UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Heloísa Vicente Garcia Bioestimulação de célula-tronco mesenquimal de rato sob ação da luz contínua e pulsátil de 630 nm utilizando LED Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre(a) em Pesquisa e Desenvolvimento: Biotecnologia Médica. Orientadora: Profa. Dra. Elenice Deffune Coorientador: Prof. Dr. Andrei Moroz Botucatu 2015 Heloísa Vicente Garcia Bioestimulação de célula-tronco mesenquimal de rato sob ação da luz contínua e pulsátil de 630 nm utilizando LED Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre(a) em Pesquisa e Desenvolvimento: Biotecnologia Médica. Orientadora: Profa. Dra. Elenice Deffune Coorientador: Prof. Dr. Andrei Moroz Botucatu 2015 Dedicatória Dedico este trabalho... Aos meus pais Sílvia e Daniel, e minha irmã Daniela, que sempre me incentivaram aos estudos e me apoiaram em todos os momentos de minha vida... Ao meu grande amor Kleber, por todo amor, carinho, incentivo e apoio... Aos meus queridos amigos... Agradecimentos À Deus e Nossa Senhora Aparecida por me guiarem e me protegerem antes e durante esta jornada de trabalho e dedicação, sempre me abençoando e escutando meus pedidos e sonhos. Obrigada por me mostrarem que cada dia era um novo dia, um novo recomeço para continuar minhas tarefas com saúde. Aos meus pais Daniel e Sílvia, que desde que me conheço por gente, sempre me ensinaram os verdadeiros valores da vida, a honestidade, a humildade, o respeito, a amizade, a lealdade, a gentileza. Obrigada por incentivarem a mim e minha irmã aos estudos e mostrarem a nós que sempre é possível sonhar e alcançar nossos objetivos. Obrigada por cada momento de apoio, carinho, amor e conforto. Espero que a concretização deste trabalho represente parte da gratidão por tudo que sempre fizeram por mim. Amo vocês. À minha querida irmã Daniela, que sempre esteve ao meu lado, me protegendo, me apoiando, me incentivando e sempre me dando bons exemplos. Não poderia haver irmã melhor em minha vida. Muito obrigada por todo carinho. Você também fez parte da luta para finaliza esse trabalho. Amo você. Ao meu namorado Kleber, obrigada meu amor por todos os momentos de apoio, de paciência, de carinho, de incentivo e por acreditar em mim e no meu trabalho. Você também foi fundamental para eu conseguir concluir minhas atividades. Quando somos felizes por amar, as coisas fluem muito melhor. Aos meus entes queridos que me protegeram e olharam por mim lá do céu (meus Avós paternos, Avô materno e tios) e aos meu parentes que ainda estão pertinho, minha Avó Wanda, Tios e Tias, primos e primas que sempre perguntavam como estavam as coisas e me incentivaram a prosseguir com persistência o meu trabalho. Sei que vocês torceram muito por mim. Aos meus sogros e cunhada por todo carinho, apoio, amizade e preocupação que tiveram comigo. Muito obrigada. À minha orientadora e mãe de coração, Profa. Dra. Elenice Deffune, primeiramente muito obrigada por me aceitar em seu Laboratório, confiar este trabalho a mim e acreditar em mim. Sabemos que essa caminhada não foi fácil, mas foi vencedora, pois estamos colhendo muitos frutos bons. A sua dedicação e empenho, o seu exemplo de vida me incentivaram ainda mais a sempre me esforçar mais. Obrigada por cada abraço, carinho, atenção, apoio. Foi uma honra poder ser orientada pela senhora. Meu muito obrigada, de coração. À Professora Dra. Rosana Ferreira, que me trouxe ao Laboratório e me deu a oportunidade de seguir meus estudos em Botucatu. A senhora também é uma mãe de coração para mim, sempre me estendeu a mão para todas as dificuldades, sempre generosa, amiga e carinhosa. Obrigada por cada momento em que pude aprender muito com a senhora e por todos os conselhos, desde minha faculdade em Bauru até hoje, em nosso Laboratório. Minha eterna gratidão por confiar em mim. Ao meu coorientador Dr. Andrei Moroz, obrigada por me ajudar nos momentos de dificuldade nas técnicas do trabalho e por se mostrar solicito para eventuais contratempos. À querida Ondina, por “puxar nossa orelhas” quando precisamos e por toda ajuda e apoio nos momentos de preocupação e dificuldade. Obrigada sua colaboração fundamental em manter a organização do Laboratório e dos materiais, permitindo que nosso trabalho fosse desempenhado com sucesso. Suas histórias divertidas nos distraiam positivamente e seu abraço muitas vezes nos confortava quando a saudade de casa batia. Aos meus queridos amigos de Laboratório (e de minha vida, agora) Thaiane, Josy, Ana Claudia, Juliana, Helga, Isabele, Henrique, Woner, Vitória, Camilla, Ana Lívia, Priscila, Ana Carolina, Natália, Rodrigo, Michele, meu muito obrigada por fazerem parte da minha vida, alguns por pouco tempo outros por mais. Com vocês formei uma nova família e acreditem, vou sentir muita saudade da convivência, dos momentos de risadas, histórias, trabalho em equipe, dos aprendizados, dos abraços, do carinho, da lealdade de vocês. Vocês moram no meu coração e nunca me esquecerei desses 3 anos em minha vida. Agradeço a Deus por terem colocado vocês no meu caminho. Obrigada por me socorrerem e estenderem a mão nos momentos difíceis, tanto de saúde, quanto de trabalho. Não poderia ter feito parte de equipe tão agradável e calorosa quanto essa. Contem sempre comigo para o que precisarem! Aos meus novos amigos de Laboratório Pâmela, Monique, Mariane, Taís, Aline, Mateus, agradeço por cederem parte do tempo de vocês e me ajudarem nos momentos de dificuldade. Contem comigo para o que precisarem. Às minhas amigas de apartamento Viviam Massolini, Taiane Gardizani e Helga Nunes pela amizade e convivência! Foram muitos os aprendizados! Obrigada pelo apoio e momentos de alegria! Ao Centro de Pesquisa em Óptica e Fotônica (CEPOF) do Instituto de Física de São Carlos da USP, por todo apoio, pela confiança em nosso trabalho, pela dedicação em nos amparar, pela prestatividade. Agradeço muito ao Professor Vanderlei Bagnato, a Natália Inada, ao LAT (Madison, Priscila) e a todos que de alguma forma colaboraram com o nosso trabalho! Vocês foram fundamentais! Ao Laboratório de Citometria de Fluxo, Márjorie, Aline, Caroline por todo apoio e colaboração em nosso trabalho e por cederem tantas vezes o vosso tempo para a realização dos testes. Muito Obrigada! Ao Laboratório de Toxicogenômica e Nutrigenômica da Profa. Daisy, que nos recebeu com generosidade e permitiu que pudéssemos acompanhar as técnicas que seriam empregadas em nosso trabalho. Obrigada ao pessoal do Laboratório, João Paulo, André, Rafael, Bruno, Fábio, Nice, por toda prestatividade e ajuda nos momentos de dificuldade. Agradeço pela paciência e colaboração. Ao Laboratório de Carcinogênese Química e Experimental por toda colaboração, generosidade e ajuda. Agradeço ao Brunno, Renata e Guilherme por estenderem a mão sempre que precisei. Vocês foram fundamentais. Ao Ednelson Bianchi (Biotério e Unipex) que sempre me recebeu com muita disposição e colaborou bastante para o início deste trabalho. Obrigada por participar desta etapa e por me socorrer nos momentos imprevisíveis, pelos conselhos e ensinamentos. Agradeço a toda equipe do Biotério Central e da Unipex pela colaboração. Ao Professor Dr. Carlo Roberto Padovani, por toda colaboração e generosidade e dispor de seu tempo e amplo conhecimento com as dificuldades estatísticas para o delineamento deste trabalho. Às minhas queridas amigas de faculdade (Bauru) e Araçatuba, Taísa Katz, Ana Paula de Freitas, Ana Cláudia Ribeiro, vocês sempre preocupadas comigo e com meu bem estar. Obrigada por cada palavra de carinho, de conforto, pela amizade, pelos bons momentos de alegria e desafios. Vocês moram no meu coração há muito tempo. A amizade é um elo que não se desfaz quando o amor é verdadeiro e quando Deus coloca essas pessoas em nosso caminho para serem eternas. À minha orientadora de iniciação científica e professora de histologia e embriologia da graduação em Bauru, Profa. Dra. Irene Bastos Franceschini Vicentini, por toda confiança, aprendizado, generosidade, carinho, respeito e por abrir caminhos que me geraram a primeira oportunidade de contato com o mundo da pesquisa científica. A senhora foi a minha inspiração e incentivo para que eu continuasse na área acadêmica, diante dos excelentes exemplos de profissionalismo e de valores pessoais. Muito obrigada. Aos funcionários do Hemocentro, do Hospital, do IBB e a todos aqueles que de alguma forma me estenderam a mão e colaboraram para o caminhar das etapas. Às funcionárias da limpeza, Natália e Bruna, sempre tão educadas e generosas. Sem o trabalho de vocês o nosso não pode ser realizado. Obrigada por manterem nosso ambiente de trabalho sempre limpo e confortável. Agradeço sinceramente aos animais (ratos) que foram fundamentais para o início deste trabalho! Espero que estes sacrifícios dentro da pesquisa gerem ótimos frutos para o bem da humanidade e da natureza. E, por fim, agradeço à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) por todo apoio, respeito, confiança e respaldo intelectuais e financeiros depositados em mim, como iniciante da carreira acadêmica, e neste projeto científico que mereceu, assim como tantos outros, indispensável apoio desta Fundação. Acreditamos que essas parcerias e colaborações são essenciais para um caminhar progressivo e póspero da pesquisa e do ensino no país e no mundo. Meu muito obrigada, de coração! Epígrafe “Cabem aqui meus pensamentos e sentimentos, aprendi mais um pouco. Tudo que almejamos e sonhamos é possível se tornar realidade, mesmo quando tudo parece desabar, ou quando se perdem as forças, ou quando achamos que não estamos no caminho certo. Não importa para onde seguimos, contanto que façam parte da nossa vida e do nosso caminho as pessoas que realmente nos amam e nos protegem, nos incentivando e ensinando a não desistir e enfrentar os desafios. Sou extremamente feliz e agradecida por ter essas pessoas ao meu lado.” (Heloisa Vicente Garcia) “Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”. (Madre Teresa de Calcutá) Resumo e Abstract RESUMO A medicina regenerativa emergiu do impulso biotecnológico com uso da célula-tronco (CT), caracterizada por indiferenciação, autorrenovação e capacidade de gerar vários tipos celulares. A célula-tronco mesenquimal (CTM) pode ser isolada de várias fontes biológicas, sendo o tecido adiposo uma promissora fonte. São candidatas para aplicação em terapia celular por vários motivos e capazes de se diferenciar e produzir muitos tipos celulares para reparação do tecido danificado, no entanto, são dose dependentes necessitando de expansão pelo método de cultura celular. A aplicabilidade do diodo emissor de luz – LED – (Light Emitting Diode) como agente bioestimulador tem sido proposta. