RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 17/05/2020. MARAYLLA INÁCIO DE MORAES Hidratação enzimática de nitrilas pela enzima Nitrila Hidratase (NHase) para a obtenção de amidas Orientadora: Profa. Dra. Cíntia Duarte de Freitas Milagre Araraquara 2019 Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Química. FICHA CATALOGRÁFICA M827h Moraes, Maraylla Inácio de Hidratação enzimática de nitrilas pela enzima Nitrila Hidratase (NHase) para a obtenção de amidas / Maraylla Inácio de Moraes. – Araraquara : [s.n.], 2019 122 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Cíntia Duarte de Freitas Milagre 1. Biocatálise. 2. Química verde. 3. Clonagem. 4. Nitrilas. 5. Expressão gênica. I. Título. Bibliotecária Responsável: Ana Carolina Gonçalves Bet - CRB/8 8315 DADOS CURRICULARES Identificação Nome: Maraylla Inácio de Moraes Nome em citações bibliográficas: MORAES, M.I. Formação Acadêmica - Graduada no curso de Licenciatura em Química pela Universidade Estadual do Piauí (UESPI) no período de 2005 a 2009. - Mestre em química orgânica, área de concentração: Química Orgânica, Título: “Biorredução de aldeídos e cetonas utilizando células íntegras de espécies vegetais cultivadas no estado do Piauí”, sob a orientação da Profa. Dra. Allana Kellen Lima Santos, na Universidade Federal do Piauí (UFPI), no período de 2013 a 2015 com bolsa da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Piauí (FAPEPI). - Curso de pós-graduação modalidade Doutorado em química, área de concentração: Química Orgânica, Título: “Hidratação enzimática de nitrilas pela enzima Nitrila Hidratase (NHase) na obtenção de amidas” sob a orientação da Profa. Dra. Cíntia Duarte de Freitas Milagre, no Instituto de Química, UNESP, Araraquara, no período de 2015 a 2019 com bolsa da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Estágios e Bolsas auxílio - Bolsa de mestrado no período de 2013 a 2015, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Piauí (FAPEPI). - Bolsa de Doutorado no período de 2016 a 2019, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). - Bolsa Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior, PDSE/CAPES, processo (88881.134096/2016-01). - Programa de Estágio Docente na disciplina Química Orgânica I sob a orientação da Profa. Dra. Allana Kellen Lima Santos na Universidade Federal do Piauí, 2013. - Programa de Estágio Docente na disciplina Química Orgânica Experimental sob a orientação da Profa. Dra. Cíntia Duarte de Freitas Milagre no Instituto de Química, UNESP, Araraquara, 2016. https://linhadireta.capes.gov.br/linhadireta/admin/processo/index.seam?conversationId=5282 PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Livros e Capítulos MILAGRE, C. D. F.; SANTOS, L. S.; MORAES, M. I.; CRUZ, R. S. Biocatálise: estratégias para obtenção de substâncias bioativas. In: Lourdes Campaner dos Santos; Maysa Furlan; Marcelo Rodrigues de Amorim. (Org.). Produtos naturais bioativos. 1ed. São Paulo: Cultura Acadêmica, 2016, v. 1, p. 197-228. Depósito da sequência de aminoácidos MORAES, M. I.; AMARAL, B. S.; IGLESIAS, C.; MILAGRE, C.D. F.; GIORDANO, S.R. Deposito da sequência de aminoácidos do gene NHase de R.erythropolis ATCC 4277 ao GenBank (nº de acesso MH732727, MH 732728 e MH732729). Artigo para publicação MORAES, M. I.; IGLESIAS, C.; MILAGRE, C. D. F.; GIORDANO, S. R. Biotransformations of nitriles mediated by in vivo nitrile hydratase of Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 heterologous expressed in E. coli. Molecular Catalysis (para submissão). Apresentação de Trabalhos em Congressos MORAES, M. I.; AMARAL, B. S.; IGLESIAS, C.; MILAGRE, C.D. F.; GIORDANO, S.R. Clonado y expresión de nuevas NHase: Una herramienta importante en la síntesis de amidas de interés industrial. 5º Encuentro Nacional de Química (Enaqui), 2017, Montevideo. MORAES, M. I.; IGLESIAS, C.; GIORDANO, S.R.; MILAGRE,C.D.F. Biotransformations of nitriles mediated by nitrile hydratase of Rhodococcus erythropolis heterologous expressed in E. coli. 1st Brazilian Symposium on Sustainable Chemistry (BSSC-I), 2018, São Pedro/SP. SARAIVA, E.S; MORAES, M. I.; LEMOS,T.L.G.; Pereira, A.K.L.S. Determinação da composição e do teor de ácidos graxos no óleo fixo das folhas de Hematanthus drasticus (Mart.) Plumel. 9º Simpósio Nacional de Biocambustíveis, 2016, Teresina. MORAES, M. I.; MATOS, J. M. E.; VIEIRA, E.C.; VIANA, C. C.; NOBRE, F. X.; SANTOS, A.K.L. Biotransformação de compostos carbonílicos utilizando células íntegras de Morinda citrifolia Linn. II Encontro Estratégico em Ciências Farmacêutica, 2015, Teresina. AQUINO, T. P. B.; MORAES, M. I.; PAIVA, G. M. S. ; SILVA, D. M. L. C. . Análise http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 do uso de fóruns de discussão no ensino e aprendizagem da disciplina Química Orgânica I. Congresso Brasileiro de Química, 2014, Natal/ RN. SOARES, S. H.; MORAES, M. I.; MATOS, J. M. E.; VIEIRA, E.C.; SANTOS, A. K. L.; CITO, A. M. G. L. 'Utilização de Alpiste (Phalaris canariesis) em reações de biotransformação'. Congresso Brasileiro de Química, 2014, Natal/ RN. MORAES, M. I.; SOARES, S. H.; VIANA, C. C.; NOBRE, F. X.; MATOS, J. M. E.; VIEIRA, E. C.; MACHADO, L. L.; SANTOS, A. K. L. Biocatálise utilizando células integras de Amendoim (Arachis hypogaeal). Congresso Brasileiro de Química, 2014, Natal/ RN. SOARES, S. H.; MORAES, M. I.; CITO, A. M. G. L.; MATOS, J. M. E.; VIEIRA, E. C.; SANTOS, A. K. L. Samanea tubulosa e Morinda citrifolia como biocatalisadores em reações com benzaldeído. Congresso Brasileiro de Química, 2014, Natal/ RN. MORAES, M. I.; SOARES, S. H.; MATOS, J. M. E.; VIEIRA, E. C.; MACHADO, L. L.; SANTOS, A. K. L. Biotransformação de compostos carbonílicos utilizando células íntegras de sementes de Girassol (Helianthus annus). Congresso Brasileiro de Química, 2014, Natal/ RN. MORAES, M. I.; AQUINO, T. P. B.; PAIVA, G. M. S.; SILVA, D. M. L. C.; SILVA, L. K. R.; ARAUJO, M. M. Uma prospecção do tema Química verde na revista Química nova on-line no período de 2000 à 2012.11º Simpósio Brasileiro de Educação Química, 2013, Teresina. AQUINO, T. P. B.; MORAES, M. I.; PAIVA, G. M. S.; SILVA, D. M. L. C.; SILVA, L. K. R.; ARAUJO, M. M. Química Verde: Uma abordagem sobre a formação ambiental do licenciado.11º Simpósio Brasileiro de Educação Química, 2013, Teresina. AQUINO, T. P. B.; PAIVA, G. M. S.; MORAES, M. I.; SILVA, D.M.L C.; ARAUJO, M. M.; NASCIMENTO, L.A. Fotonovela: Trabalhando conceitos químicos de forma lúdica.11º Simpósio Brasileiro de Educação Química, 2013, Teresina. ARAUJO, M. M.; SILVA, L. K. R.; NASCIMENTO, L. A.; MORAES, M. I.; PAIVA, G. M. S.; AQUINO, T. P. B. O uso da internet por alunos de escolas públicas de Teresina-PI: Um caminho para novas metodologias no ensino de Química.. In: 11º Simpósio Brasileiro de Educação Química, 2013, Teresina. PEREIRA, A. B.; SOARES, S. H.; RAMOS, T. F; MORAES, M. I.; SANTOS, A. K. L. Prática de ensino de Química no ensino médio em escolas da rede pública de Campinas-PI.11º Simpósio Brasileiro de Educação Química, 2013, Teresina. SOARES, S. H.; MORAES, M. I.; MACHADO, L. L.; LEMOS, T. L. G.; SANTOS, http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 A.K.L. Hidrólise de éster aromático catalisada por células integras de macaúba (Acrocomia aculeata). 53º Congresso Brasileiro de Química, 2013, Rio de Janeiro. MORAES, M. I.; NASCIMENTO, L. A.; PAIVA, G. M. S.; SILVA, D. M. L. C.; AQUINO, T. P. B. Importância da biocatálise na química verde. I Congresso Regional dos Estudantes de Química, 2013, Teresina. SOARES, S. H.; MORAES, M. I.; MACHADO, L. L. ; LEMOS, T. L. G.; SANTOS, A. K. L. Biorreduções utilizando células integras de macaúba (Acrocomia aculeata). 53º Congresso Brasileiro de Química, 2013, Rio de Janeiro. Participação em bancas de trabalho de conclusão de curso MATOS, J. M. E; MORAES, M. I.; ARAUJO, S. B. Participação em banca de Lília Verônica Cardoso Cunha."Nanotubos de carbono e algumas aplicações". 2015. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Química)-Universidade Federal do Piauí. MATOS, J. M. E.; MORAES, M. I.; COSTA, I. C. G. Participação em banca de Janiele Pinto de Sousa. “Utilização de cromatografia líquida na separação de enantiômeros”. 2015. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Química) -Universidade Federal do Piauí. SANTOS, A. K. L.; MORAES, M. I.; SILVA, D. Participação em banca de Katiana Lima do Patrocinio. “Química sustentável: O biodiesel e os diversos produtos obtidos através do glicerol-Um estudo de revisão”. 2014. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Química) - Universidade Federal do Piauí. SANTOS, A. K. L.; MORAES, M. I.; MATOS, J. M. E.; MOURA, C. V. R. Participação em banca de Espedito de Sousa Saraiva. “Biotransformação utilizando células íntegras de sementes de vegetais da família Fabaceae cultivadas no estado do Piauí”. 2014. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Química) - Universidade Federal do Piauí. Participação em Eventos 5º Encuentro Nacional de Química (Enaqui), 2017. 1º Workshop de Inovação e Empreendedorismo do Instituto de Química, 2016. Mulheres na Ciência 2016: o Gênero na Pós-Graduação, 2016. Workshop "Inovações em análise de Enantiômeros", 2016. http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 http://lattes.cnpq.br/5236171154841141 34° Congresso Brasileiro de Química, 2014. I- Curso de Geoquímica Orgânica: Fundamentos e Aplicações da cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, 2014. 11º Simpósio Brasileiro de Química, 2013. I Congresso Regional dos Estudantes de Química, 2013. Organização de eventos - Integrante da equipe de apoio do festival internacional de divulgação científica Pint of Science, Araraquara, 2017 e 2018. Coorientação concluída Luana Alves Galvão de Souza. Imobilização de nitrila hidratases em matrizes poliméricas visando o aumento da estabilidade enzimática. 2017. Iniciação Científica - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Estágio no Exterior Estágio na Universidad de La República, Montevideo, Uruguai, 2017, para realização do projeto “Clonagem e expressão de nitrilas hidratases dos catalinismos Klebsiella e Rhodococcus”. Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior, CAPES, processo 88881.134096/2016-01, com supervisão da Profa. Dra. Sonia Rodriguez Giordano. https://linhadireta.capes.gov.br/linhadireta/admin/processo/index.seam?conversationId=5282 Para Caio com muito amor AGRADECIMENTOS Aos meus pais, por acreditarem em mim e depositarem tanta confiança. Mãe você é o meu maior exemplo de amor e dedicação. Aos meus irmãos Diego e Solano, mesmo longe estavam me apoiando e ajudando. Ao Caio, razão da minha vida. Eu te amo muito. À Profa. Dra. Cíntia Duarte de Freitas Milagre, pela orientação, compreensão, paciência, aprendizado e amizade. Serei eternamente grata pela confiança depositada em mim. Ao Prof. Dr. Humberto M. S. Milagre, pelas contribuições neste trabalho e para a minha formação. Aos colegas de laboratório Íris, Gabriel, Laíza, Lucas e Thayna pela convivência, discussões e momentos descontraídos. À Profa. Dra. Sonia Rodrigues pela oportunidade de desenvolver meu estágio de doutorado sanduiche em seu grupo de pesquisa. Obrigada pelo constante acompanhamento no laboratório e dedicação em ensinar-me. Agradeço, também, aos amigos do laboratório 12, Ariel, Agustin, César, Diego, Gabriela, Luís, Mariana, Maria Inés, Nicol, Virginia, Valentina, María Eugenia e Martin, por terem me recebido de braços abertos. Aos meus amigos Cibele, Erika, João, Isabella, Luís Paulo, Túlio, Maxsuelen e Vitor, sem os quais não imagino como seria essa minha jornada. Ao Instituto de Química e Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, pela oportunidade e infraestrutura concedidas. À CAPES pela bolsa concedida e pela manutenção do Portal de Periódicos, essencial para que essa pesquisa fosse realizada. À CAPES-PDSE pela bolsa de estágio no exterior. Ao CERSusChem e INCT-BioNat pelo auxílio financeiro ao grupo de pesquisa. Aos técnicos e funcionários do IQ, Naira, Alberto, Marquinhos, Nivaldo e Lucinéia. À Profa. Dra. Isabele Rodrigues Nascimento pelas análises no polarímetro e HPLC. À Profa. Dra. Lourdes Campaner dos Santos pela coluna de HPLC emprestada. À doutoranda Camila Luiza Cunha pelo auxílio com os equipamentos. A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. “Só é verdadeiramente digno da liberdade, bem como da vida, aquele que se empenha em conquistá-la”. (Johann Goethe) RESUMO Reações catalisadas enzimaticamente constituem uma alternativa ambientalmente atrativa em relação a catálise metálica e organometálica, pois utiliza catalisadores biodegradáveis e oriundos de fontes renováveis, oferecendo ferramentas apropriadas para a transformação de substâncias naturais ou sintéticas levando-se em conta os preceitos da Química Verde. Neste trabalho, foi realizada a clonagem do gene nitrila hidratase (subunidades α e β e gene ativador) de Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 e Klebisella oxytoca via metodologia de clonagem livre de restrição e posterior expressão em E. coli para realização de reações de biotransformação. A análise da especificidade do substrato da NHase tipo Fe de R. erythropolis ATCC 4277 indica que este aceita uma diversidade de nitrilas. As nitrilas alifáticas foram hidratadas com conversões acima de 99%, com exceção da acrilonitrila. As nitrilas aromáticas foram hidratadas com conversões que variaram de 1% a 88%. As células inteiras de E. coli recombinante hidrataram o 1,4-fenilenodiacetonitrila com elevada regiosseletividade, enquanto o excesso enantiomérico das nitrilas aromáticas 2- amino-2-(4-fluorofenil) acetonitrila e 2-fenilbutironitrila foram de 7% e 60%, respectivamente. A clonagem do gene NHase de Klebisella oxytoca não foi observada. A segunda etapa deste trabalho consistiu na síntese de 4- (cianometil)benzenoacetanamida, um intermediário importante na síntese de compostos de interesse industrial e utilizado como material de partida em reações de Grignard e transamidação. Uma coleção de enzimas do tipo NHase obtidas comercialmente foram empregadas para catalisar as reações de conversão da nitrila na amida correspondente, com altas conversões e rendimentos. Para as reações de Grignard e transamidação não foram obtidos bons resultados nas condições estudadas. De maneira geral foi possível obter amidas, que são de interesse industrial, com conversões variadas através de catálise enzimática. Palavras-chave: Biocatálise, Nitrila hidratase, Clonagem, Expressão enzimática, nitrila. ABSTRACT Enzymatically catalyzed reactions are an environmentally attractive alternative for metal and organometallic catalysis, because it uses biodegradable catalysts and from renewable sources, offering appropriate tools for the transformation of natural substances or synthetic taking into account the precepts of Green Chemistry. This work was performed nitrile hydratase gene cloning (α- and β- subunits and activator gene) from Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 and Klebisella oxytoca via restriction-free cloning methodology and subsequent expression in E. coli to perform biotransformation reactions. The analysis of the substrate specificity of the Fe-type NHase of R. erythropolis ATCC 4277 indicates that it accepts a diversity of nitriles. The aliphatic nitriles were hydrated with conversions above 99%, with the exception of acrylonitrile. The aromatic nitriles were hydrated with conversions ranging from 1% to 88%. Whole cells of recombinant E. coli hydrated 1,4-phenylenediacetonitrile with high regioselectivity, while the enantiomeric excess of the aromatic nitriles 2-amino-2- (4-fluorophenyl)acetonitrile and 2-phenylbutyronitrile were 7% and 60%, respectively. The cloning of the gene NHase of Klebisella oxytoca was not observed. The second step of this work consisted in the synthesis of 4- (cyanomethyl)benzeneacetanamide an important intermediate in the synthesis of compounds of industrial interest and used as starting material in Grignard reactions and transamidation. A collection of enzymes NHase type obtained commercially were employed to catalyze the conversion reactions of nitrile to the corresponding amide, with high conversions and yields. For the reactions of Grignard and transamidation have not obtained good results in the conditions studied. In general, it was possible to obtain amides, which are of industrial interest, with high and low conversions by enzymatic catalysis. Keywords: Biocatalysis, Nitrile hydratase, Cloning, Enzyme expression, nitrile. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Os 12 primeiros princípios da química verde.......................................24 Figura 2. Duas rotas da natureza para a conversão de nitrilas em ácido carboxílico..........................................................................................................32 Figura 3. NHase na síntese de amidas produzidas industrialmente ............... 