RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 29/09/2025. FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA MESTRADO ACADÊMICO ANNA CAROLINA TOLEDO BORGES Estudo da interação in vitro de peptídeos sintetizados a partir da região RBD do SARS-CoV-2 com o receptor ECA-2 ARAQUARA, SP 2023 ANNA CAROLINA TOLEDO BORGES Estudo da interação in vitro de peptídeos sintetizados a partir da região RBD do SARS-CoV-2 com o receptor ECA-2 ARARAQUARA, SP 2023 Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologias Aplicadas à Farmácia, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Área de Concentração: Imunologia Orientador: Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa Borges, Anna Carolina Toledo. B731e Estudo da interação in vitro de peptídeos sintetizados a partir da região RBD do SARS-CoV-2 com o receptor ECA-2 / Anna Carolina Toledo Borges. – Araraquara, 2023. 56 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Área de concentração: Imunologia. Orientador: Paulo Inácio da Costa. 1. Glicoproteína Spike. 2. SARS-CoV-2. 3. Síntese Peptídica. 4. ECA-2. I. Costa, Paulo Inácio da, orient. II. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030078P6 Esta ficha não pode ser modificada UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Estudo da Interação in vitro de peptídeos sintetizados a partir da região RBD do SARS-CoV-2 com o receptor ECA-2 TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTORA: ANNA CAROLINA TOLEDO BORGES ORIENTADOR: PAULO INACIO DA COSTA Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Mestra em Ciências, área de conhecimento: Imunologia pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. PAULO INACIO DA COSTA (Participaçao Virtual) Departamento de Análises Clínicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara da Unesp Prof. Dr. ADILSON CÉSAR ABREU BERNARDI (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde / Universidade de Araraquara - UNIARA Prof. Dr. NORIVAL ALVES SANTOS FILHO (Participaçao Virtual) Departamento de Bioquimica e Quimica Organica / Instituto de Química do Câmpus de Araraquara da Unesp Araraquara, 29 de setembro de 2023 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA-JAÚ, KM 1 - CP 502, 14800903 http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/biociencias-e-biotecnologias-aplicadas-a-farmacia/CNPJ: 48.031.918/0025-00. ESTE TRABALHO FOI FINANCEIRAMENTE APOIADO COM UMA BOLSA DE ESTUDOS DO CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPq) DURANTE 24 MESES ATRAVÉS DO PROCESSO 162054/2021-1 E PELO PROCESSO FUNDUNESP nº 3119/2020. O PRESENTE TRABALHO FOI REALIZADO COM O AOPIO DA COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR – BRASIL (CAPES) – CÓDIGO DE FINANCIAMENTO 001. Dedicatória Este trabalho é dedicado à Anna Beatriz, que nos deixou cedo demais. Também dedico este trabalho a minha família, que me deu as forças para conseguir terminá-lo. Agradecimentos Agradeço à minha família – mãe, pai e a Anna Clara (irmã) – pelo amor, apoio e força para realizar este trabalho. Agradeço à minha irmã Anna Beatriz, que mesmo não estando aqui durante todo o processo, me ajudou muito no começo e sempre me apoiou em todas as minhas decisões. Agradeço à minha outra família – Priscilla (esposa) e Albus (cachorro) – pelo suporte e paciência durante a realização deste trabalho. Agradeço ao professor Paulo Inácio pela oportunidade, orientação e os aprendizados. Agradeço ao pessoal do laboratório – Aline, Anderson, Rualdo, Lorrane, Eloise, Elisandra, Felipe, Nicoly e Rafael – pela companhia e amizade. Agradeço ao Anderson pelas sequências. Agradeço em especial à Aline e à Lorrane por ouvir meus desabafos e por me hospedarem sempre e, pela nossa amizade. Agradeço à UNESP pela infraestrutura e pelo programa. Agradeço à CNPq e à CAPES pelo financiamento. Resumo O SARS-CoV-2 surgiu em 2019 na China e rapidamente se espalhou pelo mundo causando uma pandemia com mais de três anos de duração e com quase 15 milhões de mortes, segundo a estimativa da Organização Mundial da Saúde (OMS, 2022). Responsável por causar a COVID-19, uma nova forma de síndrome respiratória aguda e grave, abalou o mundo economicamente e demograficamente. Graças aos avanços tecnológicos o genoma viral foi rapidamente sequenciado e identificado 4 importantes proteínas estruturais: a glicoproteína de superfície (S) – responsável pela entrada no vírus na célula do hospedeiro; a glicoproteína de membrana (M); a fosfoproteína do nucleocapsídio (N); e, a proteína do envelope (E). A descoberta da região da proteína S capaz de promover a ligação do vírus ao receptor na célula alvo, denominado de RBD (Receptor-Binding Domain), permitiu por meio de estudos in sílico o desenho e síntese de peptídeos para o entendimento da interação vírus-célula. Neste sentido, este trabalho teve como proposta a análise da sequência predita da proteína S correspondente ao RBD para a síntese dois peptídeos denominados E7 selvagem (E7w) e E7 com a mutação L452R (E7mut). A síntese manual foi feita em suporte sólido de rink-amida com grau de substituição de 04-06mesh/g, usando a estratégia Fmoc/tBu. Os peptídeos sintetizados foram caracterizados pela espectrometria de massas e suas qualidades avaliadas por HPLC. O estudo da interação dos peptídeos com a ECA-2 foi realizado em um novo sistema proposto neste trabalho usando sensores eletroquímicos para imobilização da enzima e análise das interações pela inibição da transdução do sinal eletrônico na superfície do eletrodo de trabalho. Como resultado, ambos os peptídeos apresentaram excelentes interações com o receptor ECA-2 nas concentrações de 1 e 10ng. Entretanto, a mutação L452R no peptídeo E7 revelou maior eficiência de interação quando comparada com a forma selvagem. Portanto, conclui-se que o modelo de plataforma proposto para o estudo de binding vírus-receptor é de grande relevância e que a mutação estudada permitiu corroborar no entendimento da eficiência do SARS-CoV-2 (variante P.4 da linhagem B.1.1.28) na infecção das células possuindo o receptor EAC-2 e consequentemente