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação da luz contínua e pulsátil, 630 nm, comparando esta ação sobre células obtidas pelos métodos de dissociação mecânica (DM) e enzimática (DE). Foram retirados blocos de tecido adiposo (TA) de ratos da linhagem Wistar com idade média de 3 meses. A concentração de células linfomononucleares (LMN) obtidas/grama de TA foi de 1 x 105 advinda de DM e 3,34 x 105 de DE. O perfil fenotípico utilizando CD90/CD44/CD71/CD31/CD11b/CD45 evidenciou que a DE remove um percentual significativo de antígenos das superfícies das CTMs. Quanto à curva de confluência à 80% entre as passagens, mostrou que as CTMs obtidas por DM sofrem melhor ação do LED, proliferando mais rapidamente. Foram determinadas citocinas TNF, IFN-ɣ, IL-4 e IL-10. A maioria das amostras que apresentam secreção de citocinas foram obtidas pelo método de DM. Amostras controle, não irradiadas, também apresentaram secreção de citocinas, mostrando a ação dos aditivos do meio de cultura como bioestimulador dos efeitos parácrinos. Os testes de micronúcleo e cometa para análise de mutagenicidade e genotoxicidade, respectivamente, evidenciam que a luz pulsátil de 1J/cm2 determina o aparecimento de micronúcleos, enquanto que o dano de DNA determinado pelo cometa é reparado pela ação do LED. Palavras-chaves: célula-tronco mesenquimal, cultura celular, bioestimulação, LED, terapia celular. ABSTRACT Regenerative medicine (RM) has emerged of different sciences boost, including biology of the stem cell. The mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from adipose tissue have occupied more space in RM. They are characterized by differentiation, self-renewal and the ability to generate at least three different cell lines, being involved in the repair of damaged tissue, however they are dose-dependent requiring expansion by cell culture method. The applicability of LED (Light Emitting Diode) as biostimulator agent has been proposed. The aim of this study was to evaluate the effect of continuous and pulsed light, 630 nm, comparing this action in cells obtained by the methods of mechanical (MD) and enzymatic dissociation (ED). Adipose tissue were removed from rats of Wistar lineage with an average age of 3 months. The concentration of lymphomononuclear cells (LMN) obtained/gram of tissue was 1 x 105 from MD and 3.34 x 105 and from ED. The phenotypic profile using markers as CD90 / CD44 / CD71 / CD31 / CD11b / CD45 showed that ED removes a significant percentage of the surface antigens of MSCs. The curve of the confluence at 80% between passages showed that MSCs obtained by MD was beneficiated by the action LED and proliferating faster. Cytokines TNF, IFN-ɣ, IL-4 and IL-10 were determined by flow cytometry. Most of the samples showed cytokine secretion was obtained by MD method. Control samples, not-irradiated, also showed secretion of cytokines, showing the action of the additive of the culture medium as biostimulator of paracrine effects. The micronucleus and comet assays to the mutagenicity and genotoxicity analysis, respectively, show that pulsed light of 1 J/cm2 determine the appearance of micronuclei, while DNA damage determined by the comet assay decreases by the LED action. Keywords: mesenchymal stem cell, cell culture, bioestimulation, LED, cellular therapy Lista de Abreviaturas Lista de Abreviaturas BN Broto Nuclear BNDES Banco Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social CA Contador Automático CBA Cytometric Bead Array CD Cluster of Differenciation CEPOF Centro de Pesquisa em Óptica e Fotônica CEUA Comitê de Ética em Utilização Animal CF Citometria de Fluxo CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CT Célula-tronco CTA Célula-tronco Adulta CTL Controle CTM Célula-tronco Mesenquimal DAPI 4´6-diamidino-2-pheniphenylindole DE Dissociação Enzimática DM Dissociação Mecânica DMEM-F12 Dulbecco’s Modified Minimal Essential Médium DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido Desoxirribonucleico EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EPI Equipamento de Proteção Individual FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FC Fatores de Crescimento FGF Fator de Crescimento Fibroblástico FINEP Financiadora de Estudos e Projetos FITC Isotiocianato de Fluoresceína FMB Faculdade de Medicina de Botucatu FNS Fundo Nacional de Saúde HC Hospital das Clínicas HE Hematoxilina-Eosina HEPES 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic acid ICE Interleukin-1β-converting Enzime IDN Índice de Divisão Nuclear IL Interleucina IFN-γ Interferon gama IFSC Instituto de Física de São Carlos IP Iodeto de Propídeo KCl Cloreto de potássio LAC Laboratório de Atividades Complementares LASER Light Amplified by Stimulated Emission Radiation LAT Laboratório de Apoio Tecnológico LBE LASER de baixa energia LEC Laboratório de Engenharia Celular LED Light Emitting Diode LLLT LASER de baixo nível LMN Células Linfomononucleares MN Micronúcleo MO Medula Óssea MR Medicina Regenerativa NASA National Aero Space Agency OMS Organização Mundial da Saúde PDT Terapia Fotodinâmica PE Ficoeritrina PERCP Proteína Clorofila Peridinina PN Ponte Nucleoplasmática POP Procedimento Operacional Padrão UNESP Universidade Estadual Paulista SFB Soro Fetal Bovino SCGE Eletroforese em Gel de Células Individualizadas TA Tecido Adiposo TNF Fator de Necrose Tumoral UNIPEX Unidade de Pesquisa Experimental USP Universidade de São Paulo Lista de Figuras Lista de Figuras Figura 1 - Linha do tempo do surgimento e aplicabilidades do LASER e LED nas ciências, tecnologia e comunicação................................................................25 Figura 2 - Ilustração da ação da luz de 600 a 950 nm sobre a célula e seus efeitos subsequentes...................................................................................................26 Figura 3 - Imagem representando os efeitos produzidos pela CTM pelo estímulo com LED..................................................................................................................27 Figura 4 - Fotos da obtenção do TA de rato em fluxo laminar.......................................33 Figura 5 - Fotos do processo de dissociação mecânica com tesoura e cell scrapper...34 Figura 6 - Câmara de contagem para o contador automático e modelo ilustrativo Countess BD®.................................................................................................37 Figura 7 - Detalhe das biotables produzidas pelo CEPOF/LAT e da irradiação dentro da estufa...............................................................................................................41 Figura 8 - Esquema representativo da metodologia de irradiação e controles..............44 Figura 9 - Fluxograma do experimento proposto, contendo as etapas desde a coleta de TA até o encerramento com as análises.........................................................46 Figura 10 - Representação esquemática do teste de Anexina V e Iodeto de Propídeo..........................................................................................................48 Figura 11 - Esquema da análise do teste de Anexina V e Iodeto de Propídeo por Citometria de Fluxo........................................................................................49 Figura 12 - Esquema ilustrativo das vias de morte celular.............................................49 Figura 13 - Esquema representativo do método de detecção por CBA, no citômetro de fluxo...............................................................................................................51 Figura 14 - Fotomicrogafias obtidas por microscopia invertida, contraste de fase, da cultura de CTM-TA com diferentes aspectos de confluência celular.............57 Figura 15 - Desempenho das CTM obtidas por DM quanto à contagem celular nos diferentes momentos da pesquisa.................................................................60 Figura 16 - Desempenho das CTM obtidas por DE quanto à contagem celular nos diferentes momentos da pesquisa.................................................................61 Figura 17 - Fotos em microscopia invertida das culturas mecânicas no experimento...65 Figura 18 - Fotos em microscopia invertida das culturas mecânicas no experimento...66 Figura 19 - Fotos em microscopia invertida das culturas enzimáticas no experimento.............................................................................................66 Figura 20 - Fotos em microscopia invertida das culturas enzimáticas no experimento........................................................................................67 Figura 21 - Análise do índice de apoptose e necrose em amostra obtida por DE.........69 Figura 22 - Análise do índice apoptose e necrose em amostra obtida por DM..............70 Figura 23 - Análise de morte celular via Caspase-3, por citometria de fluxo.................73 Figura 24 - Visualização dos campos pelo softaware MetaXpress® HTS.....................74 Figura 25 - Análise combinada de campo pelo software MetaXpress®HTS com marcador DAPI e anti-caspase-3 marcado com ficoeritrina (vermelho).........................74 Figura 26 - Representação de resultado da imunofenotipagem com 6 anticorpos........75 Figura 27 - Curva-padrão das diferentes citocinas: TNF, IFN-ƴ, IL-4 e IL-10.................81 Figura 28 - Diferenciações adipogênica e osteogênica das CTMs pré-experimento.....84 Figura 29 - Fotos com as diferenciações das culturas de CTM.....................................85 Figura 30 - Fotos com as diferenciações das CTMs pós-experimento com LED...........86 Figura 31 - Fotomicrografias de lâminas histológicas evidenciando a diferenciação condrogênica e outras formações..................................................................................90 Figura 32 - Fotomicrografias de lâminas histológicas evidenciando a diferenciação condrogênica, formação de cartilagem e outras estruturas............................................92 Figura 33 - Imagens de nucleóides geradas pelo software Comet Assay IV.................96 Figura 34 - Fotomicrografias mostrando CTMs após teste do micronúcleo...................99 Lista de Gráficos Lista de Gráficos Gráfico 1 - Tempo de confluência a 80% em dias, entre as passagens, segundo a dose de irradiação - dissociação enzimática..........................................................58 Gráfico 2 - Tempo de confluência a 80% em dias, entre as passagens, segundo a dose de irradiação - dissociação mecânica............................................................59 Gráfico 3 - Valores médios da contagem celular para CTMs obtidas por DM, nas diferentes passagens e doses de irradiação.................................................62 Gráfico 4 - Valores médios da contagem celular para CTM obtidas por DE, nas diferentes passagens e doses de irradiação.................................................63 Gráfico 5 - Média da contagem celular (triplicata), segundo o tipo de dissociação e o tratamento realizado......................................................................................64 Gráfico 6 - Índices de apoptose e necrose em 3 amostras de CTM-TA, pré- experimento, segundo o método de dissociação..........................................68 Gráfico 7 - Índice de apoptose e necrose em CTM, segundo o método de dissociação, em 1ª passagem e nas diferentes doses de irradiação.................................71 Gráfico 8 - Valore médios de viabilidade e apoptose e necrose, pós-experimento, segundo o método de dissociação e tratamentos.........................................72 Gráfico 9 - Imunofenotipagem com diferentes marcadores de superfície: CD71, CD11b, CD45, CD90, CD44 e CD31, segundo o método de dissociação, pré- experimento...................................................................................................76 Gráfico 10 - Imunofenotipagem (expressão dos marcadores de superfície) do pool de 5 amostras dos diferentes tratamentos............................................................79 Gráfico 11 - Escore das diferenciações adipogênica e osteogênica advindas de Dissociação Mecânica - pós-experimento.....................................................88 Gráfico 12 - Escore das diferenciações adipogênica e osteogênica advindas de Dissociação Enzimática - pós-experimento...................................................89 Gráfico 13 - Resultados estatísticos dos valores da intensidade da cauda pré- experimento...................................................................................................97 Gráfico 14 - Resultados estatísticos dos valores da intensidade da cauda