32 Figura 4. Representação tridimensional de uma NHase de Rhodococcus erythropolis AJ270. Em verde e azul estão representadas as subunidades α e β, respectivamente. A esfera vermelha representa o cofator Fe3+..........................34 Figura 5. Mecanismo proposto para reação de hidratação de nitrila catalisada por NHase..........................................................................................................36 Figura 6. Representação esquemática de clonagem RF. Primers híbridos são desenhados para se ligarem ao gene (verde) e ao plasmídeo (rosa). A primeira PCR leva ao megaprimer que possui em suas extremidades sequências que se flanqueiam ao plasmídeo. Na segunda PCR, o produto da primeira é usado para amplificação linear do vetor circular escolhido. Uma vez que todo plasmídeo é replicado, é realizado uma digestão com DpnI, para degradar seletivamente o DNA parental metilado e a mistura reacional é transformada em células competente de E. coli.........................................................................................40 Figura 7. Esquema do vetor recombinante pACYCDuet-1-NHase...................47 Figura 8. Construção do plasmídeo recombinante por clonagem RF. (A) A primeira PCR amplifica os genes (ativador, subunidades α e β) que codificam a proteína de interesse. (B) Na segunda PCR, o produto da primeira PCR foi usado como megaprimer para amplificação linear do vetor escolhido. (C) O plasmídeo parental foi digerido com DpnI antes da transformação......................................48 Figura 9. (A) Esquema do vetor recombinante pkk223-3-NHase. (B) Eletroforese em gel de agarose das amplificações de NHase (entrada 1). A entrada 2 é controle negativo. M: marcador de massa molecular, bp: pares de base............49 Figura 10. Triagem branco-azul de E. coli JM109 para a presença do gene NHase................................................................................................................50 Figura 11. Sequências conservadas de aminoácidos da subunidade α de NHase de vários micro-organismos. Os padrões de ligação de cobalto (CTLCSC) ou ferro (CSLCSC) estão destacados. Idêntico (*), fortemente similar (:) e pouco semelhante (.).................................................................................................... 50 Figura 12. Análise filogenética da subunidade α de NHase de R.erythropolis comparada com outras reportadas na literatura.................................................51 Figura 13. Análise por SDS-PAGE da expressão de NHase recombinante. M: marcador de proteína. As entradas indicam: 1 e 2 (pACYCDuet1-solúvel/ insolúvel-24h), 3 e 4 (pACYCDuet1-solúvel/insolúvel-48h, 5 e 6 (pACYCDuet- NH-RE-solúvel/insolúvel-24h), 7 e 8 (pACYCDuet-NH-RE solúvel/insolúvel- 48h)....................................................................................................................53 Figura 14. Curva Analítica - Ensaio de Bradford..............................................54 Figura 15. Curva Analítica – Determinação da atividade enzimática...............55 Figura 16. Cromatograma de separação dos enantiômeros de 6b por GC- FID.....................................................................................................................61 Figura 17. Cromatograma de separação dos enantiômeros de 7b por HPLC..62 Figura 18. Cromatograma da reação de 5a com NHase 017...........................66 Figura 19. Cromatograma da reação de Grignard por CG-EM.........................69 Figura 20. Cromatograma da reação de transamidação analisada por CG- FID.....................................................................................................................70 Figura 21. Representação do ciclo de PCR utilizado para a amplificação dos genes de R. erythropolis (ativador e subunidades α e β) e o gene NHase de K. oxytoca...............................................................................................................79 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1. Síntese da hidroxinitrila (1) intermediário de atorvastatina.............27 Esquema 2. Síntese da sitagliptina a partir da prositagliptina usando uma (R)- transaminase.....................................................................................................29 Esquema 3. Biotransformação da rac-2,2-dimetilciclopropanocarbonitrila por Rhodococcus boritolerans FW815 para obtenção de um intermediário da cilastantina.........................................................................................................30 Esquema 4. Versatilidade das nitrilas na obtenção de outros compostos..........31 Esquema 5. Dessimetrização de adiponitrila para produzir 5-cianovaleramida um precursor do azafenidin................................................................................41 Esquema 6. Dessimetrização do 3-hidroxiglutaronitrila por nitrilase................42 Esquema 7. Hidratação enzimática das nitrilas alifáticas.................................58 Esquema 8. Hidratação enzimática das nitrilas 4a e 9a...................................59 Esquema 9. Hidratação enzimática da nitrila 5a...............................................60 Esquema 10. Hidratação enzimática da nitrila 6a.............................................61 Esquema 11. Hidratação enzimática da nitrila 7a.............................................62 Esquema 12. Hidratação enzimática da nitrila 8a.............................................63 Esquema 13. Reações com os extratos enzimáticos.......................................64 Esquema 14. Conversão do substrato (5a) para a respectiva amida (5b) por NHase................................................................................................................65 Esquema 15. Preparação geral de cetonas via adição nucleofílica de reagentes de Grignard a nitrila............................................................................................68 Esquema 16. Síntese do intermediário 10........................................................68 Esquema 17. Reação de transamidação do composto 5b...............................69 Esquema 18. Reação geral para hidrólise ácida da nitrila de 2a em 2b...........86 Esquema 19. Reação geral para hidrólise ácida da nitrila de 3a em 3b...........86 Esquema 20 Reação geral para hidrólise ácida da nitrila de 6a em 6b............87 Esquema 21. Reação geral para hidrólise ácida da nitrila de 7a em 7b...........88 Esquema 22. Esquema geral das biotransformações......................................88 Esquema 23. Esquema para reação de Grignard com composto 5b...............93 Esquema 24. Reação de Grignard com composto 5b......................................94 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Algumas métricas comuns de química verde e suas descrições......25 Tabela 2. Atividade de NHase de alguns micro-organismos.............................33 Tabela 3. NHases enantiosseletivas catalisam a transformação da nitrila (R1R2CHCN) para a correspondente amida.......................................................35 Tabela 4. Conversão de dinitrilas por Rhodococcus sp. AJ270..........................43 Tabela 5. Primers desenhados para a amplificação e sequenciamento dos genes que codificam NHase. Em vermelho, estão representadas as caudas que ficarão livres para se ligar ao vetor na segunda PCR. Os códons grifados representam start e stop..........................................................................................................47 Tabela 6. Sequência de aminoácidos do gene ativador de NHase de alguns micro-organismos..............................................................................................52 Tabela 7. Curva analítica do Ensaio de Bradford................................................54 Tabela 8. Proteínas totais presentes no extrato enzimático pós diálise.............55 Tabela 9. Dados para a construção da curva analítica para determinação da atividade.............................................................................................................55 Tabela 10. Especificidade dos substratos utilizando R.erythropolis ATCC 4277...................................................................................................................57 Tabela 11. Conversão de 5a em 5b catalisada por NHase.................................66 Tabela 12. Resultado das reações enzimáticas com NHase 001, 009 e 017......67 Tabela 13. Reagentes e quantidades utilizadas nas reações de PCR para amplificação do DNA genômico..........................................................................78 Tabela 14. Reagentes e quantidades utilizadas nas reações de PCR................79 LISTA DE FLUXOGRAMAS Fluxograma 1. Etapas para o desenvolvimento do trabalho............................45 Fluxograma 2. Planejamento para o desenvolvimento do trabalho.................46 Fluxograma 