1 Bruno Faulin Gamba Estudo Citogenético da região 17p11.2 A síndrome de Smith-Magenis Botucatu 2010 2 Bruno Faulin Gamba Estudo Citogenético da região 17p11.2 A síndrome de Smith-Magenis Orientador: Prof. Adj. Danilo Moretti-Ferreira Botucatu 2010 Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências de Botucatu (IBB) da Universidade Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como requisito obrigatório para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, A/C: genética. 3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus Gamba, Bruno Faulin. Estudo Citogenético da região 17p11.2: a síndrome de Smith-Magenis / Bruno Faulin Gamba. – Botucatu : [s.n.], 2010. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Botucatu, 2010 Orientador: Danilo Moretti-Ferreira Assunto CAPES: 20801017 1. Smith-Magenis, Síndrome de 2. Citogenética 3. Anomalias Palavras-chave: Deleção 17p11.2; Fenótipo comportamental; FISH; Síndrome de Smith-Magenis 4 1. INTRODUÇÃO Nas últimas três décadas, várias condições genéticas, clinicamente reconhecíveis, tiveram suas causas estabelecidas pela detecção de pequenas deleções em regiões específicas do genoma humano. Estas afecções com fenótipo clínico distinto são denominadas de síndromes de microdeleção ou de síndromes de genes contíguos, podendo ser atribuídas a uma haploinsuficiência de muitos locos gênicos contíguos, dentro da região deletada (SCHMICKEL, 1986). Atualmente, tais condições, na qual o fenótipo clínico e a consequência de dosagem ou desregulação anormal de um ou mais genes resultantes de rearranjos no genoma, tem sido denominadas de doenças genômicas (LUPSKI, 1998; STANKIEWICZ & LUPSKI, 2002; LUPSKI, 2003; SHAW & LUPSKI, 2004). A deleção ou a perda de um seguimento cromossômico pode ser terminal (na extremidade do cromossomo) ou intersticial (dentro de um braço do cromossomo). Os efeitos clínicos desta deleção dependem do tamanho, do seguimento perdido e, do número, tamanho e da importância dos genes que este segmento contém (SPINNER & EMANUEL, 2002). Além das deleções usualmente detectadas nos exames citogenéticos de rotina, novas técnicas de citogenética de alta resolução e citogenética molecular têm possibilitado a identificação de deleções que são muito pequenas e que não são visualizadas nas metáfases de preparações citogenéticas habituais. Para ser identificável, citogeneticamente, por bandeamento de alta resolução, uma deleção deve abranger, aproximadamente 4Mb (KEARNEY, 2001; MCNEIL & RIED, 2000). Estas pequenas deleções foram observadas em regiões específicas e encontradas em pacientes com síndromes clinicamente reconhecidas (síndromes 5 onde existe uma associação característica entre aparência incomum e desenvolvimento defeituoso de órgãos ou sistemas). Isto levou a acreditar que os aspectos clínicos destas síndromes resultam da perda de muitos genes diferentes, que estão fisicamente ligados, ou seja, que a deleção se estende sobre vários genes contíguos, que se localizam dentro da mesma região cromossômica deletada. A tabela 1 resume as principais síndromes de microdeleção já estabelecidas e suas regiões cromossômicas envolvidas (SHAFFER, et al., 2007). Tabela 1: Síndromes de microdeleção com região cromossômica crítica estabelecida.* Síndrome OMIN Localização no cromossomo Tamanho da microdeleção (Mb) Sotos 117550 5q35.2 2,2 Williams-Beuren 194050 7q11.23 1.6 Microdeleção 8p23 600576 8p23.1 6 Prader-Willi/Angelman 176270/105830 15p12 4 Smith-Magenis 182290 17p11.2 1.5 – 12 Neurofibromatose 1/DM 162200 17q11.2 1.5 DiGeorge/Velocardiofacial 1 188400 22q11.2 1.5 – 3 * modificada de Shaffer et al., (2007). Vale ressaltar alguns aspectos comuns nas síndromes de microdeleção: (a) são afecções bem delineadas, porque são causadas pela perda de muitos genes comuns, mas uma maior ou menor quantidade de genes da região podem ter sido comprometidos em cada caso individual; (b) apresentam um amplo espectro de acometimento ou quadro clínico, estando sempre presente algum nível de deficiência mental; (c) o padrão de herança é usualmente esporádico, 6 mas não se podem excluir casos familiares e (d) as perdas cromossômicas podem ser detectadas ao microscópio, mas o exame citogenético de rotina normal não exclui a microdeleção (SCHIMICKEL, 1986). 7 2 SÍNDROME DE SMITH-MAGENIS A síndrome de Smith-Magenis (SMS) (OMIM #182290) foi descrita em nove pacientes pelo grupo de pesquisa de Ellen Magenis, em artigo de Smith et al., (1986), como uma síndrome que envolve uma alteração na região 17p, tendo sido observada uma deleção parcial em oito indivíduos e uma deleção completa da banda 17p11.2 em um dos indivíduos. A SMS apresenta fenótipo que inclui características físicas, desenvolvimentais e comportamentais, sendo ambos os sexos igualmente afetados (SMITH, et al., 2009). Assim como em outras afecções de microdeleção, existe grande variabilidade no fenótipo da SMS, principalmente nas malformações associadas. Além disso, ocorre uma modificação nas dismorfias faciais, que são muito sutis nos primeiros anos de vida, e tornam-se mais evidentes no final da infância e na adolescência (ALLANSON, et al., 1999), bem como uma mudança evolutiva dos aspectos neurológico e comportamental (SMITH, et al., 1998). Andrieux et al., (2007), utilizando a técnica de Comparação Genômica por Hibridização por arrays (CGH-array), quantificaram microdeleções em 30 pacientes diagnosticados previamente com SMS pela técnica de Hibridização in situ por Fluorescêcnia (FISH). Três pacientes apresentaram grandes deleções (12Mb) e, em dois deles, foi observada fissura de lábio e palato, característica presentes em 10% dos pacientes com SMS (GREENBERG, et al., 1996). Neste estudo foi sugerido que grandes deleções estejam associadas a fenótipos que apresentem fissura de lábio e palato e que estas grandes deleções incluem o gene da ubiquitina (UBB) como gene candidato para fissuras de lábio e palato não sindrômicas. A tabela 2 resume os principais aspectos clínicos observados na SMS. 8 Tabela 2: Resumo dos principais sinais clínicos da síndrome de Smith-Magenis.* Crâniofacial/músculo esquelético Frequência % Braquicefalia 90 Hipoplasia de face média 90 Prognatismo relativo com a idade 50 Face larga e de formato quadrado 80 Sinofre 30-65 Lábio superior protuso e em “v” invertido 70-90 Baixa estatura 70 Escoliose 40-70 Otorrinolaringológica Anomalias de laringe e ouvido médio 80-90 Voz rouca e grave 80 Neuro-comportamental Comprometimento cognitivo/atraso no desenvolvimento 100 Hipotonia (até os 2 anos) 90 Distúrbio do sono 90 Atraso de fala 90 Agressividade 80-100 Sinal de auto-agressão 70-90 Lamber os dedos como se folhassem páginas 50-80 Auto abraço 50-80 Poliembolocoilomania 25-85 Onicotilomania 25-85 Aspectos comuns Obesidade 13 Anormalidades odontológicas 90 *modificada de Elsea & Girirajan, (2008). 2.1 Fenótipo comportamental e síndrome de Smith-Magenis 2.1.1 Fenótipo comportamental O termo fenótipo comportamental foi usado pela primeira vez por William Nyhan (1972) ao enfocar sua atenção no comportamento de auto-mutilação presente nos meninos com déficit de hipoxantina-guanina fosforibosiltranferase (doença de Lesch-Nyhan) descrevendo que “o comportamento é endógeno e não exógeno” e que as crianças tinham um comportamento incomum e singular. A 9 doença de Lesch-Nyhan é um erro inato do metabolismo das purinas que acarreta a produção exagerada de ácido úrico, provocando um quadro, com início no 2º ano de vida, de deficiência mental, distonia, comprometimento das articulações e da fala, e auto-mutilação crônica. Harris (1987), após avaliar crianças afetadas pela síndrome de Prader-Willi com hiperfagia e Lesch-Nyhan com auto-mutilação, propõe que o fenótipo comportamental abrange transtornos de comportamento não aprendidos, ou seja, transtornos que não são determinados por fatores educacionais ou pelo meio ambiente do paciente. Desta forma, a idéia é que o fenótipo de muitas condições não se restringe às características físicas e à predisposição a certos problemas médicos (cardiopatia, malformação renal, etc.), mas também abrange e, principalmente, inclui o comportamento (DYKENS, et al., 2000). Uma das grandes autoras neste assunto e defensora desta idéia, Dra Elisabeth Dykens, explica que o fenótipo comportamental envolve a alta probabilidade de um indivíduo, com uma afecção genética reconhecível, vir a exibir um padrão característico de comprometimento do seu desenvolvimento diferente daqueles que não são portadores (DYKENS, 1995). Apesar de não haver consenso, a Sociedade de Estudos do Fenótipo Comportamental (Society for the Study of Behavioural Phenotypes – SSBP) organizada em 1987, define fenótipo comportamental como: “um padrão de características de anormalidades motoras, cognitivas, lingüísticas e sociais, o qual é consistentemente associado a uma alteração biológica”. Esta entidade (SSBP) foi motivada pelos pais e cuidadores de indivíduos portadores de afecções genéticas, que se manifestavam com uma deficiência mental e com um 10 comportamento problemático e incomum que era pouco compreendido, cuja maior dificuldade seria o manejo/cuidado desses indivíduos. O fenótipo comportamental de diversos transtornos biológicos, com causas genéticas conhecidas ou não, auxilia na prática de atendimento médico, como um importante dado para a suspeita diagnóstica. 