UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE QUÍMICA - CÂMPUS DE ARARAQUARA Análise da interação funcional de eIF5A com a tradução, repressão da tradução e degradação de mRNA em Saccharomyces cerevisiae Juliana Sposto Avaca Crusca Tese de Doutorado Araraquara 2011 JULIANA SPOSTO AVACA CRUSCA Análise da interação funcional de eIF5A com a tradução, repressão da tradução e degradação de mRNA em Saccharomyces cerevisiae Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Sandro Roberto Valentini Co-orientador: Prof. Dr. Cleslei Fernando Zanelli Araraquara 2011 FICHA CATALOGRÁFICA Avaca-Crusca, Juliana Sposto A945a Análise da interação funcional de eIF5A com a tradução, repressão da tradução e degradação de mRNA em Saccharomyces cerevisiae / Juliana Sposto Avaca Crusca. – Araraquara : [s.n], 2011 128 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Sandro Roberto Valentini Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli 1. Biotecnologia. 2. eIF5A. 3. Biologia molecular. 4. Genética de leveduras. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Curriculum Vitae Formação Acadêmica/Titulação 2007 - 2011 Doutorado em Biotecnologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Sao Paulo, Brasil Título: Análise da interação funcional de eIF5A com a tradução, repressão da tradução e degradação de mRNA em Saccharomyces cerevisiae. Orientador: Sandro Roberto Valentini Bolsista do(a): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2010 - 2010 Doutorado em Estágio sanduíche no exterior. Instituto de Química de Araraquara - UNESP, IQ - AR, Brasil com período sanduíche em Academy of Sciences of the Czech Republic (Orientador : Jiri Hasek) Título: Análise da interação funcional entre eIF5A, a repressão da tradução e a degradação de mRNA em S. cerevisiae, Ano de obtenção: 2011 Orientador: Jiri Hasek Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 2004 - 2007 Mestrado em Biotecnologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Título: A proteína quinase dependente de ciclina NcPHO85 de Neurospora crassa. Estudos de caracterização molecular e bioquímica., Ano de obtenção: 2007 Orientador: Maria Celia Bertolini Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 1999 - 2003 Graduação em Farmácia Bioquímica. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Formação complementar 2011 - 2011 Curso de curta duração em MicroRNAs: Papel Regulatório e Métodos de Análise. Instituto de Biociências - UNESP - Botucatu-SP Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 2007 - 2007 Curso de curta duração em Curso Restrito a Novos Usuários de Real Time. Applied Biosystems do Brasil Ltda., AB, Brasil 2004 - 2004 Curso de curta duração em Expressão Diferencial de Genes Em Fungos Interação. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 2004 - 2004 Curso de curta duração em Molecular And Cellular Biology Of The Yeast Saccha. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 2004 - 2004 Expressão diferencial de genes em fungos. Centro Brasileiro-Argentino de Biotecnologia, CBAB, Brasil 2003 - 2003 Curso de curta duração em Infecção Hospitalar. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 2003 - 2003 Curso de curta duração em Novas Técnicas de Diagnóstico Em Análises Clínicas. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 2002 - 2002 Curso de curta duração em Clonagem Gênica e Suas Aplicações na Biotecnologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 2000 - 2000 Curso de curta duração em Biologia Molecular Aplicada Às Análises Clínicas e. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 2000 - 2000 Curso de curta duração em Correlação Clínico Laboratorial de Doenças Endócri. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 1999 - 1999 Curso de curta duração em Quimioterápicos no Tratamento Oncológico. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 1999 - 1999 Curso de curta duração em Infecção Hospitalar. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 1999 - 1999 Curso de curta duração em O Profissional Farmacêutico e Mercado de Trabalho. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 1999 - 1999 Curso de curta duração em Vacinas Gênicas. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil 1999 - 1999 Curso de curta duração em Introdução a Hemotoxicologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Atuação profissional 1. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara - UNESP - FCFAR - UNESP ____________________________________________________________________________ Vínculo institucional 2007 - Atual Vínculo: Aluna de doutorado , Enquadramento funcional: Pesquisadora e aluna , Carga horária: 40, Regime: Dedicação Exclusiva ____________________________________________________________________________ Atividades 03/2007 - 07/2007 Estágio, Laboratório de Biologia Molecular e Celular de microrganismos Estágio: Estágio no laboratório 2. Academy of Sciences of the Czech Republic - AS CR ____________________________________________________________________________ Vínculo institucional 2010 - 2010 Vínculo: Colaborador , Enquadramento funcional: Bolsita CAPES/PDEE , Carga horária: 40 ____________________________________________________________________________ Atividades 2010 - 2010 Projetos de pesquisa, Institute of Microbiology of ASCR, v.v.i. Participação em projetos: Análise do envolvimento de eIF5A com a via de degradação de mRNA em Saccharomyces cerevisiae 3. Instituto de Química de Araraquara - UNESP - IQ - AR ____________________________________________________________________________ Vínculo institucional 2004 - 2007 Vínculo: outro , Enquadramento funcional: Aluna de pós-graduação (mestrado) , Carga horária: 40, Regime: Dedicação Exclusiva 4. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP ____________________________________________________________________________ Vínculo institucional 1999 - 2003 Vínculo: Outro , Enquadramento funcional: Aluna de Graduação, Regime: Dedicação Exclusiva _______________________________________________________________________ Atividades 2007 - 2011 Projetos de pesquisa, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara Participação em projetos: Análise da interação funcional de eIF5A com a tradução, repressão da tradução e degradação de mRNA Saccharomyces cerevisiae 10/2002 - 06/2003 Conselhos, Comissões e Consultoria, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Departamento de Análises Clínicas Especificação: Representante Discente no Conselho de Departamento 01/2001 - 12/2001 Estágio, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Departamento de Análises Clínicas Estágio: Iniciação Científica - CNPq 09/2000 - 12/2000 Estágio, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Departamento de Análises Clínicas Estágio: Estágio de Treinamento em Micologia Clínica 04/2000 - 03/2001 Conselhos, Comissões e Consultoria, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara Especificação: Representante Discente na Comissão Permanente de Pesquisa 08/1999 - 12/1999 Estágio, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Departamento de Análises Clínicas Estágio: Estágio de Treinamento em Microbiologia Clínica Projetos 2010 - 2010 Análise do envolvimento de eIF5A com a via de degradação de mRNA em Saccharomyces cerevisiae Descrição: Projeto de doutorado sanduiche realizado no "Laboratory of Cell Reproduction", sob supervisao do PhD Jiri Hasek, realizado na "Academy of Sciences of the Czech Republic". Situação: Em Andamento Natureza: Pesquisa Alunos envolvidos: Doutorado (2); Integrantes: Juliana Sposto Avaca Crusca (Responsável); ; Cleslei Fernando Zanelli; Sandro Roberto Valentini; Jiri Hasek; Tomas Grousl Financiador(es): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES 2007 - 2011 Análise da interação funcional de eIF5A com a tradução, repressão da tradução e degradação de mRNA em Saccharomyces cerevisiae Situação: Em Andamento Natureza: Pesquisa Alunos envolvidos: Doutorado (1); Integrantes: Juliana Sposto Avaca Crusca; Cleslei Fernando Zanelli; Sandro Roberto Valentini (Responsável) Financiador(es): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP Produção em C, T& A Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos 1. GREGIO, A. P. B., CANO, V. S. P., AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., VALENTINI, S. R., ZANELLI, C. F. eIF5A HAS A FUNCTION IN THE ELONGATION STEP OF TRANSLATION IN YEAST. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 380, p. 785 - 790, 2009. Artigos completos aceito para publicação em periódicos 1. GONDIM, J. O.; MOREIRA-NETO, J. J. S.; GOMES, D. A. S.; AVACA, J. S. e/ou AVACA- CRUSCA, J. S.; VALENTINI, S. R.; ZANELLI, C. F.; SPOLIDORIO, D. M. P.; GIRO, E. M. A. Effect of a calcium hydroxide/chlorhexidine paste as intracanal dressing in human primary teeth with necrotic pulp against P. gingivalis and E. faecalis. International Journal of Paediatric Dentistry, 2011. In press. Trabalhos publicados em anais de eventos (completo) 1. Grousl, T, AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., VALENTINI, S. R., HASEK, J. Stress Induced Rearrangement of Actin Cytoskeleton in Saccharomyces cerevisiae In: 19th Cytoskeletal club, 2011, Vranovská Ves, Rep Tcheca. 19th Cytoskeletal club - Czechoslovak Biological Society. Praga, Rep Tcheca, 2011. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. AVACA, J. S. E/OU AVACA-CRUSCA, J. S., RAYMUNDO, D. P., ROSSI, D., BELLATO, H. M.; GROUSL, T.; ZANELLI, C. F.; HASEK, J.; VALENTINI, S. R. Sbp1 is a high-copy suppressor of the tif51A-1 ts phenotype and associates with heat-induced stress granules. In: 25th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, 2011. Olsztyn/Kortowo - Polônica. Yeast. Wiley-Blackwell, v. 27, 2011. 2. RAYMUNDO, D. P., AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., ROSSI, D., VALENTINI, S. R., ZANELLI, C. F. Analysis of genetic interactions between mutants of eIF5A and mRNA decay factors in S. cerevisiae. In: XL Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2011, Foz do Iguaçu - PR. Anais da XL Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2011. 3. AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., RAYMUNDO, D. P., VALENTINI, S. R., ZANELLI, C. F. Study of the Involvement of eIF5A with the mRNA Decay Pathway in Saccharomyces cerevisiae. XXXIX Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq), 2010, Foz do Iguacu - PR. XXXIX Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2010. 4. GREGIO, A. P. B., CANO, V. S. P., AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., RAYMUNDO, D. P., VALENTINI, S. R., ZANELLI, C. F. A role for eIF5A in the elongation step of translation. In: XXXVIII Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq), 2009, Águas de Lindóia - SP. XXXVIII Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2009. 5. GONDIM, J. O., MOREIRA-NETO, J. J. S., GOMES, D. A. S., AVACA, J. S. e/ou AVACA- CRUSCA, J. S., ZANELLI, C. F., SPOLIDORIO, D. M. P., GIRO, E. M. A. Efeito da pasta de hidróxido de cálcio associada a clorexedina no tratamento de dentes decíduos humanos com polpa necrosada. In: 26ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica, 2009, Águas de Lindóia - SP. 26ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica, 2009. 6. GREGIO, A. P. B., CANO, V. S. P., AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., RAYMUNDO, D. P., VALENTINI, S. R., ZANELLI, C. F. eIF5A has a function in the elongation step of translation in yeast. In: 24th International Yeast Genetics and Molecular Biology & Molecular Biology Conference, 2009. Manchester - UK. Yeast. Wiley-Blackwell, v. 26, 2009. 7. AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., ZANELLI, C. F., VALENTINI, S. R. Functional interaction analysis between the proteins eIF5A and Sbp1 in Saccharomyces cerevisiae. In: XXVII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2008, Águas de Lindóia - SP. XXVII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2008. 8. AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., BERTOLINI, Maria Célia Molecular and biochemical characterization of the NcPHO85 cyclin-dependent protein kinase from Neurospora crassa. In: XXXVI Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq) and 10th International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) Conference, 2007, Salvador - Bahia. Livro de Resumos, 2007. 9. AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., Terenzi, H. F, BERTOLINI, Maria Célia Inactivation of the NcPho85 Gene Encoding the Pho85p-Like Protein Kinase of Neurospora crassa. In: XXXV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2006, Águas de Lindóia - SP. Livro de resumos, 2006. 10. AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., PAULA, Renato Magalhães de, FREITAS, Fernanda Zanolli, TERENZI, Heitor Francisco, BERTOLINI, Maria Célia Molecular Cloning of the Pho85p-Like Protein Kinase in Neurospora crassa. In: XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2005, Águas de Lindóia - SP. XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2005. 11. AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., SILVA, Juliana L Monteiro da, ANDREOTTI, Patrícia F, GIANNINI, Maria José Soares Mendes Interação de Paracoccidioides brasiliensis com Células Endoteliais. In: XIII Congresso de Iniciação Científica-UNESP, 2001, Bauru-SP. Anais do XIII Congresso de Iniciação Científica-UNESP, 2001. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo expandido) 1. GONDIM, J. O., AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S., ZANELLI, C. F., VALENTINI, S. R., SPOLIDORIO, D. M. P., GIRO, E. M. A. Eficácia antibacteriana da pasta de hidróxido de cálcio associada à clorexedina como medicação intracanal em dentes decíduos humanos. In: 40º Encontro do Grupo Brasileiro de Professores de Ortodontia e Odontopediatria, 2009, São Pedro - SP. 40º Encontro do Grupo Brasileiro de Professores de Ortodontia e Odontopediatria, 2009. Produção Técnica Demais produções técnicas 1. AVACA, J. S. e/ou AVACA-CRUSCA, J. S. Curso de Especialização em Biotecnologia, 2008 (Especialização, Curso de curta duração ministrado). DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Regina e Luis Alberto, que sempre me conduziram pelo melhor caminho, apoiando minhas decisões, e sempre permitindo meu aprendizado e crescimento pessoal. Eles são meus exemplos de vida pessoal e profissional. Ao meu marido, Edson Crusca Junior, que desde o início esteve ao meu lado, nos momentos de alegrias e conquistas e também mas decepções e dificuldades da vida acadêmica e pessoal. Pelos maravilhosos momentos vividos juntos, pela força, compreensão, carinho, paciência e atenção. A Deus, pelos desafios, facilidades e pessoas que Ele colocou em meu caminho, que apesar das dificuldades, me trouxeram tantas alegrias e conquistas. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer ao meu orientador, Prof. Dr. Sandro Roberto Valentini, pela oportunidade, ensinamentos, apoio e valiosas discussões e sugestões. Ao meu co-orientador Prof. Dr. Cleslei Fernando Zanelli pelos ensinamentos. Ao Prof. Ji i Ha ek do Laboratory of Cell Reproduction, da Academy of Sciences of the Czech Republic, em Praga na República Tcheca, que me recebeu muito cordialmente em seu laboratório onde desenvolvi parte da minha pesquisa. Aos Professores do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, em especial o Prof. Dr. Eduardo Maffud Cilli e Prof. Dr. Maria Célia Bertolini pela excelente coordenação do Programa. A minha mãe e ao meu pai por toda minha vida, pelo amor, carinho, incentivo, e pelos sábios aconselhamentos desde sempre. Ao Junior por todo amor, carinho, paciência, apoio e compreensão em todos os momentos vividos juntos. Aos integrantes atuais e aos que passaram pelo laboratório BioMol VZ Diana, Camila, Ana Paula, Danuza, Veridiana, Daniella, Laura, Sílvia, Tatiana, Tati Maria, Thaís, Eliane, Karina, Beatriz, Fábio, Paulo, Eric, Kadu, Hermano e Luciano, pela amizade, pela colaboração, pelas conversas e dúvidas esclarecidas, além dos bons momentos e convivência. Aos integrantes do Laboratory of Cell Reproduction, da Academy of Sciences of the Czech Republic, em Praga na República Tcheca, Tomas, Ivana M., Ivana F., Pavla, Renata, Mirka, Lenka e Jarmila, pela ajuda, apoio e amizade. As funcionárias da Biblioteca e da Seção de Pós-Graduação. A todos os funcionários do Instituto de Química e da Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científica e Tecnológico), FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) e Capes (Coordenadoria de Aperfeiçoamento Profissional de Ensino Superior) pelas bolsas de doutorado e doutorado sanduíche concedidas. Muito obrigada a todos vocês que de alguma maneira contribuíram para formação pessoal e profissional. RESUMO O provável fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial, em que uma lisina específica é convertida em um resíduo de hipusina. Este fator já foi relacionado ao transporte nucleocitoplasmático, à degradação de mRNA e à proliferação celular. Dados recentes restabelecem uma função para eIF5A na tradução e sugerem a sua atuação na etapa de elongação ao invés de início, como originalmente proposto. Uma vez que o envolvimento de eIF5A com o degradação de mRNA ainda não foi elucidado, tornou-se interessante estudar qual a natureza desta relação. O metabolismo de mRNA é um processo complexo que envolve as etapas da tradução (mRNAs nos polissomos), repressão da tradução (mRNAs acumulados em grânulos de estresse) e degradação de mRNA (mRNAs nos P bodies). Os componentes da maquinaria de degradação de mRNA acumulam-se nos P bodies e, neste trabalho, foi verificado que eIF5A não se localiza nestes corpúsculos. Ainda, foi avaliada a formação de P bodies no mutante tif51A-3, na temperatura não permissiva (38ºC), e foi verificada uma inibição na formação de P bodies. Outros mutantes com defeitos na elongação da tradução, como cca1-1 e eft2H699K, também apresentaram defeito na agregação dos P bodies. Foi avaliada a existência de interação genética sintética entre os mutantes tif51A-1 e tif51A-3 e mutantes de fatores envolvidos com a repressão da tradução e/ou degradação de mRNA. Foi revelada uma supressão parcial do fenótipo de termossensibilidade com nocautes dos genes SBP1, DHH1 e PAT1, que codificam fatores ativadores da remoção do capacete e repressores da tradução. Por outro lado, uma interação sintético doente entre os mutantes tif51A-1 e xrn1 foi observada. Por fim, a agregação de grânulos de estresse induzidos por choque térmico foi testada. Os mutantes tif51A-3, tif51AQ22H/L93F e tif51AK56A apresentaram reduzida formação de grânulos de estresse, especialmente o mutante tif51A-3. Foi mostrado que os fatores eIF5A e Sbp1 também se agregam nos grânulos de estresse induzido por choque térmico. Os dados obtidos reforçam o envolvimento de eIF5A com a elongação da tradução, mostram que o efeito de eIF5A na degradação de mRNA é secundário e sugerem uma função para eIF5A como ativador da tradução. ABSTRACT The putative translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archaea to mammals and undergoes an unique and essential post-translational modification, in which a specific lysine residue is converted into a hypusine residue. This factor has been involved in several cellular processes such as nucleocytoplasmic transport, mRNA decay and cell proliferation. Recent data have re-established a function for eIF5A in translation and suggests a role in elongation rather than initiation as originally proposed. Since the involvement of eIF5A with mRNA decay has not been elucidated it has become interesting to study the aspects of this relationship. mRNA metabolism is a complex process that involves the steps of translation (mRNAs on the polysomes), translation repression (mRNAs accumulated in granules) and mRNA degradation (mRNAs in P bodies). The mRNA degradation machinery accumulates in P bodies and in this study we have verified that eIF5A is not localized inside them. P bodies assembly was evaluated in the tif51A-3 mutant at non-permissive temperature and this aggregation was inhibited. Other mutant strains with defects in translation elongation, such as cca1-1 e eft2H699K, also presented defective P body assembly. The existence of synthetic genetic interactions between the eIF5A mutants, tif51A-1 and tif51A-3, and translation repression and/or mRNA decay mutants was evaluated. A partial suppression of the temperature sensitive phenotype of the eIF5A mutants was revealed when SBP1, DHH1 and PAT1 genes were deleted. Since those proteins are decapping activators and translational repressors these interactions reveal a putative function for eIF5A as an inhibitor of translation repression. However, a synthetic sick phenotype between tif51A-1 and xrn1 mutants was observed. Finally, stress granules assembly was induced by robust heat shock in eIF5A mutants, specifically tif51A-3, tif51AQ22H/L93F e tif51AK56A. Stress granules formation was reduced for all strains, especially for the tif51A-3 mutant. Moreover, the factors eIF5A and Sbp1 also aggregate in stress granules induced by robust heat shock. The present data reinforce the involvement of eIF5A with translation elongation, showing that eIF5A has a secondary effect in mRNA decay and suggests a role for eIF5A as an activator of translation. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Etapas do início da tradução em eucariotos 25 Figura 2. Ciclo da elongação da tradução em eucariotos 26 Figura 3. Reação de terminação da tradução 27 Figura 4. Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos de eIF5A de diferentes organismos 37 Figura 5. Via de biossíntese do resíduo de aminoácido hipusina em eIF5A 38 Figura 6. Principais vias de degradação do mRNA eucariótico 46 Figura 7. Metabolismo de mRNA 47 Figura 8. eIF5A não se localiza nos P bodies em diferentes condições de estresse 67 Figura 9. O mutante tif51A-3 não forma P bodies na temperatua não permissiva 68 Figura 10. O mutante cca1-1 não forma P bodies na temperatua não permissiva 69 Figura 11. O dominante negativo eft2 H699K apresenta diminuída formação de P bodies na temperatura não permissiva 70 Figura 12. Resposta à repressão da tradução dos mutantes tif51A-1 e xrn1 induzida por depleção de glicose 73 Figura 13. Os mutantes tif51A-1 e xrn1 são sintético doentes 77 Figura 14. Os mutantes duplo tif51A-1 lsm1 e triplo tif51A-1 dcp1-2 ski8 não apresentam interação genética sintética 78 Figura 15. Os mutantes duplos tif51A-1 ou tif51A-3 e sbp1 apresentam interações genéticas sintéticas por supressão parcial do defeito de crescimento 79 Figura 16. O mutante duplo tif51A-3 dhh1 apresenta interação genética sintética por supressão parcial do defeito de crescimento 80 Figura 17. O mutante duplo tif51A-3 e pat1 apresenta interação genética sintética por supressão parcial do defeito de crescimento 81 Figura 18. Os mutantes estáveis de eIF5A possuem defeito na formação de grânulos de estresse induzidos por choque térmico 89 Figura 19. Os mutantes tif51A-3 e tif51A Q22H/L93F apresentam defeito na formação de grânulos de estresse induzidos por choque térmico 90 Figura 20. Os mutantes de eIF5A apresentam parada no início da tradução após choque térmico 91 Figura 21. Co-localização de eIF5A com a proteína Dcp2 nos grânulos de estresse 