UNESP- UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA AVALIAÇÃO DO EMPREGO DE UM NOVO MÉTODO DE TRIAGEM MOLECULAR DA SÍNDROME DO CROMOSSOMO X FRÁGIL EM INDIVÍDUOS BRASILEIROS Karen Maria de Carvalho Curtis Dissertação de Mestrado 2010 1 Karen Maria de Carvalho Curtis AVALIAÇÃO DO EMPREGO DE UM NOVO MÉTODO DE TRIAGEM MOLECULAR DA SÍNDROME DO CROMOSSOMO X FRÁGIL EM INDIVÍDUOS BRASILEIROS Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia. Orientadora Profa. Dra. Regina Maria Barretto Cicarelli Co-orientadora: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga ARARAQUARA 2010 2 FICHA CATALOGRÁFICA Curtis, Karen Maria de Carvalho C978a Avaliação do emprego de um novo método de triagem molecular da síndrome do cromossomo X frágil em indivíduos brasileiros / Karen Maria de Carvalho Curtis. – Araraquara : [s.n], 2010 84f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli Co-orientador: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga 1. Biotecnologia. 2. Síndrome do cromossomo X frágil. 3. Triagem diagnóstica. 4. PCR . I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação 3 4 DADOS CURRICULARES Nome : Karen Maria de Carvalho Curtis Nome em citações bibliográficas: CURTIS, K. M. C. Sexo: feminino Filiação: José Umberto Curtis e Sonia Aparecida de Carvalho Curtis Nascimento: 14/05/1984 - Araraquara/SP - Brasil Endereço profissional: Universidade Estadual Paulista - Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Odontologia de Araraquara - FOAR Rua Humaitá, 1680 Centro - Araraquara 14801-903, SP - Brasil Telefone: 16 33016517 Formação Acadêmica/Titulação: 2008 Mestrado em Biotecnologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Título: Avaliação do emprego de um novo método de diagnóstico molecular da síndrome do cromossomo X frágil em indivíduos brasileiros Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli Bolsista do (a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 2002 - 2005 Graduação em Ciências Biológicas. Centro Universitário de Araraquara, UNIARA, Araraquara, Brasil Título: Análise do consumo de água residencial em Matão/SP no período de 1999 a 2004 Orientador: Adalberto Cunha Formação complementar: 2003 - 2005 Licenciatura. Centro Universitário de Araraquara, UNIARA, Araraquara, Brasil Atuação profissional: 1. Universidade Estadual Paulista - Júlio de Mesquita Filho - UNESP 5 Vínculo institucional 2008 - Atual Vínculo: Bolsista, Enquadramento funcional: Mestranda, Carga horária: 40 Regimes: Dedicação Exclusiva 2007 - 2007 Estágio de Atualização na disciplina de Genética Humana do Departamento de Morfologia. 2006 - 2006 Estágio de Atualização na Disciplina de Genética Humana do Departamento de Morfologia. Produção bibliográfica: Artigos completos publicados em periódicos 1. VIANA, A. C., KIM, Y. J, CURTIS, K. M. C., RENZI, R., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Association of haplotypes in the CXCR2 gene with periodontitis in a Brazilian population. DNA and Cell Biology., v.29, p. 191-200, 2010. 2. ANOVAZZI, G., KIM, Y. J., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Polymorphism and haplotype in the IL4 gene are associated with chronic periodontitis in Brazilian population. Journal of Periodontology ., v.81, p. 392-402, 2010. . 3. KIM, Y. J., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SACREL-CAMINAGA, R. M. Lack of association of a functional polymorphism in the Interleukin 8 gene with susceptibility to Periodontitis. DNA and Cell Biology., v.28, p. 185-190, 2009. 4. VIANA, A. C., KIM, Y. J., CIRELLI, J. A., ORRICO, S. R. P., CURTIS, K. M. C., CANO, V.S., VALENTINI, S. R., SCAREL-CAMINAGA, R. M. A Novel PCR-RFLP Assay for the Detection of the Single Nucleotide Polymorphism at Position +1440 in the Human CXCR2 gene. Biochemical Genetics., v.45, p. 737-741, 2007. Artigos aceitos para publicação 1. KIM, Y. J., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., MENDES-JUNIOR, C. T., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Association of haplotypes in the IL8 gene with susceptibility to chronic periodontitis in a Brazilian population. Clinica Chemica Acta (Print)., 2010. 6 Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. PIGOSSI, S., CURTIS, K. M. C., ALVIM-PEREIRA, F., TREVILATTO, P. C., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Associação do polimorfismo VNTR no gene IL4 com perdas múltiplas de implante dentário In: 63a. Jornada Odontológica e 23a. Jornada Acadêmica "Prof. Dr. Mario Tanomaru Filho", 2009, Araraquara. Revista Odontológica UNESP., 2009. v. 38.p. 18. 2. ANOVAZZI, G., CORBI, S. C. T., VIANA, A. C., KIM, Y. J., CURTIS, K. M. C., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Associação do polimorfismo -590 (C/T) do gene interleucina 4 com suscetibilidade à periodontite In: 26a. Reunião da SBPqO, 2009, Águas de Lindóia. Brazilian Oral Research., 2009. v.23. p. 181. 3. CURTIS, K. M. C., RODRIGUEIRO, D. A., RODRIGUES, V. C., LIPINSKI- FIGUEIREDO, E, SCAREL-CAMINAGA, R. M., CICARELLI, R. M. B. Avaliação operacional de um novo método de triagem diagnóstica da síndrome do cromossomo X frágil em indivíduos brasileiros: resultados preliminares In: X Simpósio Nacional de Biologia Molecular aplicada à medicina, 2009, Ribeirão Preto. X Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina., 2009. 4. VIANA, A. C., KIM, Y. J., CICARELLI, R. M. B., ORRICO, S. R. P., CURTIS, K. M. C., RENZI, R., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Associação de haplótipos do gene CXCR2 com periodontite em indivíduos brasileiros In: 25a. Reunião da SBPqO, 2008, Águas de Lindóia. Brazilian Oral Research., 2008. v.22. p.265. 5. ANOVAZZI, G., CORBI, S. C. T., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Associação de polimorfismo no gene interleucina 4 com suscetibilidade a periodontite In: 25a. Reunião da SBPqO, 2008, Águas de Lindóia. Brazilian Oral Research., 2008. v.22. p.150. 6. KIM, Y. J., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., CIRELLI, J. A., ORRICO, S. R. P., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Haplotype association of interleukin-8 gene with susceptibility to Periodontitis In: Exhibition of the IADR, 2008, Toronto. Journal of Dental Research., 2008. v.87. p.2712. 7. CORBI, S. C. T., CURTIS, K. M. C., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., Cirelli, J.A, SCAREL-CAMINAGA, R. M. Investigação da associação do polimorfismo +781 (T/C) no gene interleucina 8 com suscetibilidade à periodontite In: 25a. Reunião da SBPqO, 2008, Águas de Lindóia. Brazilian Oral Research., 2008. v.22. p.264. 7 8. KIM, Y. J., SOGUMO, P. M., VIANA, A. C., Cirelli, J.A, ORRICO, S. R. P., CURTIS, K. M. C., RENZI, R., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Investigação do polimorfismo +396 (T/G) do gene interleucina 8 em indivíduos com periodontite In: 25a. Reunião da SBPqO, 2008, Águas de Lindóia. Brazilian Oral Research., 2008. v.22. p.206 - 206 9. SCAREL-CAMINAGA, R. M., CURTIS, K. M. C., RENZI, R., CORBI, S. C. T., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A. Metodologia Simples e Econômica para Genotipagem do Polimorfismo RS2227307 no Gene IL8 In: IX Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina, 2008, São Paulo. IX Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina. São Paulo: 2008. 10. CURTIS, K. M. C., RENZI, R., CORBI, S. C. T., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., CANO, V. S. P., VALENTINI, S. R., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Utilização do ACRS como estratégia eficiente e econômica para genotipagem do lócus +781 C/T (RS2227306) no gene IL8 In: X Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina, São Paulo. IX Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina. São Paulo: 2008. 11. VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CURTIS, K. M. C., SCAREL- CAMINAGA, R. M. Investigação do polimorfismo (+1440 G/A) do gene CXCR2 na Doença Periodontal Crônica. In: 24ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica e 2ª Reunião da Federação Latino americana/IADR, 2007, Atibaia - SP. Brazilian Oral Research., 2007. v.21. p. 282. 12. KIM, Y. J., SCAREL-CAMINAGA, R. M., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., CIRELLI, J. A., ORRICO, S. R. P. Investigação do polimorfismo -353 (A/T) do gene interleucina 8 em indivíduos com doença periodontal crônica In: 20ª JOB Jornada Odontológica de Bauru, 2007, Bauru - SP. Anais da 20ª JOB Jornada Odontológica de Bauru., 2007. p. 470. 13. KIM, Y. J., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., ORRICO, S. R. P., SCAREL- CAMINAGA, R. M. Investigação dos polimorfismos (-353A/T) e (+678 T/C) do gene IL8 na Doença Periodontal Crônica. In: 24ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica e 2ª Reunião da Federação Latino americana /IADR, 2007, Atibaia - SP. Brazilian Oral Research., 2007. v.21. p. 218. 14. RENZI, R., SOGUMO, P. M., CURTIS, K. M. C., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Metodologia acessível para genotipagem do lócus polimórfico +396 G/T do gene IL8 In: 53º Congresso Brasileiro de Genética, 2007, Águas de Lindóia - SP. 53º Congresso Brasileiro de Genética., 2007. p.146. 8 15. CURTIS, K. M. C., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Novo método PCR-RFLP para genotipagem do lócus polimórfico +781 C/T do gene IL8 In: 53º Congresso Brasileiro de Genética, 2007, Águas de Lindóia - SP. 53º Congresso Brasileiro de Genética., 2007. p. 90. 16. CURTIS, K. M. C., MACERA, C.B.L., CAVALCANTE, L.B., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Novo método de PCR-RFLP para genotipagem do lócus polimórfico +1440 G/A do gene CXCR2 In: 52º Congresso Brasileiro de Genética e 12º Congresso de la Asociación Latino americana de Genética, 2006, Foz do Iguaçu. 52º Congresso Brasileiro de Genética., 2006. p. 467. Apresentação de Trabalho 1. CURTIS, K. M. C., RODRIGUEIRO, D. A., RODRIGUES, V. C., LIPINSKI- FIGUEIREDO, E, SCAREL-CAMINAGA, R. M., CICARELLI, R. M. B. Avaliação operacional de um novo método de triagem diagnóstica da síndrome do cromossomo X frágil em indivíduos brasileiros: resultados preliminares, 2009. 2. SCAREL-CAMINAGA, R. M., CURTIS, K. M. C., RENZI, R., CORBI, S. C. T., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A. Metodologia simples e econômica para genotipagem do polimorfismo RS2227307 no gene IL8, 2008. (Simpósio,Apresentação de Trabalho) 3. CURTIS, K. M. C., RENZI, R., CORBI, S. C. T., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., CANO, V. S. P., VALENTINI, S. R., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Utilização do ACRS como estratégia eficiente e econômica para genotipagem do lócus +781 C/T no gene IL8, 2008. 4. VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CURTIS, K. M. C., SCAREL- CAMINAGA, R. M. Investigação do polimorfismo (+1440 G/A) do gene CXCR2 na Doença Periodontal Crônica, 2007. 