RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo deste trabalho será disponibilizado somente a partir de 22/02/2019. i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - CAMPUS DE BOTUCATU PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (ZOOLOGIA) CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE ESPÉCIES DO GÊNERO Synthesium (DIGENEA: BRACHYCLADIIDAE) EM ODONTOCETOS (CETACEA) Mariana Bertholdi Ebert Orientador: Prof. Tit. Reinaldo José da Silva Coorientadora: Dra. Juliana Marigo Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Zoologia) do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Campus de Botucatu-SP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Zoologia). Botucatu, SP 2017 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 Ebert, Mariana Bertholdi. Caracterização morfológica e molecular de espécies do gênero Synthesium (Digenea: Brachycladiidae) em odontocetos (Cetacea) / Mariana Bertholdi Ebert. - Botucatu, 2017 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Reinaldo José da Silva Coorientador: Juliana Marigo Capes: 20400004 1. Mamífero aquático. 2. Intestinos - Parasitos. 3. Helminto. 4. Morfologia. 5. Taxonomia numérica. Palavras-chave: Delphinidae; Identificação molecular; Morfologia; Parasitos intestinais; Taxonomia. ii Dedico este trabalho a meus pais, Estela e Arlindo, inspirações da minha vida. iii “Deus ao mar o perigo e o abismo deu, Mas nele é que espelhou o céu.” (Fernando Pessoa) ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Agradecimentos! ! ! v ! AGRADECIMENTOS- - - Este%trabalho%seria%impossível%sem%a%colaboração%de%algumas%pessoas%e%instituições% que,% de% diversas% formas,% deram% sua% contribuição% em% diferentes% etapas.% Destas,% manifesto%um%agradecimento%especial:%% Aos%meus%pais% pelo% infinito% amor,% respeito,% cumplicidade% e% confiança.% Sem%esses% pilares,%nada%seria%possível.% À%Juliana%Marigo,%pela%confiança%e%por%me%ensinar%tanto.%Que%sorte%a%minha%de%ter% uma%amiga%e%fada%madrinha%como%coorientadora!% Ao% Professor% Reinaldo% José% da% Silva,% por% ser% um% orientador% sempre% presente.% Agradeço% todos%os% ensinamentos,% apoio%e%disponibilidade%em%sempre% tirar% todas% minhas%dúvidas.�% Aos% amigos% do% LAPAS% pelo% acolhimento,% conversas% bemKhumoradas% durante% os% cafézinhos%e%ensinamentos%de%todas%as%formas.%% Aos%colegas%do%IPeC%e%Cananéia%por%me%ensinarem%a%amar%o%que%se%faz.%Agradeço%a% todos%que%ajudaram%nas%animadas%coletas%de%amostras%e%monitoramentos%de%praia.% Agradeço%também%todas%as%palavras%de%carinho%e%incentivo%nessa%caminhada.% À%Maria%Isabel%Müller,%por%me%guiar%pelo%maravilhoso%mundo%da%biologia%molecular.% À%Natalia%FraijaKFernández,%pelas%valiosas%discussões%sobre%parasitos%de%cetáceos%e% por%ser%sempre%gentil,%e%à%Mercedez%Fernández%pela%disponibilidade%em%ajudar%e%pela% cessão%de%amostras.%%%%% Ao%Conselho%Nacional% de%Desenvolvimento%Científico% e%Tecnológico% (CNPq),% pela% bolsa% de%mestrado,% e% à%UNESP%pelo% suporte% tecnológico%para% o% desenvolvimento% desta%pesquisa.%% Ao%Leandro%Cagiano%pela%imagem%de%capa.% À%todos%aqueles%que%contribuíram%de%alguma%forma,%mesmo%sem%saber,%para%o%meu% crescimento%na%pesquisa%e%como%ser%humano.% Por%fim,%agradeço%aos%golfinhos%e%baleias%e%seus%“vermes”,%por%involuntariamente%me% servirem%de%objeto%de%estudo%e%me%darem%a%chance%de%realizar%meus%sonhos.% Gratidão%ao%universo%por%todos%os%ensinamentos%de%todas%as%formas!%%%% ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Sumário! ! ! vii ! ! SUMÁRIO! RESUMO!..............................................................................................................................................!1! ABSTRACT!.........................................................................................................................................!3! INTRODUÇÃO!GERAL!..................................................................................................................!5! Estudos!parasitológicos!.........................................................................................................!6! Cetáceos!........................................................................................................................................!6! Parasitismo!e!diversidade!de!helmintos!em!cetáceos!..............................................!7! Família!Brachycladiidae!........................................................................................................!8! Gênero!Synthesium!...................................................................................................................!8! Referências!bibliográficas!.................................................................................................!10! OBJETIVO!........................................................................................................................................!15! Objetivo!geral!..........................................................................................................................!16! Objetivos!específicos!............................................................................................................!16! A!NEW!Synthesium!SPECIES!