sugerir que as variantes com maior transmissibilidade possam apresentar aspectos semelhantes a esse, avaliado neste trabalho. Palavras-chave: Glicoproteina Spike; SARS-CoV-2; Síntese Peptídica; ECA-2 Abstract SARS-CoV-2 emerged in 2019 in China and quickly spread around the world causing a pandemic that lasted more than three years and killed nearly 15 million people, according to the estimate of the World Health Organization (WHO, 2022). Responsible for causing COVID-19, a new form of severe acute respiratory syndrome, it shook the world economically and demographically. Thanks to technological advances, the viral genome was quickly sequenced and identified 4 important structural proteins: the surface glycoprotein (S) - responsible for the entry of the virus into the host cell; the membrane glycoprotein (M); the nucleocapsid phosphoprotein (N); and the envelope protein (E). The discovery of the region of the S protein capable of promoting the binding of the virus to the receptor on the target cell, called RBD (Receptor-Binding Domain), allowed through in silico studies the design and synthesis of peptides for understanding the virus-cell interaction. In this sense, this work proposed to analyze the predicted sequence of the S protein corresponding to the RBD for the synthesis of two peptides called E7 wild type (E7w) and E7 with the L452R mutation (E7mut). The manual synthesis was done on a solid rink-amide support with a degree of substitution of 04-06mesh/g, using the Fmoc/tBu strategy. The synthesized peptides were characterized by mass spectrometry and their qualities evaluated by HPLC. The study of the interaction of the peptides with ACE-2 was carried out in a new system proposed in this work using electrochemical sensors for enzyme immobilization and analysis of interactions by inhibition of electronic signal transduction on the surface of the working electrode. As a result, both peptides showed excellent interactions with the ACE-2 receptor at concentrations of 1 and 10ng. However, the L452R mutation in peptide E7 revealed greater interaction efficiency when compared to the wild type. Therefore, it is concluded that the platform model proposed for the study of virus-receptor binding is of great relevance and that the mutation studied allowed to corroborate the understanding of the efficiency of SARS-CoV-2 (P.4 variant of the B1.1.28 lineage) in the infection of cells possessing the EAC-2 receptor and consequently suggest that variants with higher transmissibility may present similar aspects to this one, evaluated in this work. Keywords: Spike Glycoprotein; SARS-CoV-2; Peptide Synthesis; ECA-2 Lista de figuras Figura 1: Representação esquemática do SARS-CoV-2...............................página 10 Figura 2: Comparação da organização genômica de dois β-coronavírus: SARS-CoV original e 2019-nCoV (o novo coronavírus)....................................................página 10 Figura 3: Esquema da proteína S do SARS-CoV-2.......................................página 11 Figura 4: Ciclo do SARS-CoV-2.....................................................................página 11 Figura 5: Ligação SARS-CoV-2 à ECA-2…………………………….………...página 13 Figura 6: Estrutura geral dos aminoácidos.....................................................página 14 Figura 7: Esquema de um espectrômetro de massas....................................página 17 Figura 8: Posição do peptídeo E7. a) Na proteína S. b) Na estrutura quaternária da proteína S.......................................................................................................página 24 Figura 9: Exemplos de resultados do teste de ninidrina. a) Sem nitrogênio livre. b) Com nitrogênio livre........................................................................................página 25 Figura 10: Precipitado seco do peptídeo E7 wt..............................................página 25 Figura 11: Precipitado seco do peptídeo E7 mut...........................................página 26 Figura 12: Espectro de massas do peptídeo E7wt.........................................página 26 Figura 13: Espectro de massas do peptídeo E7mut......................................página 27 Figura 14: Cromatograma do peptídeo E7wt.................................................página 28 Figura 15: Cromatograma do peptídeo E7mut...............................................página 29 Figura 16: Esquema da reação no sensor.....................................................página 30 Figura 17: Teste de binding do peptídeo E7wt-ECA-2...................................página 30 Figura 18: Teste de binding do peptídeo E7mut-ECA-2................................página 31 Figura 19: Comparação do binding entre os peptídeos E7wt e E7mut. a) Na concentração de 1 ng. b) Na concentração de 10 ng. c) Na concentração de 50 ng....................................................................................................................página 32 Figura 20: Resultado do teste de viabilidade da enzima................................página 33 Figura 21: Gráfico da atividade da ECA-2......................................................página 34 Figura 22: Gráfico da atividade enzimática na presença dos peptídeos. a) E7wt. b) E7mut.............................................................................................................página 35 Figura 23: Gráfico da atividade da ECA-2 na presença do inibidor...............página 36 Figura 24: Gráfico da comparação da atividade enzimática com a presença dos peptídeos E7wt e W7mut em sua melhor concentração................................página 36 Figura 25: Gráfico da comparação da atividade enzimática com a presença dos peptídeos E7wt e W7mut na mesma concentração.......................................página 37 Figura 26: Gráfico de coluna montado com o ponto final da leitura da atividade da ECA-2.............................................................................................................página 38 Lista de quadros e tabelas Quadro 1: Vacinas contra a