2.1.2 Fenótipo comportamental na síndrome de Smith-Magenis A grande maioria dos trabalhos relatando a SMS apontam os aspectos psicológicos e comportamentais como os traços clínicos mais característicos desta síndrome (SHELLEY, et al., 2007). Na fase de lactente, quando os sinais dismórficos são pouco evidentes, as crianças são descritas pelos pais como “bebês perfeitos”, ou seja, são referidos com disposição sociável, com sorriso cativante, choram muito pouco e dormem bastante. O choro é caracteristicamente pouco freqüente e de timbre rouco; e os bebês com SMS apresentam reduzida vocalização para a idade (balbucio). Histórico de hipotonia, dificuldade para se alimentar e letargia (muitos pais referindo-se a necessidade de acordá-los para alimentá-los), associados com atrasos de marcos motores são frequentes. Nesta fase de vida dos pacientes com SMS, é comum a suspeita diagnóstica de síndrome de Down, que é prontamente afastada por um exame citogenético “normal” (SMITH, et al., 2004). Na fase pré-escolar, escolar e até na adolescência, o atraso do desenvolvimento torna-se evidente e sua dimensão correlaciona-se com os comportamentos desajustados, além de exibirem déficit de atenção com ou sem hiperatividade. Os comportamentos desajustados abrangem acessos ou explosões de raiva, busca constante de atenção (principalmente dos adultos), 11 impulsividade, desobediência, agressividade, auto-injúria e dificuldades para higiene pessoal. Estes comportamentos indesejados, na SMS, são mais importantes em relação outras afecções genéticas ou com um grupo de deficiência mental de causas diversas (CLARKE & BOER, 1998; DYKENS & SMITH, 1998). Os problemas de auto-injúria começam por volta dos dois anos de idade, e os mais comuns incluem bater-se ou bater a cabeça, morder-se e/ou beliscar-se. Observa-se um aumento da freqüência e dos diferentes tipos de comportamento de auto-injúria com a idade (FINUCANE, et al., 2001). Também são observados movimentos estereotipados na grande maioria dos pacientes, sendo o mais frequente o de levar à boca mãos e objetos, o que persiste por toda a infância. A grande maioria dos pacientes desenvolvem significativo distúrbio do sono, atingindo uma frequência de 75% dos pacientes estudados por Greenberg et al., (1996). A avaliação dos pacientes confirmou dificuldade em começar a dormir, frequentes despertares durante a noite, sonolência excessiva durante o dia e cochilos frequentes (SMITH, et al., 1998). Alguns estudos apontam anormalidades do sono REM e inversão do ritmo circadiano da melatonina nos pacientes portadores de SMS (SMITH, et al., 2004; DE LEERSNYDER et al., 2006). Estudo realizado por Potocki et al., (2000) em 28 probandos com a SMS mostraram uma recorrência de casos, os quais não apresentavam inversão do ritmo circadiano da melatonina e apresentavam deleções atípicas (maiores) na região cromossômica 17p11.2. Evidências de que casos com deleções atípicas (maiores) não apresentavam a inversão da secreção da melatonina também foram apresentados por Boudreau et al., (2009). 12 Baseado em 36 casos publicados (POTOCKI, et al., 2000; DE LEERSNYDER, et al., 2001), constatou-se que 55.6% dos pacientes apresentavam tempo total de sono reduzido em 7 horas, 72% apresentam perturbação do sono REM e 86% tiveram despertares frequentes durante a noite. Potocki et al., (2000) mostraram que em metade dos casos estudados (13/26), os episódios de sonolência durante o dia eram secundários ao evento de distúrbio do sono. Analisando a atividade de pulso elétrico durante o sono, através do ActiwatchTM, observaram que há alterações dos padrões de sono que começam na infância e continuam até a idade adulta (GROPMAN, et al., 2006). O movimento estereotipado que se reporta como específico para a SMS é o de “self-hung” ou “spasmodic upper-body squeeze”, que se traduz como movimento de abraçar-se, principalmente em circunstância de excitação, quando muito alegres ou contrariados. Este movimento pode ser de dois tipos: colocar os braços ao redor do tórax ou apertar as mãos com os dedos entrelaçados na altura do peito ou do queixo (FINUCANE, et al., 1994). O outro movimento estereotipado apontado como marcador diagnóstico é descrito como “hand licking and page flipping” que traduzimos como “lamber repetitivamente a mão como se folhassem páginas”, (SMITH, et al., 1998). Estes movimentos incomuns e repetitivos chamaram a atenção dos cuidadores dos afetados antes da confirmação diagnóstica da SMS. Quase todos os autores enfatizam dois tipos de comportamentos de auto- injúria nos afetados, que são muito característicos: onicotilomania, que é o hábito de cortar e/ou arrancar unhas, assim como a poliembolocoilamania, que é a inserção de objetos em orifícios do corpo (nariz, ouvido, ânus e vagina), muitas vezes requerendo atenção vigorosa dos cuidadores. Em seu estudo de revisão, 13 Shelley et al., (2005) mostraram que 96.6% dos pacientes estudados apresentaram estes comportamentos de auto-injúria. Ambos os comportamentos estão relacionados à redução da sensibilidade que se acredita ocorrer nos afetados, e que esteja mais presente ao final da infância, e na adolescência (SMITH, et al., 2004). Alguns outros aspectos singulares são: necessidade pouco saciável de atenção individualizada de adultos (principalmente do professor na sala de aula) e uma fascinação exagerada por mexer em equipamentos eletrônicos (computadores, gravadores, vídeos-cassete, etc.) (SMITH, et al., 1998). Padrões característicos do perfil cognitivo e da linguagem dos pacientes com a SMS, também são comparados e detalhados em diferentes estudos (DYKENS ,et al., 2000). Baseado no estudo de Udwin et al., (2001), 29 crianças e 21 adultos foram estudados com relação a inteligêncial, cognição, comportamento adaptativo e aprendizado. Todos os pacientes tiveram leves a graves dificuldades de aprendizagem, com níveis de realização e de comportamento adaptativo surpreendentemente baixos. Das 29 crianças, 75% apresentaram QI igual a 50. Em contraste, a amostra de adultos obteve maior QI, mas eles eram mais dependentes dos cuidadores, com pouca independência em atividades diárias. Sobre estudo ocupacional os pacientes apresentaram níveis baixos, o que foi explicado em virtude das psicopatologias comórbidas a SMS, como: graves distúrbios de comportamento (agressão e auto-agressão), falta de concentração, impulsividade, comportamentos de busca de atenção (UDWIN, et al., 2001). 14 2.2 Epidemiologia A prevalência estimada da SMS é de, aproximadamente, 1:25.000 nascidos vivos, afetando igualmente os sexos (GREENBERG, et al., 1991). Acredita-se que estes números são subestimados devido ao desconhecimento clínico para o diagnóstico, e que esteja, na realidade, em torno de 1:15.000 nascidos vivos (SMITH, et al., 2005). A totalidade dos casos reportados na literatura são de casos isolados, sendo a análise citogenética dos genitores, normal e, desta forma, o risco de recorrência é baixo (esporádico) (SMITH, et al., 2004), sendo que todos os casos descritos ocorrem de novo (SMITH, et al., 2009). A revisão de literatura nos permitiu observar a descrição de apenas dois casos de pacientes brasileiros com o diagnóstico de SMS (CABRAL DE ALMEIDA, et al., 1989; LLERENA & CABRAL DE ALMEIDA, 1998). 2.3 Mecanismo genético O mapeamento físico e a análise por seqüenciamento direto da região usualmente deletada na SMS permitiram identificar que esta região é flanqueada por três segmentos de seqüências de DNA repetitivo (“low-copy repeats – LCRs”) com alta homologia e que foram denominados: “SMS-repeats” (SMS-REP). Os SMS-REP proximal (~256kb) e distal (~176kb) orientados no mesmo sentido, e a terceira cópia chamada SMS-REP medial (~241Kb) está mapeada entre as SMS- REP proximal e distal. As três LCRs atuam como substrato para que ocorra uma recombinação desigual entre homólogos não alélicos (“nonallelic homolugous recombination – NAHR”), o que resulta em uma deleção encontrada, na SMS, de aproximadamente 4 Mb, presente em mais de 90% dos pacientes, e na recíproca 15 duplicação 17p11.2, que provoca uma afecção diferente da SMS (CHEN, et al., 1997; VLANGOS, et al., 2003). Na figura 1 está uma representação esquemática de NAHR. 16 LC R LC R LC R LC R LC R LC R C ro m át id e 1 C ro m át id e 2 ge ne 1 ge ne 2 ge ne 3 ge ne 4 ge ne 5 Al in ha m en to d e C ro m át id es Ir m ãs LC R LC R LC R LC R LC R LC R C ro m át ide 1 C ro m át id e 2 ge ne 1 ge ne 2 ge ne 3 ge ne 4 ge ne 5 Al in ha m en to N or m al Fi gu ra 1 . M ec an is m o qu e ge ra m ic ro de le çõ es c ro m os sô m ic as (N A H R ). O m ec an is m o de m ic ro de le çã o oc or re p or u m a lin ha m en to d es ig ua l en tre c ro m át id es d e cr om os so m os h om ól og os d ur an te a m ei os e. 17 Al in ha m en to D es ig ua l LC R LC R LC R LC R LC R LC R LC R LC R LC R LC R LC R C ro m át ide 1 C ro m át ide 2 ge ne 1 ge ne 2 ge ne 3 ge ne 4 ge ne 4 ge ne 5 ge ne 5 LC R LC R LC R LC R LC R LC R C ro m át ide 1 C ro m át id e 1 C ro m át ide 2 C ro m át ide 2 ge ne 1 ge ne 2 ge ne 3 ge ne 4 ge ne 5 P er da d e F ra gm en to C ro m os sô m ic o Fi gu ra 1 : M ec an is m o qu e ge ra m ic ro de le çõ es c ro m os sô m ic as . O m ec an is m o de m ic ro de le çã o oc or re p or u m a lin ha m en to d es ig ua l en tre cr om át id es d e cr om os so m os h om ól og os d ur an te a m ei os e (C on tin ua çã o) . pode WIT reali com apre crom seis as r LCR caso