UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Biociências de Botucatu Caracterização da região MHM em aves: padrões diferenciais de metilação em machos e fêmeas Bruna Cristina Jeronimo Botucatu, SP - 2016 - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Biociências de Botucatu Caracterização da região MHM em aves: padrões diferenciais de metilação em machos e fêmeas Mestranda: Bruna Cristina Jeronimo Orientadora: Profª. Dra. Adriane Pinto Wasko Co-orientadora: Profª. Dra. Claudia Aparecida Rainho Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Genética) do Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para a obtenção do título de Mestre. Botucatu, SP - 2016 – “Se você encontrar um caminho sem obstáculos, ele provavelmente não te levará a lugar algum.” Frank Clark Dedicatória À minha avó, que mesmo não estando mais fisicamente entre nós, está presente em todos os momentos. Obrigada pelo amor que tinha por mim, por me ensinar a ser forte e a correr atrás dos meus sonhos. Vó, este trabalho também é seu! AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, quero agradecer à minha família, especialmente minha mãe, meu maior presente. Pai, Carol, Tia Cris, Brú, Jú e Fer, obrigada por me acompanharem em todas as minhas conquistas, sempre me incentivando a perseguir meus objetivos. Sou muito grata por fazer parte desta família. Ao meu afilhado, Pedro, que mesmo sem falar uma única palavra consegue me acalmar e renovar minhas esperanças. Obrigada por trazer leveza e alegria à minha vida, gordinho. À minha orientadora Adriane, um exemplo de pessoa e profissional. Agradeço pelos ensinamentos, pela paciência, por me encorajar a enfrentar todos os desafios. Não tenho palavras para agradecer tudo que fez por mim e por este trabalho. Serei eternamente grata. À minha co-orientadora, Profa. Dra. Claudia Rainho, por toda a contribuição que trouxe a este trabalho, pelos ensinamentos e pelas muitas horas de trabalho no laboratório. Aos professores, funcionários e alunos do Departamento de Genética, por toda colaboração ao longo do meu mestrado. Aos atuais e ex-integrantes do Laboratório de Genética Animal: Val, Talita, Bianca e Flávia, pelo aprendizado, pelo estímulo e, principalmente, pela amizade. Aos amigos do Laboratório de Genômica Integrativa: Érica, Diego, Adauto, Natália, Bruno, Taka e Rafael, agradeço imensamente por tudo que me ensinaram nestes dois anos e também pelos momentos de descontração. À Talita, a irmã que a pós-graduação me trouxe, pelas experiências compartilhadas, por aguentar minha crises, por sempre me incentivar a acreditar em mim, enfim, por estar sempre disposta a me ajudar em tudo. Ao meu amigo, Diego, pelas conversas, bom senso, pelo suporte emocional e profissional. Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Teixeira e a todos os veterinários do CEMPAS (Centro de Medicina e Pesquisa em Animais Selvagens), por toda ajuda na coleta das amostras utilizadas neste trabalho. Ao Acácio, proprietário do sítio Bela Vista, ao PC, proprietário da Chácara Estância Lambari, e a Maria, moradora da Chácara Santa Inês, por terem doado seu tempo e por permitirem a coleta de amostras biológicas de seus animais. Ao João Henrique Maia por toda a ajuda com as análises computacionais. Ao Zé do Departamento de Morfologia e ao Robson do Biotério Central da UNESP pela ajuda nas coletas de amostras biológicas. Ao Prof. Dr. Cesar Martins por ceder a infra-estrutura de seu laboratório para a realização de diversas análises presentes neste trabalho. À Prof Dra. Daisy Salvadori e aos amigos do laboratório Omics, por tudo que me ensinaram no período do meu treinamento técnico e também pela parceria durante o mestrado. À minha amiga Juliana Padovani, por todos os conselhos, palavras de incentivo e pelos muitos géis de poliacrilamida. Aos pesquisadores Prof. Dr. Jaes Joseph Roper e Dr. Felipe Shibuya da Universidade Federal do Paraná e à Profa. Dra. Cristina Miyaki do Laboratório de Genética e Evolução Molecular de Aves (LGEMA) da Universidade de São Paulo, pelas amostras cedidas. Ao CNPq pelo suporte financeiro, fundamental para o desenvolvimento deste trabalho. Considero-me uma pessoa de sorte, pois estou sempre rodeada de pessoas maravilhosas. Desta maneira, agradeço imensamente a todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho; não seria possível realizá-lo sozinha. RESUMO Em contraste ao padrão de cromossomos sexuais de mamíferos (XX/XY), as aves apresentam um sistema de determinação sexual em que os machos representam o sexo homogamético (ZZ) e as fêmeas constituem o sexo heterogamético (ZW). Adicionalmente, embora mamíferos apresentem um mecanismo de compensação de dose, a inativação completa de um dos cromossomos Z não é observada em machos de aves e, portanto, estes possuem um maior nível de expressão de vários genes presentes nesse cromossomo. A despeito disso, um mecanismo ainda não completamente esclarecido de compensação de dose parcial em aves resulta em expressão equivalente entre os sexos para alguns genes do cromossomo Z. A região MHM (Male Hypermethylated), localizada no cromossomo Z de Galliformes, está associada a um padrão de hipermetilação em machos e hipometilação em fêmeas, levando à síntese de um RNA não-codificante longo (lncRNA) somente em fêmeas. A presença deste lncRNA é associada ao aumento da expressão de genes próximos à região MHM em fêmeas, o que parece resultar em uma compensação de dose local entre os sexos. Dado que, até o momento, segmentos MHM foram somente identificados em Galiformes e Anseriformes, o presente estudo visou isolar e caracterizar esta região em Galliformes (galinha doméstica, codorna européia, peru) e também em Struthioniformes (avestruz), Strigiformes (coruja-orelhuda, corujinha-do-mato, coruja-da-igreja, coruja-buraqueira), Piciformes (tucanuçu), Psittaciformes (arara-azul-grande) e Apodiformes (beija-flor-da-banda-branca, beija-flor-tesoura, beija-flor-preto). Indivíduos adultos e embriões com seis dias de desenvolvimento foram sexados com base em caracteres morfológicos e moleculares - por meio de PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificação de uma região intrônica dos genes CHD1-Z e CHD1-W, seguida de eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida, análise SSCP e análise automatizada de fragmentos de DNA. Métodos de sexagem molecular mostraram-se adequados para identificação de machos e fêmeas de galinha doméstica, codorna européia, peru, tucanuçu, arara-azul-grande, coruja-orelhuda, corujinha-do-mato, coruja-buraqueira, beija-flor-da-banda-branca, beija-flor- tesoura e beija-flor-preto. Entretanto, as técnicas moleculares utilizadas não permitiram identificar diferenças entre machos e fêmeas de avestruz. Análises in silico da região MHM de galinha doméstica mostraram que esta se encontra localizada no braço curto do cromossomo Z, sendo constituída por 260Kb (chrZ:27,000,000-27,260,000) e alto conteúdo de CG. Esta região é delimitada por duas LINES (Long Interspersed Nuclear Elements) e possui múltiplos elementos repetitivos da classe LTR (Long Terminal Repeat), especialmente os pertencentes à família EVRL (Endogenous Retrovirus), denominados GGLTR5A. Com base em sua composição genômica, a região MHM de galinha doméstica foi subdividida em sub-regiões - denominadas de 1 https://pt.wikipedia.org/wiki/Struthioniformes (chrZ:27,176,712-27,260,282), 2 (chrZ:27,132,044-27,174,901), 3a (chrZ:27,094,512- 27,132,043), 4 (chrZ:27,036,950-27,094,511) e 3b (chrZ:27,000,000-27,036,949) - que apresentam-se compostas por três unidades de repetições diferentes (denominadas de repeats 1, 2 e 3) flanqueadas por LTRs específicas. PCR multiplex em amostras de galinha doméstica levou à amplificação de dois fragmentos de DNA de aproximadamente 240 e 750 pares de bases, sendo o fragmento maior correspondente à repeat 1 da região MHM. Assim como observado para galinha doméstica, também foram gerados, via PCR, dois fragmentos de DNA de diferentes tamanhos associados à região MHM para as outras espécies de aves estudadas. Um maior nível de identidade (80-97%) foi observado entre a região MHM de galinha doméstica e as sequências nucleotídicas obtidas de codorna européia, peru e avestruz, o que demonstra que a presença de segmentos MHM não se restringe ao genoma de Galliformes e Anseriformes. Ensaios de digestão enzimática em DNA genômico de galinha doméstica, codorna européia e peru, por meio do uso de endonucleases de restrição sensíveis à metilação e dependentes de metilação (MspI, HpaII e McrBC), seguidos de amplificação de um fragmento de DNA associado à sub-região 1 MHM, evidenciaram padrões diferenciais de metilação dessa região entre os sexos, sendo hipometilada em fêmeas e hipermetilada em machos. Tais padrões diferenciais mostram-se potencialmente adequados para aplicação em testes de sexagem molecular em espécies de aves. Palavras-chave: aves, MHM, metilação, sexagem molecular. ABSTRACT In contrast to the sexual chromosomes pattern found in mammals (XX/XY), birds present a sex determination system in which males represent the homogametic sex (ZZ) and females correspond to the heterogametic sex (ZW). Furthermore, although mammals present a dosage compensation mechanism, the complete inactivation of one Z chromosome is not observed in male birds and, therefore, they have a higher expression level of several genes that are found in this chromosome. Despite this, a mechanism of partial dosage compensation that was not clearly explained so far for birds results on an equivalent expression between sexes for some of the genes found at the Z chromosome. The MHM region (Male Hypermethylated), localized at the Z chromosome of Galliformes, is associated to a hypermethylation pattern in males and hypomethylation in females, which leads to the synthesis of a long non-coding RNA (lncRNA) only in females. The presence of this lncRNA is associated with a higher expression of genes that are located near to the MHM region in females, which seems to result in a local dosage compensation between sexes. As MHM segments were so far identified only in Galliformes and Anseriformes, the present study aimed to isolate and characterize this region on Galliformes (chicken, European quail, turkey) and also on Struthioniformes (ostrich), Strigiformes (striped owl, tropical screech-owl, barn owl, burrowing owl), Piciformes (toco toucan), Psittaciformes (hyacinth macaw), and Apodiformes (versicolored emerald, swallow-tailed hummingbird, black jacobin). Adult individuals and six-day embryos were sexed based on morphological and molecular characters - throughout PCR (Polymerase Chain Reaction) to amplify an intronic region of the CHD1-Z e CHD1-W genes, followed by agarose and polyacrylamide electrophoresis, SSCP analysis and automated fragment DNA analysis. Molecular sexing methodologies were useful for the identification of males and females of chicken, European quail, turkey, toco toucan, hyacinth macaw, striped owl, tropical screech- owl, burrowing owl, versicolored emerald, swallow-tailed hummingbird, and black jacobin. However, the applied techniques were not effective to identify differences between male and female ostriches. In silico analyses of the chicken MHM region showed that it is localized at the short arm of the Z chromosome and is constituted by 260Kb (chrZ:27,000,000-27,260,000) and a high CG content. This region is delimited by two LINES (Long Interspersed Nuclear Elements) and presents multiple repetitive elements of the LTR (Long Terminal Repeat) class, especially those of the EVRL (Endogenous Retrovirus) family, denominated GGLTR5A. Based on its genomic composition, the MHM region was subdivided into sub regions – denominated as 1 (chrZ:27,176,712-27,260,282), 2 (chrZ:27,132,044-27,174,901), 3a (chrZ:27,094,512- 27,132,043), 4 (chrZ:27,036,950-27,094,511), and 3b (chrZ:27,000,000-27,036,949) - that are https://pt.wikipedia.org/wiki/Struthioniformes composed by three different repeat units (denominated as repeats 1, 2 e 3) flanked by specific LTRs. Multiplex PCR on chicken samples resulted in the amplification of two different size DNA fragments of around 240 and 750 base pairs, and the larger fragment corresponds to the repeat 1 of the MHM region. As observed for chicken, two different DNA fragments associated to the MHM region were also generated, by PCR, for the other studied species. A higher identity index (80-97%) was recognized between the chicken MHM region and the obtained nucleotide sequences of European quail, turkey and ostrich, which evidences that the presence of MHM segments is not restricted to the Galliformes and Anseriformes genomes. Enzymatic digestion assays in genomic DNA samples of chicken, European quail and turkey, through the use of methylation sensitive and methylation dependent restriction endonucleases (MspI, HpaII e McrBC), followed by the amplification of a DNA fragment associated to the sub region 1 MHM, showed differential methylation patterns between sexes - hypomethylated in females and hypermethylated in males. These differential patterns are potentially applicable for molecular sexing tests in bird species. Key words: birds, MHM, methylation, molecular sexing. SUMÁRIO 1. Introdução.................................................................................................................................1 1.1. Determinação e diferenciação sexual em aves.................................................................1 1.2. Identificação de machos e fêmeas de aves sem dimorfismo sexual aparente..................4 1.3. Fatores epigenéticos associados à região MHM (Male Hypermethylated)......................6 2. Objetivos..................................................................................................................................10 2.1. Objetivo Geral................................................................................................................10 2.2. Objetivos Específicos.....................................................................................................10 3. Materiais e Métodos................................................................................................................11 3.1. Materiais.........................................................................................................................11 3.1.1. Espécies estudadas...................................................................................................11 3.1.2. Amostras biológicas................................................................................................14 3.2. Métodos.........................................................................................................................15 3.2.1. Extração de DNA....................................................................................................15 3.2.2. Análise da qualidade e quantidade das amostras de DNA......................................16 3.2.3. Identificação do sexo das aves................................................................................16 3.2.3.1. Caracteres morfológicos externos........................................................................16 3.2.3.2. Sexagem molecular por PCR (Polymerase Chain Reaction)...............................17 3.2.3.3. Análise automatizada de fragmentos de DNA.....................................................19 3.2.4. PCR para amplificação da região MHM (Male Hypermethylated).........................20 3.2.5. Sequenciamento nucleotídico..................................................................................20 3.2.6. Análise das sequências nucleotídicas......................................................................20 3.2.7. Análise in silico da sequência e organização genômica da região MHM...............21 3.2.8. Análise da metilação da região MHM por MSRE-PCR (Methylation Sensitive Restriction Enzyme-Polymerase Chain Reaction) e MDRE-PCR (Methylation Dependent Restriction Enzyme-Polymerase Chain Reaction...........................................22 4. Resultados e Discussão................................................................................................25 4.1. Amostragem biológica........................................................................................25 4.2. Sexagem das aves...............................................................................................26 4.3. Caracterização in silico da região MHM de galinha doméstica.........................37 4.4. Identificação e caracterização da região MHM em outras espécies de aves......49 5. Conclusões...................................................................................................................60 6. Referências Bibliográficas...........................................................................................61 APÊNDICE I ..................................................................................................................73 APÊNDICE II.................................................................................................................76 1 1. Introdução 1.1. Determinação e diferenciação sexual em aves A caracterização de genes envolvidos na determinação e diferenciação sexual representa uma área de estudo extremamente vasta, já que uma das características dos mecanismos de determinação do sexo é sua falta de conservação entre diferentes grupos taxonômicos. A determinação e diferenciação sexual em eucariotos envolvem diferentes mecanismos e tanto fatores genéticos como ambientais podem fazer parte destes processos. Entre os vertebrados, a determinação do sexo tem sido atribuída a um ou mais genes (Genetic Sex Determination - GSD), que podem estar localizados em cromossomos autossômicos, sexuais ou em ambos, e/ou a fatores externos (Environmental Sex Determination - ESD), como a temperatura ambiental e pH (e.g. Manolakou et al., 2006; Bachtrog et al., 2014) (Figura 1). A diferenciação entre machos e fêmeas refere-se não somente ao processo pelo qual gônadas indiferenciadas transformam-se em ovários ou testículos como também ao desenvolvimento dos genitais e ao estabelecimento de diferenças cerebrais sexo-específicas (Valenzuela & Lance, 2004; Penman & Piferrer, 2008). Figura 1: Diversidade de mecanismos de determinação sexual em vertebrados (adaptado de Bachtrog et al., 2014). 2 Embora tanto mamíferos quanto aves exibam determinação sexual genética baseada em cromossomos heteromórficos e com extensas regiões não recombinantes (Charlesworth & Mank, 2010; Gable & Zarkower, 2012; Smith & Sinclair, 2014), as aves apresentam um sistema de cromossomos sexuais, geralmente claramente distinguidos, em que os machos são homogaméticos (ZZ) e as fêmeas são heterogaméticas (ZW), em contraste ao padrão de cromossomos sexuais de mamíferos - XX para fêmeas e XY para machos. Dados de mapeamento genético comparativo demonstram que os cromossomos sexuais destes dois grupos de vertebrados evoluíram independentemente a partir de diferentes cromossomos autossômicos (Graves & Shetty, 2001). As diferentes espécies de aves geralmente possuem um grande número de cromossomos (2n > 70 na maioria das espécies), compreendendo pares de macrocromossomos e diversos microcromossomos (Griffin et al., 2008). Os cromossomos sexuais classificam-se como macrocromossomos, embora o tamanho relativo do Z e do W varie grandemente entre as espécies (Takagi & Sasali, 1974). Em galinhas, o cromossomo Z, considerado o sexto maior do genoma e eucromático, possui um tamanho de aproximadamente 82.36Mb, tendo cerca de 1.140 genes identificados, enquanto o cromossomo W, menor e altamente heterocromático, apresenta somente 1,25Mb e poucos genes caracterizados (International Chicken Genome Sequencing Consortium, 2011; NCBI Genome, 2015). Assim como em Gallus gallus (galinha doméstica), o cariótipo da maioria das espécies de aves inclui um cromossomo W consideravelmente menor que o cromossomo Z (Bloom, 1974; Rutkowska et al., 2012), rico em arranjos de amplicons (Backstrom et al., 2005) e repetições satélites (Saitoh et al., 1991; Itoh & Mizuno, 2002). Por outro lado, esta diferença entre os cromossomos Z e W não se mostra tão evidente em outras aves, como as Ratitas - Struthio camelus (avestruz) apresenta os cromossomos W e Z praticamente do mesmo tamanho, diferindo apenas pela posição do centrômero (Solari, 1994). Os cromossomos sexuais de Rhea americana (ema), também muito similares em tamanho, distinguem-se apenas devido a uma pequena deleção no cromossomo Z (Nishida-Umehara et al., 1999). Tais diferenças podem ter grandes implicações na organização, evolução e função dos cromossomos sexuais de vertebrados (Oliver & Parisi, 2004; Vallender & Lahn, 2004; Graves, 2006; Ellegren & Parsch, 2007). Embora atualmente já se tenha conhecimento dos fatores associados à determinação sexual em mamíferos, este mecanismo permanece um enigma no grupo das aves. Tanto em mamíferos como em aves, a diferença no número de cópias dos cromossomos X ou Z resulta em uma maior dose de genes em um determinado sexo (Melamed & Arnold, 2007). No sistema sexual XX/XY de mamíferos, em que ocorre compensação de dose, um dos cromossomos X é inativado com o objetivo de igualar a quantidade de expressão gênica nos dois sexos (Straub & Becker, 2007; 3 Mank et al., 2011). Entretanto, em aves, parece não ocorrer inativação completa de um dos cromossomos Z em machos. Em galinha doméstica, a expressão média de genes presentes no cromossomo Z é cerca de 30-40% maior em machos do que em fêmeas, mesmo antes da diferenciação gonadal (Itoh et al., 2010; Arnold et al., 2008; Zhang et al., 2010; Morey & Avner, 2011). A despeito disso, um mecanismo ainda não completamente esclarecido de compensação de dose local resulta em expressão equivalente entre os sexos para alguns genes presentes no cromossomo Z (Smith, 2007; McQueen & Clinton, 2009; Itoh et al., 2010). Os papéis dos cromossomos sexuais Z e W na determinação e diferenciação sexual são ainda, em grande parte, desconhecidos e nenhum gene homólogo ao gene SRY (Sex-determining region on the Y chromosome) presente no cromossomo Y de mamíferos terianos (marsupiais e placentários) foi identificado em aves (Teranish et al., 2001). Enquanto algumas evidências apontam para uma associação entre o cromossomo Z e mecanismos de compensação de dose de alguns genes (Z Dosage Model), outros dados apontam para a presença de genes associados ao desenvolvimento sexual feminino no cromossomo W (W Domination Model), assim como o gene SRY de mamíferos desencadeia a diferenciação dos testículos. Por outro lado, também existe a possibilidade da presença de uma dose única de um determinado gene no cromossomo Z ser importante para desencadear o desenvolvimento de fêmeas (Gubbay et al., 1990; Sinclair et al., 1990; Smith, 2007). A teoria referente à dosagem de Z é fundamentada pela ação do gene DMRT1 (Doublesex and Mab-3-Related Transcription Factor 1). Este gene, conservado entre os vertebrados, é fortemente expresso nas gônadas masculinas durante o período embrionário. Em aves, encontra-se presente no cromossomo Z e não apresenta nenhum gene ortólogo no cromossomo W (Raymond et al., 1999; Smith et al., 1999; Nanda et al., 2000; Shan et al., 2000). Quando presente em dose dupla no genoma, favorece o desenvolvimento de gônadas masculinas (Zhao et al., 2010). Smith et al. (2009), ao utilizarem um RNA de interferência (RNAi) para nocautear o gene DMRT1 em embriões de galinha, verificaram uma redução da expressão da proteína DMRT1, o que levou à feminilização das gônadas em embriões geneticamente masculinos (ZZ). A despeito destes dados, não se sabe ainda qual o exato mecanismo de determinação sexual