COVID-19............................................................página 8 Quadro 2: Sequências sintetizadas................................................................página 23 Quadro 3: Ionização teórica dos peptídeos E7 wt e E7 mut..........................página 27 Lista de símbolos e abreviações µg: Migrograma µL: Microlitro µM: Micromolar a.C.: Antes de Cristo Boc: terc-butiloxicarbonil DIC: N,N'-Diisopropilcarbodiimida DCM: diclorometamo DMF: dimetilformamida DODT: 2,2'-etil enedioxidietanetiol ECA: Enzima Conversora de Angiotensina Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonil HOBT: N-Hidroxibenzotriazol HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Inib: MLN-4760 – Inibidor seletivo de ECA-2 M: Molar MERS: Síndrome Respiratória do Oriente Médio mL: Mililitro mM: Milimolar mRNA: RNA mensageiro MUT: mutante NaCl: Cloreto de Sódio ng: Nanograma OMS: Organização Mundial da Saúde PBS: tampão fosfato salina (sigla em inglês) Pep: Peptídeo RBD: Domínio de Ligação ao Receptor RT-qPCR: Reação da Polimerase em Cadeia da Transcriptase Reversa [S]: Concentração de Substrato SARA: Síndrome de Angústia Respiratória Aguda SNC: sistema nervoso central SPFS: Síntese de Peptídeo em Fase Sólida SRA: Sistema Renina-Angiotensina Subs: Substrato fluorogênico de ECA-2 TFA: ácido trifluoracético TIS: triisopropilsilano UTI: Unidade de Terapia Intensiva WT: wild type - selvagem Sumário 1. Introdução............................................................................................... 4 1.1 Surtos passados....................................................................................... 4 1.2 COVID-19................................................................................................. 7 1.3 SARS-CoV-2............................................................................................ 9 1.4 Enzima Conversora de Angiotensina do tipo 2 (ECA-2).......................... 12 1.5 Interação RBD-ECA-2.............................................................................. 13 1.6 Síntese peptídica...................................................................................... 14 1.7 Análise e caracterização por espectrometria de massas e Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC)............................... 16 1.8 Sensores eletroquímicos.......................................................................... 17 1.9 Atividade enzimática................................................................................. 18 2. Objetivos................................................................................................. 19 2.1 Geral......................................................................................................... 19 2.2 Específicos............................................................................................... 19 3. Material e métodos................................................................................. 19 3.1 Seleção da sequência peptídica............................................................... 19 3.2 Síntese peptídica e clivagem.................................................................... 19 3.3 Análise e caracterização peptídica........................................................... 21 3.3.1 Análise e caracterização peptídica por espectrometria de massas.......... 21 3.3.2 Análise e caracterização peptídica por HPLC.......................................... 21 3.4 Estudo de binding através da análise por voltametria de pulso diferencial................................................................................................. 22 3.5 Teste de viabilidade da ECA-2................................................................. 22 3.6 Teste de atividade enzimática.................................................................. 23 4. Resultados e discussão......................................................................... 23 4.1 Seleção da sequência peptídica .............................................................. 23 4.2 Síntese peptídica...................................................................................... 24 4.3 Análise e caracterização peptídica........................................................... 26 4.3.1 Análise e caracterização por espectrometria de massas......................... 26 4.3.2 Análise e caracterização por HPLC.......................................................... 28 4.4 Estudo de binding através da análise por voltametria de pulso diferencial................................................................................................. 30 4.4.1 Comparação entre o binding dos peptídeos............................................. 32 4.5 Teste de viabilidade da ECA-2................................................................. 33 4.6 Teste de atividade enzimática.................................................................. 34 4.7 Teste da atividade enzimática com os peptídeos E7wt e E7mut............. 34 4.8 Comparação entre os peptídeos na alteração da atividade da ECA-2..... 36 5. Conclusões............................................................................................. 38 6. Perspectivas........................................................................................... 39 7. Benefícios à sociedade.......................................................................... 39 REFERÊNCIAS........................................................................................ 