GABRIEL RAMALHO FERREIRA AVALIAÇÃO DO REPARO ÓSSEO NA INTERFACE OSSO/IMPLANTE EM RATAS COM OSTEOPOROSE INDUZIDA TRATADAS COM RALOXIFENO OU ALENDRONATO – ANÁLISE HISTOMÉTRICA, IMUNOISTOQUÍMICA, POR EPIFLUORESCÊNCIA E BIOMECÂNICA Araçatuba – São Paulo 2014 GABRIEL RAMALHO FERREIRA AVALIAÇÃO DO REPARO ÓSSEO NA INTERFACE OSSO/IMPLANTE EM RATAS COM OSTEOPOROSE INDUZIDA TRATADAS COM RALOXIFENO OU ALENDRONATO – ANÁLISE HISTOMÉTRICA, IMUNOISTOQUÍMICA, POR EPIFLUORESCÊNCIA E BIOMECÂNICA Tese apresentada à Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- UNESP, para obtenção do Título de DOUTOR EM ODONTOLOGIA (Área de concentração em Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial). Orientador: Profa Ass. Dra Roberta Okamoto Coorientador: Prof. Adj. Roelf Justino Cruz Rizzolo Araçatuba – São Paulo 2014 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da FOA / UNESP Ramalho-Ferreira Gabriel. R165a Avaliação do reparo ósseo na interface osso/implante em ratas com osteoporose induzida tratadas com raloxifeno ou alendronato : análise histométrica, imunoistoquímica, por epifluorescência e biomecânica / Gabriel Ramalho-Ferreira. - Araçatuba, 2014 122 f. : il. ; tab. + 1 CD-ROM Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientadora: Profa. Roberta Okamoto Coorientador: Prof. Roelf Justino Cruz Rizzolo 1. Alendronato 2. Raloxifeno 3. Osteoporose I. T. Black D7 CDD 617.64 DEDICATÓRIA Dedicatória A Deus, que na pessoa de seu Filho Jesus Cristo me presenteou com a vida eterna, e pela ação do Espírito Santo, que me convence diariamente a ser um homem melhor, a mudar e rever minhas condutas, levando-me à pensar e valorizar as coisas atemporais. Que eu possa sempre ter ouvidos para te ouvir, e um coração disposto ao arrependimento e concordância contigo. A ti Senhor, seja toda honra e toda glória até o fim dos meus dias! Muito obrigado pelas ricas bençãos que me concedes, e por me ensinar que nem sempre o que eu quero é o melhor para mim e para os que me rodeiam. Aos meus pais (Paulo Martins Ferreira e Marianne de Azevedo Ramalho Ferreira), por serem um alicerce na minha vida, que me sustentou até eu chegar aqui. Sem vocês realmente teria sido muito difícil, sei que sou um privilegiado por ter tido as oportunidades que tive. Espero que ainda possamos viver muitos anos juntos, com muito amor, paz, confiança e solidariedade entre nós. Amo vocês e desejo do fundo do meu coração que vocês tenham abençoados anos de vida, com muita saúde para desfrutar de nosso maior presente de Deus que é a vida. Ao meu irmão Felipe e minha cunhada Letícia, por formarem um belo casal. Sou grato a Deus pelo irmão que você é, bem como por nossa família ter aumentado com uma mulher tão dedicada e amável como a sua. Que o amor de vocês possa crescer cada vez mais, e que tenham um coração sempre disposto a perdoar para continuar a caminhada juntos. Um grande beijo! Que Deus os abençoe e guarde sempre. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Agradecimentos Especiais À minha Orientadora Profa Ass. Dra Dra Roberta Okamoto, pelas oportunidades que me deu e por ter aberto o caminho para aprender coisas novas. Fico muito feliz em te ver como professora da UNESP, pois durante o mestrado a senhora ainda não havia tido esta oportunidade. Isso é a fidelidade de Deus se cumprindo na sua vida, a colheita de todas as boas sementes que lançou. Tenho certeza de que os alunos estão sendo brindados com um fantástico ser humano, e uma valiosa professora. Que Deus continue a te abençoar! Ao Prof. Adj. Idelmo Rangel Garcia Júnior, pela confiança em mim depositada e por nos tratar como uma extensão de sua família, emprestando-nos seus conhecimentos, bem como suas ferramentas para trabalharmos. Qualidade esta difícil de ser encontrada nesse tempo individualista em que vivemos. Desejo que seja próspero em tudo o que fizer, e que aproveite os frutos de seu trabalho com seu bem mais precioso, sua família. Conte comigo no que precisar. Deus o abençoe! Ao meu Coorientador Prof. Adj. Roelf Justino Cruz Rizzolo, por suas contribuições valiosas para a realização deste trabalho. Abraço. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da Bolsa de doutorado e auxílio regular em pesquisa (processos 2012/15748-8 e 2012/15912-2), indispensáveis para a realização desta pesquisa. AGRADECIMENTOS Agradecimentos À Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP na pessoa da Diretora Profa. Dra. Ana Maria Pires Soubhia pela oportunidade de me graduar como Mestre e Doutor na mais tradicional Pós-graduação de Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial do país. À Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Profa. Adj. Maria José Hitomi Nagata, pelo esforço e busca incessante da excelência, fazendo de nossa Pós-graduação uma referência. Aos Professores da Cirurgia Tetuo Okamoto, Michel Saad Neto, Osvaldo Magro Filho, Alessandra Marcondes Aranega, Daniela Ponzoni, Ana Paula Farnezi Bassi, Francisley Àvila Campos, por participarem da minha formação partilhando suas experiências e conhecimento. Deus os abençoe sempre e que continuem formando bons alunos! Aos Professores da Clínica Integrada Celso Koogi Sonoda, Sonia Regina Panzarini Barioni e Wilson Roberto Poi, pelos ensinamentos da vida, da ciência e convivência pacífica. Ao professor Cláudio Maldonado Pastori, por ser um profissional que admiro dentro de nossa especialidade. E pelas oportunidades que ofereceu. Deus abençoe você e família sempre! Ao “Léo” (Leonardo Perez Faverani), por ser alguém que mesmo crescendo bastante não se esquece de onde veio, valoriza aos que o rodeiam por meio de seu encorajamento e elogios, e que não deixa o coração se encher de vaidade. Uma das virtudes suas é o fato de se doar aos outros e “abraçar” os problemas dos outros como se fossem seus. O que mostra seu grande desprendimento e altruísmo. Sem você este trabalho não seria possível, sem sua insistência provavelmente não teria feito a pós- graduação. Mas dou graças a Deus por ter colocado você em meu caminho para me abençoar e abrir minha visão. Ao ser brindado com sua amizade, ganhei também um irmão, alguém que posso contar nos bons e maus momentos. Deus te abençoe, guarde, proteja, e guie, agora como Professor universitário. Tenho certeza de que será luz na vida de muitas pessoas. Um grande abraço! Ao mestrando Tarik Polo, e às alunas de iniciação cientifica Fernanda, Danila, Jaqueline e Karen pela inestimável ajuda na pesquisa e competência em tudo que fizeram. Aos colegas de curso da Pós-graduação em Cirurgia: André Fabris, Sabrina Ferreira, Lamis Nogueira, Igor Benetti, Gustavo Augusto Grossi de Oliveira, Rafael Santiago e Júlio de Oliveira, pela oportunidade de aprendizado mútuo e convivência respeitosa. Um abraço e felicidades a todos! Aos funcionários da Pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, pela ajuda e carinho com que nos tratam, e em especial ao Gilmar pelas valiosas orientações na parte laboratorial. Abraços! Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP. Aos pacientes, que nos guiam em nossa busca por excelência. Epígrafe Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo o propósito debaixo do céu. Há tempo de nascer, e tempo de morrer; tempo de plantar, e tempo de arrancar o que se plantou; Tempo de matar, e tempo de curar; tempo de derrubar, e tempo de edificar; Tempo de chorar, e tempo de rir; tempo de prantear, e tempo de dançar; Tempo de espalhar pedras, e tempo de ajuntar pedras; tempo de abraçar, e tempo de afastar-se de abraçar; Tempo de buscar, e tempo de perder; tempo de guardar, e tempo de lançar fora; Tempo de rasgar, e tempo de coser; tempo de estar calado, e tempo de falar; Tempo de amar, e tempo de odiar; tempo de guerra, e tempo de paz. Eclesiastes 3: 1-8 LISTAS E SUMÁRIO Lista de Abreviaturas OVX = Ratas submetidas à ovariectomia OVX RAL = Ratas submetidas à ovariectomia, alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato, e tratadas com raloxifeno OVX ALE = Ratas submetidas à ovariectomia, alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato,e tratadas com alendronato de sódio OVX ST = Ratas submetidas à ovariectomia, alimentadas com dieta balanceada e sem tratamento para a osteoporose SHAM DN = Ratas submetidas à cirurgia fictícia de ovariectomia e alimentadas com dieta balanceada ELCOI = Extensão linear de contato osso/implante RAL = Cloridrato de raloxifeno ALE = Alendronato de sódio p = Nível crítico da estatística (p <0,05 ou p >0,05) SERMs = moduladores seletivos dos receptores de estrógeno N = Número total de animais utilizados na pesquisa Ca = Cálcio P = Fósforo mg = miligramas (unidade de medida) ml = mililitros (unidade de medida) kg = quilogramas (unidade de medida) PVPI = Polivinil Pirrolidona Iodo cm = centímetros (unidade de medida) mm = milímetros (unidade de medida) rpm = rotações por minuto HE = Hematoxilina e eosina N.cm = Newton por centímetro (unidade de medida) vs = versus (comparação) n = Número de animais por grupo experimental µm2 = micrometros quadrados (área) µm = micrometros (unidade de medida) pH = potencial hidrogeniônico TRAP = fosfatase ácida resistente ao tartarato OPG = Osteoprotegerina OC = Osteocalcina RANKL = ativador do receptor do fator nuclear kappa-B ligante BMUs = Unidades Multicelulares Básicas Lista de Figuras – Capíulo 1 Figura 1 - Aspecto clínico da fresagem realizada na tíbia das ratas antes da instalação do implante (A). Instalação do implante com chave digital (B). Implante instalado na tíbia do animal (C). 46 Figura 2 – Imagem da região periimplantar obtida através da microscopia confocal, padronizada para o cálculo de ELCOI (perímetro), representada pelas linhas azuis. Considerou-se na análise ELCOI as linhas fluorescentes verdes (calceína) e vermelhas (alizarina) na interface osso/implante na região de terceira e quarta espiras do implante. 47 Figura 3 - Cortes histológicos mostrando as espiras dos implantes usinados dos grupos experimentais SHAM DN (A), OVX ST (B), OVX ALE (C), e OVX RAL (D) groups. Note o osso neoformado próximo às espiras do implante, especialmente no grupo SHAM DN. Importante notar a quantidade considerável de osso medular, repleto de tecido adiposo, nos grupos OVX ST e OVX ALE 48 Figura 4 - Cortes histológicos mostrando as espiras dos implantes com superfície texturizada dos grupos experimentais SHAM DN (A), OVX ST (B), OVX ALE (C), e OVX RAL (D) groups. Note o osso neoformado próximo às espiras do implante, especialmente no grupo SHAM DN. Similarmente aos implantes usinados, observa-se a quantidade considerável de osso medular, repleto de tecido adiposo, nos grupos OVX ST e OVX ALE 49 Figura 5 - Gráfico representativo dos resultados de torque reverso na comparação entre a instalação de implantes de superfície usinada e implantes de superfície texturizada nos diferentes grupos experimentais 50 Figura 6 - Gráfico representativo dos resultados de ELCOI na comparação entre a instalação de implantes de superfície usinada e implantes de superfície texturizada nos diferentes grupos experimentais. 