92 Figura 22. Co-localização de eIF5A com a proteína Ngr1 nos grânulos de estresse 93 Figura 23. Co-localização de eIF5A com a proteína eEF3 nos grânulos de estresse 94 Figura 24. Presença de Sbp1 nos grânulos de estresse induzidos por choque térmico 95 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Linhagens utilizadas nos experimentos 53 Tabela 2. Plasmídeos utilizados nos experimentos 56 Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados nos experimentos 57 Tabela 4. Resultados da interações genéticas sintéticas 82 ABREVIAÇÕES E SIGLAS g micrograma L microlitro °C graus Celcius 5’-UTR região 5’-não traduzida 7mG capacete de 7-metil-guanosina ATP desoxirriboadenosina trifosfatada ATPase hidrolase que se liga a ATP C-terminal carboxi-terminal Caf4 CCR4 Associated Factor 4 Caf16 CCR4 Associated Factor 16 Caf40 CCR4 Associated Factor 40 Caf130 CCR4 Associated Factor 130 Ccr4 Carbon Catabolite Repression 4 CHX ciclo-heximida cm centímetro CRM Chromosome Region Maintenance 1 Dcp1 mRNA DeCaPping 1 Dcp2 mRNA DeCaPping 2 Dhh1 DExD/H-box Helicase DIC Differential Interference Contrast DNA ácido desoxirribonucleico dNTPs mistura dos desoxirribonucleotídeos trifosfatafos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) D.O. densidade ótica DTT ditiotreitol EDTA ácido etilenodiaminotetracético eEF's fatores de elongação da tradução eEF1A Eukaryotic translation Elongation Factor 1A eEF2 Eukaryotic translation Elongation Factor 2 eEF3 Eukaryotic translation Elongation Factor 3 EF-P Eubacterial Elongation Factor P eIF's fatores de início de tradução eIF1 Eukaryotic translation Initiation Factor 1 eIF1A Eukaryotic translation Initiation Factor 1A eIF2 Eukaryotic translation Initiation Factor 2 eIF3 Eukaryotic translation Initiation Factor 3 eIF4E Eukaryotic translation Initiation Factor 4E eIF4A Eukaryotic translation Initiation Factor 4A eIF4G Eukaryotic translation Initiation Factor 4G eIF4F Eukaryotic translation Initiation Factor 4F eIF4B Eukaryotic translation Initiation Factor 4B eIF5 Eukaryotic translation Initiation Factor 5 eIF5A Eukaryotic translation Initiation Factor 5A eIF5B Eukaryotic translation Initiation Factor 5B eRF1 Eukaryotic translation Release Factor 1 eRF3 Eukaryotic translation Release Factor 3 g grama GC7 N1-Guanil-diaminoheptano GDP desoxirriboguanidina difosfatada GFP Green Fluorescent Protein GIC1 GTPase Interactive Component GTP desoxirriboguanidina trifosfatafa GTPase hidrolase que se liga a GTP GW182 glycine/tryptophan (GW) rich protein h hora HIV-1 vírus da imunodeficiência humana 1 HSP150 Heat Shock Protein 150 IRES Internal Ribosome Entry Sites kb quilobase kDa quilodalton L11 proteína ribossomal da subunidade 60S Lsm1-7 Like Sm1-7 M molar MAP Mitogen-Activated signaling Pathway mCh mCherry Met-tRNAi Methionin initiatior tRNA mg miligrama miRNA micro RNA min minuto mL mililitro mm milímetro mM milimolar mRNA RNA mensageiro mRNP messenger Ribonucleoprotein N normal N-terminal amino-terminal ng nanograma Ngr1 Negative Growth Regulatory protein 1 nm nanômetro NMD Non-sense Mediated Decay Not1-5 (alias CDC39) Cell Division Cycle ODC ornitina descarboxilase ORF Open Reading Frame P0 proteína ribossomal da subunidade 60S PAB1 Poly(A) Binding protein Pat1 Protein Associated with Topoisomerase II pb pares de base P bodies Processing bodies PBS solução salina tamponada com fosfato PCI solução de fenol:clorofórmio:ácido isoamílico (25:24:1) PCR Polymerase Chain Reaction PDB Protein Data Base PEG polietilenoglicol pH potencial hidrogeniônico PKC1 Protein Kinase C PMSF fluoreto de fenilmetilsulfonila poli(A)+ cauda de poliadenina do mRNA Pop2 PGK promoter directed OverProduction 2 PRF Programmed Ribosomal Frameshiting Rev proteína de propagação do vírus HIV-1 RFP Red Fluorescent Protein RNA ácido ribonucleico RNAse enzima que cliva RNA rpm rotação por minuto S5 proteína ribossomal da subunidade 40S Sbp1 provável proteína de ligação a RNA SC meio sintético completo para levedura SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS SDS dodecil sulfato de sódio s segundo SIA1 proteína envolvida na ativação da H+-ATPase Pma1 por glicose SG Stress Granules Ski3 SuperKIller 3 Ski8 SuperKIller 8 SSD1 Suppressor of SIT4 Deletion TAE tampão conteno tris, ácido acético e EDTA TE tampão tris-EDTA Tris tris-hidroximetilaminometano Triton X-100 polietilenoglicol-terc-octilfenil éter tRNA RNA transportador ts temperatura sensível Tub1 TUBulin U unidade enzimática YPD Yeast extract, Peptone, Dextrose media Ypt1 Yeast Protein Two xg aceleração gravitacional Xpo1 (alias Crm1) Chromosome Region Maintenance 1 Xrn1 (alias Kem1) Kar-Enhancing Mutations WSC1 (alias Slg1) Synthetic Lethal with Gap 1 WSC2 cell Wall integrity and Stress response Component 2 WSC3 cell Wall integrity and Stress response Component 3 ZDS1 Zillion Different Screens 1 SUMÁRIO 1. Introdução 21 1.1. Síntese de proteínas em eucariotos 22 1.2. O fator eIF5A 28 1.3. O metabolismo de mRNA: o papel dos P bodies e dos grânulos de estresse 39 2. Objetivo Geral 48 3. Objetivos Específicos 50 4. Metodologia experiemental 52 4.1. Materiais 53 4.2. Métodos 58 4.2.1. Transformação de S. cerevisiae 58 4.2.2. Reação de PCR 58 4.2.3. Extração de DNA genômico de levedura 59 4.2.4. Microscopia de fluorescência para GFP, RFP e mCherry 60 4.2.5. Perfil polissomal 60 4.2.5.1. Preparo do gradiente de sacarose 60 4.2.5.2. Preparo do extrato e centrifugação dos gradientes 61 4.2.5.3. Fracionamento dos gradientes e coleta das frações 61 4.2.6. Teste de sensibilidade a temperatura 62 5. RESULTADOS 63 5.1. eIF5A e a organização dos P bodies 64 5.2. Análise do perfil polissomal de mutantes de eIF5A e xrn1 em condição de repressão da tradução 71 5.3. Avaliação da interação genética entre mutantes de eIF5A e de fatores de repressão da tradução e/ou degradação de mRNA 74 5.4. Avaliação da relação entre os grânulos de estresse, eIF5A e Sbp1 82 6. DISCUSSÃO 95 6.1. eIF5A no contexto dos P bodies 96 6.2. eIF5A no contexto dos fatores de repressão e/ou degradação de mRNA 98 6.3. eIF5A e Sbp1 no contexto dos grânulos de estresse 99 7. CONCLUSÕES 103 REFERÊNCIAS 105 ANEXO 121 21 INTRODUÇÃO 22 1.1. Síntese de proteínas em eucariotos As proteínas estão entre as biomoléculas mais importantes e abundantes nos seres vivos. É necessário, portanto, que a síntese protéica realizada pelo mecanismo de tradução seja um processo amplamente regulado. A tradução requer uma grande maquinaria biológica, a qual utiliza inúmeros componentes, entre eles, mRNAs, RNAs, tRNAs aminoacilados, enzimas diversas e fatores de tradução (MATHEWS; SONENBERG; HERSHEY, 2007). Os componentes protéicos da maquinaria traducional representam mais de 50% do total das proteínas celulares (MERRICK, 1992). A tradução pode ser dividida em três etapas: início, elongação e término. O início da tradução consiste basicamente da seleção do mRNA a ser traduzido e da formação do complexo de pré-iniciação 80S com o Met-tRNAi ligado ao códon iniciador no sítio P (peptidil) do ribossomo. As etapas do início da tradução são mostradas na Figura 1 (adaptada de HERSHEY, 2010) e estão descritas a seguir. Primeiramente, à extremidade 5' do mRNA a ser traduzido, mais especificamente no capacete de 7-metil-guanosina (7mG), ocorre a ligação de eIF4E, seguido de eIF4G e eIF4A. Estes três fatores de início da tradução (eIF's) formam o complexo eIF4F. Na cauda de poliA do mRNA liga-se Pab1 (polyA-binding protein), e por sua vez, a interação eIF4E-eIF4G-Pab1 circulariza o mRNA (GINGRAS; RAUGHT; SONENBERG, 1999; SONENBERG; HINNEBUSCH, 2009). Em seguida, a helicase eIF4A desfaz as estruturas secundárias da extremidade 5'-UTR do mRNA, próximas ao capacete 7mG, possibilitando a ligação do ribossomo nesta região (PESTOVA et al., 2001; HERSHEY, 2010; JACKSON; HELLEN; PESTOVA, 2010). Paralelamente, ocorre a formação do complexo ternário, composto por eIF2- GTP-Met-tRNAi (PESTOVA; LORSCH; HELLEN, 2007), ao qual se liga a subunidade ribossomal 40S e os fatores eIF1, eIF1A, eIF3 e eIF5. Este novo complexo formado é conhecido como complexo de pré-iniciação 43S (CHAUDHURI; CHOWDHURY; MAITRA, 1999; MAJUMDAR; BANDYOPADHYAY; MAITRA, 2003). Ainda, eIF6 liga-se às subunidades 60S, prevenindo a re-associação prematura do ribossomo 80S. Em seguida, o mRNA circularizado é recrutado e ligado ao complexo 43S através de interações entre eIF4G/eIF4B e eIF3/eIF5, formando o complexo 48S. Posteriormente, o complexo de pré-iniciação escaneia o mRNA até localizar o códon de iniciação, geralmente o primeiro AUG da sequência, e então ocorre uma ligação entre o códon e o anticódon (do mRNA e do Met-tRNAi). Finalmente, a subunidade 23 ribossomal 60S acopla-se ao complexo de pré-iniciação 48S formando o complexo de pré-iniciação 80S com o Met-tRNAi ligado ao sítio P do ribossomo (PESTOVA et al., 2001; HERSHEY, 2010; JACKSON; HELLEN; PESTOVA, 2010). A elongação da tradução é um processo mais simples e que requer menos fatores do que o início da tradução. O ciclo de elongação pode ser resumido pelo acoplamento dos tRNA aminoacilados ao ribossomo 80S e formação das ligações peptídicas. Este ciclo se utiliza de fatores de elongação (eEF's: eEF1A, eEF1B ( ) , eEF2 e eEF3) os quais são responsáveis por manter correta a janela de leitura do mRNA (TAYLOR; FRANK; KINZY, 2007). Uma ilustração da etapa de elongação está mostrada na Figura 2 (adaptada de MERRICK, 1992). Após o início da tradução, temos o Met-tRNAi ligado sítio P do ribossomo, o próximo códon a ser traduzido está na posição ribosomal chamada de sítio A (aminoacyl), sendo que, eEF1A-GTP é o responsável por ligar e recrutar os tRNAs aminoacilados para o sítio A, assegurando um correto pareamento códon/anti- códon. Ocorrem mudanças conformacionais no ribossomo, seguido de hidrólise do GTP ligado a eEF1A. Em seguida, eEF1A-GDP é liberado, e este será reciclado por eEF1B ( ) para gerar um novo eEF1A-GTP. O centro peptidil transferase da subunidade maior do ribossomo catalisa a ligação peptídica entre o aminoacil-tRNA do sítio A e o peptidil-tRNA do sítio P, onde há a cadeia polipeptídica nascente. eEF3 é uma ATPase cuja atividade é estimulada pelo ribossomo, sendo este fator necessário para a ligação do complexo aminoacil-tRNA/eIF1A-GTP no sítio A do ribossomo (TRIANA-ALONSO; CHAKRABURTTY; NIERHAUS, 1995). Após a ligação peptídica, a GTPase eEF2 catalisa a translocação do tRNA em um códon, com hidrólise de GTP (TAYLOR et al., 2009), transferindo o tRNA do sítio A/P (aminoacyl/peptidil) para P/E (peptidil/exit), deixando um tRNA não carregado no sítio E e o novo peptidil-tRNA no sítio P (MERRICK, 1992; TAYLOR; FRANK; KINZY, 2007). Ainda, eEF3 promove a liberação do tRNA localizado no sítio E do ribossomo durante os ciclos de elongação (TRIANA-ALONSO; CHAKRABURTTY; NIERHAUS, 1995; ANDERSEN et al., 2006), além de atuar na reciclagem das subunidades ribossomais (KURATA et al., 2010). O término da tradução é mediado pelos fatores eRF1 e eRF3, e está mostrado na Figura 3 (adaptada de FAN-MINOGUE et al., 2008). Na terminação, um dos códons de terminação (UAA, UGA e UAG) é translocado para o sítio A do ribossomo. eRF1 reconhece estes códons e bloqueia a ligação de um novo tRNA. 24 Além disso, eRF1 promove a atividade GTPásica de eRF3 liberando a cadeia polipeptídica. Por fim, ocorre a reciclagem das subunidades ribossomais 40S e 60S (KAPP; LORSCH, 2004; SALAS-MARCO; BEDWELL, 2004; EHRENBERG et al. 2007; FAN- MINOGUE et al., 2008). A regulação dos níveis de síntese protéica ocorre principalmente pela fosforilação, e consequente inibição da atividade, dos fatores de início e elongação da tradução. Em células eucarióticas, essa regulação ocorre principalmente na etapa de início da tradução, o que permite um rápido e reversível controle da expressão gênica neste nível (JACKSON, HELLEN, PESTOVA et al., 2010). Entre os fatores de início alvos de regulação da tradução podemos citar como exemplos, eIF2, eIF3, eIF4E, eIF4G, eIF4B, entre outros. Uma vez que, entre as etapas inicias da tradução está à ligação de eIF4E ao capacete 7mG, a inibição desta ligação torna-se um importante ponto de regulação. Neste cenário, podemos citar a família de proteínas 4E-BP's, que quando hipofosforiladas ligam-se ao fator eIF4E, impedindo sua associação com eIF4G. Quando as 4E-BP's são fosforiladas, estas perdem afinidade por eIF4E, revertendo a inibição. Entre os fatores de elongação, temos como exemplo a fosforilação de eEF2 (MATHEWS; SONENBERG; HERSHEY, 2007; HERSHEY, 2010). Por fim, existe a regulação pela presença de códons de terminação prematuros nos mRNAs, os quais são reconhecidos e o mRNA é direcionado para degradação pela via de NMD (Non sense mediated decay) (CHANG; IMAM; WILKINSON, 2007; BROGNA; WEN, 2009), além disso, estes mRNAs são traducionalmente reprimidos (ZHANG et al., 2010). Através dos mecanismos regulatórios brevemente descritos neste capítulo, compreendemos que as células são capazes de manter a tradução altamente regulada, produzindo as proteínas em níveis adequados. 