O n foi igual a 

10 para todos os grupos. O período de incubação foi de 5 min e 24 h. 

Após, o material foi descartado e os poços foram lavados com PBS.  

Para verificação da viabilidade da cultura, foram 

adicionados 100 µL/poço da solução de MTT e as placas voltaram para 

incubação por período de 1 h, abrigadas da luz. Posteriormente, esta 

solução foi descartada e foram adicionados 100 µL/poço de 

dimetilsulfóxido (DMSO – Sigma) para expor os cristais de formazan 

produzidos, após absorção do sal de MTT, por células viáveis. Após 

incubação de 10 min e agitação por mais 10 min em mesa agitadora. A 

absorbância dos poços foi lida em leitora de microplacas com 

comprimento de onda de 570 nm (Figura 2). As densidades ópticas (DO) 

obtidas foram convertidas em percentual de viabilidade celular 

empregando a seguinte fórmula:  

 

% Viabilidade = (DO Grupo Tratado/ Média DO Grupo Controle) x 100  

 



   36 

 

 
Figura 2 – Cultura de RAW 264.7 em placa de 96 poços após reação com o MTT e 
DMSO. Quanto maior a intensidade da cor púrpura maior a viabilidade celular. 

 

 

4.2.2 Ensaios de citotoxicidade pela produção de citocinas IL-1β e TNF-α 
por macrófagos (Oliveira et al., 2013) 
 

 

Em placas de 24 poços (TPP, Zollstrasse, Suiça) foram 

acrescentadas 5 x 105 células viáveis por poço, sendo o volume 

completado com meio DMEM + 10% SFB para 1 mL. As placas foram 

incubadas (37 °C, com 5% de CO2) por 24 h para aderência das células. 

Após, o meio foi removido e adicionado o extrato diluído em meio DMEM 

em concentrações que não comprometeram a viabilidade celular pelo 

método do MTT, as quais foram 12,5, 25 e 50 mg/mL para exposição de 5 

min e 0,39, 0,78 e 1,56 mg/mL para exposição de 24 h. Para o grupo 

controle foi utilizado apenas o meio DMEM + 10% SFB. O n foi igual a 10 

para todos os grupos. Para o grupo com exposição de 5 min, após o 

tempo de contato o sobrenadante foi descartado, as células foram 



   37 

lavadas duas vezes com PBS e acrescido meio de cultura (Figura 3). As 

placas seguiram novamente para incubação por 24 h.  

Após este período, os sobrenadantes de todos os grupos 

foram coletados, armazenados em microtubos e congelados em freezer    

(-20 °C) para posterior quantificação de citocinas pelo teste 

imunoenzimático ELISA.  

 

 

 
Figura 3 – Cultura de RAW264.7 após tratamento com diferentes concentrações do 
extrato, mostrando o sobrenadante que foi coletado para a quantificação de citocinas.  

 

 

4.2.2.1 Ensaio imunoenzimático ELISA  

 

 

Microplacas de 96 poços (Nunc Thermo Scientific, 

Waltham, EUA) foram sensibilizadas com anticorpos de captura (anti-

TNF-α, anti-IL-1β ou anti-IL10) de camundongo (R&D Systems, 

Minneapolis, EUA) e mantidas overnight em temperatura ambiente. No dia 

seguinte, as microplacas foram lavadas com PBS contendo Tween 20 

(PBS-T) e bloqueadas com soro albumina bovina (BSA, 0,1%) por 1 h. 



   38 

Após, as microplacas foram lavadas com PBS-T e receberam os 

sobrenadantes da cultura de células (100 µL por poço) e os padrões das 

citocinas com concentrações conhecidas (curva-padrão). Após 2 h, as 

placas foram lavadas (PBS-T) e acrescentados anticorpos de detecção 

anti-TNF-α, anti-IL-1β ou anti-IL10 marcados com biotina. Após 2 h, a 

reação foi revelada com solução contendo substrato cromogênico e 

peróxido de hidrogênio. A reação foi bloqueada após 20 min com ácido 

sulfúrico 2 N (Figura 4). As densidades ópticas (DO) foram lidas no leitor 

de microplacas (Biotek) com comprimento de onda de 450 nm.  

Após obtenção das DO foram determinados os níveis de 

TNF-α, IL-1β ou IL-10 (pg/mL) das amostras de sobrenadantes celulares 

com auxílio do programa GraphPad Prism 5.0. 

 

 

 
Figura 4 – Ensaio de ELISA, mostrando a última etapa quando há o bloqueio da reação 
cromogênica pelo ácido sulfúrico 2 N.  
 

 

4.3 Avaliação da genotoxicidade (teste de micronúcleos) 

 

 

Os macrófagos (RAW 264.7) foram cultivados em meio 

DMEM (LGC Biotecnologia, Cotia, Brasil) suplementado com 10% de soro 

fetal bovino (SFB) (Invitrogen, Nova York, EUA) a 37 °C e 5% CO2. Para o 

teste, 2 x 104 células foram cultivadas em poços de placas de 24 poços 



   39 

(TPP, Zollstrasse, Suiça) por 24 h a 37 °C em atmosfera de 5% CO2. 

Após este período, as células foram expostas por 24 h ao extrato diluído 

em DMEM + 10% SFB nas seguintes concentrações: 0,78, 1,56, 3,13, 25, 

50 e 100 mg/mL. Utilizou-se o meio DMEM como controle negativo. 

Após, os sobrenadantes foram descartados e as células 

lavadas com PBS-T. Prosseguindo, as células foram fixadas com formol 

4% por 10 min, lavadas novamente com PBS-T e acrescentados 200 μL 

de PBS-T e uma gota do reagente DAPI (Sigma-Aldrich) em cada poço.  

Os micronúcleos foram analisados em microscópio de 

fluorescência, sendo avaliadas 1000 células/poço por concentração. Os 

micronúcleos foram identificados como estruturas de DNA contidas no 

citoplasma claramente separados do núcleo principal, cercados por uma 

membrana nuclear, e incluindo uma área menor que 1/3 da área do 

núcleo principal. Foram contadas as células com menos de cinco 

micronúcleos. 