(DIGENEA:!BRACHYCLADIIDAE)!FROM! BOTTLENOSE!DOLPHINS!Tursiops/truncatus!(CETACEA:!DELPHINIDAE)!IN! SOUTHWESTERN!ATLANTIC!WATERS!...........................................................................!17! Abstract!.....................................................................................................................................!18! Introduction!.............................................................................................................................!19! Material!and!Methods!..........................................................................................................!19! Results!........................................................................................................................................!22! Discussion!.................................................................................................................................!26! References!................................................................................................................................!28! PHYLOGENETIC!RELATIONSHIP!AMONG!SPECIES!OF!Synthesium! (DIGENEA:!BRACHYCLADIIDAE),!PARASITES!OF!DOLPHINS,!BASED!ON! MORPHOLOGICAL!AND!MOLECULAR!DATA!................................................................!40! Abstract!.....................................................................................................................................!41! Introduction!.............................................................................................................................!42! Material!and!Methods!..........................................................................................................!43! Results!........................................................................................................................................!45! Discussion!.................................................................................................................................!48! References!................................................................................................................................!52! /CONSIDERAÇÕES!FINAIS!.......................................................................................................!69! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Resumo! ! ! ! 2 RESUMO Trematódeos do gênero Synthesium infectam o intestino de diversas famílias de odontocetos em todo o mundo. No entanto, a identificação e o status taxonômico de Synthesium ainda são confusos e, principalmente, baseados em análises morfológicas. As informações genéticas ainda são excassas. O presente estudo teve como objetivo investigar a diversidade de parasitos intestinais do gênero Synthesium colhidos de diferentes odontocetos, através de comparações morfológicas e moleculares. Foram estudados parasitos de golfinhos encontrados mortos em praias ou acidentalmente capturados em redes de pesca de diferentes regiões. Durante a necropsia, o intestino delgado foi removido e armazenado a -20°C. Posteriormente, os intestinos foram abertos, lavados em água corrente sobre peneira de 150 µm e o conteúdo examinado sob estereomicroscópio. Os trematódeos encontrados foram fixados e preservados em etanol 70% para análises morfológicas e moleculares. Os trematódeos foram preparados em lâminas temporárias e as análises morfométricas diagnósticas foram feitas em um sistema computadorizado para análise de imagens. O DNA genômico dos trematódeos foi extraído e amplificado utilizando-se primers com alvo no DNA ribossomal (menor subunidade do DNA ribossomal - gene SSU - e região intergênica - ITS1) e DNA mitocondrial (nicotinamida dinucleotídeo dehidrogenase subunidade 3 - gene ND3 - e citocromo c oxidase subunidade I - gene COI). Os resultados morfológicos e moleculares apontam a existência de pelo menos quatro novas espécies de trematódeos do gênero Synthesium, sendo uma delas, Synthesium neotropicalis, descrita neste trabalho. As análises filogenéticas demonstram um complexo de espécies agregando S. tursionis e o posicionamento de S. delamurei, S. subtile e S. seymouri gera questionamentos sobre a correta inclusão destas espécies ao gênero, incentivando sua revisão através de abordagens morfológicas e moleculares. Os resultados obtidos representam uma importante contribuição para o conhecimento da helmintofauna de cetáceos. ! Palavras-chave: Parasitos intestinais, Delphinidae, Identificação molecular, Morfologia, Taxonomia. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Abstract! ! ! ! 4 ABSTRACT Trematodes of the genus Synthesium infect the intestines of a wide range of odontocete families worldwide. However, the identification and the taxonomic status of Synthesium are still confusing and mainly based on morphological analyses. Genetic information is still scarce. The present study aimed to investigate the diversity of intestinal parasites of the genus Synthesium collected from different odontocetes species, by means of morphological and molecular approaches. Parasites of dolphins found washed ashore or accidentally caught in fishing nets from different regions were studied. During necropsy, the small intestines were removed and stored at -20°C. The intestines were opened, washed in tap water over a 150 µm sieve and examined under a stereomicroscope. The recovered trematodes were fixed and preserved in 70% ethanol for morphological and molecular analyses. The parasites were prepared as temporary slides and diagnostic morphometric analyses were performed on a computerized imaging system. The genomic DNA of the trematodes was extracted and amplified using primers targeted at the ribosomal (small ribosomal subunit - SSU gene- and internal transcribed spacer 1 - ITS1) and mitochondrial DNA (NDH dehydrogenase subunit 3 - ND3 gene- and cytochrome c oxidase subunit 1 – COI gene). The morphological and molecular results indicate the existence of at least four new species of trematodes of the genus Synthesium. Phylogenetic analyses show a species complex aggregating S. tursionis and the phylogenetic position of S. delamurei, S. subtile and S. seymouri raises questionings about the correct inclusion of these species to the genus, suggesting a revision of the genus through morphological and specialy molecular approaches. The obtained results represent an important contribution to the knowledge of the helmintofauna of cetaceans. Keywords: Intestinal parasites, Delphinidae, Molecular identification, Morphology, Taxonomy. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Introdução!geral! ! ! ! 6 INTRODUÇÃO GERAL Estudos parasitológicos Parasitos apresentam uma grande biodiversidade e potencialmente infectam a maioria dos metazoários de vida livre (POULIN & MORAND, 2000). Parasitos podem influenciar no funcionamento dos ecossistemas e fornecer informações sobre a história evolutiva e demográfica de seus hospedeiros, aspectos estes de grande importância para a conservação das espécies (AZNAR et al., 2010). Parasitos em cetáceos têm sido envolvidos em diversos estudos relacionados à delimitação de estoque populacional (BALBUENA et al., 1995; MARIGO et al., 2015), estrutura social (BALBUENA et al., 1995), história da população (KALISZEWSKA et al., 2005) e condição de saúde de seus hospedeiros (AZNAR et al., 2005). Assim, um modelo parasito-hospedeiro fornece uma ferramenta adequada para estudar a relação ecológica, sistemática, evolutiva e biogeográfica entre organismos (BROOKS & HOBERG, 2000). Cetáceos Os cetáceos (golfinhos, botos e baleias) são mamíferos marinhos completamente adaptados à vida aquática (DI BENEDITTO et al., 2010). A ordem Cetacea Brisson, 1762 é dividida em três subordens, Archaeoceti Flower, 1833 (apenas fósseis), Mysticeti Cope, 1864 e Odontoceti Flower, 1867. Os Mysticeti (cetáceos com barbatanas, conhecidos como baleias verdadeiras) estão divididos em quatro famílias e 14 espécies, sendo que oito delas ocorrem no Brasil. Os Odontoceti (cetáceos que possuem dentes, conhecidos como golfinhos e botos) dividem-se em nove famílias e 69 espécies, das quais 35 ocorrem no litoral brasileiro (ICMBio, 2010; DI BENEDITTO et al., 2010). A distribuição dos cetáceos ao longo dos 8.000 km da costa brasileira é de extrema amplitude, ocorrendo de forma contínua. Isso se dá pela diversidade de ecossistemas presentes ao longo de nosso litoral (baías, manguezais, recifais etc), os quais representam habitats favoráveis para reprodução e alimentação destes animais (IBAMA, 2005). A maioria das espécies listadas no Plano de Ação de Mamíferos Aquáticos do Brasil (IBAMA, 2001) está classificada na categoria DD (Deficient Data) da IUCN Red List of Threatened Species (http://www.iucnredlist.org), indicando que não existem informações adequadas para avaliação do status de conservação, ameaças sofridas e ! 