5. KIM, Y. J., SCAREL-CAMINAGA, R. M., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., CIRELLI, J. A., ORRICO, S. R. P. Investigação do polimorfismo -353 (A/T) do gene interleucina 8 em indivíduos com doença periodontal crônica, 2007. (Outra,Apresentação de Trabalho) 6. KIM, Y. J., VIANA, A. C., CURTIS, K. M. C., ORRICO, S. R. P., SCAREL- CAMINAGA, R. M. Investigação dos polimorfismos (-353 A/T) e (+678 T/C) do gene IL8 na Doença Periodontal Crônica, 2007. (Outra,Apresentação de Trabalho) 9 7. RENZI, R., SOGUMO, P. M., CURTIS, K. M. C., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Metodologia acessível para genotipagem do lócus polimórfico +396 G/T do gene IL8, 2007. (Congresso,Apresentação de Trabalho) 8. CURTIS, K. M. C., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., CIRELLI, J. A., SCAREL-CAMINAGA, R. M. Novo método PCR-RFLP para genotipagem do lócus polimórfico +781 C/T do gene IL8, 2007. (Congresso,Apresentação de Trabalho) 9. CURTIS, K. M. C., MACERA, C.B.L., CAVALCANTE, L.B., VIANA, A. C., KIM, Y. J., ORRICO, S. R. P., Cirelli, J.A, SCAREL-CAMINAGA, R. M. Novo método de PCR-RFLP para genotipagem do locus polimórfico +1440 G/A do gene CXCR2, 2006. (Congresso,Apresentação de Trabalho) Participação em eventos: 1. Apresentação de Poster / Painel no(a) X Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina, 2009. Avaliação Operacional de um novo método de triagem diagnóstica da síndrome do cromossomo X frágil em indivíduos brasileiros: resultados preliminares. 2. Apresentação de Poster / Painel no(a) IX Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina, 2008. Utilização do ACRS com a estratégia eficiente e econômica para genotipagem do lócus +781 C/T (RS2227306) no gene IL8. 3. Apresentação de Poster / Painel no(a) 53º Congresso Brasileiro de Genética, 2007. Novo método PCR-RFLP para genotipagem do lócus polimórfico +781 C/T do gene IL8. 4. Apresentação de Poster / Painel no(a) 52º Congresso Brasileiro de Genética e 12º Congresso de la Asociación Latino americana de Genética, 2006. Novo método de PCR-RFLP para genotipagem do lócus polimórfico +1440 G/A do gene CXCR2. Outras informações relevantes: BOLSA DE TREINAMENTO TÉCNICO TT-3 concedida em 01/11/2006 para realização do Projeto: Investigação de Polimorfismos no gene Interleucina 8 e seus receptores em indivíduos com Doença Periodontal Crônica. Processo: 06/04492-1. O término da bolsa foi em 31/10/2007, porém obteve-se prorrogação da mesma até 31/12/2007, para término do Projeto. REALIZAÇÃO DE CONCURSO PÚBLICO para provimento de vaga de Técnico de Laboratório na Faculdade de Odontologia de Araraquara - FOAR- UNESP, realizado pela VUNESP. Classificação Final: 3º lugar. 10 ARTIGOS ENVIADOS PARA PUBLICAÇÃO: 1- Association of the polymorphism rs2227307 in the Interleukin 8 gene with periodontitis. KIM, Y. J. ; SOGUMO, P. M. ; VIANA, A. C. ; CURTIS, K. M. C. ; ORRICO, S. R. P. ; CIRELLI, J. A. ; SCAREL-CAMINAGA, R. M. Journal of Clinical Periodontology - CPE-08-08-1689 2- Detection of the Single Nucleotide Polymorphism (rs2227307) in the Human Interleukin 8 gene using a novel PCR-RFLP assay. KIM, Y. J. ; SOGUMO, P. M.; CURTIS, K. M. C.; RENZI, R.; VIANA, A. C.; CORBI, S. C. T.; ORRICO, S. R. P. ; SCAREL-CAMINAGA, R. M. 3- Haplotypes in the Interleukin 8 gene and their association with Chronic Periodontitis Susceptibility. SCAREL-CAMINAGA, R. M.; KIM, Y. J.; VIANA, A.C. ; CURTIS, K. M. C.; CORBI, S. C. T.; SOGUMO, P. Biochemical Genetics, Mar. 2010. 11 À Deus, por ser meu guia hoje e sempre, me dar força e iluminar meus caminhos; Aos meus pais Sonia e José Umberto, e a minha irmã Amanda, por serem meu refúgio nas horas difíceis, pelo amor e pelo incentivo; À meu noivo Loitson, pela paciência, apoio, carinho e compreensão em todos os momentos. 12 AGRADECIMENTOS À Profa. Dra. Regina Maria Barretto Cicarelli pela orientação, paciência e confiança, além da contribuição na minha formação acadêmica. À Profa. Dra. Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga, por ter proporcionado-me a oportunidade de entrar na vida acadêmica, a partir do momento que abriu as portas de seu laboratório para que eu fizesse estágio; por ensinar a maioria das coisas que sei sobre biologia molecular e vida acadêmica; por acreditar e confiar em meu trabalho; pelo incentivo desde o início; pela contribuição em minha formação acadêmica e pessoal; e pela amizade. Ao Prof. Dr. Valter Curi Rodrigues, por introduzir a ideia de realização deste projeto, por confiar em nosso trabalho para o desenvolvimento do mesmo e por encaminhar os pacientes que participaram do projeto. À Profa. Dra. Débora Aparecida Rodrigueiro, por confiar em meu trabalho, mesmo sem conhecer-me; pela ajuda nos contatos com a Profa. Ângela Maria Vianna Morgante do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva (IB/USP); pelo apoio durante todo o projeto; e por sempre estar disposta à ajudar, independente do dia hora e condições. À Profa. Dra. Ângela Maria Vianna Morgante (IB/USP), pela doação das amostras utilizadas neste projeto e por disponibilizar seu laboratório para desenvolvimento da técnica quando houve necessidade. Ao Prof. Dr. Sílvio Govone, pela colaboração na escolha do método estatístico e na aplicação da análise, bem como na interpretação dos resultados. À meus pais e minha irmã, que sempre me incentivaram na vida e nos estudos, apóiam minhas decisões e são meus “pilares de sustentação”. À minha mãe, em especial, por agüentar minhas lamurias e sempre interceder a Deus pelas minha realizações. 13 Ao Loitson, por apoiar meu trabalho, ser o motorista das viagens, aguentar minhas reclamações, pela paciência e compreensão e por me incentivar sempre. À Fátima do IB-USP, pela realização do SB, pela troca de idéias, assim como pela amizade. À Sílvia do IB-USP, pela contribuição no envio das amostras pela troca de idéias, assim como pela amizade. À Renata de Aquino do Laboratório de Citologia da UNIARA, por ajudar na idealização do trabalho, estar presente no início dos trabalhos e pela amizade. À Suzane, Lívia, Sâmia, Gabriella e Giovana, amigas do laboratório, pelo apoio nas horas difíceis da pesquisa, pela mão amiga, pela contribuição em vários momentos, por me ouvirem nos momentos complicados, e principalmente, pela amizade. À Margareth, por ajudar nos momentos burocráticos, por ser uma boa ouvinte, assim como pela amizade. À todos os amigos que mesmo distante torceram por mim e deram incentivo e apoio ao meu trabalho. À CAPES pela bolsa de estudos concedida durante o mestrado. 14 RESUMO A síndrome do cromossomo X frágil (SXF) é a forma mais comum de deficiência mental herdada. A doença ocorre pela expansão das repetições de trinucleotídeos na região 5’ não traduzida do gene FMR1 no cromossomo X. Dependendo do número de repetições CGG originam-se 4 tipos de alelos: normal (NL), pré-mutado (PM), gray zone (GZ) e mutação completa (FM). A instabilidade e expansão das repetições, aliado à metilação do DNA, causam a diminuição ou ausência na produção da proteína FMRP, a qual é essencial para a função cerebral. O diagnóstico da SXF tem sido realizado principalmente por análise molecular Southern blot. Porém, este método é trabalhoso, demorado e de custo elevado. Recentemente foi desenvolvido um novo método molecular para triagem da SXF por PCR, que segundo os autores, é rápido, de baixo custo, e eficiente na detecção das repetições CGG em homens e mulheres. No entanto, notou-se a ausência de informações importantes para reprodução do método. Os objetivos deste estudo foram: (i) padronizar a técnica de PCR proposta por Tassone et al., (2008), adaptando-a, devido a carência de informações metodológicas; (ii) comprovar a exatidão (acurácia), sensibilidade e especificidade do método, comparando-a ao Southern blot; (iii) avaliar a aplicação da técnica utilizando DNA extraído de diferentes materiais biológicos/métodos de extração; (iv) estimar o custo e o tempo de execução do método no mercado nacional. Os materiais biológicos utilizados foram: sangue coletado por sistema à vácuo e células da mucosa oral, que foram extraídos por solventes orgânicos e sangue coletado em cartões FTA, purificado pelo kit Whatman. Obteve- se sucesso na reprodução do método da PCR em 75 indivíduos utilizando a enzima Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics). A exatidão (acurácia), sensibilidade e especificidade foram 100% quando analisada a casuística total, indicando que a técnica consegue detectar a presença de todos os alelos da SXF. Porém, quando os alelos PM e FM foram analisados separadamente, houve diminuição da exatidão (acurácia), sensibilidade e especificidade, provavelmente por que o método da PCR não conseguiu diferenciar os alelos PM e FM de 5 indivíduos (6,7%), comparando-se com o Southern Blot. Houve reprodutibilidade da técnica com DNA extraído de diferentes materiais biológicos. O custo aproximado para a realização da triagem por PCR no mercado nacional, considerando a coleta com cartão FTA é de R$ 9,00 com demanda de 11 horas. Portanto, verificou-se que o método é eficiente como triagem da SXF, além de rápido e de baixo custo. Conclui-se que o método da PCR é eficiente como triagem da SXF, no entanto, o Southern blot continua configurando o método padrão-ouro para diagnóstico, devendo ser aplicado em casos para os quais não 15 obteve-se resultado por PCR, ou naqueles em que se deseja determinar o tamanho dos alelos e/ou o estado de metilação dos mesmos. Palavras-chave: Síndrome do cromossomo X frágil. Triagem diagnóstica. PCR. 16 ABSTRACT Fragile X Syndrome (FXS) is the most common form of inherited mental retardation. The disease occurs by the expansion of triplet nucleotide repeats in the 5' untranslated of the FMR1 gene on chromosome X. Depending on the number of CGG repeats four types of alleles originate from it: normal (NL), pre-mutated (PM), gray zone (GZ) and full mutation (FM). The instability and expansion of these repetitions, together with the methylation of DNA, cause a decrease or absence in the production of the protein FMRP, which is essential for the brain function. The diagnosis of FXS has been done mainly by molecular analysis Southern blot. However, this method is laborious, time consuming and expensive. Recently we have developed a new molecular method for FXS screening by PCR, which according to the authors, is rapid, inexpensive, and efficient in the detection of CGG repeats in male and female. However, we noted the absence of important information for breeding method. The objectives of this study were: (i) to standardize the PCR technique proposed by Tassone et al. (2008), adapting it, due to the lack of methodological information, (ii) verify the accuracy, sensitivity and specificity of the method, comparing it to the Southern blot, and (iii) to evaluate the technique using DNA extracted from different biological materials / extraction methods, and (iv) estimate the cost and time of the method execution in the domestic market. The biological materials used were: blood collected by vacuum system and oral mucosal cells, which were extracted by organic solvents and blood collected on FTA cards, purified by Whatman kit. Success was achieved in the reproduction of the PCR method in 75 individuals using the enzyme Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics). The accuracy, sensitivity and specificity were 100% when analyzing the total sample, indicating that the technique can detect the presence of all alleles of FXS. However, when the PM and FM alleles were analyzed separately, there was a decrease in accuracy, sensitivity and specificity, probably because of the PCR method did not differentiate the PM and FM alleles of five individuals (6.7%) compared with the Southern blot. There was reproducibility of the technique with DNA extracted from different biological materials. The approximate cost to carry out the screening by PCR in the domestic market, considering the FTA collection card is $ 9.00 with a demand of 11 hours. Therefore, it was found that the method is efficient as screening of FXS, as well as fast and with a low cost. It is concluded that the PCR method is as effective as screening of FXS, however, the Southern blot is still setting the gold standard for diagnosis and should be applied in cases in which no result was obtained by PCR, or in those which the size of the alleles and / or the methylation status need to be determined. 