repre mostr horizo repre 2004 de p Paciente em sofrer HERS & zado por SMS e d esentaram mossômico Entre a pacientes recombinaç R17pD, cuj os de SMS Figura 2: esentado na rada acima, ontais contí esentam os ). Um seg ponto no g es que ap deleções LUPSKI, 2 Potocki et destes, 76 deleções o com perd s deleções s apresenta ções ocor ja frequên S com deleç : Comparaçã parte inferio e as deleç ínuas repres segmentos gundo even gene RAI1 presentam maiores o 2004), con t al., (2003 6% aprese atípicas, e a da regiã s atípicas, ados por S rreram no cia destas ção, como ão entre dele or da figura ções atípica sentam os deletado do nto genétic 1 presente outros sí ou menores nhecidas c 3), foram entaram a e 1 pacient o 17p11.2 , as maior Shaw, With mesmo p s grandes o mostra a eções clássic , mostrando as (maiores) segmentos o cromossom co que po e na região tios de re s que as d como dele investigad deleção te apresen . res destac hers, & Lu ponto de q deleções figura 2. cas e atípica a posição ) de SMS s do cromos mo (modifica ode acome o crítica p combinaçã deleções c eções atíp dos 58 cas clássica p ntou um co cam-se pel upski, (200 quebra, no está estim as na SMS. O dos LCRs. são mostrad ssomo e as ado de Shaw eter a SMS para SMS ão cromos clássicas ( picas. Em sos de ind para SMS omplexo re la ocorrên 04), na qua o LCR17p mada em O cromossom A deleção c das abaixo. s linhas po w, Withers & S é uma m (SLAGER 18 ssômica (SHAW, estudo divíduos e 22% earranjo cia nos al todas A e no 4% do mo 17p é comum é As linha ontilhadas & Lupski, mutação , et al., 19 2003). No estudo de Slager et al.,(2003) foram analisados 25 genes em uma região de 950kb do cromossomo 17p, onde ocorre a deleção clássica da SMS, e foram encontradas mutações no gene RAI1 em três indivíduos que apresentavam fenótipo sugestivo para a SMS, mas não apresentavam alterações na região 17p11.2 quando analisados por citogenética molecular. Outros estudos contribuíram com esta etiologia, destacando que o gene RAI1 possui 6 exons e 13 mutações descritas neste gene envolvem o exon 3 (BI, et al., 2004; GIRIRAJAN, et al., 2005; GIRIRAJAN, et al., 2006.), figura 3. Figura 3: Representação do gene RAI1, os blocos I,II,III,IV,V,VI indicam os 6 exons. A seta vermelha indica o exon 3, no qual concentra-se as mutações descritas. (modificado de Elsea, & Girirajan, 2008). 20 2.4 Genes na região cromossômica 17p11.2 A região cromossômica 17p11.2 possui muitos genes, além do gene RAI1 que até o momento é o principal gene associado com SMS. Genes desta região são associados à SMS ou outras síndromes. A figura 4 mostra os genes presente na região 17p11.2p12 e sua associação com demais afecções. Figura 4: Genes presentes na região cromossômica 17p11.2p12 e sua associação com demais afecções. Note que o gene RAI1 é o principal gene relacionado a SMS (Figura retirada de GROPMAN, et al., 2007). O gene FLCN, responsável pela síndrome de Birt-Hogg-Dube (OMIM #135150), quando apresenta uma mutação dominante causa início a tumores renais e de pele (BABA, et al., 2006; PITTET, et al., 2006). Outro relato demonstra que a deleção do gene TNFRSF13B pode diminuir os níveis de IgA (OMIM #604907) nos pacientes com SMS (RACHID, et al., 2006). O locus ALDH3A, Cromossomo 17 21 mapeado próximo ao gene RAI1, causa a síndrome neurocutanea Sjogren- Larsson (OMIM #270200), este fato pode estar associado com a ocorrência de pele seca em pacientes com SMS (GROPMAN, et al., 2007). Além destes relatos, esteatose e alterações hepáticas em pacientes com SMS podem ser atribuídas ao gene PEMT, já que polimorfismos neste gene foram associados com esteatose não alcoólica por Song et al., (2005). PMP22 é outro gene presente em 17p11.2 que codifica uma proteína integrante de membrana, um componente importante da mielina no sistema nervoso periférico. Mutações neste gene estão associadas a síndrome de Charcot-Marie-Tooth tipo 1A (OMIM #118220) e outras neuropatias hereditárias. O gene FLII codifica uma proteína com domínio de ligação de actina e um N-terminal rico em leucina, domínio da interação entre proteínas. A proteína codificada tem funções na organização estrutural dos músculos, papel este semelhante a proteína da drosófila envolvidos na embriogênese e na organização estrutural do músculo de vôos indiretos (NCBI, 2010). O gene UBB codifica ubiquitina, uma das proteínas mais conservadas, a qual é necessária para a reações ATP-dependentes, degradação de proteínas intracelulares não- lisossomais e de proteínas anormais. A Ubiquitina liga-se covalentemente a proteínas para degradação e também se liga à histona H2A em regiões ativamente transcritas, mas não provocam a degradação da histona H2A, sugerindo que a ubiquitina também esteja envolvida na regulação da expressão gênica. Por conseguinte, formas errônias dessa proteína tem sido observado em pacientes com doença de Alzheimer e em portadores da síndrome de Down (NCBI, 2010). 22 O gene mais estudado e relacionado a SMS é o gene RAI1. A proteína codificada por esse gene inclui um domínio N-terminal polimórficos, muito semelhante ao seu homólogo do rato. Este gene esta associado a vários transtornos neurológicos. Estudo recente realizado por Girirajan et al., 2009 mostraram o papel deste gene na SMS está relacionado a diversas anomalias apresentadas pelos pacientes da SMS, mas que a gravidade do fenótipo é devido a influência de outros genes presentes na região 17p11.2. 2.5 Como diagnosticar a síndrome de Smith-Magenis Devido ao baixo conhecimento desta rara afecção entre os geneticistas do Brasil, podemos destacar elementos que tornam o diagnóstico da SMS uma tarefa laboriosa: � significativa variabilidade do fenótipo, mesmo quando considerado a avaliação por profissional médico especialista; � mudanças das dismorfias faciais com a idade; � não se observa uma anomalia mais freqüente (ex.: cardiopatia comum, insuficiência velo-faríngea, malformação do SNC típica) que possa servir como pista diagnóstica no atual conhecimento; � dificuldade de disponibilidade de exames citogenético bandamento GTG (cariótipo de alta resolução) e citogenético molecular (FISH) quando existe a suspeita clínica, devido ao alto custo e a necessidade de profissionais com experiência para realização desses exames. nece regiã caso emp depe (qPC o dia Elsea Para co essário con ão, envolve os (VLANG pregadas endentes d CR) e Com A figura agnóstico d Figura 5 a & Girirajan oncluir o nfirmar a m endo o ge GOS, et al. para esta de Ligação mparação G a 4 represe dos pacien : Fluxogram n, 2008). diagnóstic microdeleçã ene RAI1, s ., 2005). O a finalidad o (MLPA), Genômica enta um flu ntes suspe ma utilizado co de um ão na regiã sendo que Outras met de como: Reação d por Hibridi uxograma d itos de por para realiza m paciente ão 17p11.2 e esta técn todologias Amplifica a Polimera zação por dos camin rtarem SM ção do diag e com su 2 pela técn nica detect mais rece ação Mult ase em Ca arrays (CG nhos a sere S. gnóstico da uspeita cli nica de FIS ta 95 a 10 entes estão tiplex de adeia Quan GH-arrays em seguid SMS (modif 23 nica, é SH para 0% dos o sendo Sonda ntitativa s). os para ficado de 24 3 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS A SMS é uma síndrome estabelecida há mais de 20 anos, porém, pouco conhecida pelos geneticistas e consequentemente pouco diagnosticada nos Serviços de Genética do Brasil. Algumas das dificuldades encontradas pelos geneticistas, ao realizar um diagnóstico preciso da SMS foram citadas no item 2.4. Deste modo, este trabalho é de grande importância para os geneticistas, uma vez que iremos apresentar um perfil genético clínico dos pacientes brasileiros portadores da SMS, conhecendo melhor esta rara afecção. O presente trabalho tem por objetivos: 1. Verificar a eficácia da utilização de ficha clínica induzida para SMS, objetivando os exames de subsídio diagnóstico; 2. Comparar as frequências de sinais clínicos dos portadores brasileiros de SMS com as frequências descritas na literatura internacional; 3. Analisar e comparar as técnicas de citogenética em metáfases e prometáfases para a detecção da deleção 17p11.2; 4. Analisar e comparar a deleção dos genes FLII e RAI1 pela técnica de citogenética molecular FISH. 25 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Estudo Série de pacientes encaminhados e/ou acompanhados no Serviço de Aconselhamento Genético (SAG) do Departamento de Genética do Instituto de Biociências – Unesp – Botucatu,SP, com hipótese diagnóstica de síndrome de Smith-Magenis, no período de 2003 a 2009. 