 

 

4.4 Avaliação da atividade anti-inflamatória 

 

 

Foram cultivadas em placas de 24 poços (TPP, 

Zollstrasse, Suiça) 5 x 105 células/mL de macrófagos (RAW 264.7) por 24 

h. Após incubação, o sobrenadante foi descartado e foi acrescentado 

meio fresco (DMEM + 10%SFB) no grupo controle e o extrato diluído em 

meio DMEM nas seguintes concentrações: 12,5, 25 e 50 mg/mL em 5 min 

e 0,39, 0,78 e 1,56 mg/mL em 24 h. Essas concentrações não 

comprometeram a viabilidade celular nos experimentos de citotoxicidade 

e não induziu a produção de citocinas pró-inflamatórias detectada pelo 

teste ELISA. Ao mesmo tempo, foi acrescentado lipopolissacarídeo (LPS) 

de E. coli (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) na concentração de 1 µg/mL em 

cada poço. As placas foram incubadas por dois períodos distintos: 5 min e 



   40 

24 h (37 °C e 5% de CO2). Sendo que para os grupos de 5 min o 

sobrenadante foi retirado, os poços lavados com PBS, acrescentado meio 

DMEM + 10%SFB e as placas novamente incubadas por mais 24 h. 

Posteriormente, o sobrenadante foi coletado e 

armazenado sob refrigeração (-20 °C) para posterior quantificação de 

citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-10), 

como descrito no subitem 4.2.2.1, e óxido nítrico. 

A produção de óxido nítrico nos sobrenadantes de cultura 

de macrófagos foi determinada indiretamente pela concentração de nitrito 

detectada pelo reagente de Griess. Antes do início do teste, os 

sobrenadantes foram centrifugados a 504 xg por 10 min.  

O reagente de Griess foi preparado misturando três 

soluções: solução A contendo 0,6 g de ácido sulfanílico dissolvido em 70 

mL de água destilada quente. Após a solução ter esfriado, foram 

adicionados 20 mL de ácido clorídrico concentrado e de água destilada 

suficiente para 100 mL. Solução B produzida a partir de 0,6 g de alfa-

naftalamina dissolvida em 20 mL de água destilada e 1 mL de ácido 

clorídrico. O volume foi completado com água destilada para 100 mL. E 

solução C produzida a partir 16,4 g de acetato de sódio na forma 

hidratada em água destilada no volume de 100 mL. 

Em microplaca de 96 poços (TPP, Zollstrasse, Suiça), 

foram acrescentados 100 µL das amostras dos sobrenadantes e o mesmo 

volume do reagente de Griess em cada poço. Depois de 10 min (Figura 

5), a leitura foi realizada no leitor de microplacas com comprimento de 

onda de 570 nm. Para o cálculo da concentração de nitrito, foram 

utilizadas amostras padrão de nitrito de 100 a 0,78 μM, constituindo uma 

curva-padrão. 

 



   41 

 

 

Figura 5 – Placa de 96 poços contendo os sobrenadantes das células com o Reagente 
de Griess para quantificação de ON. 

 

 

4.5 Análise estatística 

 

 

A análise estatística foi realizada no Programa Graphpad 

Prism® 5.0. Para dados paramétricos foi utilizado o método ANOVA 

complementado pelo Teste de Tukey, com nível de significância de 5%    

(p ≤ 0.05). Os dados não-paramétricos foram analisados pelo método 

Kruskal-Wallis, complementado pelo Teste de Dunn com nível de 

significância de 5% (p ≤ 0.05). Os resultados foram expressos nas médias 

dos grupos experimentais e controle ± o desvio-padrão. 

 

 

 

 

 

 



   42 

5 RESULTADOS 

 

 

 

 

5.1 Atividade antimicrobiana 

 

 

5.1.1 Culturas planctônicas 

 

 

Nos testes de microdiluição em caldo, o extrato glicólico 

de bétula apresentou ação antifúngica semelhante nas diferentes 

espécies de Candida com CIMs entre 0,78 e 3,13 mg/mL e CMMs entre 

3,13 e 6,25 mg/mL. Para as bactérias, nas concentrações testadas foi 

possível se determinar as CIM e CMM somente contra P. aeruginosa, as 

quais foram de 12,5 e 25 mg/mL, respectivamente (Tabela 1). Para as 

outras bactérias foi necessário fazer a leitura das densidades ópticas dos 

poços para verificar a redução do crescimento microbiano. Para E. coli, a 

maior redução do crescimento foi de 98% a 25 mg/mL. Para S. aureus a 

50 mg/mL o extrato reduziu 93% e para S. mutans nas concentrações de 

50 e 100 mg/mL houve redução maior que 99%, conforme mostra figura 

6. O propilenoglicol não afetou o crescimento dos micro-organismos em 

culturas planctônicas. 

 

 

 

 

 

 

 

 



   43 

Tabela 1 – Concentração Inibitória Mínina (CIM) e Concentração 
Microbicida Mínima (CMM) do extrato (concentrações em mg/mL) 
 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Figura 6 – Gráfico mostrando a porcentagem de redução do crescimento planctônico em 
relação ao controle (eixo Y), nas diferentes concentrações, em mg/mL, do extrato de 
bétula (eixo X). 

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Streptococcus mutans

Micro-organismo CIM CMM 

Candida albicans 1,56 3,13 

Candida dubliniensis 0,78 3,13 

Candida glabrata 1,56 6,25 

Candida guillermondii 1,56 3,13 

Candida krusei 1,56 3,13 

Candia tropicalis 3,13 6,25 

Escherichia coli >100 >100 

Pseudomonas aeruginosa 12,5 25 

Staphylococcus aureus >100 >100 

Streptococcus mutans >100 >100 



   44 

5.1.2 Biofilmes 

 

 

O extrato de bétula interferiu significativamente no 

crescimento do biofilme nas diferentes concentrações utilizadas e em 

contatos por 5 min e 24 h tanto em biofilmes de Candida spp (Tabelas 2 e 

3), quanto em biofilmes bacterianos (Tabelas 4 e 5). 