das aves. Há, ainda, a possibilidade de que um ou mais genes ainda não identificados, ligados ao cromossomo W, possam ter um papel antagônico ao do gene DMRT1 e ser o responsável pela determinação sexual em fêmeas (Teranish et al., 2001). Estudos em galinhas triplóides ZZW evidenciam que tais animais se desenvolvem como intersexos, contendo tecidos ovariano e testicular, embora apresentem fenótipo externo feminino (Bonaminio & Fechheimer, 1993; Lin 4 et al., 1995; Smith & Sinclair, 2004; Küpper et al., 2012). Além disso, abordagens de RNA- sequencing, para análise do perfil de transcriptomas, revelaram que, pelo menos, 26 genes são transcricionalmente ativos no cromossomo W de galinha (Ayers et al., 2013) e análises de sequências curtas identificaram ao menos 60 sequências específicas do cromossomo W (Chen et al., 2012). Tais dados evidenciam que, até o momento, não é possível descartar um possível papel do cromossomo W na determinação sexual das aves. O processo de diferenciação sexual em vertebrados pode também envolver, além de genes associados aos cromossomos sexuais, genes presentes nos cromossomos autossômicos. Diversos trabalhos envolvendo expressão gênica, silenciamento gênico, análises de promotores, hibridização in situ em tecidos e embriões, entre outros, têm discutido aspectos evolutivos e funcionais de diversos genes autossômicos candidatos (Morrish & Sinclair, 2002; Manolakou et al., 2006; Ijiri et al., 2008; Graves & Peichel, 2010). Adicionalmente, fatores epigenéticos podem também estar associados a mecanismos regulatórios de determinação sexual e de compensação de dose (Park & Kuroda, 2001; Smith & Sinclair, 2004; Nguyen & Disteche, 2006; Angelopoulou et al., 2008; Yang et al., 2010; Piferrer, 2013). A ampliação de tais análises poderá permitir uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na determinação e diferenciação sexual de aves. 1.2. Identificação de machos e fêmeas de aves sem dimorfismo sexual aparente A identificação do sexo de aves é importante em diversos estudos, sejam estes evolutivos, comportamentais ou conservacionistas (Griffiths & Tiwari, 1995; Double & Olsen, 1997; Komdeur et al., 1997; Lens et al., 1998). Espécies que apresentam dimorfismo sexual externo podem ter o sexo identificado por meio de comparação do peso e comprimento da cauda (Martin et al., 2000), do padrão da plumagem (Baker et al., 1999) ou mesmo do comportamento específico de machos e fêmeas (Jodice et al., 2000). Por outro lado, aproximadamente 50% das aves não apresentam dimorfismo sexual aparente, mesmo em indivíduos adultos (Jensen et al., 2003) e, nestes casos, a identificação de machos e fêmeas pode ser realizada por meio de análises de esteróides fecais, investigações cariotípicas ou métodos cirúrgicos. Entretanto, tais metodologias apresentam diversas desvantagens e podem levar a resultados insatisfatórios. Utilizada na análise de esteróides fecais, a razão entre estrógeno e testosterona não é totalmente fidedigna e, portanto, pode gerar resultados dúbios (Miyaki et al., 1998). A análise de cromossomos em metáfase para distinção dos sexos, além de ser trabalhosa, pois depende geralmente de cultura celular, demandar grande tempo e nem sempre gerar resultados consistentes, não é adequada para espécies cujos 5 cromossomos sexuais sejam idênticos em tamanho e morfologia (Miyaki et al., 1998; Griffiths & Phil, 2000). O exame de laparoscopia, embora possa ser utilizado em qualquer espécie de ave, é invasivo e envolve riscos cirúrgicos, incluindo a ruptura do saco aéreo e até a morte do animal. Além disso, este necessita de administração de anestésico, cuja determinação da relação entre a dose e o peso da ave nem sempre é adequada (Griffiths & Phil, 2000; Grando, 2002). Como alternativa a tais metodologias de identificação de machos e fêmeas, a sexagem por meio de métodos moleculares, envolvendo a amplificação de segmentos de DNA via PCR (Polymerase Chain Reaction), tem sido utilizada em diferentes espécies de aves (Griffiths & Tiwari, 1995; Miyaki et al., 1998; Bertault et al., 1999; Jarvi & Banko, 2000; Hornfeldt et al., 2000; Duan & Fuerst, 2001; Ewen et al., 2001; Russello & Amato, 2001; Wink et al., 2002; Jensen et al., 2003). Gerando resultados altamente confiáveis, este procedimento pode ser realizado com amostras de DNA em quantidades limitadas, o que permite a aplicação de metodologias não destrutivas e até mesmo não invasivas para obtenção de amostras biológicas, fato extremamente importante para evitar ou minimizar o estresse induzido pelo manuseamento dos animais e possíveis riscos a sua saúde (Jensen et al., 2003). Atualmente, um dos marcadores moleculares amplamente utilizados para sexagem de aves refere-se ao gene CHD1 (Chromodomain Helicase DNA Binding Protein 1) - o gene CHD1-Z é encontrado no cromossomo Z, ocorrendo, portanto, em ambos os sexos, enquanto o gene CHD1- W localiza-se no cromossomo W, presente somente nas fêmeas (Griffiths et al., 1998). Embora não existam evidências de recombinação entre estes dois genes e nenhuma cópia autossômica tenha sido identificada, estes não estão diretamente relacionados com a determinação do sexo e com os processos de diferenciação de machos e fêmeas (Kahn et al., 1998). A família de proteínas CHD é caracterizada pela presença de domínios cromo (chromatin organization modifier) que conseguem modular a expressão de genes por meio de modificações na estrutura da cromatina que resultam em alterações no acesso do aparato transcricional ao DNA molde (Strokes & Perry, 1995). Na maioria das espécies de aves, o tamanho do gene CHD1 é um pouco maior no cromossomo W do que no cromossomo Z, devido à presença de bases adicionais em uma região de íntron (Griffiths et al., 1998). Assim, diferentes conjuntos de oligonucleotídeos foram desenvolvidos para serem utilizados em PCR para amplificação de segmentos dos genes CHD1-Z e CHD1-W em um grande número de espécies de aves (Griffiths et al., 1996; Ellegren, 1996; Griffiths et al., 1998; Fridolfsson & Ellegren, 1999). O conjunto de oligonucleotídeos mais comumente utilizado refere-se aos primers denominados P2 e P8 que se anelam a regiões conservadas de éxons dos 6 genes CHD1-Z e CHD1-W e amplificam uma região de íntron que difere em tamanho entre os dois genes, resultando na identificação de um único fragmento de DNA em machos (genótipo homozigoto) e de dois fragmentos distintos em fêmeas (genótipo heterozigoto) (Griffiths et al., 1998). Apesar do alto grau de confiabilidade da sexagem molecular por meio da amplificação de íntrons dos genes CHD1-Z e CHD1-W, falsos resultados podem ser obtidos devido a artefatos técnicos, dado que o produto de PCR do alelo W geralmente é maior do que o do alelo Z, o que pode acarretar em amplificação preferencial do fragmento de DNA de menor tamanho. Tal fato pode fazer com que fêmeas sejam erroneamente identificadas como machos (Robertson & Gemmell, 2006). Além disso, para algumas espécies de aves, como as das famílias Struthionidae e Rheidae (aves ratitas como avestruz e ema) não é possível realizar a identificação do sexo por meio deste protocolo de PCR que utiliza os primers P2 e P8, devido à pequena diferença de tamanho da variação intrônica CHD1-Z e CHD1-W (Ellegren, 1996; Fridolfsson & Ellegren, 1999; Dawson et al., 2001; Sacchi et al., 2004; Huynen et al., 2006; Reddy et al., 2007; Chang et al., 2008; Wang et al., 2008). Embora o delineamento de novos conjuntos de primers (Ito et al., 2003), a separação dos produtos de PCR em gel de poliacrilamida (Kahn et al., 1998; Cortes et al., 1999) e a aplicação de enzimas de restrição (Bermudez-Humaran et al., 2002) tenham sido realizadas visando a sexagem molecular das espécies destas famílias, ainda não foi possível a obtenção de resultados satisfatórios. Uma metodologia alternativa de sexagem molecular, baseada em padrões diferenciais de metilação de uma região denominada MHM (Male Hypermethylated) foi aplicada em exemplares de galinha doméstica, evidenciando padrões sexo-específicos facilmente observáveis em gel de agarose (Caetano & Ramos, 2008). A caracterização desta região em outras aves poderá levar à padronização de novos testes de sexagem molecular, especialmente em espécies para as quais a metodologia mais tradicional, que utiliza primers em PCR para amplificação de íntrons dos genes CHD1-Z e CHD1-W, não é adequada. 1.3. Fatores epigenéticos associados à região MHM (Male Hypermethylated) Definida como o estudo de alterações herdadas mitótica e/ou meioticamente que não podem ser explicadas por mudanças na sequência do DNA (Russo et al., 1996), a epigenética envolve mecanismos que regulam a expressão gênica, como metilação do DNA, modificações pós- traducionais em histonas e presença de RNAs não-codificantes (ncRNAs) tais como miRNAs (micro RNAs), snoRNAs (small nucleolar RNAs) e lncRNAs (long non-coding RNAs). Tais 7 mecanismos, que podem ser reversíveis (James & Renard, 2010), permitem que os organismos integrem informações genômicas e ambientais para modificar a atividade de seus genes para geração de fenótipos específicos (Brock & Fisher, 2005; Bird, 2007; Jirtle & Skinner, 2007; Turner, 2009). Segundo Berger et al. (2009), existem três categorias de sinais que operam, sequencialmente, para o estabelecimento das modificações epigenéticas. A primeira categoria refere-se a um iniciador (denominado epigenator) recebido do ambiente celular, como sinais diferenciais, metabólitos ou variações de temperatura. A segunda categoria, chamada de iniciador epigenético, corresponde a um sinal de resposta na célula que estabelece um contexto na cromatina em um local específico, em resposta ao epigenator. Exemplos de iniciadores epigenéticos incluem proteínas de ligação ao DNA e RNAs não codificantes como o Xist (X-inactive specific transcript) que atua no silenciamento do cromossomo X de mamíferos (Heard, 2004; Chow et al., 2005). O terceiro tipo de sinal (epigenetic maintainer) tem como função a manutenção do estado epigenético, ou seja, a perpetuação dos padrões epigenéticos na cromatina. Exemplos de mantenedores epigenéticos incluem metilação do DNA (em que um grupo metil CH3 é adicionado no carbono 5 de uma deoxicitidina próxima a uma guanidina, ou seja, um dinucleotídeo CpG), modificações de histonas e variantes de histonas (Herman et al., 2004; Berger et al., 2009). Um mecanismo epigenético, referente a diferenças de metilação em fêmeas e machos, associado a ilhas CpG, foi recentemente descrito em Galliformes. Este mecanismo inclui uma região repetitiva no braço curto do cromossomo Z, próxima ao gene DMRT1 e composta por repetições de uma sequência de 2,2Kb, aparece hipometilada e transcrita somente no único cromossomo Z das fêmeas gerando, assim, um RNA não codificante longo (lncRNA). Por outro lado, foi sugerido que esta região é altamente metilada e reprimida em ambos cromossomos Z de machos e, assim, transcricionalmente silenciada. Devido a esta característica, esta região foi denominada de MHM (Male Hypermethylated) (Teranishi et al., 2001). Em galinha doméstica, foi demonstrado que o status MHM estabelece-se durante o desenvolvimento inicial, logo após a fertilização, dependendo da ausência ou presença do cromossomo W (Teranishi et al., 2001; Itoh et al., 2010) e que a presença de transcritos MHM está diretamente associada à diferenciação sexual gonadal (Roeszler et al., 2012). A região MHM parece representar um sítio específico de compensação gênica (Melamed & Arnold, 2007). Em galinhas, embora a maioria dos genes presentes nos cromossomos Z tenha maior grau de expressão em machos do que em fêmeas, alguns genes, como os localizados próximo ao loco MHM, mostram um grau local de compensação de dose entre os sexos (Melamed 8 & Arnold, 2007; Ellegren & Parsch, 2007; Itoh et al., 2007; Arnold et al., 2008; Mank & Ellegren, 2009; Zhang et al., 2010; Itoh et