39 4 1. Introdução 1.1 Surtos passados: Pandemias são comuns durante a história, sendo, algumas vezes, atribuídas a pragas bíblicas. (PIRET; BOIVIN, 2021) O estreitamento dos laços entre animais e humanos é o responsável pelas primeiras pandemias. As atividades humanas criaram a situação ideal para o surgimento de patógenos capazes de infectar humanos. (MORENS et al., 2020) Atualmente, grandes surtos têm ocorrido em períodos cada vez mais curtos, por exemplo, SARS-COV (2002), H1N1 (2009), Zika e Chikungunya (2014) e Ebola (1976-2020). Tal situação pode ser associada à expansão da população, ocupação de novas terras, deslocamento da fauna, mudanças climáticas e desastres naturais. (PIRET; BOIVIN, 2021) A Peste de Atenas (430 a. C) é o primeiro surto com registro, cuja causa ainda é desconhecida, apesar de inúmeras as investigações. (MORENS et al., 2020) A Peste é uma das doenças mais antigas que ainda assola a humanidade, com 200 milhões de mortes estimadas. Seu agente etiológico é a Yersinia pestis, uma bactéria Gram negativa, imóvel e sem esporos, e roedores, seu agente de transmissão. (ZIETZ; DUNKELBERG, 2004; GLATTER; FINKELMAN, 2021) Tem-se três tipos de manifestações da doença: a forma bubônica, a forma septicêmica e a forma pneumônica. A forma bubônica tem como sintomas dor de cabeça e no corpo, febre, calafrios e inchaço nos linfonodos e é causada por mordida de pulgas. A forma septicêmica é a progressão da infecção para o sangue e linfonodos, já a forma pneumônica é a infecção nos pulmões. As formas septicêmica e pneumônica podem tanto ser as manifestações primárias da infecção como uma evolução da forma bubônica. Foram várias ocorrências ao longo da história, mas três se destacam: a Peste Justiniana (541), a Peste Negra (1347-1351) e a Peste de Hong Kong (1885-hoje). (PIRET; BOIVIN, 2021) A Peste Justiniana sendo a primeira confirmada, ocorreu na África, Europa, e regiões da Ásia. Foi devastadora, estimando-se perda de metade da população em aproximadamente 20 anos de ondas, sendo um componente na queda do Império Bizantino. (ZIETZ; DUNKELBERG, 2004) A Peste Negra matou 25 5 milhões de pessoas no século XIV na Europa e é a mais famosa e bem documentada; foi espalhada por roedores por toda a Europa. (GLATTER; FINKELMAN, 2021) Além de ter causados muitos óbitos, afetou a economia e intensificou problemas sociais e a geopolítica da Europa. (ZIETZ; DUNKELBERG, 2004) A Peste de Hong Kong originou-se na região de Yunan, na China, e espalhou-se, através de navios mercantes, para Cantão, Taiwan e Hong Kong. (PIRET; BOIVIN, 2021; GLATTER; FINKELMAN, 2021) O Japão, Índia, América do Sul, África do Sul, Austrália e a porção oeste da América do Norte também foram atingidas. Tendo, somente na Índia, cerca de 12 milhões de mortes. Seu agente etiológico foi descoberto nesta época por Alexandre Yersin. (ZIETZ; DUNKELBERG, 2004) Hoje, a peste ainda causa epidemias e é endêmica em algumas partes do mundo. Em 2017, por exemplo, a doença reemergiu em Madagascar com índice de fatalidade de quase 9%. (PIRET; BOIVIN, 2021) A Influenza é outra doença com múltiplas ocorrências registradas durante a história. É provocada por vírus da família Orthomyviridae, um vírus de RNA de fita simples. A infecção deste vírus nos seres humanos está associada à domesticação dos animais. A doença afeta todas as faixas etárias, com uma mortalidade em torno de 1%. (CUNHA, 2004; POTTER, 2008) Em geral, o tempo de incubação é de 1 a 5 dias e os sintomas são: febre de início súbito, dor muscular e fadiga. No inverno, há mais casos, assim como em locais de aglomeração de pessoas ou com alta taxa de umidade. Acredita-se que o primeiro relato de influenza foi em 412 a.C. por Hipócrates, mas o consenso é que a primeira foi em 1580. (CUNHA, 2004; POTTER, 2008) De todos os surtos de influenza que marcaram a história, a gripe espanhola foi de um grande impacto na sociedade. A gripe espanhola é uma das mais destrutivas, com cerca de 40 a 50 milhões de mortes. Apesar de ter sido nomeada como gripe espanhola, sua origem não foi na Espanha, mas pelo fato de por tido acometido a região mais intensamente. Não há consenso, mas os primeiros surtos foram na América do Norte. A infecção chegou na Europa através dos militares na França e, em seguida, espalhou-se posteriormente pela Itália, Espanha, Alemanha, Grã-Bretanha, Rússia, África e China. De início teve 6 a letalidade esperada, mas após alguns ciclos tornou-se mais virulenta e aumentou sua letalidade em 10 vezes. Estima-se que, durante o pico, 50% da população mundial foi infectada e chegou-se a uma taxa de letalidade de 25%. (POTTER, 2008) Porém, a mortalidade era maior entre pessoas mais vulneráveis do que entre as populações saudáveis, como os idosos. (CUNHA, 2004) A principal causa de morte era pneumonia. Além disso, não se deve esquecer que ocorreu durante a Primeira Guerra Mundial, aumentado o impacto na sociedade, já que a má nutrição e fome foram responsáveis por mortes. A pandemia da ‘Gripe Suína’, em 2009, foi o primeiro surto de influenza no século XXI. Foi semelhante à gripe espanhola e sua mortalidade foi de 2 a 9%, em adultos jovens, com mais de 18.000 mortes no mundo. O vírus surgiu no México e em julho de 2009 já casos em mais de 168 países. (KHANDAKER et al., 2011; PATEL et al., 2010; CHENG et al., 2012) Tendo como sintomas febre, tosse, falta de ar, fadiga, coriza, dor de garganta e mialgia. (PATEL et al., 2010) Em casos mais graves, desenvolve-se a pneumonia viral com Síndrome de Angústia Respiratória Aguda (SARA), que requer cuidado intensivo e auxílio respiratório. O vírus testou a capacidade de contenção das agências de vigilância, como o Centro de Controle de Doenças e a Organização Mundial da Saúde e dos governos e sociedade, bem como desenvolvimento de vacinas. Seu surto teve fim em 2010 de acordo com a OMS. (CHENG et al., 2012) Outros vírus que são monitorados pelos órgãos de vigilância são os da família Coronaviridae, particularmente, SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2. (HARAPAN et al., 2020) O SARS-CoV, causador da Síndrome Respiratória Aguda Grave, foi responsável pela primeira epidemia viral do século XXI, que aconteceu em 2002 e reemergiu em 2004. Faz parte do rol de doenças que quebrou a barreira animal-humano, com a civeta como seu intermediário e o morcego seu transmissor. Sua transmissão é através de aerossóis e oral-fecal, uma vez que também afeta o sistema digestório. Essa epidemia matou 774 pessoas. (SOUZA et al., 2021) O vírus usa a ECA-2 como receptor para entrar no organismo, uma proteína encontrada no trato respiratório, como os alvéolos pulmonares. Também pode 7 ser encontrado no