25 Figura 1. Etapas do início da tradução em eucariotos. O início da tradução apresenta as seguintes etapas: 1) Seleção do mRNA a ser traduzido; 2) Ligação do Mte-tRNAi; 3) Formação complexo 43S; 4) Escaneamento do mRNA até o AUG; 5) Reconhecimento do AUG; 6) Ligação do 60S e reconstituição do ribossomo 80S (adaptada de HERSHEY, 2010). 26 Figura 2. Ciclo da elongação da tradução em eucariotos. A elongação da tradução apresenta as seguintes etapas: transferência do tRNA aminoacilado por eEF1A-GTP para o sítio A do ribossomo; reciclagem de eEF1A-GDP por eEF1B ( ) ; formação da ligação peptídica e liberação do tRNA; translocação por eEF2 (adaptada de MERRICK, 1992). 27 Figura 3. Reação de terminação da tradução. O término da tradução consiste no reconhecimento do códon terminador por eRF1; bloqueio da entrada de um novo tRNA; liberação da cadeia polipeptídica e das subunidades ribossomais por eRF3 (adaptada de FAN-MINOGUE et al., 2008). 28 1.2. O fator eIF5A O provável fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A - Eukaryotic translation Initiation Factor 5A) é altamente conservado desde arqueas a eucariotos, sendo que as proteínas eIF5A de Saccharomyces cerevisiae e de mamíferos são 63% idênticas (SCHNIER et al., 1991; CHEN; LIU, 1997). Na Figura 4 está mostrado um alinhamento das sequências de eIF5A de diversos organismos, incluindo arqueas, eucariotos inferiores e superiores. Como pode ser verificado, há um alto grau de conservação entre as espécies analisadas, o que sugere a importância de eIF5A em processos celulares comuns. A levedura Saccharomyces cerevisiae possui dois genes parálogos que codificam para eIF5A, TIF51A (HYP2) e TIF51B (HYP1 ou ANB1), expressos em condições aeróbicas e anaeróbicas, respectivamente (SCHNIER et al., 1991; WOHL et al., 1993; VALENTINI et al., 2002). Um estudo mostrou que linhagens expressando apenas TIF51A ou TIF51B sob controle de um promotor induzível por galactose são capazes de crescer em aerobiose ou anaerobiose, portanto as proteínas expressas por estes genes são intercambiáveis in vivo (SCHWELBERGER; KANG; HERSHEY, 1993). Estes genes estão localizados em cromossomos diferentes (WOHL et al., 1992), e apesar das ORF's de TIF51A e TIF51B possuírem 90% de identidade, ao compararmos 500 pb das suas regiões flaqueadoras 5'-UTR e 3'-UTR foi verificada uma identidade de apenas 41% e 36%, respectivamente, através de alinhamento múltiplo de sequências. Como esperado, a deleção de TIF51B não afeta o crescimento de células haplóides em condições de aerobiose (WOHL et al., 1993). Em condições aeróbicas, eIF5A expressa por TIF51A pode ser encontrada em três isoformas, uma básica, uma ácida, e um produto de degradação sem os 10 primeiros aminoácidos (WOHL et al., 1993), sendo a forma acídica predominante (KANG; SCHWELBERGER; HERSHEY, 1993). E, uma vez que TIF51A é essencial para a viabilidade celular na presença de oxigênio, vários mutantes condicionais foram isolados e caracterizados (ZUK; JACOBSON, 1998; VALENTINI et al., 2002; DIAS et al., 2008). eIF5A sofre duas modificações pós-traducionais. A primeira delas ocorre na forma acídica de eIF5A, e consiste na fosforilação do resíduo de serina acetilado da região N-terminal da proteína (KANG; SCHWELBERGER; HERSHEY, 1993; KLIER et al., 1993). Esta serina está indicada em verde e negrito na Figura 4, na sequência de 29 aminoácidos de eIF5A de S.cerevisiae. A mutação neste resíduo (S2A em levedura) revelou que a forma não fosforilada de eIF5A não apresenta defeito de crescimento nem de viabilidade celular, além de ser suficiente para promover o crescimento de células tif51A haplóides (KLIER et al., 1993), sugerindo que a fosforilação de eIF5A não seja essencial para o seu funcionamento in vivo. A segunda modificação pós- traducional de eIF5A é única e essencial para sua atividade na célula. Esta modificação corresponde à hipusinação de um resíduo de lisina que é substituído pelo resíduo de aminoácido hipusina (CHEN; LIU, 1997; PARK; LEE; JOE, 1997). No alinhamento de sequências da Figura 4 está sublinhada a região da proteína eIF5A que sofre a hipusinação, conhecida como alça de hipusinação, bem como a lisina alvo desta modificação (marcada em lilás e negrito). A formação do aminoácido hipusina [N -(4-amino-2-hidroxibutil)-lisina] (hypusine: hydroxyputrescine-lysine) ocorre através da transferência, pela desoxi- hipusina sintase, de um grupamento 4-aminobutil da espermidina (uma poliamina) para o amino grupo livre de uma lisina específica, seguido de hidroxilação deste grupo pela desoxi-hipusina hidroxilase. A hipusina é produzida logo após a tradução de eIF5A, sendo esta modificação irreversível e essencial (PARK; WOLFF; FOLK, 1993). A via de biossíntese da hipusina está representada no esquema da Figura 5. O grau de conservação, entre as diferentes espécies, dos resíduos flanqueadores do sítio de hipusinação revela a grande importância deste aminoácido raro (MAGDOLEN et al., 1994; CHEN; LIU, 1997). A mutação deste resíduo (K51R em S. cerevisiae) leva à produção de eIF5A não hipusinado, que não complementa o fenótipo de células onde TIF51A foi nocauteado (SCHNIER et al., 1991). Adicionalmente, o gene codificador da enzima desoxi-hipusina sintase é essencial para o crescimento de S. cerevisiae (SASAKI; ABID; MIYAZAKI, 1996; PARK; LEE; JOE, 1997). Portanto, o fato de eIF5A ser a única proteína eucariótica que sofre hipusinação fortalece a idéia de que este fator seja de fundamental importância no metabolismo celular. É conhecido que as poliaminas, precursoras da hipusina, são essenciais para a proliferação celular (PARK; LEE; FOLK, 1997; LEE et al., 2009). A hipusinação pode ser inibida por um análogo da poliamina espermidina, o GC7 (N1-Guanil- diaminoheptano), uma vez que esta droga liga-se ao sítio ativo da desoxi-hipusina sintase, impedindo a formação da hipusina (PARK, 2006). Recentemente, foi demonstrado em mamíferos que o tratamento das células com GC7 além de inibir a 30 hipusinação de eIF5A, também promove a regulação da tradução nas etapas de início e elongação (LANDAU et al., 2010). eIF5A possui 18 kDa em levedura, podendo variar até 21 kDa dependendo da espécie (PARK; LEE; JOE, 1997). As estruturas tridimensionais de homólogos de eIF5A foram resolvidas por cristalografia para as proteínas das arqueas Methanococcus jannaschii (KIM et al., 1998); Pyrobaculum aerophilum (PEAT et al., 1998) e Pyrococcus horikoshii (YAO et al., 2003). Além destas, as estruturas de eIF5A dos protozoários Leishmania mexicana e Leishmania braziliensis foram depositadas no Protein Data Bank (PDB 1XTD, 1X6O, respectivamente); e a estrutura de eIF5A de humanos (PDB 3CPF) (TONG et al., 2009) também foi resolvida. Um trabalho recente de nosso laboratório gerou por cristalografia a estrutura terciária de eIF5A de S. cerevisiae, a qual está depositada no PDB 3ERO. Estas determinações estruturais revelaram várias características comuns entre as proteínas. Segundo esses estudos, eIF5A trata-se de uma proteína dividida em dois domínios predominantemente compostos por folhas beta. A comparação destes domínios com outras proteínas de estruturas tridimensionais conhecidas mostra que o domínio N-terminal, o qual contém a hipusina, possui um dobramento classificado como Translation Protein SH3-like motif, o qual também está presente em várias proteínas ribossomais (http://supfam.org/SUPERFAMILY) (GOUGH et al., 2001). O domínio C-terminal, por sua vez, é similar a dobramentos de proteínas que se ligam a ácidos nucléicos de fita simples (Single-stranded Oligonucleotide Binding Fold), o qual está presente em proteínas de diferentes funções celulares que se ligam a RNA ou DNA fita simples (http://supfam.org/SUPERFAMILY) (GOUGH et al., 2001). De fato, dois trabalhos publicados tentam correlacionar a função de eIF5A com a ligação a mRNAs, porém a extensão de tais estudos ainda necessita ser ampliada para se estabelecer um papel de eIF5A na interação física direta com mRNAs (XU; CHEN, 2001; XU, JAO; CHEN, 2004). Interessantemente, embora não exista proteína homóloga de eIF5A em eubactérias, o fator de elongação da tradução de bactérias EF-P é um homólogo estrutural de eIF5A de arqueas, sendo a estrutura de eIF5A bastante semelhante a dois domínios de EF-P (HANAWA-SUETSUGU et al., 2004). Portanto, esta conservação estrutural parece estar correlacionada à conservação funcional entre as proteínas. O fator eIF5A foi inicialmente purificado a partir de ribossomos de lisados de reticulócitos de coelho e recebeu esta denominação, pois foi considerado um fator 31 de início de tradução, devido a sua capacidade de estimular a síntese de metionil- puromicina in vitro (BENNE; HERSHEY, 1978). O antibiótico puromicina é um análogo estrutural da extremidade 3’ de um tRNA aminoacilado e pode ocupar o sítio ribossomal A possibilitando que seu radical amino primário interaja com um Met- tRNAi, reproduzindo a formação de uma ligação peptídica. O ensaio de metionil- puromicina mede a incorporação de metionina radioativa, a partir de Met-tRNAi, à puromicina, através de catálise ribossomal, sendo, portanto, um ensaio bastante utilizado para avaliar a influência de diferentes fatores no início da tradução. Apesar da capacidade evidente de eIF5A estimular a síntese de metionil- puromicina in vitro utilizando-se tripletes AUG ou mRNA de globina, a não adição de eIF5A não mostrou nenhum impacto sobre a síntese de globina in vitro, discordando, de resultados obtidos na ausência dos outros fatores de início de tradução eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5B e eIF5, também testados. Além disso, eIF5A não pareceu influenciar a formação in vitro de complexo ternário ou a ligação do mRNA de globina ou do Met-tRNAi à subunidade 40S (BENNE; HERSHEY, 1978). A possibilidade de eIF5A atuar na elongação da tradução também foi considerada, mas nenhum efeito positivo foi observado com a adição de eIF5A em um sistema de síntese protéica para polimerização de poli-fenilalanina a partir de ácido poli-uridílico, ribossomos 80S e fatores de elongação eEF1 e eEF2 purificados (BENNE; HERSHEY, 1978). Em concordância com esse trabalho inicial de caracterização funcional de eIF5A em sistemas in vitro, foram publicados posteriormente estudos mostrando que a inibição da maturação funcional de eIF5A (discutida a seguir) não se correlaciona a uma repressão