17 Key words: Fragile X Syndrome. Screening test. PCR. 18 LISTA DE FIGURAS Figura 1 -Representação esquemática do gene FMR1 27 Figura 2 - Representação dos alelos da SXF 28 Figura 3 - Representação esquemática da região inicial do gene FMR1 32 Figura 4 – Representação do gene FMR1 e da proteína FMRP 33 Figura 5 – Representação esquemática do mRNA do gene FMR1 e da proteína FMRP 34 Figura 6 – Esquema do método da 2a PCR para resolver a aparente homozigoze de mulheres 54 Figura 7 – Esquema do cálculo da exatidão, sensibilidade e especificidade 56 Figura 8 - Gel de agarose 2% ilustrando os resultados iniciais da 1a PCR e 2a PCR 57 Figura 9 - Gel de agarose 2% ilustrando resultados do método utilizando a enzima FastStart Taq DNA Polymerase (Roche Diagnostics). 58 Figura 10 – Heredograma da família 1 59 Figura 11 – Heredograma da família 2 60 Figura 12 - Gel de agarose a 2% contendo resultados das duas PCRs de amostras de DNA de mesmo indivíduo do gênero feminino portadora de alelos normais para a SXF 66 19 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Classificação dos alelos da SXF Tabela 2 - Resultados das triagens por PCR e dos diagnósticos por Southern blot Tabela 3 - Informação da triagem por PCR e do diagnóstico por Southern blot dos indivíduos apresentados nas figuras 11 e 12 Tabela 4 - Resultados da exatidão, sensibilidade e especificidade Tabela 5 – Estimativa de custo e tempo para realização do método da PCR por paciente 27 61 63 64 68 20 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS % - porcentagem °C – graus Celsius 32P – Fósforo 32 ADHD – Déficit de Atenção e Transtorno de Hiperatividade ADOS – Autism Diagnosis Observation Schedule CC – Coiled Coil CpG - Citosina, fosfato, guanina CYFIP - Citoplasmatic FMR1 Interacting Protein DMSO – Dimetilsulfóxido DNA – Àcido Desoxirribonucléico dNTP – Dexoxinucleotídeo trifosfato DSM – IV – Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético FISH – Fluorescence In Situ Hybridization FM – Full Mutation FMR1 – Fragile X Mental Retardation 1 Gene FMRP – Fragile X Mental Retardation Protein FRAXA – Fragile site, X chromossome, A site FXR1P – Fragile X Related Protein 1 FXS - Fragile X Syndrome FXTAS – Fragile X-associated Tremor Ataxia Syndrome, Síndrome de Tremor Ataxia associada ao X Frágil GABA – Gamma - aminobutyricacid GZ – Gray Zone HCl – Ácido Clorídrico hn RNP - Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein Kb - Kilobases kD - kiloDalton KH – K Homology M – molar mGluR5 – Meyabotropic Glutamate Receptor 5 Pathway min – minutos mL – mililitro 21 mm – milímetro mM – milimolar mRNA – Messenger RNA, RNA mensageiro MS-PCR – Methylation Specific PCR, PCR Específica para Metilação NES – Nuclear Exportation Sign, Sinal de Exportação Nuclear ng – nanograma NL – Normal NLS – Nuclear Localization Sign, Sinal de Localização Nuclear NUFIP – Nuclear FMRP Interacting Protein pb – pares de bases PCR – Polymerase Chain Reaction Pfu – Proofreading Enzime PM – Pre Mutation POI – Primary Ovarian Insufficiency, Insuficiência Prematura dos Ovários POF – Primary Ovarian Failure, Falha Prematura dos Ovários PSD95 – Post-synaptic density protein-95, PTEN – Phosphatase and Tensin Homolog, QI – Quotient Intelligence, Quociente de Inteligência RGG box – region rich in Arginine and Glycine residues, RNA – Ribonucleic Acid, Àcido Ribonucléico rpm – rotações por minuto RT-PCR – Reverse Transcrition PCR, PCR de Transcrição Reversa SB – Southern blot SDS – Dodecil Sulfato de Sódio SXF – Síndrome do cromossomo X Frágil SHANK – SH3 and multiple ankyrin repeat domains 2 Tris – Tris (hidroximetil) aminometano U – unidade UTR – Untranslated Region, Região não traduzida V – Volts Xq27.3 – Braço curto do cromossomo X, região 2, banda 7, sub banda 3 μg – micrograma μL – microlitro μM – micromolar 22 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 24 1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA � 26 2.1 Síndrome do cromossomo X frágil 26 2.2 O gene FMR1 26 2.2.1 Classes de alelos e decorrente classificação clínica dos indivíduos 27 2.2.2 Estabilidade dos alelos durante a transmissão de repetições CGG 28 2.2.3 Herança e padrões de transmissão do gene 30 2.2.4 Padrões de mosaicismo em repetições de CGG e metilação 31 2.2.5 Influência das repetições CGG na transcrição do gene FMR1 31 2.3 A proteína FMRP 32 2.3.1 Estrutura e expressão protética 32 2.3.2 FMRP: RNAs alvos e interação com proteína 34 2.3.3 Algumas funções descritas da FMRP 35 2.4. Correlação genótipo-fenótipo 35 2.4.1 Fenótipos cognitivos em indivíduos com alelo FM da SXF 36 2.4.2 Fenótipos comportamentais e psicológicos em indivíduos com alelos FM da SXF 37 2.4.3 Fenótipos físicos em indivíduos com FM 38 2.4.4 Relação das características entre indivíduos portadores da FM e autismo 39 2.4.5 Fenótipos em indivíduos com PM 40 2.4.6 Fenótipos em indivíduos com GZ 41 2.5 Prevalência populacional da SXF 41 2.6 Diagnósticos laboratoriais da SXF 42 2.6.1 Indivíduos que devem ser testados para a SXF 46 2.6.2 Aconselhamento genético e tratamento da SXF 46 2.7 Justificativa e relevância do projeto 47 3 OBJETIVOS 49 3.1 Objetivos secundários 49 4 MATERIAIS E MÉTODOS 50 4.1 Casuística 50 4.2 Obtenção do DNA 50 4.2.1 Cartão FTA (Whatman) 50 23 4.2.2 Sangue coletado pelo sistema à vácuo e DNA extraído com solventes orgânicos 51 4.2.3 Células da mucosa oral e DNA extraído com solventes orgânicos 52 4.3 PCR para diagnóstico de alelos NL PM e FM (1a PCR) 52 4.4 PCR para diagnóstico conclusivo de mulheres que apresentam uma única banda na faixa da normalidade e homens com ausência do produto amplificado (2a PCR) 54 4.5 Análise Estatística 55 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 57 5.1 Análise e escolha da melhor enzima para a realização do método 57 5.2 Comprovação da exatidão (acurácia), sensibilidade e especificidade do método 59 5.3 Avaliação da aplicação do método adaptado de Tassone et al., (2008), utilizando DNA obtido de diferentes materiais biológicos 65 5.4 Estimativa do custo do método no mercado nacional e do tempo necessário de execução 67 6 CONCLUSÕES 70 REFERÊNCIAS 71 ANEXOS 82 24 1 INTRODUÇÃO A síndrome do cromossomo X frágil (SXF) (OMIM 300624) é a forma mais comum de deficiência mental herdável. A prevalência estimada dessa síndrome, tanto no gênero masculino como no feminino é de 1:2500 (HAGERMAN, 2008). O gene envolvido, denominado FMR1 , está localizado na região Xq27.3 designada sítio FRAXA. O gene FMR1 é altamente conservado e consiste em 17 exons (EICHLER et al., 1993). Na região 5’ não traduzida (5’-UTR, untranslated region) do exon 1, ocorrem repetições em tandem de trinucleotídeos CGG (JIN; WARREN, 2000). A SXF origina-se pela instabilidade e expansão das repetições CGG, aliados à ocorrência de metilação. O número de repetições CGG existentes no gene FMR1 é polimórfico. Devido a este fato, originam-se 4 classes diferentes de alelos para a SXF: normais (NL), gray zone (GZ) pré-mutação (PM) e mutação completa (FM) (MADALENA et al., 2001; CRAWFORD et al., 2001; HAGERMAN e HAGERMAN, 2004; SOFOCLEUS et al., 2009). Na SXF, durante a transmissão dos alelos para as próximas gerações, podem ocorrer alterações de aumento ou diminuições (OBERLÉ et al., 1991; FU et al., 1991; e CHIURAZZI et al., 1994) no número de repetições CGG. Essas alterações estão relacionadas à classe de alelo (NL, ZG, PM ou FM) envolvida na transmissão. Os padrões de transmissão genética na SXF ocorrem diferentemente em homens e mulheres, devido ao fato das mulheres apresentarem dois cromossomos X, enquanto os homens apresentam apenas um. Assim, em geral, as mulheres que apresentam alelos PM com pelo menos 56 repetições CGG (NOLIN et al., 2003) transmitirão um alelo expandido FM para metade de seus descendentes. Em homens, a transmissão genética de alelos PM para alelo expandido FM somente poderá ocorrer em caso de geração de descendentes do sexo feminino; porém, esse evento é raro. Os alelos FM do gene FMR1 são instáveis não somente na transmissão entre as gerações, mas também nos tecidos de pacientes com SXF (instabilidade somática) (QUEIROZ, 2006). Essa instabilidade leva a um dos dois tipos de mosaicismo na SXF: o mutacional e o de metilação (GARDNER; SUTHERLAND, 2004). O gene FMR1 codifica uma proteína ligante de RNAs (BARDONI e MANDEL, 2002; LOU et al., 2010), denominada FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein). A diminuição ou ausência da proteína FMRP é considerada a causa das características clínicas da SXF (FU et al., 1991; JACQUEMONT et al., 2003). Essa proteína é expressa em muitos tecidos (BASSEL; WARREN, 2008), sendo essencial para a função cerebral normal (JIN; WARREN, 2000). 25 A SXF manifesta características clínicas diferentes para o gênero masculino e feminino. Tais características abrangem distúrbios médicos e psiquiátricos principalmente em indivíduos com alelos PM e FM (pacientes com alelos ZG podem apresentar algumas deficiências, dificuldades de aprendizado e distúrbio comportamental (MITCHELL et al., 2004). Esses distúrbios podem ser divididos em: cognitivos, comportamentais, psicológicos e morfológicos (CHONCHAIYA et al., 2009). É importante ressaltar que o autismo tem relação com a SXF, sendo que algumas características clínicas são mais severas em indivíduos que têm a SXF associada ao autismo, do que em indivíduos que manifestam somente a SXF (ROGERS et al., 2001; KAUFMANN et al., 2004; ROBERTS et al., 2007). As características clínicas da SXF podem ser comuns a outros casos de atraso e distúrbios gerais de desenvolvimento, por isso é necessária a confirmação da mesma por meio de exame genético. Muitas técnicas para identificação da SXF já foram relatadas na literatura, dentre elas, os testes moleculares (ROUSSEAU et al., 1991; HADDAD et al., 1996; HAMDAM et al., 1997; PANAGAPOULOS et al., 1999; SALUTO et al., 2005; ROSALES- REYNOSO et al., 2007; DAHL et al., 2007; TASSONE et al., 2008; DODDS et al., 2009). Os testes moleculares são importantes para identificar os alelos PM e FM da SXF, e dessa forma, diagnosticar corretamente a doença, pois o conhecimento da herança genética é importante para facilitar a intervenção precoce nos transtornos (HAGERMAN; HAGERMAN, 2008). Os métodos moleculares convencionais para diagnóstico da SXF são a PCR (Polymerase Chain Reaction) e o Southern blot.. O Southern blot é o método padrão- ouro para diagnóstico da SXF, porém é trabalhoso e de alto custo. Assim, a maioria dos laboratórios realiza a PCR como método de triagem da SXF e o Southern blot somente em amostras que deixaram dúvida pela PCR (SALUTO et al., 2005). O emprego da PCR para a triagem de indivíduos com SXF sofre algumas dificuldades metodológicas. Em face dessas dificuldades vários autores propuseram modificações no método da PCR (HADDAD et al., 1996; HAMDAM et al., 1997; PANAGAPOULOS et al., 1999; SALUTO et al., 2005; ROSALES-REYNOSO et al., 2007; DAHL et al., 2007). Recentemente, Tassone et al. (2008) apresentaram um novo método da PCR para triagem da SXF que parece ser revolucionário, pois somente a PCR resolveria a maioria dos casos de suspeita da síndrome (afetados ou portadores de alelos PM ou FM, de ambos os sexos, inclusive mosaicos). Assim, o Southern Blot seria empregado somente em casos raros para os quais não foi possível obter diagnóstico por PCR e em casos que seja importante saber se os alelos estão metilados. Além disso, o método de Tassone et al. (2008) parece ser simples, de baixo custo e utiliza pouca quantidade de DNA. 26 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Síndrome do cromossomo X frágil Em 1953, Martin e Bell descreveram uma forma de retardo mental ligada ao cromossomo X em membros de uma mesma família, a qual foi denominada síndrome de Martin-Bell. Alguns anos depois, observou-se que um sítio frágil no braço longo do cromossomo X manifestava-se em amostras de indivíduos afetados pela síndrome de Martin- Bell cultivadas em meios de cultura deficientes em ácido fólico (LUBS, 1969), de forma que a síndrome passou a ser conhecida como síndrome do cromossomo X frágil. A síndrome do cromossomo X frágil envolve o sítio frágil denominado FRAXA (Fragile site, X chromossome, A site) localizado no cromossomo Xq27.3. Neste sítio está o gene FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) (OMIM 309550). O fenótipo da SXF está associado a mutações no gene FMR1 e abrange um amplo espectro de envolvimento físico e comportamental, refletindo sua expressividade clínica variável (NELSON, 1995). A proteína FMRP é altamente conservada em vertebrados e largamente expressa. Observa-se particular expressão em ovário, timo, olhos, epitélio esofágico e do baço, com abundante expressão no cérebro e testículos. Moderada expressão de FMRP foi demonstrada no colo do útero, tireóide e fígado (D’ HULST; KODY, 2009). No cérebro, a expressão de FMRP é restrita à diferenciação de neurônios sendo ausente em células nervosas não neuronais (DEVYS et al., 1993). 