Natália Prearo Moço Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Patologia Orientadora: Profa. Dra. Márcia Guimarães da Silva Botucatu 2015 Expressão gênica e proteica de receptores Toll-like em células do sangue periférico materno de gestações normais e complicadas por prematuridade. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Natália Prearo Moço Expressão gênica e proteica de receptores Toll-like em células do sangue periférico materno de gestações normais e complicadas por prematuridade. Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Patologia. Orientadora: Profa. Dra. Márcia Guimarães da Silva Botucatu 2015 Dedico este trabalho aos meus pais, Washington e Terezinha. Foram muitas as pessoas que passaram pela minha vida ao longo desses quatro anos e que, de algum modo, tiveram participação nesse trabalho de Doutorado. Portanto, a missão de deixar aqui meus agradecimentos é uma tarefa árdua. Primeiramente agradeço a Deus pelo dom da Vida e por guiar meus passos e cuidar de mim em todos os momentos. Obrigada por ser minha força, minha luz e meu abrigo. Agradeço de modo especial ao casal mais lindo desse mundo - meus pais Washington e Terezinha - pelo apoio incondicional, pela confiança e pelo amor infinito. Não estaria aqui se não fosse por vocês. Agradeço às minhas irmãs Ana Carolina e Bruna, minhas amigas de mais longa data. Cada uma tem de mim um pedaço do coração. Ana, obrigada também por ter me dado um cunhado tão incrível como o Ruberci e por vocês dois serem um ponto de apoio sempre que preciso. Agradeço aos meus sobrinhos João Pedro e João Victor por terem me ensinado ao longo dos anos a amar de uma maneira imensa e indescritível. Depois que vocês nasceram tive certeza de que meu coração não mora mais em mim. Obrigada pela amizade, pelas alegrias e pelo carinho. E não posso deixar de falar do nosso pequeno Francisco que vem chegando e já é tão amado pela tia coruja e por todos dessa família. Agradeço ao Carlos Guilherme, que entrou na minha vida ainda no final do Mestrado e acompanhou tão de perto esses quatro anos de experimentos, relatórios, artigos e muito estresse do Doutorado. O seu amor e a sua companhia tornaram tudo mais fácil. Obrigada por tudo. Agradeço ao melhor trio de amigas que alguém poderia ter: Elisângela, Joice e Juliana. São tantos anos de amizade e companheirismo que já não imagino meus dias sem vocês. Agradeço ao eterno quinteto dos distantes anos de graduação formado pelos amigos especiais Jumbo, K-vux, Dizcobre e Urutau. Amo vocês. Para sempre. E não posso deixar de agradecer também a amizade de pessoas tão queridas que encontrei nos anos de Botucatu como E-coli, Kimera, Chandelle, Hã, K-lúnia, Mukeka, Kuíka, Caracas e tantos outros! Agradeço a todos do Laboratório de Imunopatologia da Relação Materno-Fetal pela convivência nesses últimos sete anos! Obrigada pelo conhecimento compartilhado, pelo amadurecimento profissional e pela ajuda em tantos momentos importantes dessa caminhada. Agradeço de maneira especial aos queridos companheiros de vida e de trabalho Ana Carolina, Gabriel e Laura. Cada um de vocês sabe a importância que têm dentro e fora dessas paredes laboratoriais. Jamais esquecerei as conversas, o companheirismo, as risadas e o apoio de cada um de vocês. Obrigada por tudo. Agradeço também à professora Dra. Luciane Alarcão Dias-Melicio e suas alunas Amanda, Juliana e Luciana, por terem me acolhido em seu laboratório e por terem ajudado em tantos experimentos. Obrigada pelas conversas e pela companhia de sempre. Agradeço de modo especial à minha orientadora Márcia Guimarães da Silva. Suas aulas ainda na graduação foram o início da minha vontade de ser o que sou hoje. Obrigada pelo exemplo de determinação, dedicação e imenso amor pelo que faz. Obrigada por me fazer amar a pesquisa científica e por acreditar em mim durante todos esses anos. Agradeço a Secretaria da Saúde do Município de Botucatu por ter permitido a realização desse trabalho. Obrigada pela confiança. Agradeço também as enfermeiras das Unidades Básicas de Saúde onde parte das coletas foi realizada. A ajuda de vocês foi de extrema importância para a conclusão desse trabalho. Agradeço aos docentes, residentes e funcionários do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu e aos residentes e enfermeiras do Departamento Ginecologia e Obstetrícia pela colaboração com o nosso intuito e pela ajuda durante as coletas. Agradeço a todas as gestantes que entenderam o valor desse trabalho e aceitaram participar dele com muita boa vontade. Vocês são a razão de nossos esforços. Finalmente, agradeço a FAPESP pelo Auxílio de Pesquisa e pela bolsa de Doutorado que tornaram esse trabalho possível. Introdução: A prematuridade é a principal causa de mortalidade neonatal e os riscos de complicações decorrentes são inversamente proporcionais à idade gestacional na qual o parto ocorre. Diversos estudos na literatura demonstram o papel da resposta imune inata e dos receptores Toll-like (TLRs) durante a gestação normal e na presença de complicações gestacionais. A expressão de TLRs vem sendo avaliada principalmente nos tecidos da interface materno-fetal e os resultados de tais estudos são conflitantes. A investigação da expressão de TLRs em tecidos gestacionais é de grande importância para o entendimento da participação da imunidade inata em gestações normais e com desfechos gestacionais adversos, porém tais tecidos permitem análise somente após a resolução da gestação. Nesse contexto, uma possível fonte de estudo para análise de TLRs no decorrer da gestação em curso são as células do sangue periférico materno, uma vez são facilmente obtidas por punção venosa, além de possuírem papel fundamental na reposta imune inata e expressarem diversos tipos de TLRs. Objetivo: Traçar o perfil de expressão gênica e proteica de receptores Toll-like 1, -2, -4 e -6 em células mononucleares (PBMCs) e em neutrófilos do sangue periférico materno ao longo da gestação normal e na prematuridade. Materias e métodos: Foram incluídas no estudo 119 gestantes normais, as quais foram subdivididas em trimestres de acordo com sua idade gestacional. Além disso, foram avaliadas 20 gestantes em trabalho de parto pré-termo e 18 gestantes de termo. A análise de expressão gênica foi realizada por PCR em tempo real e a avaliação da expressão proteica por citometria de fluxo. Para a análise dos dados foram empregados os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney através do software SigmaStat 3.1. Resultados: Em relação às PBMCs, não foram observadas diferenças significativas nas expressões gênica e proteica de TLR-1, TLR-2, TLR-4 e TLR-6 entre os trimestres gestacionais. O mesmo foi observado comparando-se PBMCs de gestantes pré-termo e de termo. Em relação aos neutrófilos, as expressões gênica e proteica de TLR-1, TLR-2, TLR-4 e TLR-6 não se alteraram ao longo da gestação normal. Comparando-se neutrófilos de gestações pré-termo e de termo, a expressão gênica de TLR- 1(p<0,001), TLR-2 (p=0,004) e TLR-4 (p=0,004) foi significativamente superior no grupo pré-termo. Entretanto, a expressão proteica desses receptores não diferiu entre os grupos. Em relação ao TLR-6, não foram observadas diferenças significativas nas expressões gênica e proteica entre neutrófilos de gestações pré-termo e de termo. Discussão: Os resultados demonstram que as expressões gênica e proteica de TLRs em PBMCs e neutrófilos maternos não são temporalmente reguladas ao longo da gestação normal. Além disso, os dados sugerem que a análise da expressão de TLRs em células do