3. Etapas para análise do nível de proteínas em SDS-PAGE......84 Fluxograma 4. Etapas para a síntese das amidas padrões.............................85 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS Amp – Ampicilina ATR – Reflexão total atenuada (Atenuated total reflection) ATCC- Coleção de Cultura Tipo Americana (American Type Culture Collection) BSA – Soro albumina bovina (Bovine serum albumine) Can- Cloranfenicol CCD – Cromatografia em camada delgada CCT- Coleção de Culturas Tropicais CCDP – Cromatografia em camada delgada preparativa Clonagem RF- Clonagem livre de enzimas de restrição DMSO – Dimetilsulfoxido DpnI- Diplococcus pneumoniae G41 ee – excesso enantiomérico GC-FID – Cromatografia gasosa acoplada ao detector de ionização em chama (gas chromatography with flame ionization detector) GC-MS – Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (gas chromatography with mass spectrometer) GDH - glicose desidrogenase HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High pressure liquid chromatography) HHDH - halohidrina desalogenase IPTG - Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosida IV – Infravermelho J – constante de acoplamento LB – Luria Broth m/z – razão massa carga MTBE- Éter metil terc-butílico NHase- Nitrila hidratase NHase-Co -Nitrila hidratase dependente de cobalto NHase-Fe- Nitrila hidratase dependente de ferro PCR- Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) PMSF – fluoreto de fenilmetilsulfonila (phenylmethylsulfonyl fluoride) RMN de 13C - Ressonância magnética nuclear de carbono 13 RMN de 1H - Ressonância magnética nuclear de hidrogênio rpm – rotações por minuto SOC - Super Optimal Broth t.a. - temperatura ambiente TBE- Tampão Tris/borato/EDTA TMS - Tetrametilsilano X-gal - 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D-galactopiranosídeo SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...............................................................................................23 1.1 Biocatálise e Química verde......................................................................23 1.2 Aplicações da biocatálise na indústria farmacêutica.................................27 1.3 Nitrila Hidratase (NHase)...........................................................................30 1.4 Clonagem livre de restrição (Restriction Free (RF) Cloning).....................39 1.5 Biotransformação regiosseletiva de dinitrilas............................................41 2. OBJETIVOS..................................................................................................44 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................45 3.1 Planejamento de trabalho...........................................................................45 3.2 Construção do plasmídeo recombinante de R. erythropolis ATCC 4277..46 3.3. Construção do plasmídeo recombinante de K. oxytoca...........................49 3.4 Análise da sequência de nucleotídeos......................................................50 3.5. Expressão de NHase recombinante em E. coli........................................53 3.6 Determinação das proteínas totais - Ensaio de Bradford..........................53 3.7 Medida da atividade enzimática................................................................55 3.8 Especificidade do Substrato......................................................................56 3.9 Reações com extratos enzimáticos...........................................................64 3.10 Reações de catálise enzimática para formação do 4- (cianometil)benzenoacetanamida....................................................................65 3.11 Reações com o composto 4-(cianometil)benzenoacetanamida (5b).......67 4. CONCLUSÕES..............................................................................................71 5. PARTE EXPERIMENTAL..............................................................................73 5.1 Considerações Gerais...............................................................................73 5.1.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono (RMN de 1H e 13C)............................................................................73 5.1.2 Métodos Cromatográficos.......................................................................73 5.1.3 Espectroscopia no Infravermelho - (IV)..................................................74 5.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)...................................75 5.1.5 Polarimetria.............................................................................................75 5.2 Meios de cultura........................................................................................75 5.3 Tampões....................................................................................................76 5.4 Micro-organismos......................................................................................76 5.5 Extração de DNA genômico......................................................................76 5.6 Análise do DNA em gel de agarose...........................................................77 5.7 Amplificação por PCR................................................................................78 5.8 Reação de amplificação linear...................................................................79 5.9 Preparo de bactérias eletrocompetentes...................................................80 5.10 Transformação de células de E. coli por eletroporação...........................81 5.11 Análise dos transformantes de E. coli......................................................81 5.12 Análise das sequências de DNA..............................................................83 5.13 Análise da expressão de proteínas..........................................................83 5.14 Metodologia para a síntese dos padrões e dados espectroscópicos dos compostos.......................................................................................................84 5.14.1 Síntese do composto butanamida (2b).................................................85 5.14.2 Síntese do composto isobutanamida (3b)............................................86 5.14.3 Síntese do composto 2-amino-2-(4-fluorofenil)acetanamida (6b)........87 5.14.4 Síntese do composto 2-fenilbutanamida (7b).......................................87 5.15 Procedimento geral para as biotransformações e dados espectroscópicos das amidas.......................................................................................................88 5.16 Quantificação das proteínas- Método de Bradford..................................90 5.17 Procedimento para as reações com extratos enzimáticos......................91 5.17.1 Lise celular............................................................................................91 5.17.2 Diálise dos extratos enzimáticos..........................................................91 5.17.3 Reações com extratos enzimáticos dialisados.....................................91 5.18 Determinação da atividade enzimática....................................................91 5.19 Reações de biocatálise com NHase comercial.......................................92 5.20 Procedimento geral para obtenção do composto 4-(2-propanona) benzenoacetanamida (10)...............................................................................93 5.21 Reação de transamidação do 4-(cianometil)benzenoacetanamida.........94 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................95 7. APÊNDICES..............................................................................................103 24 1. INTRODUÇÃO 1.1. Biocatálise e Química Verde O termo biocatálise abrange processos através dos quais as enzimas ou outros catalisadores biológicos são utilizados para catalisar reações químicas em compostos orgânicos (BIROLLI et al., 2015). O uso de enzimas como catalisadores vem crescendo nos últimos anos em diferentes campos de aplicação, tais como a indústria química, farmacêutica, cosmética e de alimentos, dentre outras (ILLANES et al., 2012; TURNER; TRUPPO, 2013). Este crescimento deve-se ao fato de que a biocatálise viabiliza a produção de compostos intermediários oticamente ativos ou não, em condições ambientalmente sustentáveis, o que a coloca como uma ferramenta importante na química orgânica sintética (MIRABAL-GALLARDO; SORIANO; SANTOS, 2013). Nos anos 1980 e 1990, vários termos foram introduzidos no cenário da química, tais como química limpa, química ambiental, química verde, química benigna e química sustentável. A expressão “Química Verde” foi usada pela primeira vez em 1991 por P. T. Anastas e J. C. Warner em um programa especial lançado pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA (ILLANES et al., 2012). A lei ambiental dos EUA “A Lei de Prevenção da Poluição de 1990” afirmou que a primeira escolha para prevenir a poluição é projetar processos industriais que não levam à produção de resíduos em especial os resíduos tóxicos (LLEVOT; MEIER, 2016). A agência de proteção ambiental (EPA) define a Química Verde (QV) como o design de produtos químicos e processos que reduzem ou erradicam o uso ou a geração de substâncias perigosas (SAINI, 2018). Na década de 1990, John Warner e Paul Anastas propuseram os 12 princípios da química verde (Figura 1) para nortear a pesquisa e para que os químicos pudessem ter diretrizes para a avaliação do impacto ambiental de suas pesquisas (ERYTHROPEL et al., 2018). 