RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 22/02/2017. UNESP Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia Estudo das interações de eIF5A com a maquinaria de tradução e com o complexo Ribosome Quality Control, utilizando o modelo de Saccharomyces cerevisiae Paulo Eduardo Gonçalves Boldrin Tese de Doutorado UNESP 2016     Paulo Eduardo Gonçalves Boldrin Estudo das interações de eIF5A com a maquinaria de tradução e com o complexo Ribosome Quality Control, utilizando o modelo de Saccharomyces cerevisiae Tese apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP, Araraquara, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Orientador: Prof. Dr. Sandro Roberto Valentini Co-Orientador: Prof. Dr. Cleslei Fernando Zanelli UNESP 2016     Agradecimentos Aos meus pais, Carlos e Ana, pelo apoio incondicional, amizade, compreensão, paciência e incentivo durante todas as escolhas feitas que, direta ou indiretamente, levaram à realização deste trabalho. Aos meus avós Geraldo Gonçalves, Geraldo Boldrin, Aparecida (que, infelizmente, não estão mais conosco) e Ana por sempre terem sido exemplos de conduta ilibada, digna, humilde e honrosa. A especial Mayara Ivani que sempre me apoiou nos melhores e nos piores momentos desta difícil trajetória, sempre com a calma e a compreensão que o momento pedia. Aos amigos pelos momentos essências e companheirismo que em vários momentos foram essências para minha formação. Aos Professores Sandro e Cleslei pela oportunidade dada, orientação e pela paciência durante minha evolução científica e, principalmente, pessoal. Ao Professor Cláudio Joazeiro por me receber em seu laboratório, pela oportunidade e contribuição no meu desenvolvimento científico e pessoal Aos demais Professores que de alguma forma contribuíram com minha formação, desde a formação inicial até a este momento. A todas as pessoas que pude conhecer e conviver durante todo o tempo nos laboratórios, em especial, Kadu Brantis, Fábio Galvão, Natália Barbosa e Erich Tahara que foram indispensáveis no decorrer deste caminho. A FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Processo 2012/02305-0), CAPES, CNPq, PADC, Faculdade de Ciências     Farmacêuticas - UNESP e The Scripps Research Institute (TSRI) pelo apoio financeiro e institucional para a realização deste trabalho. Aos funcionários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP, em especial a Cláudia e Daniela da Seção de Pós-graduação, que sempre demonstraram muita disponibilidade, empenho e gentileza em contribuir de alguma forma para a realização deste trabalho.     “Nada é mais difícil de executar, mas duvidoso ter êxito ou mais perigoso de manejar do que dar início a uma nova ordem de coisas. O reformador tem inimigos em todos os que lucram com a velha ordem e apenas defensores tépidos nos que lucrariam com a nova ordem.” Maquiavel     RESUMO O fator de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que sofre uma modificação pós-traducional que gera um resíduo de hipusina, essencial para sua função. Apesar de eIF5A já ter sido envolvida em diferentes vias celulares, estudos mais recentes reforçam seu papel no processo de síntese proteica, mais especificamente na etapa de elongação da tradução. Resultados do nosso grupo revelaram uma relação funcional entre eIF5A e o Fator de Elongação da Tradução 2 (eEF2). No intuito de melhor compreender o papel de eIF5A com o processo de elongação da tradução, o presente trabalho buscou aprofundar os estudos de interação física entre eIF5A e eEF2. Foi mostrado que eIF5A não interage fisicamente de forma direta com eEF2 e que a interação física destes dois fatores é dependente de complexos ribossomais. Ainda, foi revelado que eIF5A e eEF2 não estão presentes no ribossomo simultaneamente ou não ocupam o mesmo ribossomo por muito tempo. Além disso, como foi mostrado que o homólogo de eIF5A em bactéria, EF-P, interage físicamente com a proteína ribossomal L1, foi investigada a relação funcional entre eIF5A e L1 em levedura. Os resultados obtidos mostraram uma forte interação genética entre estes fatores e uma possível dependência da presença de L1 para a ligação de eIF5A no ribossomo. Por fim, como foi mostrado que eIF5A é necessária para a tradução de sequências de prolinas, as quais causam stalling do ribossomo durante a tradução, e que outros tipos de stalling do ribossomo recrutam e ativam o complexo Ribossome Quality Control (RQC), foi estudada também a interação funcional entre o eIF5A e os fatores do RQC, Ltn1 e Tae2. Apesar de ter sido identificada interação genética entre mutantes de eIF5A e destes fatores do RQC, não foi possível evidenciar que o complexo RQC seja recrutado pelo ribossomo parado em sequências de poliprolinas. Porém, eIF5A se mostrou importante para a formação de agregados proteicos  causados por sequências de polilisinas. Adicionalmente, foi revelada uma correlação entre a expressão normal de eIF5A e a presença de Sis1 e Cdc48 nesses agregados, sugerindo uma possível interação funcional entre eIF5A e o RQC.     