2.2 O gene FMR1 O gene FMR1 é altamente conservado e consiste de ~38 Kilobases (Kb) (EICHLER et al., 1993). Composto por 17 exons (Figura 1), o gene apresenta, em sua região 5’ não traduzida (5’-UTR, untranslated region) do exon 1, repetições em tandem de trinucleotídeos CGG (JIN; WARREN, 2000). A SXF origina-se pela instabilidade e expansão das repetições CGG, aliados à ocorrência de metilação. 27 Figura 1. Representação esquemática do gene FMR1 . Os 17 exons do gene estão representados pelos retângulos numerados. O triângulo indica o local das repetições CGG (Modificado de Schneider et al., 2009). 2.2.1 Classes de alelos e decorrente classificação clínica dos indivíduos O número de repetições CGG existentes no gene FMR1 é polimórfico. Devido a este fato, originam-se 4 classes diferentes de alelos para a SXF: normais (NL), gray zone (GZ) pré-mutação (PM) e mutação completa (FM) (MADALENA et al., 2001; CRAWFORD et al., 2001; HAGERMAN; HAGERMAN, 2004; SOFOCLEUS et al., 2009). Embora o número de repetições CGG considerada para a classificação clínica da SXF apresente uma pequena variação entre diferentes autores, considera-se em média: (i) de 5 a 44 repetições CGG, indivíduos portadores de alelos normais (NL); (ii) de 45 a 54 repetições, indivíduos portadores de alelos em zona de gray (ZG); (iii) de 55 à 200 repetições, indivíduos portadores de alelos pré-mutados (PM); (iv) acima de 200 repetições, indivíduos portadores de alelos completamente mutados (FM) (Tabela 1). Tabela 1. Classificação dos alelos da SXF. Número de repetições CGG Classificação 5 à 44 Normal 45 à 54 Gray zone 55 à 200 Pré-mutação > 200 Mutação completa Obs: Os limites entre as classificações devem considerar as características clínicas e histórico familiar do paciente analisado. Alguns autores consideram a existência de alelo em zona de transição, quando este apresenta de 45 à aproximadamente 60 repetições (NOLIN et al, 2003; RODRIGUEIRO, 2006). Porém, um caso descrito recentemente por FERNANDEZ-CARVAJAL et al., 2009, demonstra a geração de um alelo expandido com 538 repetições de CGG em um menino, cuja 38 Kb 28 a mãe apresenta alelo com 56 repetições CGG. Isso comprova a instabilidade de alelos com pequena expansão de repetições. Por isso é importante considerar as características clínicas e o histórico familiar de cada indivíduo, pois pequenas diferenças no número de repetições CGG (por exemplo, quatro ou cinco repetições), provavelmente não definem a classificação dos indivíduos para a SXF (HAGERMAN e HAGERMAN, 2002). A figura 2 apresenta, esquematicamente, os alelos NL, PM e FM do gene FMR1 . Figura 2. Representação dos alelos da SXF. A imagem esquematiza o fragmento obtido com a enzima Pst I (barras verticais). A ilha CpG, com o exon 1 e as repetições CGG inseridos, é indicada. (A) Alelo NL do gene FMR1 com cerca de 30 repetições CGG. (B) Alelo ZG com cerca de 45 cópias CGG. (C) Alelo PM com cerca de 90 repetições CGG. (D) Alelo FM com mais de 200 repetições CGG. O losango indica a localização de possíveis sítios de restrição sensíveis à metilação (modificado de RODRIGUEIRO, 2006). 2.2.2 Estabilidade dos alelos durante a transmissão de repetições CGG Na SXF, durante a transmissão dos alelos para as próximas gerações, podem ocorrer alterações no número de repetições CGG. Essas alterações estão relacionadas à classe do alelo (NL, ZG, PM ou FM) envolvida na transmissão. Geralmente as alterações são de aumento no número de repetições CGG. Porém podem ocorrer alterações em que o número de repetições 29 CGG diminui, como é relatado pelos autores Oberlè et al. (1991); Fu et al. (1991) e Chiurazzi et al. (1994). Os alelos considerados normais (NL) para a SXF possuem, em média, um número entre 29 e 30 repetições CGG e apresentam inserções de trincas AGG após cada 9 ou 10 repetições (MADALENA et al., 2001; SULLIVAN et al., 2002; SOFOCLEUS et al., 2009). Essas inserções geram estabilidade para o gene, principalmente no momento da replicação (EICLHER e HOLDEN et al., 1994; MADALENA et al., 2001). Assim, tendem a serem transmitidos para as próximas gerações, sem expansões. Alelos conhecidos como zona de transição (ZG) podem ser citados, na literatura, como alelos intermediários (NOLIN et al., 2003). Esses alelos podem apresentar instabilidade, ocasionando expansão no número de repetições CGG nas gerações subseqüentes. No entanto, a possibilidade de instabilidade nesses alelos não é conhecida (NOLIN et al., 2003; RODRIGUEIRO, 2006). Os alelos pré-mutados (PM) não apresentam metilação (ou apresentam metilação parcial) de forma que a transcrição e tradução do gene FMR1 não são prejudicadas. Porém esses alelos são extremamente instáveis durante a transmissão para as próximas gerações, principalmente em mulheres pré-mutadas (BASSEL; WARREN, 2008). Essa instabilidade origina alelos expandidos de mutação completa (FM), que são caracterizados por possuírem mais de 200 repetições CGG (FU et al., 1991). O risco de expansão das pré-mutações está relacionado, diretamente, ao tamanho real das repetições CGG (FU et al., 1991; HEITZ et al., 1992; BASSEL; WARREN, 2008). Segundo Heitz et al. (1992) e Nolin et al. (2003), mulheres com mais de 100 repetições CGG têm mais de 95% de chance de transmitir o alelo PM, originando a partir dele, alelos completamente mutados (FM). Isso explica o chamado “Paradoxo de Sherman” onde ocorre aumento da incidência de indivíduos com deficiência mental ao longo de sucessivas gerações de família portadora da SXF (SHERMAN et al., 1984). Alelos PM com menor tamanho dos quais se originaram alelos expandidos FM, registrados na literatura, até o momento, são de 56 e 59 repetições CGG (NOLIN et al., 2003; FERNANDEZ-CARVAJAL et al., 2009). Alguns autores descreveram a existência de alelos PM que possuem apenas uma ou nenhuma inserção de AGG em ao longo das repetições de CGG (ZHONG et al., 1996; NOLIN et al., 2003). Alelos que não apresentam inserções AGG ao longo das repetições CGG tem mais propensão de gerar expansões do que alelos com inserções AGG na sequência do gene (JIN; WARREN, 2000). Os alelos FM também são instáveis e suas seqüências tornam-se anormalmente hipermetiladas, o que resulta no silenciamento do gene FMR1 , levando à inibição da 30 expressão genética (FU et al., 1991; JIN; WARREN, 2000). A hipermetilação dos alelos FM não ocorre somente nas repetições CGG, mas também, em todos CpGs localizados nas regiões que flanqueiam as repetições CGG, incluindo a região promotora do gene (COFEE et al., 2009). É possível observar que, em relação à estabilidade, os alelos PM e FM apresentam distinções perceptíveis. Entre os alelos PM e ZG é difícil estabelecer um limite de diferenciação. Mesmo assim é importante ressaltar que não devem-se aceitar como definitivas e inquestionáveis as distinções entre os alelos (RODRIGUEIRO, 2006). Durante a transmissão dos alelos é muito raro observar diminuições no tamanho das repetições CGG (MINGRONI-NETTO et al., 1996). Porém já foram descritos casos em que o tamanho do alelo FM na prole era menor que o alelo FM da progenitora (OBERLÉ et al., 1991; CHIURAZZI et al., 1994). Van Der Ouwenland et al. (1994) apresentaram um caso de diminuição de um alelo PM para um alelo NL em uma filha de mãe portadora de alelo PM. Recentemente, Tabolacci et al. (2008), descreveram um caso em que a progenitora apresenta alelo PM de 190 repetições CGG e o filho possui alelo diminuído NL de 43 repetições CGG. Esse é o primeiro caso, na literatura, de redução no tamanho do alelo PM resultando em um alelo NL, em transmissão vertical de homem-mulher, sem que haja mosaicismo. 2.2.3 Herança e padrões de transmissão do gene Os alelos PM em mulheres geralmente tendem a gerar alelos expandidos de FM nos descendentes (HEITZ et al., 1992; NOLIN et al., 2003; BASSEL; WARREN, 2008); e os alelos FM são completamente instáveis durante a transmissão genética. Em geral, as mulheres que apresentam alelos PM com pelo menos 56 repetições CGG (NOLIN et al., 2003) transmitirão um alelo expandido FM para metade de seus descendentes. Exceção a esse fato foi descrita por Tabolacci et al. (2008) quando descreveram um caso de uma mulher com um alelo PM de aproximadamente 190 repetições CGG que gerou um filho com um alelo NL de 43 repetições CGG. Em homens, a transmissão genética de alelos PM para alelo expandido FM somente poderá ocorrer em caso de geração de descendentes do sexo feminino. Porém, esse evento é raro; tipicamente o homem pré-mutado portador de PM passa para as suas filhas somente alelo PM, com pequenas expansões ou contrações (ZEESMAN et al., 2004). 31 2.2.4 Padrões de mosaicismo em repetições de CGG e metilação Os alelos FM do gene FMR1 são instáveis não somente na transmissão entre as gerações, mas também nos tecidos de pacientes com SXF (instabilidade somática) (QUEIROZ, 2006). Essa instabilidade leva a um dos dois tipos de mosaicismo na SXF: o mutacional e o de metilação (GARDNER; SUTHERLAND, 2004). No mosaicismo mutacional os indivíduos apresentam uma linhagem celular que contém o alelo FM em co-concorrência com outra linhagem celular onde há alelo PM não metilado e funcional. A ocorrência de linhagem normal em conjunto com outra linhagem que possua o alelo PM ou o alelo FM é rara (RODRIGUEIRO, 2006). O mosaicismo de metilação ocorre em casos onde há a presença de alelo FM, porém o DNA não está metilado em todas as células (RODRIGUEIRO, 2006). Em mulheres com alelos NL, uma das duas cópias do gene FMR1 é metilada devido à inativação do cromossomo X (KIRCHGESSNER et al., 1995). Assim, mulheres normais têm alelos metilado e não metilado, na razão de 1:1. Em mulheres portadoras de FM, sem considerar a inativação do cromossomo X, a razão de alelos metilado e não metilado pode variar de 1:1 (50%:50%) para 3:1 (75%:25%) (COFEE et al., 2009). Essas observações indicam que a expansão das repetições CGG e a metilação são eventos separados, cuja associação não é muito clara (JIN; WARREN, 2000). 