al., 2010). Em fêmeas, o lncRNA gerado a partir do MHM se acumula no núcleo, próximo ao sítio de transcrição deste loco (Teranishi et al., 2001), onde também ocorrem elevados níveis de acetilação da histona 4 do resíduo 16 de lisina (H4K16Ac) (Bisoni et al., 2005), levando a um aumento da expressão de genes que se localizam próximos a esta região (Melamed & Arnold, 2007). Tanto a presença de RNAs não codificantes como a acetilação têm sido associadas a mecanismos epigenéticos envolvidos em outros sistemas de compensação de dose (Bone et al., 1994; Smith et al., 2005). Além disso, Itoh et al. (2011) demonstraram a ocorrência de uma grande diferença na configuração da cromatina no loco MHM, sendo descompactada nas fêmeas e condensada nos machos. Por outro lado, dado que o loco DMRT1 encontra-se adjacente ao loco MHM, tem sido sugerido que o lncRNA codificado pela região MHM poderia se acumular neste local e agir como repressor da expressão do gene DMRT1 em embriões de fêmeas de galinhas e, portanto, ter também um papel no processo de determinação sexual (Teranishi et al., 2001; Yang et al., 2010). Segundo Caetano et al. (2014), MHM é expresso (upregulated) e DMRT1 é desligado (downregulated) em fêmeas de galinhas no mesmo estágio de desenvolvimento e a expressão de MHM nas fêmeas pode ter uma ação semelhante ao ncRNA Xist de mamíferos. Produzidos por um gene presente no cromossomo X, os transcritos Xist acumulados agem como um mecanismo de compensação de dose por intermédio da inativação deste cromossomo associada à modificação de histonas e metilação do DNA (Heard, 2004; Chow et al., 2005). Embora ainda não se saiba exatamente se o loco MHM atua na determinação e/ou diferenciação sexual de aves, um estudo recente, utilizando análise de expressão mediada por retrovírus, investigou o papel potencial desta região no desenvolvimento embrionário de galinhas. Os resultados obtidos confirmaram que este é apenas expresso em diversos órgãos das fêmeas, principalmente nas gônadas. A não expressão de MHM resultou na hipertrofia dos tecidos onde deveria ser expresso (Roeszler et al., 2012). Interessantemente, análises em frangos triplóides sugeriram que a hipermetilação do MHM em machos não é simplesmente determinada pelo número de cromossomos Z por genoma, mas parece ser influenciada pela ausência ou presença do cromossomo W, embora sua função seja ainda desconhecida (Teranish et al., 2001). Até recentemente, acreditava-se que a região MHM estivesse presente exclusivamente no genoma de Galliformes, dado que esta havia sido somente identificada em galinha doméstica (Teranishi et al., 2001; Melamed & Arnold, 2007; Mank & Ellegren, 2009; Itoh et al. 2010), peru (Teranishi et al., 2001, Itoh et al. 2010) e pavão (Teranishi et al., 2001). Sequências de DNA 9 similares à MHM mostraram-se ausentes no passeriforme Taeniopygia guttata (mandarim) (Itoh et al., 2007; Warren et al., 2010; Wang et al., 2014), segunda espécie de ave a ter seu genoma completo sequenciado. Estas também não foram identificadas nos Passeriformes Ficedula albicollis (papa-mosca) (Uebbing et al., 2013) e Corvus corone (gralha preta) (Wolf & Bryk, 2011), nos Struthioniformes Dromaius novaehollandiae (emu) e Struthio camelus (avestruz) (Wang et al., 2014) e no Charadriiformes Charadrius alexandrinus (rolinha-da-praia) (Moghadam et al., 2013). Entretanto, Wright et al. (2015) identificaram a presença da região MHM não somente em outros Galliformes (Numida meleagris - galinha d’angola, Pavo cristatus - pavão e Phasianus colchicus - faisão) como também em espécies da ordem Anseriformes (Anas platyrhynchos - pato-real e Anser cygnoides - ganso africano), ambas pertencentes à superordem Galloanserae. Novas análises em espécies diversas de aves permitirão melhor inferir se a ocorrência de sequências MHM é mais ampla ou restrita a algumas ordens neste grupo de vertebrados. Além disso, será possível gerar informações adicionais acerca dos potenciais mecanismos de compensação de dose associados a esta região do genoma e confirmar se esta região configura-se como um mecanismo complexo de regulação epigenética, em que metilação, modificação de histonas e ncRNAs agem em conjunto na regulação gênica. 10 2. Objetivos 2.1. Objetivo Geral O presente estudo teve como objetivo geral caracterizar a região MHM (Male Hypermethylated) em diferentes espécies de aves, com especial ênfase em Galliformes, visando gerar dados para melhor compreensão acerca de sua distribuição taxonômica e estrutura genômica. 2.2. Objetivos Específicos (1) Identificar a presença/ausência da região MHM em espécies de aves de diferentes ordens (Galliformes, Struthioniformes, Apodiformes, Psittaciformes, Piciformes e Strigiformes); (2) Caracterizar a região MHM quanto à sua sequência nucleotídica, organização genômica e padrões de metilação; (3) Avaliar a eficiência de diferentes metodologias de sexagem molecular em diversas espécies de aves e o potencial do uso de padrões diferenciais de metilação da região MHM para identificação de machos e fêmeas. 11 3. Materiais e Métodos 3.1. Materiais 3.1.1. Espécies estudadas Foram analisados 71 exemplares de aves pertencentes à ordem Galliformes, família Phasianidae - 42 exemplares de Gallus gallus (galinha doméstica), 23 exemplares de Coturnix coturnix (codorna européia) e 6 exemplares de Meleagris gallopavo (peru) (Tabela 1 e Apêndice I), com o objetivo de caracterizar a organização genômica da região MHM e verificar a ocorrência de padrões diferenciais de metilação em machos e fêmeas. Adicionalmente, visando verificar a presença/ausência desta região em aves não Galliformes, também foram analisadas espécies de outras ordens, como Struthioniformes (3 exemplares de Struthio camelus - avestruz, Família Struthionidae), Strigiformes (3 exemplares de Asio clamator - coruja-orelhuda, 1 exemplar de Megascops choliba - corujinha-do-mato, e 1 exemplar de Athene cunicularia - coruja-buraqueira, pertencentes à Família Strigidae, e 1 exemplar de Tyto furcata - coruja-da-igreja, Família Tytonidae), Piciformes (4 exemplares de Ramphastos toco - tucanuçu, Família Rhamphastidae), Psittaciformes (4 exemplares de Anodorhynchus hyacinthinus - arara- azul-grande, Família Psittacidae) e Apodiformes (4 exemplares de Amazilia versicolor - beija-flor- da-banda-branca, 2 exemplares de Eupetomena macroura - beija-flor-tesoura e 2 exemplares de Florisuga fusca - beija-flor-preto, Família Trochilidae) (Tabela 1 e Apêndice I). https://pt.wikipedia.org/wiki/Struthioniformes https://pt.wikipedia.org/wiki/Struthionidae 12 Tabela 1. Espécies utilizadas como material de estudo no presente trabalho. (Imagens obtidas do website The Internet IBC Bird Collection - http://ibc.lynxeds.com) Ordem Família Espécie e n o . de exemplares estudados Nome Comum Foto Galliformes Phasianidae Gallus gallus (42) galinha doméstica Galliformes Phasianidae Coturnix coturnix (23) codorna européia Galliformes Phasianidae Meleagris gallopavo (6) peru Struthioniformes Struthionidae Struthio camelus (3) avestruz Strigiformes Strigidae Asio clamator (3) coruja- orelhuda 13 Strigiformes Strigidae Megascops choliba (1) corujinha-do- mato Strigiformes Strigidae Athene cunicularia (1) coruja- buraqueira Strigiformes Tytonidae Tyto furcata (1) coruja-da- igreja Piciformes Ramphastidae Ramphastos toco (4) tucanuçu Psittaciformes Psittacidae Anodorhynchus hyacinthinus (4) arara-azul- grande 14 Apodiformes Trochilidae Amazilia versicolor (4) beija-flor-da banda-branca Apodiformes Trochilidae Eupetomena macroura (2) beija-flor- tesoura Apodiformes Trochilidae Florisuga fusca (2) beija-flor- preto 3.1.2. Amostras biológicas As amostras biológicas das espécies pertencentes às ordens Strigiformes, Piciformes e Apodiformes foram obtidas do Centro de Medicina e Pesquisa em Animais Silvestres (CEMPAS) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP (Botucatu, SP) que recebe, por intermédio da Polícia Ambiental ou da própria população, animais geralmente associados ao tráfico ilegal ou a posses irregulares. Amostras de arara-azul-grande, provenientes da região de Carajás-PA, foram obtidas por intermédio de coletas do projeto de pesquisa “Conservação das araras-azuis (Anodorhynchus hyacinthinus) no mosaico de Carajás” realizado por meio de convênio entre UNESP-Fundibio (Fundação do Instituto de Biociências) e empresa Vale S.A. As amostras de galinha doméstica foram provenientes do Biotério Central e do Laboratório de Biologia e Toxicologia da Reprodução e do Desenvolvimento do Departamento de Morfologia, ambos localizados no Instituto de Biociências da UNESP (Botucatu, SP). As amostras de codorna européia foram provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia do Instituto de 15 Biociências da UNESP (Botucatu, SP) e de criadores particulares. Amostras de peru e avestruz foram também obtidas de criadores particulares. As amostras da ordem Apodiformes foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Jaes Joseph Roper da Universidade Federal do Paraná. Foram utilizadas amostras de penas e sangue de exemplares adultos, dado que a coleta desses materiais representa uma metodologia não destrutiva e implica em riscos reduzidos aos animais. Após contenção das aves, foram retiradas penas em crescimento (Figura 2) e/ou 0,2-0,5mL de sangue da veia braquial da asa, com seringa descartável. Adicionalmente, também foram utilizados embriões de galinha doméstica e codorna européia com 6 dias de desenvolvimento. Todo material coletado (penas, sangue e embriões) foi armazenado em tubos contendo etanol absoluto e mantido a -20ºC até seu processamento. Figura 2: Coleta de penas de aves utilizadas no presente estudo, realizada no CEMPAS. (A) Tyto furcata (coruja-da-igreja) e (B) Ramphastos toco (tucanuçu). 3.2. Métodos 3.2.1. Extração de DNA A extração de DNA total seguiu o protocolo baseado na utilização de fenol-clorofórmio, como descrito por Bruford et al. (1998) com algumas modificações. Em um tubo de 1,5mL contendo o material biológico coletado, foram acrescentados 300L de TNE (50mM de Tris, 100mM de NaCl e 5mM de EDTA, pH 7,5), 30L de Tris HCl 1M pH 7,5, 8L de SDS 25% e 20L de proteinase K (20mg/mL). O material foi incubado a 37°C durante 12 horas ou a 55°C por 4 horas em banho- maria. Após a incubação, foram acrescentados aproximadamente 360L de fenol : clorofórmio : álcool isoamílico (na proporção de 25:24:1). O material foi rapidamente misturado em vortex e 16 posteriormente centrifugado por 10 minutos a 12.000 rpm. A fase superior do material foi retirada com o auxílio de uma micropipeta e transferida para um novo tubo de 1,5mL. A esse novo tubo, foram adicionados aproximadamente 500L de etanol absoluto e este foi invertido para precipitação do DNA. Posteriormente, o tubo foi centrifugado por 30 minutos a 12.000 rpm e o sobrenadante foi descartado, com auxílio de uma micropipeta. O precipitado obtido foi lavado com 500L de etanol a 70%, centrifugado por 10 minutos a 12.000 rpm e mantido à temperatura ambiente até secar totalmente. O material obtido foi ressuspenso em água ultra pura estéril e armazenado em freezer a -20ºC. 3.2.2. Análise da qualidade e quantidade das amostras de DNA A integridade e a quantidade das amostras de DNA obtidas foram analisadas em gel de agarose 1% imerso em tampão TAE 1x (Tris-Ácido acético-EDTA), corado com Gel Red (Uniscience) (0,1μL/10mL) e visualizado em transiluminador, sob luz ultravioleta. Os géis obtidos foram fotografados com o uso do sistema de foto documentação Stratagene EagleSight (Stratagene). As amostras de DNA também foram avaliadas em espectrofotômetro (Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer - Thermo Fisher Scientific) para quantificação do DNA e verificação de possíveis contaminações por proteínas e/ou solventes orgânicos como álcool/fenol/clorofórmio, por meio da análise das razões de absorbância da luz na faixa de 260/280nm e 230/260nm, respectivamente. 