    

 

Tabela 2 – Crescimento de biofilmes fúngicos em UFC/mL (log10) tratados 
com extrato glicólico de bétula em diferentes concentrações (mg/mL) 
durante 5 min (n = 12). Em cada linha, médias seguidas de mesma letra 
não diferem significativamente (p > 0,05) 
 

Fungo Concentração do extrato em mg/mL 

C* 100 50 25 12,5 6,25 

Candida 
albicans 

6,71a 
± 0,64 

- - 
 
 

5,95b 
± 0,38 

6,34a 
± 0,32 

6,23a 
± 0,45 

Candida 
dubliniensis 
 

5,56a 
± 0,11 

- 
 

- 4,54b 
± 0,74 

4,7b 
± 0,57 

4,93b 
± 0,53 

Candida 
glabrata 

8,01a 
±0,14 

- 
 

- 7,09b 
±0,6 

7,07b 
± 0,46 

7,31b 
± 0,12 

Candida 
guillermondii 

7,44a 
± 0,23 

5,78b 
± 0,41 

6,54b 
± 0,23 

7,32a 
± 0,35 

- - 

Candida krusei 7,2a 
± 0,26 

6,7b 
± 0,21 

6,6b 
± 0,25 

6,92c 
± 0,15 

- - 

Candida 
tropicalis 

7a 
± 0,14 

6,51b 
± 0,34 

6,5b 
± 0,42 

6,58b 
± 0,34 

- - 

* Controle 

 

 

 

 

 

 

 

 



   45 

 

Tabela 3 – Crescimento de biofilmes fúngicos em UFC/mL (log10) tratados 
com extrato glicólico de bétula em diferentes concentrações (mg/mL) 
durante 24 h. (n = 12). Em cada linha, médias seguidas de mesma letra 
não diferem significativamente (p > 0,05) 
 

Fungo 
Concentração do extrato em mg/mL 

C* 25 12,5 6,25 

Candida 
albicans 

9,63a 
± 0,05 

5,99b 
± 0,3 

6,5c 
± 0,29 

6,43c 
± 0,33 

Candida 
dubliniensis 

7,73a 
± 0,54 

3,12b 
± 0,72 

3,41b 
± 0,53 

3,51b 
± 0,54 

Candida 
glabrata 

11,07a 
±0,36 

8,02b 
±0,38 

9,36c 
± 0,24 

9,66c 
± 0,1 

Candida 
guillermondii 

9,58a 
± 0,27 

7,38b 
± 0,24 

7,38b 
± 0,26 

7,37b 
± 0,17 

Candida krusei 
14,09a 
± 0,49 

9,91b 
± 0,28 

10,23bc 
± 0,18 

10,34c 
± 0,3 

Candida 
tropicalis 

10,39a 
± 0,48 

7,77b 
± 0,39 

8,25b 
± 0,42 

8,15b 
± 0,47 

* Controle 

 

Tabela 4 – Crescimento de biofilmes bacterianos em UFC/mL (log10) 
tratados com extrato glicólico de bétula em diferentes concentrações 
(mg/mL) durante 5 min (n = 12). Em cada linha, médias seguidas de 
mesma letra não diferem significativamente (p > 0,05) 
 

Bactéria 
Concentração do extrato em mg/mL 

C* 200 100 50 

Pseudomonas aeruginosa 
13,33a 
± 0,46 

10,2b 
± 0,56 

11,9c 
± 0,64 

10,5b 
± 0,73 

Escherichia coli 
7,12a 
± 0,27 

5,92b 
± 0,42 

6,88a 
± 0,15 

6,41b 
± 0,33 

Staphylococcus aureus 
9,79a 

± 0,09 
9,15b 
± 0,22 

9,3b 
± 0,17 

9,17b 
± 0,2 

Streptococcus mutans 
8,6a 

± 0,23 
8,21b 
± 0,4 

8,23b 
± 0,3 

8,46a 
±0,41 

* Controle 

 

 

 



   46 

Tabela 5 – Crescimento de biofilmes bacterianos em UFC/mL (log10) 
tratados com extrato glicólico de bétula em diferentes concentrações 
(mg/mL) durante 24 h (n = 12). Em cada linha, médias seguidas de 
mesma letra não diferem significativamente (p > 0,05) 
 

 
Bactéria 

Concentração do extrato em mg/mL 

C* 100 50 25 

Pseudomonas aeruginosa 10,7a 
± 0,31 

6,26b 
± 0,6 

7,3bc 
±0,17 

8,98ac 
± 0,16 

Escherichia coli 15,07a 

± 0,07 
13,1b 
± 0,06 

13,9a 
± 0,9 

14,1a 
± 0,77 

Staphylococcus aureus 11,42a 
± 0,24 

5,77b 
± 0,35 

7,7c 
±0,46 

8,9d 
± 0,26 

Streptococcus mutans 10,36a 
± 0,25 

6,14b 
± 0,27 

8,2c 
±0,43 

8,96d 
± 0,18 

* Controle 

 

 

A redução em porcentagem dos fungos em biofilme 

(UFC/mL) foi acima de 58% em 5 min, sendo C. guillermondii a levedura 

que sofreu maior redução do biofilme de 97%, e a redução foi acima de 

97% em 24 h para todas as espécies de Candida, chegando a quase 

100% para C. dubliniensis, C. glabrata e C. krusei (Figuras 7A a 7F) 

Para as bactérias, em contato por 5 min a redução foi 

acima de 39,5% e atingiu 99,9% para P. aeruginosa. Em 24 h de contato, 

a redução ficou acima de 78% e conseguiu chegar a quase 100% para    

P. aeruginosa, S. aureus e S. mutans com o extrato a 100 mg/mL (Figuras 

8A a 8D).  