ABSTRACT The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid residue hypusine, generated by a post-translational modification. Although eIF5A has been involved in different cellular pathways, recent studies have strengthened its role in protein synthesis, more specifically in the translation elongation step. Results of our group revealed a functional correlation between eIF5A and the Translation Elongation Factor 2 (eEF2). To further investigate the role of eIF5A in translation elongation, we carried out new experiments to study the physical interaction between eIF5A and eEF2. eIF5A does not interact directly with eEF2 and their physical interaction is dependent on ribosomal complexes. Moreover, eIF5A and eEF2 do not bind simultaneously to the same ribosome or they do not occupy the same ribosome for a long time. Additionally, as it was shown that the homolog of eIF5A in bacteria, EF-P, interacts physically with the Large Ribosome Protein 1 (L1). We evaluated a functional interaction between eIF5A and L1. The results demonstrated a strong genetic interaction between these factors and a possible dependency of L1 in the eIF5A ribosome binding. Finally, as eIF5A was recently involved in translation of polyproline stretches, which cause ribosome stalling, and other types of ribosome stalling recruit and activate the Ribosome Quality Control (RQC) complex, we also investigated the functional interaction between eIF5A and the RQC factors Ltn1 and Tae2. Although it was identified genetic interaction between mutants of eIF5A and mutants of these RQC factors, ribosome stalled at polyproline residues does not recruit the RQC complex. Curiously, it was observed that eIF5A is important for the formation of cellular aggregates caused by polylysines. Additionally, it was shown a correlation between normal levels of eIF5A in the cell and the presence of Sis1 e Cdc42 in the aggregates, suggesting a possible functional interaction between eIF5A and the RQC complex.     LISTA DE FIGURAS Figura 1 Via de biossíntese do resíduo de aminoácido hipusina no precursor de eIF5A. 24 Figura 2 Estrutura da proteína eIF5A e sua localização no ribossomo 80S de levedura 25 Figura 3 Modelo de funcionamento do complexo RQC. 29 Figura 4 Esquema dos genes repórteres de stalling de poliprolina. 44 Figura 5 Análise da interação física direta entre eIF5A e eEF2 utilizando o sistema de duplo-híbrido 46 Figura 6 Teste de funcionalidade da proteína de fusão GST-eIF5A. 45 Figura 7 Representação esquemática das etapas envolvidas na técnica de co-purificação por GST-eIF5A utilizada neste trabalho. 52 Figura 8 Esquema do ensaio de co-purificação de monossomos por eIF5A, utilizando crosslinking e RNase. 53 Figura 9 Ensaio de perfil polissomal para verificação da efetividade dos tratamentos com formaldeído e com RNase . 54 Figura 10 Resultados dos ensaios de co-purificação de ribossomos contendo eIF5A utilizando crosslink com formaldeído. 55 Figura 11 Resultados de espectrometria de massas para identificação de eEF2 nos ensaios de co-purificação de ribossomos portando eIF5A. 58 Figura 12 Resultados de espectrometria de massas para identificação de proteínas co-purificadas com GST-eIF5A. 59 Figura 13 Análise de interação genética entre eIF5A e proteínas ribossomais 64 Figura 14 Análise do fenótipo de crescimento celular de mutantes duplos de eIF5A e proteínas ribossomais. 65 Figura 15 Análise do perfil polissomal do mutante duplo de eIF5A e L1B. 66 Figura 16 Análise da interação genética entre TIF51A e LTN1   69 Figura 17 Análise da interação genética entre TIF51A e TAE2.   70 Figura 18 Análise dos níveis de tradução de poliprolinas em condição de depleção de eIF5A 73 Figura 19 Efeito da deleção de Ltn1 na expressão de repórteres de poliprolina (P3 e P6) e polilisina (K12).   74     Figura 20 Efeito da deleção de Ltn1 e Tae2 na expressão de repórteres de poliprolina (P3 e P6) e polilisina (K12).   75 Figura 21 Estudo dos níveis da expressão da proteína Eap1 em mutante de eIF5A e nocaute de Ltn1.   76 Figura 22 Co-imunoprecipitação do repórter FLAG-2A-HIS3-K12-4HA na linhagem VZL1299.   81 Figura 23 Figura 24 Ensaio de co-imunoprecipitação utilizando o gene repórter K12 nas linhagens VZL1074 e VZL1299.   Ensaio de co-imunoprecipitação utilizando os genes repórteres K0 ou K12 nas linhagens VZL1074 e VZL1309.   84 85     LISTA DE TABELAS Tabela 1 Linhagens de S. cerevisiae utilizadas neste trabalho. 31 Tabela 2 Plasmídeos utilizados neste trabalho. 32 Tabela 3 Oligonucleotídeos utilizados neste trabalho. 