3.2.3. Identificação do sexo das aves 3.2.3.1. Caracteres morfológicos externos Machos e fêmeas adultos e sexualmente maduros das espécies em estudo que apresentavam dimorfismo sexual aparente e inequívoco foram identificados por caracteres morfológicos externos - galinha doméstica (machos: crista e barbela de maior tamanho, esporões pontiagudos, penas da cauda mais compridas), codorna européia (machos: coloração relativamente uniforme das penas peitorais e presença de glândula cloacal; fêmeas: penas peitorais ligeiramente brancas com pintas pretas), peru (machos: maior tamanho, apêndice carnoso sob o bico, penas com zonas de iridescência vermelha, violeta, verde, cobreada, bronze e dourada; fêmeas: penas em tons de castanho e cinza) e avestruz (machos: tamanho e peso maiores, plumagem preta e ponta das asas brancas; fêmeas: plumagem de tonalidade cinza) (Eaton, 1992; Etches, 1996; Kinizetova, 1996; Deeming & Bubier, 1999). 17 3.2.3.2. Sexagem molecular por PCR (Polymerase Chain Reaction) A identificação molecular do sexo de animais adultos foi realizada tanto para as espécies que apresentam dimorfismo sexual aparente consistente como para aquelas que não apresentam diferenças morfológicas ou que possuam diferenças muito discretas entre os sexos. Os embriões de galinha doméstica e codorna européia utilizados no presente estudo também foram molecularmente sexados via PCR. As reações de amplificação foram realizadas utilizado os primers P2 (5’- TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3’) e P8 (5’-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3’), descritos por Griffiths et al. (1998), que amplificam uma região do gene CHD1-W e do gene CHD1-Z em grande parte das espécies de aves. Diferenças de tamanho entre uma região intrônica específica desses genes resultam na amplificação esperada de dois fragmentos de DNA de tamanhos distintos nas fêmeas e apenas um fragmento em machos (Griffiths et al., 1998; Miyaki et al., 1998) (Figura 3). Figura 3. (A) Alelos do gene CHD1 (Chromodomain Helicase DNA Binding Protein 1) encontrados nos cromossomos Z e W de aves. (B) Padrão de bandas geradas pela amplificação dos fragmentos CHD-Z e CHD-W utilizando os primers P2 e P8 em PCR e visualizadas por meio de eletroforese em gel. A amplificação de fragmentos de DNA foi realizada em um volume final de 10µL, sendo 6,1µL de água ultra pura estéril, 1,0µL de tampão (10x), 0,4µL de dNTPs (2mM), 0,4µL de MgCl2 (25mM), 0,1µL de Taq DNA polimerase (5U/µL), 0,5µL do primer P2 (10µm), 0,5µL do primer P8 (10µm) e 1µL de DNA (100ng). As reações de amplificação foram realizadas com desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, seguida de 40 ciclos a 95ºC por 30 segundos, 50ºC por 18 30 segundos e 72ºC por 30 segundos. Um passo adicional de extensão a 72ºC foi realizado por mais 5 minutos. As amostras de DNA foram amplificadas em réplicas (duas reações independentes) e foram utilizados um controle positivo (DNA de uma fêmea previamente analisada cujo resultado de sexagem molecular havia sido corroborado com análises morfológicas) e um controle negativo (reação de amplificação contendo todos os componentes da PCR exceto amostra de DNA, para monitorar qualquer possível contaminação). Embora tenha sido utilizado um único par de oligonucleotídeos iniciadores para amplificação de segmentos de DNA correspondentes aos genes CHD1-Z e CHD1-W, várias abordagens de eletroforese foram utilizadas para identificar as possíveis variações genéticas entre esses cromossomos. Tais abordagens referiram-se à visualização dos produtos de PCR após eletroforese em géis com diferentes resoluções, como em gel de agarose 2% (que permite uma resolução de fragmentos que apresentem 0,1 Kb de diferença), em gel de poliacrilamida 9% (que permite a distinção de fragmentos que apresentem diferenças de tamanho de cerca de 40 pares de bases) e por meio de análise SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) (capaz de detectar diferenças de até um nucleotídeo que podem refletir em mudanças na conformação da fita simples de DNA) (Calladine et al., 1991; Glavac & Dean, 1993; Walker & Rapley, 1999; Brown, 2002; Westermeier, 2005; Morinha et al., 2011; Lee & Bahaman, 2010). ● Eletroforese em gel de agarose Os produtos de amplificação obtidos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Gel Red (Uniscience) (0,1μL/10mL) imerso em tampão TAE 1X (Tris-Ácido acético- EDTA). A corrida foi realizada a 80V, 300A, por 4 horas. Os tamanhos moleculares dos fragmentos amplificados foram estimados por meio de comparação com um marcador de tamanho molecular conhecido. Os géis obtidos foram visualizados em transiluminador, sob luz ultravioleta, e fotografados com o uso do sistema de foto documentação Stratagene EagleSight (Stratagene). ● Eletroforese em gel de poliacrilamida Os produtos de amplificação foram analisados em gel de poliacrilamida 9% corado com nitrato de Prata. Os géis foram elaborados com acrilamida/bisacrilamida 29:1, tampão tris-ácido bórico - EDTA, TBE 1x, 0,01% de TEMED e 0,1% de persulfato de amônio. A corrida foi realizada a 120V, por 1 hora e 30 minutos. Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram estimados por meio de comparação com um marcador de tamanho molecular conhecido. Os géis obtidos foram fotografados com o uso de câmera digital. 19 ● SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) A análise SSCP foi realizada utilizando 8μL do produto de PCR obtido misturados com 8μL de tampão desnaturante (EDTA 10mM pH8,0; azul de bromofenol 0,025% e formamida 98%). Previamente à eletroforese, as amostras foram desnaturadas por 10 minutos a 95°C e imediatamente colocadas em gelo. Em seguida, as fitas desnaturadas foram carregadas em gel de poliacrilamida 9%, conforme descrito no item anterior. A corrida foi realizada a 120V, por aproximadamente 16 horas. Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram estimados por meio de comparação com um marcador de tamanho molecular conhecido a partir de produtos de PCR não desnaturados obtidos de cada amostra pareada. Os géis obtidos foram fotografados com o uso de câmera digital. 3.2.3.3. Análise automatizada de fragmentos de DNA A identificação do sexo dos animais em estudo foi também realizada pela definição do tamanho aproximado dos fragmentos gerados em PCR utilizando os primers P2 e P8, seguindo a técnica descrita por Schuelke (2000) que consiste em gerar produtos de PCR com primers marcados com fluorescência e sua posterior análise por eletroforese capilar. Foram utilizadas amostras de alguns exemplares previamente sexados por meio das demais metodologias empregadas, preferencialmente um macho e uma fêmea de cada uma das espécies estudadas (Apêndice I). As reações de amplificação dos fragmentos de DNA foram realizadas em um volume final de 10µL, sendo 6,0µL de água ultra pura estéril, 1,0µL de tampão (10x), 1,0µL de dNTPs (2mM), 0,2µL de MgCl2 (25mM), 0,1µL de Taq DNA polimerase (5U/µL), 0,1µL do primer P2 + cauda M13 (CACGACGTTGTAAAACGACTCTGCATCGCTAAATCCTTT) (10µM), 0,3µL do primer P8 (10µm), 0,2µL da cauda M13 + fluorescência FAM (Applied Biosystem) e 1µL de DNA (100ng). As reações de amplificação foram realizadas pela desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, seguida de 40 ciclos a 95ºC por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos. Um passo adicional de extensão a 72ºC foi realizado por mais 10 minutos. Em seguida, 0,2μL do marcador molecular GeneScan™ - 500 Rox™ Standard (Applied Biosystem) (2fmol), uma alíquota de 1,0μL de cada amostra amplificada e 1,0μL de água ultra pura estéril foram misturados a Hi-Di™ Formamida (Applied Biosystems) para completar 10μL de solução. Os produtos diluídos foram fracionados após eletroforese capilar em sequenciador automático ABIPrism 3500 (Applied Biosystems). Os picos gerados nos eletroferogramas foram analisados com auxílio do programa computacional GeneMarker v.2.6.3 (Softgenetics). 20 3.2.4. PCR para amplificação da região MHM (Male Hypermethylated) Foram utilizados dois conjuntos de primers, descritos por Caetano & Ramos (2008) com base na sequência nucleotídica de Gallus gallus (acesso GenBank AB046699), para amplificação de segmentos de DNA associados à região MHM (Male Hypermethylated). Segundo os autores, um par de primers (MHMs Forward - 5'-GCCAAACGCTGACAACTCT-3' e MHMa Reverse - 5'- ATGTAGGTAGGTGGGAGGGA-3') amplifica um segmento de 242 pares de bases, mapeado fora de uma ilha CpG, enquanto o outro conjunto de primers (MHMs Forward - 5'- GCCAAACGCTGACAACTCT-3' e MHM2a Reverse - 5'-TCAAACGCTACGATGGAAAT-3) amplifica um segmento de 756 pares de bases que inclui uma ilha CpG. Um controle negativo (reação de amplificação contendo todos os componentes da PCR exceto amostra de DNA) foi sempre utilizado para monitorar qualquer possível contaminação. As amostras de DNA foram amplificadas em um volume final de 12,5µL contendo 1,25 µL de tampão 10x, 0,4µL de MgCl2 (25mM), 0,4µL de dNTPs (2mM), 0,1µL de Taq DNA polimerase (5U/µL), 0,5µL de cada primer (MHM2a e MHMs) (10µM), 1µL de DNA total em uma concentração de 100ng e 9,35µL de água ultra pura estéril. As reações de amplificação foram realizadas sob as seguintes condições: 94 o C por 1 minuto, 62 o C por 1 minuto e 72 o C por 1 minuto, seguidos de 35 ciclos a 94 o C por 40 segundos, 62 o C por 40 segundos e 72 o C por 1 minuto, e por uma extensão final a 72 o C por 10 minutos. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose 1% imerso em tampão TAE 1x (Tris-Ácido acético-EDTA), corado com Gel Red (Uniscience) (0,1μL/10mL) e visualizado em transiluminador, sob luz ultravioleta, e comparados a um marcador de tamanho molecular conhecido. Os géis obtidos foram fotografados com o uso do sistema de foto documentação Stratagene EagleSight (Stratagene). 3.2.5. Sequenciamento nucleotídico Os produtos de PCR de maior tamanho, obtidos com o conjunto de primers MHMs e MHM2a, foram purificados com a enzima Exosap IT (Affymetrix) e posteriormente sequenciados em sequenciador automático ABI 3500 (Applied Biosystems), utilizando o kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing v.3 (Applied Biosystems). Cada reação de sequenciamento constou de 1,2µL de solução Big Dye, 1μL do primer forward ou reverse (10μM) e 5µL do produto de PCR (10 ng/µL). As reações foram colocadas em termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 96ºC por 1 minuto, seguida de 25 ciclos a 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 30 segundos e 60ºC por 4 minutos, mais um passo adicional de extensão a 72º C por 10 minutos. Em seguida, foram adicionados 4μL de água ultra 21 pura estéril e 16μL de etanol 95%. A solução foi misturada em agitador de tubos e mantida por 15 minutos à temperatura ambiente (~25ºC). A amostra foi centrifugada por 30 minutos a 12.000 rpm e o sobrenadante foi retirado com auxílio de uma micropipeta. O precipitado obtido foi lavado com 200μL de etanol 70% e a solução foi misturada em um agitador de tubos e novamente centrifugada por 7 minutos a 12.000 rpm para nova retirada do sobrenadante, com auxílio de uma micropipeta. A amostra obtida foi seca a 90ºC durante 2 minutos e os fragmentos de DNA obtidos foram posteriormente dissolvido em 1,6μL de formamida : dextran azul 25mM EDTA (5:1), ressuspenso e desnaturado por 2 minutos a 90ºC em banho seco. 1,6μL de cada amostra foram carregadas no seqüenciador automático. 