4.2 Casuística Os pacientes foram recrutados a partir do livro de registro dos atendimentos ambulatoriais do SAG, sendo selecionados os casos com diagnóstico clínico de SMS e pela divulgação da SMS através de palestras e envio de folhetos explicativos nas Associações de Pais e Amigos Excepcionais (APAE) do Estado de São Paulo. O médico geneticista do serviço convocou os pais ou responsáveis pelos pacientes selecionados e explicou a importância dos exames. O projeto de pesquisa foi divulgado entre os geneticistas de outros centros para que encaminhassem pacientes com suspeita diagnóstica da SMS ao SAG- Botucatu, a fim de aumentar a casuística deste estudo. Os Centros de Genética que participaram do presente estudo foram: Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira – Recife, PE (IMIP); Hospital das Clínicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Porto Alegre, RS (UFRS), Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Botucatu SP,(HC-FMB); Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas – Campinas, SP (HC-FMC); Hospital das Clínicas da Faculdade de 26 Medicina de Ribeirão Preto – Ribeirão Preto, SP (HC-FMRP); Universidade Estadual do Rio de Janeiro – Rio de Janeiro, RJ (UFRJ) e APAEs do Estado de São Paulo. Os pacientes com suspeita da SMS foram convocados pelos centros participantes do estudo e convidados a participar da pesquisa. Na concordância do responsável pelo paciente com a pesquisa, foi assinado o Termo de Consentimento Livre Esclarecido (TCLE) (Anexo 01). Os pacientes foram avaliados utilizando a ficha clínica padrão para diagnóstico clínico da SMS do SAG-Botucatu, fotografados e convidados a comparecer ao SAG – Botucatu para acompanhamento médico e realização do teste de FISH. Para os pacientes de outros estados ou quando não havia possibilidade de encaminhamento do paciente, foi enviado ao SAG-Botucatu amostra biológica, foto e todos os dados médicos disponíveis da criança. 4.3 Aspectos éticos O projeto da pesquisa teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (OF. 014/08-CEP) da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp-SP (Anexo 01). Todos os responsáveis pelos pacientes foram informados dos objetivos do projeto e quando aceitavam participar do mesmo assinavam o TCLE em duas vias. Uma via ficou com os responsáveis e a outra encontra-se no prontuário do paciente arquivado no SAG. Uma vez que as características faciais são componentes essenciais ao diagnóstico clínico, foi solicitada a autorização dos responsáveis, para publicação das fotografias do paciente, sem a colocação de tarja sobre os olhos. 27 4.4 Critérios de inclusão Foram incluídos na amostra os pacientes que preencheram os seguintes critérios de inclusão: 1. apresentar pelo menos três das características do sistema crânio- facial/músculo esquelético descrito na tabela 02. 2. apresentar pelo menos um dos dois movimentos estereotipados característicos: comportamento repetitivo de auto-abraço, comportamento de virar páginas de livro ou revista lambendo mãos ou dedos. 3. apresentar presença ou histórico de distúrbio do sono. 4. apresentar presença ou histórico de pelo menos um dos dois tipos de comportamento de auto-injúria: onicotilomania ou poliembolocoilamania. 4.5 Critérios de exclusão Um critério de exclusão foi considerado para não incluir no grupo amostral aqueles pacientes com outras causas genéticas, multifatoriais ou ambientais mais evidentes que provocaram a deficiência mental do paciente: 1. outra doença genética suspeitada ou diagnosticada na avaliação genético- clínica. 2. malformação grave de sistema nervoso central. 3. histórico ou injúria perinatal ou quadro clínico compatível com paralisia cerebral. 4. não ser possível ter informações seguras para preencher os critérios de inclusão. Para os pacientes que não preencheram os critérios de inclusão ou que tiveram um critério de exclusão para esta pesquisa foi oferecida a continuidade 28 no atendimento ambulatorial de rotina do SAG e/ou outros serviços de genética envolvidos na mesma pesquisa. 4.6 Grupo amostral Desta forma selecionamos 48 pacientes, dos quais 17 foram incluídos no estudo. O motivo para a não inclusão dos 31 pacientes foi devido à falta de dados para o preenchimento dos critérios de inclusão (item 4.4). Todos os pacientes incluídos foram submetidos a exames citogenéticos e citogenéticos moleculares, sendo que uma amostra biológica dos pacientes e dos seus pais foi coletada para extração e construção de um banco de DNA. 4.7 Avaliação clínica Os pacientes selecionados foram avaliados clinicamente pelo geneticista clínico dos respectivos serviços, e foi preenchida uma ficha de anamnese genético-clínica de cada paciente adicionada a ficha padrão do SAG-Botucatu para SMS (Anexo 02). Para melhor documentação de cada caso, todos os pacientes foram fotografados (face – frente e perfil, mãos e pés). Os sinais e sintomas da SMS foram tabulados como presente (+), ausente (-) ou não referido (nr). Os dados antropométricos obtidos dos pacientes foram comparados com as tabelas de peso e estatura do “National Center for Health Statistics” (2000), considerando-se como limite inferior da normalidade o percentil 5 e superior o percentil 95. Dentre os dados de nascimento foram requeridos: a idade gestacional e a adequação do peso de nascimento para a idade gestacional. 29 Definiu-se como prematuro quando a idade gestacional foi menor que 37 semanas, segundo critério da Organização Mundial da Saúde (OMS, 1980). A adequação do peso ao nascimento para a idade gestacional baseou-se na tabela de Alexandre et al., (1996), tendo como limite mínimo da normalidade o percentil 10. O laudo genético clínico final acompanhado do aconselhamento genético foi realizado e entregue pelo geneticista dos serviços envolvidos. 4.8 Análise citogenética 4.8.1 Cultura de linfócitos de sangue periférico As culturas de linfócitos de sangue periférico foram desenvolvidas segundo a técnica proposta por Moorhead et al., (1960) e a obtenção de cromossomos prometafásicos pela técnica descrita por Yunis (1976), ambas modificadas. Após assepsia de pele com álcool iodado, foram coletados 5ml de sangue venoso periférico, com seringa estéril descartável e previamente heparinizada (Liquemine Roche® 5000 μ/ml), que foi mantida em posição vertical, à temperatura ambiente, até que ocorresse a sedimentação. Após a sedimentação procedeu-se a suspensão da camada de linfócitos, que juntamente com o plasma (1ml) foram colocados em um frasco de cultura contendo 4,5ml de meio RPMI (CULTILAB®), suplementado com 10% de soro bovino fetal (GIBCO®), acrescido de 0,1ml de fitohemaglutinina (GIBCO®) e 0,1ml de antibiótico penicilina/estreptpmicina (GIBCO®) (concentração final dos antibióticos 1μ/ml e 1 μg/ml, respectivamente). 30 Em seguida, os frascos de cultura foram mantidos em estufa a 37°C, durante 72 horas. Cada amostra sanguínea foi fracionada em, no mínimo dois e no máximo quatro frascos de cultura, garantindo o resultado da análise e evitando nova coleta de sangue. Para obtenção de cromossomos metafásicos, após 72 horas de cultivo celular foi adicionado 0,1 ml de colchicina (0.0016-SIGMA®) a cada frasco, e estes foram mantidos em estufa a 37°C por mais 45 minutos. Após esse período, os conteúdos dos frascos foram transferidos para tubos de centrífuga (15ml) e centrifugados a 1500 rpm por cinco minutos. A seguir, foi feita a hipotonização do material acrescentando no tubo 5ml de solução hipotônica (KCl 0.075M) pré- aquecida a 37°C, e após homogeneização, as culturas retornaram à estufa a 37°C por mais 20 minutos. Seguiu-se a fixação da cultura, acrescentando-se 1ml de fixador (metanol-MERCK®/ácido acético glacial-MERCK® 3:1) e o material foi submetido à centrifugação por cinco minutos, a 1500 rpm. O processo de fixação e centrifugação foi repetido por mais duas ou três vezes, adicionando-se 5 ml de fixador a cada operação e desprezando o sobrenadante. O material, uma suspensão de pellet de linfócito acrescidos de 1ml de fixador, foi gotejado em lâminas previamente lavadas e geladas. As lâminas foram secas ao ar e guardada em freezer (-20°C), como também o material em suspensão para análise de FISH. Para obtenção de cromossomos prometafásicos, após 72 horas de cultivo celular, foi adicionado 0,1 ml de actinomicina D (LAPEFE®). Os frascos foram envoltos por papel alumínio (para evitar a fotodegradação do indutor) e retornaram a estufa a 37°C por 39 minutos, quando, em seguida, foi acrescido 0,1 ml de colchicina (solução uso 0,0016%-SIGMA®) e encubados na estufa a 37°C 31 por mais seis minutos. As próximas etapas, até a obtenção do pellet de linfócitos, foram iguais ao referido anteriormente na obtenção dos cromossomos metafásicos. 4.8.2 Coloração bandamento As metáfases e prometáfases obtidas pela técnica de cultura temporária de linfócitos foram submetidas às técnicas de bandamento GTG e FISH. 4.8.3 Bandamento G (GTG) Para obtenção de banda G, foi utilizada a técnica modificada de Seabright (1971). As lâminas foram imersas em solução de tripsina 0.025% (DIFCO®), diluída em tampão fosfato 0.06M com pH 6.8 em banho-maria a 37°C por dois a três segundos. A seguir foram lavadas com água destilada e coradas em solução de Giemsa 4% com tampão fosfato pH 6.8 por, aproximadamente, dois minutos. 4.8.4 Hibridização in situ por fluorescência A técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH) para a sondas comerciais seguiu os padrões do protocolo que acompanham cada produto. Neste estudo foram utilizadas duas sondas comerciais da CYTOCELL® para a região crítica da SMS e 14 metáfases foram analisadas em microscópio de fluorescência Leitz DM RBE - LEICA®, e uma metáfase foi fotografada para comprovar ou não, a presença da microdeleção. inter os g dista dele RAI1 se n Figur regiã CYTO As sond resse - um enes estão A sonda al e proxim tado na m 1 possui 16 o marcado ra 6: Repres o crítica da OCELL® gen das comerc ma flanquei o presente a CYTOCE mal do ge maioria dos 60Kb e flan or D17S25 sentação es a síndrome ne RAI1. As f ciais da CY ia a região es na regiã ELL® para ene FLII (C pacientes nqueia a re 8 (figura 6 squemática d de Smith-M figuras acima YTOCELL® o do gene o cromoss o gene F Campbell, s (Chen, K egião dista ). da posição e agenis. A- a foram mod ® diferem-s FLII e a o sômica 17p FLII possui HD et al et al., 199 al do gene e localização sonda CYT ificadas do c se na marc outra do ge p11.2. 