da tradução em células de mamífero, e que a depleção deste fator em S. cerevisiae leva a uma pequena diminuição (30%) da taxa de síntese protéica (DUNCAN; HERSHEY, 1986; KANG; HERSHEY, 1994; ZUK; JACOBSON, 1998). Assim, apesar de eIF5A ter sido denominado inicialmente um fator de início de tradução, a sua função como tal não foi claramente demonstrada. Uma função para eIF5A como fator geral da tradução foi descartada, uma vez que, a depleção in vivo deste fator em levedura causa uma pequena redução, de apenas 30%, nos níveis de síntese protéica total (KANG; HERSHEY, 1994). Interessantemente, neste estudo foi verificado que esta depleção de eIF5A gerou um aumento de células paradas em G1, sugerindo que eIF5A seja um fator envolvido na tradução de um grupo específico de mensageiros, como por exemplo, aqueles codificadores de proteínas envolvidas na transição G1/S do ciclo celular 32 (KANG; HERSHEY, 1994). Essa hipótese foi levantada, pois vários autores mostraram que o bloqueio de qualquer uma das etapas envolvidas na hipusinação de eIF5A leva a uma inibição da proliferação celular de diferentes linhagens tumorais de células de mamíferos (HANAUSKE-ABEL et al., 1994; PARK et al., 1994; CHEN et al., 1996; SHI et al., 1996b). Além destas, outras observações também evidenciam o envolvimento de eIF5A com proliferação celular como, por exemplo, foi verificado que a expressão de eIF5A é induzida em linfócitos T ativados (BEVEC et al., 1996). Complementando estes dados, um estudo utilizando Drosophila melanogaster evidenciou uma perda no controle do ciclo celular, no início do desenvolvimento deste inseto, em consequência da alteração dos níveis de eIF5A (LEE et al., 2001). Portanto, estes dados reforçaram o envolvimento de eIF5A com a progressão do ciclo celular. Embora proposto previamente que eIF5A seja um cofator celular da proteína Rev de HIV-1 e esteja envolvido na exportação dos mensageiros tardios deste vírus (RUHL et al., 1993; BEVEC et al., 1996; BEVEC; HAUBER, 1997; ELFGANG et al., 1999; ROSORIUS et al., 1999), outros estudos não evidenciam o envolvimento de eIF5A com transporte nucleocitoplasmático (HENDERSON; PERCIPALLE, 1997; SHI; YIN; WAXMAN, 1997; JAO; CHEN, 2002; VALENTINI et al., 2002). Curiosamente, um trabalho recente, mostrou que a inibição da hipusinação provoca a inibição da expressão de HIV-1 (HOQUE et al., 2009). Em outro trabalho, foi mostrado que eIF5A possui um efeito regulatório positivo na expressão gênica independente da proteína Rev e na tradução do RNA de HIV-1, além de ser um co-fator que aumenta a tradução mediada por IRES (Internal Ribosome Entry Sites) deste vírus (LIU et al., 2011). Portanto, eIF5A poderia ter um papel na tradução específica desse tipo de vírus. Uma análise da localização subcelular de Rev utilizando diferentes linhagens de células de mamíferos, revelou que esta proteína, produzida transientemente, está localizada no núcleo, e que eIF5A apresenta uma localização citoplasmática que coincide com a do retículo endoplasmático (SHI et al., 1996a). Ainda, ao se inibir a transcrição a localização de Rev é alterada completamente, enquanto que, a de eIF5A permanece inalterada. Entretanto, inibidores da tradução, alteram a localização subcelular de eIF5A, mas não de Rev. Esses dados sugerem que eIF5A não sofre translocação nucleocitoplasmática como ocorre com Rev (SHI; YIN; WAXMAN, 1997). Em S. cerevisiae, eIF5A é uma proteína que apresenta uma localização citoplasmática com maior concentração perinuclear (VALENTINI et al., 33 2002), o que está de acordo com sua localização em células de mamíferos, onde eIF5A localiza-se principalmente no citoplasma (SHI; YIN; WAXMAN, 1997; JAO; CHEN, 2002). Esta localização perinuclear não é alterada em leveduras contendo um alelo temperatura-sensível de XPO1, gene que codifica para CRM1/exportina 1 em leveduras, na temperatura não permissiva. Assim como acontece em mamíferos, o bloqueio da ação de exportina 1 em leveduras leva a um acúmulo da proteína Rev de HIV-1 no núcleo. Entretanto, não ocorre acúmulo de eIF5A nas mesmas condições onde ocorre acúmulo de Rev no mutante de Xpo1, e também não ocorre acúmulo de Rev no núcleo em mutantes de eIF5A, o que compromete o envolvimento de eIF5A com a exportação de proteínas através do receptor CRM1/exportina 1 (VALENTINI et al., 2002). Interessantemente, foi mostrado em células de mamíferos que a localização subcelular de eIF5A de humanos está relacionada à hipusinação (LEE et al., 2009). A forma precurssora de eIF5A localiza- se em ambos, citoplasma e núcleo, enquanto que, a forma hipusinada está predominantemente no citoplasma celular, local onde este fator pode atuar na tradução, sendo exportada pela exportina 4, de uma maneira depentente da hipusinação (LEE et al., 2009). O fator eIF5A está envolvido com a degradação de mRNA, pois foi demonstrado que o mutante temperatura-sensível (ts) do gene TIF51A, o mutante ts1159, acumula mRNA sem o capacete 7mG na temperatura não permissiva (ZUK; JACOBSON, 1998). Além deste, outros mutantes de eIF5A descritos por nosso laboratório (tif51A-1, tif51A-2 e tif51A-3) também acumulam mRNAs na temperatura não permissiva (VALENTINI et al., 2002). Em outro estudo, foi mostrado que linhagens contendo formas mutadas de eIF5A de humano apresentaram fenótipo ts e síntese protéica diminuída. Estes mutantes apresentaram também acúmulo de mRNAs semelhante ao observado em linhagens deficientes para NMD (Non-sense mediated decay), além de aumento na meia-vida de alguns transcritos de genes dependentes de NMD (SCHRADER et al., 2006). Diversos genes foram isolados como supressores em alto número de cópias do fenótipo ts do mutante tif51A-1. Entre estes genes estão: PAB1, PKC1, WSC1, WSC2, WSC3, SIA1, HSP150, GIC1 e ZDS1 (VALENTINI et al., 2002; ZANELLI; VALENTINI, 2005). O encontro desses genes levou à sugestão de uma nova via de sinalização celular a partir de Pkc1. A proteína Pkc1 participa da resposta a choque hipoosmótico, juntamente com as proteínas Wsc1, 2 e 3. Ainda, foi mostrado que a 34 supressão por Pkc1 é independente da via de MAP quinases e foi descrita uma via de sinalização intracelular que atua abaixo de Pkc1 e que envolve as proteínas Zds1 e Gic1. Os genes supressores PKC1, ZDS1 e GIC1 são importantes para a polaridade celular na levedura, e uma vez que, mutantes de eIF5A apresentam defeito na polarização do citoesqueleto de actina na temperatura não permissiva (ZANELLI; VALENTINI, 2005). É provável que eIF5A esteja envolvido com a progressão no ciclo celular em levedura de maneira indireta, através do controle da expressão gênica em nível traducional. Adicionalmente, um rastreamento de letalidade sintética foi realizado utilizando o mutante ts tif51A-3 e revelou o gene YPT1 como sendo sinteticamente letal com TIF51A (FRIGIERI et al., 2007). Esta letalidade sintética entre tif51A-3 e ypt1 passa a envolver direta ou indiretamente o fator eIF5A com a via secretória, uma vez que a proteína Ypt1 trata-se de uma GTPase envolvida com o trânsito vesicular do retículo endoplasmático para o Golgi. Além disso, o dado de que os genes supressores PKC1, WSC1, WSC2 e WSC3 estão relacionados ao correto funcionamento da via secretória (GUSTIN et al., 1998) fortalecem o envolvimento de eIF5A nesta via do metabolismo celular. Interessantemente, foi observado que mutações na via secretória direcionam a uma rápida e específica atenuação do início de tradução. Isto ocorre como resposta primária da célula para preservação de energia e prevenção de acúmulo de proteínas não localizadas adequadamente devido à inativação do transporte vesicular (DELOCHE et al., 2004). Diante deste dado, foi sugerido por nosso laboratório que eIF5A e Ypt1 trabalhem juntas na célula para garantir a síntese protéica apropriada e a secreção das proteínas necessárias para a formação do novo broto durante a fase G1/S em levedura (FRIGIERI et al., 2007; FRIGIERI et al., 2008). Retornando ao cenário da tradução, resultados obtidos em nosso laboratório fortaleceram o envolvimento de eIF5A com a etapa de elongação ao invés de início da tradução. Em um primeiro trabalho, foi mostrado através de ensaios de copurificação seguidos de identificação por espectrometria de massas que eIF5A interage com as proteínas ribossomais (P0, S5 e L11) e com o fator de elongação de tradução 2 (eEF2), componentes da maquinaria de tradução (ZANELLI et al., 2006). Ainda, foi observado que eIF5A interage especificamente com monossomos funcionalmente ativos, e que mutantes condicionais de eIF5A apresentam defeito no perfil polissomal (ZANELLI et al., 2006). Resultados de outro laboratório também 35 sugerem o envolvimento de eIF5A com a etapa de elongação da tradução, pois foi verificado que eIF5A interage fisicamente com proteínas ribossomais (JAO; CHEN, 2006). Além disto, o análogo de eIF5A de eubactérias (EF-P) tem sua atividade especificamente afetada in vitro por inibidores da atividade peptidil-transferase (AOKI et al., 2008) e similarmente foi observada a sensibilidade dos mutantes de eIF5A de levedura a inibidores da tradução, como a esparsomicina e anisomicina (ZANELLI et al., 2006). Estes dados evidenciam uma função para eIF5A na elongação da tradução. Posteriormente, em outro trabalho de nosso laboratório, foram realizadas interações genéticas e análises de perfil polissomal de linhagens que combinam mutações em eIF5A e em fatores envolvidos na etapa de início (eIF4E) ou elongação (eEF2) da tradução, onde foi observada interação genética entre TIF51A e os genes analisados (GREGIO et al., 2009). Neste estudo, foi mostrado que o perfil polissomal do mutante ts tif51A-3 é bastante semelhante ao do dominante negativo de eEF2 (eft2H699K) e que a depleção de eIF5A provoca uma diminuição significativa na síntese protéica total e um aumento no tempo de trânsito ribossomal (GREGIO et al., 2009). Fortalecendo e complementando os dados publicados pelo nosso laboratório, foi mostrado que o mutante ts tif51AD63V apresentou defeito na capacidade de realizar a alteração na janela de leitura programada +1, chamada de PRF +1 (Programmed Ribosomal Frameshiting), efeito semelhante ao observado para linhagens selvagens tratadas com sordarina, um inibidor de eEF2. Ainda, a linhagem selvagem tratada com sordarina apresentam perfis polissomais semelhantes ao mutantes de eIF5A, com acúmulo de polissomos na temperatura não permissiva, reforçando a correlação entre eIF5A e eEF2 (SAINI et al., 2009). Um estudo realizado pelo nosso laboratório identificou dois mutantes, tif51AK56A e tif51AQ22H/L93F, que possuem eIF5A estável na temperatura não permissiva (DIAS et al., 2008). Foi mostrado mais recentemente que o mutante tif51AK56A apresenta uma interação genética do tipo sintético doente com o dominante negativo de eEF2 (eft2H699K) (DIAS et al., 2011). A superexpressão de eEF2 em tif51AK56A suprime os defeitos de crescimento, de morfologia celular, de síntese protéica total e melhora a resistência à droga higromicina B, a qual possui ação como inibidor da síntese protéica e promove alterações de PRF. Além disso, a superexpressão de eEF2 no mutante tif51AK56A corrige o defeito de elongação da 36 tradução do mutante de eIF5A como verificado por ensaios de perfil polissomal. Estes resultados demonstram que eIF5A está intimamente correlacionado com a função de eEF2 na elongação da tradução fortalecendo a hipótese de eIF5A atuar nesta etapa da tradução. 