sangue periférico materno não é um parâmetro útil como biomarcador molecular para risco de parto pré-termo. Introduction: Prematurity is the leading cause of neonatal mortality and serious neonatal morbidity worldwide and the risk is inversely proportional to gestational age at birth. Several studies demonstrate the role of innate immune response and Toll-like receptors (TLRs) in normal and complicated pregnancies, however most studies have focused on the tissues of the maternal-fetal interface. Research of the expression of TLRs in gestational tissues is of great importance for understanding the involvement of innate immunity in normal pregnancies and adverse pregnancy outcomes, but the analysis of these tissues allows for results only after the complete resolution of gestation. In this scenario, a potential biological sample of interest for analysis of TLRs in the ongoing gestation are maternal peripheral blood cells, since they play a crucial role in the immune system and express high levels of many of the TLRs. Main: Evaluate the profile of gene expression of TLR-1, -2, -4 and -6 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and polymorphonuclear cells (PMNs) and compare these expressions between preterm and term pregnancies. Materials and methods: 119 normal pregnant women were included in the study, subdivided into three groups according to the gestational trimester. In addition, 20 pregnant women in preterm labor and 18 pregnant women at term were evaluated. Gene expression analysis was performed by real-time PCR and protein expression evaluation by flow cytometry. Statistical analyses were performed using the nonparametric Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests by SigmaStat 3.1 software. Results: Regarding PBMCs, there were no significant differences in gene and protein expressions of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 among the trimesters. The same was observed when comparing PBMCs of preterm and term pregnancies. In relation to neutrophils, gene and protein expressions of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 remained unchanged throughout normal gestation. Comparing neutrophils of pre-term and term pregnancies, the gene expression of TLR-1 (p < 0.001), TLR-2 (p = 0.004) and TLR-4 (p = 0.004) was significantly higher in the preterm group. However, the protein expression of these receptors did not differ between the groups. Regarding TLR-6, there were no significant differences in gene and protein expressions between neutrophils of preterm and term pregnancies. Discussion: Our results suggest that TLRs expression in maternal PBMCs and PMNs is not temporally regulated over the course of normal pregnancy. Moreover, the evaluation of gene and protein expression of TLRs in neutrophils and PBMCs from peripheral maternal blood is not useful as molecular biomarkers of preterm labor. AP-1: Proteína ativadora 1 ASC: Proteína associada a apoptose contendo domínio CARD CARD: Domínio de recrutamento de caspase (Caspase recruitment domain) DAMP: Padrão molecular associado ao dano (Damage-associated molecular pattern) ERO: Espécie reativa do oxigênio HMGB1: High-mobility group protein B1 HSP: Proteína de choque térmico (Heat shock protein) iE-DAP: Ácido gama-D-glutamil meso-diaminopilémico IFN: Interferon IRAK: Quinase associada ao receptor de IL-1 (IL-1 receptor-associated kinase) IRF3: Fator regulador de Interferon 3 (Interferon regulatory factor 3) IRF7: Fator regulador de Interferon 7 (interferon regulatory factor 7) LBP: Proteína ligante de LPS (LPS-binding protein) LPS: Lipopolissacarídeo LRR: Repetições ricas em leucina (Leucine-rich repeats) MAPK: Proteína quinases associadas à mitógeno (Mitogen-activated protein kinases) MDA5: Gene de melanoma associado à diferenciação 5 MDP: Muramil dipeptídeo MMP: Matrix metaloproteinase MyD88: Myeloid differentiation primary response 88 NET: Neutrophil extracellular trap NF-kB: Fator nuclear kB NLR: Receptor semelhante a NOD (Nod-like receptor) NOD: Nucleotide-binding oligomerization domain OMS: Organização Mundial da Saúde PAMP: Padrões moleculares associados a patógenos (Pathogen-associated molecular pattern) PBMCs: Células mononucleares do sangue periférico (Peripheral blood mononuclear cells) PCR: Reação em cadeia da polimerase PDLIM2: PDZ and LIM domain protein 2 PG: Peptideoglicano PMNs: Células polimorfonucleares (Polymorphonuclear cells) PRR: Receptor de reconhecimento de padrão (Pattern recognition receptor) RIG-I: Gene indutível por ácido retinóico I RLR: Receptor semelhante a RIG (RIG-like receptor) RP105: Radioprotective 105 RPM-PT: Rotura prematura de membranas pré-termo S100A8: S100 calcium binding protein A8 SHP: Small heterodimer partner ST2I: Single immunoglobulin IL-1R-related molecule TAG: TRAM adaptor with GOLD domain TANK: Proteína ligadora de TRAF (TRAF family member-associated NF-kappa-B) TIR: Domínio receptor Toll/IL-1 (Toll/Interleukin-1 receptor domain) TLR: Receptor Toll-like (Toll-like receptor) TPP: Trabalho de parto pré-termo com bolsa íntegra TRAF-6 Fator 6 associado ao TNF-R (TNF receptor-associated factor 6) TRAM: Molécula adaptadora associada ao TRIF (TRIF-related adaptor molecule) TRIF: Proteína adaptadora contendo o domínio TIR (TIR-domain-contain adapter-inducing interferon β) SUMÁRIO Capítulo I Revisão da literatura................................................................................................................................. 2 Referências bibliográficas......................................................................................................................... 25 Capítulo II “Evaluation of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 gene and protein expression in maternal PBMCs and PMNs during normal pregnancy and preterm labor”………………………………….......................................... 38 Abstract………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 39 Introduction……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 40 Material and Methods.............................................................................................................................. 42 Results..................................................................................................................................................... 47 Discussion................................................................................................................................................ 61 References................................................................................................................................................ 65 Conclusão................................................................................................................................................ 72 Anexos..................................................................................................................................................... 