pós- experimento...................................................................................................97 Lista de Quadros Lista de Quadros Quadro 1 - Obtenção dos blocos de TA, métodos de dissociação e contagem celular............................................................................................................54 Quadro 2 - Indicadores de qualidade entre os métodos de dissociação enzimática e mecânica...................................................................................................55 Quadro 3 - Função de marcador CD90, CD44 e CD71 e a média percentual de perda por ação da colagenase tipo I........................................................................78 Quadro 4 - Determinação de diferentes citocinas nas CTMs obtidas por DM e DE, no pré-experimento, expresso em pg/ml, pelo método CBA Flex......................81 Quadro 5 - Determinação de diferentes citocinas em primeira e última passagem nas CTMs obtidas por DM e DE, expresso em pg/ml, pelo método CBA Flex....83 Quadro 6 - Comparação dos potenciais de diferenciação em escore de 0 a 100..........87 Quadro 7 - Avaliação do potencial de diferenciação por Escore (0 a 5 pontos) das amostras do pós-experimento induzidas à diferenciação condrogênica.......93 Quadro 8 - Perfil global de todos os tratamentos do experimento (doses e regimes de luz aplicados e tipo de dissociação) correlacionados aos indicadores biológicos avaliados.....................................................................................104 Lista de Tabelas Lista de Tabelas Tabela 1 - Comparação entre os Marcadores de superfície (CDs) expressos em CTMs de Humanos e Ratos de acordo com estudos realizados recentemente.................................................................................................23 Tabela 2 - Medidas de potência (mW)/intensidade (mW/cm²) placa de 24 poços.........42 Tabela 3 - Cálculo do desvio em relação à 30mW/cm²..................................................42 Tabela 4 - Cálculo dos tempos de exposição ao LED....................................................45 Tabela 5 - Resultados da análise dos tratamentos do pré-experimento - Mec e Enz....................................................................................................100 Tabela 6 - Resultado da análise dos tratamentos do pós-experimento - Mec e Enz...101 Sumário Sumário 1. Introdução............................................................................................................20 1.1 Células-tronco Mesenquimais..............................................................................20 1.2 A Óptica do LED e LASER: Definição e Caracterização.....................................24 1.3 Interação Luz-tecido Biológico: Aplicabilidades Dentro das Áreas Biológicas e Médicas................................................................................................................25 1.4 Justificativa............................................................................................................28 2. Objetivos..............................................................................................................30 2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................30 2.2 Objetivos Específicos............................................................................................30 3. Material e Métodos.............................................................................................31 3.1 Infraestrutura e Instalações do Laboratório..........................................................31 3.2 Obtenção e Coleta das Amostras - Tecido Adiposo.............................................32 3.3 Processamento das Amostras: Pesagem, Dissociações Mecânica, Enzimática e Plaqueamento................................................................................33 3.3.1 Avaliação do desempenho de indicadores de qualidade comparativos entre métodos de dissociação enzimática X mecânica......................................36 3.4 Contagem e Viabilidade Celular............................................................................36 3.5 Cultivo, Expansão e Criopreservação das CTMs.................................................37 3.6 Caracterizações da CTM – TA..............................................................................38 3.6.1 Caracterização por Citometria de Fluxo: Expressão de Marcadores de Superfície Celular............................................................................................39 3.6.2 Caracterização por Diferenciação em Meios Indutores – Tri-linhagem.............40 3.7 Bioestimulação in vitro: Uso do LED de Luz Contínua e Pulsátil.........................40 3.8 Testes do Experimento (Pré e Pós): Obtenção de Dados Biológicos Quantitativos e Qualitativos das Culturas de CTM..............................................47 3.8.1 Tempo de Confluência a 80%............................................................................47 3.8.2 Determinação dos Índices de Apoptose e Necrose Celular..............................47 3.8.3 Dosagem de Citocinas.......................................................................................50 3.8.4 Índice de Genotoxicidade: Teste do Cometa.....................................................51 3.8.5 Índice de Genotoxicidade: Teste do Micronúcleo..............................................52 3.9 Análise Estatística................................................................................................53 4. Resultados e Discussões..................................................................................54 4.1 Tempo de confluência a 80% - desdobramento entre passagens.......................58 4.2 Contagem e Viabilidade celular............................................................................59 4.2.1 Aspectos morfológicos das culturas do experimento........................................64 4.3 Índice de Apoptose e Necrose.............................................................................67 4.3.1 Caspase-3: via alternativa de morte celular......................................................72 4.4 Imunofenotipagem................................................................................................75 4.5 Dosagem de citocinas .........................................................................................80 4.6 Potencial de diferenciação tri-linhagem...............................................................83 4.7 Teste do Cometa: índice de genotoxicidade........................................................95 4.8 Teste do Micronúcleo: índice de genotoxicidade..................................................99 5. Conclusões.......................................................................................................105 6. Referências Bibliográficas...............................................................................107 7. Anexos........................................................................................................113 Introdução 20 1. INTRODUÇÃO O impulso biotecnológico com uso de células-tronco (CT) fez emergir nova especialidade médica: a medicina regenerativa (MR), cujas técnicas envolvem a possibilidade de substituição ou reparo de tecidos/órgãos doentes por outros desenvolvidos in vitro. Dentre os impasses que permeiam o uso da CT em medicina encontra-se o questionamento da genotoxicidade induzida pelo cultivo celular. Uma vez que a quantidade de células obtidas nem sempre são suficientes para se obter resposta terapêutica. Sabe-se que o sucesso da terapia celular com o uso de CT é dose dependente (RICHARDSON et al., 2013; DALTRO et al., 2015). O aperfeiçoamento do processo de cultivo de CT que permita a obtenção de maior número de células em menor tempo, garantindo a eficiência e a qualidade do procedimento terapêutico faz-se necessário para beneficiar progressivamente maior número de pacientes, promovendo, desta forma, o tratamento adequado e eficiente de patologias crônicas consequentes do aumento da longevidade populacional. Frente a esta questão, o presente projeto apresentou dois grandes desafios: comprovar o efeito benéfico quantitativo da fotoestimulação sobre as células-tronco mesenquimais (CTMs) em cultura associado ao tempo de exposição, bem como, comprovar seu efeito positivo proporcionado pelo aumento de secreção de citocinas e fatores de crescimento sem alterar o perfil fenotípico, o potencial de diferenciação e a integridade estrutural/ funcional do material genético das células. Diante desta situação, as tecnologias envolvendo o LED e sua capacidade comprovada de fotoestimulação, surgiram de forma oportuna para a exploração e discussão do potencial proliferativo das CTMs cultivadas sob a influência deste equipamento emissor de luz. 1.1 Células-tronco Mesenquimais Células-tronco são por definição células indiferenciadas. As principais características que as tornam muito interessantes são: a capacidade de autorrenovação, ou seja, são capazes de se multiplicar, mantendo seu estado indiferenciado, proporcionando reposição ativa e constante de sua população nos tecidos; e a capacidade de diferenciação em diversos tipos celulares, caracterizando dois tipos de divisão celular: a simétrica e a assimétrica (LEMISCHKA, 2005). 21 Segundo Vats et al. (2002), as CTs podem ser classificadas de acordo com seu potencial como: totipotentes - podem dar origem a todas as células/tecidos de formação do organismo (ex: ovo fertilizado ou zigoto); pluripotentes - originam a maior parte das células/ tecidos do organismo (ex: CT embrionárias e células germinativas embrionárias) e multipotentes - formam um número reduzido de células/tecidos que são restritos de uma camada germinativa (ex: estroma da medula óssea ou CTMs). De acordo com Vogt (2004) as aplicações das CTs estendem-se à engenharia biotecidual, que faz uso do rápido potencial de crescimento dessas células para obtenção de tecidos como ossos, pele e cartilagem. Estes tecidos são cultivados e então reimplantados em pacientes com lesões, constituindo a base da denominada terapia celular e medicina regenerativa. As CTs somáticas ou adultas (CTAs) são células indiferenciadas, raras e encontram-se em tecidos responsáveis pela regeneração (GOMES; GRINFELD, 2008). As CTAs incluem as células hematopoiéticas, mesenquimais, neurais, epiteliais, do cordão umbilical, e inúmeras outras (VATS et al., 2002). Dentre os tipos de CTAs citadas, uma se destaca nos estudos pré-clínicos e clínicos: a célula-tronco mesenquimal (CTM). Esta célula pode ser isolada de várias fontes biológicas, como o cordão umbilical, medula óssea (MO), tecido adiposo, fígado fetal (BARRY, MURPHY, 2004; KERN et al., 2006), periósteo, tecido muscular e órgãos parenquimatosos, cuja localização é perivascular nos tecidos adultos e a quantidade é pequena (MAMBELLI et al., 1999; MEIRELLES et al., 2008; ZUCCONI et al., 2009). De acordo com Barry e Murphy (2004), Kern (2006) e Pittenger (1999), as CTMs são consideradas candidatas para aplicação em terapia celular devido aos seguintes critérios: a) facilidade de coleta; b) obtenção do próprio paciente; c) alta capacidade de proliferação celular in vitro permitindo a adequação do número de células para transplante; d) capacidade multipotente de diferenciação celular; e) fácil manipulação; f) potencial de mediação do processo imune; g) habilidade de integração no tecido hospedeiro e interação com o tecido circunjacente; h) característica própria de aderência às superfícies plásticas adequadas para se multiplicarem, otimizando o processo em cultura. Além disso, deve-se considerar a facilidade de isolamento destas células e a potencialidade de emprego em transplantes alogênicos (BOBIS; JAROCHA; MAJKA, 2006). 