esôfago, íleo, rins, células do miocárdio e bexiga. (KRISHNAN et al., 2021) O tempo de incubação foi de 2 a 11 dias e os principais sintomas são: febre alta, dores de cabeça, tosse seca, falta de ar, diarreia e diminuição nos linfócitos. A progressão à forma grave da doença se dá com febres altas e agravamento da capacidade respiratória. A doença reemergiu em 2004 e foi controlada antes mesmo do desenvolvimento da vacina. (SOUZA et al., 2021) O MERS-CoV é o agente causador da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS), que também tem os morcegos como hospedeiros e os camelos como intermediários. (SOUZA et al., 2021) Teve uma taxa de mortalidade alta em 2014, além de contaminar mais de 2400 pessoas e causar 858 óbitos na Europa, África e América. Apesar de ter mais dados epidemiológicos em 2014, há evidências de que em 2012 tenha acontecido o primeiro surto. (RAMADAN & SHAIB, 2019; SOUZA et al., 2021) Ao contrário do SARS-CoV, o MERS-CoV usa a proteína externa DPP4 (Dipeptidil peptidase-4), com ancoramento feito pela proteína viral Spike e posterior inserção do genoma viral. Os sintomas comuns são tosse e febre, mas pode surgir pneumonia que pode levar à insuficiência respiratória e à óbito. Neste episódio, a maioria dos casos foram leves e devido à alta mortalidade, o vírus não se espalhou muito. (SOUZA et al., 2021; HU, HUANG & YING, 2020) Como o vírus ainda é circulante, são necessárias outras estratégias para conter o avanço da doença, como vigilância em camelos e dromedários. (PIRET; BOIVIN, 2021) Com a globalização e aumento dos deslocamentos de animais e pessoas, facilitou bastante a propagação de patógenos, logo era somente uma questão de tempo até o surgimento de um patógeno capaz de causar uma pandemia. (PIRET; BOIVIN, 2021) Assim, em 2019, o novo Coronavírus surgiu; sendo nomeado como SARS-CoV-2, devido a sua semelhança com o SARS-CoV (GORBALENYA et al., 2020). O SARS-CoV-2 foi o causador da maior pandemia do século XXI. (SOUZA et al., 2021) 1.2 COVID-19: No final de 2019, na China, uma nova síndrome respiratória viral aguda surgiu, a COVID-19. Causada pelo vírus SARS-CoV-2, pertencente à família Coronaviridae. (CUI; LI; SHI, 2018) Geralmente, a infecção com sintomas leves, 8 incluindo tosse, dor muscular e anosmia; em alguns casos pode evoluir para quadros clínicos mais graves, como febre alta, pneumonia e estresse respiratório, podendo ser fatal. Porém, a maioria dos pacientes apresenta pouco ou nenhum sintoma, favorecendo a transmissão e dificultando a contenção da doença (AMORIM FILHO et al., 2020; SUN et al., 2020). Mais de 14% dos pacientes precisam de hospitalização por insuficiência respiratória e de 3 a 5% destes pacientes vão ser para UTI. (PIRET; BOIVIN, 2021) Apesar de o principal órgão afetado ser o pulmão, sabe-se hoje que a COVID-19 pode causar danos, as vezes irreversíveis, no músculo cardíaco, no SNC e em outros tecidos. (GUPTA et al., 2020) O registro dos primeiros casos de COVID-19 foi em dezembro de 2019 e em janeiro de 2020, cerca de vinte países já haviam registrado seus primeiros casos. Devido à dificuldade de contenção de vírus respiratórios e como o SARS-CoV-2 já havia razoavelmente se espalhado pelo mundo, em março de 2020 a OMS determinou a pandemia do novo coronavírus (WHO, 2020). O Brasil registrou seu primeiro caso em fevereiro de 2020 e atualmente, março de 2023, tem-se quase 700 mil óbitos e mais de 37 milhões de casos (BRASIL, 2023a). O diagnóstico da infecção é feito por exames de detecção do vírus, como o RT-qPCR ou o teste rápido de detecção do antígeno e por testes sorológicos, que fazem a dosagem de anticorpos no sangue, como os testes rápidos para a detecção de IgM ou IgG. (FIOCRUZ, 2020) A coleta para realização do teste deve ser feita no terceiro ou quarto dia após o surgimento dos sintomas, podendo ser feita até o décimo dia. O material é coletado com o uso de um swab nasal ou nasofaríngeo ou sangue. (BRASIL, 2023b) No Brasil, foram quatro ondas vividas desde o começo da pandemia, mas graças às vacinas, que surgiram em tempo recorde, elas ficaram cada vez mais curtas e o número de casos em cada onda também diminui. Segue quadro com as principais vacinas. Quadro 1: Vacinas contra a COVID-19. Fabricante Tecnologia Plataforma Sinovac / Instituto Butantan Vírus inativado Vírus inteiro e inativado adsorvido em adjuvante 9 Oxford / AstraZeneca Vetor viral não replicante Adenovírus de chimpanzé com a proteína S na superfície Janssen Pharmaceutical Vetor viral não replicante Adenovírus do sorotipo 26 com a proteína S na superfície Pfizer / BioNTech mRNA mRNA modificado que codifica a glicoproteína S FONTE: adaptado de CHUNG; THONE & KWON, 2021; CDC, 2023a. Apesar de anos terem se passado, vacinas terem sido criadas e fármacos terem sido aprovados, ainda há casos novos de COVID-19. (BRASIL, 2023c) Além disso, a pandemia apenas evidenciou a dependência por parte do Brasil de outros países na questão da produção de insumos farmacêuticos. (PASSARINHO, 2021; VALÉCIO, 2021) Logo, é imprescindível a pesquisa de tecnologias nacionais e de fácil obtenção para a contenção deste e de futuros vírus. 1.3 SARS-CoV-2: O SARS-CoV-2 pertence à ordem Nidovirales, família Coronaviridae, subfamília Coronavirinae e gênero Betacoronavirus (βCoVs) (CUI, LI; SHI, 2018). É vírus envelopado de RNA fita simples positiva (+ssRNA) organizado em duas grandes regiões, a extremidade 5’-replicase e a extremidade 3’-estrutural (ZHU et al., 2020; CHAN et al., 2020). Os coronavírus são de origem zoonótica e amplamente distribuídos através do mundo e, além disso, possuem uma diversidade genética muito grande devido à alta recombinação de RNA; todos estes fatores, tornam o surgimento de novos coronavírus, capazes de infectar o ser humano, algo provável, podendo ou não causar surtos epidemiológicos (CUI; LI; SHI, 2019; ZHU et al., 2020). Na extremidade 5’ encontram-se as ORFs 1a e 1b, que codificam cerca de 16 proteínas não-estruturais envolvidas na replicação do vírus. Já na extremidade 3’, encontra-se cerca de 9 fatores acessórios e as 4 