73 2 Imunidade inata e receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) A resposta imune inata constitui mecanismo de defesa primordial contra a invasão de patógenos, contribuindo na identificação e na erradicação de agentes infecciosos. A imunidade inata tem como uma das principais funções responder rapidamente aos microrganismos, prevenindo, controlando ou eliminando infecções causadas por diversos patógenos, além de reconhecer produtos de células danificadas e mortas, atuando na eliminação das mesmas e de estimular os mecanismos de imunidade adaptativa, podendo influenciar as respostas de natureza mais específicas1. A ação do sistema imune inato na detecção de microrganismos invasores baseia-se no reconhecimento de estruturas moleculares que são características de patógenos microbianos, as quais são denominadas padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) 1. Diferentes classes de microrganismos apresentam diferentes PAMPs em sua estrutura. Dentre esses PAMPs destacam-se ácidos nucleicos como RNA de fita dupla e de fita simples encontrados em vírus, proteínas como pilina e flagelina encontradas em bactérias, lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias Gram-negativas e ácido lipoteicóico de bactérias Gram-positivas, além de carboidratos como mananas e glucanas encontrados em fungos e bactérias1,2. Adicionalmente ao reconhecimento microbiano, a imunidade inata atua no reconhecimento de moléculas endógenas que são liberadas por células danificadas ou mortas, as quais são denominadas de padrões moleculares associados ao dano (DAMPs)1,2. A presença de DAMPs pode ser resultante de processos infecciosos, porém eles são produzidos também em situações de lesões celulares assépticas que podem ser causadas por toxinas químicas, queimaduras, traumas mecânicos e redução do suprimento de oxigênio3. O reconhecimento de PAMPs e DAMPs pelo sistema inume inato ocorre através de receptores especiais denominados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs)1,2. Esses receptores são expressos por diversos tipos celulares e encontram-se na membrana plasmática, na membranas dos endossomos e no citoplasma dessas células1,2. A localização privilegiada dos PRRs permite que o sistema imune inato reconheça microrganismos presentes tanto fora quanto no interior de diferentes compartimentos celulares. Diferentes PRRs interagem com diferentes PAMPs, 3 ativando vias de sinalização específicas2. Dentre as principais funções dos PRRs destacam-se opsonização, ativação do sistema complemento, fagocitose, indução de apoptose e ativação de vias de sinalização de citocinas pró-inflamatórias2. Dentre os PRRs citosólicos, ou seja, receptores que detectam PAMPs ou DAMPs no citoplasma das células, merecem destaque os receptores semelhantes ao NOD (NLRs) e os receptores semelhantes a RIG (RLRs)1. A família NLR é uma classe de receptores intracelulares composta por mais de 20 diferentes proteínas citosólicas. Essas proteínas são capazes de reconhecer PAMPs e DAMPs, desencadeando o recrutamento de outras proteínas, o que culmina na formação de complexos de sinalização intracelulares relacionados com a inflamação1. Os membros da família NLR são caracterizados pela presença de pelo menos três domínios com estruturas e funções diferentes. O primeiro é o domínio rico em repetições de leucina (LRR), o qual é responsável pelo reconhecimento do ligante em si, o segundo é um domínio NACHT, que permite a formação de oligômeros entre os NLRs e o terceiro é um domínio efetor, geralmente um domínio de recrutamento de caspase (CARD) ou de pirina, responsável pelo recrutamento de proteínas acessórias4. Os primeiros NLRs associados a reconhecimento bacteriano foram as proteínas NOD-1 (NLRC1) e NOD-2 (NLRC2)5. NOD-1 e NOD-2 reconhecem peptídeos derivados da degradação de peptideoglicanos (PG), a qual ocorre durante o crescimento e a destruição de bactérias. Os PGs são o principal componente da parede celular de bactérias Gram-positivas, já nas Gram-negativas eles estão presentes como fina camada no espaço periplasmático6,7. Especificamente, NOD-2 é capaz de detectar e se ligar de maneira direta ao muramil dipeptídeo (MDP) dos PGs presentes tanto na parede celular de bactérias Gram-positivas quanto negativas. Diferentemente, a ligação do NOD-1 aos PGs é dependente do ácido gama-D-glutamil meso-diaminopilémico (iE-DAP), o qual está presente na parede celular da maioria das bactérias Gram-negativas e em apenas algumas bactérias Gram-positivas. O reconhecimento de PGs por NOD-1 e NOD-2 culmina na ativação da via de 4 sinalização intracelular que ativa o fator de transcrição NF-κB, o que resulta na produção de diversas citocinas inflamatórias8-10. Alguns membros da família NLR, conhecidos como subfamília NLRP, são capazes de responder a PAMPS e DAMPs citoplasmáticos através da formação de complexos de sinalização intracelular multiproteicos denominados inflamassomos1. Os inflamassomos atuam na ativação de enzimas da família cisteína-aspartato proteases (caspases) durante a regulação da imunidade em condições fisiológicas, patogênicas e na presença de sinais de perigo11,12. A estrutura típica de um inflamassomo é formada por um NLRP, uma proteína adaptadora denominada ASC (proteína associada a apoptose contendo domínio CARD) e a pró-caspase13. Uma vez montada, essa plataforma proteica transitória permite a ocorrência de uma sequência de eventos enzimáticos que resulta na ativação da caspase-1 e, consequentemente, na produção de IL-1β14,15 e IL-18 ativas16. Dentre os NLRPs capazes de formar inflamassomos, o NRLP3 (NALP3 ou criopirina) tem sido o mais estudado e caracterizado (Figura 1). Figura 1. Formação do inflamassomo NLRP3: Na ausência de patógenos, o inflamassomo NLRP3 é auto-reprimido devido à interação entre os domínios NACHT e LRR. Essa auto-repressão é removida na presença de PAMPs ou DAMPs, o que resulta na exposição do domínio NACHT. Após a exposição, o NLRP3 se oligomeriza e recruta a proteína adaptadora ASC (também conhecida como PYCARD) e a pró-caspase 1. Após o recrutamento, ocorre a ativação da caspase-1 e, consequentemente, a secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β e IL-18. (Adaptado de Tschopp J, Schroder K. NLRP3 inflammasome activation: The convergence of multiple signalling pathways on ROS production? Nat Rev Immunol 2010 Mar; 10(3): 210-5). 5 O inflamassomo NLRP3 responde a diversos PAMPs, dentre eles moléculas bacterianas como flagelina, dipeptídeo muramil, LPS e toxinas formadoras de poros1. Além disso, esse complexo responde a uma diversidade de sinais endógenos (DAMPs e espécies reativas do oxigênio) e ambientais, como irradiação ultravioleta, sílica, asbestos e nanopartículas11,17,18. A resposta imune desencadeada pela ativação dos inflamassomos tem sido associada a um amplo espectro de processos fisiológicos e patológicos, dentre eles a defesa contra patógenos invasores, manutenção da homeostasia intestinal e desenvolvimento de desordens de origem inflamatória17. A segunda classe que mais se destaca dentre os PRRs citosólicos são os RLRs. Esses PRRs reconhecem ácidos nucleicos virais, incluindo RNA de fita simples e de fita dupla, e induzem a produção de interferons antivirais do tipo I1. Os membros mais bem estudados dessa família são o RIG-I (gene indutível por ácido retinóico I) e o MDA5 (gene de melanoma associado à diferenciação 5). Ambos os receptores possuem um domínio RNA-helicase (que se liga ao RNA viral) e um domínio CARD na região N-terminal2. A ligação dos RLRs ao RNA viral desencadeia uma cascata de eventos de sinalização intracelular que resulta na ativação de fatores de transcrição IRF3 (fator regulador de interferon 3) e IRF7 (fator regulador de interferon 7), os quais induzem a produção de interferons do tipo I. Adicionalmente, a sinalização por RLRs pode também estar envolvida na ativação da via intracelular do fator de transcrição NF-κB, resultando na produção de citocinas inflamatórias1,2 (Figura 2). 