3.2.6. Análise das sequências nucleotídicas A visualização dos eletroferogramas das sequências nucleotídicas obtidas foi realizada por meio do programa computacional Chromas Lite 2.01 (Technelysium Pty Ltd., 2007). As sequências individuais geradas foram posteriormente editadas e alinhadas com os programas computacionais Geneious 4.8.5 (Drummond, 2009) e Clustal W (Thompson et al., 1994) (http://www2.ebi.ac.uk/clustalw). As sequências consenso foram determinadas manualmente. Para comparar as sequências obtidas com outras sequências depositadas no GenBank, incluindo sequências de Gallus gallus (access AB046699) (Teranish et al., 2001), e confirmar a identidade das sequências geradas, foi utilizado o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al. 1990), por meio do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), o qual relaciona sequências por meio de similaridade entre bases nitrogenadas. Futuramente, as sequências obtidas no presente trabalho serão também depositadas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide). 3.2.7. Análise in silico da sequência e organização genômica da região MHM A sequência de bases nitrogenadas das repetições concatenadas associadas à região MHM - de aproximadamente 2,2Kb descrita por Teranishi et al. (2001) (Genbank acession number AB046699.1 e AB046698.1) e de aproximadamente 1,8Kb identificada como “short MHM- related sequence” (sMHM) por Itoh et al. (2011) - foram alinhadas na montagem do cromossomo Z (Assembly Chicken Nov 2011-CGSC Gallus_gallus-4.0/galGal4) disponível no UCSC Genome Browser (UC Santa Cruz Genomics Institute, University of California Santa Cruz, http://genome.ucsc.edu). A ferramenta BLAT Search Genome, que localiza sequências de, pelo menos, 95% de identidade em 25 bases ou mais de comprimento e que gera índices baseados em http://www2.ebi.ac.uk/clustalw http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide http://genome.ucsc.edu/ 22 genomas completos, foi utilizada para delimitar a posição em nucleotídeos das repetições MHM no cromossomo Z e verificar a sobreposição de outras características na respectiva sequência genômica, incluindo a presença de elementos repetitivos interdispersos. O programa computacional RepeatMasker Open-3.0 (http://www.repeatmasker.org.1996-2010) foi utilizado para verificar o conteúdo de CG e a presença de ilhas CpG, segundo os critérios propostos por Gardiner-Garden & Frommer (1987), que definem como uma ilha CpG um fragmento de pelo menos 200 pares de bases, com conteúdo mínimo de CG de 50% e razão maior do que 0,6 entre os números de dinucleotídeos CpG observado e esperado com base no número de citosinas e guanina no segmento. Para a caracterização de ilhas CpG também foi utilizado o programa Methyl Primer Express v.1 (Applyed Biosystems) (http://www.appliedbiosystems.com), seguindo o critério proposto por Takai & Jones (2002) que define como uma ilha CpG um fragmento de pelo menos 500 pares de bases, com conteúdo mínimo de CG de 55% e razão maior do que 0,65 entre os números de dinucleotídeos CpG observado e esperado com base no número de citosinas e guaninas no segmento. As diferenças detectadas na sequência de nucleotídeos das repetições in tandem e a distribuição dos elementos repetitivos foram utilizadas como parâmetros para a divisão da região MHM em sub-regiões. Para cada sub-região, a identidade/similaridade da sequência de bases de cada repetição e dos elementos repetitivos flanqueados foi avaliada pelo alinhamento de sequências múltiplas, segundo a ordem ao longo da sub-região, utilizando-se o programa Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). A orientação e extensão relativas das sub-regiões e das repetições associadas à região MHM foram delimitadas com o uso da ferramenta bl2seq (Align two sequences using BLAST) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) usando-se como sequência query a região MHM (posição em nucleotídeos chrZ:27,000,000-27,260,000) e, como subject, a sequência nucleotídica de cada sub-região ou unidade de repetição. 3.2.8 Análise da metilação da região MHM por MSRE-PCR (Methylation Sensitive Restriction Enzyme-Polymerase Chain Reaction) e MDRE-PCR (Methylation Dependent Restriction Enzyme-Polymerase Chain Reaction) Amostras de DNA das espécies pertencentes à ordem Galliformes (galinha, codorna européia e peru) foram utilizadas em ensaios de digestão enzimática para verificação dos padrões de metilação no loco MHM. As digestões enzimáticas foram realizadas com as enzimas MspI e HpaII (Invitrogen) cujos sítios de reconhecimento são CC m GG e CCGG, respectivamente. Embora sejam http://www.repeatmasker.org.1996-2010/ http://www.appliedbiosystems.com/ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 23 enzimas isoesquizômeras - reconhecem a mesma sequência de DNA -, estas exibem diferentes sensibilidades a modificações de metilação no DNA, o que permite discriminar sequências metiladas e não-metiladas (Figura 4). Figura 4: Características de sítios de corte e sensibilidade à metilação das enzimas de restrição MspI e HpaII. (A, C) Sítios de reconhecimento das mesmas sequências, embora HpaII corte somente regiões não metiladas e MspI corte regiões metiladas e não metiladas. (B) Sítio de corte das enzimas. (modificado de Zilberman & Henikoff, 2007). Visando a obtenção de resultados mais robustos, foi também utilizada uma terceira enzima de restrição (McrBC) dependente de metilação que reconhece citosinas metiladas precedidas por uma purina (5’….Pu m C(N40-3000) Pu m C….3’). Alíquotas de 1µL de DNA total (cerca de 100ng) foram tratadas com 1U de cada enzima de restrição, separadamente, em 1µL de tampão 10x, 0,1 BSA e 6,9µL de água ultra pura estéril, durante 16 horas a 37 o C. Amostras digeridas com cada uma das enzimas e uma amostra controle (DNA não digerido) foram utilizadas em reações de amplificação únicas ou multiplex, com os primers MHMs, MHMa e MHMa2 descritos no item 3.2.4. As reações de amplificação foram realizadas em um volume total de 12,5µL contendo 1,25 µL de tampão de PCR 10x , 0,4µL de MgCl2 (25µM), 0,4µL de dNTPs (2mM), 0,1µL de Taq DNA polimerase (5U/µL), 0,5µL de cada primer (10µM), 1µL de DNA total em uma concentração de 100ng e 9,35µL de água ultra pura estéril. As condições da 24 PCR foram: 94 o C por 1 minuto, 62 o C por 1 minuto e 72 o C por 1 minuto, seguidas de 35 ciclos a 94 o C por 40 segundos, 62 o C por 40 segundos e 72 o C por 1 minuto, além de uma extensão final a 72 o C por 10 minutos. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose 1% imerso em tampão TAE 1x (Tris- Ácido acético-EDTA), corado com Gel Red (Uniscience) (0,1μL/10mL) e visualizado em transiluminador, sob luz ultravioleta, e comparados a marcadores de peso molecular conhecido. Os géis obtidos foram fotografados com o uso do sistema de foto documentação Stratagene EagleSight (Stratagene). A Figura 5 indica os resultados esperados para a abordagem de MSRE-PCR, baseando-se nos padrões diferenciais de metilação de dinucleotídeos CpG contidos em sítios de reconhecimento das enzimas de restrição MspI e HpaII flanqueados pelos primers específicos para a amplificação da região MHM de interesse. Figura 5: Diagrama das principais etapas da análise MSRE-PCR (Methylation Sensitive Restriction Enzyme-Polymerase Chain Reaction) mostrando os padrões/resultados esperados após os ensaios de digestão enzimática com as enzimas MspI e HpaII, posterior PCR e visualização dos resultados por eletroforese. 25 4. Resultados e Discussão 4.1. Amostragem biológica A sexagem molecular representa um dos testes mais comumente aplicados em aves, tanto silvestres como de cativeiro. Baseadas em análises de fragmentos de DNA, as diferentes metodologias atualmente disponíveis para identificação molecular de machos e fêmeas requerem a amostragem geralmente de sangue ou penas que se configuram como metodologias não destrutivas e que não alteram substancialmente o comportamento ou a sobrevivência dos animais (e.g. Harvey et al., 2006). Adicionalmente, as hemácias das aves são nucleadas, o que faz com que estas representem uma rica fonte de DNA nuclear (Claver & Quaglia, 2009). Penas em crescimento também constituem um material adequado para isolamento de DNA, já que estas contêm tecido rico em divisões celulares na região da polpa dérmica (Segelbacher et al., 2002; Pough et al., 2005). No presente trabalho, amostras de DNA foram obtidas de penas e/ou sangue de exemplares adultos de galinha doméstica, codorna européia, peru, avestruz, coruja-orelhuda, corujinha-do- mato, coruja-da-igreja, coruja-buraqueira, tucanuçu, arara-azul-grande, beija-flor-da-banda- branca, beija-flor-tesoura e beija-flor-preto, com concentrações médias de 100ng/l. Apesar de grande parte das amostras de DNA ter sido isolada de penas, muitas vezes de pequeno tamanho, estas apresentaram valores geralmente entre 1,8 a 2,1 em comparações de absorbância a 260/280nm ao espectrofotômetro e, portanto, com qualidade excelente para uso em PCR. De forma similar, as amostras de DNA isoladas de tecido sanguíneo também apresentaram valores de 1,8 a 2,1 em comparações de absorbância a 260/280nm ao espectrofotômetro. Embora se tenha priorizado o uso de amostragens biológicas não-destrutivas, especialmente adequadas para as espécies das ordens Strigiformes, Piciformes, Psittaciformes e Apodiformes, que se configuram como objetos de programas conservacionistas, amostragens destrutivas foram empregadas para as espécies não silvestres, com o objetivo de comparar padrões de metilação em diferentes estágios de desenvolvimento. Para tanto, foram utilizados embriões de galinha doméstica e codorna européia com 6 dias, fase em que a diferenciação gonadal inicia-se (Gilbert, 2003; Smith & Sinclair, 2004), o que permitiu a obtenção de amostras de DNA com concentrações de 250-850ng/l. Análises em gel de agarose 1% ratificaram as concentrações e a integridade das amostras de DNA isoladas, demonstrando que estas são adequadas para uso em PCR e digestões enzimáticas. 26 A Figura 6 evidencia resultados obtidos de penas em crescimento, sangue e embriões de codorna européia. Figura 6: Resultado de eletroforese em gel de agarose 1% evidenciando amostras de DNA obtidas a partir de embrião (A), penas em crescimento (B) e sangue (C) de codorna européia. Ma, marcador de massa molecular; ng, nanogramas. 4.2. Sexagem das aves Em diversas áreas de pesquisa, como conservação biológica, genética, ecologia, evolução e comportamento, a identificação de machos e fêmeas é de extrema importância. Em aves, nem sempre é possível identificar o gênero somente pela observação de caracteres morfológicos ou comportamentais e a correta identificação do sexo pode ser difícil até mesmo em espécies que apresentam dimorfismo sexual, já que tais características muitas vezes são sutis ou aparecem somente após o período de maturidade sexual (Pough et al., 2005). O uso de análises morfológicas ou morfométricas para identificação de machos e fêmeas é ainda mais complicado quando o tamanho corpóreo ou a coloração das penas varia entre regiões geográficas (Kahn et al., 1998; Shepard et al., 2004). A distinção de machos e fêmeas pode ser também realizada por meio de análises de esteróides fecais para quantificação de estrógeno e testosterona, investigações cariotípicas para visualização dos cromossomos sexuais ou laparoscopia para exame das gônadas. Entretanto, estas metodologias podem levar a resultados inconsistentes e até mesmo a riscos para os animais (Miyaki et al., 1998; Griffiths & Phil, 2000; Grando, 2002). Em meados dos anos 90, técnicas moleculares de sexagem de aves começaram a ser aplicadas com o objetivo de superar estas limitações (Ellegren, 1996; Griffiths et al., 1996). 