7 outras características das espécies, inclusive sobre a diversidade parasitária abrigada ou a relação parasito-hospedeiro. Muito desta carência se deve a inexistência de estudos e destinação adequada de material biológico para fins acadêmicos e, consequentemente, dados substanciais a serem empregados em projetos que visam à conservação destes animais (IBAMA, 2005). Parasitismo e diversidade de helmintos em cetáceos Os primeiros registros de helmintos em cetáceos datam do inicio de 1930, época esta em que a caça comercial era permitida (BAYLIS, 1932; PRICE, 1932). Atualmente, a maioria dos registros utilizam carcaças de cetáceos provenientes de encalhes ocasionais ou capturas acidentais em redes de pesca (RAGA et al., 2008). Recentemente, alguns estudos têm utilizado técnicas não invasivas através da colheita de amostras de fezes para identificação de helmintos (KLEINERTZ et al., 2014; HERMOSILLA et al., 2016). Estudos parasitológicos em cetáceos são limitados pela dificuldade de acesso tanto aos hospedeiros como seus parasitos em bom estado de conservação. Como consequência, há uma escassez de informações morfológicas e principalmente genéticas a respeito destes organismos (RAGA et al., 2008). Devido a esta insuficiência de informações disponíveis, principalmente em águas brasileiras, é importante o incentivo a estudos parasitológicos de caráter contínuo e padronizado. Estes trabalhos são inclusive citados junto aos projetos e ações prioritárias estabelecidas pelo Plano de Ação para os Mamíferos Aquáticos do Brasil (IBAMA, 2001). A helmintofauna de cetáceos inclui atualmente cerca de 174 espécies divididas em quatro grandes grupos taxonômicos: os nematoides são o grupo mais diverso (62 espécies), seguido por trematódeos digenéticos (54 espécies), cestoides (38 espécies) e acantocéfalos (20 espécies) (FRAIJA-FERNÁNDEZ et al., in press). As famílias Pseudaliidae Railliet & Henry, 1909, Anisakidae Skrjabin & Karokhin, 1945 e Tetrameridae Travassos, 1914 são as mais representativas entre os nematoides parasitos de cetáceos. Os cestoides estão representados principalmente pelas famílias Tetrabothriidae Linton, 1891, Diphyllobothriidae Lühe, 1910 e Phyllobothriidae Braun, 1900. A família Polymorphidae Meyer, 1931 abriga todas as espécies de acantocéfalos infectantes de cetáceos. Já os trematódeos digenéticos estão distribuídos em quatro famílias: Brauninidae Wolf, 1903, Notocotylidae Lühe, 1909, Heterophyidae Leiper, 1909 e Brachycladiidae Odhner, 1905. A família Brauninidae é ! 8 monotípica, incluindo somente Braunina cordiformis Wolf, 1903. A família Notocotylidae inclui as espécies do gênero Ogmogaster Jägerskiöld, 1891. A família Heterophyidae é representada por uma única espécie, Pholeter gastrophilus (Kossack, 1910) Odhner, 1914. A família Brachycladiidae é a mais representativa, incluindo 10 gêneros e 42 espécies (GIBSON, 2005; FRAIJA-FERNÁNDEZ et al., in press). Família Brachycladiidae Digenéticos da família Brachycladiidae ocorrem nos ductos hepáticos e pancreáticos, intestinos, pulmões e seios nasais de mamíferos marinhos em todo o mundo (FERNÁNDEZ et al., 1998a,b; GIBSON, 2005). A maior parte da sua diversidade é encontrada em cetáceos (35 das 42 espécies descritas), mas algumas espécies também infectam pinípedes e lontras marinhas (AZNAR et al., 2001; DAILEY, 2007). Pouco se sabe sobre a biologia da família Brachycladiidae. Nenhum hospedeiro intermediário ou paratênico foi identificado até o momento (FERNÁNDEZ, 1996). Análises filogenéticas e morfológicas indicam que a origem deste grupo e sua associação com mamíferos marinhos provavelmente resultou de eventos de mudanças entre hospedeiros a partir de um ancestral ocorrente em peixes, e que foi capaz de infectar odontocetos através da relação predador-presa (FERNÁNDEZ et al., 1998b; BRAY et al., 2005; FRAIJA-FERNÁNDEZ et al., 2015). A organização taxonômica da família também é bastante controversa, incluindo muitas transferências de espécies e sinonímias. As identificações são principalmente baseadas em análises morfológicas de helmintos adultos e, recentemente, algumas espécies têm sido reavaliadas através de estudos moleculares (MARIGO et al., 2011). Atualmente são reconhecidas duas subfamílias; Brachycladiinae Odhner 1905 incluindo Brachycladium Looss, 1899, Hunterotrema McIntosh 1960, Oschmarinella Skrjabin 1947, Synthesium Stunkard & Alvey 1930, Campula Cobbold 1858, Zalophotrema Stunkard & Avey 1929, Orthosplanchnus Odhner 1905 e Odhneriella Skrjabin 1915; e Nasitrematinae Ozaki, 1935, que agrega os gêneros Nasitrema Ozaki 1935 e Cetitrema Skrjabin 1970 (GIBSON, 2005). Gênero Synthesium Parasitos do gênero Synthesium infectam o intestino, sobretudo a porção anterior do duodeno, de praticamente todas as famílias de odontocetos (17 espécies registradas ! 