 

 

 

 

 

 
 
 



   47 

        A                                                           B   

 

        C                                                       D 

 

          
        E                                                             F 

 

 
Figura 7 – Redução em porcentagem (%) em relação ao controle de UFC/mL de 
biofilmes fúngicos após contato de 5 min ou 24 h com o extrato de bétula em diferentes 
concentrações.  Letras iguais não diferem significativamente (p < 0,05). 
 

 

 

 
 
 
 



   48 

 
        A                                                             B 

 

 
        C                                                             D 

 

 
Figura 8 – Redução em porcentagem (%) em relação ao controle de UFC/mL de 
biofilmes bacterianos após contato de 5 min ou 24 h com o extrato de bétula em 
diferentes concentrações.  Letras iguais não diferem significativamente (p < 0,05). 

 

 

5.2 Citotoxicidade 

  

 

Em relação à avaliação do metabolismo celular pelo 

método MTT, em células de fibroblasto com 5 min de exposição, as 

concentrações abaixo de 50 mg/mL não comprometeram a viabilidade 

celular dos fibroblastos, como mostra a figura 9.  

Em 24 h de contato, somente a concentração de 6,25 

mg/mL não foi citotóxica aos fibroblastos e a viabilidade celular não 

diferenciou significativamente do controle, enquanto as concentrações 

Biofilme de E. coli

20
0

10
0 50 10

0 50 25

0

20

40

60

80

100 a
ab

b

a

ab ab 5 min

24 h

Concentração do extrato de Bétula (mg/mL)

R
e
d

u
ç
ã
o

 (
%

)



   49 

acima comprometeram mais de 50% da viabilidade celular dos 

fibroblastos (Figura 10). 

 

 

Figura 9 – Gráfico apresenta a porcentagem da viabilidade celular da linhagem FMM-1 
em relação ao controle após contato de 5 min com diferentes concentrações do extrato 
de bétula. 

 

 
 

Figura 10 – Gráfico apresenta a porcentagem da viabilidade celular da linhagem FMM-1 
em relação ao controle após contato de 24 h com diferentes concentrações do extrato de 
bétula. 



   50 

Na cultura celular RAW 264.7 foi constatado que 

concentrações abaixo de 50 mg/mL também não comprometeram a 

viabilidade celular em 5 min de contato como mostra a Figura 11.  

 

 

 
Figura 11 – Gráfico apresenta a porcentagem da viabilidade celular em relação ao 
controle da linhagem RAW 264.7 após contato de 5 min com diferentes concentrações 
do extrato de bétula. 

 

 Em contato por 24 h com o extrato, as células RAW 

264.7 apresentaram alta influência em sua atividade metabólica nas 

diferentes concentrações do extrato, apresentando viabilidade celular 

superior a 50% e sem diferenciar significativamente do controle somente 

em concentrações abaixo de 1,56 mg/mL (Figura 12). 

 



   51 

 

 
Figura 12 – Gráfico apresenta a porcentagem da viabilidade celular da linhagem RAW 
264.7 após contato de 24 h com diferentes concentrações do extrato de bétula. 

   

 Para a quantificação de citocinas foram utilizadas 

concentrações não citotóxicas para as células RAW 264.7, verificada no 

ensaio de metabolismo celular pelo método MTT. Em 5 min de contato 

nas concentrações de 50 e 25 mg/mL do extrato os níveis de IL-1β e TNF-

α não tiveram diferença estatística em relação ao controle (p > 0,05), 

enquanto na concentração de 12,5 mg/mL a produção de ambas citocinas 

foi menor, como mostra a comparação presente na Tabela 6.  

 

 

Tabela 6 – Quantificação de IL-1β e TNF-α (pg/mL) produzida por RAW 
264.7 após contato de 5 min com diferentes concentrações do extrato de 
bétula. Em cada coluna, médias seguidas por mesma letra não diferem 
significativamente (p > 0,05) 

 

Concentração 
(mg/mL) 

IL-1β TNF-α 

50  2,61 ± 0,65a 255,27 ± 34,01a 

25 3,38 ± 1,68a 358,68 ± 52,38a 

12,5 0,25 ± 0,79b 109,89 ± 57,41b 

Controle  4,9 ± 1,48a 293,24 ± 152,29a 



   52 

No tratamento de 24 h, foram utilizadas concentrações 

menores que em 5 min, as quais não provocaram citotoxicidade nos 

macrófagos. Verificou-se que a produção de IL-1β não diferiu 

significativamente entre os grupos tratados e o controle (p > 0,05) e o 

nível de TNF-α não diferiu significativamente entre os grupos controle e 

tratados nas concentrações de 0,39 e 0,78 mg/mL, mas foi estimulado na 

concentração de 1,56 mg/mL, conforme Tabela 7. 

 

 

Tabela 7 – Quantificação de IL-1β e TNF-α (pg/mL) produzida por RAW 
264.7 após contato de 24 h com diferentes concentrações do extrato de 
bétula. Em cada coluna, médias seguidas por mesma letra não diferem 
significativamente (p > 0,05) 
 

Concentração 
(mg/mL) 

IL-1β TNF-α 

1,56 7,76 ± 5,21a 1568,72 ± 289,78b 

0,78 2,53 ± 5,28a 548,06 ± 85,05a 

0,39 0a 537,9 ± 30,43a 

Controle 0a 577,07 ± 191,38a 

 

 

5.3 Genotoxicidade 

 

 

A genotoxicidade do extrato de bétula foi realizada por 

meio da contagem de micronúcleos (Figura 13). Foram escolhidas 

concentrações maiores: 100, 50 e 25 mg/mL, e concentrações menores: 

3,13, 1,56 e 0,78 mg/mL do extrato de bétula. Em todas as 

concentrações, o número de micronúcleo foi semelhante ao grupo 

controle (Tabela 8).  