33 Tabela 4 Proteínas identificadas por espectrometria de massas em amostras obtidas por co-imunoprecipitação, utilizando o gene repórter K12 como isca. 82     ABREVIATURAS λ comprimento de onda µg micrograma µL Microlitro °C graus Celcius µM Milimolar C-terminal carboxi-terminal Cryo-EM Cryo-electron microscopy D.O. densidade ótica DNA ácido desoxirribonucléico DTT Ditiotreitol EDTA ácido etilenodiaminotetracético g Grama kb Quilobase kDa Quilodalton L Litro LB meio Luria-Bertani LiAC Acetato de lítio M Molar mg MgSO4 Miligrama Sulfato de magnésio mL Mililitro mM Milimolar mRNA m/v RNA mensageiro Relação massa/volume NaCl cloreto de sódio ng Nanograma nm Nanômetro N-terminal amino-terminal ORF Open Reading Frame (janela aberta de leitura) PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida pb pares de bases PBS solução salina tamponada com fosfato PBST PBS com Tween 20 PCR Polymerase Chain Reaction (reação de polimerase em cadeia) PDB Protein Data Bank PEG polietilenoglicol pH potencial hidrogeniônico     q.s.p. quantidade suficiente para RNA RQC ácido ribonucleico Ribosome Quality Control (Controle de qualidade do ribossomo) SC meio sintético completo para levedura SDS dodecil sulfato de sódio SGA Synthetic Genetic Array ssDNA DNA de esperma de salmão S-SPO TCA super-sporulation (meio para esporulação de levedura) Ácido tricloroacético TE Tris-EDTA Tris tRNA tris-hidroximetilaminometano RNA transportador Tween 20 monolaurato de polioxietilenosorbitana U unidade enzimatica V Volt xg aceleração gravitacional YPD yeast extract, peptone, dextrose (meio rico para levedura contendo extrato de levedura, peptona e glicose)     ÍNDICE Cap ítulo 1  ...............................................................................................................................  17   1    INTRODUÇÃO  .....................................................................................................................  18   1.1.  A  proteína  eIF5A  .......................................................................................................  18   1.2.  A  proteína  ribossomal  L1  .......................................................................................  26   1.3.  O  complexo  Ribosome  Quality  Control  (RQC)  .................................................  27   2.  OBJETIVOS  ...........................................................................................................................  30   2.1.  OBJETIVOS  GERAIS  ...................................................................................................  30   2.2.  OBJETIVOS  ESPECÍFICOS  ........................................................................................  30   3.  MATERIAL  E  MÉTODOS  ...................................................................................................  31   3.1.    MATERIAL  ..................................................................................................................  31   3.2.  MÉTODOS  .....................................................................................................................  33   3.2.1.  Transformação  de  levedura  ..............................................................................  33   3.2.2.  Teste  de  crescimento  celular  ............................................................................  34   3.2.3.  Duplo-­‐híbrido  em  S.  Cerevisiae  (Sistema  da  linhagem  L40)  ..................  34   3.2.3.1.  Teste  de  crescimento  em  meio  desprovido  de  histidina  ..............................  35   3.2.3.2.  Ensaio  de  β-­‐galactosidase  ..........................................................................................  35   3.2.4.  GST-­‐pulldown  .........................................................................................................  36   3.2.4.1  –  Preparação  do  extrato  celular  e  crosslinking  ...................................................  36   3.2.4.2  –  Clivagem  dos  polissomos  com  RNase  A  .............................................................  36   3.2.4.3    –  Incubação  do  extrato  com  a  resina  .....................................................................  37   3.2.5.  Perfil  polissomal  ....................................................................................................  37   3.2.5.1  –  Preparação  do  gradiente  de  sacarose  ......................................................  37   3.2.5.2  –  Fracionamento  dos  gradientes  ...................................................................  37   3.2.6.  Western  blot  ...........................................................................................................  38   3.2.6.1  –  Tranferência  úmida  ....................................................................................................  38   3.2.6.2  –  Transferência  semisseca  ..........................................................................................  38   3.2.7.  Cruzamento,  esporulação  e  dissecção  de  S.  cerevisiae  ............................  39   3.2.7.1.  Cruzamento  ......................................................................................................................  