9 dentro das famílias Pontoporiidae Gray, 1846, Delphinidae Gray, 1821, Monodontidae Gray, 1821 e Phocoenidae Gray, 1825), sugerindo um longo período de adaptações parasito-hospedeiros (FERNÁNDEZ, 1996). O gênero Synthesium sofreu diferentes rearranjos taxonômicos nos últimos anos, com várias sinonímias entre gêneros morfologicamente relacionados como Leucasiella Krotov & Delyamure 1952, Hadwenius Price, 1932 e Odhneriella Skrjabin, 1915 (GIBSON, 2005, 2014). YAMAGUTI (1958) reconheceu Leucasiella como sinônimo de Hadwenius. Posteriormente, GIBSON (2005) considerou Hadwenius como sinônimo júnior de Synthesium. Atualmente são reconhecidas oito espécies deste gênero; três aparentam especificidade de hospedeiros sendo Synthesium seymouri (Price, 1932) Marigo, Vicente, Valente, Measures & Santos, 2008, parasito de belugas Delphinapterus leucas (Pallas, 1776), Synthesium delamurei Raga & Balbuena, 1988, parasito de baleias piloto de peitorais longas Globicephala melas Traill, 1809, e Synthesium pontoporiae (Raga, Aznar, Balbuena & Dailey, 1994) Marigo, Vicente, Valente, Measures & Santos, 2008 encontrado em toninhas Pontoporia blainvillei Gervais & d'Orbigny, 1844. Synthesium nipponicum Yamaguti, 1951 é exclusivo de delfinídeos da família Phocoenidae, parasitando o golfinho de Dall Phocoenoides dalli True, 1885 e o golfinho do proto Phocoena phocoena Linnaeus, 1758. O restante das espécies, Synthesium subtile Skrjabin, 1959, Synthesium mironovi Krotov & Delyamure, 1952, Synthesium elongatum Ozaki, 1935 e Synthesium tursionis (Marchi, 1873) Stunkard & Alvey, 1930 são generalistas e apresentam uma grande variedade de hospedeiros registrados (FERNÁNDEZ, 1996; GIBSON, 2005, 2014). Devido à dificuldade na obtenção de espécimes preservados e a fixação inadequada dos parasitos, muitos caracteres morfológicos são comprometidos (GIBSON, 2005), principalmente porque as espécies deste gênero são bastante similares e as diferenças morfológicas muitas vezes são sutis, o que dificulta a identificação e classificação através de abordagens morfológicas tradicionais. Alem disso, alguns estudos apontam variação morfológica intraespecífica em diferentes populações de odontocetos (LAMOTHE-ARGUMEDO, 1988; FERNANDÉZ et al., 1994, 1995). O uso de métodos de identificação molecular para este gênero ainda é recente e os resultados estimulam novas investigações (MARIGO et al., 2011, 2015). Um estudo integrando caracteres morfológicos e moleculares de espécies de Synthesium, coletados de diferentes odontocetos hospedeiros, gera informações ! 10 importantes para a identificação e caracterização correta das espécies deste gênero, contribuindo para um panorama mais preciso a respeito da biodiversidade e do status taxonômico de Synthesium e, em consequência, sua posição filogenética dentro da família Brachycladiidae. Referências bibliográficas AZNAR, F.J.; BALBUENA J.A.; FERNÁNDEZ, M. & RAGA, J.A. Living together: The parasites of marine mammals. In: Evans P. and Raga J.A. (eds). Marine mammals: Biology and Conservation. New York, USA: Kluwer Academic, Plenum Publishers, p. 385-421, 2001. AZNAR, F.J.; PERDIGUERO, D.; PÉREZ DEL OLMO, A.; REPULLÉS, A.; AGUSTÍ, C. & RAGA, J.A. 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Estudos parasitológicos em cetáceos ainda são escassos, principalmente na costa brasileira, devido a falta de incentivo e conhecimento dos pesquisadores a respeito destes organismos. A identificação correta bem como estudos agregando dados ecológicos, biológicos e moleculares destes parasitos e seus hospedeiros contribuem para o conhecimento não somente da mortalidade destes animais, mas também de aspectos evolutivos e demográficos de ambos. Os resultados morfológicos e moleculares obtidos revelam a existência de pelo menos quatro novas espécies de parasitos do gênero Synthesium ocorrentes em golfinhos da costa brasileira. Além disso, as análises filogenéticas obtidas indicam a existência de um complexo de espécies agregando S. tursionis provenientes da costa brasileira e espanhola, os quais devem ser melhor investigados. A posição filogenética das espécies S. delamurei, S. subtile e S. seymouri é incerta e levanta questionamentos sobre o correto posicionamento destas espécies no gênero Synthesium. Finalmente, este estudo agrega novas informações moleculares para espécimes de braquicladídeos, principalmente para os marcadores rITS1 e mtCOI, os quais carecem de informações em banco de dados, informações estas essenciais para a elucidação do status taxonômico do gênero bem como da família Brachycladiidae. Os resultados obtidos ressaltam a importância de trabalhos relacionados aos parasitos de cetáceos e incentivam a revisão dos espécimes pertencentes ao gênero Synthesium usando abordagens morfológicas e principalmente moleculares. !