2.2.5 Influência das repetições CGG na transcrição do gene FMR1 . A transcrição do gene FMR1 pode ser iniciada em três sítios diferentes (I, II ou III) ao longo do promotor (BEILINA et al., 2004) (Figura 3). A seleção do sítio de iniciação da transcrição é influenciada pelos elementos CGG. Assim, quanto maior a repetição, ocorre o predomínio da utilização de sítios iniciadores mais distais à repetição (BEILINA et al., 2004). Smith et al. (2004), especulam que o local de início da transcrição influencia nos níveis de RNA mensageiro (mRNA) em pacientes portadores de alelo PM. 32 Figura 3. Representação esquemática da região inicial do gene FMR1 . O promotor do gene e a maior parte do éxon 1 estão inseridos na ilha CpG indicada pela linha pontilhada. Os sítios de transcrição (I, II e III) representados por losangos, são requeridos de acordo com o tamanho da repetição CGG (retângulo hachurado). O retângulo negro representa o éxon 1, onde está inserida a repetição CGG. A seta simboliza o início da tradução.(Retirada de RODRIGUEIRO, 2006). 2.3 A proteína FMRP 2.3.1 Estrutura e expressão protéica O gene FMR1 codifica uma proteína ligante de RNAs (BARDONI; MANDEL, 2002; LUO et al., 2010) com 631kilodaltons (kD), denominada FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein). A diminuição ou ausência da proteína FMRP é considerada a causa das características clínicas da SXF (FU et al., 1991; JACQUEMONT et al., 2003). A proteína é expressa em muitos tecidos (BASSEL; WARREN, 2008) sendo essencial para a função cerebral normal (JIN; WARREN, 2000). A transcrição do gene FMR1 gera um transcrito da ordem de 4,4 Kb (EICHLER et al., 1993). O processamento do transcrito apresenta alternativas diferentes, dando origem a mais de 12 isoformas da proteína (D´HULST; KODY, 2009; XIE et al., 2009). Cada isoforma da proteína liga RNAs diferentes, resultando em proteínas com diferentes afinidades (DENMAN et al., 2002) A especificidade dessas isoformas no desenvolvimento da SXF, vem sendo estudada (BECHARA et al., 2006; XIE et al., 2009; BANERJEE et al., 2010). Na proteína FMRP existem três domínios: KH1, KH2 (hn RNP K-protein homology) e um domínio de arginina-glicina-glicina (RGG box) (BARDONI; MANDEL, 2002; BASSEL; WARREN, 2008; OOSTRA et al., 2009). Há ainda, um sinal de localização nuclear (NLS) e um sinal de exportação nuclear (NES) (EBERHART et al., 1996; BARDONI et al., 1997; BASSEL; WARREN, 2008). A existência dos domínios KH1, KH2 e RGG box indica que a proteína é ligante de RNA (SIOMI et al., 1993). Os sinais NSL e NES sugerem que a proteína FMRP tem um importante papel no transporte (do núcleo para o citoplasma) de muitos mRNAs alvo, podendo atuar na regulação da tradução de tais mRNAs (BARDONI; MANDEL, 2002; BASSEL; WARREN, 2008). 33 A figura 4 apresenta o gene FMR1 e a proteína FMRP apresentando os sítios de processamento alternativo do gene (que gera as diferentes isoformas da proteína); os domínios de ligação de RNAs (KH1, KH2 e RGG box) e os sinais de localização e exportação nuclear (NSL e NES). Figura 4. Representação do gene FMR1 e da proteína FMRP. As caixas verdes indicam domínios da proteína (NLS – sinal de localização nuclear; KH1 e KH2 – domínios ligantes de RNA; NES – sinal de exportação nuclear; RGG – “box” RGG ligante de RNA. As caixas azuis indicam os 17 exons do gene. As caixas cinzas representam regiões não traduzidas. As linhas pontilhadas indicam os exons que codificam os domínios da proteína. As linhas contínuas indicam os processamentos alternativos do gene. (Modificada de Bassel; Warren, 2008). A proteína FMRP apresenta, ainda, dois principais sítios CC (coiled coil) envolvidos na interação com outras proteínas, como por exemplo: FXR1P (Fragile X Related Protein 1), FXR2P (Fragile X Related Protein 2), CYFIP1 (Citoplasmic FMR1 Interacting Protein 1), CYFIP2 (Citoplasmic FMR1 Interacting Protein 2) e NUFIP1 (Nuclear FMRP interacting protein) (D’HULST; KODY, 2009). Na figura 5 é possível visualizar na proteína FMRP os sítios (CC) de interação com outras proteínas e alguns exemplos de proteínas que interagem com a FMRP. Aminoácidos 34 Figura 5. Representação esquemática do mRNA do gene FMR1 e da proteína FMRP. Os sítios (CC) de interação com proteínas e as proteínas que interagem com a FMRP são visualizados. (Modificada de D’Hulst; Kody, 2009). A proteína FMRP é altamente conservada em vertebrados e amplamente expressa. Observa-se particular expressão em ovário, timo, olhos, epitélio esofágico e do baço, com abundante expressão no cérebro e testículos. Já, uma moderada expressão de FMRP foi demonstrada no colo do útero, tireóide e fígado (D’HULST; KODY, 2009). No cérebro, a expressão de FMRP é restrita à diferenciação de neurônios e é ausente em células nervosas não neuronais (DEVYS et al., 1993). Tamanini et al. (1997) encontraram, em células germinativas primordiais de fetos e adultos normais, alta expressão da proteína FMRP. A proteína também foi encontrada em testículos de fetos e adultos portadores do alelo FM do gene FMR1. Nos adultos a expressão da proteína era normal. Isso coincide com relatos anteriores onde pacientes com FM nas células somáticas apresentavam alelo PM nas células germinativas (REYNIERS et al., 1993; DE GRAAF et al., 1995). 2.3.2 FMRP: RNAs alvos e interação com proteína A pesquisa por RNAs que se ligam à proteína FMRP resultou na identificação de uma grande quantidade de mRNAs responsáveis pela síntese de diferentes proteínas com variadas funções (D’HULST; KODY, 2009). Myashiro et al. (2003) identificaram mais de 80 mRNAs, dos quais 60% estão envolvidos diretamente com a FMRP. Realizando experimentos com ratos, esses autores observaram que muitos desses mRNAs (e suas proteínas correspondentes) demonstravam mudanças sutis de localização e abundância da proteína FMRP. Os dados foram consistentes com a ideia de que a FMRP regula seletivamente múltiplos caminhos biológicos. 35 Uma grande quantidade de proteínas podem interagir direta ou indiretamente com a com a FMRP (D’HULST; KODY, 2009) Muitas dessas proteínas, como FXR1P, FXR2P, NUFIP1, entre outras, podem modular a afinidade de FMRP para diferentes classes de mRNAs, induzindo mudanças estruturais na conformação da proteína. Isso gera domínios de RNAs diferentes, possibilitando a ligação de outros mRNAs (D’HULST; KODY, 2009). 2.3.3 Algumas funções descritas da FMRP. Diante da vasta gama de mRNAs e proteínas que podem ligar-se à proteína FMRP, as funções dessa proteína podem ser inúmeras. A proteína FMRP tem importante papel na regulação e tradução de específicos alvos mRNAs (OOSTRA et al., 2009). Jin e Warren, (2003) propuseram um modelo para comprovar que a FMRP tem um importante papel na plasticidade das sinapses dos neurônios através do transporte e regulação da síntese protéica de específicos mRNAs em resposta à estimulação sináptica. Também já foi descrito, em trabalhos in vitro que a proteína FMRP pode atuar como repressor da tradução de seu próprio mRNA (LAGGERBAUER et al., 2001). Nos neurônios, a FMRP está localizada dentro e na base dos espinhos de dendritos (D’HULST; KODY, 2009). Os espinhos de dendritos são pequenas extensões de membrana plasmática em um dendrito de neurônios, no cérebro. Esses espinhos servem como sítios de armazenamento sináptico, suporte de transmissão de sinal elétrico, e aumento do número da possibilidade de contato entre neurônios. Muitos estudos apresentam anormalidades na formação dos espinhos de dendritos em SXF, que podem estar diretamente relacionadas com prejuízo cognitivo (CHONCHAIYA et al., 2009). Assim, os baixos níveis de FMRP afetam o desenvolvimento dos neurônios, levando a problemas que envolvem as funções cognitivas de motivação, leitura e memória (CHONCHAIYA et al., 2009). 2.4 Correlação genótipo-fenótipo A SXF manifesta características clínicas diferentes para o gênero masculino e feminino. A variação nos distúrbios ocorre de acordo com as características genéticas individuais a influência ambiental. Além disso, há as variações no gene FMR1, como diferentes graus de mosaicismo, níveis de mRNAs do gene FMR1 , níveis da proteína FMRP e a proporção de alelos NL do gene FMR1, ativos em mulheres (CHONCHAIYA et al., 2009). 36 Dependendo do tamanho da expansão de repetições CGG ocorre menor ou maior bloqueio à tradução da proteína FMRP. Alelos FM são geralmente hipermetilados e silenciados, o que leva à pouca ou nenhuma produção de mRNA ou proteína. O tamanho da expansão de repetições CGG no alelo PM leva à toxicidade gerada pelo excesso de mRNA. Essa toxicidade e a redução na expressão da proteína FMRP podem ambos contribuir com os distúrbios clínicos (HAGERMAN; HAGERMAN, 2008). As características clínicas abrangem distúrbios médicos e psiquiátricos em indivíduos com alelos PM e FM. Esses distúrbios podem ser divididos em cognitivos, comportamentais, psicológicos e morfológicos (CHONCHAIYA et al., 2009). É importante ressaltar que o autismo (doença heterogênea de forte influência genética - RODRIGUEIRO, 2006), tem relação íntima com a SXF, e algumas características clínicas são mais severas em indivíduos que tem a SXF associada ao autismo, do que em indivíduos que manifestam somente a SXF (ROGERS et al., 2001; KAUFMANN et al., 2004; HALTON et al., 2006; ROBERTS et al., 2007). 2.4.1 Fenótipos cognitivos em indivíduos com alelo FM da SXF A principal característica da SXF é a deficiência mental. Essa deficiência manifestada apresenta-se de leve a grave, com valores QI (Intelligence Quotient) entre 20 e 60 (SOFOCLEUS et al., 2009). Cerca de 85% de homens e 25 - 30% de mulheres com a FM do gene FMR1 tem índices de QI menores de 70 (LOESCH et al., 2004). A severidade da deficiência mental está relacionada à deficiência da proteína FMRP (LOESCH et al., 2004). Indivíduos com discretas diminuições nos níveis de FMRP podem apresentar QI normal (ou próximo do normal) com ou sem dificuldades de aprendizagem. Esses indivíduos são, em geral, mulheres com a SXF (CHONCHAIYA et al., 2009). A trajetória de desenvolvimento cognitivo na SXF é lenta e podem ser observados declínios de QI no final da infância e adolescência. A capacidade cognitiva continua a aumentar, embora a taxas mais lentas do que o normal (SKINNER et al., 2005). Aproximadamente 30% dos meninos com SXF tem comportamento autista (LEWIS et al., 2006). Em crianças portadoras da SXF com idade de 1 a 6 anos, foram descritas alterações no sistema motor, principalmente, quando há associação dessa SXF com o autismo (ZINGEREVICH et al., 2009). Adicionalmente, competências cognitivas, de linguagem e adaptativas são mais baixas em pacientes com a SXF associada ao autismo (ROGERS et al., 2001; KAUFFMANN et al., 2004; LEWIS et al., 2006). 