39   3.2.7.2.  Esporulação  ......................................................................................................................  39   3.2.7.3.  Dissecção  ...........................................................................................................................  39   3.2.7.4.  Caracterização  de  tétrades  ........................................................................................  39       3.2.8.  Curva  de  crescimento  e  cálculo  do  tempo  de  dobramento  .....................  40   3.2.9.  Recombinação  homóloga  ...................................................................................  40   3.2.9.1.  PCR  (Polymerase  Chain  Reaction)  ...........................................................................  40   3.2.9.2.  Transformação  de  levedura  para  recombinação  homóloga  ........................  41   3.2.10.  Obtenção  dos  genes  repórteres  .....................................................................  41   3.2.11.  Co-­‐imunoprecipitação  com  tag  de  FLAG  .....................................................  42   4.  RESULTADOS  E  DISCUSSÃO  ...........................................................................................  45   4.1.  Análise  da  interação  física  entre  eIF5A  e  eEF2  ...............................................  45   4.1.1.  Análise  da  interação  física  direta  entre  eIF5A  e  eEF2  utilizando  o  sistema   de  duplo-­‐híbrido  em  levedura  .................................................................................................................  45   4.1.2.  Análise  da  interação  física  entre  eIF5A  e  eEF2  via  complexos  ribossomais  ...............................................................................................................................................................................  47   4.1.3.  Investigação  da  presença  de  eEF2  e  outros  fatores  relacionados  à   tradução  em  ribossomos  portando  eIF5A  ..........................................................................................  56   4.2.  Análise  da  interação  funcional  entre  eIF5A  e  a  proteína  ribossomal  L160   4.3.  Análise  da  interação  funcional  entre  eIF5A  e  o  complexo  RQC  (Ribosome   Quality  Control)  ...............................................................................................................................  67   4.3.1.  Análise  de  Interação  genética  entre  mutantes  de  eIF5A  e  dos  fatores  Ltn1   e  Tae2  do  complexo  RQC  ............................................................................................................................  67   4.3.2.  Investigação  do  papel  do  complexo  RQC  no  stalling  de  poliprolinas  ..........  71   4.3.3.  Análise  da  participação  de  eIF5A  no  funcionamento  do  complexo  RQC  e   na  formação  de  agregados  proteicos.  ...................................................................................................  77   5.  CONCLUSÕES  ......................................................................................................................  86   5.1.  Análise  da  interação  física  entre  eIF5A  e  eEF2  ...............................................  86   5.2.  Análise  da  interação  funcional  entre  eIF5A  e  a  proteína  ribossomal  L186   5.3.  Análise  da  interação  funcional  entre  eIF5A  e  o  complexo  RQC  (Ribosome   Quality  Control)  ...............................................................................................................................  86   6.  REFERÊNCIAS  BIBLIOGRAFICAS  ..................................................................................  87   Cap ítulo 2 (Artigos e manuscritos relacionados a este trabalho)  ..............  92         Capítulo 1             18   1 INTRODUÇÃO 1.1. A proteína eIF5A O fator de tradução eIF5A (eukaryotic translation Initiation Factor 5A) é uma proteína relativamente pequena, de apenas 17 kDa, e altamente conservada em arqueas e eucariotos (Schinier et al., 1991; Chen e Liu 1997). A proteína eIF5A sofre uma modificação pós-traducional única, que corresponde à hipusinação de um resíduo de lisina (Chen e Liu 1997; Park et al., 1998). A formação do aminoácido hipusina (do inglês “hypusine: hydroxyputrescine-lysine”) ocorre através da transferência, pela desoxi-hipusina sintase (Dys1), de um grupo aminobutil da espermidina para o amino grupo livre de uma lisina específica, seguido de hidroxilação deste grupo pela desoxi- hipusina hidroxilase (Lia1). A Figura 1 apresenta esquematicamente a via de biossíntese da hipusina. O grau de conservação dos resíduos flanqueadores do sítio de hipusinação, nas diferentes espécies, revela a grande importância deste aminoácido raro (Chen e Liu 1997; Magdolen et al., 1994). Apesar de não existir proteína homóloga de eIF5A em eubactérias, o