25 Figura 1. Os 12 primeiros princípios da química verde Fonte: Adaptado de Erythropel e colaboradores (ERYTHROPEL et al., 2018) Os princípios da química sustentável também incluem preocupações com a conservação de energia, redução da geração de resíduos e considerações sobre o uso de matérias-primas renováveis, dentre outros. O desenvolvimento da química verde passa por uma transição, a partir de descrições qualitativas gerais para comparações quantitativas baseadas em resultados mensuráveis (LLEVOT; MEIER, 2016). Melhorias na sustentabilidade dos processos de fabricação, incluindo os biocatalíticos, precisam ser medidos quantitativamente. De fato, se não for possível medir a sustentabilidade de um processo, não é possível definir metas para melhoria (SHELDON; WOODLEY, 2018). Medir o rendimento de uma reação pode ser uma boa indicação da economia do processo; no entanto, não fornece informações suficientes para promover práticas sustentáveis. Felizmente, uma ampla gama de métricas de química verde está agora disponível para os pesquisadores compararem rotas sintéticas e metodologias em termos de sustentabilidade das reações e/ou processos químicos (CLARKE et al., 2018) (Tabela 1). 1- Prevenção de resíduos 2- Eficiência atômica Eficiência 3- Redução de resíduos de resíduos 4- Desenho de produtos mais seguros 5-Solventes e auxiliares menos nocivos 6- Eficiência energética 7- Uso de matéria-prima renovável 8- Rotas sintéticas mais curtas de resíduos 9-Catálise 10- Produtos para Degradação de resíduos 11- Análise para prevenção da poluição 12- Desenvolvimento de processos mais seguros 12 PRINCÍPIOS DA QUÍMICA VERDE 26 Tabela 1: Algumas métricas comuns da química verde e suas descrições Métrica Abreviatura Descrição Meta Economia Atômica AE Massa molar (MM) do produto dividido pela soma das MM dos reagentes 100% Eficiência de carbono CE Porcentagem de carbono dos reagentes que permanecem no produto final 100% Eficiência de massa da reação RME Razão da massa do produto pela massa de todos os reagentes do processo. 100% Fator ambiental Fator E Razão da massa dos resíduos pela massa do produto desejado 0 Intensidade de massa do processo PMI Relação entre a massa total utilizada no processo e a massa do produto 1 Fonte: Adaptado de Clarke e colaboradores (CLARKE et al., 2018) As concepções de economia atômica (EA) e eficiência de carbono (CE) foram feitas em contexto laboratorial e a do fator E na fronteira laboratório- indústria, datando ambas do início da década de noventa. A intensidade de massa do processo (PMI) teve origem industrial – fez parte das métricas de consumo de recursos incluídas nas métricas de sustentabilidade concebidas no âmbito da Engenharia Química. A eficiência de massa da reação (RME) foi introduzida por se ter verificado que a economia atômica, de natureza teórica, tinha limitações práticas (CONSTABLE; CURZONS; CUNNINGHAM, 2002; MACHADO, 2014). As métricas permitem a avaliação do bom uso da matéria nas reações químicas: as três primeiras (AE, CE e RME) visam a aferição do sucesso na passagem dos átomos dos reagentes para o produto final; as duas últimas (PMI e fator E) focam globalmente na produção de resíduos nos processos industriais (MACHADO, 2014). Uma das principais causas de geração de resíduos, particularmente na fabricação de produtos de química fina e farmacêutica, é o uso de proporções estequiométricas entre reagentes e o uso de solventes em síntese orgânica. Exemplos pertinentes são as reduções com metais (Na, Mg, Zn, Fe) e hidretos de metal (LiAlH4, NaBH4); e oxidações com permanganato, dióxido de manganês e reagentes de cromo (VI); e ácidos de Lewis (AlCl3, ZnCl2, BF3), empregados como reagentes nas reações ou em etapas posteriores do processo. Além disso, devido à complexidade molecular da maioria dos produtos farmacêuticos, sua 27 síntese envolve várias etapas, que provavelmente geram mais resíduos do que a síntese de produtos químicos mais simples. A solução para esses problemas é a substituição das metodologias estequiométricas dispendiosas. Logo, uma das principais alternativas para a química verde e sustentável é o uso da catálise heterogênea e catálise homogênea em síntese orgânica (SHELDON; BRADY, 2018; SHELDON; WOODLEY, 2018). Dentro desse contexto, a biocatálise apresenta muitas características atraentes especialmente para a síntese de compostos quirais enantiomericamente puros como as condições brandas de reação (pressão, temperatura e pH), uso de solventes ambientalmente amigáveis (água, fluidos supercríticos, solventes com baixa toxicidade e pressão de vapor) e utilização de biocatalisadores oriundos de fontes renováveis (micro-organismos e plantas) que são biodegradáveis, não tóxicos e que podem ser quimio-, regio- e estereosseletivos. Consequentemente, os processos biocatalíticos geram menos resíduos e são, portanto, ambientalmente e economicamente mais atrativos do que as rotas convencionais (MUÑOZ SOLANO et al., 2012, NESTL; NEBEL; HAUER, 2011; SIMON; MUTTI; KROUTIL, 2013). Além das vantagens mencionadas anteriormente, o emprego de sistemas multienzimáticos em cascata e o desenvolvimento de processos em regime de fluxo contínuo miniaturizado incrementam sobremaneira as características de sustentabilidade ambiental dos processos biocatalíticos (SIMON; MUTTI; KROUTIL, 2013). A química verde já existe há décadas e vem fazendo uma diferença real no mundo. Empresas e organizações bem conhecidas que a adotaram incluem Nike, BASF, Pfizer, Agência de Proteção Ambiental Americana, Bayer, Codexis, Johnson & Johnson e outras. O mercado global de química verde está previsto para crescer exponencialmente nos próximos anos, para US $ 98,5 bilhões até 2020 (CLARKE et al., 2018). Assim, a biocatálise tem sido utilizada com sucesso na fabricação de uma grande variedade de produtos químicos necessários para a produção de medicamentos, biodiesel, detergentes, biossurfactantes, aditivos alimentares, biopolímeros funcionalizados, de forma mais sustentável que as metodologias tradicionais (PRASAD; BHALLA, 2010). 28 1.2. Aplicações da biocatálise na indústria farmacêutica Nos últimos anos observa-se um emprego crescente de processos biocatalíticos, principalmente em áreas como química fina e farmacêutica (BARREIRO; FRAGA, 2015). A biocatálise está evoluindo rapidamente como uma tecnologia-chave para a indústria farmacêutica, devido à elevada enantiosseletividade, condições de reação suaves e respeito ao ambiente (ZHENG et al., 2014). Nos últimos anos, os processos químicos da indústria farmacêutica têm voltado sua atenção para a aplicação da biocatálise utilizando tanto enzimas isoladas, ou mais comumente, enzimas imobilizadas ou células íntegras de micro-organismos (WOODLEY, 2008). Na década de 1980 a redução de cetonas foi amplamente investigada utilizando cetorredutases/álcool desidrogenases isoladas de levedura, fígado de cavalo, ou Thermoanaerobium brockii. Nos últimos anos, cientistas da Codexis desenvolveram processos com base em cetorredutase para a produção de intermediários de fármacos de sucesso como atorvastatina, montelucaste, duloxetina, fenilefrina, ezetimiba e crizotinibe. A atorvastatina é um fármaco membro da família das estatinas que reduz o colesterol através do bloqueio da síntese do colesterol no fígado, e é atualmente comercializado pela Pfizer sob o nome comercial de Lipitor®. A Codexis desenvolveu um processo em duas etapas para a síntese de um intermediário chave na produção da atorvastatina utilizando enzimas geneticamente modificadas (CHOI; HAN; KIM, 2015; HUISMAN; COLLIER, 2013) (Esquema 1). Esquema 1. Síntese da hidroxinitrila (I) intermediário de atorvastatina Fonte: Adaptado de Choi e colaboradores (CHOI et al., 2015) 29 Na primeira etapa, 