22 Pesquisas relacionadas com as células atualmente designadas como CTMs datam dos anos 60 e 70, quando o Dr. Alexander J. Friedenstein e colaboradores iniciaram pesquisas com células fibroblásticas da medula óssea de roedores e coelhos. A cultura de CTMs em condições adequadas de cultivo exibem morfologia fibroblastóide, adesão em substrato plástico, autorrenovação e diferenciação em tipos celulares distintos. São células multipotentes capazes de se diferenciar e produzir qualquer tipo celular necessário num processo de reparação. (MENDELOW et al., 1980; PITTENGER et al., 1999; NARDI, MEIRELLES, 2006). Elas não apenas regeneram tecidos de linhagem mesenquimal como osso (CHAMBERLAIN et al., 2004; ARINZEH et al., 2003), cardiomiócitos (GRINNEMO et al., 2004), cartilagem articular e articulação do joelho (BARRY, 2003), mas também se diferenciam em células derivadas de outras camadas embrionárias, incluindo neurônios (SUGAYA, 2003), epitélios em pele, pulmão, fígado, intestino, rim, e baço (CHAPEL et al., 2003; DENG et al., 2003; ORTIZ et al., 2003). Tais características de plasticidade sugerem que a CTM seja responsável pelo turnover e manutenção dos tecidos do organismo (CAPLAN, 2009). Elas tornaram-se foco de muitas pesquisas por gerar perspectivas clínicas promissoras à terapia celular (MONTEIRO et al., 2009). As CTMs expressam um grande número de moléculas bioativas como as moléculas de adesão, as proteínas de matriz extracelular, os receptores para fatores de crescimento e secretam citocinas por elas produzidas permitindo interações com demais células (HUSS, 2000; BOBIS et al., 2006). Essas moléculas atuam modulando a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual (WAN et al., 2008; CAPLAN, 2009). Os marcadores de superfície estão presentes, em conjunto, em todas as células do organismo, caracterizando a singularidade biológica e a marca das células que os contêm (COVAS, 2006). Contudo, as CTMs apresentam poucos marcadores imunofenotípicos específicos (ALHADLAQ; MAO, 2004; MEIRELLES et al., 2006), sendo sua caracterização baseada na identificação de um perfil de marcadores específicos e não específicos. As CTMs humanas e de rato demonstram ser CD34, e alguns trabalhos relatam variações na expressão de CD34 em murinos (PEISTER et al., 2004). É geralmente aceito que todas as CTMs são desprovidas do marcador hematopoiético CD45 e do endotelial CD31 (CHAMBERLAIN et al., 2007). A tabela 1 lista os marcadores de superfície de CTM típicos de cada espécie. 23 Tabela 1 - Comparação entre os Marcadores de superfície (CDs) expressos em CTMs de Humanos e Ratos de acordo com estudos realizados recentemente Tabela comparativa de Marcadores de Superfície (CDs) de CTMs HUMANOS RATOS Expressar Não Expressar Expressar Não Expressar CD71 CD11b CD90 CD11b CD73 CD14 CD44 CD31 CD90 CD18 CD71 CD45 CD105 CD31 CD44 CD34 Stro-1 CD40 CD106 CD45 CD166 CD80 CD29 CD86 Antígenos leucocitários (HLA-DR) Fonte: Woodbury et al., 2000; Peister et al., 2004; Chamberlain et al., 2007; Bydlowski et al., 2009; Polisetti et al., 2010 Existem diversos estudos referentes à manipulação, cultivo e aplicação de CTMs de rato, Alhadlaq et al. (2004) investigaram a possibilidade de criar côndilos articulares na forma humana usando CTMs de MO de rato. Obtiveram resultados que reforçam a possibilidade de substituir esses tecidos degenerados por CTMs adultas. Em outra pesquisa realizada, foram isoladas CTMs de ratos a partir da MO, sinóvia, periósteo, gordura e músculo e comparadas as propriedades de rendimento, expansão e multipotencialidade adipogênica, condrogênica e de calcificação e determinada a fonte de células adequada para cada característica. (YOSHIMURA et al., 2007). Woodbury et al. (2000) demonstraram o potencial de diferenciação de CTM da MO humana e de rato adultos em neurônios. Isso prova que se pode induzir tais células a superar o compromisso mesenquimal e constituir um reservatório celular abundante e acessível para tratar várias doenças neurológicas. A necessidade crescente do uso de CTs em MR resgata a importância da terapia celular como atividade inter e transdisciplinar. Sob este prisma, destaca-se a contribuição e grande importância da biofotônica, que faz convergir atividades da física 24 quântica, da química e da biologia. O surgimento de diodos emissores de luz, os LEDs (Light Emitting Diode), é considerado como a terceira revolução da óptica que trouxe à luz o conhecimento de que moléculas e estruturas biológicas interagem com a luz modificando seu comportamento causando microalterações que fazem a célula redirecionar seu curso no ciclo vital. Este potencial tem sido utilizado em medicina, odontologia e biologia no tratamento de doenças, no controle de infecções e como bioestimulador e biofotoseleção. Fez-se necessária, portanto, uma revisão sobre diodos (BAGNATO, 2008, p. 11-12). 1.2 A Óptica do LED e LASER: Definição e Caracterização A óptica é um campo da física que lida não somente com a propagação da luz, mas também com a produção da luz e, principalmente, seus mecanismos de interação com a matéria. A grande aplicabilidade da óptica hoje em dia deve-se, bastante, à existência do raio LASER (Light Amplified by Stimulated Emission Radiation). Funcionando como fonte de luz de características únicas, o LASER possui propriedades especiais que o tornam um excelente instrumento de uso científico e tecnológico nas áreas ligadas à saúde (BAGNATO, 2001). O LASER representa um dispositivo constituído por substâncias de origem sólida, líquida ou gasosa que produzem um feixe de luz, frequentemente conhecido como “raio LASER”, quando excitadas por uma fonte de energia. É considerado um instrumento de altíssima precisão geométrica, aumentando, assim, sua aplicabilidade (BAGNATO, 2008). Tal dispositivo pode ser classificado em duas categorias: LASER de alta potência ou cirúrgico, com efeito térmico, apresentando propriedade de corte, vaporização e hemostasia, e LASER de baixa potência ou terapêutico, com propriedade analgésica, anti-inflamatória e de bioestimulação (SILVA et al., 2007; BARROS et al., 2008). Os LEDs de potência são diodos emissores de luz que funcionam diferentemente da emissão de luz comum. Isso ocorre porque a emissão de luz do LED é oriunda de uma recombinação de elétrons com defeitos (buracos) no momento da passagem de corrente elétrica em um determinado material semicondutor. Os LEDs apresentam grandes vantagens que os tornaram destaque para uso em outros campos da ciência e tecnologia, sendo elas: longa duração, facilidade e conveniência de uso, alta potência gerada e não poluentes ao ambiente (sem mercúrio), podem ser 25 produzidos em tamanhos muito pequenos, permitindo seu uso em equipamentos e dispositivos portáteis, além de garantirem o avanço tecnológico necessário para os campos biomédicos (BAGNATO, 2008, p.13-14). A figura 1 mostra uma linha do tempo sobre surgimento do LASER e LED dentro da ciência desde a antiguidade até os dias atuais e as aplicabilidades dos mesmos em várias áreas da ciência, tecnologia e comunicação, evidenciando a grande importância dessa evolução. Figura 1 – Linha do tempo do surgimento e aplicabilidades do LASER e LED nas ciências, tecnologia e comunicação. Fonte: MION, W. 2014 1.3 Interação Luz-tecido Biológico: Aplicabilidades Dentro das Áreas Biológicas e Médicas Recentemente, a utilização do LASER de baixa energia (LBE) vem sendo pesquisada por inúmeros autores como medida adjuvante na cicatrização de feridas de partes moles. Tem sido sugerido que o LBE aumenta o metabolismo celular, estimula a fosforilação oxidativa e reduz a resposta inflamatória local, alterando positivamente as propriedades eletrofisiológicas do tecido irradiado (CAPON et al, 2001; REDDY, 2003). Estudos in vitro de culturas de queratinócitos revelaram que o LBE estimula a liberação de citocinas (IL-6 e IL-8) e fatores de crescimento e diferenciação (FGF – fibroblast growth factor) envolvidos no processo de reparo cutâneo (PEREIRA et al., 2002; MOORE et al., 2005). 26 Segundo Genovese (2000), os efeitos biológicos que o LBE ou terapia a LASER de baixo nível (LLLT) provoca nos tecidos consistem em energia luminosa, que se deposita sobre os mesmos e se transforma em energia vital, produzindo efeitos primários, secundários e terapêuticos gerais (natureza analgésica, anti-inflamatória e cicatrizante). Na figura 2 pode-se observar uma representação desta ação da luz sobre a célula nos comprimentos de onda que variam do vermelho (600 nm) ao infravermelho (950 nm) e os respectivos efeitos gerados sobre elas. Figura 2 - Ilustração da ação da luz de 600 a 950 nm sobre a célula e seus efeitos subsequentes Fonte: HAMBLIN, M. R; DEMIDOVA, T. N., 2006 - http://proceedings.spiedigitallibrary.org/ Terms of Use: http://spiedigitallibrary.org/ss/TermsOfUse.aspx O uso do LED como recurso terapêutico ampliou-se na última década. Estudos desenvolvidos pela NASA (National Aero Space Agency), nos Estados Unidos, demonstraram fortes evidências de que a eficiência dos LEDs em processos de fotoestimulação celular e de proliferação celular in vitro é semelhante à do LASER de baixa intensidade (VINCK et al., 2003). Ambos LASER e LED são utilizados para diferentes tipos de aplicações no diagnóstico e tratamento de doenças ou mesmo por bioestimulação da regeneração de tecidos. Mais recentemente, o LASER tem provado ser uma excelente ferramenta terapêutica, possuindo capacidade biostimuladora, bem http://br.mg5.mail.yahoo.com/neo/#_ENREF_47 27 como fazendo parte de terapias modernas, como a terapia fotodinâmica (PDT) entre outros (BAGNATO et al, 2006). O princípio da bioestimulação promovida pelo LASER terapêutico foi introduzido há mais de 20 anos, sendo aplicado, inicialmente, na dermatologia, no processo de reparo de feridas cutâneas. Logo após, sugeriu-se que a bioestimulação também poderia ser útil para acelerar a cicatrização de feridas de dentro da boca (CATÃO, 2004; CAMELO, 2007). Dos efeitos bioestimulantes mediados pelo LASER de baixa potência no reparo tecidual, destacam-se: indução da atividade mitótica das células epiteliais e fibroblastos; estímulo à produção de colágeno por estas últimas células; inibição secretória de alguns mediadores químicos; modificação da densidade capilar e estímulo à microcirculação local (SILVA et al., 2007; MALUF et al., 2006; CONLAN, RAPLEY, COBB, 1996; WALSH, 1997). A figura 3 mostra efeitos secundários desencadeados pela ação inicial do LED sobre a CTM, efeitos esses de extrema relevância e necessidade para processos de cultura celular. Figura 3 - Imagem representando os efeitos produzidos pela CTM pelo estímulo com LED Fonte: adaptado de University of Birmingham (2015) - . 