fator de elongação da tradução de bactérias EF-P é um homólogo estrutural de eIF5A. Curiosamente, foi observado que EF-P de um subgrupo de bactérias sofre uma modificação pós-traducional em um resíduo específico de lisina na posição 34, correspondente ao sítio de hipusinação de eIF5A. Esta modificação, denominada lisilação, é análoga à hipusinação e envolve a incorporação de uma lisina através da carbonila do grupamento amino da lisina 34 de EF-P pelas enzimas YjeA e YjeK (Bailly e Crécy-Lagard, 2010; Navarre et al., 2010; Yanagisawa et al., 2010). Apesar de EF-P ser essencial e o sítio alvo da modificação pós-traducional ser altamente conservado, esta modificação parece não ser essencial para a função de EF-P em todas as bactérias, uma vez que, como mencionado anteriormente, esta modificação foi observada apenas em um subgrupo de bactérias (Brochier et al., 2004; Bailly e Crécy-Lagard 2010). Enquanto ortólogos de eIF5A, assim como da enzima desoxi-hipusina sintase, são encontrados desde arqueas até mamíferos, arqueas parecem não     19   possuir ortólogos para a enzima desoxi-hipusina hidroxilase. Além disso, o gene da desoxi-hipusina hidroxilase não é essencial em S. cerevisiae para crescimento em nenhuma condição testada até o momento (Thompson et al., 2004), enquanto o ortólogo de Schizosaccharomyces pombe é necessário para o crescimento em temperaturas acima de 37°C (Weir e Yaffe, 2004). Por outro lado, o gene para desoxi-hipusina hidroxilase é essencial para o desenvolvimento tanto em Drosophila melanogaster como em Caenorhabditis elegans (Park et al., 2010). Portanto, a primeira etapa da hipusinação é essencial em todas as espécies que possuem eIF5A, mas a segunda etapa parece se tornar mais importante funcionalmente apenas ao longo da progressão evolutiva. Dessa forma, a substituição do resíduo de lisina específico de eIF5A, em S. cerevisiae, por arginina (K51R) leva à produção de eIF5A não hipusinado, sendo este incapaz de permitir o crescimento celular quando é a única fonte de eIF5A na célula (Schinier et al., 1991). Além disso, eIF5A recombinante, não hipusinada, não é funcional no ensaio de síntese de metionil- puromicina, sendo que, após modificação in vitro pela desoxi-hipusina sintase, a eIF5A recombinante passa a ser funcional neste ensaio (Park 1989; Smit- McBride et al., 1989). Por fim, a região flanqueadora do sítio de hipusinação é extremamente conservada ao longo da evolução, sendo formada por uma sequência de doze aminoácidos: STSKTG-HIPUSINA-HGHAK (Park et al., 1993; Magdolen et al., 1994; Chen e Liu, 1997). Portanto, todos estes dados mostram que a hipusinação ou, ao menos sua primeira etapa, é essencial para a função in vivo de eIF5A. O fato de eIF5A ser a única proteína eucariótica que sofre hipusinação evidencia uma atividade biológica fundamental para este fator. A importância da hipusinação para a atividade de eIF5A no processo de tradução foi mostrada a partir da observação de que eIF5A humana recombinante, não hipusinada, foi incapaz de estimular a síntese in vitro de metionil-puromicina. Entretanto, quando este precursor foi modificado in vitro para a forma hipusinada, a proteína resultante tornou-se ativa neste ensaio (Park 1989; Smit-McBride et al., 1989).     20   As estruturas tridimensionais de homólogos de eIF5A de arqueas, protozoários, levedura e de humanos foram determinadas e revelaram várias características comuns (Kim et al., 1998; Peat et al., 1998; Tong et al., 2009; Yao et al., 2003). Segundo esses estudos, eIF5A é uma proteína dividida em dois domínios predominantemente compostos por folhas beta. A comparação destes domínios com outras proteínas de estruturas tridimensionais conhecidas mostra que o domínio N-terminal (domínio I), o qual contém a hipusina, possui um dobramento classificado como Translation Protein SH3-like motif, o qual também está presente em várias proteínas ribossomais (http://supfam.org/SUPERFAMILY; (Gough et al., 2001)). O C-terminal (domínio II), por sua vez, é similar a dobramentos de proteínas que se ligam a ácidos nucléicos de fita simples (Single-stranded Oligonucleotide Binding Fold), o qual está presente em proteínas de diferentes funções celulares que se ligam a RNA ou DNA fita simples (http://supfam.org/SUPERFAMILY; (Gough et al., 2001). Ainda, a estrutura tridimensional de EF-P de bactéria também foi determinada por cristalografia e apresenta características similares com as obtidas para eIF5A. Diferentemente de eIF5A, EF-P possui três domínios, sendo que os domínios I e II são sobreponíveis, respectivamente, aos domínios N- terminal (domínio I) e C-terminal (domínio II) de eIF5A. Acredita-se que domínio III de EF-P surgiu devido a um evento de duplicação do domínio II (Figura 2A). Outra característica similar entre as estruturas de EF-P e eIF5A é a posição de suas modificações pós-traducionais, no topo da alça flexível no domínio I destas proteínas (HANAWA-SUETSUGU