37 Pho -------------------MGDKTKVQVSKLKPGRYIIIDDEPCRIVNITVSSPGKHGSA 41 Pae -------------------MSTK-YVEAGELKEGSYVVIDGEPCRVVEIEKSKTGKHGSA 40 Mja ---------------MVIIMPGTKQVNVGSLKVGQYVMIDGVPCEIVDISVSKPGKHGGA 45 Sce MSD--EEHT-FETADAG--SSATYPMQCSALRKNGFVVIKSRPCKIVDMSTSKTGKHGHA 55 Spo MAE--EEHVDFEGGEAG--ASLTFPMQCSALRKNGHVVIKGRPCKIVDMSTSKTGKHGHA 56 Lme MSD---EDHDFAHQGGGDNASKTYPMAAGALKKGGYVCINGRPCKVIDLSVSKTGKHGHA 57 Lbr MSD---EDHDFSHQGGGDNASKTYPLAAGALKKGGYVCINGRPCKVIDLSVSKTGKHGHA 57 Cel MSDDHHDDEHFHTGDSG--AAATFPKQCSALRKNEHVMIKGRPCKIVEMSTSKTGKHGHA 58 Dme MAEL---DDQFETTDSG--ASTTYPMQCSALRKNGFVMLKSRPCKIVEMSTSKTGKHGHA 55 Mmu MAD----DLDFETGDAG--ASATFPMQCSALRKNGFVVLKGRPCKIVEMSTSKTGKHGHA 54 Hsa1 MAD----DLDFETGDAG--ASATFPMQCSALRKNGFVVLKGWPCKIVEMSASKTGKHGHA 54 Hsa2 MAD----EIDFTTGDAG--ASSTYPMQCSALRKNGFVVLKGRPCKIVEMSTSKTGKHGHA 54 . . *: . .: :.. **.:::: *..**** * Pho KARIEAVGIFDGKVRSIVKPTSAEVDVPIIDKKTAQVIAITPD-------TVQIMD---M 91 Pae KARIVAVGVFDGGKRTLSLPVDAQVEVPIIEKFTAQILSVSGD-------VIQLMD---M 90 Mja KARVVGIGIFEKVKKEFVAPTSSKVEVPIIDRRKGQVLAIMGD-------MVQIMD---L 95 Sce KVHLVAIDIFTGKKLEDLSPSTHNMEVPVVKRNEYQLLDIDDG-------FLSLMN-MDG 107 Spo KVHIVALDIFNGRKYEDMSPSTHNMDVPVVKRDEYQLVNIDDG-------YLNLMT-TDG 108 Lme KVSIVATDIFTGNRLEDQAPSTHNVEVPFVKTFTYSVLDIQPNEDPSLPSHLSLMD-DEG 116 Lbr KVSIVATDIFTGNRLEDQAPSTHNVEVPFVKTYTYSVLDIQANEDPSLPAHLSLMD-DEG 116 Cel KVHMVAIDIFTSKKLEDICPSTHNMDVPVVKRREYLLMAIDDG-------YCSLMDPESC 111 Dme KVHMVGIDIFSNKKYEDICPSTHNMDVPNVKREDLQLIAISDDS------FLTLMT-ESG 108 Mmu KVHLVGIDIFTGKKYEDICPSTHNMDVPNIKRNDFQLIGIQDG-------YLSLLQ-DSG 106 Hsa1 KVHLVGIDIFTGKKYEDICPSTHNMDVPNIKRNDFQLIGIQDG-------YLSLLQ-DSG 106 Hsa2 KVHLVGIDIFTGKKYEDICPSTHNMDVPNIKRNDYQLICIQDG-------YLSLLT-ETG 106 *. : . .:* * :::** :. :: : . :: Pho ETYETFEVPIDTGVADEIRDQLKEGI---NVEYWETLGRIKIMRIKGEGE--- 138 Pae RDYKTIEVPMKY-VEEEAKGRLAPGA---EVEVWQILDRYKIIRVK------- 132 Mja QTYETLELPIPE----GIEG-LEPGG---EVEYIEAVGQYKITRVIGGK---- 136 Sce DTKDDVKAP-EGELGDSLQTAFDEGK-DLMVTIISAMGEEAAISFKEAARTD- 157 Spo TTKDDVRLP-EGELGNEIEEGFDEGR-DLIITVVSAMGEETALACRDAPSS-- 157 Lme ESREDLDMPPDAALATQIKEQFDSGK-EVLVVVVSAMGTEQVLQTKNAAEK-- 166 Lbr ESREDLDMPPDPALATQIKEQFDSGK-EVLVVVVSAMGTEQVLQTKNAAEK-- 166 Cel EQKDDLKLP-DTELGQQIRDAYEKDEGSVLVQVVSAIGEEAILGWKVSTKE-- 161 Dme DLREDLKVP-EGELGEQLRLDFDSGK-DLLCTVLKACGEECVIAIKTNTALDK 159 Mmu EVREDLRLP-EGDLGKEIEQKYDCGE-EILITVLSAMTEEAAVAIKAMAK--- 154 Hsa1 EVPEDLRLP-EGDLGKEIEQKYDCGE-EILITVLSAMTEEAAVAIKAMAK--- 154 Hsa2 EVREDLKLP-EGELGKEIEGKYNAGE-DVQVSVMCAMSEEYAVAIKPCK---- 153 . . * . . Figura 4. Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos de eIF5A de diferentes organismos. As sequências de arqueas: Pho (Pyrococcus horikoshii), Pae (Pyrobaculum aerophilum), Mja (Methanococcus jannaschii); de eucariotos inferiores: Sce (Saccharomyces cerevisiae), Spo (Schizosaccharomyces pombe), Lme (Leishmania mexicana), Lbr (Leishmania braziliensis), Cel (Caenorhabditis elegans), Dme (Drosophila melanogaster), Mmu (Mus musculus), e de eucariotos superiores: Hsa1 (Homo sapiens eIF5A-1) e HsaI2 (Homo sapiens eIF5A-2) foram comparadas através do programa CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Os resíduos de aminoácidos completamente conservados em todos os organismos estão marcados com "*", os resíduos com alguma conservação estão marcados com ":" ou "." indicando uma maior ou menor conservação, respectivamente. A região sublinhada indica os resíduos que fazem parte da região da alça de hipusinação, o resíduo de lisina modificado para hipusina está na cor lilás e em negrito, e o resíduo de serina- acetilado que sofre fosforilação em S. cerevisiae está na cor verde e em negrito. 38 Figura 5. Via de biossíntese do resíduo de aminoácido hipusina em eIF5A. A modificação pós-traducional que ocorre em eIF5A está mostrado simplificadamente. Um resíduo 4-aminobutil da poliamina espermidina é transferido para a lisina alvo em eIF5A pela enzima desoxi-hipusina sintase. A forma intermediária de eIF5A sofre a hidroxilação pela desoxi-hipusina hidroxilase formando eIF5A madura e hipusinada (adaptada de PARK, 2006). 39 1.3. O metabolismo de mRNA: o papel dos P bodies e dos grânulos de estresse O controle entre a tradução e a degradação dos mRNAs também representa um ponto relevante da regulação da expressão gênica (WILUSZ; WORMINGTON; PELTZ, 2001; MOORE, 2005). Diversos estudos, utilizando a levedura S. cerevisiae como modelo, foram realizados para analisar o degradação de mRNA como mecanismo de regulação da expressão gênica, e esses estudos revelaram componentes cruciais de mecanismos de regulação da estabilidade de mensageiros evolutivamente conservados (HILLEREN; PARKER, 1999; VASUDEVAN; PELTZ, 2001; WILUSZ; WORMINGTON; PELTZ, 2001; COLLER; PARKER, 2004). Durante o processamento do mRNA de eucaritos são incorporados co- transcricionalmente ao transcrito duas estruturas que conferem estabilidade a este mRNA: o capacete de 7mG na extremidade 5' e a cauda poli(A)+ na extremidade 3'. Essas duas estruturas interagem com as proteínas citoplasmáticas eIF4E e Pab1, respectivamente, protegendo o transcrito da ação de exonucleases (WILUSZ; WILUSZ, 2004). Para o início da degradação de mRNA, uma dessas estruturas deve ser comprometida ou o mRNA deve sofrer clivagem por ataque endonucleásico (WILUSZ; WILUSZ, 2004). Ao longo dos vários ciclos da tradução de um mRNA eucariótico, ocorre o encurtamento da cauda de poli(A)+ pelo complexo de desadelinação, o qual inclui as nucleases Ccr4 e Pop2, além de proteínas efetoras como Not1-5, Caf4, Caf16, Caf40 e Caf130 (DENIS et al., 2001; TUCKER et al., 2001). Em seguida, é ativada a remoção do capacete 7mG da extremidade 5' do mRNA pelo complexo Dcp1/Dcp2 (DECKER; PARKER, 1993; MUHLRAD; DECKER; PARKER, 1994), e então, o mRNA é degradado no sentido 5' 3' por Xrn1 (HSU; STEVENS, 1993). Alternativamente, o mRNA desadenilado pode ser degradado mais lentamente no sentido 3' 5' pelo complexo de exorribonucleases, o exossomo (MUHLRAD; DECKER; PARKER, 1995; ANDERSON; PARKER, 1998; CAO; PARKER, 2001), seguido da hidrólise do capacete 7mG pela enzima DcpS (VAN DIJK; LE HIR; SÉRAPHIN, 2003). Na via de remoção do capacete 7mG, juntamente com o complexo Dcp1/Dcp2, atuam fatores ativadores da remoção do capacete, que incluem Dhh1, Pat1, Sbp1, Edc3, Scd6 e o complexo Lsm1-7 (BONNEROT; BOECK; LAPEYRE, 2000; THARUN et al., 2000; COLLER et al., 2001; THARUN; PARKER, 2001; KSHIRSAGAR; PARKER, 2004; SEGAL; DUNCKLEY; PARKER, 2006; 40 NISSAN et al., 2010). Na Figura 6 estão descritas resumidamente as principais vias de degradação do mRNA e as enzimas e complexos envolvidos nestas etapas (adaptada de PARKER; SHETH, 2007). Uma eficiente remoção do capacete 7mG do mRNA está correlacionada à formação de complexos de mRNPs não traduzidos com fatores de maquinaria de degradação (COLLER; PARKER, 2004). Portanto, a remoção do capacete é uma etapa muito importante no degradação de mRNA, visto que permite a degradação rápida do transcrito, sendo assim um alvo para regulação (PARKER; SHETH, 2007). Alguns estudos verificaram que há uma competição entre o complexo de remoção do capacete (Dcp1/Dcp2) e o complexo de início de tradução eIF4F pelo capacete 7mG (BEELMAN; PARKER, 1994; SCHWARTZ; PARKER, 1999; 2000). Baseado na análise dos corpúsculos de processamento (P bodies), foi concluído que a tradução e a remoção do capacete atuam competitivamente (COLLER; PARKER, 2004). Estes corpúsculos são atualmente chamados de P bodies, mas foram inicialmente chamados de corpúsculos de Dcp1 ou corpúsculos GW182, e receberam estas denominações por apresentarem em sua composição as proteínas Dcp1, Dcp2, Xrn1 e GW182 (BASHKIROV et al., 1997; EYSTATHIOY et al., 2002; INGELFINGER et al., 2002; VAN DIJK et al., 2002; SHETH; PARKER, 2003). Posteriormente, outros componentes dos P bodies foram identificados, como os fatores ativadores da remoção do capacete (FENGER-GRØN et al., 2005; YU et al., 2005; SCHELLER et al., 2007; BECKHAM et al., 2008) . Portanto, os P bodies são agregados citoplasmáticos cuja composição pode variar, mas contêm principalmente os mRNA que não estão sendo traduzidos (mRNPs), os fatores de remoção do capacete e fatores de degradação de mRNA (SHETH; PARKER, 2003; COUGOT et al., 2004; EULALIO et al., 2007; PARKER; SHETH, 2007). As proteínas que compõem os P bodies são conservadas desde leveduras até os mamíferos (ANDERSON; KEDERSHA, 2006; EULALIO et al., 2007; PARKER; SHETH, 2007). Os P bodies e seus mRNPs agregados têm sido amplamente estudados, e estes corpúsculos já foram envolvidos com a repressão da tradução (HOLMES et al., 2004; COLLER; PARKER, 2005), com o degradação normal de mRNAs (SHETH; PARKER, 2003; COUGOT et al., 2004), com a via de NMD (UNTERHOLZNER; IZAURRALDE, 2004; SHETH; PARKER, 2006), e com o armazenamento de mRNA (BRENGUES; TEIXEIRA; PARKER, 2005; BHATTACHARYYA et al., 2006). Os P bodies servem como marcadores da proporção entre os mRNPs complexados com as maquinarias de 41 repressão e degradação de mRNA, além de poderem atuar no controle da tradução dos mRNAs e/ou na sua degradação (NISSAN; PARKER, 2008; BUCHAN; NISSAN; PARKER, 2010). Os componentes dos P bodies podem atuar como repressores da tradução durante a depleção de glicose e outras condições de estresse celular (HOLMES et al., 2004; COLLER; PARKER, 2005; PILKINGTON; PARKER, 2008), reforçando a relação dos P bodies com os processos de tradução e degradação de mRNAs. É estabelecido que estes corpúsculos servem como local de armazenamento de mRNAs no citoplasma até que sua tradução seja adequada (PARKER; SHETH, 2007), entretanto, a função e a importância dos P bodies na regulação dos mRNPs ainda está sujeita a controvérsias e inúmeros estudos estão em andamento. Na Figura 7 (BALAGOPAL; PARKER, 2009) está mostrado um esquema do ciclo do mRNA dentro da célula, mostrando o envolvimento do mRNA com tradução, degradação e acúmulo em corpúsculos. Após a tradução, os mRNAs acumulam-se nos P bodies e podem ser direcionados para a degradação, e ao se interferir no processo da tradução, foram observadas consequências no tamanho e número dos P bodies (SHETH; PARKER, 2003; TEIXEIRA et al., 2005). Além disso, se interferirmos nas etapas de repressão e/ou degradação de mRNA, também verificamos alterações no padrão de agregação destes corpúsculos (PARKER; SHETH, 2007; NISSAN; PARKER, 2008). Uma vez que os níveis de tradução e degradação de mRNA são influenciados por um equilíbrio dinâmico entre os polissomos e os mRNPs presentes nos P bodies, a observação da localização de fatores componentes de P bodies pode ser informativa com relação às alterações nas diferentes etapas da tradução e da degradação de mRNAs. Estudos mostram que a adição do inibidor da elongação da tradução ciclo- heximida provoca um acúmulo de mRNA ligados a ribossomos, levando à redução drástica de P bodies; por outro lado, o bloqueio do início da tradução acarreta aumento em tamanho e número de P bodies, além de aumentar a remoção do capacete de 7mG. Portanto, nestes estudos foi mostrado que há uma relação direta entre o pool de proteínas celulares funcionais e a agregação deste corpúsculos (BEELMAN; PARKER, 1994; SCHWARTZ; PARKER, 1999; SHETH; PARKER, 2003; TEIXEIRA et al., 2005). Além disso, a deleção de diferentes componentes dos P bodies pode levar ao acúmulo ou ausência de outros componentes dos P bodies, assim como a sua distribuição na célula (TEIXEIRA; PARKER, 2007). 