37 Prejuízos cognitivos envolvem funções executivas, memória visual, coordenação motora visual, memória auditiva de curto prazo, processamento de informações sequenciais, atenção continuada e memória de trabalho (ROBERTS et al., 2005; REISS et al 2007; FARZIN et al., 2008; CORNISH et al., 2008). Aproximadamente 30% a 50% de todas as mulheres com a FM tem índices de QI normais. Porém, é possível observar dificuldades de leitura, função executiva deficiente, distúrbios de atenção, dificuldades com a matemática e deficiências de linguagem ou aprendizagem. A proteína FMRP regula a síntese de proteínas participantes das sinapses de neurônios. A ausência da proteína FMRP ocasiona alta expressão de proteínas, principalmente, da via mGluR5 (Metabotropic Glutamate Receptor 5 Pathway) levando, à depressões nas sinapses à longo prazo ou o enfraquecimento das ligações sinápticas (BEAR et al., 2004). Estudos com modelos animais revelaram que os déficits cognitivos estão relacionados à alta expressão de proteínas da via mGluR5 (DE VRIJ et al., 2008; DOLEN et al., 2008). Casos de epilepsia ocorrem em aproximadamente 10-40% de indivíduos com SXF (MUSUMECI et al., 1999; BERRY-KRAVIS et al., 2002). As crises são generalizadas ou parcialmente complexas e podem ocorrer à noite (BERRY-BRAVIS et al., 2002). Tais crises são 3 vezes mais comuns em indivíduos com SXF associada ao autismo se comparada com a SXF sem autismo (GARCIA-NONELL et al., 2008). Estudos com modelos animais tem demonstrado que alta expressão de proteínas na via do receptor mGluR5 leva à fenótipos de crise epiléptica (YAN et al 2005). As dificuldades de linguagem variam de total ausência de linguagem até dificuldades medianas na comunicação (RODRIGUEIRO, 2006). Tem sido observado um padrão de fala desordenado, onde a fala é rápida, ocasionalmente confusa, repetitiva e desorganizada (PLOMIN et al., 2001). 2.4.2 Fenótipos comportamentais e psicológicos em indivíduos com alelos FM da SXF As características comportamentais e psicológicas na SXF, incluem: timidez, esquiva social, ansiedade, distração, hiperatividade, desatenção, impulsividade, defensividade tátil, comportamento de auto-lesão, instabilidade agressiva, irritabilidade, inflexibilidade e comportamentos autista (contato visual pobre, ecolalia, palilia, comportamentos motores repetitivos ou esteriotipados [ex. agitar e morder as mãos] e hipersensibilidade sensorial) (HAGERMAN in HAGERMAN; HAGERMAN, 2002; KAUFMANN et al., 2004; BUDIMIROVIC et al., 2006; BAILEY et al., 2008). 38 A identificação precoce da SXF na infância (entre 9 e 12 meses) pode ser facilitada pela presença incomum de desenvolvimento sensor e motor (ex. desempenhar competências objetivas, como movimentos giratórios) e padrões motores (ex. movimentos repetitivos de pernas e postura incomum) (CHONCHAIYA et al., 2009). Em mulheres, tipicamente, os comportamentos e os problemas cognitivos são mais leves do que os observados em homens. Isso pode ser explicado por haver alguma produção da proteína FMRP a partir do alelo normal do gene FMR1, presente no outro cromossomo X (CHONCHAIYA et al., 2009). Não obstante, as mulheres são susceptíveis ao desenvolvimento de problemas emocionais, tais como: depressão, ansiedade social e afastamento (REISS et al., 2007). Indivíduos com SXF possuem distúrbios no sistema nervoso autônomo. Esses distúrbios são mais comuns em pacientes com SXF associada ao autismo (ROBERTS et al., 2006). As crianças são mais susceptíveis a ter ansiedade. A razão dessa susceptibilidade pode estar na resposta simpática (relacionada ao sistema nervoso simpático) aos estímulos do meio, e a capacidade de se acostumar com esses estímulos (CHONCHAIYA et al., 2009). Essa desregulação autônoma está provavelmente relacionada à alta expressão de proteínas na via do receptor mGluR5 e a baixa expressão de proteínas do sistema do neurotransmissor GABA (Gamma-aminobutyric acid) (HESSL et al., 2002). Indivíduos com SXF também possuem maior liberação de cortisol após um estímulo estressante (HESSL et al., 2002). A alta liberação de cortisol pode levar à ADHD (Déficit de Atenção e Transtorno de Hipertatividade) que requer tratamento médico (HAGERMAN et al., 2009). 2.4.3 Fenótipos físicos em indivíduos com FM Os indivíduos portadores da SXF manifestam uma ampla variedade de características físicas. Entretanto, nenhuma dessas características é específica da síndrome, e nenhuma das características é encontrada em 100% dos afetados (RODRIGUEIRO, 2006). Muitos portadores da SXF jovens e do sexo masculino tem alterações no tecido conjuntivo, demonstrando problemas nas fibras elásticas da pele, na aorta e nas válvulas do coração (HAGERMAN; HAGERMAN, 2002). As alterações nas fibras elásticas da pele incluem: orelhas proeminentes, hiperextensibilidade das articulações dos dedos, pele macia e pés chatos. Outras características identificadas são: pectus excavatum, prolapso da vávula mitral, estrabismo, macroorquidismo, mandíbula proeminente e face alongada (HAGERMAN; HAGERMAN, 2002). A face alongada ocorre por hipoplasia mandibular (RODRIGUEIRO, 2006). O macroorquidismo usualmente começa a aparecer aos os 8 anos de 39 idade e o tamanho máximo que os testículos podem atingir (em torno de 2 ou 3 vezes o tamanho normal) é observado na adolescência (LACHIEWICZ et al., 1994). Todas estas manifestações clínicas poderiam ser explicadas pela alteração do tecido conjuntivo, uma vez que neste tecido há alta expressão do gene FMR1. Mulheres portadoras da FM que apresentam deficiência mental manifestam, ocasionalmente, algumas características faciais exibidas por homens afetados. Porém, na maioria dos casos, as características físicas são normais (HAGERMAN; HAGERMAN, 2002). 2.4.4 Relação das características entre indivíduos portadores de FM e autismo O autismo é uma desordem com forte influência genética que é definida, segundo o critério DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition), como um grave comprometimento da interação social ou verbal e de habilidades de comunicação não verbal aliado a um repertório restrito de atividades e interesses (APA, 2000). A prevalência de autismo em indivíduos com a SXF foi relatada como sendo de 15 a 35%, embora a ADOS (Autism Diagnosis Observation Schedule) considere aproximadamente 30% (ROGERS et al., 2001; KAUFMANN et al., 2004; HARRIS et al., 2008). Essa prevalência provavelmente é devido ao fato da proteína FMRP regular a tradução de muitas proteínas associadas ao autismo, como SHANK, PTEN, CYFIP, PSD95 (BEAR et al., 2004; BELMONTE et al., 2006; BASSEL; WARREN, 2008). Indivíduos com SXF associada ao autismo, quando comparados com indivíduos que somente possuem a SXF, são mais severamente comprometimentos em relação à aspectos cognitivos, comportamentos adaptativos, linguagem e interação social (ROGERS et al., 2001; KAUFMANN et al., 2004; KAU et al., 2004; ROBERTS et al., 2007; HALTON et al 2006). Os déficits de linguagem em indivíduos com a SXF e autismo envolvem severos déficits receptivos, incluindo aspectos de raciocínio verbal, além do reconhecimento e diferenciação de emoções (LEWIS et al., 2006; BUDIMIROVIC et al., 2006).O prejuízo social afetivo em crianças com SXF e autismo torna difícil o aprendizado da língua de forma efetiva (CHONCHAIYA et al., 2009). O diagnóstico de autismo em crianças com SXF inclui a avaliação de déficits de comunicação, comportamento de afastamento social, deficiências no complexo de interações sociais e competências de adaptação social, já que essas características estão altamente associadas ao autismo (KAUFMANN et al., 2004; KAU et al., 2004; BUDIMIROVIC et al., 2006). Altos níveis de afastamento social, considerados muito 40 evasivos em vários contextos e baixos em outros, podem ser vistos em indivíduos com a SXF associada ao autismo (ROBERTS et al., 2007). Comportamentos autistas na SXF e de reação emocional do paciente podem variar diariamente ou mesmo em determinados horários do dia (CHONCHAIYA et al., 2009). Nota-se que uma avaliação abrangente envolvendo diferentes especialidades da Medicina pode ser necessária para chegar a um consenso sobre o diagnóstico do autismo. Tal diagnóstico é essencial para ajudar as crianças a receberem intervenções adequadas para o autismo, embora tais intervenções também possam beneficiar indivíduos que tenham somente a SXF (HARRIS et al., 2008). 2.4.5 Fenótipos em indivíduos com PM. Indivíduos portadores de alelo PM da SXF podem apresentar ou não fenótipos clínicos (CHONCHAIYA et al., 2009). Dentre os distúrbios observados destaca-se o risco aumentado de desordens de humor e de ansiedade. Além disso, os homens podem ter particular aumento no risco de desordens caracterizadas por afastamento social (transtorno de personalidade e fobia social) (BOUGEOIS et al., 2009). Apesar de muitos indivíduos não sofrerem com problemas cognitivos, psiquiátricos ou médicos, mulheres com o alelo PM podem apresentar falha prematura dos ovários (POF (Primary Ovarian Failure) ou POI (Primary Ovarian Insufficiency)) e/ou síndrome Tremor-ataxia (FXTAS (Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome) (WITTENBERG et al., 2007; HAGERMAN et al., 2004). Em indivíduos com o alelo PM os níveis de mRNAs do gene FMR1 estão aumentados. Muitos problemas observados em indivíduos com PM estão relacionados ao ganho de função secundária de RNA obtido pela elevada quantidade de mRNAs presentes (CHONCHAIYA et al., 2009). Os elevados níveis de mRNAs levam à toxicidade celular, principalmente em neurônios (HAGERMAN et al., 2004; HAGERMAN; HAGERMAN, 2008), já que causam desregulação de muitas proteínas (CHONCHAIYA et al 2009). Mulheres portadoras de PM que geralmente apresentam um quociente QI normal manifestam um risco aumentado para POF (WITTENBERGE et al., 2007), depressão e ansiedade, (HESSL et al., 2005), hipotireoidismo, fibromialgia, neuropatia e FXTAS (COFFEY et al., 2008). Homens podem desenvolver problemas que incluem: perda da memória de curto prazo, parkinsonismo, neuropatia periférica, ansiedade, comportamento reclusivo, demência, fraqueza muscular, disfunção do sistema nervoso autônomo (JACQUEMONT et al., 2003), déficits de atenção e de função executiva, hiperatividade, problemas de memória e desordens relacionadas ao autismo (AZIZ et al., 2003; FARZIN et al., 2006). Problemas psicopatológicos mais comuns (ansiedade, depressão e comportamento 41 obsessivo compulsivo) são clinicamente significantes em 25 a 40% dos pacientes (CHONCHAIYA et al., 2009). A POF é definida como menopausa ou amenorréia hipoestrogênica que ocorre antes dos 40 anos (HAGERMAN; HAGERMAN, 2002). Estimativa desse problema nas mulheres com PM são da ordem de 4% aos 30 anos e 25% aos 39 anos de idade (HUNDSCHEID et al., 2000). A FXTAS é uma desordem degenerativa que ocorre predominantemente em homens de 50 a 70 anos com PM (HAGERMAN; HAGERMAN, 2004), embora aproximadamente 8% das mulheres com PM são afetadas (COFFEY et al., 2008). As características dessa desordem incluem: intenso tremor, ataxia, parkisionismo, neuropatias, déficits cognitivos e de funções executivas, eventual declínio à demência e disfunções autônomas como hipertensão, impotência, e eventuais incontinências urinária e intestinal (JACQUEMONT et al., 2003; BERRY-KRAVIS et al., 2007; COFFEY et al., 2008). 2.4.6 Fenótipos em indivíduos com GZ. Pacientes GZ podem apresentar algumas deficiências como dificuldades de aprendizado e distúrbio comportamental (MITCHELL et al., 2004). Em um estudo na Tasmânia, com meninos que apresentavam necessidades especiais, Mitchell et al. (2004) relataram que 3,4% deles apresentaram alelos GZ. Vale ressaltar que Bretherick et al. (2005), realizando estudo em pacientes com POF, observaram que algumas pacientes possuíam alelos GZ. 2.5 Prevalência populacional da SXF A prevalência da expansão das repetições CGG é similar na maioria dos grupos étnicos, mas podem ocorrer variações entre as populações (QUEIROZ, 2006). Há pouco consenso da prevalência dessa síndrome na população geral (principalmente quando se consideram variações geográficas) e entre os gêneros feminino e masculino (HAGERMAN, 2008). Considerando o consenso internacional sobre o fato da SXF ser subdiagnosticada, a prevalência de 1:4000 (TURNER et al., 1996) foi amplamente utilizada até recentemente, quando HAGERMAN, 2008 em um amplo estudo sobre prevalência da SXF, sugere que seja considerada a prevalência de 1:2500 dessa síndrome tanto em homem como mulheres. Um estudo em pacientes do Canadá revelou a prevalência do alelo PM em 1:259 mulheres (ROUSSEAU et al., 1995). Os mesmos pesquisadores (DOWBROWSKI et al., 42 2002) realizaram um estudo em outros 10.572 homens e puderam observar uma prevalência de 1:813 do alelo PM. Toledano et al. (2001) analisaram 14.334 mulheres em fase pré- conceptiva ou gestacional, sem histórico familiar de retardo mental. Os resultado obtidos identificaram a presença de alelos com número de repetições CGG maior que 54 em 1:113 mulheres e de alelos com número de repetições CGG menor que 54 em 1:69 mulheres. Tais resultados ainda, proporcionaram aos autores evidenciar a alta prevalência de alelos PM na população em geral, recomendando a triagem de mulheres portadoras de PM em larga escala. 