   53 

Tabela 8 – Contagem de micronúcleos (MN) por mil núcleos em duplicata 

 

 

 

 
Figura 13 – Microscopia óptica de fluorescência de células RAW264.7 coradas por DAPI 
evidenciando os núcleos (N) e o micronúcleo (seta). Aumento 800 x.  

 

 

5.4 Atividade anti-inflamatória 

 

 

Em 5 min de tratamento, a cultura de RAW 264.7 

estimulada com LPS produziu quantidade que não foi diferente 

significativamente (p > 0,05) de IL-1β nos grupos tratados com extrato de 

bétula nas concentrações de 50 e 25 mg/mL e no grupo controle. 

Contudo, houve significativa redução da produção de IL-β no grupo 

tratado com 12,5 mg/mL do extrato (Tabela 9). 

Com relação à produção de TNF-α pelos macrófagos, 

todas as concentrações analisadas do extrato (50, 25 e 12,5 mg/mL) 

promoveram significativa redução em relação ao controle (LPS), sendo 

que a concentração de 12,5 mg/mL promoveu maior redução na produção 

desta citocina (Tabela 9).  

Concentração do 
extrato (mg/mL) 

Controle 0,78 1,56 3,13 25 50 100 

MN/1000 núcleos 1 4 3 4 4 3 2 

N 

 



   54 

Considerando a concentração 12,5 mg/mL como a que 

apresentou melhores resultados quanto à diminuição da produção de 

citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e TNF-α), nesta concentração foi 

quantificada também a citocina anti-inflamatória IL-10, a qual não 

diferenciou significamente entre os grupos tratado e o controle LPS 

(Tabela 9). 

 

 

Tabela 9 – Quantificação de IL-1β e TNF-α (pg/mL) produzida por RAW 
264.7 após contato de 5 min com diferentes concentrações do extrato de 
bétula na presença de LPS. Em cada coluna, médias seguidas por 
mesma letra não diferem significativamente (p > 0,05) 
 

 

 

Quanto à produção de óxido nítrico (ON), as 

concentrações de 12,5 e 25 mg/mL não diferenciaram significativamente 

do controle (LPS), enquanto que em 50 mg/mL a liberação de ON foi 

estatisticamente menor (p < 0,05) que no grupo controle LPS (Figura 14).  

 

Concentração 
(mg/mL) 

IL-1β TNF-α IL-10 

50 3,59 ± 1,07a 766,05 ± 111,79b - 

25 2,83 ± 1,0ab 815,06 ± 351,18b - 

12,5 1,24 ± 1,76b 238,95 ± 42,36c 127,61 ± 24,74a 

Controle 4,44 ± 1,44a 2623,61± 725,6a 117,27 ± 57,35a 



   55 

  

Figura 14- Quantificação da produção de ON nos grupos tratados e controle em 5 min 
estimulados por LPS. N=10. Letras iguais correspondem a grupos homogêneos              
(p > 0,05). * Diferença significativa em comparação ao controle (p < 0,05). 

 

No tratamento de 24 h, observou-se que a cultura RAW 

264.7 estimulada por LPS em todos os grupos tratados aumentou 

significativamente (p < 0,05) a produção de IL-1β em relação ao grupo 

controle (DMEM + LPS). No entanto, houve redução estatisticamente 

significante na produção de TNF-α nos grupos tratados com diferentes 

concentrações do extrato de bétula (1,58, 0,78 e 0,39 mg/mL) em relação 

ao controle LPS (p < 0,05). Com relação à produção da citocina IL-10, 

observou redução significativa no grupo tratado pelo extrato de bétula na 

concentração 0,78 mg/mL em relação ao grupo controle LPS (Tabela 10). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



   56 

Tabela 10 – Quantificação de IL-1β e TNF-α (pg/mL) produzida por RAW 
264.7 após contato de 24 h com diferentes concentrações do extrato de 
bétula. Em cada coluna, médias seguidas por mesma letra não diferem 
significativamente (p > 0,05) 
 

Concentração 
(mg/mL) 

IL-1β TNF-α IL-10 

1,56 43,43 ± 17,36b 2686,88 ± 369,73c - 

0,78 50,72 ± 12,24b 2882,25 ± 400,75c 552,22 ± 99,86b 

0,39 44,15 ± 10,88b 3439,15 ± 396,8b - 

Controle 26,23 ± 4,16a 21407,48 ± 299,53a 2451,3 ± 24,74a 

 

 

Em adição, foi notado que a produção de ON foi menor 

estatisticamente (p > 0,05) em todos os grupos tratados com o extrato de 

bétula em relação ao grupo controle LPS (Figura 15). 

 

 

Figura 15 – Quantificação da produção de ON nos grupos tratados e controle em 24 h 
estimulados por LPS. N = 10. Letras iguais correspondem a grupos homogêneos            
(p > 0,05). * Diferença significativa em comparação ao controle (p < 0,05). 
 

 

Para relacionar todos as variáveis avaliadas quanto à 

atividade anti-inflamatória, as tabelas 11 e 12 indicam as alterações na 



   57 

quantificação de citocinas e ON nos grupos tratados em relação ao grupo 

controle LPS em 5 min e 24 h de contato. 

 

 

Tabela 11 -  Comparação da quantificação das citocinas e ON nos grupos 
tratados em relação ao grupo controle em 5 min estimulados com LPS. 
Quantificação     maior, ...menor e      semelhante ao do controle 
 

 

 

Tabela 12 -  Comparação da quantificação das citocinas e ON nos grupos 
tratados em relação ao grupo controle em 24 h estimulados com LPS. 
Quantificação    maior e ...menor ao do controle 
 

 

 

 

 

 

 

Concentração 
(mg/mL) 

IL-1β TNF-α IL-10 ON 

50   - 
 

25   - 
 

12,5 
  

 
 

Concentração 
(mg/mL) 

IL-1β TNF-α IL-10 ON 

1,56 
  

- 
 

0,78  
   

0,39   - 
 



   58 

6 DISCUSSÃO 

 

 

 

 

Para avaliação da atividade antimicrobiana, este estudo 

analisou os efeitos do extrato glicólico de bétula sobre dez espécies de 

micro-organismos de interesse médico e odontológico, sendo seis 

espécies de Candida e quatro espécies de bactérias. Foi verificado que 

para as espécies de Candida, o extrato foi capaz de eliminar culturas 

planctônicas em concentrações entre 3,13 e 6,25 mg/mL (Tabela 1). A 

ação antifúngica do extrato também foi evidenciada nos biofilmes 

maduros, os quais sofreram significativas reduções, como mostram as 

Figuras 7A a 7F. 