proteínas estruturais: a fosfoproteína do nucleocapsídio (N) a glicoproteína de superfície 10 (ou spike, S), a glicoproteína de membrana (M), e a proteína do envelope (E) (CHAN et al., 2020). Figura 1: Representação esquemática do SARS-CoV-2. FONTE: adaptado de JAMISON et al., 2022. A proteína S é uma glicoproteína composta por duas subunidades (S1 e S2), sendo a responsável pela entrada do vírus na célula hospedeira; é uma proteína transmembrana de fusão de classe I. (WRAPP et al., 2020; CHENG et al., 2020) A proteína S é encontrada no envelope viral composta por três protômeros idênticos associados uns aos outros, com 1273 aminoácidos de extensão cada. Eles formam as duas subunidades da Spike. A subunidade S1 é responsável por ligar o vírus com a superfície da célula alvo, utilizando como receptor a enzima conversora da angiotensina tipo 2 (ECA-2) e contém o domínio de ligação ao receptor (RBD); já a subunidade S2 é altamente conservada e faz a fusão do envelope viral com a membrana celular (AKRAM; MANNAN, 2020). Como representado na figura 2, o SARS-CoV-2 recebeu este nome devido à sua semelhança com o SARS-CoV. (GORBALENYA et al., 2020) Figura 2: Comparação da organização genômica de dois β-coronavírus: SARS- CoV original e 2019-nCoV (o novo coronavírus). 11 Fonte: Adaptado de CHAN et al., 2020. Cada subunidade possui uma função específica, como citada anteriormente. Porém, no SARS-CoV-2 a clivagem por furina se dá previamente à liberação do vírion maduro, conferindo uma vantagem evolutiva ao SARS-CoV-2 em relação ao seu parente, o SARS-CoV. Isto o torna mais transmissível. (ANDERSEN et al., 2020) Figura 3: Esquema da proteína S do SARS-CoV-2. FONTE: adaptado de WRAPP et al., 2020. Como anteriormente mencionado, a proteína Spike é a responsável pelo reconhecimento do receptor ECA-2 e pela ligação do vírus na superfície da célula que está prestes a ser infectada (LAN et al., 2020). Na figura 4, segue uma representação do ciclo de infecção do SARS-CoV-2, por ela é possível observar que uma vez que há o reconhecimento da ECA-2 pelo vírus, este utiliza a maquinaria da célula para formar novos vírus. Este fato fez com que esta proteína fosse muito estudada para a criação de vacinas e fármacos anti-SARS- CoV-2. (CHUNG; THONE; KWON, 2021; ZOST et al., 2020) Figura 4: Ciclo do SARS-CoV-2. 12 FONTE: FENG et al., 2020 A alta variabilidade genética, obtida pelas mutações, é comum para vírus patogênicos, logo, há o surgimento das chamadas variantes. Uma variante apresenta uma ou mais mudanças no genoma que a diferencia do vírus antes circulante (CDC, 2023b). Sabe-se que o SARS-CoV-2 apresentou um grande número de variantes. A patogenia e o comportamento imunológico destas variantes precisam ser estudado e analisado. Normalmente, as mutações geradas no material genético viral são deletérias ou neutras, contudo, uma pequena fração dessas mutações são capazes de alterar a infectividade, a interação vírus-hospedeiro, a gravidade da doença, as propriedades do vírus, a fuga do sistema imunológico e, consequentemente, a imunidade produzida pelas vacinas (HARVEY et al., 2021). As variantes que apresentam mutações no domínio RBD conseguem escapar totalmente ou parcialmente da neutralização mediada por anticorpos direcionados contra este domínio (GRAHAM et al., 2021). Por isso, a importância de estudar os efeitos destas mutações. 1.4 Enzima Conversora de Angiotensina do tipo 2 (ECA-2): O sistema renina-angiontesina (SRA) é um dos maiores mecanismos para o controle da pressão sanguínea, dentro deste sistema temos a enzima conversora de angiotensina 1 (ECA-1) como um dos principais componentes. A ECA-1 faz a clivagem da angiotensina 1 em angiotensina 2, promovendo a 13 vasoconstrição; além de reduzir os níveis de bradicinina. Ela é uma enzima dependente de zinco e está situada na superfície das células endoteliais. (BERNE; LEVY, 2010; HUANG, L et al., 2003) Outro componente deste sistema é a enzima conversora de angiotensina 2 (ECA-2; estruturalmente semelhante à ECA-1, também depende do zinco e possui uma semelhança com o domínio ativo da ECA-1 de 42%. A enzima conversora da angiotensina tipo 2 (ECA-2) é uma molécula expressa na superfície das células do endotélio, dos rins, dos pulmões e de outros órgãos em abundância. (HUANG et al., 2003; COLOMBO et al., 2020) Embora estruturalmente similares, funcionalmente são diferentes. Primeiramente a ECA-2 é uma caboxypeptidase e a ECA-1 é uma dipeptidase. Além disso, a ECA faz a conversão da angiotensina 1 em angiotensina 2, provocando efeitos deletérios devido à estimulação dos receptores AT1, com aumento da atividade simpática, reabsorção de sal e água, vasoconstrição, inflamação, liberação de aldosterona e vasopressina, o que contribui para fibrose tecidual, disfunção do endotélio e hipertensão arterial. (HUANG et al., 2003; COLOMBO et al., 2020) A ECA-2 faz remoção do C-terminal da angitensina 1, formando angiotensina (1 a 9) e outras diferenças são os substratos específicos e os inibidores específicos. A ECA-2 também faz a quebra da angiotensina 2 em angiotensina (1 a 7), o que ativa receptores que são potentes vasodilatadores, ou seja, podendo ser um regulador negativo do SRA. (HUANG et al., 2003; COLOMBO et al., 2020) A expressão de ECA-2 ocorre em vários tecidos, entre eles as vias respiratórias superiores e inferiores, o miocárdio e a mucosa gastrointestinal. Mesmo com sua função na saúde e na doença humana não totalmente elucidada, ela aparentemente apresenta um papel importante na regulação da pressão sanguínea e na função cardíaca. Porém, seu papel nas vias respiratórias ainda não foi descoberto; entretanto, foi demonstrado em camundongos que ela age na proteção de lesões pulmonares graves associadas a aspiração e sepse. (COLOMBO et al., 2020) 1.5 Interação RBD-ECA-2: 14 A ligação entre o RBD do SARS-CoV-2 e a ECA-2 é a etapa inicial para a entrada do vírus na célula, que é feita através da glicoproteína S. A ECA-2 liga- se simultaneamente nos dois trímeros da proteína S, clivando a subunidade S2 com proteases do hospedeiro; assim, ocorre