80Kb e f l., 1997), o 95); já a so RAI1, esta o das sonda OCELL® ge catálogos do cação do g ene RAI1. lanqueia a o qual mo onda para a sonda en as comerciai ne FLII e B fabricante. 32 gene de Ambos a região ostra-se o gene ncontra- is para a B- sonda 33 A utilização das duas sondas no diagnóstico de SMS foi para verificar a acuidade das sondas no diagnóstico de SMS e verificar a presença/ausência dos genes FLII e RAI1 nos pacientes deste estudo. 4.8.5 Análise cromossômica As análises cromossômicas foram realizadas em, no mínimo, 11 metáfases ou prometáfases por bandamento GTG, para detectar alguma possível translocação ou outra anormalidade cromossômica. A nomenclatura cromossômica utilizada foi baseada no International System For Human Cytogenetc Nomenclatute (ISCN) (SHAFFER & TOMMERUP, 2005). As metáfases ou prometáfases apresentaram nível de resolução de, no mínimo, 300 a 550 bandas. As análises foram realizadas em fotomicroscópio Leica Leitz DMRBE, no aumento de 1250X e fotografadas. As análises da técnica de FISH foram realizadas em fotomicroscópio de fluorescência Leica Leitz DMRBE. Em cada paciente, foram analisadas cerca de 10 metáfases e pelo menos cinco delas foram fotografadas, tanto para o diagnóstico positivo ou negativo da microdeleção que envolve a região 17p11.2. Uma vez que a sonda utilizada liga-se especificamente à região 17p11.2, o diagnóstico positivo é feito pela ausência da hibridação, ou seja, a região estaria deletada em um dos cromossomos homólogos e no outro apareceria o sinal fluorescente. Para não haver dúvidas quanto a interpretação do resultado devido a erros técnicos, as sondas contêm uma região controle (região cromossômica 17p13.3 – gene SLI1) que aparece marcada em vermelho (figura 6). Desta forma, paciente com SMS sem a microdeleção apresentam o par cromossômico 17 de cada 34 metáfase marcada com dois sinais fluorescentes, sendo um verde e um vermelho em cada um dos cromossomos. Os portadores da SMS com microdeleção apresentam um cromossomo 17 com dois sinais fluorescentes, um verde e um vermelho, enquanto que o outro cromossomo 17 tem apenas o sinal vermelho fluorescente. A ausência do sinal verde comprova a microdeleção da região 17p11.2. 4.9 Análise estatística Para comparar os achados citogenéticos com os dados clínicos presentes na literatura foi utilizado método estatístico simples, uma vez que a casuística é restrita, impossibilitando a utilização de outros testes. 35 5 RESULTADOS � 5.1 Grupo amostral Para este estudo foram selecionados 17 probandos, os quais constituíram o grupo amostral. Dos 17 pacientes estudados, doze foram encaminhados de outras unidades (APAEs do Estado de São Paulo ou outras Universidades de diferentes Estados do Brasil) e 7 pertenciam ao banco de dados do SAG – Botucatu os quais foram reconvocados. A tabela 3 mostra a origem dos pacientes incluídos neste estudo. Tabela 3: Origem de encaminhamento dos pacientes deste estudo. Origem Casos APAE – Mauá, SP 4 APAE – Limeira, SP 9, 10 HC-FMRP 11, 12 UERJ 15, 16 IMIP 5, 6 HC-UFRS 7 SAG - Botucatu, SP 1, 2, 3, 8, 13, 14, 17 Para a realização deste estudo nos casos encaminhados ao SAG- Botucatu, foi enviado uma amostra biológica, TCLE assinado pelo responsável, os dados clínicos e as fotos, e para os casos pertencentes ao banco de dados do 36 SAG – Botucatu, foi coletado dos pacientes os dados clínicos, a assinatura do TCLE e as fotografias no ato da consulta. 5.2 Avaliação genético-clínica As principais características da SMS evidenciadas nesta casuística, bem como as características descritas na literatura, são apresentadas nas tabelas 4. Os dados individuais, a documentação fotográfica dos pacientes e as análises citogenética encontram-se no anexo 03. Cabe aqui ressaltar que todos os dados clínicos foram copilados pelo autor, quer das fichas de anamnese preenchidas pelos geneticistas clínicos, quer da literatura. Em nenhum momento o autor deste trabalho avaliou ou obteve dados clínicos de forma diferente. A idade do início da investigação diagnóstica variou desde 1a e 9m até 24a, (média de 10a e 9 m). Em oito casos não foi possível obter todos os dados de nascimento e dados antropométricos, na consulta, que sugeriram hipótese diagnóstica para SMS, devido a falta de memória do responsável durante a consulta e devido a falta de envio destes dados para o SAG-Botucatu pelos geneticistas responsáveis. Os dados antropométricos e sexos dos pacientes desta casuística estão apresentados na tabela 4. 37 Ta be la 4 : P rin ci pa is c ar ac te rís tic as d os 1 7 ca so s in cl uí do s ne st a ca su ís tic a (c as os 1 a 9 ). C A SO S C A R A C TE R ÍS TI C A S G ER A IS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 S ex o F M M M M F F M F Id ad e ge st ac io na l ( se m an as ) 38 38 38 38 38 38 35 38 nr P es o R N (p er ce nt il) 25 25 50 nr 10 50 nr 10 nr C om pr im en to (p er ce nt il) 25 25 10 nr 50 10 nr 25 nr Id ad e do 1 ° at en di m en to 13 a 19 a 5m 7a 6 m 12 a 6m 8a 4 m 9a 6 m 10 a 1a 9 m 10 a P es o (p er ce nt il) 90 25 50 nr 90 3 nr 10 nr E st at ur a (p er ce nt il) 50 10 25 nr 50 3 nr 10 nr C A R A C TE R ÍS TI C A S C LÍ N IC A S C râ ni of ac ia l/m ús cu lo e sq ue lé tic o Br aq ui ce fa lia + + + + + - - - + H ip op la si a de fa ce m éd ia + + + + + + + + + P ro gn at is m o re la tiv o co m a id ad e + + + - + + + + n r Fa ce la rg a e de fo rm at o qu ad ra do + + + + + + + + + Si no fre nr + nr + + + - nr + Lá bi o su pe rio r p ro tu so e e m “v ” i nv er tid o + + + + + + + + + O lh os e nc ov ad os e d is tâ nc ia in te rc an ta l d im in uí da + + + + + - + + n r M ão s pe qu en as e la rg as + + + + + + + + n r O to rr in ol ar in go ló gi ca A no m al ia s de la rin ge e o uv id o m éd io nr nr nr + - + nr + n r V oz ro uc a e gr av e - nr nr + - - nr + n r N eu ro -c om po rt am en ta l C om pr om et im en to c og ni tiv o/ at ra so n o de se nv ol vi m en to + + + + + + + + + Le ta rg ia e p ou ca re at iv id ad e na in fâ nc ia p re co ce + + + + + + + + n r H ip ot on ia (a té o s 2 an os ) + nr nr + + + nr + + 38 C A SO S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 N eu ro -c om po rt am en ta l ( co nt in ua çã o) D is tú rb io d o so no + - nr + + + + + + In ve rs ão d o rit m o ci rc ad ia no d a m el at on in a nr nr nr nr nr nr nr + n r At ra so d e fa la + + + + + + + + + R ef le xo s hi po at iv os + nr nr nr - nr n - n r Ag re ss iv id ad e + + + + + + + + + Si na l d e au to a gr es sã o + + + + + + + + + S in ai s de n eu ro pa tia p er ifé ric a - nr nr nr nr nr - nr n r La m be r o s de do s co m o se fo lh as se m p ág in as nr nr - + - + nr + n r Au to a br aç o + + + + + + nr nr + Po lie m bo lo co ilo m an ia + nr + + - - nr + - O ni co til om an ia + + + + - + + + + D is fu nç ão d a m ot ric id ad e or al n a in fâ nc ia p re co ce + - nr nr + + nr + n r A sp ec to s co m un s Ba ix a es ta tu ra + nr nr + + + + + nr Es co lio se + - nr + - - + - + D is cr et o al ar ga m en to d os v en trí cu lo s ce re br ai s nr nr nr + nr nr nr nr nr In su fic iê nc ia v el o- fa rin ge an a + nr nr nr nr nr nr nr nr A no rm . o fta lm ol óg ic as (a no m al ia d e íri s, m ic ro có rn ea ) + nr nr + + + nr + nr A no rm al id ad es d o so no R E M (M ov im en to R áp id o do O lh o) nr nr nr nr nr + nr nr nr H ip er co le st er ol em ia / H ip er tri gl ic er id em ia nr nr nr nr nr nr nr nr n r R el at o de c on st ip aç ão + nr nr nr - + - - + A no rm al id ad es a o E le tre nc ef al og ra m a / c ris es c on vu ls iv as e vi de nt es + nr nr + - nr nr - n r C ar di op at ia nr nr nr nr - - nr nr + A no rm al id ad es d a fu nç ão ti re oi di an a nr nr nr nr nr nr nr nr n r Ep ile ps ia nr nr nr nr - - - - n r H ip og en ita lis m o no s m en in os - nr nr nr - - - nr - 39 C A SO S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A sp ec to s co m un s (c on tin ua çã o) A no rm al id ad es re na is o u do tr at o ur in ár io nr nr nr nr - - nr nr + A no rm al id ad es d o an te br aç o nr nr nr nr - - - - n r Fe nd a lá bi o- pa la tin a - - nr - - - - - - D es lo ca m en to d e re tin a nr nr nr nr - nr nr - n r O be si da de nr nr nr - + nr - - - A lte ra çã o O do nt ol óg ic a nr + nr + + + + + n r EX A M ES C O M PL EM EN TA R ES C ar ió tip o em a lta re so lu çã o de l(1 7p ) de l(1 7p ) de l(1 7p ) de l(1 7p ) de l(1 7p ) de l(1 7p ) de l(1 7p ) 46 ,X Y 4 6, X X FI S H d el 1 7p (1 1. 2) - FL II + + + + + + + - - FI S H d el 1 7p (1 1. 2) - R A I1 + + + + + + + - - (+ ) p re se nt e (- ) a us en te (n r) n ão re fe rid o * 46 ,X X ,d el (1 7) (p 11 .2 p1 1. 