28 Evidências recentes sugerem que a irradiação com laser de baixa energia também poderia aumentar a proliferação de células-tronco em cultura, incluindo CTMs, CTs cardíacas e da polpa dentária (GIANNELLI et al, 2012). Estudos sugerem que a aplicação de um único tratamento com LED de 660 nm aumenta a atividade de fase inicial do DNA e promove a proliferação celular de células de osteoblastos in vitro (CANKAYA et al., 2011). Kim et al. (2009) relataram uma diferenciação muito mais rápida em culturas de osteoblastos de fase inicial após tratamento com LED. Também observaram que o aumento da atividade da fosfatase alcalina influenciou na diferenciação precoce de células progenitoras e estimulou a proliferação celular, resultando numa alta contagem de células na fase inicial. Outro estudo importante que traduz a ação da luz do LASER foi desenvolvido por Barbosa et al. (2011). Neste trabalho, foi avaliada a função mitocondrial de fígado remanescente (princípio da regeneração) em ratos após hepatectomia à 70%, com uso do LASER em 660 nm. Observou-se que o LASER revelou efeito positivo: não induziu lesão ao fígado remanescente, além de parecer retardar a sobrecarga hepatocelular do mesmo. Como se trata de uma pesquisa inovadora, as informações adicionais na literatura especializada surgem a cada dia. Diante disto destacam-se algumas pesquisas recentes. Ong et al. (2013), na Biomaterials, intitulado The activation of directional stem cell motility by green light-emitting diode irradiation, conclui que as células-tronco mesenquimais são sensíveis ao LED verde que induz a migração celular direcionada. No presente projeto, propôs-se o uso do LED vermelho (630 nm). Barboza et al. (2014) publicaram o artigo Low-level laser irradiation induces in vitro proliferation of mesenchymal stem cells concluindo que o laser de baixa potência bioestimula as células-tronco mesenquimais de rato, sem ocasionar dano no núcleo corroborando com os dados de Giannelli et al. (2013) no artigo Photoactivation of bone marrow mesenchymal stromal cells with diode laser: effects and mechanisms of action, publicado no ano passado. 1.4 Justificativa Tendo em vista a rápida progressão dos protocolos clínicos na pesquisa usando CTMs, cultivá-las sem provocar dano de DNA e tumorigênese, proporcionaria o uso das mesmas, em quantidades terapêuticas adequadas, em menor espaço de 29 tempo. A validação da bioestimulação de CTMs com uso de LEDs resultaria no uso das mesmas em doenças agudas, em especial traumas medulares, infarto agudo do miocárdio, acidentes vasculares cerebrais, feridas crônicas e agudas, etc. Uma vez indicado o uso das CTMs, para se obter em condições normais de cultura as quantidades adequadas, seriam necessários de 20 a 30 dias de cultivo, período este em que determinadas lesões já estabeleceram sequelas crônicas. As informações mais recentes corroboram a hipótese formulada para este trabalho de que a fotoestimulação seja uma grande aliada da Medicina Regenerativa contribuindo com a expansão de células-tronco mesenquimais em menor espaço de tempo. Diante do exposto, deve-se destacar a importância da biofotônica para a área biomédica, dentre elas a associação à cultura celular, pois pode apresentar soluções de otimização de processos que determine melhor viabilidade econômica das terapêuticas envolvendo a medicina regenerativa, sejam elas a terapia celular com uso de CTs, órgãos reestruturados pela engenharia de tecidos ou imunomodulação com o uso de citocinas produzidas pelas CT. 30 Objetivos 31 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Avaliar a ação do LED, emitindo luz em 630 nm, como bioestimulador de CTM em cultura em duas diferentes situações: exposição à luz contínua e à luz pulsátil. 2.2 Objetivos Específicos  Avaliar o desempenho de indicadores de qualidade comparativos entre métodos de dissociação enzimática X mecânica.  Estabelecer parâmetros quantitativos e qualitativos das CTMs pelo uso do LED como bioestimulador: - determinar a contagem, viabilidade e o tempo de confluência em cultura a 80%; - caracterizar a expressão de marcadores de superfície; - estabelecer o índice de apoptose e necrose; - monitorar a secreção de citocinas; - determinar o potencial de diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica; - analisar o índice de dano do DNA. 32 Material e Métodos 33 3. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Engenharia Celular (LEC), associado ao Programa de Pós-graduação em Pesquisa e Desenvolvimento (Biotecnologia Médica) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), campus de Botucatu. As culturas celulares seguiram critérios estabelecidos pelo Procedimento Operacional Padrão (POP) do LEC do Hemocentro de Botucatu e este trabalho recebeu aprovação pelo Comitê de Ética em pesquisa no uso de animais da FMB (CEUA), cujo número de protocolo recebido foi nº 1009/2013. 3.1 Infraestrutura e Instalações do Laboratório O Laboratório de Engenharia Celular do Hemocentro conta com a instalação de dois laboratórios internos de uso contínuo: LAC (Laboratório de Atividades Complementares) e Área Limpa, na qual foram realizadas todas as etapas de isolamento e cultura celular bem como o experimento com o LED. O LAC integra a seção de Biotecnologia do Hemocentro de Botucatu e iniciou suas atividades em dezembro de 1992. Durante este período, fontes de financiamento de pesquisas vigentes no país, em especial FAPESP, CNPq, BNDES, FINEP e FNS deram suporte à pesquisa. As atividades tiveram um primoroso crescimento dando hoje origem a três diferentes linhas de atuação. São elas: a) cultura de células-tronco de diferentes espécies, b) obtenção de anticorpos monoclonais murinos, c) produção de curativos bioativos com foco na terapêutica humana. Essas três linhas de pesquisa ocupam uma área correspondente a 1200m² classificados nas categorias: Laboratório convencional ou standard – LAC, onde são desenvolvidas as atividades: viabilidade celular, contagem celular, técnica de ELISA, preparo de tampões, eletroforese de proteínas em gel de agarose ou poliacrilamida, purificação de proteínas pela técnica de cromatografia de afinidade, Western blotting, imunodifusão (Ouchterlony), imunofenotipagem, técnicas de hemaglutinação, entre outras. Área Limpa classificada 10.000. Laboratório de contenção de nível III de segurança, P3 ou BSL-3 dentro da classificação internacional do matiz da OMS de laboratórios segundo a periculosidade, presença ou não de medidas preventivas e de vacinação além do risco para o meio ambiente e para o homem. Esta área possui 34 sistema de ar filtrado sob pressão positiva com filtros HEPA, apresenta vestiário específico com ducha na entrada e colocação de equipamentos de proteção individual (EPIs) de circulação interna. 3.2 Obtenção e Coleta das Amostras - Tecido Adiposo Os fragmentos de tecido adiposo (TA) foram obtidos de ratos da linhagem Wistar, provenientes do Biotério Central da FMB, animais saudáveis, peso variável de 250g a 350g, machos, com idade média de 3 meses. O número amostral estabelecido estatisticamente foi de 15 animais, após análise detalhada do projeto com bioestaticista, Prof. Dr. Carlos Roberto Padovani, do Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu. Este alto número, em razão da grandeza do experimento, trouxe consequente aumento das atividades de obtenção, dissociação e cultura das células para expansão. Nem todos os animais liberados para o experimento estavam no peso ideal (próximo aos 400 g) determinado para a coleta do tecido adiposo. Diante disso, os mesmos foram colocados em regime de engorda e receberam o tratamento com ração adequada, água e condições ambientais necessárias até atingirem o peso ideal. O procedimento foi realizado na sala de cirurgia do Biotério da Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) sob supervisão e auxílio de médico veterinário e de zootecnista responsáveis pelo setor. Os animais foram anestesiados com os medicamentos injetáveis Dopalen® à base de Ketamina (80 mg/Kg) e Anasedan® à base de Xilazina (5 mg/Kg) e higienizados com álcool 70° iodado para assepsia e prevenção de contaminação. Os animais foram operados com o uso de campo cirúrgico, luvas e instrumentação cirúrgica estéril (pinças de dissecção anatômica, Kelly e dente de rato, tesouras Metzenbaum, cirúrgica fina-fina e romba-romba, bisturi, cabo de bisturi e gaze) dentro de capela de fluxo laminar para garantir um procedimento estéril (Figura 2). Os blocos de tecido adiposo coletados foram provenientes da região inguinal dos animais (dos lados direito e esquerdo) e, imediatamente após a coleta, foram colocados em tubo cônico estéril de 50 mL, contendo meio HEPES, suplementado com antibiótico e antimicótico específicos (penicilina, streptomicina e anfotericina), para acondicionar o material biológico (Figura 4). 35 Os tubos contendo a gordura foram transportados em caixas isotérmicas para o Laboratório de Engenharia Celular (LEC) onde o material biológico foi processado. Na primeira etapa do início do processamento, a amostra de gordura foi colocada em laboratório de Quarentena, sob refrigeração à +/- 4ºC durante 24 horas. Este procedimento se faz necessário para se minimizar as contaminações eventuais que possam ter ocorrido durante o período de coleta. Desta forma, a amostra só foi transferida para Área limpa a fim de ser manipulada, após ser confirmada a “não contaminação”. Figura 4 – Fotos da obtenção do TA de rato em fluxo laminar Legenda – A imagem à esquerda representa o procedimento cirúrgico em fluxo laminar e a imagem à direita mostra o bloco de tecido adiposo recém-coletado para armazenamento em geladeira por 24 h e posterior procedimento de dissociação. Fonte: arquivo pessoal, 2014. 3.3 Processamento das Amostras: Pesagem, Dissociações Mecânica, Enzimática e Plaqueamento O bloco inteiro de tecido adiposo de cada animal, após 24 horas de manutenção em geladeira, destinou-se à manipulação no equipamento Fluxo Laminar (Trox® Technik) da sala de quarentena do LEC, sob condições estéreis. Procedeu-se, então, à lavagem dos blocos de TA com cloreto de sódio 0,9% e com auxílio de uma pinça para segurar o tecido. O bloco de TA foi colocado em placa de Petri de plástico estéril com tampa e pesado em balança analítica (GR200 modelo D0001, A&D Company®). Os pesos da gordura total coletada de cada animal foram registrados. Após a pesagem, o bloco de TA foi dividido em duas partes ligeiramente diferentes com auxílio de tesoura 36 dentro do fluxo laminar, sendo novamente pesados e destinadas às técnicas de dissociação mecânica e enzimática, afim de se obter maior número de células-tronco mesenquimais. Todo o material utilizado nessa etapa de manipulação e processamento das amostras estava sob condição estéril. Para a dissociação mecânica, o bloco de tecido adiposo foi colocado em berço plástico estéril com pequena quantidade de HEPES e cortado com uso de tesoura cirúrgica em pequenos fragmentos. Com o uso de um par de cell scrapper (Nunc®), foi feita a fixação dos fragmentos de TA com a mão esquerda e com a direita foram realizados movimentos suaves, com leve pressão sobre o tecido, seguido de “raspagem” para a remoção e isolamento das células (Figura 5). Figura 5 - Fotos do processo de dissociação mecânica com tesoura e cell scrapper Legenda – (A) corte do bloco de TA com tesoura; início da dissociação. (B) dissociação própria com uso do cell scraper, para raspagem do TA e desprendimento das CTMs. Fonte: arquivo pessoal, 2014. Após tal procedimento, esse conteúdo formado por células, vesículas de gordura, fragmentos celulares e HEPES foi sugado por uma seringa e permaneceu sob descanso por 15 minutos com o bisel direcionado para baixo, para que, nesse intervalo de tempo, houvesse a decantação do conteúdo celular embebido em meio e o sobrenadante repleto de restos celulares (debris) ficasse separado Em seguida, o conteúdo celular (porção inferior da seringa), foi destinado aos processos de lavagens, contagem e plaqueamento. 