51 Lista de Figuras – Capíulo 2 Figura 1 - Imagens do osso periimplantar obtidas pela microscopia confocal. (A): área óssea marcada pela calceína (verde); (B): área óssea marcada pela alizarina (vermelho) e (C): reconstrução de ambas as marcações dos fluorocromos (calceína e alizarina). 81 Figura 2 - Marcação das linhas fluorescentes na matriz de cálcio pela calceína (verde) e alizarina (vermelho), evidenciando a dinâmica do osso periimplantar dos grupos experimentais: (A) – SHAM; (B) – OVX; (C) – ALE e (D) – RAL. 85 Figura 3 - Área óssea periimplantar (µm2) dos grupos de osteoporose (SHAM, OVX, ALE e RAL) pelas expressões de calceína e alizarina. *p<0,05 (comparações intragrupos com significância estatística). 87 Figura 4 - Área óssea periimplantar (µm2) dos grupos de osteoporose (SHAM, OVX, ALE e RAL) pelas expressões de calceína e alizarina. *p<0,05 (comparações intragrupos com significância estatística). 87 Figura 5 – Imunomarcações de osteoprotegerina (OPG) aos 14 e 42 dias dos grupos de osteoporose (SHAM, OVX, ALE e RAL). Setas indicando a intensidade da marcação (14 dias: SHAM (1), OVX (2), ALE (2) e RAL (2); 42 dias: SHAM (1), OVX (1), ALE (2) e RAL (2)). 91 Figura 6 – Imunomarcações de RANKL aos 14 e 42 dias dos grupos de osteoporose (SHAM, OVX, ALE e RAL). Setas indicando a intensidade da marcação (14 dias: SHAM (2-3), OVX (3), ALE (2) e RAL (2); 42 dias: SHAM (2-3), OVX (2), ALE (2) e RAL (2)). 92 Figura 7 – Imunomarcações de TRAP aos 42 dias dos grupos de osteoporose (SHAM, OVX, ALE e RAL). Setas indicando a intensidade da marcação (SHAM (2), OVX (3), ALE (1) e RAL (2)). 93 Figura 8 – Imunomarcações de osteocalcina (OC) aos 14 e 42 dias dos grupos de osteoporose (SHAM, OVX, ALE e RAL). Setas indicando a intensidade da marcação (14 dias: SHAM (2), OVX (2), ALE (2) e RAL (1); 42 dias: SHAM (2), OVX (2), ALE (1) e RAL (2)). 94 Sumário Resumo Geral 20 Abstract Geral 21 1. Capítulo 1 – Raloxifeno melhora o reparo ósseo periimplantar em ratas osteoporóticas 22 Resumo 23 Abstract 24 1.1 Introdução 25 1.2 Materiais e métodos 27 1.3 Resultados 34 1.4 Discussão 36 1.5 Conclusões 40 1.6 Referências 41 1.7 Tabelas 46 1.8 Figuras 48 1.9 Anexo A (Comitê de Ética no uso de animais - para os capítulos 1 e 2) 55 1.10 Anexo B (Normas do periódico IJOMS) 56 Sumário – Capítulo 2 2. Capítulo 2 – Dinâmica do processo de reparo ósseo periimplantar durante o tratamento com alendronato de sódio ou raloxifeno em ratas osteoporóticas 72 Resumo 74 Abstract 76 2.1 Introdução 78 2.2 Materiais e métodos 80 2.3 Resultados 87 2.4 Discussão 98 2.5 Referências 103 2.6 Anexo C (Normas do periódico Clinical Oral Implants Research) 110 20 Resumo Geral O objetivo deste estudo foi avaliar o reparo ósseo na interface osso/implante em ratas com osteoporose induzida. As ratas submetidas à ovariectomia bilateral foram alimentadas com uma dieta pobre em cálcio. Dois grupos receberam tratamento medicamentoso (raloxifeno [OVX RAL] ou alendronato [OVX ALE]) e outro grupo não recebeu nenhuma medicação (OVX ST). O grupo controle foi submetido à cirurgia fictícia e foi alimentado com uma dieta normal (SHAM DN). Cada animal recebeu um implante em cada tíbia. Os animais foram eutanasiados após 14 ou 42 dias. Foram realizadas as análises biomecânica (torque reverso), extensão linear de contato osso/implante (ELCOI) e dinâmica óssea periimplantar pela proporção dos fluorocromos calceína/alizarina, aplicando-se a análise de variância ANOVA e o pós- teste de Tukey (p<0,05). A imunoistoquímica marcou a precipitação de osteoprotegerina (OPG), RANKL, TRAP e osteocalcina (OC). O medicamento RAL melhorou o reparo ósseo periimplantar, em que o grupo ALE foi semelhante ao grupo OVX ST. Não houve diferenças estatisticamente significativas no torque reverso (p = 0,861), na precipitação dos fluorocromos (calceína/alizarina) e na ELCOI entre os grupos OVX RAL e grupo controle – SHAM DN (p > 0,05). As imunomarcações de OPG e RANKL foram similares para os grupos RAL e SHAM; houve moderada expressão de OC aos 14 dias. A TRAP foi marcada intensamente aos 42 dias para o grupo OVX. Portanto, o raloxifeno melhorou o reparo ósseo periimplantar de ratas osteoporóticas, sugerindo a sua indicação no tratamento da osteoporose. Palavras-chaves: alendronato, raloxifeno, osteoporose. 21 Abstract Geral The aim of this study was to evaluate the bone healing in bone/implant interface in rats with induced osteoporosis. The rats underwent bilateral ovariectomy were fed a diet low in calcium. Two groups received drug treatment (raloxifene [OVX RAL] or alendronate [OVX ALE]) and the other group received no medication (OVX NT). The control group underwent sham surgery and was fed a normal diet (SHAM ND). Each animal received an implant on the tibia. The animals were euthanized after 14 or 42 days. The biomechanical analysis (reverse torque), linear extension contact bone / implant (BIC) and bone dynamics periimplantar by the proportion of fluorochrome calcein/alizarin, applying the ANOVA and Tukey's post-test (p<0.05). Immunohistochemistry marked precipitation of osteoprotegerin (OPG), RANKL, TRAP and osteocalcin (OC). The RAL improved drug peri-implant bone repair, wherein the ALE OVX group was similar to the ST group. There were no statistically significant differences in reverse torque (p = 0.861), precipitation of fluorochromes (calcein/alizarin) and BIC between OVX RAL and control groups - SHAM ND (p> 0.05). The immunostaining of OPG and RANKL were similar to RAL and SHAM groups; there was moderate OC expression at 14 days. TRAP was marked intensely at 42 days for the OVX group. Therefore, raloxifene improved peri-implant bone repair of osteoporotic rats, suggesting its indication in the treatment of osteoporosis. Keywords: alendronate, raloxifene, osteoporosis. 22 Capítulo 1 Raloxifeno melhora o reparo ósseo periimplantar em ratas osteoporóticas * *Este artigo foi enviado para o periódico International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 23 Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar o reparo ósseo na interface osso/implante em ratas com osteoporose induzida. As ratas submetidas à ovariectomia bilateral (OVX), foram alimentadas com uma dieta pobre em cálcio e fosfato. Dois grupos receberam tratamento medicamentoso (raloxifeno [OVX RAL] ou alendronato [OVX ALE]) e outro grupo não recebeu nenhuma medicação (OVX ST). O grupo controle foi submetido à cirurgia fictícia e foi alimentado com uma dieta normal (SHAM DN). Cada animal recebeu um implante em cada tíbia (na tíbia direita, implantes com superfície usinada, e na tíbia esquerda, implantes com texturização da superfície). Todos os animais foram eutanasiados após 42 dias. Para os dados da biomecânica e de extensão linear de contato osso/implante (ELCOI) a análise de variância ANOVA e o pós-teste de Tukey (p<0,05) foram empregados. Os medicamentos (RAL e ALE) melhoraram o reparo ósseo periimplantar; no entanto, o grupo ALE foi semelhante ao grupo OVX ST. A texturização da superfície promoveu maior corticalização na interface osso/implante, mas com as mesmas características que o implante usinado, com osso maduro e neoformação óssea em laminações concêntricas. Não houve diferenças estatisticamente significativas no torque reverso (p = 0,861) e ELCOI entre os grupos OVX RAL e grupo controle – SHAM DN (p = 0,745). Portanto, o tratamento com raloxifeno foi associado à melhores resultados nas análises biomecânicas, de ELCOI e histológicas no tratamento da osteoporose induzida em rata. Palavras-chaves: alendronato, raloxifeno, osteoporose. 24 Abstract This study aimed to evaluate bone healing at the bone/implant interface in rats with induced osteoporosis. The rats underwent bilateral ovariectomy (OVX) and were fed a low calcium and phosphate diet. Two groups received drug treatment (raloxifene [OVX RAL] or alendronate [OVX ALE]) and another group received no medication (OVX NT). The control group underwent SHAM surgery and was fed a normal diet. Each animal received 1 implant in each tibia (right tibia implants with a machined surface and left tibia implants with surface etching). All animals were euthanized after 42 days. ANOVA with Tukey post-tests were applied to the biomechanics (reverse torque) and bone implant contact (BIC) data (p < 0.05). RAL and ALE improved peri-implant bone healing; however, the ALE group was similar to the OVX NT group. Surface treatment promoted higher corticalization at the bone/implant interface, but with the same characteristics as the machined implant, as mature bone and bone neoformation in concentric laminations. There were no statistically significant differences in reverse torque (p = 0.861) and BIC between the OVX RAL and SHAM groups (p=0,745). Therefore, raloxifene treatment was associated with better biomechanical, BIC and histological findings in the context of treatment of induced osteoporosis in rats. Key-words: alendronate, raloxifene, osteoporosis. 25 1.1 Introdução Um dos fatores determinantes para a adequada osseointegração dos implantes dentários é a qualidade do tecido ósseo, tendo em vista que as características da micro-arquitetura óssea influenciam na habilidade do osso em suportar a transmissão e distribuição de forças fisiológicas (Isidor 2006, Tabata, et al. 2011). Neste contexto, quando o osso adquire uma estrutura cortical e/ou trabecular com menor densidade, a interface osso/implante é comprometida (Drage, et al. 2007, Shapurian, et al. 2006). A diminuição da densidade óssea corporal é observada em dois terços das mulheres, como consequência da deficiência de estrógeno após a menopausa (Aubin & Bonnelye 2000). Assim, a deficiência estrogênica associada ao envelhecimento da população pode ocasionar a osteoporose (Aubin & Bonnelye 2000, Kribbs 1990, Manolagas & Jilka 1995). Esta perda óssea decorrente do envelhecimento é devida à diminuição da absorção intestinal do cálcio da dieta, resultando na perda óssea principalmente cortical (Teofilo, et al. 2003, Teofilo, et al. 2004). Este processo ainda é motivo de bastante discussão na literatura, no tocante ao tratamento reabilitador com os implantes osseointegráveis. Yamazaki et al (Yamazaki, et al. 1999), Ozawa et al (Ozawa, et al. 2002) e Dvorak et al (Dvorak, et al. 2012) analisaram a porcentagem de contato entre tecido ósseo e implantes instalados na tíbia de ratas Wistar ovariectomizadas. Os autores observaram que a redução da massa óssea nas ratas osteoporóticas promoveu menor área de contato entre o osso e o implante, o que pode ocasionar menor habilidade no suporte das próteses. Dentre os tratamentos da osteoporose, a reposição hormonal ainda é o mais utilizado, porém com várias contra-indicações e efeitos colaterais (Burg, et al. 2006). Outros fármacos têm sido utilizados, incluindo os bifosfonatos (Atanes-Bonome, et al. 26 2014, Munoz-Torres, et al. 2009) e os moduladores seletivos dos receptores de estrógeno (SERMs) (Barrett-Connor, et al. 2002, Luvizuto, et al. 2010, Luvizuto, et al. 2010) como terapias alternativas promissoras para o tratamento da osteoporose pós- menopausa. A texturização da superfície dos implantes dentários através das técnicas de adição e subtração têm melhorado as respostas biológicas na osteogênese periimplantar, principalmente em áreas de menor densidade, tal como ocorre na osteoporose (Buser, et al. 2004, Tavares, et al. 2007, Wennerberg & Albrektsson 2009, Wennerberg & Albrektsson 2011, Xavier, et al. 2003). Isso porque a texturização da superfície dos implantes dentários ocasiona aumento das porosidades e da rugosidade superficial, promovendo que as células da linhagem osteoblástica atinjam a região periimplantar de forma mais eficiente e acelerada (Buser, Broggini, Wieland, Schenk, Denzer, Cochran, Hoffmann, Lussi & Steinemann 2004, Tavares, de Oliveira, Nanci, Hawthorne, Rosa & Xavier 2007). Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento biomecânico e histométrico de implantes, com e sem texturização da superfície, os quais foram instalados nas tíbias das ratas ovariectomizadas e alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato para a indução de osteoporose, e os eventos do reparo ósseo na interface osso/implante. Além disso, dois grupos de ratas foram tratados com alendronato ou raloxifeno (SERM), com o intuito de verificar se estes tratamentos melhoram o processo de reparo ósseo periimplantar, podendo ser indicados na reabilitação com implantes dentários. A hipótese apresentada é que os tratamentos medicamentosos (OVX RAL e OVX ALE) melhorariam o processo reparacional periimplantar e ocasionariam maior torque 27 reverso e ELCOI na comparação com o grupo OVX ST. Além disso, lançamos a hipótese de que a texturização da superfície promoveria melhora nos resultados histológicos, de ELCOI e biomecânicos. 1.2 Materiais e Métodos Animais O projeto desta pesquisa foi aprovado pelo Comitê de ética no uso de animais (CEUA) sob o protocolo 2012-01096. Para esta pesquisa foram utilizadas ratas (N=72) (Rattus novergicus albinus, Wistar), com peso médio de 200 gramas, as quais foram divididas em 3 grupos de acordo com a análise (Grupo I – análise histológica, Grupo II – análise histométrica e grupo III – análise biomecânica por meio do torque reverso). Dentro destes grupos as ratas foram divididas em quatro subgrupos: ratas submetidas à cirurgia fictícia de ovarictomia, somente com exposição dos ovários, e alimentadas com dieta balanceada - SHAM DN; ratas ovariectomizadas e alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato, sem tratamento medicamentoso para osteoporose - OVX ST; ratas ovariectomizadas, alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato e tratadas com alendronato de sódio - OVX ALE e ratas ovariectomizadas, alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato e tratadas com raloxifeno - OVX RAL. A eutanásia de todos os animais foi realizada aos 42 dias após a instalação dos implantes. Inicialmente os animais de todos os grupos, com seus respectivos subgrupos foram mantidos em gaiolas e alimentados com ração balanceada (NUVILAB, Curitiba PR, Brazil) contendo 1.4% Ca e 0.8% P e água ad libitum, até o momento em que foram divididos de acordo com a osteoporose induzida e o tratamento medicamentoso (SHAM DN, OVX ST, OVX ALE e OVX RAL). 28 Após a realização das cirurgias SHAM e das cirurgias de ovariectomia, os animais do subgrupo SHAM com dieta balanceada (SHAM DN) continuaram sendo alimentados com ração balanceada (NUVILAB, Curitiba PR, Brazil) contendo 1.4% Ca e 0.8% P e água ad libitum, enquanto os demais animais dos subgrupos de ratas ovariectomizadas foram alimentados com ração contendo 0.1% Ca e 0.5%P (RHOSTER Ind. Com., Vargem Grande Paulista, SP, Brasil) e água ad libitum. Experimental Design 1) Estudo do ciclo estral O ciclo estral foi realizado diariamente de acordo com a técnica sugerida por Evans e Long (Evans & Long 1922), em que as ratas foram colocadas em gaiolas individuais para o estudo diário do ciclo estral. Decorridos 2 a 3 ciclos regulares, as ratas foram utilizadas para os experimentos. 2) Ovariectomia bilateral As ratas dos grupos OVX ST, OVX ALE e OVX RAL foram sedadas com Vetaset (Cloridrato de Quetamina injetável, Fort Dodge, Saúde Animal Ltda) e receberam também o relaxante muscular Coopazine (Xilazina-Coopers, Brasil, Ltda), a seguir, foram realizadas incisões em ambos os flancos, com a exposição dos ovários e remoção cirúrgica dos mesmos. As ratas do grupo SHAM DN passaram pelo mesmo procedimento, porém apenas foi realizada a exposição cirúrgica dos ovários sem sua remoção. 3) Tratamento Medicamentoso OVX ALE (Alendronato de Sódio) 29 Oito dias após a ovariectomia as ratas foram submetidas a tratamento com alendronato sódico por 30 dias através da gavagem de 0,1mg/Kg/dia (da Paz, et al. 2001) dissolvido em solução aquosa. Esta medicação permaneceu até o término do experimento (eutanásia dos animais), totalizando 72 dias de administração. OVX RAL (Raloxifeno) Oito dias após a ovariectomia as ratas foram submetidas a tratamento com raloxifeno por 30 dias através da gavagem de 1mg/kg/dia (Luvizuto, Dias, Queiroz, Okamoto, Garcia, Okamoto & Dornelles 2010) dissolvido em solução aquosa. Da mesma forma que a medicação anterior, esta permaneceu até a eutanásia dos animais. 4) Cirurgia para instalação dos implantes nas tíbias Os animais foram mantidos em jejum durante oito horas prévias ao procedimento cirúrgico e sedados pela combinação de anestésico e relaxante muscular por meio da administração de 50mg/kg de Ketamina intramuscular (Vetaset – Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas, São Paulo, Brazil) e 5mg/Kg de cloridrato de xilazina (Dopaser – Laboratório Calier do Brasil Ltda – Osasco, São Paulo, Brazil) e receberam cloridrato de mepivacaína (0.3 ml/Kg, Scandicaíne 2% com adrenalina 1:100.000, Septodont, França) como anestesia local e para hemostasia do campo operatório. Após a sedação dos animais foi realizada tricotomia na porção medial da tíbia direita e esquerda, antissepsia com Polivinil Pirrolidona Iodo Degermante (PVPI 10%, Riodeine Degermante, Rioquímica, São José do Rio Preto), associado à PVPI tópico. Foi realizada incisão de aproximadamente 1 cm, divulsão dos tecidos moles em espessura total até a exposição das metáfises tibiais direita e esquerda. 30 Na tíbia direita de cada rata foi instalado um implante de titânio grau 4 com superfície usinada (Implalife Biotecnologia, Jales, São Paulo, Brazil) e na tíbia esquerda, um implante de titânio grau 4 com superfície texturizada por duplo ataque ácido comercialmente disponível (Implalife Biotecnologia, Jales, São Paulo, Brazil). Todos os implantes apresentavam 2.0 mm de diâmetro e 4 mm de comprimento e módulo de rebordo quadrado. Para tanto, a fresagem foi realizada com fresa espiral de 1,4mm de diâmetro montada em motor elétrico (BLM 600®; Driller, São Paulo, SP, Brasil) a uma velocidade de 1000 rpm, sob irrigação com solução isotônica de cloreto de sódio a 0,9% (Fisiológico®, Laboratórios Biosintética Ltda®, Ribeirão Preto, SP, Brasil). A instalação foi realizada com chave digital quadrada de forma manual, com travamento bicortical do implante (Figuras 1A, 1B e 1C). Os tecidos foram suturados em planos empregando-se fio absorvível (Poligalactina 910 – Vycril 4.0, Ethicon, Johnson Prod., São José dos Campos, Brazil) com pontos contínuos no plano profundo e com fio monofilamentar (Nylon 5.0, Ethicon, Johnson, São José dos Campos, Brazil) com pontos interrompidos no plano mais externo. No pós-operatório imediato os animais receberam administração intramuscular de Pentabiótico (0,1ml/Kg, Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas, São Paulo, Brasil) com uma dose e Dipirona Sódica (1mg/kg/dia, Ariston Indústrias Químicas e Farmacêuticas Ltda, São Paulo, Brasil). Aos 14 dias após a instalação dos implantes, em 24 animais foi administrado o fluorocromo calceína pela via intramuscular, na dosagem de 20 mg/kg para cada animal. 20 dias após, o fluorocromo vermelho de alizarina foi administrado (20 mg/kg). Com a infiltração dos fluorocromos, a avaliação da ELCOI foi realizada por microscopia 31 confocal. As biópsias destes animais foram reservadas para o processamento de tecido calcificado, a fim de obter dados da análise histométrica do contato osso/implante. 5) Análises GRUPO I – Análise histológica Processamento laboratorial para obtenção das lâminas histológicas A eutanásia dos animais foi realizada após 42 dias da instalação dos implantes através de sobredosagem anestésica. Após a eutanásia dos animais, as metáfises tibiais esquerda e direita das ratas do grupo I foram removidas e reduzidas. A seguir, foram fixadas em solução de formalina tamponada a 10% (Reagentes Analíticos, Dinâmica Odonto-Hospitalar Ltda, Catanduva, SP, Brazil) durante 48 horas e banhadas em água corrente por 24 horas. Preparo das peças para análise histológica Após a lavagem das peças, as mesmas foram descalcificadas em EDTA (18%) por 6 semanas, e com isso foi possível realizar a cuidadosa remoção dos implantes pela rotação anti-horária. A seguir, utilizando uma sequência crescente de alcoóis as peças foram desidratadas. Após estas etapas, foi realizada a diafanização com xilol para posterior inclusão em parafina a fim de que cortes com 5 μm de espessura no sentido longitudinal fossem obtidos e montados em lâminas. As lâminas foram coradas em hematoxilina e eosina (HE). As imagens obtidas foram capturadas no microscópio óptico convencional (Leica Aristoplan Microsystems Leitz, Benshein, Alemanha), acoplado a uma câmera de captura de imagem (Leica DFC 300FX, Leica microsystems, Heerbrugg, Switzerland) e conectado a um microcomputador. 