2) p ar a pa ci en te s do s ex o fe m in in o e 46 ,X Y ,d el (1 7) (p 11 .2 p1 .2 ) p ar a pa ci en te s do s ex o m as cu lin o. 40 Ta be la 4 : P rin ci pa is c ar ac te rís tic as d os 1 7 ca so s in cl uí do s ne st a ca su ís tic a (c as os 1 0 a 17 ) ( co nt in ua çã o) . C A SO S C A R A C TE R ÍS TI C A S G ER A IS 10 11 12 13 14 15 16 17 Fr eq S ex o F M F M M M F M 10 H :7 F Id ad e ge st ac io na l ( se m an as ) 36 39 39 38 36 nr nr 38 P es o R N (p er ce nt il) 50 50 50 75 25 nr nr 50 C om pr im en to (p er ce nt il) nr 10 25 25 50 nr nr 3 Id ad e do 1 ° at en di m en to 8a 6a 8a 12 a 24 a 6a 14 a 15 a P es o (p er ce nt il) nr nr nr 50 3 nr nr 50 E st at ur a (p er ce nt il) nr nr nr 50 3 nr nr 50 C A R A C TE R ÍS TI C A S C LÍ N IC A S C râ ni of ac ia l/m ús cu lo e sq ue lé tic o B ra qu ic ef al ia + + + + - - + - 11 /1 7 H ip op la si a de fa ce m éd ia + + + + + + + + 17 /1 7 P ro gn at is m o re la tiv o co m a id ad e + + - + + + + - 13 /1 6 Fa ce la rg a e de fo rm at o qu ad ra do + + + - + - + - 13 /1 7 S in of re + - + n r + - + + 10 /1 3 Lá bi o su pe rio r p ro tu so e e m “v ” i nv er tid o - - + - + + + + 14 /1 7 O lh os e nc ov ad os e d is tâ nc ia in te rc an ta l d im in ui da - + - + + - + + 12 /1 6 M ão s pe qu en as e la rg as + - + + + - + - 13 /1 6 O to rr in ol ar in go ló gi ca A no m al ia s de la rin ge e o uv id o m éd io - - - n r - n r - - 3/ 10 V oz ro uc a e gr av e + + + + + n r - + 8/ 12 41 C A SO S 10 11 12 13 14 15 16 17 Fr eq . N eu ro -c om po rt am en ta l C om pr om et im en to c og ni tiv o/ at ra so n o de se nv ol vi m en to + + + + + + + + 17 /1 7 Le ta rg ia e p ou ca re at iv id ad e na in fâ nc ia p re co ce + - + + + + + - 14 /1 6 H ip ot on ia (a té o s 2 an os ) + - + + + + + + 14 /1 6 D is tú rb io d o so no + + + + + + + + 15 /1 6 In ve rs ão d o rit m o ci rc ad ia no d a m el at on ia - + + + n r + n r n r 5/ 6 A tra so d e fa la + + + + + + + + 17 /1 7 R ef le xo s hi po at iv os - - - + + n r n r + 4/ 10 A gr es si vi da de + - + + - + + - 14 /1 7 S in al d e au to a gr es sã o + + + + + - + + 16 /1 7 S in ai s de n eu ro pa tia p er ifé ric a - - - + + n r n r + 3/ 8 La m be r o s de do s co m o se fo lh as se m p ág in as - + + n r - n r + - 6/ 11 A ut o ab ra ço + - + - - + - + 11 /1 5 P ol ie m bo lo co ilo m an ia + - - + - - - - 6/ 15 O ni co til om an ia + + + - + n r + + 14 /1 6 D is fu nç ão d a m ot ric id ad e or al n a in fâ nc ia p re co ce + + - + + n r n r + 9/ 11 A sp ec to s co m un s B ai xa e st at ur a + - + - + - - + 10 /1 4 E sc ol io se + - - - + + - + 8/ 16 D is cr et o al ar ga m en to d os v en trí cu lo s ce re br ai s + - n r n r n r - - n r 2/ 5 In su fic iê nc ia v el o- fa rin ge an a - n r - n r n r n r n r n r 1/ 3 A no rm . o fta lm ol óg ic as (a no m al ia d e íri s, m ic ro có rn ea ) - - - n r n r + n r + 7/ 10 A no rm al id ad es d o so no R E M (M ov im en to R áp id o do O lh o) n r n r n r + n r n r n r n r 2/ 2 H ip er co le st er ol em ia / H ip er tri gl ic er id em ia - n r n r n r n r n r - - 0/ 3 R el at o de c on st ip aç ão + + + + + + - - 9/ 14 42 C A SO S 10 11 12 13 14 15 16 17 Fr eq . A sp ec to s co m un s (c on tin ua çã o) A no rm al id ad es a o E le tre nc ef al og ra m a / c ris es c on vu ls iv as e vi de nt es + - - + + - - n r 5/ 11 C ar di op at ia + + - + - - - - 4/ 11 A no rm al id ad es d a fu nç ão ti re oi di an a + - - + - - - - 2/ 8 E pi le ps ia - - n r + + n r + + 4/ 11 H ip og en ita lis m o no s m en in os - - - n r n r - - - 0/ 4 A no rm al id ad es re na is o u do tr at o ur in ár io + - n r n r n r n r n r - 2/ 6 A no rm al id ad es d o an te br aç o - - - n r + - - + 2/ 11 Fe nd a lá bi o- pa la tin a - - - - - - - - 0/ 16 D es lo ca m en to d e re tin a - - - n r - - - - 0/ 9 O be si da de + - - - - - n r - 2/ 12 A lte ra çã o O do nt ol óg ic a n r + - + + n r n r + 9/ 10 EX A M ES C O M PL EM EN TA R ES C ar ió tip o em a lta re so lu çã o 4 6, X X ,in v9 4 6, X Y 4 6, X X 4 6, X Y 4 6, X Y 4 6, X Y 4 6, X X 4 6, X Y FI S H d el 1 7p (1 1. 2) - FL II - - - - - - - - FI S H d el 1 7p (1 1. 2) - R A I1 - - - - - - - - (+ ) p re se nt e (- ) a us en te (n r) n ão re fe rid o * 46 ,X X ,d el (1 7) (p 11 .2 p1 1. 2) p ar a pa ci en te s do s ex o fe m in in o e 46 ,X Y ,d el (1 7) (p 11 .2 p1 .2 ) p ar a pa ci en te s do s ex o m as cu lin o. 43 5.3 Avaliação citogenética Dos 17 pacientes estudados, sete casos (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7) apresentaram a microdeleção da região 17p11.2, tanto pela técnica de bandamento GTG, GTG em alta resolução e FISH. Todos os pacientes acima apresentaram deleção por FISH para o gene FLII e para o gene RAI1. Os demais pacientes (8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17) apresentaram cariótipo normal em alta resolução e não apresentaram deleção por FISH para o gene FLII e para o gene RAI1. Apenas um caso sem a deleção da região 17p11.2 (caso 10) apresentou um cariótipo com uma inversão pericêntrica do cromossomo 9 (inv 9), considerada uma variante normal da população sem significado clínico. 5.4 Comparação das características clínicas dos pacientes com e sem microdeleção da presente casuística. Na tabela 5 encontram-se as características gerais da SMS subdivididas em dois grupos: os pacientes com microdeleção e os pacientes sem microdeleção. Tabela5: Características gerais dos pacientes deste estudo com síndrome de Smith- Magenis com e sem microdeleção. Características Gerais Pacientes com�deleção�(n=7)� sem�deleção�(n=10)� Sexo 4M�:�3F� 6M�:�4F� Idade Gestacional (semanas) 38� 37.7� Peso de nascimento � P10 1� 1� Comprimento ao nascimento � P10 1� 2� Idade do 1° atendimento 11.4� 11� Peso < P5 1� 1� Estatua < P5 2� 2� 44 Na tabela 6 constam as freqüências dos sinais clínicos dos pacientes deste estudo, com e sem deleção, confrontando-os com a literatura. Segundo Willians et al., (2009) o termo "síndrome de Smith-Magenis-like" (SMS-like) é utilizado para os casos que apresentam características clínicas da SMS e não apresentam deleção 17p11.2 ou mutação do gene RAI1, sendo assim indistinguíveis fenotipicamente dos casos que as apresentam. Assim, os pacientes deste estudo que não apresentaram a deleção para o gene RAI1 foram denominados de SMS-like, uma vez que o sequenciamento deste gene não foi utilizado como metodologia investigativa neste trabalho. 45 Ta be la 6 : F re qu ên ci a do s si na is c lín ic os d a sí nd ro m e de S m ith -M ag en is n os p ac ie nt es d es te e st ud o co m e s em m ic ro de le çã o co m pa ra do s co m a li te ra tu ra . SM S - d el (1 7p ) SM S - l ik e Pr es en te c as uí st ic a Li te ra tu ra * Pr es en te c as uí st ic a Li te ra tu ra * C ra ni of ac ia l/m ús cu lo e sq ue lé tic o B ra qu ic ef al ia 5/ 7 79 % 6/ 10 47 % H ip op la si a de fa ce m éd ia 7/ 7 90 % 10 /1 0 P ro gn at is m o re la tiv o co m a id ad e 6/ 7 50 % 7/ 9 Fa ce la rg a e de fo rm at o qu ad ra do 6/ 7 80 % 7/ 10 S in of re 4/ 5 30 -6 5% 6/ 8 Lá bi o su pe rio r p ro tu so e e m “v ” i nv er tid o 7/ 7 70 -9 0% 7/ 10 O lh os e nc ov ad os e d is tâ nc ia in te rc an ta l d im in uí da 6/ 7 6/ 9 M ão s pe qu en as e la rg as 6/ 6 6/ 9 O to rr in ol ar in go ló gi ca A no m al ia s de la rin ge e o uv id o m éd io 2/ 3 63 % 1/ 7 64 % V oz ro uc a e gr av e 1/ 5 86 % 7/ 8 50 % N eu ro -c om po rt am en ta l C om pr om et im en to c og ni tiv o/ at ra so n o de se nv ol vi m en to 7/ 7 10 0% 10 /1 0 10 0% Le ta rg ia e p ou ca re at iv id ad e na in fâ nc ia p re co ce 5/ 5 7/ 9 H ip ot on ia (a té o s 2 an os ) 4/ 4 71 % 9/ 10 72 % D is tú rb io d o so no 5/ 6 88 % 10 /1 0 97 % In ve rs ão d o rit m o ci rc ad ia no d a m el at on ia -- -- -- -- - 5/ 7 A tra so d e fa la 7/ 7 90 % 10 /1 0 R ef le xo s hi po at iv os 1/ 3 3/ 7 A gr es si vi da de 7/ 7 7/ 10 S in al d e au to a gr es sã o 7/ 7 9/ 10 S in ai s de n eu ro pa tia p er ifé ric a 0/ 2 86 % 3/ 6 72 % La m be r o s de do s co m s e fo ss e vi ra r p ág in as 2/ 4 4/ 7 A ut o ab ra ço 6/ 6 63 % 5/ 9 55 % P ol ie m bo lo co ilo m an ia 3/ 5 25 -8 5% 3/ 10 O ni co til om an ia 6/ 7 25 -8 5% 8/ 9 D is fu nç ão d a m ot ric id ad e or al n a in fâ nc ia p re co ce 3/ 3 85 % 6/ 7 70 % 46 Ta be la 6 : F re qu ên ci a do s si na is c lín ic os d a sí nd ro m e de S m ith -M ag en is n os p ac ie nt es d es te e st ud o co m e s em m ic ro de le çã o co m pa ra do s co m a li te ra tu ra (c on tin ua çã o) . SM S - d el (1 7p ) SM S - l ik e Pr es en te c as uí st ic a Li te ra tu ra * Pr es en te c as uí st ic a Li te ra tu ra * A sp ec to s co m un s B ai xa e st at ur a 5/ 5 67 % 5/ 9 43 % E sc ol io se 3/ 6 32 % 5/ 10 34 % D is cr et o al ar ga m en to d os v en trí cu lo s ce re br ai s 1/ 1 1/ 4 In su fic iê nc ia v el o- fa rin ge an a 1/ 1 0/ 2 A no rm . o fta lm ol óg ic as (a no m al ia d e íri s, m ic ro có rn ea ) 4/ 4 87 % 3/ 5 59 % A no rm al id ad es d o so no R E M (M ov im en to rá pi do d os o lh os ) 1/ 1 1/ 1 H ip er co le st er ol em ia / H ip er tri gl ic er id em ia -- -- -- -- - 0/ 3 R el at o de c on st ip aç ão 2/ 4 95 % 7/ 10 67 % A no rm al id ad es a o E E G s (E le tre nc ef al og ra m a) / cr is es c on vu ls iv as e vi de nt es 2/ 3 3/ 8 C ar di op at ia 0/ 2 31 % 4/ 9 11 % A no rm al id ad es d a fu nç ão ti re oi di an a --- --- --- 2/ 8 E pi le ps ia 0/ 3 28 % 4/ 7 56 % H ip og en ita lis m o no s m en in os 0/ 1 0/ 3 A no rm al id ad es re na is o u do tr at o ur in ár io 0/ 2 15 -3 0% 2/ 4 A no rm al id ad es d o an te br aç o 0/ 3 2/ 8 Fe nd a lá bi o- pa la tin a 0/ 7 15 % 0/ 10 2% D es lo ca m en to d e re tin a 0/ 6 0/ 8 O be si da de 1/ 3 33 % 1/ 9 53 % A lte ra çã o od on to ló gi ca 4/ 4 54 % 5/ 6 73 % * S eg un do E ls ea & G iri ra ja n (2 00 8) ; W ill ia m s et a l., (2 00 9) . 