37 Para a dissociação enzimática, que consiste na obtenção de células através de processamento químico (enzimático) do tecido de interesse, o bloco de tecido adiposo foi lavado abundantemente com solução fisiológica, colocado em placa de Petri estéril com pequena quantidade de HEPES e cortado em fragmentos com uso de tesoura cirúrgica. Esses fragmentos, juntos, foram pesados em balança de precisão (GR200 modelo D0001, A&D Company), embebidos em meio HEPES e reservados em fluxo laminar. Paralelamente, procedeu-se a preparação da solução contendo a enzima colagenase tipo I. A colagenase tipo I é responsável por quebrar ligações entre aminoácidos neutros e glicina na sequência Pro-X-Gly-Pro, encontradas em alta frequência nas fibras colágenas de tecidos conjuntivos como pele tendões, vasos sanguíneos e osso, atuando de forma satisfatória sobre a digestão de gordura, adrenais, fígado e outros tecidos (Gibco®). Uma solução de 2 mg de colagenase/mL de HEPES foi preparada em fluxo laminar de acordo com o peso do TA de cada amostra animal. Utiliza-se 2 mL de meio HEPES por grama de tecido adiposo pesado. Diluiu-se a colagenase no meio HEPES, obtendo-se a solução final de 2 mg/mL. Em seguida, procedeu-se a sua homogeneização e filtragem em filtro de 0,45 µm (BD®), com intuito de eliminação de debris. Depois, os fragmentos de TA reservados em fluxo laminar foram adicionados à solução enzimática. O tubo foi levado à estufa a 37°C com 5% de CO2 permanecendo overnight por 15 horas. No dia seguinte, pela manhã, adicionou-se igual volume de meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) para a inativação enzimática e interrupção do processo de dissociação. No processo de lavagem, após ambas as dissociações, os tubos cônicos com o conteúdo celular foram centrifugados à 1200 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente em Centrífuga Eppendorf®, levando a formação de um botão celular (pellet), que representa um conjunto de células sedimentadas no fundo do tubo e que será destinado ao plaqueamento em frascos plásticos de cultura aderente (TPP®) de 25cm2 na presença do meio de cultura DMEM-F12 (Dulbecco’s Modified Minimal Essential Médium - Invitrogen®) acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (Invitrogen®) (total de 6mL) de acordo com os resultados da contagem. Os frascos com as células foram mantidos em estufa apropriada a 37C com atmosfera úmida controlada a 5% de CO2 e 95% de oxigênio. 38 3.3.1 Avaliação do desempenho de indicadores de qualidade comparativos entre métodos de dissociação enzimática X mecânica. Foram estabelecidos indicadores de qualidade para a análise de custo X benefício, comparativos, entre os métodos de dissociação. Os indicadores foram:  Tempo médio em horas: - homem/hora/trabalho; - obtenção;  Número de LMN/g de tecido;  Facilidade/Dificuldade operacional;  Habilidade do manipulador;  Risco de contaminação;  Custos diretos/amostra. 3.4 Contagem e Viabilidade Celular Esses parâmetros são essenciais na prática da cultura celular. Tal procedimento deve ser realizado primeiramente ao final do processo de isolamento celular (por meio das dissociações), a cada tripsinização ou experimento do qual se necessita saber a quantidade aproximada de células por área do frasco. Além disso, também é realizada quando se procedem as técnicas de criopreservação. A contagem celular foi realizada por contador Automático (CA), Countess™. Na contagem automática, o equipamento Countess™ utiliza-se das propriedades da ótica e análise de imagem para automatizar a contagem celular, possibilitando ainda a quantificação em porcentagem da viabilidade da amostra (células vivas, mortas, e o número total) com rigor e precisão, utilizando a técnica de azul de tripan como corante padrão. O contador leva 30 segundos por amostra para a contagem das células e é compatível com uma grande variedade de células eucarióticas fornecendo informação sobre tamanho da célula. Uma única medição, em 30 segundos fornece: concentração de células vivas e mortas/mL concentração total de células/mL, viabilidade, porcentagem de células vivas para as células totais. A figura 6 abaixo mostra a câmara de contagem que é inserida no aparelho (à esquerda). 39 Figura 6 - Câmara de contagem para o contador automático e modelo ilustrativo Countess BD®. Fonte: arquivo pessoal, 2013. 3.5 Cultivo, Expansão e Criopreservação das CTMs O conteúdo celular total, proveniente dos 2 métodos de dissociação, foi destinado à cultura para posterior expansão das CTMs em número e passagens (repicagens), que determinam o amadurecimento cronológico ou fisiológico (envelhecimento/senescência celular). Para a manutenção e crescimento celular, as células nos frascos foram tratadas com meio de cultura DMEM-F12 contendo aditivos necessários e específicos (antibióticos, antimicóticos, aminoácidos, entre outros) para CTMs e a troca do mesmo foi realizada 2 vezes por semana, por meio da aspiração e reposição de meio novo (SOUTO, KOMMERS et al., 2006). Uma vez por semana e antes da troca do meio, cada frasco foi observado por microscopia invertida utilizando microscópio Axiovert 200-Zeiss. A observação microscópica semanal das células em cultura foi realizada para controle e prevenção de possíveis contaminações dos frascos por bactérias, micoplasmas e fungos diversos que podem estar presentes em nossa pele, materiais de laboratório, equipamentos de proteção individual, ar e superfícies. Durante essas observações, fotografias foram tiradas para registrar o crescimento e aspecto das células, as características da cultura, a confluência celular (percentual da área de distribuição celular na superfície aderente do frasco), a presença de debris celulares, e até mesmo de possíveis agentes contaminantes do meio. Quando a cultura atingia confluência  80%, as células eram submetidas ao tratamento enzimático com uso da enzima Tripsina EDTA 0,25% (Gibco®) para 40 proceder à passagem (repicagem) para outro frasco com superfície a fim de expansão celular numérica. A tripsinização é realizada em fluxo laminar e tem início com a lavagem dos frascos com HEPES. Em seguida, o HEPES é aspirado e a tripsina é adicionada ao frasco, que permanece em estufa por alguns minutos, até ocorrer desprendimento das células da superfície aderente do frasco e posterior observação em microscópio para confirmar tal evento. Realiza-se a inativação enzimática adicionando-se ao frasco meio HEPES com 10% de SFB (o dobro da quantidade de tripsina). Esse meio de cultura com células é destinado à lavagem (centrifugação à 1200 rpm por 10 minutos). Após isso, o pellet celular é ressuspenso em HEPES e destinado à contagem e plaqueamento em novo frasco com DMEM-F12. A partir do momento em que as células atingiram a 2ª passagem durante a expansão, elas passaram a ser plaqueadas e cultivadas em placas de 24 poços. Como houve interesse em formar um banco de células congeladas durante a expansão e cultivo celular para preservação de todas as amostras, as células foram criopreservadas em freezer - 80°C (Thermo®) e posteriormente destinadas ao congelamento em containers apropriados contendo nitrogênio líquido a - 196°C. Para tanto, ao final do procedimento de tripsinização celular, o conteúdo celular destinado ao congelamento foi ressuspenso com 1,5 mL de SFB acrescido de 10% de solução criopreservante, o DMSO (dimetilsulfóxido) e colocado em tubo de congelamento e, imediatamente, armazenado em freezer - 80°C. 3.6 Caracterizações da CTM - TA Desde o plaqueamento inicial, ou seja, após as dissociações mecânica e enzimática, as células foram cultivadas por 4 passagens consecutivas para expansão e obtenção de células-tronco mesenquimais para o início do experimento proposto com a irradiação do LED (Light Emitting Diode). Para tanto, houve a necessidade de se comprovar a identidade de CTMs cultivadas por meio de 2 métodos específicos e tradicionais: a imunofenotipagem e a análise do potencial de diferenciação. Tendo em vista a experiência do LEC na obtenção e caracterização das CTM, com métodos padronizados e com Procedimentos Operacionais Padrão bem estabelecidos nos laboratórios de Engenharia Celular e Citometria de Fluxo. 41 3.6.1 Caracterização por Citometria de Fluxo: Expressão de Marcadores de Superfície Celular A citometria de fluxo é um sistema multiparamétrico de análise que utiliza do laser para analisar partículas suspensas em meio líquido sob fluxo contínuo. A imunofenotipagem por citometria de fluxo é uma técnica capaz de acessar e analisar populações heterogêneas de células com o propósito de identificar a presença e proporções de várias populações de interesse. Anticorpos marcados com fluorocromos identificam as células pela detecção de antígenos específicos expressos por essas células, chamados marcadores. Esses marcadores são proteínas de membrana envolvidas em comunicação celular, adesão ou metabolismo. Alguns marcadores celulares imunológicos são marcadores de superfície sendo comumente utilizados para detecção em citometria de fluxo para populações imunologicamente específicas e subpopulações. A caracterização imunofenotípica foi realizada nas CTMs após 4 passagens de cultura. A avaliação se deu a partir de um painel imunofenotípico multicolor composto pelos marcadores positivos CD90-PERCP, CD44-FITC e CD71- FITC e negativos CD11b-APC, CD31-PE e CD45-PE (WOODBURY et al., 2000; PEISTER et al., 2004; POLISETTI et al., 2010). Tais marcadores foram analisados por trios de fluorocromos distintos, sendo eles FITC (isotiocianato de fluoresceína), PE (ficoeritrina), APC (Aloficocianina) e PERCP (Proteína Clorofila Peridinina). As análises FORAM processadas no equipamento FACSCalibur da BD, constituído de 4 detectores de fluorescência, do Laboratório de Citometria de Fluxo do Hospital das Clínicas (HC) de Botucatu. Foi utilizado o software CellQuest Pro, perfazendo avaliação multiparamétrica, incluindo tamanho celular, granulosidade e co- expressão de marcadores de superfície concomitantes. As amostras preparadas para o ensaio continham 105 células por tubo. Todos os anticorpos utilizados foram da marca BD® com afinidade para antígenos de rato. As células foram lavadas com solução isotônica, marcadas com o trio de anticorpos determinados (1º trio: CD90, CD44 E CD31; 2º trio: CD71, CD11b e CD45) e após 15 minutos de incubação, fixadas com paraformaldeído (BD®) e levadas para leitura em citômetro de fluxo. 42 3.6.2 Caracterização por Diferenciação em Meios Indutores – Tri-linhagem As CTMs obtidas após cultura por 4 passagens foram destinadas ao teste de comprovação do potencial de diferenciação das CTM em 3 diferentes tipos celulares: adipócitos, condrócitos e osteócitos. Para tanto, foram submetidas à ação de 3 diferentes meios indutores específicos para cada diferenciação, sendo eles: Stempro® adipogen., Stempro® chondro. e Stempro® osteogen. (Life technologies™) segundo instruções do fabricante. Alíquotas de CTM foram colocadas em presença de meio indutor específico. Para a diferenciação condrogênica, após 21 dias de indução, as células foram coradas com Alcian blue®, que coram deposições de colágeno, e contra coradas com HE (Hematoxilina-Eosina); para a diferenciação adipogênica, após 14 dias de indução, foi procedida a coloração citoquímica Oil red O®, que possui afinidade com gotículas de lipídeo, enquanto que para a diferenciação osteogênica, após 14 dias de indução, utilizou-se o corante Alizarin red®, que cora fragmentos de cálcio. As trocas dos meios indutores de cada placa de 24 poços foi realizada 2 vezes na semana, além de registros fotográficos durante a evolução da diferenciação. 3.7 Bioestimulação in vitro: Uso do LED de Luz Contínua e Pulsátil As culturas celulares estabelecidas até a 4ª passagem foram preparadas e destinadas ao experimento proposto. As irradiações foram realizadas com auxílio de 2 equipamentos portáteis tipo protótipo, também conhecidos como mesas difusoras “biotable” (Figura 7), com potência de 30 mW/cm2, constituída por LEDs (Light Emitting Diode) que emitem luz em 630 nm (visível ao olho humano na cor vermelha), sendo um equipamento com emissão de luz contínua e outro de pulsátil, de propriedade do Centro de Pesquisa em Óptica e Fotônica (CEPOF) do Instituto de Física de São Carlos (IFSC) da Universidade de São Paulo (USP), com o qual foi estabelecida parceria neste projeto de pesquisa e com outros projetos do Laboratório. 