et al. 2004). eIF5A está relacionada à tradução de proteínas. Embora a função de eIF5A como fator de início de tradução nunca tenha sido claramente demonstrada, estudos realizados por nosso laboratório e por outros, revelaram a associação de eIF5A com ribossomos traducionalmente ativos e trouxeram esse fator de volta ao cenário da tradução (Jao e Chen, 2006; Zanelli et al., 2006). Ensaios de co-purificação seguidos de espectrometria de massas revelaram que eIF5A interage com algumas proteínas ribossomais e com o fator de elongação de tradução 2 (eEF2), componentes da maquinaria de tradução. Ainda, foi mostrado     21   que eIF5A interage especificamente com monossomos funcionalmente ativos, e que mutantes condicionais de eIF5A apresentam defeito no perfil polissomal e são sensíveis a inibidores da tradução (Zanelli et al., 2006). Além disso, a análise de diferentes mutantes de eIF5A demonstrou uma diminuição na síntese proteica total nas condições não-permissivas de crescimento (Cano et al., 2008; Dias et al., 2008). Além disso, estudos recentes utilizando diferentes mutantes condicionais de eIF5A em S. cerevisiae revelaram um aumento de polissomos em relação a monossomos na temperatura não permissiva, dados que sugerem defeito na elongação da tradução (Gregio et al., 2009; Saini et al., 2009). Ao verificar a velocidade do trânsito ribossomal nesses mesmos mutantes, foi constatado um atraso significativo, na temperatura não permissiva (Gregio et al., 2009; Saini et al., 2009), resultado que fortalece a idéia do envolvimento da proteína eIF5A com a elongação da tradução. Ainda, mutantes de eIF5A não apresentaram formação do “P-bodies” (agregados de mRNA e proteínas, onde ocorre a degradação do mRNA) na temperatura não permissiva, característica semelhante à observada para células tratadas com ciclo-heximida, um inibidor da elongação da tradução. Este efeito sobre os “P-bodies” também é consistente com um papel de eIF5A na fase de elongação de tradução (Gregio et al., 2009). Finalmente, um mutante de eIF5A (tif51AD63V) apresentou defeito na capacidade do ribossomo de realizar alteração programada da janela de leitura (Ribosomal Programmed Frameshifting - PRF) +1, de forma similar ao que ocorre com a célula selvagem tratada com sordarina, um inibidor do fator de elongação eEF2. Esse resultado, aliado ao fato desse mutante ser sensível à sordarina, sugere uma interação funcional entre eIF5A e o fator de elongação eEF2 (Saini et al., 2009). Concordante com essa idéia está o fato de que o mutante tif51A-3 mostrou-se sinteticamente doente com o mutante dominante negativo do fator de elongação eft2H699K (Gregio et al., 2009). Assim, apesar de estimular a síntese in vitro de metionil-puromicina, os dados recentes sugerem fortemente um papel para eIF5A na elongação da tradução.     22   Embora a atuação de eIF5A na tradução seja clara, não está determinado se ela atua de maneira geral ou específica e, sendo específica, que tipo de mensageiros são favorecidos por este fator. Há pouco tempo, foi observado que eIF5A e seu homólogo estrutural em bactéria, EF-P, apresentam um importante papel na atenuação de um tipo de stalling dos ribossomos, ou seja, eIF5A facilitaria a tradução de uma sequência de aminoácidos do polipeptídio, que por algum motivo, atrasa o processo de tradução. Estes resultados foram observados durante o processo de tradução de proteínas com sequências consecutivas de poliprolinas, demonstrando assim uma provável função específica para estes fatores no processo de tradução (Doerfel et al., 2013; Gutierrez et al., 2013; Ude et al., 2013). Corroborando com o papel na tradução de sítios com sequência de prolina, eIF5A foi mostrado ser essencial para a fertilidade e o crescimento celular polarizado através da tradução da proteína BniI, que possui sítio com 12 prolinas e tem seus níveis drasticamente diminuídos em mutantes de eIF5A (Li et al., 2014). Para compreender melhor como eIF5A atua na tradução de poliprolinas, é necessário conhecer o seu local de ligação no ribossomo. Foi mostrado, recentemente que eIF5A se liga ao ribossomo de maneira quase idêntica ao seu homólogo estrutural EF-P, entre o sítio E (exit) e P (peptidyl) do ribossomo e que ambos possuem interação física com a proteína ribossomal L1, também chamada de Rpl1 (Ribosome Protein Large 1) (Gutierrez et al., 2013; Blaha et al., 2009). Sendo assim, eIF5A não ocupa em momento algum o sítio A (aminoacyl), que é o ponto de ligação de eEF2 no ribossomo (Figura 2B) e o local onde o tRNA aminoacilado chega ao ribossomo trazido pelo Fator de Elongação 1A (eEF1A). Mais recentemente, foi demonstrado por Cryo-EM e com uma resolução alta que eIF5A de Saccharomyces cerevisiae se liga no sítio E do ribossomo 60S e interage com rRNA e proteínas ribossomais. Enquanto o domínio N- terminal (domínio I) interage predominantemente com as hélices H74 e H93 do rRNA 25S, o domínio C-terminal (domínio II) e