32 GROUP II – Análise histométrica Preparação dos espécimes para análise histométrica As outras tíbias, após fixação em formaldeído por 48h também foram lavadas em água durante 24h e em seguida, desidratadas em ordem crescente de álcoois para que fossem infiltradas com resina fotopolimerizável (Technovit 7200VLC, Advanced Technologies exakt, Norderstedt, Alemanha). Após a polimerização da resina, os espécimes foram submetidos ao corte da serra de semi-precisão (Exakt Tecnologias Avançadas, Norderstedt, Alemanha) e reduzidas a uma espessura média de 80 micrômetros em polidora automática (Exakt Tecnologias Avançadas, Norderstedt, Alemanha) com lixas de diferentes graumaturas. As lâminas foram montadas com as peças estabilizadas com óleo mineral. Microscopia de escaneamento a laser Confocal Cortes longitudinais da interface osso / implante correspondentes à terceira, quarta e quinta espiras dos implantes instalados nas tíbias do lado direito e esquerdo foram obtidas pelo microscópio Leica CTR 4000 CS SPE (Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha), utilizando uma objetiva de 10X (aumento original 100) (Figura 2). As imagens obtidas pela microscopia confocal foram reconstruídas e, assim o osso periimplantar mostrou a sobreposição dos dois fluorocromos (calceína e alizarina). Análise histométrica - ELCOI O cálculo, em micrômetros, da extensão linear do contato osso/implante contato (ELCOI) da interface periimplantar nas regiões da terceira e quarta espiras dos implantes, foi padronizado para todos os grupos. Utilizou-se o programa de análise de imagens - Imagem J (Software de Processamento e Análise de Imagem, Ontario, ON, Canadá) para esta finalidade. Portanto, somente as linhas fluorescentes verdes 33 (calceína) e vermelhas (alizarina), que foram precipitadas na interface periimplantar, foram mensuradas. GRUPO III -Ensaio Biomecânico Antes da eutanásia dos animais deste grupo, também aos 42 dias após a instalação dos implantes, os animais foram sedados pela combinação de 50mg/kg de Ketamina intramuscular (Vetaset – Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas, São Paulo, Brazil) e 5mg/Kg de cloridrato de xilazina (Dopaser – Laboratório Calier do Brasil Ltda – Osasco, São Paulo, Brazil). As metáfises tibiais direita e esquerda foram reabertas para exposição dos implantes e realização do torque reverso. Uma chave quadrada foi adaptada ao torquímetro digital (Torque Meter - Instrutherm®, São Paulo-SP, Brasil) e este ao módulo de rebordo do implante. Foi aplicado movimento anti-horário aumentando-se o torque reverso até a rotação do implante no interior do tecido ósseo, rompendo-se completamente a interface osso/implante, momento em que o torquímetro registrou o pico máximo de torque para esse rompimento, em Newton por centímetros2 (N.cm2). Análise estatística Os dados obtidos pelo torque reverso e ELCOI foram submetidos ao teste estatístico de homocedasticidade (Kolmogorov-Smirnov, p< 0,05), os quais mostraram distribuição normal pelo programa Sigmaplot 12.5 Exact Graphs and Data Analysis (San Jose, California, USA). A análise de variância a 2 fatores (medicamento x superfície) foi realizada e para os dados que mostraram significância estatística, o teste Tukey foi aplicado. Para todos os testes foi adotado o nível de significância de 5%. 34 1.3 Resultados Análise Histológica A análise histológica aos 42 dias após a instalação dos implantes de superfície usinada mostrou que o reparo ósseo periimplantar no grupo SHAM DN apresentou maior corticalização do tecido ósseo na interface osso/implante, de modo a envolver as espiras dos implantes, com osso maturo, através de neoformação de osso em laminações concêntricas (Figura 3A). O grupo OVX ST, teve neoformação óssea com corticalização na interface somente nas primeiras espiras dos implantes na região cervical dos mesmos. Na porção medular, uma pequena neoformação óssea foi observada com grande quantidade de tecido adiposo (Figura 3B). No grupo OVX ALE houve uma melhora no reparo ósseo (Figura 3C), mas de forma bastante semelhante ao grupo OVX ST, ainda com o reparo atrasado em especial na região medular. O tratamento com raloxifeno (OVX RAL) mostrou melhora na maturação óssea periimplantar (Figura 3D), próximo dos resultados histológicos do SHAM DN. Os implantes com superfície texturizada melhoraram a corticalização na interface osso/implante nos grupos OVX ST e OVX ALE, quando comparados aos implantes usinados, porém no tecido medular ainda havia grande quantidade de tecido adiposo. Já os grupos OVX RAL e SHAM DN foram semelhantes, mostrando neoformação de osso maduro em toda a interface osso/implante (Figuras 4A, 4B, 4C e 4D). 35 Torque Reverso Foi aplicado o teste ANOVA a dois fatores (medicamento x superfície), apresentando diferenças estatisticamente significantes nas variáveis superfície (p= 0,02) e medicamentos (p< 0,001) comparadas isoladamente. A comparação entre texturização da superfície versus medicamentos não houve diferença estatística (p= 0,560) (Tabela 1). Como pós-teste foi aplicado o teste Tukey, em que foi identificado maior torque para a superfície texturizada dos implantes em comparação a superfície usinada (p= 0,020, Tukey). Para o fator medicamento, foi observado maior torque com diferenças estatísticas entre os grupos SHAM-DN vs. OVX-ST (p<0,001), SHAM-DN vs. OVX-ALE (p< 0,001), com maior torque para SHAM-DN em ambas as comparações; OVX-RAL vs. OVX-ST (p< 0,001), OVX-RAL vs. OVX-ALE (p< 0,001), com maior torque para OVX-RAL e OVX-ALE vs. OVX-ST (p< 0,01), com maior torque para OVX-ALE. Somente entre SHAM-DN vs. OVX-RAL não houve diferença estatisticamente significante (p= 0,861) (Tabela 2 e Figura 5). ELCOI A análise de variância a dois fatores mostrou significância estatística somente no fator de variação medicamento utilizado na comparação entre os grupos de tratamento da osteoporose (OVX ALE e OVX RAL) e os Grupos controles (SHAM e OVX ST) (p < 0,001). As comparações isoladas da variável texturização da superfície dos implantes e/ou superfície vs medicamento não apresentaram diferenças estatisticamente significantes (p>0,05), mesmo que para todos os grupos houve uma tendência do aumento do BIC nos implantes com texturização da superfície (Tabela 3). 36 Os maiores valores de ELCOI foram observados nos grupos SHAM e OVX RAL, sem diferenças estatísticas entre os dois grupos (p = 0,745, teste Tukey). Os menores valores de ELCOI foram encontrados nos grupos OVX ALE e OVX ST e, na comparação entre eles também não houve relevância estatística (p = 0,934, teste Tukey). As demais interações mostraram diferenças estatisticamente significantes, com maiores valores de ELCOI para SHAM DN, OVX RAL, seguidas por OVX ALE e OVX ST (p< 0,001, teste Tukey) (Tabela 4 e Figura 6). 1.4 Discussão As hipóteses dos autores nesta pesquisa de que os tratamentos medicamentosos (OVX RAL e OVX ALE) melhorariam os parâmetros avaliados em relação às ratas do grupo OVX ST, e de que a texturização da superfície promoveria melhores resultados histológicos e biomecânicos, foram parcialmente aceitas. Isso porque em relação aos resultados de torque reverso, os grupos OVX ALE, OVX RAL e SHAM DN obtiveram maior torque em relação ao OVX ST (P< 0,01). Porém na comparação com o grupo SHAM DN, os grupos OVX ST e OVX ALE apresentaram menor torque reverso (p< 0,01), ou seja, o alendronato não promoveu melhora a ponto de ter desempenho semelhante ao das ratas SHAM DN. Enquanto que o raloxifeno (OVX RAL) não mostrou diferença estatística quando comparado com o grupo SHAM DN (p= 0,861). Os implantes com texturização da superfície foram estatisticamente superiores aos implantes usinados para todos os grupos (p= 0,020) na análise de torque reverso. Esses resultados biomecânicos foram suportados pelas imagens histológicas (Figuras 3 e 4). Analisando os resultados de ELCOI comparando os medicamentos utilizados, os dados confirmam as outras analíses realizadas, exceto para a texturização da 37 superfície, que não mostrou diferença estatisticamente significante entre os grupos (p> 0,05). Sendo assim, ficou evidente que o raloxifeno conseguiu melhorar o reparo ósseo periimplantar no tratamento da osteoporose induzida em ratas. A semelhança histológica com o grupo SHAM DN, associado aos valores biomecânicos e ELCOI, sugere que esta medicação além de tratar a diminuição da densidade óssea causada pela osteoporose induzida, provavelmente possibilita adequada osseointegração no tratamento reabilitador com os implantes dentários. Tendo em vista que somente após o carregamento, obtem-se a osseointegração (Albrektson 1989, Branemark, et al. 1977, Ericsson, et al. 2000, Ravald, et al. 2012), estudos futuros devem ser realizados com o intuito de avaliar se essas medicações são capazes de suportar cargas, através de micromovimentações aplicadas transcutaneamente sobre os implantes, em diferentes momentos do reparo ósseo, como realizado por Wazen et al (Wazen, et al. 2013). Apesar da literatura atual não identificar diferenças estatisticamente significativas entre os pacientes com osteoporose reabilitados com implantes dentários, em relação à taxa de falha deste tratamento, há uma forte correlação entre a osteoporose e a diminuição da taxa de sobrevivência, principalmente na mandíbula quando comparado com maxila, ricamente vascularizada. É importante salientar que o objetivo do presente estudo foi o avaliar o efeito de medicações utilizadas no tratamento da osteoporose no reparo ósseo periimplantar. Assim, será possível estabelecer um protocolo clínico no tratamento desta alteração sistêmica, melhorando o processo de reparo ósseo. 38 Estudos previamente publicados (Luvizuto, Dias, Queiroz, Okamoto, Garcia, Okamoto & Dornelles 2010, Luvizuto, et al. 2011) observaram melhor dinâmica do processo de reparo alveolar em ratas ovariectomizadas quando tratadas com raloxifeno aos 42 dias, com melhores respostas histomofométricas de porcentagem de osso neoformado. Mesmo que esses resultados foram obtidos em alvéolos em reparação pós-exodôntica, corroboram com os do presente trabalho, sustentando a assertiva da indicação do raloxifeno no tratamento da osteoporose, especialmente em indivíduos que se submeterão ao tratamento com implantes osseointegráveis. A habilidade dos moduladores seletivos de receptores de estrógeno para ativar os osteoblastos foi confirmada em estudos anteriores (Luvizuto, Dias, Queiroz, Okamoto, Garcia, Okamoto & Dornelles 2010, Luvizuto, Queiroz, Dias, Okamoto, Dornelles, Garcia & Okamoto 2010). Este é provavelmente o principal fator que explica os resultados na reparação óssea alveolar e periimplantar com este medicamento. A ação anti-reabsortiva dos bifosfonatos orais, através da ligação à hidroxiapatita, que inibe a ação dos osteoclastos e também promove a apoptose dos osteoclastos (Giro, et al. 2011) é eficiente no tratamento da osteoporose, entretanto ainda é incerto no que diz respeito à instalação de implantes dentários em pacientes osteoporóticos. Além do risco da osteonecrose dos maxilares (Marx, et al. 2007, Ruggiero, et al. 2009, Sigua-Rodriguez, et al. 2014), ainda que os resultados histométricos observados por Giro et al (Giro, Coelho, Pereira, Jorgetti, Marcantonio & Orrico 2011), foram semelhantes ao grupo controle (SHAM DN), essa dúvida ainda permanece. Portanto, corroborado