6 Figura 2. Atuação dos receptores RIG-I e MDA5: O RLRs atuam como sensores citosólicos para RNA viral, podendo desencadear respostas celulares anti-virais e inflamatórias. O RIG-I reconhece RNA de fita simples, enquanto o MDA5 reconhece RNA de fita dupla. Enzimas helicases interagem com os RLRs, desencadeando o recrutamento de moléculas efetoras como IPS-1 (peroxisomal- associated interferon promoter stimulator), TRAF-3 (TNF receptor associated factor 3) e/ou STING (stimulator of interferon genes). O recrutamento dessas moléculas leva à ativação de quinases (KKα, IKKβ, TBK1 e IKKi), as quais ativam os fatores de transcrição NF-κB e IRF-3/7. (Adaptado de Furr SR, Marriott I. Viral CNS infections: role of glial pattern recognition receptors in neuroinflammation. Front Microbiol 2012; 3: 201). Em relação aos PRRs acoplados à membrana celular, a classe mais bem caracterizada é a família de receptores Toll-like (TLR), os quais merecem destaque devido a seu papel crucial contra a invasão microbiana, tendo em vista sua capacidade de reconhecer amplo espectro de padrões moleculares19,20. A descoberta dos TLRs, em meados da década de 1990, alterou o conceito de que a imunidade inata era responsável apenas pelo reconhecimento inespecífico de microrganismos2,21. O primeiro membro da família TLR a ser descoberto foi a proteína Toll, inicialmente identificada como produto gênico essencial para o desenvolvimento embrionário de drosófilas, sendo responsável pelo estabelecimento do eixo dorsoventral do inseto, porém, posteriormente descobriu-se que tal 7 proteína desempenha papel essencial na resposta anti-fúngica das moscas1,22. Foram descritas na literatura dez isoformas de TLRs em tecidos humanos, as quais são denominadas TLR-1 a TLR-1019. Os genes responsáveis pela expressão de TLRs estão dispersos pelo genoma humano, sendo que os genes para TLR-1 e TLR-6 são encontrados no cromossomo 4p14, o gene para TLR-2 no cromossomo 4q31.3-q35 e o gene para TLR-4 no cromossomo 9q32-q3323. Especificamente, os TLRs são glicoproteínas do tipo I integrais de membrana, que possuem uma estrutura básica constituída por três domínios: um ectodomínio que contém repetições ricas em leucina (LRR) flanqueadas por motivos característicos ricos em cisteína; um domínio intracitoplasmático (endodomínio) denominado domínio receptor Toll/IL-1 (TIR), o qual compartilha uma região conservada de cerca de 200 aminoácidos com o receptor de IL-1 e de IL-18 e um domínio transmembrana muito curto que conecta o ectodomínio ao endodomínio1,24. Enquanto o ectodomínio é responsável pelo reconhecimento dos PAMPs específicos, o domínio intracitoplasmático permite o recrutamento de moléculas adaptadoras necessárias para o desencadeamento da sinalização intracelular20. Os receptores Toll-like são classicamente divididos em dois grupos. O primeiro grupo, composto por receptores expressos na superfície das células, inclui TLR-1, TLR-2, TLR-4, TLR-5, TLR-6 e TLR-11. Esse grupo é responsável pelo reconhecimento da maior parte dos patógenos, visto que são capazes de reconhecer componentes das membranas dos microrganismos, como lipídios, proteínas e lipoproteínas19. O segundo grupo, que inclui receptores expressos exclusivamente em vesículas intracelulares como endossomos e lisossomos, é composto por TLR-3, TLR-7 e TLR-9, os quais reconhecem apenas ácidos nucleicos de origem microbiana19,24. O reconhecimento dos PAMPs pelos TLRs ativa diversas vias de sinalização intracelulares, as quais culminam na ativação de fatores de transcrição responsáveis pela expressão de genes envolvidos nas respostas inflamatórias e anti-virais1,20,23. Todas essas vias são iniciadas pela interação do TLR com seu ligante específico na superfície da célula ou nos compartimentos celulares, o que leva a dimerização dos TLRs. Essa dimerização resulta da aproximação dos domínios TIR de um TLR 8 com o domínio TIR do outro. Em seguida são recrutadas moléculas adaptadoras que participam do recrutamento de outras proteínas e da ativação de diversas quinases1. Dentre os fatores de transcrição ativados pelas vias de sinalização dos TLRs destacam-se o NF-κB, a proteína ativadora 1 (AP-1), o IRF3 e o IRF71. A ativação de NF-κB e AP-1 resulta na produção de citocinas pró- inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão endotelial, enquanto que a ativação de IRF3 e IRF7 resulta na produção de interferons do tipo I (IFN-α e IFN-β), os quais atuam nas respostas anti- virais1,2. A via de sinalização do NF-κB é uma das mais bem caracterizadas vias de sinalização dos TLRs (Figura 3). Nessa via, após o reconhecimento do PAMP pelo TLR na superfície celular, a primeira molécula recrutada é a proteína MyD88, a qual possui um domínio TIR que se liga ao domínio TIR do TLR. Uma segunda proteína a ser recrutada dentro do complexo de sinalização é a quinase associada ao receptor de IL-1 (IRAK). A IRAK contém um domínio de morte que medeia as interações com o domínio de morte da MyD88. Quando ocorre o recrutamento da IRAK, ela sofre autofosforilação, dissociando-se da MyD88 e ativando o fator 6 associado ao TNF-R (TRAF-6). O TRAF-6 ativa a cascata de quinase IkB, levando à ativação do NF-κB. Os genes que são expressos em resposta à ativação do NF-κB codificam proteínas importantes para a resposta imune inata, como citocinas e moléculas de adesão endotelial1. Em alguns tipos celulares os TLRs acoplam-se a outras vias de sinalização intracelular, levando à ativação do fator de transcrição AP-1, porém, os mecanismos envolvidos nessas vias ainda são pouco conhecidos25. A ativação do fator de transcrição AP-1, diferentemente da via do NF- κB, está envolvida com a transdução de sinais intracelulares através de proteínas quinases associadas à mitógeno (MAPKs). Modelo proposto por Chi et al.25 sugere que as MAPKs desempenham papel tanto na regulação de citocinas pró quanto antiinflamatórias. Na fase inicial da ativação de macrófagos há rápida síntese de citocinas pró-inflamatórias, parcialmente mediadas pelas MAPKs. Em um segundo momento, a atividade das MAPKs é reduzida pela ação de fosfatases, o que leva ao aumento gradual da produção de citocinas antiinflamatórias, como a IL-1025. 9 Figura 3. Visão geral da via de sinalização dos TLRs: A via de sinalização intracelular pode ser desencadeada por vários PAMPs. A ligação do PAMP ao TLR na superfície da célula desencadeia uma via de sinalização intracelular, através da interação de diversas moléculas adaptadoras, culminando na ativação de NF-κB, o que resulta na transcrição de diversos genes associados à resposta inflamatória. (Adaptado de Abbas AK, Lichtman AH. Imunologia celular e molecular. 5ª Edição. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005). Adicionalmente, os TLRs participam da opsonização de microrganismos e da otimização da defesa do hospedeiro contra patógenos invasores através da regulação da liberação de radicais peróxido e óxido nítrico26,27. Estudos recentes demonstram também que os TLRs são capazes de induzir apoptose através da produção de diversos fatores pró-apoptóticos, como caspase 8 e proteína kinase R28. Após a ativação dos TLRs e o estabelecimento da resposta inflamatória, é necessário que a sinalização seja negativamente regulada para que a homeostasia seja retomada, uma vez que a ativação prolongada pode gerar efeitos deletérios ao hospedeiro20. A regulação negativa da sinalização de TLRs é obtida por diversos mecanismos, sendo que os principais podem ser categorizados em mecanismos de dissociação dos complexos adaptadores e mecanismos de degradação de proteínas sinalizadoras29. Em relação aos mecanismos de dissociação dos complexos adaptadores, proteínas adaptadoras da via de sinalização de TLRs possuem formas variantes que atuam como antagonistas 10 para evitar a associação entre as formas intactas de adaptadores, impedindo que a cascata de sinalização tenha continuidade20,29. A proteína TAG (TRAM adaptor with GOLD domain) é uma forma variante de TRAM (molécula adaptadora associada ao TRIF) que compete com a forma original para ligação com a molécula adaptadora TRIF (proteína adaptadora contendo o domínio TIR), inibindo a via de sinalização dependente de TRIF30. Outro exemplo de dissociação é a proteína IRF4 que compete com a proteína IRF5, a qual interage diretamente com MyD88 durante a sinalização intracelular31,32. Algumas modificações pós-transcricionais nas proteínas adaptadoras, como fosforilação e ubiquitinação, podem atuar como mecanismos reguladores da interação entre moléculas adaptadoras. A molécula denominada TANK, identificada como uma proteína ligadora de TRAF parece estar envolvida na inibição da ubiquitinação do fator TRAF-629. Outro fator recentemente descrito como regulador da sinalização de TLRs é o receptor SHP (small heterodimer partner), o qual também atua inibindo a ubiquitinação do fator TRAF-633. A proteína SHP-1 é uma enzima com atividade de fosfatase que inibe a atividade das proteínas adaptadoras IRAK1 e IRAK2, culminando na redução da produção de citocinas pró-inflamatórias e no amento da produção de IFNs do tipo I. Algumas proteínas associadas à membrana, como ST2I (single immunoglobulin IL-1R-related molecule) e RP105 (radioprotective 105) regulam negativamente a sinalização por TLRs na medida em que dificultam o recrutamento das moléculas adaptadoras necessárias20. ST2I previne a superativação de TLR-2, TLR-4 e TLR-9 através da inibição da formação do complexo receptor- adaptador34,35, enquanto que a RP105 liga-se ao ectodomínio do TLR-4, evitando a ligação do ligante específico36. A dissociação dos complexos adaptadores também ocorre através de fatores solúveis. Estudos demonstram que a forma solúvel de TLR-2, geralmente encontrada no sangue periférico, interage com a proteína CD14, a qual atua como co-receptor de TLR-2 e TLR-4, inibindo a sinalização37. Outro fator solúvel que atua inibindo a via de sinalização dos TLRs é o T1/ST2, o qual sequestra moléculas adaptadoras, impedindo que a sinalização tenha continuidade34. Estudos 11 demonstram também que a proteína ST2 solúvel é capaz de inibir a superexpressão de TLR-1 e TLR-4, levando a redução da produção de mediadores inflamatórios20. Em relação aos mecanismos de degradação de proteínas sinalizadoras, um bom exemplo é regulação de IRF3 e IRF7 por ubiquitinação. A degradação de IRF3 após ubiquitinação pela isomerase Pin1 resulta na supressão da resposta anti-viral por IFNs do tipo I38. Outro exemplo é a proteína PDLIM2 (PDZ and LIM domain protein 2), que inibe a sinalização de TLRs através da degradação do componente p65 da via NF-κB39. A integrina CD11b ativa uma kinase denominada Syk, a qual fosforila as proteínas MyD88 and TRIF, resultando na ligação da ubiquitina E3 ligase, a qual promove a degradação dessas proteínas através do sistema ubiquitina-proteassoma40. Os diferentes membros da família TLR reconhecem diferentes PAMPs e DAMPs. O TLR-4, primeiro TLR descrito na literatura41, atua no reconhecimento de LPS de bactérias Gram-negativas, que atua como importante ativador de macrófagos e desencadeador de choque séptico42. A ligação do TLR-4 ao LPS depende dos co-receptores CD14 e MD2. O LPS liga-se à proteína ligante de LPS (LBP) presente na corrente sanguínea, em seguida a LBP transfere o LPS para o co-receptor CD14, o qual permite, então, a formação do complexo TLR4-MD2-LPS43. O complexo formado leva à ativação do NF-κB e, consequentemente, à produção de citocinas como IL-1 e IL-6. Outros possíveis PAMPs para o TLR-4 são mananas presentes em Candida albicans e glucuronoxilomanana de Cryptococcus neoformans44,45. Em relação ao reconhecimento microbiano, o TLR-2 está envolvido no reconhecimento de amplo espectro de PAMPs derivados de bactérias, fungos, parasitas e vírus23. Dentre esses PAMPs estão lipoproteínas de diversas bactérias, peptideoglicanos e ácido lipoteicóico de bactérias Gram- positivas, lipoarabinomanana de micobactérias, zimozan de fungos e hemaglutinina de vírus do sarampo23. A grande capacidade de reconhecimento do TLR-2 deve-se, em parte, a sua capacidade de formar heterodímeros com TLR-1 e TLR-6. O heterodímero TLR-1/TLR-2 participa do reconhecimento de lipopeptídeos triacetilados, enquanto o heterodímero TLR-2/TLR-6 atua no reconhecimento de zimozan e lipopeptídeos diacetilados23,46. 12 Embora um dos maiores estímulos da inflamação seja a infecção, a inflamação pode ser desencadeada por estímulos não infecciosos47 e assim como a inflamação induzida por agentes microbianos, a inflamação estéril é caracterizada pela infiltração de neutrófilos e macrófagos e pela produção de citocinas48. Assim como os PAMPs são importantes para a defesa imune inata contra agentes infecciosos, os DAMPs são os componentes reconhecidos pelos receptores da imunidade inata durante a inflamação estéril. DAMPs são normalmente fatores endógenos que, em condições normais, se mantém protegidos do reconhecimento de receptores presentes nas células imunes. Na situação em que ocorre injúria tecidual, essas moléculas são liberadas pelas células mortas e passam a ser reconhecidas por tais receptores48. A participação dos DAMPs na ativação da imunidade inata por TLRs começou a ser investigada em meados do ano 2000, quando Ohashi et al.49 demonstraram que a proteína de choque térmico (HSP) 60, que é uma chaperona produzida em resposta ao estresse celular, induzia a produção de citocinas através de TLR-4. No mesmo ano, pesquisadores demonstraram que células necróticas induziam a expressão de genes relacionados à citocinas pró-inflamatórias e ao reparo tecidual através de TLR-250,51. Após essas descobertas iniciais, a lista de DAMPs reconhecidos por TLRs específicos aumentou rapidamente e atualmente fazem parte dessa lista diversas proteínas e peptídeos49,52-70, lipoproteínas e ácidos graxos71-77, proteoglicanos e glicosaminoglicanos78-81 e ácidos nucleicos82,83,84, como demonstrado na Tabela 1. 13 Existe um crescente corpo de evidências de que PAMPs e DAMPs agem de maneiras diferentes para estimular a resposta imune inata. Segundo Lee & Seong85 células apresentadoras de antígenos que não são responsivas ao LPS podem ser ativadas por células necróticas indicando que a ativação do TLR-4, independente de LPS, ocorre em resposta a ligantes endógenos. De forma similar, TLR-3 reconhece células que sofrem necrose durante eventos inflamatórios agudos, independentes da presença de PAMPs viral86. Existem evidências que DAMPs e PAMPs podem ocupar o mesmo sítio de ligação ou sítios próximos nos TLRs. Entretanto, alguns DAMPs podem utilizar diferentes sítios, enquanto as mutações D299G e T3991 do TLR-4 impede sua ativação por LPS, esses polimorfismos conferem notável habilidade ao TLR4 para responder ao fibrinogênio87. Tabela 1. Ativadores endógenos (DAMPs) de receptores Toll-like CATEGORIA DAMP RECEPTOR Proteínas e peptídeos β-defensina 3 TLR-1, TLR-2 HSP60, HSP70 TLR-2, TLR-4 HMGB-1 TLR-2, TLR-4 Proteína surfactante A e D TLR-2, TLR-4 Neurotoxina derivada de eosinófilo TLR-2 Fibronectina EDA TLR-4 Fibrinogênio TLR-4 S100A8 (MRP8) TLR-4 Elastase neutrofílica TLR-4 Lactoferrina TLR-4 Anticorpos antifosfolipídicos TLR-2, TLR-4, TLR-7, TLR-8 Ácidos graxos e lipoproteínas Amilóide sérica A TLR-2, TLR-4 Lipoproteína LDL oxidada TLR-4 Ácidos graxos saturados TLR-4 Proteoglicanos e glicosaminoglicanos