Entre os efeitos em biofilmes fúngicos, destaca-se a ação 

contra C. albicans que em contato por 5 min apresentou redução de 

UFC/mL de até 86,4 ± 9,9% e em contato por 24 h houve redução acima 

de 99,9% em todas as concentrações testadas. Este fato é relevante visto  

que C. albicans é responsável por cerca de 50 a 60% das candidoses 

invasivas (Tsai et al., 2013).  Outros trabalhos também relataram efeito 

antifúngico de plantas sobre biofilme de C. albicans, como o estudo de 

Jesus et al. (2015) que evidenciou redução significativa do biofilme a 

partir da concentração de 50 mg/mL do extrato glicólico de Persea 

americana em 5 min de contato, assim como o de Oliveira JR et al. (2014) 

com o extrato glicólico de Arctium lappa L. A 250 mg/mL e o estudo de 

Oliveira SA et al. (2014) que obteve eliminação de C. albicans em 

biofilmes mistos tratados por 5 min com óleos essenciais de C. limonum e              

C. aurantium. Estes estudos indicam o potencial das plantas no 

tratamento de infecções causadas por C. albicans. 

O efeito antifúngico do extrato de bétula também foi 

notório em espécies de Candida não-albicans, cujas reduções do biofilme 

 



   59 

em 24 h de tratamento passou dos 99% para todas as espécies, sendo 

que para C. dubliniensis, C. glabrata e C. krusei este percentual ficou 

acima dos 99,99% e em 5 min a redução foi superior a 58% (C. tropicalis) 

e atingiu 97% para C. guillermondii. Estas espécies, assim como              

C. albicans, são patógenos oportunistas, com potencial de causar 

candidoses e/ou infecções sistêmicas em humanos (Sullivan et al., 2005; 

Colombo et al., 2007; Rodrigues et al., 2014; Papon et al., 2013; Schuster 

et al., 2013).  

Outros extratos vegetais foram testados sobre espécies 

de Candida, como Buchenavia tomentosa cuja ação antifúngica foi 

observada sobre C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. krusei,         

C. tropicalis e C. parapsilosis (Teodoro et al., 2015). Samie et al. (2010) 

analisaram a ação antifúngica de extratos de 30 espécies de plantas 

contra C. albicans e C. krusei, sendo que 15 foram efetivos contra          

C. albicans e 12 contra C. krusei. Também Höfling et al. (2010) avaliaram 

a ação antifúngica de cinco extratos vegetais sobre dez espécies de 

Candida, incluindo as seis testadas no presente estudo, as quais 

apresentaram sensibilidade a todas as plantas testadas.  

Um dos poucos os estudos encontrados na literatura que 

avaliam a ação antifúngica de fitoterápicos sobre biofilmes de Candida 

não-albicans é o estudo de Pires et al. (2011), que descreveu a ação do 

óleo essencial de canela contra biofilmes de C. parapsilosis e                   

C. orthopsilosis. Diante deste cenário, na prospecção de plantas com 

ação antifúngica, há a necessidade de explorar mais seus efeitos sobre o 

biofilme, pois sabe-se que a formação do biofilme tem um papel 

importante na patogenicidade dos fungos (Martinez, Friez, 2010). 

Um dos principais fatores de virulência das espécies de 

Candida é a capacidade de aderir ao substrato e formar biofilme (Silva et 

al., 2012). Em biofilmes, os fungos se tornam menos susceptíveis aos 

agentes antimicrobianos, devido a diferentes fatores como a formação de 

uma matriz extracelular que protege as células de agentes externos, alta 



   60 

densidade celular em biofilmes maduros, cooperação metabólica entre as 

células e regulação da expressão gênica a fim de aumentar a resistência 

aos quimioterápicos (Ramage et al., 2012). Em biofilme, C. albicans pode 

ser até mil vezes mais resistente ao fluconazol que em sua forma livre 

(Uppuluri et al., 2008).  

Desse modo, considerando os resultados do presente 

estudo, o extrato de bétula mostrou ser eficaz contra esses fatores 

presentes no biofilme que conferem proteção às espécies de Candida. 

Estudos mais aprofundados são necessários para elucidar os 

mecanismos de ação utilizados por este extrato para penetrar no biofilme 

já formado e agir contra as células fúngicas.  

São raros os estudos sobre os efeitos de B. pendula em 

espécies de Candida e outros fungos. Em 2007, Välimaa et al. relataram a 

inibição de 49% no crescimento planctônico de C. albicans e de 15% em 

S. cerevisiae na presença do extrato da casca de B. pendula. Encontram-

se mais estudos sobre ação antifúngica de outras espécies de Betula 

(Jones et al., 2000; Omar et al., 2000; Webster et al., 2008). 

Em relação ao efeito antimicrobiano nas bactérias, em         

P. aeruginosa o extrato foi bacteriostático a 12,5 mg/mL e bactericida a 25 

mg/mL. Para outras bactérias, E. coli, S. aureus e S. mutans, não foi 

possível determinar a CIMs e CMMs nas concentrações testadas    

(Tabela 1), porém pode-se observar redução do crescimento bacteriano 

nas diferentes concentrações do extrato (Figura 6). Assim como neste 

estudo, utilizando o método de diluição em caldo, Duric et al. (2013) 

relataram inibição do crescimento de P. aeruginosa a 1,25% do extrato 

metanólico de folhas de bétula e não obtiveram inibição do crescimento 

de E. coli. Porém, neste mesmo estudo eles constataram também a 

inibição do crescimento de S. aureus a 2,5% do extrato.  