pelo presente estudo, ressalta-se a necessidade de outras investigações in vivo, através da avaliação dessas situações, com os implantes 39 sendo submetidos ao carregamento (Wazen, Currey, Guo, Brunski, Helms & Nanci 2013). Em relação ao modelo animal, Glosel et al (Glosel, et al. 2010) relataram que o órgão americano Food and Drug Administration considera a ovariectomia (OVX) bilateral em ratas após um período de 3 meses, como o modelo ideal para mimetizar a osteoporose pós-menopausa. Neste contexto, a associação da OVX com a dieta pobre em cálcio e fosfato, relatada pela primeira vez por Teófilo et al (Teofilo, Azevedo, Petenusci, Mazaro & Lamano-Carvalho 2003, Teofilo, Brentegani & Lamano-Carvalho 2004), mostrou maior efetividade na simulação da osteoporose induzida em ratas, apresentando redução da massa óssea duas vezes maior da na maxila em relação à tíbia num período de apenas 5 semanas, sem a necessidade de esperar 3 meses após a OVX para o inicio dos experimentos a serem analisados. Sendo assim, como suportado pelos resultados do presente trabalho, a associação da OVX com a dieta pobre em cálcio e fosfato deve ser considerada para os estudos. Uma limitação do estudo em animais é a extrapolação para os parâmetros clínicos. A seleção da tíbia das ratas para a avaliação do reparo ósseo é justificada por sua aceitação na literatura como um modelo experimental valioso para o estudo da osseointegração na osteoporose (Glosel, Kuchler, Watzek & Gruber 2010). Ainda Glosel et al (Glosel, Kuchler, Watzek & Gruber 2010) observaram que as alterações histométricas através dos valores de ELCOI ocorreram somente no tecido medular das ratas osteoporóticas em comparação as ratas do grupo controle (SHAM DN). O que foi suportado pela análise histológica deste estudo, onde de forma mais marcante nos grupos OVX ST e OVX ALE, na região medular a neoformação óssea da interface osso/implante foi atrasada, com grande quantidade de tecido adiposo e 40 pouca corticalização nessa interface, importante para o processo de reparo ósseo periimplantar. Além disso, os resultados da análise de ELCOI apresentaram maiores valores no grupo OVX RAL, quando comparado com os grupos OVX ALE e OVX ST. É importante notar que esse grupo teve valores semelhantes ao grupo SHAM DN, sugerindo que o raloxifeno reverteu a osteoporose induzida em ratos. A literatura é congruente em afirmar que a texturização da superfície dos implantes dentários promove melhores respostas biológicas, principalmente nas regiões de menor densidade, como a região posterior de maxila, assim como nas alterações do metabolismo ósseo, como ocorre na osteoporose (Buser, Broggini, Wieland, Schenk, Denzer, Cochran, Hoffmann, Lussi & Steinemann 2004, Tavares, de Oliveira, Nanci, Hawthorne, Rosa & Xavier 2007, Wennerberg & Albrektsson 2009, Wennerberg & Albrektsson 2011, Xavier, Carvalho, Beloti & Rosa 2003). Este estudo comprovou esta assertiva da literatura, onde os resultados histológicos e biomecânicos mostraram superioridade da texturização da superfície dos implantes através do duplo ataque ácido, quando comparado aos implantes de superfície usinada. Sendo assim, a texturização da superfície dos implantes deve ser realizada, principalmente, nas situações avaliadas neste estudo. Mesmo não havendo diferença estatística na análise histométrica (ELCOI) (p> 0,05), o implante com superfície texturizada em comparação com os implantes usinados, mostrou uma tendência de aumento da ELCOI, corroborando com as outras análises realizadas. 1.5 Conclusões Diante dos limites deste estudo in vivo, foi possível concluir que: 41 1) Raloxifeno foi o medicamento que apresentou melhores resultados histológicos, de extensão linear de contato osso/implante e biomecânicos para o tratamento da osteoporose induzida em ratas; 2) Os implantes com texturização da superfície promoveram maior resistência para o torque reverso aplicado na interface osso/implante. Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer a Fundação de Amparo a Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento deste estudo (processo número 2012/15748-8 e 2012/15912-2). 1.6 Referências 1. Isidor F. Influence of forces on peri-implant bone. Clin Oral Implants Res 2006 Oct; 17 Suppl 2:8-18. 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PubMed PMID:. 20556250 Epub 2010/06/18. eng. 46 1.7 Tabelas Tabela 1 – Teste ANOVA a dois fatores (superfície x medicamento) para torque reverso Fator de variação *p Superfície 0,020 Medicamento <0,001 Superfície x Medicamento 0,560 *valores de P<0,05 denotam significância estatística Tabela 2 – Teste Tukey para os grupos experimentais de osteoporose (SHAM DN, OVX ST, OVX ALE e OVX RAL) na análise biomecânica (torque reverso) Comparação (Grupos experimentais) *p Sham-DN vs. OVX-NT P<0,001 Sham-DN vs. OVX-ALE P<0,001 Sham-DN vs. OVX-RAL P=0,861 OVX-RAL vs. OVX-NT P <0,001 OVX-RAL vs. OVX-ALE P<0,001 OVX-ALE vs. OVX-NT P<0,001 *valores de P<0,05 denotam significância estatística 47 Tabela 3 - Teste ANOVA a dois fatores (medicamento x superfície) para ELCOI Fator de variação *p Superfície 0,261 Medicamento <0,001 Superfície x Medicamento 0,858 *valores de P<0,05 denotam significância estatística Tabela 4 - Test Tukey para os grupos experimentais de osteoporose (SHAM DN, OVX ST, OVX ALE e OVX RAL) nos dados de ELCOI Comparação (Grupos experimentais) *P Sham-DN vs. OVX-NT P<0,001 Sham-DN vs. OVX-ALE P<0,001 Sham-DN vs. OVX-RAL P=0,745 OVX-RAL vs. OVX-NT P <0,001 OVX-RAL vs. OVX-ALE P<0,001 OVX-ALE vs. OVX-NT 0,934 *valores de P<0,05 denotam significância estatística 48 1.8 Figuras Figura 1 – Aspecto clínico da fresagem realizada na tíbia das ratas antes da instalação do implante (A). Instalação do implante com chave digital (B). Implante instalado na tíbia do animal (C). 49 Figura 2 – Imagem da região periimplantar obtida através da microscopia confocal, padronizada para o cálculo de ELCOI, representada pela soma das linhas azuis. Considerou-se na análise ELCOI as linhas fluorescentes verdes (calceína) e vermelhas (alizarina) na interface osso/implante na região de terceira e quarta espiras do implante. 50 Figura 3 – Cortes histológicos mostrando o tecido ósseo envolvendo as espiras dos implantes usinados dos grupos experimentais SHAM DN (A), OVX ST (B), OVX ALE (C), e OVX RAL (D). Note o osso neoformado junto à superfície do implante, especialmente no grupo SHAM DN. Importante notar a quantidade considerável de osso medular, repleto de tecido adiposo, nos grupos OVX ST e OVX ALE. 51 Figura 4 – Cortes histológicos mostrando o tecido ósseo envolvendo as espiras dos implantes com superfície texturizada dos grupos experimentais SHAM DN (A), OVX ST (B), OVX ALE (C), e OVX RAL (D). Note o osso neoformado próximo junto às espiras do implante, especialmente no grupo SHAM DN. De modo similar aos implantes usinados, observa-se a quantidade considerável de osso medular, repleto de tecido adiposo, em especial nos grupos OVX ST e OVX ALE. 52 Figura 5 – Gráfico representativo dos resultados de torque reverso na comparação entre a instalação de implantes de superfície usinada e implantes de superfície texturizada nos diferentes grupos experimentais. 53 Figura 6 – Gráfico representativo dos resultados de ELCOI na comparação entre a instalação de implantes de superfície usinada e implantes de superfície texturizada nos diferentes grupos experimentais. 54 ANEXOS 55 1.9 Anexo A - Aprovação do Comitê de Ética no Uso de animais da Faculdade de Odontologia de Araçatuba 1.10 Anexo B- Normas para publicação do periódico IJOMS 56 IJOMS Guide for Authors Would authors please note that the reference style for the journal has now changed. Please pay special attention to the guidelines under the heading "References" below Authors wishing to submit their work to the journal are urged to read this detailed guide for authors and comply with all the requirements, particularly those relating to manuscript length and format. This will speed up the reviewing process and reduce the time taken to publish a paper following acceptance. Online Submission Submission and peer-review of all papers is now conducted entirely online, increasing efficiency for editors, authors, and reviewers, and enhancing publication speed. Authors requiring further information on online submission are strongly encouraged to view the system, including a tutorial, at External link http://ees.elsevier.com/ijoms A comprehensive Author Support service is available to answer additional enquiries at authorsupport@elsevier.com. Once a paper has been submitted, all subsequent correspondence between the Editorial Office (ijoms@elsevier.com) and the corresponding author will be by e-mail. Editorial Policy A paper is accepted for publication on the understanding that it has not been submitted simultaneously to another journal, has been read and approved by all authors, and that the work has not been published before. The Editors reserve the right to make editorial 57 and literary corrections. Any opinions expressed or policies advocated do not necessarily reflect the opinions and policies of the Editors. Declarations Upon submission you will be required to complete and upload the declarations page (pdf version or word version) to declare funding, conflict of interest and to indicate whether ethical approval was sought. This information must also be inserted into your manuscript under the acknowledgements section with the headings below. Upon submission you will be required to complete and upload this form (pdf version or word version) to declare funding, conflict of interest, and to indicate whether ethical approval and patient consent were sought. Lastly you must confirm that all authors have agreed to the submission. PLEASE NOTE that all funding must be declared at first submission, as the addition of funding at acceptance stage may invalidate the acceptance of your manuscript. Authorship All authors should have made substantial contributions to all of the following: (1) the conception and design of the study, or acquisition of data, or analysis and interpretation of data (2) drafting the article or revising it critically for important intellectual content (3) final approval of the version to be submitted. Normally one or two, and no more than three, authors should appear on a short communication, technical note or interesting case/lesson learnt. Full length articles may contain as many authors as appropriate. Minor contributors and non-contributory clinicians who have allowed their patients to be used in the paper should be acknowledged at the end of the text and before the references. 