Versicano TLR-2 Biglicano TLR-2, TLR-4 Fragmentos de ácido hialurônico TLR-2, TLR-4 Ácidos nucleicos RNAm TLR-3 RNA fita simples TLR-7, TLR-8 Complexos IgG-cromatina TLR-9 14 Gestação, imunidade materna e estresse oxidativo Durante a gestação, a regulação precisa do sistema imune materno permite a sobrevivência e o desenvolvimento adequado do feto, o qual é considerado um aloenxerto em relação ao organismo da gestante devido à expressão de antígenos de origem paterna88. A sobrevivência do aloenxerto fetal desencadeou a elaboração da teoria de que o sistema reprodutor feminino tem privilégio imunológico durante a gestação, ou seja, nesse período específico o sistema imune materno mantém um estado de tolerância por período de tempo programado89. Dentre as diversas alterações do sistema imunológico materno que visam garantir o privilégio imunológico no útero durante a gestação destaca-se a regulação precisa dos perfis de citocinas e outros mediadores inflamatórios na interface materno-fetal. Diversos estudos na literatura apoiam a ideia de que o sistema imune inato e, em particular a resposta inflamatória, desempenham papel importante em diversas etapas da gestação, incluindo a implantação e a placentação, além de serem essenciais para a manutenção da gestação e o desencadeamento do trabalho de parto90. Durantes muitos anos a comunidade científica aceitou o paradigma de que o sucesso da gestação era um “fenômeno Th2”, com predomínio de citocinas com atividade anti-inflamatória e que a resposta imune de perfil Th1, com predomínio de citocinas com atividade pró-inflamatória, era associada a resultados gestacionais adversos91,92. Atualmente, estudos demonstram que na verdade o sucesso da gestação depende de um complexo e dinâmico balanço entre citocinas com atividade anti e pró-inflamatórias, o qual se modifica ao longo da gestação normal93,94. O primeiro trimestre da gestação é marcado por predomínio de resposta imune de perfil Th1, visto que nesse primeiro estágio o microambiente inflamatório torna-se necessário tanto para permitir o correto reparo do epitélio uterino, o qual sofre danos consequentes da implantação do feto, quanto para remoção de debris celulares95. No segundo trimestre o predomínio passa a ser de resposta imune de perfil Th291,96,97, com aumento de citocinas com atividade anti-inflamatórias importantes para a 15 manutenção da gestação. No terceiro trimestre e no momento do parto, o predomínio volta a ser de perfil Th1, tanto sistemicamente98, quanto no tecido placentário e no líquido amniótico99-101. Nesse sentido, o avanço da idade gestacional e mais precisamente o final do terceiro trimestre de gestação é caracterizado por um aumento da resposta inflamatória, com influxo maciço de células imunes na interface materno-fetal e aumento da produção de citocinas pró- inflamatórias102,103. Esse cenário pró-inflamatório é essencial para o desencadeamento dos processos fisiológicos de remodelamento da cérvice, enfraquecimento e rotura das membranas fetais e início das contrações uterinas, que culminam no trabalho de parto104,107. Estudos recentes demonstram também que a gestação normal é caracterizada pelo aumento do estresse oxidativo, devido ao aumento do consumo e do metabolismo do oxigênio ou em resposta ao estresse oxidativo placentário108,109. O estresse oxidativo é decorrente da produção exacerbada de espécies reativas do oxigênio (EROs) e/ou devido a deficiência no mecanismo antioxidante, o que pode acarretar em peroxidação lipídica e proteica e dano ao DNA110,111. No contexto gestacional o aumento do estresse oxidativo tem sido descrito no terceiro trimestre da gestação normal e no trabalho de parto109. 16 Prematuridade, resposta inflamatória e estresse oxidativo A prematuridade é a principal causa de mortalidade neonatal e é responsável por sérias morbidades na infância, tanto a curto quanto a longo prazo, sendo que os riscos de complicações decorrentes são inversamente proporcionais à idade gestacional na qual o parto ocorre112-116. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) a incidência mundial de parto pré-termo em gestações únicas é de 9,6%117. O parto pré-termo é definido como o nascimento ocorrido anteriormente a 37ª semana de gestação completa, podendo ser medicamente induzido ou espontâneo. A prematuridade induzida pode ser consequente de indicação fetal ou materna, podendo ser iniciada através de medicação indutora de trabalho de parto ou por cesárea. O parto pré-termo espontâneo pode ser subdividido em duas categorias: precedido por trabalho de parto pré-termo com bolsa íntegra (TPP) ou precedido por rotura prematura de membranas pré-termo (RPM-PT)115,118. Dentre os partos pré- termo espontâneos, a incidência de TPP é de cerca de 60% e a de RPM-PT é de 30-40% 115,118-124. A etiologia da prematuridade é multifatorial e inclui fatores de riscos maternos, paternos e genéticos125-128, como sumarizado na Tabela 2. Apesar dessa multifatoriedade, estudos demonstram que a infecção intra-amniótica acomete de 25% a 40% das gestações pré-termo, entretanto, essa porcentagem provavelmente é subestimada, visto que a infecção intra-amniótica nem sempre é diagnosticada pelos métodos de cultura comumente empregados115,129. 17 Tabela 2. Fatores de risco para prematuridade Maternos Características sociodemográficas Etnia afro-americana Idades maternas extremas Baixo índice sócio-ecomônico Hábito tabagista Uso de drogas e álcool Histórico médico e gestacional Prematuridade anterior Diabetes Hipertensão Biópsia cônica da cérvice Características gestacionais Gestação múltipla Placenta prévia Placenta abrupta Pré-eclâmpsia Oligodrâmnio e polidrâmnio Anomalias uterinas e cervicais Concepção assistida Infecções Vaginose bacteriana Infecção peridontal Infecção clamidiana Infecção intra-uterina Paterno Idadade paterna elevada Genéticos Polimorfismos IL-1R,IL-1β, IL-6, IL-10, MMP-1, MMP-9, TLR-4, TNF-α, HPS47 A principal rota da infecção da cavidade amniótica é a ascensão de bactérias presentes no trato genital inferior através do canal endocervical, as quais atravessam uma pequena região das membranas e invadem a cavidade amniótica, proliferando-se no líquido amniótico. Quando presentes na cavidade amniótica, esses microrganismos podem invadir o âmnio, o tecido conjuntivo e em casos mais severos, o cório e a decídua130. Outras possíveis rotas de infecção incluem a via hematogênica ou transplacentária, infecção retrógrada da pelve e infecção transuterina causada por procedimentos como a amniocentese131. 