42 Em um trabalho de 2005, Coller e Parker, verificaram que ao se interromper duas vias de repressão da tradução, pela deleção de DHH1 e PAT1, ocorre inibição da formação de P bodies. Neste estudo, foi sugerido que os ativadores da remoção do capacete Dhh1 e Pat1 mediam a transição da tradução para o degradação de mRNA, e estes fatores estariam atuando também na repressão da tradução (COLLER; PARKER, 2005). Portanto, a formação dos P bodies está fortemente relacionada com os níveis de tradução na célula (PARKER; SHETH, 2007). Os fatores de início de tradução eIF4E e eIF4G foram observados nos P bodies durante a depleção de glicose e na fase estacionária de crescimento celular (BRENGUES; PARKER, 2007). Estes resultados sugerem que os mRNAs poliadenilados podem entrar nos P bodies, e que um complexo de mRNP traducionalmente reprimido, incluindo mRNA poli(A)+, Pab1, eIF4E e eIF4G pode representar uma situação transitória do mRNA entre P bodies e posterior retorno à tradução (BRENGUES; PARKER, 2007). Dois componentes dos P bodies foram identificados como necessários para a agregação de corpúsculos visíveis em S. cerevisiae. As proteínas Edc3 e Lsm4 foram determinados como os fatores que promovem as interações físicas entre os mRNPs e são necessárias para a agregação do P bodies (DECKER; TEIXEIRA; PARKER, 2007; REIJNS et al., 2008). Nestes estudos, foram geradas linhagens de levedura com a deleção da região C-terminal do domínio de dimerização de Edc3 (chamado Yjef-N), e uma deleção do domínio rico em Glutamina/Asparagina (Q/N) da região C-terminal de Lsm4, e foi verificado que nestas células não há formação de P bodies (DECKER; TEIXEIRA; PARKER, 2007; REIJNS et al., 2008). Entretanto, nestas linhagens a tradução e o degradação de mRNA não sofrem alterações, o que gera dúvidas sobre a função e importância destes corpúsculos. Interessantemente, um estudo demonstrou haver uma relação entre a formação do P bodies e os microtúbulos em S. cerevisiae (SWEET et al., 2007). Neste trabalho, foi mostrado que ao romper os microtúbulos, pela ação do droga benomil ou em uma linhagem mutante da -tubulina, a formação dos P bodies é estimulada e favorecida. Ainda, foi verificado que durante a desestabilização dos microtúbulos, a proteína Tub1 co-localiza com os P bodies. Nestas condições de formação dos P bodies, não foram observadas alterações na estabilidade do mRNA nem na tradução de uma maneira geral. Portanto, estes dados revelaram que a agregação 43 dos P bodies está relacionada à rede intracelular de microtúbulos, independentemente da degradação ou da tradução dos mRNAs (SWEET et al., 2007). Além dos P bodies, outros corpúsculos citoplasmáticos contendo mRNPs já foram descritos em eucariotos, como os grânulos de estresse (Stress granules - SGs) (ANDERSON; KEDERSHA, 2008), diversos grânulos de células germinativas (ANDERSON; KEDERSHA, 2006), grânulos neuronais (BARBEE et al., 2006) e grânulos de mRNPs importantes para a via secretória (DECKER; PARKER, 2006). Acredita-se que a característica em comum destes corpúsculos é que eles promovem uma repressão da tradução restrita a um determinado momento e local. Entretanto, se estes grânulos possuem uma função na regulação ou repressão da tradução, ou na remoção do capacete 7mG, ou no degradação de mRNA, ainda permanece obscura (Franks e Lykke-Andersen, 2008). Em S. cerevisiae, além dos P bodies (BRENGUES; PARKER, 2007), foram descritos os grânulos de estresse (BUCHAN; MUHLRAD; PARKER, 2008; GROUSL et al., 2009; SWISHER; PARKER, 2010) e os EGP bodies (HOYLE et al., 2007). Estes corpúsculos diferem quanto aos componentes presentes e/ou ausentes em cada um deles, quanto ao tipo de estresse que induza sua formação e pela dependência da fosforilação de eIF2 e da quinse Gcn2 (THOMAS et al., 2011). Recentemente, os grânulos de estresse foram descritos para S. cerevisiae e apresentam em sua composição geral os fatores do complexo de pré-iniciação 48S. Mais epecificamente, estes corpúsculos contêm: mRNAs não traduzidos (mRNPs) ligados a Pab1, fatores de início de tradução (eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4E, eIF4G), a subunidade ribossomal 40S, proteínas envolvidas com tradução (Pub1, Ngr1), proteínas envolvidas com a degradação de mRNA (Dcp2, Dhh1, Xrn1, Lsm12, Sus1), e por fim, proteínas de função desconhecida e ligantes de Lsm12 (Pbp1, Pbp4) (KEDERSHA et al., 2002; KEDERSHA et al., 2005; ANDERSON; KEDERSHA, 2006; BUCHAN; MUHLRAD; PARKER, 2008; BALAGOPAL; PARKER, 2009; GROUSL et al., 2009; BUCHAN; NISSAN; PARKER, 2010; CUENCA-BONO et al., 2010; SWISHER; PARKER, 2010). Logo, a composição destes corpúsculos bem como as condições que induzem ou suprimem sua agregação continuam sendo alvo de investigação. Alguns trabalhos de revisão sobre o assunto foram publicados recentemente (KEDERSHA; ANDERSON, 2009; BUCHAN; NISSAN; PARKER, 2010; THOMAS et al., 2011). Tanto os P bodies como os grânulos de estresse são estruturas dinâmicas e formam-se simultaneamente em células submetidas a estresses ambientais e 44 apresentam proteínas em comum, como Xrn1 e eIF4E (KEDERSHA et al., 2005; HOYLE et al., 2007; BRENGUES; PARKER, 2007). Entretanto, os P bodies e os grânulos de estresse diferem nos seguintes aspectos: 1) apenas os P bodies são observados em células em fase exponencial de crescimento e sem estresse, 2) apenas a formação dos grânulos de estresse necessita da fosforilação de eIF2 induzida por estresse e 3) os grânulos de estresse são definidos pelos fatores de início da tradução (complexo de pré-iniciação 48S: eIF3, eIF4A, Pab1 e subunidade ribossomal 40S), enquanto que os P bodies são definidos pelos componentes da maquinaria de degradação de mRNA Dcp1, Dcp2 e Edc3 (TEIXEIRA et al., 2005; KEDERSHA et al., 2005; BUCHAN; PARKER, 2009; KEDERSHA; ANDERSON, 2009). Portanto, os mRNAs agregados nos P bodies seriam direcionados para a degradação, enquanto que os mRNAs presentes nos grânulos de estresse estariam mais propensos a retornar para a tradução após remoção do estresse (Figura 7). Muitas proteínas já foram identificadas por se agregarem em grânulos de estresse após aplicação de estresse, tanto para mamíferos como para leveduras, e a lista destas está em constante reformulação (KEDERSHA; ANDERSON, 2009; THOMAS et al., 2011). Para leveduras, além das proteínas do complexo de pré-iniciação 48S, foram identificadas outras proteínas envolvidas na degradação de mRNA, como Dhh1 (GROUSL et al., 2009; SWISHER; PARKER, 2010) e Sus1 (CUENCA-BONO et al., 2010). Em mamíferos, foi mostrado que eIF5A hipusinado é necessário para promover a formação de grânulos de estresse induzidos por arsenito (LI et al., 2010), o que sugere uma importância da hipusinação, e talvez de eIF5A, na formação destes agregados citoplasmáticos. Ainda, foi verificada a localização citoplasmática de eIF5A nos grânulos de estresse induzidos por diferentes estresses, como tratamentos com drogas (arsenito e clotrimazol) e por choque térmico (LI et al., 2010). Estes dados da literatura, somados à identificação de outros fatores de elongação nos grânulos de estresse, entre eles eEF3 e eEF1B( ) (HA EK, J.)1, despertaram o interesse de investigar a presença de eIF5A nestes corpúsculos induzidos por choque térmico. Recentemente, foi descrito que a formação dos grânulos de estresse em levedura pode ser induzida por vários fatores, entre eles, choque térmico a 46ºC (GROUSL et al., 2009), depleção de glicose (BUCHAN; MUHLRAD; PARKER, 2008; 1 HA EK, J. (Institute of Microbiology - Academy of Sciences of the Czech Republic) Comunicação pessoal, 2010. 45 SWISHER; PARKER, 2010), adição de arsenito (SWISHER; PARKER, 2010), adição de NaN3 0,5% (BUCHAN; YOON; PARKER, 2011) e adição de etanol 15% (KATO et al., 2011). Ainda, segundo o tipo de estresse aplicado nas células, o conteúdo dos grânulos de estresse formados apresenta proteínas específicas (KEDERSHA; ANDERSON, 2009; BUCHAN; NISSAN; PARKER, 2010; THOMAS et al., 2011). Portanto, sabe-se que sua composição pode variar, entretanto, sua função celular não está eluciada, o que torna interessante a investigação de quais os componentes dos grânulos de estresse são essencias para sua formação. Como representado na Figura 7, os P bodies e grânulos de estresse podem estar co-localizados. Em células de mamíferos, foi verificado que estes corpúsculos estão ancorados, já em levedura estes estariam sobrepostos e são estruturas independentes (KEDERSHA et al., 2005; BUCHAN; MUHLRAD; PARKER, 2008). Em S. cerevisiae, a formação dos P bodies e grânulos de estresse pode ser suprimida ou modificada em diversas linhagens mutantes, o que torna a levedura um modelo de estudo interessante (COLLER; PARKER, 2005; DECKER; TEIXEIRA; PARKER, 2007; TEIXEIRA; PARKER, 2007; BUCHAN; MUHLRAD; PARKER, 2008; NISSAN; PARKER, 2008). Baseado nos estudos dessas linhagens, foi proposto que a formação dos grânulos de estresse é favorecida quando há P bodies pré-existentes, o que sugere uma relação funcional entre eles (BUCHAN; MUHLRAD; PARKER, 2008). Apesar de eIF5A ter sido envolvido recentemente com a elongação da tradução (GREGIO et al., 2009; SAINI et al., 2009), o mecanismo pelo qual eIF5A exerce sua função permanece ainda indeterminado. Além disso, os efeitos de eIF5A na degradação de mRNA (ZUK; JACOBSON, 1998; VALENTINI et al., 2002) e na repressão da tradução mediada por estresse (LI et al., 2010) também precisam ser esclarecidos. 46 Figura 6. Principais vias de degradação do mRNA eucariótico. O mRNA é primeiramente submetido à remoção da cauda de poli(A)+ pelo complexo Ccr4/Not1- 5/Pop2, posteriormente este pode ser degradado por uma das vias mostradas. O capacete é removido pelo complexo Dcp1/Dcp2, então o mRNA é degradado no sentido 5´ 3´ por Xrn1. Alternativamente, a degradação ocorre no sentido 3´ 5´ pelo complexo do exossomo (adaptada de PARKER; SHETH, 2007). 47 Figura 7. Metabolismo de mRNA. O mRNA pode existir em ao menos três locais no citoplasma: nos polissomos, nos P bodies ou nos grânulos de estresse. O recrutamento de repressores da tradução, como Dhh1 e Pat1, podem induzir movimento do mRNA para o estado de não-tradução. Uma competição cinética ocorre entre as seguintes etapas: saída dos mRNAs da tradução (run-off), recrutamento da maquinaria de tradução, remoção do capacete 7mG, degradação do transcrito, agregação dos P bodies e retorno do mRNA para a tradução. Condições limitantes do início da tradução podem levar à agregação dos grânulos de estresse, onde a concentração de proteínas da tradução é alta (adaptada de BALAGOPAL; PARKER, 2009). 48 2. OBJETIVO GERAL 49 O objetivo deste trabalho foi ampliar a compreensão dos efeitos celulares de eIF5A na inter-relação das etapas da tradução, sua repressão e degradação de mRNA em S. cerevisiae. 50 3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 51 Como descrito acima, as etapas de tradução, repressão da tradução e da degradação dos mRNAs estão relacionadas. Uma vez que eIF5A já foi envolvido com os processos de tradução e degradação, estes objetivos específicos foram estabelecidos para melhor entender o papel de eIF5A nesse contexto. 