58 The corresponding author is responsible for ensuring that all authors are aware of their obligations. Before a paper is accepted all the authors of the paper must sign the Confirmation of Authorship form. This form confirms that all the named authors agree to publication if the paper is accepted and that each has had significant input into the paper. Please download the form and send it to the Editorial Office. (pdf version or word version) It is advisable that to prevent delay this form is submitted early in the editorial process. Acknowledgements All contributors who do not meet the criteria for authorship as defined above should be listed in an acknowledgements section. Examples of those who might be acknowledged include a person who provided purely technical help, writing assistance, or a department chair who provided only general support. Authors should disclose whether they had any writing assistance and identify the entity that paid for this assistance. Conflict of interest At the end of the main text, all authors must disclose any financial and personal relationships with other people or organisations that could inappropriately influence (bias) their work. Examples of potential conflicts of interest include employment, consultancies, stock ownership, honoraria, paid expert testimony, patent applications/registrations, and grants or other funding. If an author has no conflict of interest to declare, this should be stated. Role of the funding source All sources of funding should be declared as an acknowledgement at the end of the text. Authors should declare the role of study sponsors, if any, in the study design, in the collection, analysis and interpretation of data; in the writing of the manuscript; and in the 59 decision to submit the manuscript for publication. If the study sponsors had no such involvement, the authors should so state. Open access This journal offers you the option of making your article freely available to all via the ScienceDirect platform. To prevent any conflict of interest, you can only make this choice after receiving notification that your article has been accepted for publication. The fee of $3,000 excludes taxes and other potential author fees such as color charges. In some cases, institutions and funding bodies have entered into agreement with Elsevier to meet these fees on behalf of their authors. Details of these agreements are available at External link http://www.elsevier.com/fundingbodies. Authors of accepted articles, who wish to take advantage of this option, should complete and submit the order form (available at External link http://www.elsevier.com/locate/openaccessform.pdf). Whatever access option you choose, you retain many rights as an author, including the right to post a revised personal version of your article on your own website. More information can be found here: External link http://www.elsevier.com/authorsrights. Ethics Any manuscript concerned with human subjects, medical records, or human tissue that is submitted to the International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery should comply with the principles stated in the Declaration of Helsinki Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, adopted by the 18th World Medical Assembly, Helsinki, Finland, June 1964, and as amended most recently by the 64th World Medical Assembly, Fontaleza, Brazil, October 2013. The manuscript should contain a statement that the work has been approved by the appropriate Ethical Committee related to the institution(s) in which the work was performed, and that subjects gave informed consent to the work. The International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery requires institutional Ethics Committee approval 60 for all human studies. For retrospective studies of records either a statement of approval or a statement of exemption from the Committee is appropriate. This statement should be provided upon submission of the manuscript. Studies involving experiments with animals must state that their care was in accordance with institution guidelines. Patient confidentiality Patients have a right to privacy. Therefore identifying information, including patients' images, names, initials, or hospital numbers, should not be included in videos, recordings, written descriptions, photographs, and pedigrees unless the information is essential for scientific purposes and you have obtained written informed consent for publication in print and electronic form from the patient (or parent, guardian or next of kin where applicable). If such consent is made subject to any conditions, The Editor and Publisher must be made aware of all such conditions. Written consents must be provided to the Editorial Office on request. Even where consent has been given, identifying details should be omitted if they are not essential. If identifying characteristics are altered to protect anonymity, such as in genetic pedigrees, authors should provide assurance that alterations do not distort scientific meaning and editors should so note. If consent for publication has not been obtained, personal details of patients included in any part of the paper and in any supplementary materials (including all illustrations and videos) must be removed before submission. Language Editing Services Papers will only be accepted when they are written in an acceptable standard of English. Authors, particularly those whose first language is not English, who require information about language editing and copyediting services pre- and post-submission should visit External link http://www.elsevier.com/wps/find/authorshome.authors/languagepolishing or contact authorsupport@elsevier.com for more information. Please note, Elsevier 61 neither endorses nor takes responsibility for any products, goods or services offered by outside vendors through our services or in any advertising. For more information please refer to our Terms and Conditions External link http://www.elsevier.com/wps/find/termsconditions.cws_home/termsconditions. Article Types The following contributions will be accepted for publication. Please take careful note of the maximum length where applicable. Overlength articles will be returned to the authors without peer review: • editorials (commissioned by the editor) • clinical papers: no more than 5000 words and 30 references • research papers: no more than 6000 words and 40 references • review papers - no limit on length or number of references • technical notes (surgical techniques, new instruments, technical innovations) - no more than 2000 words, 10 references and 4 figures • case reports - no more than 2000 words, 10 references and 2 figures • book reviews • letters to the editor - please see detailed guidelines provided at the end of the main guide for authors • IAOMS announcements • general announcements. Please note: Case reports will be considered for publication only if they add new information to the existing body of knowledge or present new points of view on known diseases. All authors must have contributed to the paper, not necessarily the patient treatment. Technical notes and case reports are limited to a maximum of 4 authors, in exceptional circumstances, 5. 62 Criteria for Publication Papers that will be considered for publication should be: • focused • based on a sound hypothesis and an adequate investigation method analysing a statistically relevant series, leading to relevant results that back the conclusion • well written in simple, scientific English grammar and style • presented with a clear message and containing new information that is relevant for the readership of the journal • Note the comment above relating to case reports. Following peer-review, authors are required to resubmit their revised paper within 3 months; in exceptional circumstances, this timeline may be extended at the editor's discretion. Presentation of Manuscripts General points Papers should be submitted in journal style. Failure to do so will result in the paper being immediately returned to the author and may lead to significant delays in publication. Spelling may follow British or American usage, but not a mixture of the two. Papers should be double-spaced with a margin of at least 3 cm all round. Each line must be numbered. Format Observational or Case Cohort Studies, as well as Case Series must be presented in conformance with STROBE guidelines: External link www.strobe-statement.org Randomized Controlled Trials must be presented in conformance with CONSORT guidelines: External link www.consort-statement.org Systematic Reviews and Meta-Analyses must be presented according to PRISMA guidelines: External link www.prisma-statement.org 63 Papers should be set out as follows, with each section beginning on a separate page: • title page • abstract • text • acknowledgements • references • tables • captions to illustrations. Please note that the qualifications of the authors will not be included in the published paper and should not be listed anywhere on the manuscript. Title page The title page should give the following information: • title of the article • full name of each author • name and address of the department or institution to which the work should be attributed • name, address, telephone and fax numbers, and e-mail address of the author responsible for correspondence and to whom requests for offprints should be sent • sources of support in the form of grants • key words. If the title is longer than 40 characters (including spaces), a short title should be supplied for use in the running heads. Abstract 200 words maximum. Do not use subheadings or abbreviations; write as a continuous paragraph. Must contain all relevant information, including results and conclusion. Text 64 Please ensure that the text of your paper conforms to the following structure: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion. There is no separate Conclusion section. There should be no mention of the institution where the work was carried out, especially in the Materials and Methods section. Introduction • Present first the nature and scope of the problem investigated • Review briefly the pertinent literature • State the rationale for the study • Explain the purpose in writing the paper • State the method of investigation and the reasons for the choice of a particular method •; Should be written in the present tense Materials and Methods • Give the full details, limit references • Should be written in the past tense • Include exact technical specifications, quantities and generic names • Limit the number of subheadings, and use the same in the results section • Mention statistical method • Do not include results in this section Results • Do not describe methods • Present results in the past tense • Present representations rather than endlessly repetitive data • Use tables where