2.6 Diagnósticos laboratoriais da SXF Como as características clínicas da SXF podem ser comuns a outros casos de atraso e distúrbios gerais de desenvolvimento, é necessária a confirmação da referida síndrome por uma avaliação laboratorial específica. O diagnóstico da SXF pode ser fornecido pela análise da presença e do número de repetições CGG expandidas e/ou pela presença ou ausência de metilação (QUEIROZ, 2006). Muitas técnicas para identificação da SXF já foram relatadas na literatura: análise citogenética (LUBS, 1969), teste de identificação da proteína FMRP em células ou tecidos (WILLEMSEN et al., 1995; WILLEMSEN et al., 1997; WILLEMSEN et al., 2002) e testes moleculares (ROUSSEAU et al., 1991; HADDAD et al., 1996; HEID et al., 1996; HAMDAM et al., 1997; PANAGAPOULOS et al., 1999; SALUTO et al., 2005; ROSALES-REYNOSO et al., 2007; DAHL et al., 2007; TASSONE et al., 2008; DODDS et al., 2009; SAUL; TARLETON, 2010; FILIPOVIC-SADIC et al., 2010; CHEN et al., 2010). O primeiro método descrito para diagnóstico da SXF foi a análise citogenética que consiste no estudo numérico e morfológico de cromossomos em metáfase (LUBS, 1969). Nessa análise, as culturas celulares são realizadas em meios modificados, geralmente com deficiência de ácido fólico, para induzir sítios frágeis (SAUL; TARLETON, 2010). Essa técnica demonstra insuficiente especificidade e sensibilidade (MADDALENA et al., 2001; SAUL; TARLETON, 2010), além disso, é muito mais cara que os testes moleculares (SAUL; TARLETON, 2010). Portanto, esse método não tem mais sido recomendado para o diagnóstico da SXF (MADDALENA et al., 2001). O primeiro teste de identificação da proteína FMRP foi descrito por Willemsen et al. (1995). Esse teste informa o percentual de FMRP em linfócitos de amostras de sangue analisadas. Pacientes afetados possuem de 0-15% de FMRP, enquanto pessoas normais apresentam de 80-10%. O teste pode ser aplicado em células (imunocitoquímica) ou em 43 tecidos (imunohistoquímica) (WILLEMSEN et al., 1995; WILLEMSEN et al., 2002). Tais testes são limitados para detectar portadores de alelo FM (MADDALENA et al., 2001). Segundo Saul e Tarleton (2010), esse método não é realizado rotineiramente nos laboratórios provavelmente por requerer sangue fresco, o que confere uma limitação ao seu emprego. Os testes moleculares para diagnóstico da SXF tem sido mais utilizados pelos laboratórios, pois apresentam resultados mais sensíveis e específicos. Os testes convencionais envolvem as técnicas de Southern Blot (ROUSSEAU et al., 1991) e PCR (Polimerase Chain Reaction) (HADDAD et al., 1996; HAMDAM et al., 1997; PANAGAPOULOS et al., 1999; SALUTO et al., 2005; ROSALES-REYNOSO et al., 2007; DAHL et al., 2007; TASSONE et al., 2008; FILIPOVIC-SADIC et al., 2010; CHEN et al., 2010). Doods et al. (2009) apresentaram uma associação de PCR com a técnica de digestão nuclear e espectometria de massas afim de melhorar a obtenção de resultados. Além das técnicas convencionais, também podem ser realizadas técnicas como: RT-PCR (Reverse Transcrition PCR) (HEID et al., 1996), análise por FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) (SAUL; TARLETON, 2010) e seqüenciamento do DNA. Por meio da PCR é possível amplificar a região do gene FMR1 que flanqueia à repetição CGG para verificar se há a presença de alelos expandidos e qual o seu tamanho. Porém, a eficiência da reação da PCR diminui conforme aumenta o número de repetições (HAMDAN et al., 1997; SALUTO et al., 2005). No método Southern blot, o DNA genômico é digerido com enzimas de restrição, os fragmentos são separados por eletroforese e transferidos para uma membrana, a qual é exposta à hibridização com uma sonda marcada (com radioisótopo ou fluorescência) para detectar a expansão CGG. Dessa forma, determinam-se o tamanho dos alelos e a identificação da metilação nos mesmos (ROUSSEAU et al., 1991). Entretanto, como o Southern blot é um método de alto custo e trabalhoso, a maioria dos laboratórios realiza a PCR como método de triagem e o Southern blot somente em amostras que deixaram dúvida pela PCR, ou aquelas em que é necessário verificar o estado de metilação do alelo (SALUTO et al., 2005). Algumas dificuldades metodológicas estão relacionadas ao emprego da PCR para a triagem de indivíduos com SXF. Como as repetições CGG são ricas em nucleotídeos Citosina e Guanina, há a tendência de se formarem estruturas secundárias (hairpins) reconhecidas pela DNA polimerase como sítios de pausa, resultando em amplificações incompletas e produtos da PCR com múltiplas bandas (QUEIROZ, 2006). Para diminuir tais estruturas secundárias pode-se utilizar na PCR o 7-deaza-2´- deoxiguanosina trifosfato e também o dimetilsulfóxido (DMSO). A utilização desses reagentes dificulta a visualização de bandas em gel de agarose. 44 Assim, como os produtos de PCR não são visíveis no gel de agarose, são utilizados desoxinucleotídeos marcados com 32P, permitindo a visualização dos produtos da PCR por autoradiografia, porém somente após 1 a 4 dias de exposição (HAMDAM et al., 1997). Por outro lado, mesmo utilizando os reagentes mencionados acima, há a possibilidade de visualização dos produtos da PCR em gel de poliacrilamida (HADDAD et al., 1996). Seja em gel de agarose ou de poliacrilamida, por meio da PCR convencional algumas amostras não fornecem um diagnóstico preciso. Por exemplo, amostras de mulheres que amplificam somente uma banda na faixa da normalidade podem na verdade ser heterozigotas e carregar um alelo FM (o qual, pelo seu longo tamanho de amplicon1 acaba não sendo visualizado). O mesmo ocorre com amostras de homens que não produziram bandas, sugerindo que podem ter um alelo FM, cujo amplicon não foi detectável pelo método (HADDAD et al., 1996; QUEIROZ, 2006). Em face dessas dificuldades, vários autores propuseram modificações no método da PCR, além de outras técnicas para o diagnóstico da SXF; por exemplo, detectar alelos metilados na região de expansão CGG no gene FMR1. A expansão das repetições CGG aumenta a chance de ocorrer metilação na região. Para essa detecção, costuma-se utilizar o DNA genômico tratado com bissulfito, para análise por PCR com primers específicos que detectam alelos metilados (MS-PCR, Methylation Specific PCR), além de proporcionar uma redução na dificuldade de amplificação da região por PCR. Essas técnicas para detectar metilação utilizam eletroforese em gel de agarose (PANAGOPOULOS et al., 1999), poliacrilamida (ROSALES-REYNOSO et al., 2007) e até PCR em tempo Real (DAHL et al., 2007). Porém, o problema para diagnosticar mulheres portadoras de um alelo FM persistiu, pois assim como nos métodos da PCR convencional, ocorre a amplificação preferencial do alelo NL em mulheres heterozigotas. Algumas modificações no protocolo da PCR convencional incluíram a adição de betaina para reduzir as estruturas secundárias do DNA e utilização de tipos alternativos de DNA polimerase que são capazes de expandir cadeias longas com alta fidelidade, como uma combinação da DNA polimerase do tipo Pfu (proofreading enzyme) com a Taq DNA polimerase (HAMDAM et al., 1997), ou a enzima Expand Long Template PCR System (Roche) (SALUTO et al., 2005). Tais modificações facilitaram a visualização dos produtos da PCR com até 300 repetições CGG em pacientes do gênero masculino e 160 repetições em pacientes do gênero feminino, em gel de agarose (SALUTO et al., 2005). Mesmo assim 1 Sequência de DNA produzida pela PCR 45 persistia a não distinção de mulheres heterozigotas com alelo FM (expansão > 200 repetições, cujo amplicon não é visualizado no gel), de homens afetados (com alelo FM) e de homens mosaico para SXF. Nesses casos a banda que caracteriza o alelo FM não é distinguível no gel (SALUTO et al., 2005). Comparando o método da PCR com o Southern blot, não há dúvida de que a PCR mostra as vantagens de ser um método mais econômico, rápido, de maior biossegurança e que necessita de menos quantidade de DNA genômico para sua realização. Por esses motivos a PCR tem sido empregada como método de triagem da SXF. No entanto, a PCR não tem sido utilizada como método de diagnóstico da SXF devido à sua limitação em identificar com precisão casos como mulheres heterozigotas (ou homozigotas para a FM, evento raro) e homens mosaicos, pois nessas situações os indivíduos portam alelos com FM de mais de 300 repetições CGG de maneira que tal amplicon não pode ser visualizado no gel. Métodos alternativos tem sido buscados para aumentar a eficiência da PCR para que possa ser empregado como método de diagnóstico da SXF. Tassone et al. (2008) descreveram um novo método da PCR de triagem da SXF. Nele, os autores introduzem modificações no método da PCR anteriormente descrito por Saluto et al. (2005), além de inovar com a possibilidade de distinguir (em gel de agarose) mulheres homozigotas para o alelo NL de mulheres heterozigotas que carregam o alelo FM ou PM muito longos, caracterizando uma grande vantagem. Além disso, também foi possível detectar visualmente a presença de alelos FM e PM em homens cujo produto de PCR não amplificava, podendo também identificar mosaicismo (TASSONE et al., 2008). A metodologia desenvolvida por Tassone et al. (2008) é simples: para as amostras inconclusivas pelo método de Saluto et al. (2005), realiza-se uma segunda reação de PCR com um novo primer denominado quimérico. Na região 3’ desse primer há uma repetição de 4 trinucleotideos CCG que se anela ao acaso na região de repetições CGG do gene FMR1 , de forma que produz um arraste no gel de agarose depois de corado por brometo de etídio. Esse arraste comprova a existência de um alelo mutado não distinguível em gel para mulheres que apresentavam somente uma banda e homens que não amplificavam nenhuma banda. O método desenvolvido por Tassone et al. (2008) parece ser revolucionário, pois somente a PCR resolveria a maioria dos casos de suspeita de SXF (afetados ou portadores de alelos PM ou FM, de ambos os sexos, inclusive mosaicos). Assim, o Southern Blot seria empregado somente em casos onde não foi possível obter diagnóstico por PCR e naqueles em que seja importante saber se os alelos estão metilados. Além disso, o método de Tassone et al. (2008) parece ser rápido, de baixo custo e utiliza pouca quantidade de DNA. Os autores 46 demonstraram a aplicabilidade do método para rastreamento da SXF em recém-nascidos, utilizando manchas de sangue em papel absorvente especial. No entanto, observou-se a ausência de detalhes importantes na metodologia, como: a quantidade de enzima utilizada, a forma de realização do hot start, as adaptações realizadas para a aplicação do método com uma enzima alternativa. A ausência desses detalhes dificulta a reprodução da técnica. Observou-se também a ausência de ilustração do padrão de bandas obtidas no gel de agarose para indivíduos do sexo masculino portadores de alelos PM e FM, quando realizada a 2a PCR Recentemente, Chen et al. (2010) descreveram uma técnica de PCR que combina: (i) a utilização de reagentes que amplificam com alta eficiência regiões ricas em nucleotídeos GC (FILIPOVIC-SADIC et al., 2010) e (ii) o primer quimérico descrito por Tassone et al. (2008), com uma repetição CGG a mais. Segundo os autores, a técnica é capaz de detectar em gel de agarose até 1300 repetições CGG tanto em homens quanto em mulheres. Utilizando em seguida a eletroforese capilar, é possível obter os resultados com melhor precisão, e inclusive detectar repetições AGG. Assim essa técnica detectaria todos os alelos para a SXF, inclusive em casos de heterozigosidade. Devido a isso, o Southern blot seria aplicado somente em casos nos quais deseja-se saber o estado de metilação dos alelos. 