43 Figura 7 - Detalhe das biotables produzidas pelo CEPOF/LAT e da irradiação dentro da estufa Legenda – (A) protótipo da biotable constituída por 24 câmaras de LED, ligada à fonte. (B) biotable ligada. (C) biotable instalada dentro da estufa para irradiação. (D) placa de cultura de 24 poços pronta para irradiação.Fonte: arquivo pessoal, 2015 As biotables foram desenvolvidas e validadas pela equipe do CEPOF/LAT (Laboratório de Apoio Tecnológico) em projeto de parceria estabelecido com Prof. Dr. Vanderlei Salvador Bagnato e sua equipe. Para avaliar a variabilidade da bioestimulação das células em cultura, foram escolhidas e estabelecidas, mediante estudos da literatura, as doses 1,0; 3,0; 5,0 e 10,0 J/cm² (RENNO et al., 2007; TUBY et al., 2007, 2008). A metodologia de aplicação do LED nas culturas in vitro seguiram as normas de segurança de acordo com a resolução da ANVISA RDC nº 185/01. Essas biotables utilizadas no experimento foram projetadas especificamente para receber placas de cultura de 24 poços. Para tanto, antes do uso do equipamento o grupo do LAT realizou uma avaliação da potência com uso do Power meter, modelo LabMax_TOP fabricado pela Coherent, e o sensor LM2-VIS, que mede até 50 mW e comprimento de onda de 400 nm até 1064 nm, com área de 0,49 cm². O erro estimado 44 para estas medidas foi de ± 10%. Foi necessária também a avaliação da potência e intensidade de luz para cada poço. Para avaliar se a variação de intensidade de luz entre os poços da extremidade com a região central da placa seria significativa realizou-se a medida individual para cada poço em cada posição de potência. De acordo com as tabelas 2 e 3 de dados das biotables fornecidas pelo relatório de manutenção do LAT, foi obtido valor médio de intensidade luminosa 30,92 mW/cm2 dos 24 poços e valor médio de desvio relativo da intensidade luminosa de 103,04% dos 24 poços, igualmente. Tomaram-se as 2 médias como base fundamental de parâmetro para estabelecer um padrão de valores a serem considerados mediante às análises e testes do experimento. Tabela 2 - Medidas de potência (mW)/intensidade (mW/cm²) placa de 24 poços 24 Poços / Intensidade Luminosa (mW/cm²) 1 2 3 4 5 6 A 28,92 31,73 32,42 30,87 31,28 28,61 B 28,85 31,81 31,16 31,38 30,03 29,13 C 32,08 31,34 33,31 32,75 28,53 29,70 D 32,43 31,48 33,65 33,25 29,60 27,91 Fonte: CEPOF/LAT-USP, 2015 Tabela 3 - Cálculo do desvio em relação à 30 mW/cm² Desvio relativo da Intensidade Luminosa 1 2 3 4 5 6 A 96% 106% 108% 103% 104% 95% B 96% 106% 104% 105% 100% 97% C 107% 104% 111% 109% 95% 99% D 108% 105% 112% 111% 99% 93% Fonte: CEPOF/LAT-USP, 2015 Avaliando as intensidades individuais de todos os poços para as placas, observou-se que há uma pequena variação entre as medições aferidas, o que poderia se tornar crítico para a realização de experimentos in vitro. Para avaliar se esta diferença é ou não significativa deve-se avaliar em um primeiro momento as diferenças encontradas entre os tratamentos nas diferentes localidades da placa. Isto é, deve-se validar primeiramente a resposta de sobrevivência frente à luz nas diferentes 45 localidades da placa. Outra hipótese seria padronizar os experimentos em função da dose de luz. Isto é, nas aplicações clínicas utiliza-se uma intensidade maior em um tempo menor e em cultivo celular pode-se utilizar uma intensidade menor em um tempo maior. Deste modo os dois tratamentos seriam utilizados em uma mesma dose de iluminação. Frente aos resultados dessas análises das biotables, decidiu-se realizar durante o experimento com irradiação a formação de pool dos 24 poços para todos os procedimentos, incluindo a evolução das passagens (tripsinizações), contagens celulares, congelamentos, coleta de sobrenadante de cultura e preparo para os testes (indicadores biológicos) determinados no trabalho (Apoptose e Necrose, Dano de DNA, Imunofenotipagem e Potencial de Diferenciação). Desta maneira houve uma padronização dos resultados, neutralizando as interferências que poderiam ocorrer, sem a necessidade de se estender a padronização dos testes considerando-se as diferenças encontradas nos 24 poços, no que diz respeito à potência e intensidade em cada poço Dessa maneira, constituiu-se o perfil do experimento com 9 tratamentos (ou 3 grupos) distintos sobre as culturas de CTMs para cada animal, sendo o primeiro grupo exposto à luz contínua, o segundo grupo sob exposição à luz pulsátil e o terceiro grupo sem exposição, portanto o controle. Para dar início ao experimento, as amostras de CTM obtidas de cada dissociação (2) de cada rato foram plaqueadas na quantidade de 1 x 104 células por poço, sendo que cada animal gerou 18 placas de cultura, sendo elas: 4 placas para o LED Contínuo (Dissociação Mecânica), 4 placas para o LED Pulsátil (Dissociação Mecânica), 4 placas para o LED Contínuo (Dissociação Enzimática), 4 placas para o LED Pulsátil (Dissociação Enzimática) e 2 placas para o Controle (Sem irradiação) (Dissociação Mecânica e Enzimática). A figura 8 mostra esse esquema de grupos e tratamentos. 46 Figura 8 - Esquema representativo da metodologia de irradiação e controles Legenda – O esquema acima mostra a composição e formação dos grupos do experimento, a partir de 1 rato. Considerando as variáveis envolvidas como, tipo de dissociação, regimes de luz (LED) e controle, doses estabelecidas, totalizam-se 18 tratamentos por animal, ou seja, 18 placas experimentais. Fonte: arquivo pessoal, 2015. As irradiações com os LEDs sobre as placas de cultura de CTM foram realizadas 3 vezes por semana (segundas, quartas e sextas-feiras) e tiveram início 48 horas após o plaqueamento inicial do experimento (momento zero = M0). O meio de cultura utilizado para o experimento foi o DMEM-F12 (Gibco®) livre de fenol, substância essa responsável pela coloração em tom alaranjado do meio, em associação com 10% de SFB. Em virtude de o fenol ser uma substância refringente à irradiação, inclusive com o LED, a presença do mesmo no meio de cultura poderia interferir no resultado do experimento, portanto a necessidade de sua ausência. O meio de cultura das placas foi trocado 2 vezes por semana, acompanhado previamente de observação microscópica, por microscopia invertida utilizando microscópio Axiovert 200-Zeiss e registros fotográficos sempre que indicados. A monitoração microscópica das placas permitiu avaliar o aspecto celular, a morfologia, a confluência das células e eventual aparecimento de indicadores tóxicos tais como depósitos intracelulares, vacuolizações ou sinais de desdiferenciação e/ou contaminação evidenciados pela mudança de comportamento da CTM-TA, tipicamente aderente ao plástico, tornando-se células em suspensão. A exposição à luz do LED das placas de cultura teve duração de tempo diferente para cada uma das 4 doses aplicadas. De acordo com a tabela 4, é possível conhecer 47 os tempos de exposição dedicados às placas a partir de doses diferentes. Esses tempos foram calculados previamente. Para a realização das irradiações, as placas eram retiradas das estufas principais, uma de cada vez, colocadas sobre a biotable específica (em outra estufa reservada para tal procedimento), e irradiadas pelo tempo correspondente a cada dose. Tabela 4 – Cálculo dos tempos de exposição ao LED Tempo de Exposição ao LED (em segundos) Doses LED Contínuo LED Pulsátil 1 J/cm² 34 s 68 s 3 J/cm² 100 s 200 s 5 J/cm² 167 s 334 s 10 J/cm² 334 s 668 s Controle 668 s 668 s Obs: os Controles foram colocados em fluxo laminar Fonte: arquivo pessoal, 2015. As placas que não receberam irradiação pelo LED (controles) foram retiradas das estufas e colocadas dentro da capela de fluxo laminar e permaneceram assim expostas pelo tempo máximo de todas as doses, sendo ela a de 10 J/cm2 (668 segundos). Ao final das irradiações, as placas eram retornadas com para as estufas. O experimento se estendeu por 4 passagens, a contar da 4ª passagem (momento zero = M0) obtida após prévia expansão da cultura. Em todas as passagens as células foram tratadas com tripsina para remoção da placa e evolução de passagem, desde M0 até P4. A cada passagem, parte das células eram replaqueadas e outra parte era destinada à criopreservação. Diante disso, foi possível estabelecer algumas relações, como por exemplo, o tempo transcorrido entre cada passagem das diferentes placas de CTMs e as características qualitativas e quantitativas apresentadas por cada uma delas. A sequência de etapas do experimento recebeu a denominação subsequente: M0 → P1, P1 → P2, P2 → P3, P3 → P4. A figura 9 explicita as etapas e os procedimentos totais do experimento proposto, de forma mais clara e abrangente. 48 Figura 9 - Fluxograma do experimento proposto, contendo as etapas desde a coleta de TA até o encerramento com as análises. Fonte: arquivo pessoal, 2015. 49 Imediatamente antes do plaqueamento para o experimento (→ M0) e ao final do experimento com fotoestimulação, as CTMs foram destinadas aos testes e análises estabelecidas para o conhecimento dos parâmetros biológicos quantitativos e qualitativos de interesse, sendo eles: contagem, viabilidade, índice de necrose e apoptose (teste de anexina V e iodeto de propídeo; teste da caspase 3), índice de dano do DNA (teste do cometa e do micronúcleo), marcadores de superfície (imunofenotipagem) e potencial de diferenciação. Além disso, o sobrenadante de cultura coletado também foi destinado à dosagem de citocinas. 3.8 Testes do Experimento (Pré e Pós): Obtenção de Dados Biológicos Quantitativos e Qualitativos das Culturas de CTM 3.8.1 Tempo de Confluência a 80% Foram analisados e comparados os tempos transcorridos entre as passagens do experimento (M0 até P4), referentes às placas de cultura de cada tratamento (em todas as amostras) até que tivessem atingido confluência de 80% (acompanhamento microscópico) procedendo-se o registro fotográfico. 3.8.2 Determinação dos Índices de Apoptose e Necrose Celular O fenômeno da morte celular pode ser desencadeado por uma série de fatores ou injúrias como: danos de DNA, hipóxia tissular, agressão imunológica, infecciosa e tóxica. A morte celular pode ser dividida em duas categorias: a programada ou fisiopatológica (apoptótica), e a patológica (necrótica). Foram utilizados três reagentes para determinar a morte celular por apoptose e necrose pela metodologia de CF: Anexina V FITC, Iodeto de Propídeo e Caspase-3 FITC, todos do mesmo fabricante (Kit BD Pharmingen®). A marcação das células seguiu especificações do fabricante, com leitura no equipamento citômetro de fluxo FACS Calibur BD e análise em software PAINT-A-GATE da BD®. A Anexina V é uma proteína Ca2 dependente que tem elevada afinidade por fosfatidilserinas, que são fosfolipídeos internos da membrana e só são expressos nos casos de apoptose. O Iodeto de Propídeo (IP) é utilizado para diferenciar células intactas das não intactas. As 50 células intactas excluem o IP enquanto as células mortas são permeáveis ao produto. A ativação da via das caspases (proteínas efetoras) é observada na forma clássica, podendo a apoptose ser independente ou dependente dessa via. A apoptose pela via independente é determinada pela externalização das fosfatidilserinas pela membrana celular, como exemplificado na figura 10 abaixo. Figura 10 - Representação esquemática do teste de Anexina V e Iodeto de Propídeo Fonte: Esquema adaptado de www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/apoptosis A leitura dos resultados pelo software CellQuest da BD™, foi gerada em dot plot, cuja distribuição das células analisadas é feita por quadrante. No esquema abaixo estão representadas as células viáveis, não expressando a marcação por Anexina V nem Iodeto de Propídeo, cuja concentração é a maior e pode ser identificada no quadrante inferior esquerdo. A população de células em apoptose precoce expressa a Anexina V, mas não marca com o IP (quadrante inferior direito), já as células em apoptose tardia, começam a coexpressar com o IP, e são identificadas no quadrante superior direito enquanto que as células em necrose encontram-se no quadrante superior esquerdo (figura 11). 