27 A correta identificação do sexo dos animais mostrou-se essencial no presente trabalho, dado que este visou verificar a ocorrência de padrões diferenciais de metilação de uma região encontrada no cromossomo Z de machos e fêmeas, como já descrito para Gallus gallus (Teranishi et al., 2001; Itoh et al., 2010). Desta forma, os exemplares adultos e os embriões utilizados neste estudo tiveram seu sexo identificado por meio da visualização de características morfológicas externas e sexagem molecular baseada na amplificação e visualização de fragmentos dos genes CHD1-Z e CHD1-W em gel de agarose ou de poliacrilamida, análises de SSCP e análise automatizada de fragmentos por eletroforese capilar (Apêndice I). Como não existe uma técnica de análise de DNA que possa ser amplamente utilizada em aves para identificação de machos e fêmeas (Ito et al., 2003; Dubiec & Zagalska-Neubauer, 2006; Morinha et al., 2011), foram utilizadas diferentes abordagens moleculares para detecção da variação genética entre esses genes, o que permitiu definir as melhores metodologias para as diferentes espécies (Tabela 2). Somente não foi possível diferenciar, por meio das técnicas moleculares utilizadas no presente estudo, machos e fêmeas de avestruz. A sexagem molecular realizada baseou-se na amplificação de uma região intrônica que, em diversas espécies de aves, difere em tamanho entre os genes CHD1-Z e CHD1-W, resultando na identificação de um único fragmento de DNA em machos e de dois fragmentos em fêmeas (Griffiths et al., 1998). A Figura 7 indica a localização do gene CHD-1 no cromossomo sexual Z e os sítios de anelamento dos primers P2 e P8 utilizados no presente trabalho. Estes oligonucleotídeos vêm sendo empregado com sucesso em diferentes espécies e têm resultado em padrões de bandas altamente específicas, sendo mais vantajosos que outros oligonucleotídeos também associados ao gene CHD1 mas que não apresentam uma aplicação ampla em aves (Jensen et al., 2003). Dois fragmentos de DNA de tamanhos distintos e um único fragmento de DNA puderam ser claramente identificados, em fêmeas e machos, respectivamente, de galinha doméstica, arara-azul- grande e tucanuçu (Tabela 2 e Figuras 8A e 10). Entretanto, para os demais Galliformes (codorna européia e peru) e também para avestruz e todos Strigiformes (espécies de corujas) e Apodiformes analisados (espécies de beija-flor), tais diferenças não puderam ser visualizadas ou não se mostraram muito consistentes em gel de agarose (Tabela 2, Apêndice I e Figuras 8A e 10). Este resultado provavelmente relaciona-se a diferenças de tamanho menos evidentes entre os íntrons dos genes CHD1-Z e CHD1-W, observadas em algumas espécies de aves (Morinha et al., 2011; Chen et al., 2012), que não puderam ser identificadas em gel de agarose a uma concentração de 2% já que este não permite uma alta resolução de fragmentos com tamanhos muito próximos 28 (Calladine et al., 1991; Westermeier, 2005; Lee & Bahaman, 2010). Geralmente, a diferença de tamanho entre os fragmentos dos genes CHD1-Z e CHD1-W amplificados com o conjunto de primers P2 e P8 varia de 10 a 80 pares de bases (Fridolfsson & Ellegren, 1999; Jensen et al., 2003) e, assim, fragmentos mais similares em tamanho não conseguem ser resolvidos nesta condição. Para as espécies e indivíduos para os quais não foi possível identificar diferenças de fragmentos de DNA entre machos e fêmeas em gel de agarose, foram também realizadas análises em gel de poliacrilamida (Tabela 2, Apêndice I, Figuras 8B, 9 e 10). Tanto produtos diretos de PCR como produtos desnaturados (análises SSCP) foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida neutro, já que este, por possuir uma matriz com poros menores, proporciona uma melhor definição de bandas com tamanhos muito próximos (Walker & Rapley, 1999) - concentrações de acrilamida de 9-10% permitem uma excelente resolução de fragmentos de 30 a 1.000 pares de bases (Calladine et al., 1991; Brown, 2002). Além disso, a metodologia de SSCP é altamente sensível e capaz de detectar diferenças de até um nucleotídeo. Nesta, a desnaturação parcial de fragmentos de DNA amplificados via PCR faz com que estes migrem no gel de poliacrilamida como dois fragmentos de fita simples cujas estruturas secundárias dependem de sua sequência de bases e de seu tamanho (Glavac & Dean, 1993; Morinha et al., 2011), o que torna a análise SSCP potencialmente apropriada para identificação de machos e fêmeas de espécies de aves que apresentem tamanhos muito similares entre os genes CHD1-Z e CHD1-W. As análises em gel de poliacrilamida utilizando produtos de PCR não desnaturados permitiram identificar, com segurança, o sexo de exemplares de galinha doméstica, codorna européia, peru, arara-azul-grande, tucanuçu, coruja-orelhuda, corujinha-do-mato, coruja-da-igreja, beija-flor-da- banda-branca, beija-flor-tesoura e beija-flor-preto (Tabela 2 e Apêndice I), por meio da visualização de dois fragmentos de DNA em fêmeas e um único fragmento de DNA em machos (Figuras 8B, 9 e 10). Os resultados obtidos por meio das análises SSCP mostraram que esta metodologia foi altamente eficaz para sexagem das espécies em estudo, com exceção de codorna européia, avestruz e beija-flor-da-banda-branca (Figuras 9 e 10). Dado que as duas amostras de beija-flor-preto referiam-se a duas fêmeas (Apêndice I), não foi possível verificar a aplicabilidade da técnica de SSCP para sexagem de exemplares desta espécie. Problemas metodológicos, como o uso de concentrações não favoráveis de acrilamida e bisacrilamida ou a presença de primers livres (Fijita & Silver, 1994), podem ter levado aos resultados observados em codorna européia e beija- flor-da-banda-branca já que exemplares dessas duas espécies puderam ser molecularmente sexados por meio da visualização de fragmentos de DNA não desnaturados associados aos genes 29 CHD1-Z e CHD1-W em gel de poliacrilamida (Figuras 8B e 10). Ademais, a técnica de SSCP foi aplicada com sucesso, por Morina et al. (2011), para sexagem molecular em duas espécies de codorna utilizando o mesmo conjunto de primers do presente estudo, o que indica que esta também se configura como alternativa viável para identificação de machos e fêmeas de Coturnix coturnix. Análises SSCP mostram-se especialmente úteis para identificação do gênero em espécies de corujas dado que diversos trabalhos têm relatado resultados dúbios de sexagem por meio do uso de diferentes conjuntos de oligonucleotídeos, incluindo os primers P2 e P8 que amplificam íntrons dos genes CHD1, e posterior eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida (Griffiths et al., 1998; Lepert et al., 2006; Wang et al., 2008). A impossibilidade de identificação de machos e fêmeas de avestruz por meio do uso do conjunto de primers P2 e P8 em PCR e posterior análise dos resultados de amplificação por meio das diferentes técnicas empregadas (Figuras 8, 9 e 10) pode ser correlacionada à pequena diferença de tamanho entre os cromossomos Z e W das aves Ratitas (Ansari et al., 1988; Solari, 1994; Ellegren, 1996; Griffiths et al., 1996; Nishida-Umehara et al., 1999), o que se reflete em diferenças diminutas ou mesma na ausência de diferenças de tamanho dos íntrons dos genes CHD1-Z e CHD1-W (Ellegren, 1996; Fridolfsson & Ellegren, 1999; Dawson et al., 2001; Sacchi et al., 2004; Huynen et al., 2006; Reddy et al., 2007; Chang et al., 2008; Wang et al., 2008). Os resultados das análises SSCP também indicam a ausência de diferenças na sequência de bases dos segmentos dos genes CHD1-Z e CHD1-W amplificados de machos e fêmeas de avestruz. A genotipagem utilizando eletroforese capilar mostra-se uma estratégia alternativa para a discriminação de genótipos que apresentam diferenças muito reduzidas de tamanho, especialmente se estas variarem entre 2 a 44 pares de bases (Morinha et al., 2011). Desta forma, a identificação de machos e fêmeas por meio de genotipagem automatizada foi aplicada em exemplares previamente sexados por meio das demais técnicas empregadas. Para tanto, foram utilizados um macho e uma fêmea de galinha doméstica, codorna européia, peru, tucanuçu, arara-azul-grande e beija-flor-da-banda-branca e todos exemplares de coruja-orelhuda, corujinha-do-mato e coruja-da- igreja. Além disso, amostras de DNA de todos os exemplares de avestruz, para as quais não havia sido possível a identificação do sexo por meio de técnicas moleculares, também foram utilizadas para geração de genótipos moleculares (Apêndice I). Os resultados observados, por meio de eletroferogramas - em que se observam dois picos de tamanhos diferentes para fêmeas e apenas um para machos (Figura 11) - corroboraram os dados prévios de identificação do sexo em galinha doméstica, peru, codorna européia, tucanuçu, arara- 30 azul-grande e todos exemplares de coruja-orelhuda, corujinha-do-mato e coruja-da-igreja. A Figura 11 exemplifica a determinação dos genótipos de um macho e uma fêmea de coruja- orelhuda, associados aos genes CHD1-Z e CHD1-W, mostrando a presença de dois fragmentos de DNA com 9 pares de bases de diferença. Ao contrário do padrão esperado, as fêmeas de beija-flor-da-banda-branca analisadas no presente trabalho apresentaram apenas um pico no eletroesferograma de genotipagem, não sendo, portanto, possível a distinção entre machos e fêmeas pelo processo de genotipagem empregado. Lee et al. (2009) também identificaram um único pico em algumas amostras de fêmeas de Amazilia versicolor, o que pode estar relacionado a variações nucleotídicas individuais no local de ligação dos primers ou ao uso de amostras de DNA degradadas. A metodologia de genotipagem automatizada também não gerou resultados adequados para identificação do sexo dos exemplares de avestruz, dado que não foi possível observar diferenças entre os picos dos eletroesferograma de machos e fêmeas, confirmando a ausência de diferenças no tamanho dos íntrons associados aos genes CHD1-Z e CHD1-W em Struthioniformes (Fridolfsson & Ellegren, 1999; Sacchi et al., 2004; Huynen et al., 2006; Chang et al., 2008; Wang et al., 2008). A despeito de algumas dificuldades na visualização dos resultados dos produtos amplificados por meio de PCR, o uso dos primers P2 e P8 para geração de fragmentos diferenciais em machos e fêmeas mostrou-se vantajoso para as espécies do presente estudo. Embora tais oligonucleotídeos possam gerar a amplificação preferencial do íntron de menor tamanho, geralmente associado ao gene CHD1-Z, e assim identificar erroneamente fêmeas como sendo machos, a comparação dos resultados de diferentes tipos de análise dos produtos de PCR permitiu identificar com precisão o sexo dos animais. As metodologias empregadas somente não permitiram identificar machos e fêmeas de avestruz. Não somente a separação dos produtos de PCR, gerados com o uso dos primers P2 e P8, em gel de poliacrilamida (Kahn et al., 1998; Cortes et al., 1999), como também o delineamento de outros conjuntos de oligonucleotídeos para amplificação dos genes CHD1-Z e CHD1-W (Ito et al., 2003) e a aplicação de enzimas de restrição (Bermudez-Humaran et al., 2002) não têm mostrado sucesso para a sexagem molecular das espécies de aves da ordem Struthioniformes. Uma técnica alternativa, baseada na amplificação de fragmentos de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) convertidos em marcadores SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), por meio de PCR multiplex, gerou resultados positivos para identificação de machos e fêmeas de avestruz (Mine, 2002; Hinckley et al., 2005). Entretanto, esta metodologia é dispendiosa e gera múltiplos https://pt.wikipedia.org/wiki/Struthioniformes 31 fragmentos, o que dificulta a correta visualização de padrões sexo-específicos, especialmente se as condições de PCR não forem altamente padronizadas. Desta forma, a identificação e caracterização de outros segmentos de DNA que apresentem padrões sexo-específicos poderão subsidiar a identificação molecular de machos e fêmeas de Struthionifomes. Tabela 2: Metodologias moleculares aplicáveis para identificação de machos e fêmeas das espécies estudadas. Sexagem baseada na visualização de características morfológicas externas (CME) e sexagem molecular baseada na amplificação e visualização de fragmentos dos genes CHD1-Z e CHD1-W em gel de agarose (AGAR), gel de poliacrilamida (POL), análise SSCP (SSCP) e genotipagem automatizada (GA). Ordem Família Espécie Métodos de sexagem Galliformes Phasianidae Gallus gallus (galinha doméstica) CME/AGAR/POL/SSCP/GA Coturnix coturnix (codorna européia) CME/POL/GA Meleagris gallopavo (peru) CME/POL/SSCP/GA Struthioniformes Struthionidae Struthio camelus (avestruz) CME Strigiformes Strigidae Asio clamator (coruja-orelhuda) POL/SSCP/GA Megascops choliba (corujinha-do-mato) POL/SSCP/GA Athene cunicularia (coruja-buraqueira) POL/SSCP/GA Tytonidae Tyto furcata (coruja-da-igreja) POL/SSCP/GA Piciformes Ramphastidae Ramphastos toco (tucanuçu) AGAR/POL/SSCP/GA Psittaciformes Psittacidae Anodorhynchus hyacinthinus (arara-azul-grande) AGAR/POL/SSCP/GA Apodiformes Trochilidae Amazilia versicolor (beija-flor-da-banda-branca) POL Eupetomena macroura (beija-flor-tesoura) POL/GA*/SSCP Florisuga fusca (beija-flor-preto) POL *sexagem realizada pelo Prof. Dr. Jaes Joseph Roper (Universidade Federal do Paraná). 