a extensão do N-terminal de eIF5A (que corresponde à sequência dos primeiros 16 aminoácidos) interagem     23   com L11 e/ou L42 (Figura 2C) (Schmidt et al., 2015). Além disso, este trabalho mostra que há uma interação física entre a arginina da posição 27 (R27) de eIF5A e o tRNA presente no sítio P do ribossomo e, ainda, que a hipusina de eIF5A interage com o nucleotídeo da posição 76 do tRNA-Pro presente no sítio P, facilitando assim a tradução de resíduos consecutivos de prolina (Schmidt et al., 2015). Por fim, vale ressaltar que todas estas análises foram realizadas utilizando ribossomos associados com o complexo Ski que, em leveduras, está associado à degradação de mRNA aberrantes. Sendo assim, é, pela primeira vez, sugerido um possível papel para eIF5A no controle de qualidade de mRNA aberrantes (Schmidt et al., 2015).     24   Figura 1. Via de biossíntese do resíduo de aminoácido hipusina no precursor de eIF5A. Esquema simplificado da modificação pós-traducional de eIF5A. A porção 4-aminobutil proveniente da poliamina espermidina está sombreada e é transferida ao resíduo de lisina do precursor inativo de eIF5A por meio da ação da enzima desoxihipusina sintase (Dys1 em levedura, DHS em humanos). O intermediário resultante, agora contendo desoxihipusina, é posteriormente hidroxilado pela enzima desoxihipusina hidroxilase (Lia1 em levedura, DOHH em humanos), o que resulta na ativação de eIF5A. As cadeias laterais da lisina, desoxihipusina e hipusina estão destacadas (Park, 2006).     25   Figura 2. Estrutura da proteína eIF5A e sua localização no ribossomo 80S de levedura. (A) Estrutura de eIF5A (amarelo) mostrando os domínios N-terminal (domínio I) e C-terminal (domínio II) em sobreposição com os domínios I e II da estrutura de EF-P (azul) (Hanawa-Suetsugu et al. 2004). (B) Modelagem molecular utilizando a estrutura do ribossomo 80S ligado a eEF2 e a de eIF5A, baseada no posicionamento conhecido de EF-P em ribossomos 70S (Danuza Rossi, dados não publicados). (C) Localização de eIF5A no ribossomo 80S de levedura obtida por Cryo-EM, evidenciando as interações físicas com L1 e L42 (Schmidt et al., 2015).     26   1.2. A proteína ribossomal L1 Rpl1 (Ribosome Protein Large 1), também conhecida como L1, é uma proteína estrutural da subunidade 60S do ribossomo, essencial para viabilidade celular e que não é encontrada livre no citosol. Como acontece com outras proteínas ribossomais, os genes de RPL1A e RPL1B são parálogos e codificam proteínas 100% idênticas. No entanto, a expressão de RPL1B é cerca de 2 vezes maior em relação à expressão de RPL1A, de maneira que, apesar de serem genes reduntantes, o efeito do nocaute de RPL1B é relativamente mais severo que o de RPL1A (Petitjean et al., 1995, McIntosh et al., 2011). Apesar da diferença no grau de severidade dos nocautes, a superexpressão de L1A recupera o defeito causado pelo nocaute de L1B, demonstrando que o defeito não é parálogo específico (McIntosh et al., 2011). Diferentemente das demais proteínas ribossomais, o nocaute de RPL1B (rpl1BΔ) apresenta fenótipo de crescimento lento além da diminuição discreta do pico da subunidade 60S e da quantidade baixa de halfmeres (a presença de halfmer indica um excesso do pré complexo 43S parados no mRNA esperando pela subunidade 60S (Rotenberg et al., 1988)), no entanto, apresenta redução nos níveis de polissomos mais pesados, o que pode representar um defeito no início da tradução (McIntosh et al., 2011). Ainda, em perfil polissomal de linhagens rpl1BΔ, apesar de se manter constante nos polissomos, a proteína L1 diminui cerca de dois terços no pico de 60S e metade no pico de 80S o que indica que o ribossomo pode se montar sem L1, mas estes ribossomos não se engajam na tradução. Em E. coli, embora L1 não seja essencial, cepas sem esta proteína perdem cerca de 50% da atividade em comparação com a selvagem (Subramanian e Dabbs, 1980). Ainda em E. coli, foi também demonstrado haver interação física entre o domínio II de EF-P e L1 (Blaha et al., 2009). Mais recentemente foi sugerido uma função importante para L1. É conhecido que uma sequência com pelo menos quatro códons CGA causa uma parada na tradução (ribosome stalling), pois foi demonstrado que a tradução destes códons de arginina é facilitada quando há depleção do gene RPL1B     27   (Letzring et al., 2013). Apesar dos dados, ainda há necessidade de mais estudos para mostrar se o aumento da tradução dos códons CGA é devido à redução da tradução geral causado pela deleção de Rpl1B ou algum papel específico desta proteína. 1.3. O complexo Ribosome Quality Control (RQC) O complexo de Ribosome Quality Control (RQC) desempenha um mecanismo de controle de qualidade em um ribossomo impedido de prosseguir a síntese proteica durante a elongação, ou seja, um ribossomo em stalling. Foi demonstrado que este complexo atua para tentar liberar ribossomos em stalling após a tradução de resíduos consecutivos de aminoácidos básicos (sequência polibásica), como uma sequência de 12 lisinas. Estes peptídeos com 12 lisinas causam o stalling devido à interação eletrostática entre a carga positiva dos resíduos de aminoácidos com o interior do túnel de saída do ribossomo, que possui carga negativa (Dimitrova et al,. 