4-cloroacetoacetato de etila sofre uma redução enantiosseletiva catalisada por cetorredutase (KRED). A regeneração do cofator é realizada com glicose como doador de hidrogênio e NADP dependente de glicose desidrogenase (GDH) com catalisador. No segundo passo, uma halohidrina desalogenase (HHDH) é empregada para catalisar a substituição nucleofílica do cloro pelo grupo ciano por reação com HCN em pH neutro e temperatura ambiente (MA et al., 2010) Devido à elevada quimio-, regio- e estereosseletividade natural das enzimas, as reações enzimáticas foram altamente seletivas e proporcionaram uma redução substancial na produção de resíduos. O fator E (kg de resíduos/ Kg de produto) para o processo global de síntese da hidroxinitrila foi de 5,8. Avanços na tecnologia de engenharia de proteínas permitiram a síntese em larga escala do intermediário I, e o processo multienzimático provou ser ambientalmente atrativo e economicamente viável em comparação com processos químicos tradicionais (MA et al., 2010; PATEL, 2009; ROSCHANGAR; SHELDON; SENANAYAKE, 2015). Outro exemplo da aplicação prática do uso de enzimas na indústria farmacêutica é o composto antidiabético sitagliptina. A sitagliptina é um medicamento para diabetes tipo II que foi comercializado sob o nome comercial Januvia pela Merck. Pesquisadores da Codexis e da Merck usaram uma combinação de técnicas de engenharia de proteínas para obter uma transaminase (R)-seletiva de Arthrobacter sp. para a conversão da cetona precursora, a prositagliptina (CHOI; HAS; KIM, 2015). A transaminase (R)-seletiva de Arthrobacter sp. continha 27 mutações e converteu 200 g/L da cetona prositagliptina em sitagliptina com um excesso enantiomérico superior a 99,95%, na presença de isopropilamina, com 50% de DMSO a uma temperatura superior a 40 ºC (Esquema 2) (BORNSCHEUER et al., 2012). 30 Esquema 2. Síntese da sitagliptina a partir da prositagliptina usando uma (R)- transaminase Fonte: Adaptado de Bornscheuer e colaboradores (BORNSCHEUER et al., 2012) Comparado com o processo catalisado por ródio (Rh), o processo biocatalítico não só reduziu o total de resíduos e eliminou a necessidade de um metal pesado (Rh), como também aumentou o rendimento total em 10% e a produtividade (kg/L por dia) em 53%. A imobilização da transaminase (R)- seletiva permitiu a manutenção da atividade e estabilidade da enzima em solvente orgânico e o uso repetitivo da enzima (BORNSCHEUER et al., 2012; CHOI; HAS; KIM, 2015). As possíveis rotas sintéticas para cada molécula alvo são avaliadas a fim de encontrar a melhor rota global. A disponibilidade de materiais de partida, o número de etapas envolvidas, considerações ambientais, escalabilidade, tempo de desenvolvimento e qualidade dos produtos são todos levados em consideração. A rota de escolha pode ser química ou uma combinação de química e biocatálise (SHAW; ROBINS; KIENER, 2003). O composto (S)-2,2-dimetilciclopropanocarboxamida (II) é um intermediário sintético quiral da cilastatina (Esquema 3). Nos últimos anos, esforços consideráveis foram dedicados à síntese desse importante bloco de construção. A cilastatina é comumente administrada em associação ao antibiótico imipenem, no tratamento de infecções bacterianas graves que afetam o sistema respiratório e urinário. Zheng e colaboradores (2014) descrevem um processo one-pot em duas etapas, catalisada por nitrila hidratase (Rhodococcus boritolerans FW815) e amidase (Delftia tsuruhatensis ZJB-05174) que forneceu o (S)-2,2-dimetilciclopropanocarboxamida com rendimento de 38% e excesso enantiomérico maior que 99,5% (ZHENG et al., 2014). 31 Esquema 3. Biotransformação da rac-2,2-dimetilciclopropanocarbonitrila por Rhodococcus boritolerans FW815 para obtenção de um intermediário da cilastatina. Fonte: Adaptado de Zheng e colaboradores (ZHENG et al., 2014) A rota biocatalítica melhorou drasticamente a eficiência do processo em comparação com a rota química, eliminando seis etapas. O bioprocesso evitou o uso de auxiliares quirais e redução no uso de solventes orgânicos. A reação foi realizada sob condições brandas, reduzindo a energia consumida no processo. A síntese do composto II é um exemplo de sucesso de processo farmacêutico ambientalmente benigno por combinação de NHase e amidase (ZHENG et al., 2014). 1.3. Nitrila Hidratase (NHase) As nitrilas são compostos orgânicos com um grupo –C≡N; eles são frequentemente conhecidos por ocorrerem naturalmente tanto na fauna como na flora e também são sintetizados quimicamente. Eles têm ampla aplicabilidade nos campos da medicina, indústria e monitoramento ambiental. No entanto, grande parte dos compostos nitrílicos são considerados letais, mutagênicos e carcinogênicos na natureza, e são conhecidos por causar problemas de saúde tais como náuseas, desconforto respiratório, convulsões e outros (RAMAKRISHNA; DAVE; RAVINDRANATHAN, 1999). 32 As nitrilas são compostos versáteis, podendo ser convertidas em amidas, aminas, iminas, oximas, ácidos carboxílicos, ésteres e álcoois (Esquema 4). São amplamente utilizadas como materiais de partida e intermediários em síntese orgânica, sobretudo, devido à hidratação de nitrilas para amidas correspondentes. As enzimas conversoras de nitrila são extraídas de vários micro-organismos e vegetais e têm chamado a atenção de pesquisadores de todo o mundo (RAMTEKE et al., 2013). Esquema 4. Versatilidade das nitrilas na obtenção de outros compostos Fonte: Adaptado de Ramteke e colaboradores (RAMTEKE et al., 2013) Na Natureza, a biotransformação das nitrilas ocorre através de duas rotas enzimáticas (Figura 2). i) reação direta catalisada pela nitrilase (Nase, EC 3.5.5.1) para produzir os correspondentes ácidos carboxílicos e amônia; ii) reação indireta em duas etapas, na qual as nitrilas são primeiramente transformadas em amidas por nitrila hidratase (NHase, EC 4.2.1.84), e depois as amidas são transformadas para os correspondentes ácidos carboxílicos e amônia por amidase (EC 3.5.1.4) (D’ANTONA et al., 2010). 33 Figura 2. Duas rotas da natureza para a conversão de nitrilas em ácido carboxílico A primeira ocorrência de nitrila hidratase foi reportada em Rhodococcus rhodochrous J-1, a princípio esta bactéria foi identificada como Arthrobacter sp. J-1, a qual degradou acetonitrila (ASANO, TANI; YAMADO, 1980; CHEN et al., 2009). A nitrila hidratase é uma enzima chave envolvida no metabolismo microbiano que catalisa a hidratação de nitrilas para amidas. Este biocatalisador tem sido utilizado para a produção industrial de diversas amidas, tais como acrilamida, nicotinamida e 5-cianovaleramida (Figura 3) (BLACK et al, 2010; CUI et al., 2014; KAYANUMA et al., 2015). Figura 3. NHase na síntese de amidas produzidas industrialmente Muitos micro-organismos exibem atividade NHase, tal como Rhodococcus equi TG3282, (RZEZNICKA et al., 2010), Klebsiella oxytoca KCTC 1686 (GUO et al., 2015), Aurantimonas manganoxydans ATCC BAA-1229 (PEI et al., 2013), Pseudomonas chlororaphis B23 (NAGASAWA et al., 1987) e outros. Até agora, um número considerável de micro-organismos foi rastreado com sucesso por catalisar a hidratação de nitrilas (Tabela 2). 34 Tabela 2. Atividade de NHase de alguns micro-organismos Micro-organismo Especificidade do substrato Agrobacterium tumefaciens d3 Nitrilas alifáticas e aromáticas Arthrobacter sp. J-1 Nitrilas alifáticas Bacillus cereus Acrilonitrila Bacillus sp. BR 449 Acrilonitrila Bacillus smithii SC-J05-1 Nitrilas aromáticas Brevibacterium imperialis CBS 489-74 Acrilonitrila Pseudomonas chlororaphis B23 Nitrilas alifáticas Pseudomonas putida Acetonitrila Pseudonocardia thermophila JCM 3095 Acrilonitrila Rhodococcus rhodochrous J-1 Nitrilas alifáticas e aromáticas Rhodococcus rhodochrous R312 Nitrilas alifáticas e benzonitrila Rhodococcus rhodochrous LL 100-21 Nitrilas alifáticas e aromáticas Rhodococcus erythropolis BL1 Nitrilas alifáticas e aromáticas Rhodococcus rhodochrous A4 Nitrilas alifáticas e aromáticas Cryptococcus flavus UFMG-Y61 Isobutironitrila Rhodococcus sp. N 774 Nitrilas alifáticas Fonte: Adaptado de Chen e colaboradores (CHEN et al., 2009) Estudos demonstraram que o gene cluster das NHase consistem de um gene amidase e um gene ativador, além dos genes das subunidades α e β (ZHANG et al., 2017). As NHases consistem em duas subunidades, α e β, sem homologia na sequência de aminoácidos (Figura 4), com uma massa molecular de aproximadamente 23 kD por subunidade, e geralmente existem como dímeros αβ ou tetrâmeros α2β2 (KANG et al., 2014; PEI et al., 2014). NHases podem ser classificadas em dois grandes grupos, com base no componente íon metálico: tipo Fe e tipo Co. Estes dois grupos exibem