47 6 DISCUSSÃO O diagnóstico de SMS é baseado inicialmente na suspeita clínica da doença seguida de confirmação molecular do defeito cromossômico ou gênico. Para a realização da suspeita clínica faz-se necessário a verificação dos sinais clínicos mais freqüentes. Neste estudo comparamos os sinais clínicos de 17 pacientes com suspeita de SMS sendo que sete apresentaram a deleção 17p11.2 (SMS-del) e em dez pacientes não foi verificada a deleção dos genes FLII e RAI1 por FISH, e também não foram realizados estudos moleculares do gene RAI1 ou CGH-array. Estes dez casos são tratados aqui como SMS-like. 6.1 Características clínicas A proporção sexual verificada no grupo amostral (17 casos) foi de 1,42H:1F e nos subgrupos SMS-del e SMS-like foi de 1,3H:1F, 1,5H:1F, respectivamente. Estas proporções sexuais não diferem significadamente do esperado de 1H:1F, conforme observado no trabalho de Gropman, et al., (2006). A maioria dos pacientes (14/17) teve idade gestacional de 37-40 semanas, sendo um caso de SMS-del e dois casos de SMS-like com prematuridade (35, 36, 36 respectivamente) (Casos 7, 10 e 14). A taxa de prematuridade no Brasil é de 8% (DATASUS, 2006), e desta forma nosso grupo amostral está dentro do esperado (X2= 0.4961). Neste estudo, a maioria dos casos apresentou peso e comprimento ao nascimento na faixa de normalidade conforme já descrito por Gropman, Duncan & Smith (2006). 48 A idade dos pacientes no primeiro atendimento pelo geneticista foi de 10a e 9m (1a e 9m até 24a), sendo que para os pacientes SMS-del foi de 11a e 4m (12a e 6m até 19a e 5m) e para os pacientes SMS-like foi de 10a e 5m (1a e 9m até 24a). No primeiro atendimento, dois pacientes (um caso SMS-del e um caso SMS-like) estavam abaixo do percentil 5 para peso e estatura (casos 6 e 14 respectivamente). As consultas genético-clínicas posteriores observaram que 5/5 dos casos SMS-del e 5/9 dos casos SMS-like apresentaram baixa estatura. Este sinal clínico está presente em 67% dos pacientes adultos da literatura. Em geral, as características clínicas dos dois subgrupos (SMS-del e SMS- like) diferem muito pouco entre si, quer no nosso grupo amostral, que nos trabalho de Elsea & Girirajan (2008) e Williams, et al., (2009). Em genética clínica, as diferenças entre frequências é considerada quando � 20% entre os grupos. Assim, na comparação das características clínicas entre os dois subgrupos (SMS-del e SMS-like) da presente casuística, verificamos que os sinais lábio superior protuso e em “v” invertido (7/7 – 7/10), olhos encovados e distância intercantal diminuída (6/7 – 6/9), anomalias de laringe e ouvido médio (2/3 – 1/7), letargia e pouca reatividade na infância precoce (5/5 – 7/9), agressividade (7/7 – 7/10), auto-abraço (6/6 – 5/9), poliembolocoilomania (3/5 – 3/10), baixa estatura (5/5 – 5/9), anormalidades oftalmológicas (4/4 – 3/5), anormalidades ao EEGs / crises convulsivas evidentes (2/3 – 3/8) e obesidade (1/3 – 1/9) estavam mais frequente no subgrupo SMS-del, e todos os sinais clínicos avaliados apresentaram-se com freqüências similares, demonstrando a eficácia dos critérios diagnósticos neste trabalho. 49 A comparação dos sinais clínicos do subgrupo SMS-del da presente casuística com o subgrupo SMS-del da literatura (ELSEA & GIRIRAJAN, 2008; WILLIAMS et al., 2009) mostra que os sinais clínicos prognatismo relativo com a idade (6/7 – 50%), hipotonia (até os dois anos) (4/4 – 71%), auto-abraço (6/6 – 66%), baixa estatura (5/5 – 67%) e alteração odontológica (4/4 – 54%) estavam mais frequentes nos pacientes brasileiros em relação aos descritos na literatura, provavelmente devido a indução, através da lista de sinais clínicos elaborada para avaliação clínica pelos médicos geneticistas clínicos brasileiros (Anexo 02). Os sinais clínicos constipação intestinal (2/4 – 95%) e voz rouca e grave (1/5 – 86%) estavam com frequências inferiores no subgrupo de pacientes brasileiros em relação à literatura. A característica voz rouca e grave é bastante subjetiva e relato de constipação intestinal pode ser subjetivo ou refletir hábitos alimentares diferentes. O subgrupo SMS-like descrito por Williams et al., (2009), em 52 pacientes foi referido como não possuindo deleção 17p11.2 ou mutação no gene RAI1. O presente subgrupo SMS-like somente diz respeito a pacientes sem a deleção 17p11.2, necessitando ainda neste subgrupo realizarmos os estudos moleculares. Porém, para efeitos comparativos consideramos os dois subgrupos (SMS-like da presente casuística e SMS-like da literatura), e verificamos que voz rouca e grave (7/8 – 50%) e cardiopatia (4/9 – 11%) estavam mais frequentes nos pacientes SMS-like brasileiros e anomalias de laringe e ouvido médio (1/7 – 64%), sinais de neuropatia periférica (3/6 – 72%) e obesidade (1/9 – 53%) estavam mais frequentes no subgrupo internacional. 50 Destas comparações, muito embora tenhamos feito aqui algumas considerações, demonstramos a similaridade do diagnóstico de SMS nos subgrupos SMS-del e SMS-like tanto brasileiro quanto da literatura. Segundo Williams et al., (2009), os casos sem deleção 17p11.2 e sem alterações moleculares demonstram que outras vias para a etiologia de SMS podem ainda ser desvendadas, demonstrando claramente a heterogeneidade genética desta condição. 6.2 Análise citogenética A análise citogenética proposta neste trabalho foi de: a) analisar inicialmente, metáfases em bandamento GTG resolução de 300-400 bandas, b) analisar prometáfases em bandamento GTG resolução superior a 550 bandas, c) realizar FISH para detectar deleção do gene FLII e d) realizar FISH para detectar a deleção do gene RAI1. Todos os 17 casos foram analisados em metáfases (etapa a), sendo que em sete casos detectamos a deleção 17p. Nos dez casos restantes foram realizadas as análises em prometáfases (etapa b) onde não foi observada a deleção. Nos sete casos anteriormente detectados com a deleção 17p, as análises por FISH demonstraram que tanto o gene FLII e como o gene RAI1 também estavam deletados. Nos 10 casos em que não foi evidenciada a deleção 17p, análises de FISH demonstraram que os genes FLII e RAI1 estavam presentes nos dois cromossomos 17 de cada célula. Salman et al., 2004 sugerem que todas as deleções em 17p11.2 podem ser detectadas pela análise citogenética com resolução de bandamento de 550 bandas ou mais. Em nosso grupo amostral pudemos detectar tal deleção em 51 resolução de bandamento de 300 a 400 bandas, isto pode ser devido a experiência em citogenética do nosso grupo ou por indução de verificação dos cromossomos 17 devido a hipótese diagnóstica. Muito embora só tenhamos sete casos com a deleção 17p11.2, a análise por FISH apresentou-se idêntica em qualquer das duas metodologias empregadas (etapas c e d), não nos permitindo inferir superioridade entre elas. Uma vez que o gene RAI1, quer deletado, quer mutado (mutação de ponto), tem sido apontado como o principal gene responsável por grande parte do fenótipo de SMS, sugerimos sempre a utilização da sonda que detecta a presença/ausência deste gene pela análise de FISH. 52 7 CONCLUSÃO 1- Utilização de ficha clínica específica para preenchimento do geneticista clínico é extremamente útil na definição da hipótese diagnóstica de SMS. 2- No grupo amostral com hipótese diagnóstica de SMS, 40% apresentaram deleção 17p11.2. 3- Não ocorreram diferenças significativas entre as características clínicas do grupo amostral brasileiro comparado com os publicados na literatura. 4- Não ocorreram diferenças significativas entre as características clínicas dos subgrupos SMS-del e SMS-like da presente casuística comparados entre si e com os subgrupos descritos na literatura internacional. 5- A análise citogenética induzida para o cromossomo 17 pode comprovar a deleção 17p por bandamento GTG resolução de 300 a 400 bandas. 6- Todos os sete casos com deleção 17p11.2 também apresentaram deleção dos genes FLII e RAI1. 7- Sugerimos a utilização da sonda que detecta a presença/ausência do gene RAI1 na técnica de FISH para o diagnóstico da SMS. 8- Todos os casos com hipótese diagnóstica para SMS sem deleção 17p11.2, com os genes FLII e RAI1 não deletados devem ser analisados por técnicas de genética molecular (qPCR, MLPA, CGH-array, etc). 9- Trata-se aqui da maior amostra brasileira de SMS já descrita. 53 8. 