Todavia, o extrato glicólico de bétula provocou ação 

antimicrobiana com redução satisfatória em todos biofilmes bacterianos, 

sendo P. aeruginosa a mais sensível ao tratamento, com redução de até 



   61 

99,9% em 5 min e acima de 99,99% em 24 h (Figuras 8A a 8D). De 

acordo com Mesaros et al. (2007), P. aeruginosa apresenta mecanismos 

intrínsecos de resistência aos agentes antimicrobianos como baixa 

permeabilidade de parede celular, bomba de efluxo com especificidade 

para um amplo espectro de substrato e a produção de enzima β-

lactamase AmpC, conferindo-lhe resistência a antibióticos β-lactâmicos, 

como a penicilina. Além disso, segundo Strateva e Yordanov (2009), 

observa-se em P. aeruginosa facilidade de adquirir mecanismos de 

defesa adicionais.  Diante dessas características de P. aeruginosa, o 

extrato de bétula se mostra como uma alternativa ao controle deste micro-

organismo, já que mostrou ser capaz de quase eliminar seu crescimento 

in vitro.  

A evidência da ação do extrato sobre o biofilme maduro 

de E. coli apresentada neste estudo complementa os resultados do 

estudo de Wojnicz et al. (2012), os quais mostraram que o extrato aquoso 

de B. pendula diminuiu a mobilidade de E. coli e reduziu a formação de 

biofilme, porém discorda do estudo de Samoilova et al. (2014) que 

embora descreveu a redução da mobilidade de E. coli por B. pendula, 

relata que o extrato aquoso desta planta favoreceu a formação de biofilme 

de E. coli. 

As bactérias testadas no presente estudo são de 

importância médica e odontológica. Embora, tenham sido utilizadas cepas 

de referência, essas espécies podem apresentar cepas ou sorotipos 

altamente virulentas e/ou resistentes a antibiótico.  Em 2011, E. coli 

O104:H4 causou a morte de 53 pessoas por hemorragia gastrointestinal 

na Alemanha (Radosavljevic et al., 2015). O sorotipo E. coli O157 tem 

sido responsável por diversos casos de infecção alimentar na Europa e 

EUA desde a década de 80 (Pennington, 2014).  

S. aureus, conhecido por ser um micro-organismo 

comensal da nosofaringe e pele do ser humano, pode invadir partes 

internas do corpo e causar doenças como fasciite necrosante, 



   62 

endocardites e pneumonia (Otto, 2010). Além disso, devido ao uso 

indiscriminado de antibióticos, vem aumentando o surgimento de cepas 

de S. aureus resistente à meticilina (MRSA), cuja infecção causa 20% de 

mortalidade (Klevens et al., 2007). A eficiência do extrato de bétula sobre 

estas espécies de bactérias sugere potencial também para o tratamento 

dessas cepas mais danosas à saúde, sendo de interesse avaliar seus 

efeitos sobre tais cepas resistentes, de forma isolada ou em associação 

com antibióticos. 

O efeito antimicrobiano do extrato de bétula sobre biofilme 

de S. mutans também é relevante, visto que este micro-organismo pode 

ser naturalmente encontrado no biofilme dental (Sato et al., 2015), cuja a 

associação com outros fatores favorece a formação de cárie. Em 5 min de 

contato, que é um tempo aproximado da ação do enxaguatório bucal, 

considerando o tempo de bochecho e ação residual, o extrato foi capaz 

de reduzir até 70% do biofilme de S. mutans, o que indica a possibilidade 

deste extrato ser acrescentado em enxaguatórios bucais como composto 

principal ou adjuvante na prevenção e tratamento da cárie.  

Alguns compostos bioativos encontrados em extratos de 

B. pendula podem ser responsáveis por sua ação antimicrobiana, uma 

vez que em estudos prévios demonstraram ter efeito contra alguns micro-

organismos, como o ácido oleanólico que mostrou ter ação contra            

S. aureus e B. subtillis (Duric et al., 2013), a betulina com ação antifúngica 

sobre Fusarium oxysporium (Cota et al., 2003) e o ácido betulínico que 

apresentou ação antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas (Schühly 

et al., 1999). 

Os efeitos antimicrobianos do extrato de bétula 

encontrados neste estudo endossam o uso popular desta planta em 

infecções bacterianas relatado em levantamento etnobotânico realizado 

em Montenegro (Menkovic et al., 2011).  

Outra indicação mais comumente associada a B. pendula 

em estudos etnobotânicos é o tratamento de quadros inflamatórios, como 



   63 

em infecções renais e reumatismos (Havlik et al., 2010; Saric-Kundalic et 

al., 2010), inflamação do trato urinário (Menkovic et al., 2011) e artrose 

(Agelet, Vallès, 2003). Diante dessa propriedade farmacológica atribuída 

à bétula, este estudo avaliou também a capacidade desta planta em 

modular in vitro a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e TNF-α) 

e anti-inflamatória (IL-10) e a produção de óxido nítrico em cultura de 

macrófagos de camundongo (RAW 264.7).  

O processo inflamatório foi induzido pela adição de LPS 

na cultura celular e as concentrações testadas não comprometeram a 

viabilidade celular das células RAW 264.7, o que afirma que as 

ocorrências sejam devido à ação do extrato e não a sua citotoxicidade. 

Em contato por 5 min, houve redução no nível de IL-1β na concentração 

de 12,5 mg/mL. Entretanto, em contato por 24 h houve maior aumento 

desta citocina nos grupos tratados, embora observou-se que o LPS 

estimulou a produção de IL-1β de forma contida em todos os grupos, 

permanecendo em baixo nível.  