diferentes propriedades enzimáticas, em particular a especificidade pelo substrato (PEI et al., 2014) Trabalhos iniciais apontaram que as NHases-Fe hidratam preferencialmente nitrilas alifáticas pequenas, enquanto a NHases-Co exibem uma elevada afinidade pelas nitrilas aromáticas. No entanto, vários estudos têm mostrado que a especificidade pelo substrato não está relacionada ao tipo de componente metálico da enzima. A atividade da NHase possui características 35 únicas quando exposta à luz. As NHases dependentes de ferro (NHases-Fe) apresentam fotorreatividade regulada por óxido nítrico (NO), enquanto as dependentes de cobalto (NHases-Co) não. Por causa disso, micro-organismos que possuem NHase-Fe, a molécula de NO endógena permanece ligada ao Fe3+ no sítio ativo até receber irradiação pela luz, quando é substituído por uma molécula de água ou OH-, resultando na recuperação da atividade original do NHase (BANERJEE; SHARMA; BANERJEE, 2002). Existem duas principais razões da presença do íon metálico no sítio ativo dessas enzimas: (1) os íons metálicos são bons catalisadores para hidratação da ligação –CN e (2) são necessários para a flexibilidade da enzima. Os complexos do sítio ativo de ambos os metais são semelhantes em alguns aspectos: são de baixo spin, apresentam baixo potencial redox e compartilham um conjunto de ligantes comum, que são três tiolatos de cisteína (Cis110, Cis112, Cis114) e dois átomos de nitrogênio (Ser113, Cis112) (BANERJEE; SHARMA; BANERJEE, 2002; NELP et al., 2014). Figura 4. Representação tridimensional de uma NHase de Rhodococcus erythropolis AJ270. Em verde e azul estão representadas as subunidades α e β, respectivamente. A esfera vermelha representa o cofator Fe3+ Fonte: Adaptado do PDB (2QDY) utilizando o software PyMol Em relação à estereosseletividade, os trabalhos iniciais apontaram uma baixa estereosseletividade para a enzima conversora da nitrila (PRÊPECHALOVÁ et al., 2001). No entanto, mais e mais relatos tiveram sucesso 36 na bioconversão enantiosseletiva de nitrilas, através de técnicas de evolução dirigida de enzimas, que introduz mutações nas proteínas, adaptando os biocatalisadores para as condições do processo (Tabela 3). Uma das primeiras NHases enantiosseletivas foi isolada a partir de Pseudomonas putida NRRL- 18668. Esta NHase dependente de cobalto catalisou a hidratação de (S)-2-(40- clorofenil)-3-metilbutironitrila pelo menos 50 vezes mais rápido do que o de (R)- 2-(40-clorofenil)-3-metilbutironitrila (EWERT; LUTZ-WAHL; FISCHER, 2008). A NHase de Agrobacterium tumefaciens d3 hidratou várias 2-arilpropionitrilas e outras nitrilas aromáticas e heterocíclicas enantiosseletivamente à respetiva (S)- amida (BAUER; KNACKMUSS; STOLZ, 1998). Tabela 3. NHases enantiosseletivas catalisam a transformação da nitrila (R1R2CHCN) para a correspondente amida Micro-organismo R1 R2 Seletividade (razão E ou ee) Agrobacterium tumefaciens d3 Ph- CH3- S (253) Agrobacterium tumefaciens d3 Ph- CH3CH2- S (58) P. putida NRRL18668 4-(Cl)Ph- (CH3)2CH- S (50) P. putida13-5 S-CAN-2a 4-(Cl)Ph- (CH3)2CH- S Pseudomonas sp. 2D-11-5-1c 4-(Cl)Ph- (CH3)2CH- S Rhodococcus sp. AJ270 Ph- CH3CH2- R (ee 83%) Rhodococcus equi TG328 Ph- CH3CH2- R Rhodococcus sp. HT40-6 Ph- OH- S (ee 95%) R. equi A4 Ph- (CH3)2CH- S (5) Fonte: Adaptado de Prasad e Bhalla (PRASAD; BHALLA, 2010) Apesar do aumento nos relatos da literatura descrevendo NHases enantiosseletivas nos últimos anos, o escopo dos substratos testados ainda é estreito e muitas vezes os dados disponíveis não são suficientes para calcular os valores de E (TUCKER et al., 2009). Embora a estrutura da NHase já tenha sido definida, o mecanismo catalítico exato das NHases ainda não foi elucidado. Vários mecanismos plausíveis da reação catalítica da NHase foram propostos. Huang e colaboradores (1997) proporam três mecanismos: 37 i) a nitrila, então ligada ao metal, sofre hidrólise por uma molécula de água (mecanismo de esfera interna), ii) a nitrila sofre um ataque nucleofílico do hidróxido ligado ao metal no sítio ativo (mecanismo de esfera externa), iii) o hidróxido ligado ao metal ativa uma molécula de água livre, que por sua vez atua como um nucleófilo (mecanismo de segunda esfera externa) (HUANG et al., 1997). Estudos experimentais recentes apoiaram a coordenação direta do substrato nitrila ao centro do metal durante a reação de hidratação catalítica. Hashimoto e colaboradores (2008) analisaram o mecanismo de reação da conversão do tert-butilisonitrila (tBuCN) catalisada por NHase usando cristalografia de raio-X com resolução temporal e sugeriu que o substrato estava coordenado com o íon metálico e atacado por molécula de água ativada por Cys- SO (HASHIMOTO et al., 2008). Os resíduos de aminoácidos do sítio ativo da NHase estão localizados na subunidade α da enzima com uma sequência altamente conservada. Os estudos experimentais de cristalografia por raios X feitos com a enzima de Pseudonocardia thermophilia JCM3095 sugeriram que o transporte tanto do substrato quanto do produto ocorre através de um canal localizado ao longo da interface das subunidades α e β. Um certo número de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos revestem as paredes deste canal. Estes incluem Phe 37, Pro 38, Phe 41, Leu 48, Phe 51, Arg 52, Tyr 68, Trp 72, Phe 118, Ala 122 e Leu 127 (presente na subunidade β) e Leu 88, Gln 89 e Trp 116 (presente na subunidade α (Huang et al., 1997). Hopmann (2014) propôs um possível mecanismo de ação em que a nitrila hidratase converte nitrilas em suas respectivas amidas (Figura 5). 38 i) ii) Figura 5. Mecanismo proposto para reação de hidratação de nitrila catalisada por NHase Fonte: Adaptado de Hopmann (HOPMANN, 2014) 39 As principais etapas desses mecanismos são: i) O metal inicialmente se coordena com uma molécula de água (Fe-H2O) e uma barreira de entalpia de 13,8 Kcal/mol é suficiente para deslocar a molécula de água pela de nitrila da esfera de coordenação do Fe3+ (intermediário 1). ii) Na etapa seguinte da catálise ocorre a formação de um intermediário cíclico a partir de um ataque nucleofílico do átomo de oxigênio de Cys-SO- ao substrato coordenado com o metal. Logo após, ocorre a formação da ligação dissulfeto (Intermediário 2) entre a Cys109 e Cys114, a partir de um ataque nucleofílico do átomo de enxofre ligado ao resíduo Cys109. Concomitante com a clivagem da ligação Cys114-substrato e transferência de próton entre os resíduos Try72 → Ser113 → substrato, resultando na formação do intermediário cíclico protonado (Intermediário 3). Após a formação do intermediário dissulfeto o nitrogênio do substrato abstrai um próton de Arg56 e protonação do oxigênio do substrato, formando um iminol, é energeticamente menos preferível. Após o deslocamento da amida, o sítio ativo é regenerado através de etapas sequenciais de transferência de prótons para Tyr72, ataque de uma molécula água no dissulfeto e transferência de prótons para Arg56. O interesse nas NHases cresceu desde sua aplicação bem-sucedida na produção industrial de amidas (PRASAD; BHALLA, 2010). No entanto, as cepas originais também transformam amidas em ácidos carboxílicos usando amidase, que é expressa junto com as NHases no mesmo operon. Consequentemente, a pureza e o rendimento da amida alvo é reduzido. Para resolver este problema, o gene NHase é tipicamente clonado em células heterólogas. A clonagem facilita a expressão da enzima, que é um método alternativo para a produção de amida como o único produto. Além disso, NHases recombinantes podem ser convenientemente adaptadas e melhoradas através de engenharia de proteínas. A Escherichia coli é o hospedeiro procariótico mais utilizado para a expressão de proteínas e biocatalisadores (PEI et al., 2013). 