appropriate, and do not repeat information in the text Discussion • Discuss - do not recapitulate results • Point out exceptions and lack of correlations. Do not try to cover up or 'fudge' data • Show how results 65 agree/contrast with previous work • Discuss the implications of your findings • State your conclusions very clearly Headings: Headings enhance readability but should be appropriate to the nature of the paper. They should be kept to a minimum and may be removed by the Editors. Normally only two categories of headings should be used: major ones should be typed in capital letters; minor ones should be typed in lower case (with an initial capital letter) at the left hand margin. Quantitative analysis: If any statistical methods are used, the text should state the test or other analytical method applied, basic descriptive statistics, critical value obtained, degrees of freedom, and significance level, e.g. (ANOVA, F=2.34; df=3,46; P<0.001). If a computer data analysis was involved, the software package should be mentioned. Descriptive statistics may be presented in the form of a table, or included in the text. Abbreviations, symbols, and nomenclature: Only standardized terms, which have been generally accepted, should be used. Unfamiliar abbreviations must be defined when first used. For further details concerning abbreviations, see Baron DN, ed. Units, symbols, and abbreviations. A guide for biological and medical editors and authors, London, Royal Society of Medicine, 1988 (available from The Royal Society of Medicine Services, 1 Wimpole Street, London W1M 8AE, UK). The minus sign should be -. If a special designation for teeth is used, a note should explain the symbols. Scientific names of organisms should be binomials, the generic name only with a capital, and should be italicised in the typescript. Microorganisms should be named according to the latest edition of the Manual of Clinical Microbiology, American Society of Microbiology. Drugs: use only generic (non-proprietary) names in the text. Suppliers of drugs used may be named in the Acknowledgments section. Do not use 'he', 'his' etc where the sex of the 66 person is unknown; say 'the patient' etc. Avoid inelegant alternatives such as 'he/she'. Patients should not be automatically designated as 'she', and doctors as 'he'. References The journal's reference style has changed. References should be numbered consecutively throughout the article, beginning with 1 for the first-cited reference. References should be listed at the end of the paper in the order in which they appear in the text (not listed alphabetically by author and numbered as previously). The accuracy of references is the responsibility of the author. References in the text should be numbered with superscript numerals inside punctuation: for example "Kenneth and Cohen14 showed..."; "each technique has advantages and disadvantages5-13." Citations in the text to papers with more than two authors should give the name of the first author followed by "et al."; for example: "Wang et al37 identified..." All references cited in the text must be included in the list of references at the end of the paper. Each reference listed must include the names of all authors. Please see section "Article Types" for guidance on the maximum number of reference for each type of article. Titles of journals should be abbreviated according to Index Medicus (see www.nlm.nih.gov.uk) . When citing papers from monographs and books, give the author, title of chapter, editor of book, title of book, publisher, place and year of publication, first and last page numbers. Internet pages and online resources may be included within the text and should state as a minimum the author(s), title and full URL. The date of access should be supplied and all URLs should be checked again at proof stage. Examples: 67 Journal article: Halsband ER, Hirshberg YA, Berg LI. Ketamine hydrochloride in outpatient oral surgery. J Oral Surg 1971: 29: 472-476. When citing a paper which has a Digital Object Identifier (DOI), use the following style: Toschka H, Feifel H. Aesthetic and functional results of harvesting radial forearm flap. Int J Oral Maxillofac Surg 2001: 30: 45-51. doi: 10.1054/ijom.2000.0005 Book/monograph: Costich ER, White RP. Fundamentals of oral surgery. Philadelphia: WB Saunders, 1971: 201-220. Book chapter: Hodge HC, Smith FA. Biological properties of inorganic fluorides. In: Simons JH, ed.: Fluorine chemistry. New York: Academic Press, 1965: 135. Internet resource: International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals. External link http://www.icmje.org [Accessibility verified March 21, 2008] Tables Tables should be used only to clarify important points. Double documentation in the form of tables and figures is not acceptable. Tables should be numbered consecutively with Arabic numerals. They should be double spaced on separate pages and contain only horizontal rules. Do not submit tables as photographs. A short descriptive title should appear above each table, with any footnotes suitably identified below. Care must be taken to ensure that all units are included. Ensure that each table is cited in the text. Figures All illustrations (e.g. graphs, drawings or photographs) are considered to be figures, and should be numbered in sequence with Arabic numerals. Each figure should have a caption, typed double-spaced on a separate page and numbered correspondingly. The minimum resolution for electronically generated figures is 300 dpi. 68 Line illustrations: All line illustrations should present a crisp black image on an even white background (127 x 178 mm (5 x 7 in), or no larger than 203 x 254 mm (8 x 10 in). The size of the lettering should be appropriate, taking into account the necessary size reduction. Photographs and radiographs: Photomicrographs should show magnification and details of any staining techniques used. The area(s) of interest must be clearly indicated with arrows or other symbols. Colour images are encouraged, but the decision whether an illustration is accepted for reproduction in colour in the printed journal lies with the editor-in-chief. Figures supplied in colour will appear in colour in the online version of the journal. Size of photographs: The final size of photographs will be: (a) single column width (53 mm), (b) double column width (110 mm), (c) full page width (170 mm). Photographs should ideally be submitted at the final reproduction size based on the above figures. Funding body agreements and policies Elsevier has established agreements and developed policies to allow authors who publish in Elsevier journals to comply with potential manuscript archiving requirements as specified as conditions of their grant awards. To learn more about existing agreements and policies please visit External link http://www.elsevier.com/fundingbodies Proofs One set of page proofs in PDF format will be sent by e-mail to the corresponding author, which they are requested to correct and return within 48 hours. Elsevier now sends PDF proofs which can be annotated; for this you will need to download Adobe Reader version 7 available free from External link http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. Instructions on how to annotate PDF files will accompany the proofs. The exact system requirements are given at 69 the Adobe site: External link http://www.adobe.com/products/acrobat/acrrsystemreqs.html#70win. If you do not wish to use the PDF annotations function, you may list the corrections (including replies to the Query Form) and return to Elsevier in an e-mail. Please list your corrections quoting line number. If, for any reason, this is not possible, then mark the corrections and any other comments (including replies to the Query Form) on a printout of your proof and return by fax, or scan the pages and e-mail, or by post. Please use this proof only for checking the typesetting, editing, completeness and correctness of the text, tables and figures. Significant changes to the article as accepted for publication will only be considered at this stage with permission from the Editor. We will do everything possible to get your article published quickly and accurately. Therefore, it is important to ensure that all of your corrections are sent back to us in one communication: please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is received. Offprints The corresponding authorwill be provided , at no cost, with a PDF file of the article via e- mail. The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use. Additional paper offprints can be ordered by the authors. An order form with prices will be sent to the corresponding author. Accepted Articles For the facility to track accepted articles and set email alerts to inform you of when an article's status has changed, visit: External link http://authors.elsevier.com/TrackPaper.html There are also detailed artwork guidelines, copyright information, frequently asked questions and more. Contact details for questions 70 arising after acceptance of an article, especially those related to proofs, are provided after registration of an article for publication. Instructions for Letters to the Editor The IJOMS welcomes Letters to the Editor. To facilitate submission of the highest quality of Letters to the Editor, the following guidelines should be followed: 1. Letters are meant to be focus pieces and, therefore, are limited to no more than 600 words, 6 references and a maximum of 2 figures. One reference should include a reference to the IJOMS article being addressed. 2. It is recommended that you limit your letter to one or two important and critical points to which you wish to provide a clear and precise discussion regarding the previously published article. 3. One should support all assertion by peer review literature which should be a primary research or large clinical studies rather than a case report. 4. Please include any financial disclosures at the end of the letter. This would include the potential conflicts of interest not just related to the specific content of your letter but also the content of the IJOMS article and other related areas. 5. Please recognize that letters that are essentially in agreement with the author's findings and offer no additional insights provide little new information for publication. Likewise, letters that highlight the writer's own research or are otherwise self promotional will receive a low publication priority. 6. There may be a need for additional editing. Should editing be required the letter will be sent back to the author for final approval of the edited version. 7. It is important to use civil and professional discourse. It is not advisable that one adopt a tone that may be misconstrued to be in anyway insulting. 