18 Quando a resposta inflamatória é instalada em função da infecção bacteriana tem-se o diagnóstico de corioamnionite, que pode se apresentar nas condições clínica e histológica. A corioamnionite clínica, frequentemente denominada de infecção intra-amniótica ou amnionite, acomete de 1% a 2% dos partos de termo e 5% a 10% dos partos pré-termo, havendo aumento dessa incidência quando há RPM por tempo prolongado132. Seu diagnóstico é geralmente definido como presença de temperatura ≥ 37,8°C e pelo menos dois dos seguintes achados: taquicardia materna (acima de 120 bpm), leucocitose materna (acima de 18.000 células/mm3), presença de sensibilidade uterina, líquido amniótico purulento ou de odor fétido ou taquicardia fetal (acima de 160 bpm)133. A corioamnionite histológica é definida pela presença de leucócitos polimorfonucleares nas estratificações das membranas corioamnióticas, podendo também ser avaliada a densidade e a degeneração tecidual para se estimar a intensidade e a progressão da resposta inflamatória materna134-136. Os principais microrganismos presentes na cavidade amniótica de gestantes com infecção intra-amniótica são Ureaplasma urealitycum e Mycoplasma hominis e espécies de Fusobacterium; ocasionalmente também são encontrados bacilos Gram-negativos, como os do gênero Bacteroides e Prevotela, ambos encontrados na vaginose bacteriana; além de coliformes como Escherichia coli e Streptococcus do grupo B137-139. O principal mecanismo pelo qual a infecção intra-amniótica é causa direta de prematuridade é a indução de síntese de prostaglandinas, responsável pelo início das contrações uterinas103. As bactérias presentes no líquido amniótico produzem fosfolipases, as quais ativam a liberação de ácido aracdônico, que com a metabolização, via ciclooxigenase, culmina na amplificação da produção de prostaglandinas. Além disso, a ativação de TLRs e NLRs por PAMPs presentes nessas bactérias desencadeia a produção e a liberação de citocinas inflamatórias, as quais provocam liberação adicional de prostaglandinas pelas células amnióticas, deciduais e pelos macrófagos140-143. Existe similaridade na etiologia associada a RPM-PT e ao TPP, mas segundo Menon et al.144, um dos principais diferenciadores entre as duas manifestações clinicas da prematuridade é a 19 presença de certos fatores moleculares associados à infecção, como as metaloproteinases e fatores pró-apoptóticos, que em gestantes com RPM-PT seriam responsáveis por modificações estruturais e pelo enfraquecimento das membranas fetais. Esses mesmos fatores moleculares são ausentes ou minimamente expressos em casos de TPP com bolsa íntegra. Além disso, outros diferenciadores entre a RPM-PT e o TPP com bolsa íntegra seriam a maneira distinta com a qual as membranas fetais respondem aos diferentes tipos de microrganismos presentes na cavidade amniótica145-147 e a intensidade da resposta inflamatória considerando cada manifestação148. Mais recentemente, estudos têm demonstrado a participação do estresse oxidativo na fisiopatologia do RPM-PT149,150, sugerindo haver similaridade entre a RPM-PT e a gestação de termo quanto à degradação, sinais apoptóticos, danos oxidativos e envelhecimento das membranas fetais151,152,153. Esses resultados não são surpreendentes já que a gestação normal é caracterizada pelo aumento do estresse oxidativo108,109. Na gestação, além do aumento de estresse oxidativo observado no terceiro trimestre da gestação normal e no trabalho de parto109, níveis aumentados de marcadores de estresse oxidativo no segundo trimestre têm sido associados com complicações gestacionais como pré-eclâmpsia e baixo peso ao nascimento154. Assim, a semelhança entre gestações de termo e gestações com RPM-PT quanto à degradação, sinais apoptóticos, danos oxidativos e envelhecimento das membranas fetais sugere que a senescência precoce é característica da RPM-PT. 20 TLRs na interface-materno fetal e complicações gestacionais Diversos estudos na literatura relatam o papel da resposta imune inata e dos TLRs durante a gestação normal e na presença de complicações gestacionais155-157. A expressão desses receptores vem sendo investigada principalmente na placenta e nas membranas corioamnióticas e os resultados de tais estudos são conflitantes. Rindsjö et al.157, empregando a técnica de imunoistoquímica, demonstraram significante redução da expressão de TLR-2 em placentas na presença de corioamnionite histológica, justificando que a expressão de TLR-2 pelo trofoblasto deve ser afetada pelo processo inflamatório nas membranas corioamnióticas. Esses resultados diferem dos achados de Kim et al.158 que demonstraram aumento na expressão de TLR-2 em membranas que apresentavam corioamnionite histológica. Para Kumazaki et al.159 as células de Hofbauer das placentas pré-termo complicadas por corioamnionite demonstraram aumento da imunorreatividade ao TLR-4, quando comparadas com aquelas sem infiltrado inflamatório, ou com placentas de termo. Em estudo recente, Moço et al.160 demonstraram, pela primeira vez na literatura, aumento de RNAm de TLR-1 e TLR-2 em membranas corioamnióticas de gestações pré-termo complicadas por corioamnionite histológica, quando comparadas com membranas corioamnióticas de gestações pré- termo na ausência de infiltrado inflamatório. Adicionalmente, Kacerovsky et al.161,162 demostraram que gestantes com RPM-PT e invasão microbiana da cavidade amniótica apresentam aumento significativo das formas solúveis de TLR-1 (sTLR-1), TLR-2 (sTLR-2), TLR-4 (sTLR-4) e TLR-6 (sTLR-6) no líquido amniótico. A expressão de TLR-2 e TLR-4 pelo epitélio amniótico sugere que esse epitélio não funciona apenas como barreira mecânica aos microrganismos, mas que também é requerido na ativação do sistema imune inato158. Segundo Kim et al.158 o aumento na expressão de ambos os receptores, em membranas corioamnióticas de termo, corrobora a associação do parto espontâneo, ainda que modestamente, à resposta inflamatória dos tecidos gestacionais, com produção de citocinas pró- inflamatórias, conforme descrito por Keelan et al.163. Segundo Muzio et al.164 citocinas inflamatórias têm mostrado regulação positiva na expressão de TLR-2 e TLR-4 e a possível explicação para esses 21 achados é que a expressão aumentada dos TLRs nos tecidos gestacionais no momento do trabalho de parto pode servir para aumento da proteção materna e fetal à invasão microbiana da cavidade amniótica. Holmlund et al.155, utilizando as técnica de imunoistoquímica e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, não observaram diferença na expressão de TLR-2 e de TLR-4 entre trofoblastos estimulados, respectivamente, com zimozan e LPS, e trofoblastos não estimulados. De acordo com esses pesquisadores, a possível explicação para tal resultado é que ambos os receptores estejam normalmente super expressos nos tecidos uterinos como mecanismo de defesa, o qual pode rapidamente ser mobilizado e proteger o feto contra infecções durante a gestação e o parto. Em estudo experimental, realizados com camundongos, Gonzalez et al.165 avaliaram a expressão de TLRs pela técnica PCR em tempo real e demonstraram que a expressão desses receptores é substancialmente diferente no tecido uterino de fêmeas prenhes e não prenhes e que a expressão dos receptores TLR-2, -3, -4 e -9 aumenta ao longo da prenhez. Esses dados estão de acordo com Beijar et al.166 que relataram que as vilosidades placentárias de primeiro trimestre demonstraram menor expressão de TLR-4 quando comparado com as vilosidades de termo. Há de se considerar que possíveis discordâncias entre esses estudos podem refletir diferenças da resposta à infecção nas diferentes partes da placenta e seus anexos. 