2.6.1 Indivíduos que devem ser testados para a SXF Segundo Hagerman e Hagerman, 2008, é altamente aconselhável a realização de testes moleculares no gene FMR1 em alguns grupos de pacientes: (i) crianças com deficiências intelectuais e de desenvolvimento, além de comportamento autista; (ii) mulheres adultas com características de menopausa precoce e outros adultos com ataxia ou tremor intenso; (iii) e indivíduos com deficiências cognitivas ou demência, neuropatias, parkinsonismo, esclerose múltipla atípica, e distúrbios de ansiedade, principalmente se há histórico familiar de distúrbios intelectuais e do desenvolvimento, além de comportamento autista. 2.6.2 Aconselhamento genético e tratamento da SXF Os testes diagnósticos para a SXF são importantes para correlacionar os distúrbios com a presença de ambos alelos PM e FM. O conhecimento da herança genética é importante para facilitar a intervenção precoce nos transtornos (HAGERMAN; HAGERMAN, 2008). As intervenções incluem: aconselhamento genético para toda a família; intervenções comportamentais e médicas diretas para crianças com deficiências de desenvolvimento; novas 47 opções de reprodução para mulheres que estão com o risco de desenvolver POF (ou POI); tratamento para adultos com PM que apresentam sinais de FXTAS; e tratamento precoce de depressão ou ansiedade (HAGERMAN, 2008; HAGERMAN et al., 2009). Testes de triagem em recém nascidos facilitam a intervenção precoce em crianças e o aconselhamento genético da família, além da identificação precoce e tratamento de outros membros da família (HAGERMAN; HAGERMAN, 2008). No aconselhamento genético, o profissional responsável revisará os padrões genéticos da SXF permitindo a identificação de indivíduos com risco de portarem alelos PM e FM. (MCCONKIE-ROSELL et al., 1995). O profissional também pode aconselhar sobre opções reprodutivas para futuras gerações, incluindo doação de óvulos, diagnóstico pré-natal, adoção, e diagnóstico genético pré-implantação (GANE; CRONISTER in HAGERMAN; HAGERMAN, 2002; CEDERBAUM, 2007; McCONKIE-ROSELL t al., 2007). Existem vários medicamentos que ajudam no tratamento de vários sintomas da SXF, principalmente em crianças (CHONCHAIYA et al., 2009). O uso de tratamentos direcionados é uma área interessante de investigação que promete reverter a epilepsia, problemas de comportamento e deficiências cognitivas (CHONCHAIYA et al., 2009). Bear et al. (2005), utilizando modelos animais, demonstraram que a inibição do receptor metabotrófico glutamato 5 (mGlu5) com antagonistas, normaliza parcialmente a depressão a longo prazo. 2.7 Justificativa e relevância do projeto Conforme o exposto, o teste de diagnóstico da SXF deveria ser aplicado em um grande grupo de indivíduos e a descoberta precoce da síndrome é muito importante para o aconselhamento genético e eventuais intervenções de tratamento. Assim, faz-se necessária a existência de procedimentos de diagnóstico mais rápido e de baixo custo. Dentre as técnicas alternativas ao Southern blot existentes (HADDAD et al., 1996; HAMDAM et al., 1997; PANAGAPOULOS et al., 1999; SALUTO et al., 2005; ROSALES-REYNOSO et al., 2007; DAHL et al., 2007), a técnica desenvolvida por Tassone et al. (2008), abrange os dois gêneros (masculino e feminino) e as três formas alélicas possíveis (NL, PM, FM). Segundo os autores, a técnica é uma boa alternativa de triagem da SXF (TASSONE et al., 2008). Apesar da ausência de informações metodológicas importantes para reproduzir a técnica de Tassone et al. (2008), o presente trabalho enfrentou esse desafio, buscando padronizar a referida técnica e comparar os resultados obtidos com os de Southern blot (padrão-ouro). Também investigou-se a aplicação da referida técnica utilizando DNA de material biológico 48 extraído de outras fontes como células da mucosa oral e a estimativa de custo e do tempo de execução do método no mercado nacional. Se confirmada a eficiência desse novo método da PCR como alternativa ao Southern blot, e se confirmando seu baixo custo no mercado nacional, poderá ser sugerida a futura utilização deste para triagem da SXF em indivíduos com suspeita clínica, como alunos que freqüentam escolas especiais, mulheres com falha prematura de ovário e homens com diagnóstico diferencial de outras ataxias, como FXTAS ou sintomas clínicos de portador de pré-mutação do gene FMR1. 49 3 OBJETIVOS O presente trabalho tem os seguintes objetivos: • Reproduzir a técnica proposta por Tassone et al. (2008) para triagem da Síndrome de X Frágil, realizando a padronização necessária para isso, em vista da não descrição pelos autores de detalhes metodológicos importantes. • Procurar comprovar em pacientes brasileiros, a exatidão (acurácia), sensibilidade e especificidade da técnica adaptada de Tassone et al. (2008), com o método padrão-ouro de diagnóstico da SXF, o Southern blot. 3.1 Objetivos secundários • Avaliar a aplicação da técnica adaptada de Tassone et al. (2008) utilizando DNA extraído de diferentes materiais biológicos. • Estimar o custo do método no mercado nacional e o número de horas necessário para a sua execução. 50 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Casuística A casuística consistiu de 78 amostras de DNA. Dessas, 62 amostras foram cedidas por colaboração da Profa. Dra. Débora Aparecida Rodrigueiro da Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde (FCMS/PUC-SP) juntamente com a Profa. Dra. Ângela Maria Vianna-Morgante do Instituto de Biociências de São Paulo - USP. Outras 16 amostras foram coletadas de pacientes encaminhados pelo Prof. Dr. Valter Curi Rodrigues, pediatra com larga experiência em casos de dismorfologias clínicas do Centro Universitário de Araraquara (UNIARA). Após obter o consentimento livre e esclarecido dos voluntários, foram coletadas gotas de sangue periférico em um cartão FTA (Whatman), onde o DNA fica aderido após purificação com o reagente FTA (Whatman). Esse material biológico foi utilizado para realização da técnica adaptada de Tassone et al. (2008). Além disso, cerca de 15 μg de DNA de cada paciente, obtidos de célula da mucosa oral, foram encaminhados para um laboratório particular para realização do Southern Blot. Esse estudo contou com a aprovação do Comitê de Ética em Seres Humanos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Campus de Araraquara (CEP/FCFAr no 24/2008). Visando ampliar as possibilidades de obtenção de DNA para realização do método de triagem da SXF, diferentes materiais biológicos foram utilizados. Isso se justifica pela probabilidade de pacientes se recusarem a doar sangue para realização do teste, já que há a utilização de agulhas. Na doação de células da mucosa oral, por exemplo, tal inconveniente não existe. 4.2 Obtenção do DNA 4.2.1 Cartão FTA (Whatman) Essa metodologia buscou acompanhar o protocolo descrito por Tassone et al. (2008). Foram coletadas no cartão FTA (Whatman) gotas de sangue periférico de cada paciente por meio da perfuração do dedo, utilizando uma lanceta descartável. Os cartões foram mantidos à temperatura ambiente por 1 hora. Posteriormente, o sangue foi purificado utilizando-se o Reagente de purificação FTA (Whatman). Segue-se o protocolo de purificação para cada paciente recomendado pelo fabricante: 51 • Um círculo de 1.5 mm foi removido do cartão, com o auxílio do Harris Uni-Core cutting mat – 1.5 mm (Whatman). O círculo foi transferido para um microtubo de 0.2 mL. • Foi adicionado 200 μL do reagente de purificação e, após 5 min à temperatura ambiente o reagente foi removido com micropipeta. Este passo foi repetido mais duas vezes. • Adicionou-se 200 μL de tampão T.E (10mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA – pH 8,0) e incubou-se por 5 min, removendo o tampão em seguida com micropipeta. Repetiu-se esse passo. • Manteve-se o círculo de papel FTA em estufa à 37°C por 1 hora para secagem. Dessa maneira o material pôde ser armazenado em temperatura ambiente até o momento da realização da PCR. 4.2.2 Sangue coletado pelo sistema à vácuo e DNA extraído com solventes orgânicos O sangue foi recolhido em tubos próprios (Vacuette) que continham EDTA como anticoagulante. O sangue foi transferido para tubos falcon de 15 mL, onde foi “lavado” várias vezes (até que o pellet de células ficasse branco) com solução de lise (10 mM Tris –HCl, 5mM MgCl2 , 10mM NaCl – pH 7,5) para remoção das hemácias. Em seguida foi realizada a extração do DNA. O pellet de células foi transferido para um microtubo de 1,5 mL. Foi adicionado 500 μL de solução tampão (1M Tris-HCl, 0,5M EDTA, SDS 0,5%) e 2,5 μL de proteinase K (USB). Os microtubos foram incubados à 56ºC por 2 horas. Após, foram adicionados 600 μL da mistura Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico (25:24:1), agitou-se manualmente por 2 minutos e centrifugou-se por 3 min a 14.000 rpm. Transferiu-se o sobrenadante para um novo microtubo e repetiu-se esse passo. Ao sobrenadante em um novo microtubo adicionou-se 600 μL de clorofórmio. Agitou-se manualmente por 2 minutos e centrifuga-se por 3 min a 14.000 rpm. Estimou-se o volume do sobrenadante coletado, que continha o DNA, e precipitou-se o mesmo com acetato de sódio (3M, pH 5,2; sendo 1/10 do volume do sobrenadante) e o dobro do volume de etanol absoluto. Os microtubos foram mantidos à –20ºC por 12 horas. Em seguida foi realizada uma lavagem com 400 μL de etanol 70%. O etanol foi removido e o DNA mantido à temperatura ambiente para secagem. Foi adicionado 100 μL de água livre de DNAses e RNAses (Ambion). O DNA foi mantido à temperatura ambiente por 2 horas para 52 que ressuspendesse, quando, então, foi realizada a leitura da sua concentração e pureza, em um espectrofotômetro (Biophotometer, Eppendorf). 4.2.3 Células da mucosa oral e DNA extraído com solventes orgânicos Foram coletadas células da mucosa oral por meio de bochecho com solução de glicose a 3%. O bochecho foi centrifugado a 4.000 rpm por 10 min. Após essa centrifugação o sobrenadante foi descartado. Adicionou-se 500 μL de solução tampão (1M Tris-HCl, 0,5M EDTA, SDS 0,5%) e 2,5 μL de proteinase K (USB). Após 2 horas a 56 ºC, realizou-se a extração do DNA com Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico (25:24:1), sua precipitação com acetato de sódio e etanol, secagem e leitura da concentração do DNA, conforme citado no subitem anterior. 4.3 PCR para diagnóstico de alelos NL, PM e FM (1a PCR) Para amplificar as repetições CGG referentes a alelos normal, pré-mutado e mutado do gene FMR1 foram utilizados os primers “c” e “f” descritos por Fu et al., (1991) e utilizados por Saluto et