3.1. Estudar a localização subcelular de proteínas para determinar a relação de eIF5A com a organização dos P bodies; 3.2. Analisar o perfil polissomal de eIF5A em condições de repressão da tradução induzida por depleção de glicose; 3.3. Analisar a existência de interação genética sintética entre mutantes de eIF5A e mutantes de fatores envolvidos com a repressão da tradução e/ou degradação de mRNA; 3.4. Avaliar a relação entre os grânulos de estresse, eIF5A e Sbp1; 52 4. MATERIAIS E MÉTODOS 53 4.1. MATERIAIS Os materiais (linhagens, plasmídeos e oligonucleotídeos) utilizados neste trabalho estão listados na tabelas 1, 2 e 3, respectivamente. Tabela 1. Linhagens utilizadas nos experimentos. Linhagem Outros nomes Genótipo Origem SVL8 MATa ade2 trp1 ura3 leu2 his can1 cyt1::HIS3 Coleção do laboratório SVL10 MATa ade2 trp1 ura3 leu2 his3 can1 cyt1::HIS3 tif51A-1 (tif51AP83S) Coleção do laboratório SVL14 SVY144 e PSY8-35 MATa ade2 his3 leu2 trp1 ura3 can1 tif51A-1 (tif51AP83S) (VALENTINI et al., 2002) SVL17 MAT ade2 trp1 ura3 leu2 his3 can1 tif51A-1 (tif51AP83S) Coleção do laboratório SVL55 MATa ura3 trp1 leu2 Pamela Silver SVL73 SVY479 e PSY1176 MATa leu2 ade2 ade3 ura3 lys2 can1 Pamela Silver SVL100 PSY1190 MAT ade2 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 xrn1::URA3 Pamela Silver SVL101 PSY1757 MATa ade leu2 trp1 ura3 tif51A-1 (tif51AP83S) xrn1::URA3 Pamela Silver SVL114 MAT leu2-3 ade2-1 ade3 his3-11-15 trp1-1 tif51A-3 (tif51AC39Y/G118D) (FRIGIERI et al., 2007) SVL132 MAT his3 leu2 ura3 trp1 tif51A::HIS3 [TIF51A/URA3/CEN] Coleção do laboratório 54 SVL323 MAT his3 leu2 ura3 trp1 tif51A::HIS3 [tif51A-1/LEU2/CEN] (tif51AP83S) Coleção do laboratório SVL445 MATa ade2 ura3 his3 leu2 lys2 trp1 tif51A- 3::URA3 (tif51AC39Y/G118D) ssd1::LEU2 Coleção do laboratório SVL447 MAT ade2 ura3 his3 leu2 lys2 trp1 can1 tif51A-3::URA3 (tif51AC39Y/G118D) ssd1::LEU2 Coleção do laboratório SVL513 MAT trp1 his3 leu2 ura3 ade2 tif51A-1 (tif51AP83S) ssd1::LEU2 Coleção do laboratório SVL529 MAT his3 leu2 ura3 trp1 tif51A::HIS3 [tif51A-3/LEU2/CEN] (tif51AC39Y/G118D) Coleção do laboratório SVL595 yAS2324 MATa ade2 his 3 leu2 trp1 ura3 lsm1::LEU2 Charles Cole SVL596 MAT his3 leu2 ura3 pat1::kanMX4 Charles Cole SVL599 MAT his3 leu2 ura3 trp1 tif51A::HIS3 [tif51AQ22H/L93F/TRP1/CEN] Coleção do laboratório SVL634 MAT his3 leu2 ura3 trp1 tif51A::HIS3 [tif51AK56A/LEU2/CEN] Coleção do laboratório VZL781 MATa his3 leu2 ura3 dhh1::kanMX4 Coleção de nocautes VZL784 MATa his3 leu2 ura3 sbp1::kanMX4 Coleção de nocautes VZL789 MATa leu2 trp1 ura3 his4 cup1::LEU2/PGK1pG/MFA2pG DCP2-GFP (SHETH; PARKER, 2003) VZL801 yRP1345 MATa his4 leu2 lys 2 ura3 dcp1-2::TRP1 ski8::URA3 (DUNCKLEY ; TUCKER; PARKER, 2001) 55 VZL910 MAT leu2 trp1 his3 ura3 cca1-1 DCP2-GFP (NEO) Este trabalho VZL912 MATa leu2 trp1 his3 his4 ura3 ade2 ade3 DCP2-GFP (NEO) Este trabalho VZL915 MAT leu2 trp1 his3 ura3 tif51A-3 DCP2-GFP (NEO) Este trabalho VZL996 MAT leu2 lys2 ura3 dcp1-2::TRP1 tif51A::HIS3 [tif51A-1/LEU2/CEN] (tif51AP83S) Este trabalho VZL1109 Sbp1-GFP MATa his3 1 leu2 0 met15 0 ura3 0 SBP1- GFP::HIS3MX6 GFP collection VZL1110 CRY204 MATa ura3 leu2 his3 trp1 lys2 suc2 RPG1- GFP::kanMX Ji i Ha ek VZL1111 CRY255 MAT ura3 leu2 his3 trp1 lys2 suc2 RPG1- mRFP::kanMX Ji i Ha ek VZL1112 MAT his3 leu2 ura3 trp1 lys2 RPG1- mRFP::kanMX tif51A::HIS3 [TIF51A/URA3/CEN] Este trabalho VZL1113 MATa his3 leu2 ura3 trp1 RPG1- mRFP::kanMX tif51A::HIS3 [tif51AQ22H/L93F/TRP1/CEN] Este trabalho VZL1114 MATa his3 leu2 ura3 trp1 lys2 RPG1- mRFP::kanMX tif51A::HIS3 [tif51AK56A/LEU2/CEN] Este trabalho VZL1115 MATa his3 leu2 ura3 trp1 lys2 RPG1- mRFP::kanMX tif51A::HIS3 [tif51A-3/LEU2/CEN] (tif51AC39Y/G118D) Este trabalho VZL1116 MATa his3 leu2 ura3 trp1 lys2 met15 SBP1- GFP::HIS3MX6 RPG1-mRFP::kanMX Este trabalho VZL1117 MAT his3 1 leu2 0 lys2 0 ura3 0 dcp2- mCherry::norseotricina [pSV137] Este trabalho VZL1118 MAT his3 1 leu2 0 lys2 0 ura3 0 ngr1- mCherry::norseotricina [pSV137] Este trabalho 56 VZL1119 MAT his3 1 leu2 0 lys2 0 ura3 0 yef3- mCherry::norseotricina [pSV137] Este trabalho VZL1124 MAT his3 leu2 ura3 trp1 lys2 RPG1- mRFP::kanMX tif51A::HIS3 yef3- mCherry::norseotricina [TIF51A/URA3/CEN] Este trabalho VZL1125 MAT his3 leu2 ura3 trp1 RPG1- mRFP::kanMX tif51A::HIS3 yef3- mCherry::norseotricina [tif51A-3/LEU2/CEN] (tif51AC39Y/G118D) Este trabalho VZL1126 MAT his3 leu2 ura3 trp1 RPG1- mRFP::kanMX tif51A::HIS3 yef3- mCherry::norseotricina [tif51AQ22H/L93F/TRP1/CEN] Este trabalho Tabela 2. Plasmídeos utilizados nos experimentos. Plasmídeo Outros nomes Descrição Origem pSV59 pRS315 Vetor LEU2/CEN (SIKORSKI; HIETER, 1989) pSV60 pRS316 Vetor URA3/CEN (SIKORSKI; HIETER, 1989) pSV65 pRS426 Vetor URA3/2 (CHRISTIANSON et al., 1992) pSV76 pPS808 Vetor URA3/2 para expressão em fusão com GFP (N-terminal, GALp) Pamela Silver pSV137 TIF51A clonado em vetor GALp- GFP (pSV76) Coleção do laboratório pSV138 TIF51A clonado em vetor pSV60 Coleção do laboratório pSV300 EFT2 clonado no vetor pSV64 Coleção do laboratório 57 pVZ955 pRP1175 Fusão DCP2-GFP clonada em vetor LEU2/2 (COLLER; PARKER, 2005) pVZ1104 Dominante negativo de eEF2, eft2H699K, gerado por mutação sítio dirigida a partir do pSV300 Coleção do laboratório pVZ1181 pFM699 Plasmídeo pFM699 contruído a partir do pFA6a-natNT2 (JANKE et al., 2004) com cassete de mCherry clonado nos sítios de BamHI e SalI Marian Farkasovsky e Roger Tsein Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados nos experimentos. Oligonucleotídeo Sequência VZO912 5' - CGA ATG GAA CTT CAG GGT CTA ATG AAT TAT TAA GCA TTT TGC ATA GGA AGC GTA CGC TGC AGG TCG AC - 3' VZO913 5' - CGG CTG CCT TCA TTT ACA GTG TGT CTA TAA AAC GTA TAA CAC TTA TTC TT - 3' VZO914 5' - TCC TAA TAG GAA CAA TGT TCC GCC AAT TCA TCC TTC TCT TCT ACA TCG TAC GCT GCA GGT CGA C - 3' VZO915 5' - CGT AGA GAC GCA GAT AAA ACT GCG GAC AAG ATT AAA ATT TTC TTT TTT TGT CTT TTG TAA ATC GAT GAA TTC GAG CTC G - 3' VZO916 5' - TCT TTT TGA TCA CTG CTT TCA CAG TTT TCT TTA AGA TTT TTA TTG CGT ACG CTG CAG GTC GAC - 3' VZO917 5' - TTG ATC AAT AAA AAT CTT AAA GAA AAC TGT GAA AGC AGT GAT CAA AAA GAA TCG ATG AAT TCG AGC TCG - 3' 58 4.2. MÉTODOS Os procedimentos básicos de preparação de soluções e meios de cultivo, preparação de Escherichia coli competente, transformação de E. coli, preparação de plasmídeos a partir de E. coli em pequena escala, bem como outras metodologias utilizadas neste trabalho foram baseadas nos seguintes manuais de laboratório: (GUTHRIE; FINK, 1991; SAMBROOK; RUSSELL, 2001; AUSUBEL et al., 2004). 4.2.1. Transformação de S. cerevisiae Uma colônia da linhagem de interesse foi inoculada em 5 mL de meio adequado e incubada a 30ºC sob agitação por toda a noite. Um volume de 1,5 mL da cultura foi centrifugado na velocidade máxima por 5 s. Após a remoção do sobrenadante, as células foram lavadas com 1 mL de água ultrapura estéril, suspensas em 1 mL de solução de acetato de lítio 100 mM e então incubadas por 5 min a 30ºC. As células foram coletadas por centrifugação e o sobrenadante foi removido. Foram adicionados, na seguinte ordem, 240 L de PEG 50%, 36 L de acetato de lítio 1 M, 25 L de DNA de esperma de salmão (2 mg/mL) e 5 L de DNA plasmidial (100 ng a 5 g) , completando-se o volume de reação com 45 L de água ultrapura estéril. O microtubo foi então agitado vigorosamente (vortex) por 1 min e incubado a 42ºC por 20 min. Os microtubos foram centrifugados na velocidade máxima por 10 s. Após o sobrenadante ter sido removido, as células foram suspensas em 150 L de água ultrapura estéril e então plaqueadas em meio seletivo apropriado. As placas foram incubadas a 30ºC até o aparecimento de colônias. 4.2.2. Reação de PCR As reações de PCR foram realizadas em microtubos de 0,5 mL contendo 1 M de cada oligonucleotídeo, 1 L de uma mistura de desoxiribonucleotídeos 100 M cada (dATP, dTTP, dCTP e dGTP), 1 L de DNA genômico de levedura e 2 U da enzima Taq Hifi DNA Polimerase (Invitrogen), num volume final de reação de 50 L. As condições das reações foram estabelecidas de acordo com a temperatura de desnaturação dos oligonucleotídeos utilizados. Após o último ciclo, as reações foram mantidas a 72ºC por 5 min. Os produtos das reações foram então analisados por eletroforese em gel de agarose 0,8% em tampão TAE (Tris 40 mM, ácido acético glacial 0,11% e EDTA 1 mM). 59 4.2.3. Extração de DNA genômico de levedura A linhagem de interesse foi cultivada até a saturação em 10 mL de meio YPD líquido a 30ºC, sob agitação. O volume total de cultura foi submetido à centrifugação a 3.000 xg por 15 min a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e as células suspensas em 500 L de água ultrapura e transferidas para um microtubo de 1,5 mL. O tubo foi submetido à centrifugação a 13.000 xg por 1 min, o sobrenadante foi descartado e as células suspensas no líquido residual. A esse tubo foram adicionados 200 L de tampão de lise (Triton X-100 2%, SDS 1%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM), 200 L de solução PCI (Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico a 25:24:1) e aproximadamente 300 mg de pérolas de vidro. A mistura foi agitada em vortex por 3 min. Posteriormente, foram adicionados 200 L de tampão TE pH 8,0 (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0). O tubo foi agitado em vortex e submetido à centrifugação a 13.000 xg por 5 min. Após esse procedimento, a fase aquosa foi transferida para um microtubo de 1,5 mL ao qual foram adicionados 200 L de solução PCI. A mistura foi agitada novamente, submetida à centrifugação a 13.000 xg por 5 min e a fase aquosa transferida para um novo microtubo de 1,5 mL. Esse procedimento de extração foi repetido duas vezes. A seguir, foi adicionado ao tubo 1 mL de etanol absoluto gelado e o conteúdo homogeneizado por inversão. O tubo foi centrifugado a 13.000 xg por 2 min a 4°C e o sobrenadante descartado. O precipitado foi suspenso em 400 L de TE pH 8,0 e foram adicionados 3 L de RNase (10 mg/mL). A suspensão foi incubada por 30 min a 37ºC. Em seguida, foram adicionados 200 L de solução PCI e o tubo foi agitado brevemente em vortex. A mistura foi submetida à centrifugação a 13.000 xg por 5 min a 4ºC e a fase aquosa foi transferida para um novo microtubo de 1,5 mL. Ao tubo foram adicionados 10 L de acetato de amônio 4 M e 1 mL de etanol absoluto gelado. O conteúdo dos tubos foi misturado por inversão e estes foram centrifugados a 13.000 xg por 2 min a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 400 L de etanol 75% gelado. Após a secagem, o precipitado foi suspenso em 50 L de TE pH 8,0. A concentração do DNA genômico foi determinada por espectrofotometria a 260 nm, e a relação entre as absorbâncias a 260/280 nm foi analisada. Como parâmetro de qualidade, foram consideradas adequadas amostras com valor da razão entre 1,8- 2,0. Este DNA foi armazenado em freezer a -20ºC até o momento do uso. 60 4.2.4. Microscopia de fluorescência para GFP, RFP e mCherry Para a análise da formação de P bodies, células de diferentes linhagens de interesse expressando a fusão Dcp2-GFP, um marcador de P bodies, foram cultivadas em meio apropriado a 25ºC ou 30ºC até D.O.600nm = 0,6 (TEIXEIRA et al., 2005). Quando o plasmídeo pSV137 (VALENTINI et al., 2002) foi utilizado, a expressão de GFP-eIF5A foi induzida com galactose 4% por 1 a 2 h em meio apropriado. Já quando mutantes termossenvíveis foram utilizados, as células foram submetidas a 38ºC por 1 a 4 h para induzir a depleção de eIF5A (VALENTINI et al., 2002). Então, as células foram coletadas (13.000 xg por 1 min), lavadas com tampão PBS 1x (NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 10 mM; KH2PO4 1,8 mM pH 7,4), ressuspendidas em 1 mL de solução PBS 1x e incubadas por 10 min sob agitação e na temperatura adequada, para induzir a formação dos P bodies. Para analisar a distribuição dos P bodies, a proteína de fusão Dcp2-GFP foi analisada com uso do microscópio de fluorescência Nikon Eclipse TE300 com objetiva de 100x. Nos experimentos de formação de grânulos de estresse foram utilizadas proteínas consideradas marcadores destes corpúsculos em fusão com GFP (verde), RFP (vermelho) ou mCherry (vermelho). Para gerar as fusões com a proteína mCherry foi utilizado o plasmídeo pFM699 (pVZ1181), o qual foi construído por Marian Farkasovsky e Roger Tsien, do Institute of Molecular Biology - Slovak Academy of Sciences (Bratislava, República Eslovaca). As fusões de Dcp2, Ngr1 e eEF3 à proteína mCherry foram realizadas por PCR utilizando os oligonucleotídeos VZO912/913, VZO914/915, VZO916/917, respectivamente. As células foram cultivadas em meio apropriado até D.O.600nm = 0,6 a 25ºC ou 30ºC, coletadas por centrifugação, ressuspendidas em meio pré-aquecido a 46ºC e incubadas nesta temperatura por 10 min. Em seguida, para a visualização dos corpúsculos, as células foram lavadas com meio SC com glicose. Para fix