8. Finally, it is not advisable to provide a letter that is anecdotal. While personal experiences can have great value in patient care, it is generally not strong evidence to be placed in a letter to the editor. 71 72 Capítulo 2 Dinâmica do processo de reparo ósseo periimplantar durante o tratamento com alendronato de sódio ou raloxifeno em ratas osteoporóticas ** **Este artigo foi formatado de acordo com as normas do periódico Clinical Oral Implants Research 73 Título: Dinâmica do processo de reparo ósseo periimplantar durante o tratamento com alendronato de sódio ou raloxifeno em ratas osteoporóticas Autores: Gabriel Ramalho-Ferreira DDS, MSca, Leonardo Perez Faverani DDS, MSc, PhDa; Tárik Ocon Braga Polo DDS, MSca, Tetuo Okamoto DDS, MSc, PhDb e Roberta Okamoto DDS, MSc, PhDb a Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada, Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Univ Estadual Paulista (UNESP), São Paulo, Brasil. b Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Univ Estadual Paulista (UNESP), São Paulo, Brasil. Autor para correspondência: Leonardo Perez Faverani Rua Jose Bonifacio, 1193 / Cep: 16015-050 Telefone: (+55) 18 3636-3270 Email: leobucomaxilo@gmail.com 74 Resumo Objetivos: Avaliar a taxa de remodelação do tecido ósseo durante o processo de reparo periimplantar em ratas osteoporóticas tratadas com medicamentos da classe dos bifosfonatos e moduladores de receptores de estrógeno. Materiais e Métodos: 72 ratas foram divididas em 2 grupos segundo às análises propostas (imunoistoquímica e fuorocromos), e 4 sub-grupos (n = 6) em função da osteoporose induzida e das medicações utilizadas: OVX, ratas ovariectomizadas e alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato; SHAM - ratas submetidas à cirurgia fictícia de ovariectomia e alimentadas com dieta balanceada; ALE - ratas ovariectomizadas, alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato e tratadas com alendronato e, RAL - ratas ovariectomizadas, alimentadas com dieta pobre em cálcio e fosfato e tratadas com raloxifeno. Oito dias após a ovariectomia e cirurgias SHAM iniciou-se o tratamento com raloxifeno (RAL) ou alendronato (ALE) em dois dos sub-grupos. Após 30 dias da administração das medicações, foi instalado um implante de superíficie texturizada com duplo ataque ácido em cada tíbia das ratas. Para a imunomarcação de osteoprotegerina (OPG), RANKL, TRAP e osteocalcina (OC), 24 ratas foram submetidas à eutanásia aos 14 e 42 dias após a instalação dos implantes. As demais 24 ratas, aos 52 dias após a ovariectomia, receberam pela via intramuscular 20 mg/kg de calceína e no 80o dia, 20 mg /kg de vermelho de alizarina. A eutanásia foi realizada aos 60 dias após a instalação dos implantes. As peças para imunoistoquímica foram incluídas em parafina e para a microscopia confocal, em resina fotopolimerizável. Foi calculada a área de osso marcada pelos fluorocromos (calceína e alizarina), nos diferentes grupos experimentais por meio 75 do programa Image J. Os dados foram submetidos ao teste estatístico ANOVA 2 fatores e para os dados com significância estatística, foi aplicado o teste Tukey, com p<0,05. Resultados: A dinâmica óssea periimplantar foi superior estatisticamente nos grupos SHAM e RAL em comparação aos demais grupos, em que ambos apresentaram maior área óssea periimplantar para o vermelho de alizarina e menor para a calceína (p<0,05). Não houve diferença entre os grupos SHAM e RAL, bem como nas interações entre ALE e OVX (p>0,05) para as expressões dos fluorocromos. As imunomarcações de OPG e RANKL foram similares para os grupos RAL e SHAM; houve moderada expressão de OC precocemente (14 dias). A TRAP foi marcada intensamente aos 42 dias para o grupo OVX e para o grupo ALE, foi marcada levemente aos 42 dias. Conclusões: Raloxifeno melhorou a dinâmica óssea periimplantar de ratas osteoporóticas, indicando-se sua utilização no tratamento da osteoporose. Palavras-chave: osteoporose, implantes dentários, alendronato, raloxifeno, microscopia. 76 Abstract Objectives: To evaluate the bone remodeling rate during the peri-implant healing process in osteoporotic rats treated with drugs of the class of bisphosphonates and selective estrogen receptor modulators. Materials and Methods: 72 rats were divided into 2 groups according to the proposed analysis (immunohistochemistry and fuorocromos), and 4 sub groups (n = 6) depending on the induced osteoporosis and medications used: OVX, and ovariectomized rats fed with low-calcium and phosphate diet; SHAM - rats subjected to sham surgery and fed with a balanced diet; ALE - ovariectomized rats fed diet low in calcium and phosphate and treated with alendronate and RAL - ovariectomized rats fed with a diet low in calcium and phosphate and treated with raloxifene. Eight days after ovariectomy and sham surgeries treatment with raloxifene (RAL) or alendronate (ALE) began in two sub groups. After 30 days of administration of medications, a surface treated implant with double acid attack was installed on each tibia of rats. For immunostaining of osteoprotegerin (OPG), RANKL, TRAP and osteocalcin (OC), 24 rats were euthanized at 14 and 42 days after implant placement. The other 24 rats at day 52 after ovariectomy, received intramuscularly 20 mg / kg calcein on the 80th day and 20 mg / kg of alizarin red. The animals were sacrificed at 60 days after implant placement. The pieces to immunohistochemistry were embedded in paraffin, and to confocal microscopy in photopolymerizable resin. The bone area marked by fluorochromes (calcein and alizarin) was calculated, in the different experimental groups through the program Image J. The data were submitted to ANOVA 2 factors and to the statistically significant data, the Tukey test was applied, with p <0.05. 77 Results: The peri-implant bone dynamics was statistically higher in SHAM and RAL groups compared to the other groups, in which both showed higher peri-implant bone area for alizarin red and lowest for calcein (p <0.05). There was no difference between SHAM and RAL groups as well as the interactions between ALE and OVX (p> 0.05) for the expressions of fluorochromes. The immunostaining of OPG and RANKL were similar to RAL and SHAM groups; OC expression was moderate early (14 days). TRAP was marked intensely at 42 days for the OVX group, and the ALE group was lightly marked at 42 days. Conclusions: Raloxifene improved dynamic peri-implant bone osteoporotic rats, indicating its use in the treatment of osteoporosis. Keywords: osteoporosis, dental implants, alendronate, raloxifene, microscopy. 78 2.1 Introdução O uso de implantes dentários para a reabilitação dos pacientes parcial ou totalmente edêntulos promoveu substancial melhora na qualidade de vida dos indivíduos, uma vez que a mastigação é um fator fundamental para o correto funcionamento do sistema estomatognático (Menassa, et al. 2014, Yao, et al. 2014). O aumento da expectativa de vida da população promoveu o crescimento da procura de pacientes idosos ao atendimento odontológico (Maihofer 2014). A senilidade associada às alterações hormonais, a desnutrição, a desidratação, bem como as doenças sistêmicas que interferem no metabolismo ósseo podem aumentar a falha do tratamento com implantes ossseointegráveis (Busenlechner, et al. 2014, Chen, et al. 2013). Dentre as alterações sistêmicas observadas, a osteoporose é considerada um problema de saúde pública em nível mundial (Fujiwara, et al. 2014). Conceitualmente, é caracterizada pela diminuição da massa óssea e deteriorização microestrutural do tecido ósseo (Prestwood & Kenny 1998). A incidência da osteoporose aumenta com a idade e é maior nas mulheres quando comparado com os homens, devido à deficiência de estrógeno no período pós- menopausa (Yoshimura, et al. 2009). Estudos clínicos prospectivos e ensaios clínicos randomizados evidenciaram menor taxa de sobrevivência dos implantes dentários nos pacientes com osteoporose, com predileção pela mandíbula, tendo em vista que o arranjo estrutural do tecido ósseo da maxila permite uma alta taxa de vascularização frente a uma menor densidade óssea, favorecendo a osseointegração nessas situações (Busenlechner, Furhauser, Haas, Watzek, Mailath & Pommer 2014, Chen, Liu, Xu, Qu & Lu 2013). Entretanto, os estudos não 79 apresentam um consenso a este respeito e ainda não existe um protocolo de tratamento padronizado para os pacientes com osteoporose e irão ser reabilitados com os implantes dentários. Atualmente a terapia anti-osteoporose tem sido realizada com medicações que reduzem a taxa de reabsorção, principalmente os bifosfonatos administrados pela via oral com destaque para o alendronato de sódio (Giro, Coelho, Pereira, Jorgetti, Marcantonio & Orrico 2011). Outra classe de medicamentos consiste nos moduladores seletivos dos receptores de estrógeno, sendo o cloridrato de raloxifeno, o único medicamento deste grupo aprovado pela FDA (Food and Drug Administration) nos Estados Unidos da América para o tratamento da osteoporose. Sua atuação ocorre de maneira seletiva aos receptores de estrógeno presentes também nos osteoblastos, regulando o mecanismo de reabsorção em nível hormonal (Glosel, Kuchler, Watzek & Gruber 2010). O efeito da osteoporose sobre a dinâmica do tecido ósseo é um aspecto de grande relevância para o sucesso na resposta de osseointegração após a instalação dos implantes. A ação destas medicações, interferindo especialmente nas respostas de reabsorção do tecido ósseo pode interferir de forma positiva na dinâmica óssea periimplantar de pacientes portadores desta interferência sistêmica. Com o intuito de acelerar o processo de reparo ósseo na interface osso/implante, além de favorecer a adesão de células da linhagem osteoblástica, em especial em ossos com menor densidade, como ocorre na osteoporose, a engenharia tecidual desenvolveu modificações na topografia dos implantes dentários, por meio de diversas técnicas de adição ou subtração físico-químicas (Albrektsson & Wennerberg 2004, Buser, Broggini, 80 Wieland, Schenk, Denzer, Cochran, Hoffmann, Lussi & Steinemann 2004, Ivanoff, et al. 2001, Tavares, de Oliveira, Nanci, Hawthorne, Rosa & Xavier 2007, Wennerberg & Albrektsson 2009, Wennerberg & Albrektsson 2011, Xavier, Carvalho, Beloti & Rosa 2003). Sendo assim, a utilização de implantes com superfícies texturizadas tornou-se mandatória (Albrektsson & Wennerberg 2004, Wennerberg & Albrektsson 2011). Portanto, o objetivo deste estudo foi analisar os mecanismos da dinâmica óssea periimplantar de ratas osteoporóticas, tratadas com alendronato de sódio, raloxifeno, submetidas à cirurgia fictícia de ovariectomia (SHAM), ou osteoporóticas sem tratamento medicamentoso. Foi hipotetizado que