a formação do peptídeo de fusão, o que, através de mudanças conformacionais, leva à fusão do vírus na membrana. Na figura 5 é possível observar a ligação entre o vírus e seu receptor. (LAN et al, 2020; YANG et al., 2020) Figura 5: Ligação SARS-CoV-2 à ECA-2. FONTE: Yang et al., 2020 A fusão permite que o vírus entre na célula devido à ativação de uma cascata de eventos. Após a entrada na célula hospedeira, a replicase do RNA viral entra em ação, formando mRNAs. Eles resultam na rápida replicação do RNA viral e das outras proteínas estruturais. (LAN et al, 2020; MUKHERJEE; CHOUDHURY, 2020). O RBD forma um bolsão amplo que consegue acomodar a região de reconhecimento da ECA-2 humana. A proteína S do SARS-CoV-2 também utiliza outras moléculas na superfície da célula para facilitar a ligação de alta afinidade com a ECA-2. A ligação entre o vírus e a ECA-2 se dá através de interações eletrostáticas e forças de Van der Waals. (ZHOU et al., 2020; AMIN; SOROUR; KASRY, 2020; HAO et al., 2021) 1.6 Síntese peptídica: 15 Proteínas fazem o controle de quase todos os processos na célula e elas possuem uma gama enorme de funções, como compor as estruturas das células até fazer a aceleração de reações. Elas são formadas pelos aminoácidos, através de uma ligação covalente – a ligação peptídica – entre cada resíduo de aminoácido. São 20 aminoácidos comuns. (NELSON; COX, 2019) Os aminoácidos são compostos de um carbono central ao qual está ligado um hidrogênio, um grupo carboxila, grupo amino e uma cadeia lateral (R), responsável por diferenciar cada aminoácido (NELSON; COX, 2019). Segue imagem (figura 6) ilustrando a estrutura de um aminoácido. Figura 6: Estrutura geral dos aminoácidos. FONTE: NELSON; COX, 2019. A junção de dois ou mais aminoácidos dá um peptídeo ou uma proteína – quando são muitos aminoácidos agrupados. A extremidade do peptídeo em que o resíduo de aminoácido com o grupamento amino livre é chamado de N-terminal e a extremidade com o grupamento carboxila livre é a C-terminal. (NELSON; COX, 2019) O que diferencia as proteínas em suas diferentes funções é a sua estrutura, na qual a sequência dos aminoácidos possui uma grande importância. A sequência dos aminoácidos é determinada pelo código genético de todos os seres, desde os vírus até o ser humano. (NELSON; COX, 2019) O código genético é transcrito em mRNA, que por sua vez é traduzido para a formação das proteínas. É durante o processo de tradução que a interação (pareamento) entre os códons e anticódons resulta na sequência que a proteína irá possuir. Os ribossomos são os responsáveis pelo pareamento, sendo chamados de mini fábricas. (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014). 16 A síntese química de peptídeos já é antiga, já que por volta de 1900 Emil Fischer produziu pequenos peptídeos compostos por glicina. Esta técnica foi melhorada por Merrifield em 1963 com a síntese de peptídeo em fase sólida (SPFS). Trazendo como vantagens: a reação é feita em um único recipiente; o excesso de reagentes e aminoácidos usados para que a reação seja completa pode ser facilmente removido através de filtração, o que elimina a necessidade de purificações entre cada etapa e o processo pode ser automatizado, pois são etapas repetitivas e como desvantagem: a impossibilidade de se remover produtos intermediários durante a reação. (TRIER; HANSEN; HOUEN, 2019; NIELSEN; MARCATILI, 2015) Na síntese de peptídeos em fase sólida, o crescimento do peptídeo é da porção C-terminal para N-terminal e uma resina é utilizada como suporte sólido, sendo nela feito o acoplamento do primeiro aminoácido. Quando a síntese termina, o peptídeo é clivado da resina com o uso de um ácido. Antes desta técnica, havia a necessidade da realização de uma etapa de purificação após cada etapa da síntese. (TRIER; HANSEN; HOUEN, 2019; NIELSEN; MARCATILI, 2015) Há duas estratégias que podem ser utilizadas na SPFS, a Fmoc e Boc. Na Fmoc, o grupamento N-terminal dos aminoácidos estão protegidos pelo grupo 9- fluorenilmetiloxicarbonil e a cadeia lateral pelo grupo terc-butilo; a desproteção é feita utilizando uma base e a clivagem, um ácido. Já na estratégia Boc, o grupamento N-terminal está protegido pelo grupo terc-butiloxicarbonil e a cadeia lateral por grupos à base de benzilo; a desproteção e a clivagem são feitas utilizando um ácido. (TRIER; HANSEN; HOUEN, 2019; NIELSEN; MARCATILI, 2015) A estratégia Fmoc é a mais utilizada quando se trata da síntese de peptídeos em fase sólida devido ao reagente empregado na etapa de clivagem, o ácido trifluoracético; enquanto na estratégia Boc, é utilizado o ácido fluorídrico anidro líquido, altamente tóxico e corrosivo. (SIGMAALDRICH, 2023) Atualmente, há um interesse crescente na síntese de peptídeos devido a gama de aplicabilidade que eles possuem, como o uso de peptídeos anticorpos 17 no diagnóstico de doenças, no desenvolvimento de vacinas e no tratamento de doenças – no caso da insulina sintética. (TRIER; HOUEN, 2017; Kent, 1988) 1.7 Análise e caracterização por espectrometria de massas e Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC): Utilizando a proporção de massa em relação à carga (m/z), a espectrometria de massa consegue identificar compostos numa amostra. Identificando um composto através de seu peso molecular e sua abundância isotópica. Um espectrômetro de massa faz a ionização da amostra em íons gasosos e, em seguida, faz a identificação dos íons através de suas proporções de massa em relação à carga e abundâncias relativas. (MERCK, 2023) A espectrometria de massa oferece uma série de benefícios, como seletividade, sensibilidade e análise de várias amostras, sendo assim, um método de detecção bem estabelecido. (MERCK, 2023) O espetrômetro de massas é composto de cinco componentes básicos: o injetor de amostra – faz a injeção da amostra no componente de baixa pressão; depois do injetor fica a fonte de ionização – transforma a amostra em um gás ionizado, que será acelerado por campo magnético; em seguida, o espectrômetro separa os íons com base na razão massa/carga. O detector faz a detecção dos íons e um computador, gera o gráfico – espectro de massas – onde os íons detectados são apresentados em função de sua razão massa/carga. Segue uma imagem (figura 6) esquemática de um espectrômetro de massas. (PAVIA et al., 2009) Figura 7: Esquema de um espectrômetro de massas. 