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(14) 3811-6016 Fone/Fax (14) 3815-3131 Cx.P. 529 18618-000 Botucatu/SP email: sag@fmb.unesp.br TERMO DE CONSENTIMEMNTO LIVRE ESCLARECISDO Nós estamos convidando vocês a participarem de projeto de pesquisa intitulado “Refinamento citogenético da região 17p11.2 em portadores do Síndrome de Smith- Magenis” do Serviço de Aconselhamento Genético (SAG) – UNESP – Botucatu cujo responsável é o Bruno Faulin Gamba e gostaríamos que vocês soubessem que: - Participar deste projeto é uma opção de vocês, podendo decidir participar ou não; Caso vocês decidirem não participar ou desistirem de participar a qualquer momento vocês não perderão nenhum benefício ou tratamento que estiverem fazendo nesta instituição ( UNESP – Botucatu). - Em qualquer momento você terá a liberdade de buscar junto aos responsáveis pelo projeto, esclarecimentos de qualquer natureza, inclusive os relativos a metodologia de trabalho. - Sua participação nesta pesquisa é total e completamente isenta de qualquer ônus Financeiro. Caso você venha a ter qualquer despesa decorrente de sua participação nesta pesquisa, será imediatamente ressarcido, mediante a devolução dos valores despendidos. - Você receberá uma cópia desse Termo de Consentimento Livre Esclarecido. - O presente trabalho tem por Objetivos: 1- Realizar exames citogenéticos de alta resolução para caracterizar a deleção da região 17p11.2 nos pacientes brasileiros portadores de SMS; 2- Realizar exame molecular citogenético nos pacientes brasileiros portadores da SMS, pela técnica de FISH para a detecção da microdeleção da região 17p1.2; 3- Correlacionar os achados fenotípicos (clínicos) com os achados citogenéticos; - Se vocês decidirem participar gostaríamos de informar-lhes que: a) iremos coletar uma amostra de 6ml de sangue (1 colher de sopa) do portador da síndrome Smith-Magenis e de seus pais. b) A coleta de sangue pode causar algum desconforto físico e existe um risco de ocorrer uma mancha roxa (hematoma) na região da coleta. c) Os resultados deste estudo talvez não sejam de benefício imediato para você ou sua família. d) Vocês estarão colaborando para aumentar o nosso conhecimento sobre a origem da síndrome de Smith-Magenis. e) O material biológico (DNA) será armazenado em nossos bancos de estoque e poderá ser usado em futuras pesquisas por fatores genéticos, relacionados com a síndrome de Smith-Magenis, que venha a ser descobertos, diante de nova aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa e Comissão Nacional de Ética em Pesquisa, após vocês serem novamente constatados e dando nova autorização. f) OS resultados poderão demorar meses para ficarem prontos. 67 g) Assim que existam resultados, estes serão apresentados a vocês pelos responsáveis. h) Os resultados deverão ser publicados em revistas científicas que circulam entre os profissionais da saúde que tenham interesse nesta área. i) Sempre que ocorrerem publicações científicas, a sua identidade, de seu filho ou sua família será mantida em absoluto sigilo. j) Somente pesquisadores envolvidos com o projeto terão acesso aos dados completos, não sendo permitido o acesso aos dados por terceiros. k) Os resultados dos exames realizados estarão disponíveis no prontuário do portador da síndrome de Smith-Magenis do Serviço de Aconselhamento Genético – UNESP. l) Os pesquisadores se responsabilizam por reparar danos eventuais associados e/ou decorrentes da pesquisa, sejam eles imediatos ou tardios, inclusive no que diz respeito às indenizações. Eu, _________________________________________________ portador do R.G. nº _______________________(responsável pelo paciente) concordo em participar do projeto de pesquisa “refinamento citogenético da região 17p1.2 em portadores da síndrome de Smith-Magenis”. Declaro haver recebido as devidas explicações sobre o referido projeto, estar ciente sobre os itens acima mencionados e minha participação é voluntária por opção própria. Nome do Paciente:_______________________________________data:_____________ __________________________ Assinatura Nome do responsável: Responsável: Bruno Faulin Gamba Fone: (14) 3814-6229 Endereço: Rubião Junior S/N – UNESP – Campos de Botucatu – Depto. de Genética – Serviço de Aconselhamento Genético Botucatu/SP – CEP: 18.618-000 gamba_sp@yahoo.com.br 68 Eu, _______________________________________ portador do R.G. nº ______________________. ( ) Autorizo ( ) Não Autorizo que minha amostra de DNA fique depositada no Banco de DNA do Serviço de Aconselhamento Genético de Botucatu. _________________________ Assinatura Nome do responsável: 69 � 70 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � Anexo 2: Ficha clínica 71 FICHA DE ANAMNESE 1. Identificação: Nome: ------------------------------------------------------------------------------------------------ Nasc.:--------------- Data:----------------------------------- RG:----------------------------------------------- Idade:--------------------------------- Local:----------------------------------------------------- Mãe: ------------------------------------------------------------------------------------------------ Idade:--------------- Profissão:------------------------------------------------- Pai: ------------------------------------------------------------------------------------------------- Idade:--------------- Profissão:------------------------------------------------- Endereço:--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Telefone:-------------------------------------------------- 2. Dados gestacionais e antecedentes maternos Pré-natal ( ) Período______ Duração da gravidez__________ Início dos movimentos fetais_____________________ Intensidade_________ Ganho de peso com a gravidez________kg Hemorragia ( ) Processo febril ( ) Contágio ( ) Edema ( ) PA____________ Convulsões ( ) Polidrâmnio ( ) Oligodrâmnio ( ) Obs.: ______________________________________________________________________________ Enfermidades agudas/crônicas: ______________________________________________________________________________ Fatores físicos/qumicos: ______________________________________________________________________________ 3. Parto Normal ( ) Cesariana ( ) Fórceps ( ) 72 Obs.: _________________________________________________________ Hospitalar ( ) Domiciliar ( ) Outro ( ) Especificar___________________________________________________ Obs.:__________________________________________________________________________ 4. Condições do RN Peso_________ Comprimento__________ PC________ PT_______ APGAR_________ Choro________ Cianose____________ Sucção____________ Tônus_________ Icterícia_______________ Fototerapia ( ) Exanguíneotransfusão ( ) Permanência na maternidade_______________________________________ Febre_______________ Convulsões________________ Obs.: 5. Evolução Firmou cabeça_______________ Sorriso social________________ Sentou com __________ apoio__________________ Sentou sem apoio____________ Andou______________ Palavra_______________ Frases_________________ Fechou fontanela__________________ Controle vesical ___________ Anos de escolaridade_____________ Tipo de escola_______________________________________________ Passado mórbido: Doenças próprias da Infância ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Complicações: ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ Convulsões (quantos episódios, tempo de duração, descrição) 73 ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ Obs.: ______________________________________________________________________________ 6. Antecedentes Familiais Retardo mental________________ Recorrência familial da doença semelhante ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ Caso de malformação na família __________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ Recorrência familial de alguma outra doença ________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ Consangüinidade entre os pais? ( ) Tipo________________ 8. Heredograma 74 9. Foto do Paciente: ( ) Sim ( ) Não 75 Exame Físico 1. Biometria Estatura_____cm ( %) Peso_____gr ( %) Envergadura_____cm ( %) PC_____cm ( %) PT______cm ( %) DII_____mm ( %) DIE_____mm ( %) Bregma_______________________ AP_______cm BP ______cm BP x 100 = I.C. = __________ AP 2. Crânio e face Microcefalia ( ) Macrocefalia ( ) Hidrocefalia ( ) Craniossinostose ( ) Occipital plano ( ) Proeminente ( ) Abaulamento Frontal ( ) Glabela proeminente ( ) Assimetria craniana ( ) Braquicefalia ( ) Dolicocefalia ( ) Plagiocefalia ( ) Faceis triangular ( ) Faceis redonda ( ) Assemetria Facial ( ) Áreas de aplasia de couro cabeludo ( ) Implantação do cabelo Normal ( ) Baixa ( ) Obs.: ______________________________________________________________________________ 3. Orelhas Grandes ( ) Pequenas ( ) Implantação normal ( ) Baixa ( ) Microtia ( ) Pavilhão malformado ( ) Apêndices auriculares ( ) Ausência do conduto auditivo externo ( ) Estenose do mesmo ( ) Fístula ( ) Obs.: ______________________________________________________________________________ 4. Olhos Sinofre ( ) Ptose Palpebral ( ) Estrabismo ( ) Convergente ( ) Divergente ( ) Infecção ( ) Lacrimejamento ( ) Anoftalmia ( ) Microftalmia ( ) Hipertelorismo ( ) Prega epicântica ( ) Fendas palpebrais oblíquas para cima ( ) Para baixo ( ) Retificados ( ) Exoftalmo ( ) Nistagmo ( ) Esclereóticos azuis ( ) Íris ( ) Coróide ( ) Cristalino ( ) Retina ( ) Pálpebra ( ) Aniridia ( ) 76 Manchas na íris ( ) Glaucoma congênito ( ) Cataratas ( ) Opacidade corneana ( ) Retinose pigmentar ( ) Obs.: ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 5. Nariz Em sela ( ) ponte nasal:_________ base nasal_________ Estenose de narinas Columela _______________ Desvio de septo ( ) Hipoplasia alar ( ) Nariz proeminente ( ) Obs.: ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 6. Maxilar e Mandíbula Hipoplasia maxilar ( ) Micrognatismo ( ) Macrognatismo ( ) Progatismo ( ) Retrognatismo ( ) Filtro Nasal _______________ Obs.: _____________________________________________________________________ 7. Boca Fissura lábio ( ) __________________________ Fissura palatina ( ) ___________________________ Lábios volumosos ( ) Fossetas no lábio inferior ( ) Comissuras bucais desviadas para baixa ( ) Microstomia ( ) Macrostomia ( ) Língua fendida ( ) Língua geográfica ( ) Freio lingual curto ( ) Defeito dentario ( ) Palato alto ( ) Ogival ( ) Úvula bífidal ( ) Início da dentição: _________ Obs.: ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 8. Pescoço Pescoço curto ( ) Cistos ( ) Fístulas ( ) Tireóide ( ) Obs.: ______________________________________________________________________________ 77 9. Tórax Caixa To