22 Células do sangue periférico materno e análise de TLRs na gestação A investigação da expressão de TLRs em tecidos gestacionais é de grande importância para o entendimento da participação da imunidade inata em gestações normais e com desfechos gestacionais adversos, porém tais tecidos permitem análise somente após a resolução da gestação, quando a cinética da expressão desses receptores pode sofrer modificações. Nesse contexto, uma possível fonte de estudo para análise de TLRs durante a gestação em curso são as células do sangue periférico materno, uma vez são facilmente obtidas por punção venosa, além de possuírem papel fundamental na reposta imune inata e expressarem diversos tipos de TLRs167-172. Os neutrófilos, também chamados de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) ou granulócitos neutrofílicos, são os leucócitos mais abundante na circulação e medeiam as fases iniciais da resposta inflamatória1,173. Morfologicamente, essas células circulantes geralmente são esféricas, com diâmetro de 12-15µm e possuem o núcleo segmentado em três a cinco lóbulos conectados1. No citoplasma dos neutrófilos encontram-se diversos grânulos específicos, os quais contêm enzimas líticas como lisozima, colagenase e elastase1. A migração dos neutrófilos para os locais de infecção pode ser bastante rápida, ocorrendo poucas horas depois da invasão dos patógenos. Após o recrutamento, essas células atuam por algumas horas e morrem. Quando os neutrófilos circulantes não são recrutados nesse período, eles sofrem processo apoptótico e são fagocitados por macrófagos do fígado ou do baço1. Classicamente, os neutrófilos são descritos como células que possuem capacidade fagocítica, além de liberarem enzimas líticas através de seus grânulos e de serem capazes de produzir EROs com potencial antimicrobiano168,173. Porém, uma abordagem mais recente de suas funções e habilidades demonstra que essas células codificam a expressão de mediadores inflamatórios, como componentes do sistema complemento, PRRs, citocinas inflamatórias e quimiocinas168,173. Além disso, mais recentemente demonstrou-se que os neutrófilos são capazes de expelir seu conteúdo nuclear através das chamadas NETs (neutrophil extracelular traps), as quais atuam como 23 “armadilhas” para os patógenos invasores, permitindo a interação dos microrganismos com proteínas derivadas dos grânulos neutrofílicos168,173. As células mononucleares do sangue periférico são células que participam tanto da imunidade inata quanto da imunidade adaptativa e cuja principal função é a fagocitose. O monócito é a célula mononuclear circulante, que sai da medula onde é produzido em direção ao sangue periférico. Morfologicamente, os monócitos são células circulares com 10-15 µm de diâmetro, possuindo núcleo único com forma clássica de feijão e um citoplasma finamente granular contento lisossomos e vacúolos fagocíticos1. Quando os monócitos circulantes atingem os tecidos eles são capazes de se diferenciar em macrófagos tissulares. Os macrófagos são células fagocítica que recebem nomes distintos dependendo do tecido nos quais se originam1. Monócitos e macrófagos participam da iniciação e da resolução da inflamação através da fagocitose de microrganismos, liberação de citocinas inflamatórias e de EROs, além de atuarem na ativação da imunidade adaptativa174. Diferentemente do que ocorre na interface materno-fetal, poucos estudos na literatura avaliam a expressão de TLRs em células do sangue periférico materno durante complicações gestacionais como a prematuridade. Recentemente Nitsche et al.175, pela primeira vez investigaram, empregando a técnica de PCR em tempo real, se a expressão de TLR-2 e TLR-4 nos neutrófilos maternos é alterada com a progressão da gestação e no momento do parto. Segundo esses autores, embora a expressão desses receptores esteja aumentada nos tecidos gestacionais, a expressão nos neutrófilos maternos tem mínima alteração ao longo da gestação normal e durante o parto. Entretanto, este estudo foi realizado com pequeno número de amostras, podendo apresentar limitações na acurácia dos dados apresentados. Pawelczyk et al.176 demonstraram que a expressão gênica de TLR-4 foi significativamente superior nos leucócitos totais de gestantes em trabalho de parto pré-termo, quando comparado com o grupo controle. Não houve diferença na expressão gênica de TLR-4 em leucócitos totais entre gestantes de termo em trabalho de parto e fora de trabalho de parto. Os mesmos pesquisadores avaliaram a expressão proteica de TLR-4 através de 24 citometria de fluxo e observaram que não houve diferença na expressão de TLR-4 na população de granulócitos, porém, entre os monócitos a expressão proteica de TLR-4 foi significativamente superior em gestantes em trabalho de parto pré-termo176. No mesmo sentido, recentemente Kim et al.177 demonstraram aumento da expressão proteica de TLR-4 na população de monócitos de gestantes em trabalho de parto pré-termo. Considerando a escassez de dados na literatura em relação à expressão de TLRs em neutrófilos e em monócitos maternos ao longo da gestação normal e os poucos trabalhos com esse mesmo enfoque na presença de complicações gestacionais como pré-eclâmpsia, infecções da cavidade amniótica, TPP e RPM-PT, trabalhos nesse contexto se justificam, pois poderão demonstrar o envolvimento da resposta imune inata no cenário das complicações gestacionais. 25 Referências Bibliográficas 1. Abbas AK, Lichtman AH. 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Phone: +55 (14) 3880 1580 Fax: +55 (14) 3815-2348 E-mail: mgsilva@fmb.unesp.br Evaluation of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 gene and protein expression in maternal PBMCs and PMNs during normal pregnancy and preterm labor. Article written according to guide for authors of the “American Journal of Reproductive Immunology” (AJRI). mailto:jpolettini@fmb.unesp.br 39 Abstract Problem: The inflammation response triggered by Toll-like receptors (TLRs) has become the focus of investigations to predict preterm labor. Aim: Evaluate TLR-1, -2, -4 and -6 expression in maternal neutrophils and PBMCs in normal and preterm pregnancies. Method of study: We included 139 pregnant women and TLR expression was performed by real-time PCR and flow cytometry. Results: There were no differences in gene and protein expression of TLRs in PBMCs between trimesters and between preterm and term pregnancies. Regarding neutrophils, there were no differences in the expressions of TLRs between trimesters, however preterm pregnancies showed higher TLR-1, TLR-2 and TLR-4 gene expression. Nevertheless, the protein expression of these TLRs did not differ between these groups. Conclusion: TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 expression in maternal neutrophils and PBMCs are not temporally regulated in normal pregnancy and this expression in maternal blood cells is not useful as a biomarker of preterm labor. Keywords: Innate immunity, Pregnancy, Prematurity, Real-time PCR, Flow Cytometry 40 Introduction Pregnancy constitutes distinctive challenges for the maternal immune system1,2. During this period, the immune system of pregnant women is tightly controlled to promote tolerance to the allogeneic fetus, and to protect the mother and the growing fetus against possible pathogens2-6. Dysregulation of this immune control may lead to pregnancy complications, such as implantation failure, pregnancy loss, intrauterine fetal growth restriction and preterm birth6. Preterm birth (PTB), defined as delivery before 37 weeks of gestation, is the major cause of neonatal mortality and serious neonatal morbidity worldwide and the risk is inversely proportional to gestational age at birth7-11. The overall prevalence of prematurity is approximately 12% in developed countries12-14 and 9.6% worldwide15. It has been currently postulated that early activation of the pro-inflammatory pathway is the major cause of induction of preterm labor and delivery16-19 and compelling evidence supports the association between intrauterine infection, maternal inflammatory response and early activation of the parturition pathway, which results in preterm birth20-23. Predisposing factors for infection-related PTB are diverse and include subclinical intrauterine infection24, intrauterine infection25-26 and pyelonephritis27. The innate immune system is the first line of defense28-30 that provides an immediate response against invading pathogens throug