18 Fonte: PAVIA et al., 2009. A técnica de HPLC consiste na separação dos componentes de uma amostra através de sua aplicação em colunas com um fluxo de solventes em alta pressão; podendo ser utilizada tanto para a análise da composição da amostra, como para sua purificação. Os aparelhos empregados nesta técnica são os cromatógrafos líquidos. As colunas constituem a fase estacionária, podendo ser apolares – também chamadas de fase reversa ou polares – também chamadas de fase normal. Os solventes constituem a fase móvel, sendo os responsáveis pela separação através de sua afinidade pela mesma. Eles precisam solubilizar somente a amostra e não a fase estacionária. Há dois tipos de eluição: isocrática – a composição da fase móvel é não se altera durante toda a corrida – e a gradiente – a composição da fase móvel varia durante a corrida. Juntamente com os cromatógrafos, um computador faz a emissão do cromatograma – gráfico que nos permite identificar e separar os componentes da amostra. (UFJF, 2022) 1.8 Sensores eletroquímicos: Os sensores fazem a conversão de um sinal biológico ou químico em um sinal eletrônico, relacionado à concentração do analito. (LI et al., 2021) Para gerar um sinal analítico, utilizam uma reação específica, como variação de corrente, impedância ou potencial mensurável. (RICCARD et al., 2002; SOARES, 2011). São três as partes essenciais: o bioreceptor – molécula específica que se liga ao analito, o transdutor – sendo o sinal em si – e o sistema de processamento de sinal – responsável por gerar o gráfico de resposta. (ABID et al., 2021) O sinal pode ser mudanças de corrente ou voltagem, luz, pH e temperatura e é convertido em sinal eletrônico. (METKAR & GIRIGOSWAMI, 2019) São vários os tipos de biossensores: os ópticos, que são baseados em fenômenos ópticos como espalhamento de luz e interferometria; os transdutores mecânicos, que detectam mudanças de propriedades mecânicas, força ou movimento. Além dos biossensores elétricos, que dependendo do tipo de análise utilizada, fazem a medição de mudanças de voltagem, potência e corrente elétrica. O reconhecimento da interação entre o biomarcador e o analito é vista 19 na mudança de carga que ocorre com a ligação do marcador e do analito e na formação de uma dupla camada elétrica. (SIN et al., 2014; LI et al., 2021) Devido à facilidade na utilização dos biossensores, faz com que ele seja de um crescente interesse. Além do baixo custo e das respostas específicas e de alta sensibilidade. (GASPAROTTO et al., 2017) 1.9 Atividade enzimática: Determinar a velocidade da reação é a abordagem mais antiga e uma das mais importantes para entender o mecanismo das enzimas; além disso, verificar a cinética enzimática – modificação da enzima em resposta a mudanças nos parâmetros experimentais. A concentração de substrato [S] é um fator-chave que afeta a velocidade das reações catalisadas por enzimas. Porém, estudar os efeitos da concentração do substrato é difícil, pois o substrato é convertido em produto durante a reação. (NELSON; COX, 2019). Em primeiro lugar, a enzima combina-se reversivelmente com o substrato, o que forma um complexo enzima-substrato (ES) em uma etapa reversível e relativamente rápida: E + S ⇌ ES Em seguida, o complexo ES é rompido lentamente em uma segunda etapa, gerando a enzima livre e o produto P: ES ⇌ E + P A segunda reação sendo mais lenta, limita a velocidade da reação total. Numa reação catalisada por enzima, num determinado momento, a enzima está presente de duas maneiras, na forma livre ou não combinada (E) na forma combinada (ES). A velocidade é proporcional à concentração de substrato, pois em baixa concentração, a maior parte da enzima está na forma livre e o equilíbrio é deslocado na direção da formação de mais enzima combinada com o aumento da concentração. (NELSON; COX, 2019) 20 4. Conclusões • Os peptídeos foram escolhidos com sucesso; • Os peptídeos foram sintetizados e caracterizados com sucesso; • Os peptídeos E7wt e E7mut se ligaram com sucesso à ECA-2; • A concentração de 10 ng do peptídeo E7wt apresentou a melhor ligação com a ECA-2; • A concentração de 1 ng do peptídeo E7mut apresentou a melhor ligação com ECA-2; • O peptídeo E7mut apresentou maior afinidade pela ECA-2 do que o peptídeo E7wt; • A ligação dos peptídeos com a ECA-2 aumentou a atividade enzimática; • A concentração de 25 µM do peptídeo E7wt apresentou o maior aumento da atividade da ECA-2; • A concentração de 50 µM do peptídeo E7mut apresentou o maior aumento da atividade da ECA-2; • O peptídeo E7mut aumentou mais a atividade da ECA-2 do que o peptídeo E7wt. 5. Perspectivas futuras Continuar os estudos com estes peptídeos e possíveis derivados deles para sua possível utilização em doenças relacionadas ao mau funcionamento da ECA-2. 6. Benefícios à sociedade Tendo em vista a calamidade gerada por doenças causadas por patógenos virulentos, como a COVID-19, a necessidade de estudar a interação entre patógeno-hospedeiro é vital para a contenção da doença e novos tratamentos. Logo, a proposta deste trabalho foi um novo método para o estudo da ligação de vírus com o seu receptor no hospedeiro, um método simples e de fácil reprodução. Além disso, o uso de uma tecnologia simplificada pode ser uma vantagem adicional, uma vez que não seríamos tão dependentes de outros países. Pois, como visto durante o auge da pandemia, a falta de insumos foi um problema a mais. (HOMMA et al., 2022; VALÉCIO, 2023) Portanto, o 21 desenvolvimento de uma tecnologia rápida, barata e específica é a aposta para o futuro. (COSTA, 2019) REFERÊNCIAS ABID, S. A.; SUHAIL, A.; AL-KADMY, I. M. S.; et al. Biosensors as a future diagnostic approach for COVID-19. Life Sciences, p. 119117, 2021. AGUILAR, M. I. 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