Por outro lado, o extrato de bétula promoveu significativa 

inibição da produção de TNF-α em todas as concentrações, alcançando 

91% de redução em 5 min e 87% em 24 h de contato. TNF-α está 

envolvida com a ativação de cascatas de eventos que induz a produção 

de outras citocinas e moléculas moduladoras do processo inflamatório 

(Paul et al., 2006), por isso é considerada uma das principais citocinas 

pró-inflamatórias. 

Outro efeito do extrato de bétula foi a menor quantificação 

de óxido nítrico, de até 80% de redução em relação ao controle (LPS) em 

ambos tempos de contato, o que pode estar também relacionado ao 

menor nível de TNF-α, uma vez que esta citocina tem influência na 

síntese de ON (Paul et al., 2006). O óxido nítrico é um importante 

mediador de diversas ações biológicas como a vasodilatação, 

neurotransmissão e inibição da adesão e agregação de plaquetas (Chan 

et al., 2015). Contudo, a superprodução de óxido nítrico pode acelerar o 



   64 

processo inflamatório ao promover produção de citocinas e mediar 

funções de células no sítio da inflamação (Chen X et al., 2015). 

Quanto à produção de IL-10, em 5 min o extrato manteve 

esta citocina em nível semelhante ao controle (LPS) porém em 24 h sua 

quantificação foi menor. A IL-10 é amplamente denominada como citocina 

anti-inflamatória por estar associada a regulação do processo 

inflamatório, sendo capaz de suprimir alguns mediadores pró-

inflamatórios (Asadullah et al., 2003). 

A atividade anti-inflamatória de B. pendula tem sido 

avaliada por diferentes modos de ação.  Gründemann et al. (2011) 

relataram o efeito anti-inflamatório de B. pendula por meio da inibição do 

crescimento e divisão celular de linfócitos ativados. Tunón et al. (1995) 

demonstraram que o extrato aquoso de bétula inibiu a síntese de 

prostaglandinas e fator ativador de plaquetas (PAF). Wacker et al. (2012) 

evidenciaram que o extrato de bétula causou inibição da proliferação de 

células T in vitro e in vivo, no qual também retardou o aparecimento da 

opacificação da córnea.   

Tem sido comprovado que alguns dos fitocompostos de 

bétula, como taninos, outros polifenóis e polissacarídeos tem capacidade 

modulatória na inflamação (Tunón et al., 1995; Yi et al., 2010; Ligacheva 

et al., 2014; Wacker et al., 2012). O estudo de Yi et al. (2010) mostrou 

que o ácido betulínico proporcionou diminuição significativa dos níveis 

séricos de interleucinas pró-inflamatórias, como IL-2 e IL-6, porém não 

afetou os níveis da citocina anti-inflamatória IL-10, em camundongos. Em 

adição, os autores também comprovaram que este biocomposto 

apresentou a capacidade de inibir in vitro a síntese de TNF-α por 

macrófagos peritoneais murinos estimulados com LPS. 

Ligacheva et al. (2014) mostraram a capacidade 

imunomoduladora de polissacarídeos extraídos de B. pendula por meio de 

sua influência na cascata de sinalização em macrófagos ativados por 

LPS. Estes estudos mostram que B. pendula e seus compostos têm 



   65 

apresentado resultados promissores na modulação do processo 

inflamatório. 

Quanto à citotoxicidade, as concentrações que 

apresentaram atividade anti-inflamatória não comprometeram a 

viabilidade celular. Contudo, alerta-se para as concentrações com 

atividade antimicrobiana, já que em 5 min concentrações acima de 100 

mg/mL apresentaram citotoxicidade nas duas linhagens celulares 

analisadas (fibroblastos gengivais humanos e macrófagos de 

camundongo) e em 24 h somente concentrações abaixo de 6,25 e 1,56 

mg/mL em fibroblastos e macrófagos de camundongo, respectivamente, 

não diferenciaram significativamente a viabilidade celular em relação ao 

controle. Entretanto, estudos in vivo são necessários para analisar a 

capacidade do organismo em repor as células afetadas.  

 Para finalizar, a avaliação da genotoxicidade foi realizada 

pela contagem de micronúcleos. Os micronúcleos são importantes 

biomarcadores de genotoxicidade, porque são fragmentos de material 

genético separados do núcleo, formados durante a telófase da mitose ou 

meiose em consequência de danos cromossomais sofridos pela 

exposição a agentes externos (Araldi et al., 2015).  

Os resultados mostraram que o extrato de bétula não 

alterou a contagem de micronúcleos, mesmo as concentrações que 

previamente demonstraram citotoxicidade (100, 50 e 25 mg/mL) não 

foram capazes de alterar a integridade nuclear em 24 h de contato. Este 

dado é importante visto que a avaliação da genotoxicidade é exigência da 

ANVISA para validação de novos fármacos (Brasil, 2010). 

Sabe-se que em infecções orais entre outras, os micro-

organismos e seus produtos metabólitos estimulam também quadros 

inflamatórios. Como visto no presente estudo, B. pendula tem ação contra 

diversos micro-organismos e também na modulação inflamatória com 

redução de TNF-α e ON.   



   66 

Sendo assim, este estudo permite inferir que B. pendula 

tem potencial de ser utilizada na elaboração de produtos de uso médico-

odontológico para tratamento de doenças infeciosas e inflamatórias. Além 

disso, seus biocompostos poderiam também ser adicionados em 

formulações já existentes no intuito de intensificar as ações anti-

microbiana e anti-inflamatória destes fármacos.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



   67 

7 CONCLUSÃO 

 

 

 

 

O extrato glicólico de B. pendula apresentou importante 

atividade anti-biofilme sobre todas as espécies bacterianas e fúngicas 

avaliadas neste estudo. Mostrou também atividade anti-inflamatória por 

meio da redução de TNF-α e ON. Manteve a viabilidade celular na maioria 

das concentrações em contato por 5 min e em concentrações baixas em 

24 h e não apresentou ação genotóxica.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



   68 

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