51 Figura 11 - Esquema da análise do teste de Anexina V e Iodeto de Propídeo por Citometria de Fluxo Legenda - A imagem acima representa célula viável e células sofrendo morte por apoptose e necrose. Na necrose, ocorre abertura dos poros a membrana celular (desintegração), que permite a entrada do marcador intracelular de necrose. Enquanto que na apoptose precoce, ocorre externalização da fosfatidilserina. À direita, um plot mostrando a marcação reduzida nos quadrantes superiores e inferior direito, de células que estão morrendo ou mortas. Fonte: Esquema adaptado de www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/apoptosis A apoptose dependente das caspases pode ser identificada pela quantidade de uma protease chave ativada na fase inicial da apoptose, a Caspase-3 (Figura 12). Figura 12 - Esquema ilustrativo das vias de morte celular Fonte: Adaptado de Bertanha, 2011. 52 3.8.3 Dosagem de Citocinas As citocinas compõem um grupo heterogêneo de polipeptídios que podem ser denominados de peptídeos regulatórios, pois modulam as funções de diferentes tipos celulares. As citocinas são produzidas por várias células e tem função imediata, regulando resposta imune e inflamatória e controlando a proliferação e diferenciação celular. Para efetuar a dosagem, será utilizado Kit de Citocinas e Reagentes Complementares da BD® Cytometric Bead Array (CBA). Os ensaios de CBA proporcionam um método de captura de analitos solúveis com carreadores conhecidos e de fluorescência. Quando estes são incubados junto a amostra desconhecida com analitos conhecidos, complexos de sanduíche são formados e podem ser medidos por CF para identificar partículas com características de fluorescência de ambos carreador e detector. Após análise de trabalhos publicados foram escolhidas as seguintes citocinas de rato: TNF, IFN-γ (pró-inflamatórias) e IL-4, IL-10, (anti-inflamatórias) (LEDEBOER et al., 2000; JIA et al., 2012; ZINOCKER; VAAGE, 2012; SEIFERT et al., 2012). Tal procedimento, com uso do Kit, foi realizado no equipamento citômetro de fluxo FACS Calibur BD do Laboratório de Citometria de Fluxo do HC de Botucatu. Antes de cada momento de tripsinização (evolução das passagens do experimento), o sobrenadante de cultura (1 mL) foi aliquotado e criopreservado a -30°C para posterior dosagem de citocinas. A constituição deste painel foi importante, pois evitou distorções nas análises repetidas em grande número de manipulações, já que cada manipulação em CF implica em fazer controles positivos e negativos. A proposta do banco de sobrenadantes se deu pela demora na importação dos Kits para determinação das citocinas e da projeção de que manipulações organizadas em bateladas gastam menor quantidade (proporcionalmente) de controles utilizados. Quanto mais fracionada é esta análise, maior é o gasto com análises controle. Diante disto, e do alto custo dos insumos, optou-se por realizar o banco de sobrenadantes de cultura para análise posterior ao final do experimento. Na figura 13 é possível visualizar um esquema representativo do método de detecção por CBA, no citômetro de fluxo. 53 Figura 13 - esquema representativo do método de detecção por CBA, no citômetro de fluxo . Legenda – A imagem inicial mostra o preparo do teste com a mistura dos componentes: beads carreadoras específicas, amostra selecionada e anticorpos de detecção da amostra (fluorescentes). Se houver reconhecimento pelo anticorpo, a amostra será marcada e vizualizada no software, após lavagens. Fonte: Data Sheet BD®, 2015. 3.8.4 Índice de Genotoxicidade: Teste do Cometa Esta técnica foi desenvolvida em parceria com o Laboratório de Carcinogênese Química e Experimental, do Instituto de Biociências da Unesp de Botucatu, sob responsabilidade do Prof. Dr. Luis Fernando Barbisan para determinar o dano de DNA das CTMs pré e pós-experimento. O teste do cometa ou eletroforese em gel de células individualizadas (SCGE) é bastante empregado para detectar danos genotóxicos devido à sua sensibilidade, eficácia, facilidade e baixo custo. É um teste quantitativo observacional. Singh et al. (1988), aprimoraram-no com o uso de condições alcalinas (pH >13) de eletroforese, permitindo a detecção de quebras de fita simples, dupla e sítios álcali-lábeis do DNA de células que sofreram rompimento nuclear e deixaram um rastro escuro na corrida do gel. Após preparação do material celular, 1 x 104 por amostra/lâmina, as células foram ressuspensas em 100 L de agarose (baixo ponto de fusão). Este conteúdo foi colocado sobre lâminas previamente preparadas com agarose (ponto de fusão normal) e sobre elas, uma lamínula para proteção. As lâminas foram incubadas em geladeira por 10 minutos e, em seguida, retiradas as lamínulas. As lâminas foram acondicionadas em cubetas com solução de lise (Triton-X, DMSO, M-NaCl, EDTA, Tris 54 e N-Lauroyl–Sarcosine) e mantidas em geladeira por no mínimo 24 horas. Após incubação, as lâminas foram lavadas com PBS e colocadas na cuba de eletroforese (300 mA por 20 min) para corrida em solução com pH 13 (Singh et al, 1988, com modificações). Foi utilizado como controle positivo para as amostras o Peróxido de Hidrogênio (200 micromols ou 1 µL/1 x 104 células/1 mL) induzido na amostra por 30 minutos. As lâminas foram analisadas com uso do intercalante de DNA SYBR GOLG (Life Technologies®) (diluição 1 : 10000) em microscópio de fluorescência (Olympus BX60) (aumento de 10X), para visualizar as seguintes imagens microscópicas: com contorno circular (sem danos no DNA) ou em forma de “cometa” (com danos no DNA). A extensão de cada imagem significa a distância de migração da fita de DNA danificada. Os resultados foram obtidos através do cálculo de porcentagem de dano da categoria de análise tail intensity. A contagem das lâminas foi feita em duplica, totalizando 100 nucleóides do teste e 100 nucleóides do controle positivo para cada amostra. 3.8.5 Índice de Mutagenicidade: Teste do Micronúcleo Esta etapa foi realizada em parceria com o laboratório de Toxicogenômica e Nutrigenômica da Profa. Dra. Daisy Maria Fávero Salvadori, utilizando a técnica do micronúcleo para determinar o dano de DNA das CTMs pré e pós-experimento. A necessidade de células é próxima a 1 x 105 de cada tratamento estabelecido. O teste do micronúcleo (MN) foi inicialmente desenvolvido em eritrócitos da MO de camundongos por Schmid (1976), tornou-se viável, confiável e é, atualmente, um dos métodos utilizados para avaliar danos citogenéticos causados por substâncias xenobióticas nos organismos. Os micronúcleos (núcleos secundários) formam-se a partir de pequenas quantidades de DNA (cromatina) não incorporadas dentro do núcleo da célula-filha, durante a divisão celular, e recebem esse nome por serem menores que o núcleo principal. Há, geralmente, um micronúcleo por célula, o suficiente para indicar perda irreversível de DNA e até associação à carcinogenicidade (DIETZ et al., 2000). Após preparação do material celular em placas de 6 poços, foi adicionada a citocalasina B (SigmaAldrich®) (composto que bloqueia a citocinese) (4,25 μg/mL de meio) e mantida na cultura por 24 horas, em estufa. Após esse tempo, as células receberam tratamento específico com etapa de hipotonização (solução hipotônica gelada de KCl 0,075M) e fixação (Ácido Acético P.A., Metanol P.A. e Formoldeído 37%) 55 intercaladas por centrifugações à 1200 rpm por 10 min. A sequência do procedimento se deu por: hipotonizar as CTMs, adicionando (pingando) 5 mL de KCL, centrifugar, colocar 5 mL de 2 soluções fixadoras em sequência (metanol/ácido acético 3:4) e (metanol/ácido acético 5:1). Para auxiliar na preservação do citoplasma, 3 gotas de formoldeído foram acrescidas entre as 2 fixações anteriores. Terminada a fixação, o conteúdo foi centrifugado e o sobrenadante descartado, restando 0,5 mL, que foi agitado e gotejado sobre lâminas limpas e pré-aquecidas. Como controle positivo, utilizou-se a substância cloridrato de doxorrubicina (4 µg/mL de meio) após plaqueamento para o teste, mantido por 24 horas em cultura. Após esse tempo, retirou- se esse meio e foi adicionado meio de cultura contendo a citocalasina B. As células foram coradas em solução de Giemsa 5% (Merck®), por 7 min e analisadas em microscópio óptico (aumento de 20x) segundo critérios propostos por Fenech (2000) (FENECH; MORLEY, 1985; DAISY, 2003, com modificações). O índice de divisão nuclear (IDN) foi calculado com base em Eastmond e Tucker (1989), por meio da seguinte equação: IDN = M1 + 2(M2) + 3(M3) + 4(M4)/N; M1 - M4: número de células com, respectivamente, 1, 2, 3 e 4 núcleos; N: número total de células analisadas. Foram incluídas na análise das lâminas, células binucleadas, células binucleadas com 1, 2, 3 ou mais micronúcleos, binucleadas com ponte nuclear e broto nuclear, dentro de uma contagem de 1000 células binucleadas/lâmina e 1000 células binucleadas/lâmina do controle positivo. A contagem foi realizada pelo método do duplo-cego. 3.9 Análise Estatística Quanto aos procedimentos descritivos foram estabelecidas distribuições de frequências (absoluta e percentual) das variáveis envolvidas, complementadas com gráficos e tabelas frequenciais. As discussões seguiram o nível de 5% de significância. Os dados obtidos pelo micronúcleo foram analisados por binomial e Poisson, pelo software SAS, v9.2. O teste do cometa recebeu análise por Anova Ranks (Tukey/Kruskal-Wallis). Os outros testes receberam análise pelo Software GraphPad InstatTM com a realização do teste T Student. 56 Resultados e Discussão 57 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados deste trabalho foram descritos de acordo com os testes realizados, em sequência lógica, abrangendo para cada um as relevâncias resultantes dos tempos pré-experimento e pós-experimento, ou seja, pré-irradiação e pós- irradiação com LED, o que facilitou a organização dos dados para análise e discussão. Respeitando a padronização inicial realizada por estaticista foram obtidas amostras de tecido adiposo de 15 animais. As amostras de TA foram transferidas para o LEC e processadas. Frente a resultados anteriores obtidos por Cleto et al, (2011) evidenciando que amostras obtidas pelo método de DM tem rendimento inicial inferior ao de DE, optou-se por fazer uma partição do bloco de TA em partes desiguais, sendo que o bloco contendo maior peso de TA foi processado mecanicamente enquanto que o menor, por colagenase. O quadro 1 abaixo mostra os dados relativos ao peso médio do TA coletado de 15 ratos, tipo de dissociação (DM e DE) e número médio de células obtidas/grama de tecido adiposo. Quadro 1 – Obtenção dos blocos de TA, métodos de dissociação e contagem celular Número amostral Tipo de dissociação Peso médio (g) do TA N0 médio total de células obtidas N0 médio de células/g de TA N=15 Mecânica 2,95 2,93 x 10 5 1,0 x 10 5 Enzimática 2,01 6,73 x 10 5 3,34 x 10 5 Fonte: arquivo pessoal, 2015 As médias de células linfomononucleares (LMN) obtidas por dissociação mecânica foi de 1,0 x 105 células/grama de TA. Denomina-se esta população de células obtidas como LMN, pois os métodos de dissociação extraem linfócitos e monócitos dos tecidos, conjuntamente com as células-tronco mesenquimais. Estas células aderentes do sangue foram purificadas pelo método de plaqueamento, pois foram eliminadas na expansã