2009). Utilizando um repórter com sequência polibásica, identificou-se o RQC como um complexo de controle de qualidade cotraducional que atua degradando o peptídeo nascente na presença de stalling no ribossomo e liberando os ribossomos associados a este tipo de peptídeo para que possam ser engajados novamente no processo celular de tradução (Brandman et al., 2012). Inicialmente, a proteína Ltn1 foi associada com degradação de peptídeos nascentes em repórteres com sequência polibásica (Bengtson e Joazeiro 2010). Após esta caracterização inicial, foram realizados vários ensaios de interação genética e física, o que levou à caracterização do complexo RQC: Ltn1/Rkr1 (E3 ubiquitina ligase), Tae2/Rqc2, Rqc1 e Cdc48 (Brandman et al., 2012; Defenouillère et al., 2013; Verma et al., 2013). Atribuiu-se a Tae2 a função iniciadora de formação do complexo RQC. Tae2 reconhece e se liga ao peptidil tRNA não hidrolisado presente no sítio P da subunidade 60S do ribossomo que sofreu stalling. Adicionalmente, Tae2 se liga em torno do 28S rRNA, na hélice H69, que também é um sítio de ligação da subunidade 40S. Levando-se em conta o tamanho da proteína Tae2, de     28   aproximadamente 120 kDa, este dado sugere que Tae2 também tenha a função de impedir a reassociação do ribossomo, ajudando assim na estabilização de Ltn1 na subunidade 60S do ribossomo que sofreu stalling, uma vez que Ltn1 é incapaz de se ligar ao ribossomo 80S (Lyumkis et al., 2014; Defenouillère et al., 2013). Mais recentemente, foi mostrado que Tae2 promove o recrutamento do tRNA de alanina e treonina, desencadeando a formação de uma pequena cadeia peptídica contendo repetições destes dois aminoácidos e de maneira idependente de mRNA ou da subunidade 40S do ribossomo. Esta cadeia peptídica induzida por Tae2 pode ser responsável por identificar o ribossomo que sofreu stalling e otimizar o processo de controle de qualidade da célula (Shen et al., 2014) (Figura 3). Após Ltn1 ser recrutada, esta induz a ubiquitinação do peptídeo nascente. Após ser ubiquitinado, o peptídeo nascente é removido do túnel de saída do 60S pela ATPase Cdc48 e, então, degradado pelo proteassomo (Brandman et al., 2012; Defenouillère et al., 2013; Verma et al., 2013)     29   Figura 3- Modelo de funcionamento do complexo RQC. Após ocorrer a parada na tradução do 80S, a subunidade 40S se dissocia. Ltn1 e Tae2 reconhecem uma sinalização do complexo peptídeo nascente - tRNA - 60S e ligam-se na subunidade 60S com a função de ubiquitinar (Ub) o peptídeo nascente que emerge no túnel de saída. Cdc48 e seus co-fatores Npl4 e Ufd1 têm a função remover o peptídeo nascente da subunidade 60S e disponibilizá-lo para degradação pelo proteassomo. Tae2 liga-se no complexo sítio P – tRNA e inicia a elongação de uma cadeia peptídica denominada cauda CAT pelo recrutamento de tRNA Ala (IGC) e tRNA Thr (IGU) para o sítio A. A tradução desta cauda é modulada por Tae2 e não necessita a presença da subunidade 40S do ribossomo (adaptada de Shen et al., 2015).     86   5. CONCLUSÕES 5.1. Análise da interação física entre eIF5A e eEF2 • eIF5A não interage fisicamente de forma direta com eEF2 através de ensaios de duplo-híbrido. • A interação física entre eIF5A e eEF2 é dependente de complexos ribossomais. • eIF5A e eEF2 não se ligam simultaneamente ao mesmo ribossomo ou se ligam mas não ocupam o mesmo ribossomo por muito tempo. 5.2. Análise da interação funcional entre eIF5A e a proteína ribossomal L1 • Os genes TIF51A e RPL1B possuem forte interação genética sintética negativa, demonstrada pelo impacto no crescimento celular e no perfil polissomal. • A presença de L1 é possivelmente requerida para a correta interação de eIF5A no ribossomo. 5.3. Análise da interação funcional entre eIF5A e o complexo RQC (Ribosome Quality Control) • O gene TIF51A interage geneticamente com os genes LTN1 e TAE2. • O complexo RQC não é recrutado em stalling de poliprolinas. • eIF5A é necessária para a formação de agregados proteicos causados por poli-K (K12). • eIF5A pode desempenhar um papel no funcionamento do RQC em stalling de polilisinas.     87   6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS Amberg, D., 2005 Methods in yeast genetics, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp., edited by D. Burke e S. JN. Andersen, C.B.F., Becker, T., Blau,M., Anand, M., Halic, M., et al. 2006. Structure of eEF3 e the mechanism of transfer RNA release from the E-site. Nature 443(7112):663-8. Ausubel, F., 2004 Current protocols in molecular biology, New York, pp., edited by R. Brent, R. Kingston, D. Moore, J. Sedman, J. Smith et al. 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