32 Figura 7. Representação esquemática dos genes CHD1-Z e CHD1-W. (A) Localização do gene CHD1- Z, no braço longo do cromossomo Z de Gallus gallus (chrZ:51,097,769-51,146,189) constituído por 37 éxons distribuídos ao longo de 48.420 pares de bases e uma ilha CpG associada à sua região promotora. Os primers P2 e P8 geram um produto de PCR de 345 pares de bases e possuem sítios de anelamento nos éxons 23 e 24, respectivamente, que flanqueiam um íntron pequeno do gene CHD-Z. (B) Alinhamento da sequência do íntron do gene CHD1-Z no cromossomo W de G. gallus que prediz um produto correspondente a 362 pares de bases (Align two sequences using BLAST, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 33 Figura 8. Produtos de PCR, relativos à amplificação de segmentos dos genes CHD1-Z e CHD1-W em diferentes espécies de aves, visualizados em gel de agarose (A) e poliacrilamida (B). 1 - galinha doméstica, 2 - peru, 3 - codorna européia, 4 - avestruz, 5 - arara-azul-grande, 6 - tucanuçu, 7 - coruja- orelhuda (padrão de fragmentos também observado para as demais espécies de corujas) e 8 - beija-flor- preto (padrão de fragmentos também observado para as demais espécies de beija-flores). Ma, marcador de tamanho molecular conhecido; pb, pares de bases; F, fêmea; M, macho; C, controle negativo (ausência de amostra de DNA em PCR). 34 Figura 9. Produtos de PCR, relativos à amplificação de segmentos dos genes CHD1-Z e CHD1-W em diferentes espécies de aves, visualizados por meio de análise SSCP. 1 - galinha doméstica, 2 - peru, 3 - codorna européia, 4 - avestruz, 5 - arara-azul-grande, 6 - tucanuçu, 7 - coruja-orelhuda (padrão também observado para as demais espécies de corujas), 8 - beija-flor-da-banda-branca, 9 - beija-flor- tesoura e 10 - beija-flor-preto. F, fêmea; M, macho. 35 Figura 10. Comparação dos resultados de sexagem molecular relativos à amplificação de segmentos dos genes CHD1-Z e CHD1-W em diferentes espécies de aves. (A) gel de agarose, (B) gel de poliacrilamida, (C) análise SSCP. Ma, marcador de tamanho molecular conhecido; F, fêmea; M, macho. O padrão observado para coruja-orelhuda também foi observado para as demais espécies de corujas. 36 Figura 11. Eletroferogramas relativos à genotipagem automatizada de coruja-orelhuda evidenciando dois alelos de tamanhos diferentes associados aos genes CHD1-Z e CHD1-W em fêmeas (A) e alelos de tamanhos iguais associados ao gene CHD1-Z em machos (B). 37 4.3. Caracterização in silico da região MHM de galinha doméstica Grande parte do conhecimento sobre a determinação e diferenciação sexual das aves vem de estudos em Gallus gallus, cujo genoma completo está disponível no GenBank (Hillier et al., 2004; Bisoni et al., 2005). Seus cromossomos são organizados em 39 pares, sendo 28 pares de microcromossomos, 10 pares de macrocromossomos e 1 par de cromossomos sexuais. Nesta espécie, a diferenciação sexual ocorre entre o 6º e o 21º dia do período embrionário, quando as gônadas começam a se diferenciar em ovários ou testículos (Chue & Smith, 2011). Por outro lado, pouco se sabe sobre os mecanismos genéticos responsáveis pelo desencadeamento das diferenças entre machos e fêmeas. Identificada até o momento somente em espécies das ordens Galliformes e Anseriformes (Teranishi et al., 2001; Teranishi & Mizuno, 2004; Caetano & Ramos, 2008; Itoh et al., 2010; Itoh et al., 2011; Caetano et al., 2014; Wright et al., 2015), ambas pertencentes à superordem Galloanserae, a região MHM pode estar associada a um mecanismo de diferenciação sexual gonadal (Roeszler et al., 2012), representando um potencial sítio específico de compensação gênica nas aves (Melamed & Arnold, 2007). Segundo Teranishi et al., 2001, esta região apresenta um padrão diferencial de metilação em fêmeas e machos de galinha doméstica. Em fêmeas, a região MHM apresenta-se hipometilada, sendo transcrita no cromossomo Z e gerando, assim, um lncRNA. Por outro lado, em machos, esta aparece hipermetilada e reprimida em ambos cromossomos Z, sendo assim transcricionalmente inativa. Embora ainda não se saiba com certeza se o loco MHM atua na diferenciação sexual de aves, foi sugerido que este possui um papel regulatório sobre o gene DMRT1, dado que ambos localizam-se próximos um do outro, no braço curto do cromossomo Z. O lncRNA produzido pelo MHM poderia se acumular neste local e agir como repressor da expressão do gene DMRT1 em embriões de fêmeas de galinhas, uma vez que este gene está relacionado com a formação dos testículos (Teranishi et al., 2001; Yang et al., 2010). Visando contribuir com estudos acerca da função, evolução e organização da região MHM, no presente estudo este segmento de DNA de galinha doméstica foi analisado por meio de simulação computacional para construção de um modelo de sua estrutura genômica. O alinhamento das sequências repetidas previamente descritas como associadas à região MHM de galinha doméstica por Teranishi et al. (2001) e por Itoh et al. (2011) revelou múltiplos hits no segmento de 260Kb localizado no braço curto do cromossomo Z (posição em nucleotídeos chrZ:27,000,000- 27,260,000). Este segmento genômico é caracterizado por um alto conteúdo de CG, delimitado por duas LINES (Long Interspersed Nuclear Elements) que apresentam conteúdo de CG menor em 38 relação às sequências adjacentes. Entre essas LINES, há uma região intermediária também apresentando menor conteúdo de CG. De forma geral, a região MHM de galinha doméstica apresenta múltiplos elementos repetitivos da classe LTR (Long Terminal Repeat), especialmente os pertencentes à família EVRL (Endogenous Retrovirus), denominados GGLTR5A. Baseado na posição e distribuição desses elementos e na composição da sequência repetitiva entre LTRs consecutivas, no presente trabalho, a região MHM foi subdividida em sub-regiões, numeradas do contrômero para o telômero do cromossomo Z: sub-região 1 (chrZ:27,176,712-27,260,282), sub- região 2 (chrZ:27,132,044-27,174,901), sub-região 3a (chrZ:27,094,512-27,132,043), sub-região 4 (chrZ:27,036,950-27,094,511) e sub-região 3b (chrZ:27,000,000-27,036,949) (Figura 12 e Apêndice II). Considerando-se que a região MHM caracteriza-se por repetições concatenadas, buscou-se avaliar a identidade das LTRs correspondentes a cada sub-região, bem como os segmentos de DNA localizados entre LTRs. Essa análise diferenciou as LTRs e as sequências entre LTRs de acordo com as sub-regiões MHM propostas, conforme demonstrado na Figura 13. Além da presença de fragmentos distintos derivados da LTR GGLTR5A, as sub-regiões mostraram sequências repetitivas entre LTRs características, que foram identificadas como repeat 1 para a sub-região 1, repeat 2 para as sub-regiões 2 e 4 e repeat 3 para as sub-regiões 3a e 3b (Figura 13A, B, C). Em adição, foram também identificadas duas duplicações segmentares - a primeira duplicação com aproximadamente 32,200 pares de bases mostrando orientação invertida e contida nas sub-regiões 3a (chrZ:27,002,428-27,034,648) e 3b (chrZ:27,094,799-27,127,331) e a segunda duplicação com cerca de 12,970 pares de bases e contida na sub-região 2. Esta segunda duplicação foi identificada como segmentos 2a (chrZ:27,132,044-27,145,016) e 2b (chrZ:27,151,845- 27,164,811) (Figura 13D). Análises de identidade de sequência revelarem que a repeat 1, característica da sub-região 1 proximal, relaciona-se com a sequência original MHM descrita por Teranishi et al. (2001) (Figura 14A). Em relação à sequência de 2,276 pares de bases descrita inicialmente por estes autores (AB046699.1 e AB046698.1), a repeat 1 se sobrepõe por 1,860 pares de bases, sendo flanqueada por duas LTRs GGLTR5A de aproximadamente 350 pares de bases (Figura 14B). A repeat 2, das sub-regiões mediais 2 e 4, corresponde à sequência MHM originalmente identificada por Itoh et al. (2011) e denominada de sMHM (Figura 14C). Em relação à sequência de 1,860 pares de bases descrita por estes autores, a repeat 2 se sobrepõe a esta em cerca de 1,260 pares de bases, sendo flanqueada parcialmente por duas LTRs GGLTR5A que variam em tamanho entre 493 a 613 pares 39 de bases (Figura 14D). A descrição detalhada da distribuição dos diferentes fragmentos das LTRs GGLTR5A e das repeats flanqueadas pelas mesmas encontra-se no Apêndice II. O conjunto de oligonucleotídeos utilizado em PCR no presente estudo para amplificação da região MHM e para detecção do padrão de metilação desta região no genoma de Gallus gallus, amplifica dois fragmentos compostos por aproximadamente 240 e 750 pares de bases em galinha doméstica (Caetano & Ramos, 2008). O fragmento de maior tamanho mostrou-se associado à sequência descrita por Teranishi et al. (2001) e que se sobrepõe à repeat 1 (Figura 15) que apresenta alto conteúdo de CG (cada unidade de repetição apresenta uma razão CpG observada/GpG esperada igual a 0,65% e %CG igual a 59,8%) e uma ilha CpG de 1,354 pares de bases que contém o amplicon (Figura 15 A e B). O alinhamento deste amplicon com a sequência de 83,571 pares de bases correspondente à sub-região 1 confirmou a presença de 32 cópias desta repetição (Figura 15 C) que potencialmente foram amplificadas simultaneamente pela PCR. No presente trabalho, a região MHM foi amplificada com sucesso, por PCR multiplex, em Gallus gallus - foi possível evidenciar, em gel de agarose, dois fragmentos de cerca de 240 e 750 pares de bases tanto para machos quanto para fêmeas (Figura 16). Os resultados obtidos mostraram-se similares aos observados por Caetano & Ramos (2008). Três produtos de amplificação, referentes ao fragmento de maior tamanho gerado e, portanto, correspondentes à repeat 1 da região MHM, foram encaminhados para sequenciamento. As sequências nucleotídicas individuais foram utilizadas para gerar uma sequência consenso que foi posteriormente comparada com demais sequências depositadas no GenBank. Um alto índice de identidade (≥98%) pôde ser identificado com a sequência referência de Gallus gallus (access AB046699) descrita por Teranish et al. (2001) como correspondente à região MHM (Figura 17). Um dos métodos empregados em análises de metilação refere-se à digestão de DNA com enzimas de restrição sensíveis à metilação (Zilberman & Henikoff, 2007). Em 2008, Caetano & Ramos realizaram um ensaio de digestão enzimática para evidenciar os padrões diferenciais de metilação da região MHM observados em fêmeas e machos de galinha doméstica. Amostras de DNA tratadas com a enzima HpaII, sensível à metilação de sítios CCGG, e posteriormente submetidas à PCR com primers específicos para amplificação concomitante de dois segmentos da região MHM - um de maior tamanho e que, segundo estes autores, inclui uma ilha CpG e outro de menor tamanho e mapeado fora da ilha CpG - evidenciaram, em gel de agarose, resultados distintos entre os sexos. Fêmeas apresentaram um único fragmento de cerca de 240 pares de bases e machos evidenciaram dois fragmentos, de aproximadamente 240 e 750 pares de bases. De acordo com Caetano & Ramos (2008), o fragmento menor, amplificado com os primers MHMs e 40 MHMa, é localizado fora de uma ilha Cp