40 1.4. Clonagem livre de restrição (Restriction Free (RF) Cloning) As técnicas de clonagem molecular avançaram dramaticamente desde a descoberta das primeiras endonucleases de restrição. A tecnologia de DNA recombinante é hoje considerada uma prática de rotina. Isolamento e amplificação do DNA, reação em cadeia da polimerase (PCR), clonagem molecular e anotação do genoma tornaram-se procedimentos padrões (CELIE; PARRET; PERRAKIS, 2016). A manipulação de moléculas de DNA recombinante é um passo indispensável em estudos modernos de cristalização de proteínas de alto rendimento. O uso de enzima de restrição se baseia na digestão com as enzimas que reconhecem determinada sequência de nucleotídeo, seguido do uso de uma enzima de ligação (DNA ligase) que catalisa a união de cadeias de DNA, é uma maneira simples e fácil de mover um fragmento de DNA de fita dupla de um plasmídeo para outro. No entanto, esta técnica tem duas limitações: é ineficaz quando hà falta de sites de restrição exclusivos e as vezes resulta na introdução de uma sequência extra indesejada. Para contornar essas limitações, vários métodos de clonagem independentes do local de clivagem pela endonuclease de restrição foram recentemente desenvolvidos (SOUII; M’HADHEB‐GHARBI; GHARBI ,2013). A clonagem Clássica Dependente de Ligação (Ligation-Dependent Cloning, LDC) é gradualmente substituída por técnicas de Clonagem Independente de Ligação (Ligation-Independent Cloning, LIC). A Clonagem Livre de Restrição (RF) foi originalmente desenvolvida para a introdução de um DNA alvo em um plasmídeo em qualquer posição desejada (VAN DEN ENT; LOWE, 2006). A clonagem RF é uma abordagem simples baseada na realização de duas reações em cadeia da polimerase (PCR) para inserir qualquer fragmento de DNA em qualquer posição de um vetor, independentemente dos sítios de restrição e ligações (LUND; LEIROS; BJERGA, 2014; VAN DEN ENT; LOWE, 2006). Na primeira PCR, o gene de interesse é amplificado usando um par de primers; cada um contendo sequência complementar tanto para a inserção desejada quanto para o plasmídeo alvo. Na segunda PCR, o produto da primeira é utilizado como megaprimer para amplificação linear do vetor escolhido. O produto da segunda PCR possui sítios de ligações únicos nas extremidades, que são 41 complementares a sequências que flanqueiam o sítio de inserção no vetor. O DNA parental é então removido pelo tratamento com DpnI e o plasmídeo recém- sintetizado, contendo a inserção de DNA, é introduzido nas células de Escherichia coli (Figura 6) (BOND; NAUS, 2012; CHEN et al., 2000; UNGER et al., 2010; VAN DEN ENT; LOWE, 2006). Figura 6. Representação esquemática de clonagem RF. Primers híbridos são desenhados para se ligarem ao gene (verde) e ao plasmídeo (rosa). A primeira PCR leva ao megaprimer que possui em suas extremidades sequências que se flanqueiam ao plasmídeo. Na segunda PCR, o produto da primeira é usado para amplificação linear do vetor circular escolhido. Uma vez que todo plasmídeo é replicado, é realizado uma digestão com DpnI, para degradar seletivamente o DNA parental metilado e a mistura reacional é transformada em células competente de E. coli. Fonte: Adaptado de Bond e Naus (BOND e NAUS, 2012) O método de clonagem RF apresenta vantagens, que o torna uma alternativa atraente em relação a outros procedimentos de clonagem. Este método permite uma inserção precisa e perfeita do inserto de DNA sem quaisquer sequências adicionais desnecessárias. Além disso, a reação é altamente eficiente e adequada para clonagem de alto rendimento (UNGER et al., 2010). Conhecendo as vantagens do método de clonagem RF suas aplicações incluem a clonagem simultânea de vários fragmentos de DNA em posições distintas dentro de um vetor de expressão, clonagem paralela do mesmo produto de PCR em uma série de vetores diferentes e montagem multicomponente (ULRICH; ANDERSEN; SCHWARTZ, 2012; UNGER et al., 2010). 42 1.5. Biotransformação regiosseletiva de dinitrila A hidratação química de nitrilas geralmente requer condições vigorosas tais como ácidos ou bases fortes e prossegue sem regiosseletividade quando um dinitrila é empregada. Uma abordagem enzimática, no entanto, oferece vantagens significativas, uma vez que a enzima pode hidratar seletivamente um grupo ciano de uma dinitrila (CHEN et al., 2009). A produção de 5-cianovaleramida (5-CVAM) a partir da adiponitrila é um exemplo do uso da propriedade regiosseletiva das NHases. O 5-CVAM é um intermediário para a produção do herbicida azafenidin (Esquema 5) e é produzido pela DuPont usando células imobilizadas de Pseudomonas chlororaphis B23 com conversão de 97%, alto rendimento (93%) e alta seletividade de 96%. O processo usando o biocatalisador resulta em maiores rendimentos, maior produtividade do catalisador, menor formação de subprodutos, e gera significativamente menos resíduos do que métodos químicos alternativos, como a catálise com dióxido de manganês (SHAPIRO et al., 2001) Esquema 5. Dessimetrização de adiponitrila para produzir 5-cianovaleramida, um precursor do azafenidin. Fonte: Adaptado de Shapiro e colaboradores (SHAPIRO et al., 2001) A dessimetrização de dinitrilas também foi investigada por Bergeron e colaboradores (2006), em cujo o estudo, o 3-hidroxiglutaronitrila foi 43 biotransformado no ácido (R)-4-ciano-3-hidroxibutírico pela nitrilase R- específica, a qual foi expressa de Pseudomonas fluorescens BD9570. O ácido foi obtido com uma conversão de aproximadamente 99% e excesso enantiomérico variando de 98,6% a 99,4% (Esquema 6). A esterificação do ácido (R)-4-ciano-3-hidroxibutírico é usado como um intermediário para a síntese do Lipitor®, fármaco que atua no controle do colesterol e comercializado pela Pfizer (BERGERON et al., 2006) Esquema 6. Dessimetrização do 3-hidroxiglutaronitrila por nitrilase Fonte: Adaptado de Bergeron e colaboradores (BERGERON et al., 2006) A natureza regiosseletiva das enzimas conversoras de nitrila foi investigada utilizando vários compostos de dinitrila como substratos. Células íntegras de Rhodococcus sp. AJ270 catalisaram eficazmente a hidratação das dinitrilas alifáticas em diversos monoácidos, com a exceção de o- fenilenodiacetonitrila em que a o-fenilenodiacetamida foi obtida como produto principal (Tabela 4) (CHEN et al., 2009). 44 Tabela 4. Conversão de dinitrilas por Rhodococcus sp. AJ270 Substrato Tempo (h) Produto e rendimento 24 80% 24 R1=CN R2=COOH 65% R1=COOH R2=CN 16% 24 R1=CN R2=COOH 11% R1=CN R2=CONH2 65% 30 67% 30 69% 14 99% 14 86% Fonte: Adaptado de Chen e colaboradores (CHEN et al., 2009 ) 72 5. CONCLUSÕES O gene nitrila hidratase dos micro-organismos Klebsiella oxytoca e Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 foi clonado, a partir do DNA genômico dos respectivos micro-organismos pela estratégia de clonagem livre de restrição (Restriction free cloning). O DNA de um clone positivo de R. erythropolis ATCC 4277 foi enviado para sequenciamento e o resultado confirmou que a NHase de R. erythropolis é do tipo Ferro e a presença de duas subunidades (subunidades α e β) e de um gene ativador. Os clones de K. oxytoca enviados para sequenciamento foram selecionados pela técnica azul-branco, que é apenas um procedimento de triagem e não é uma técnica de seleção. Contudo, uma análise de sequenciamento revelou que os possíveis clones selecionados não apresentam homologia com a sequência do gene NHase de K. oxytoca. Reações com células integras de E. coli recombinante (NHase- Rhodococcus) foram realizadas para avaliar a especificidade dos substratos frente a NHase. As amidas 2b, 3b e 4b foram obtidas com conversões acima de 99%. O composto 5b foi obtido com moderada conversão, mas de forma regiosseletiva na obtenção da monoamida. As amidas 6b e 7b foram obtidas com conversões de 88% e 11%, respectivamente, e excessos enantioméricos baixo e moderado. No caso da amida 7b o ee foi 60% do enantiômero (S). Para as amidas 1b, 8b e 9b não houve formação da amida ou conversões muito baixas foram observadas. Logo, a NHase do tipo Fe de Rhodococcus não tem uma preferência na hidratação de nitrilas alifáticas ou aromáticas. A fim de caracterização das amidas obtidas nas reações de biotransformação, as amidas 2b, 3b, 6b e 7b foram sintetizadas via química. Os compostos foram caracterizados a partir de espectrometria de massas, espectroscopia no infravermelho, e ressonância magnética nuclear de 1H e 13C. Foram também desenvolvidos os métodos de separação em colunas quirais (de GC e HPLC) das amidas 6b e 7b. Por fim, os extratos enzimáticos com a E. coli recombinante não apresentaram potencial para a hidratação das nitrilas, mesmo não sendo tão baixa a concentração de enzima presente nos extratos enzimáticos produzidos, de acordo com a dosagem realizada pelo Ensaio de Bradford. 73 As reações de catálise enzimática realizadas com NHases comerciais apresentaram boas conversões e rendimentos para formação do 4- (cianometil)benzenoacetanamida, que foi utilizado como intermediário em reações de Grignard e reações de transamidação. No decorrer desse trabalho exploramos a utilização das NHases que demonstraram sua capacidade estereosseletiva e regiosseletiva como biocatalisador versátil e com potencial para aplicações comerciais. E acreditamos que ainda existe uma necessidade de trabalhos de engenheiramento das NHases, a fim de se obter melhores resultados. 96 REFERÊNCIAS ABEBE, M.; MACCOLL, A.; BOWEN, R. D. Part 17 : 1 selected aliphatic amides. v. 208, p. 197–208, 1997. 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