UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Geociências e Ciências Exatas Câmpus de Rio Claro ANA MARTA CAVINATO MARCHINI ROLISOLA ANÁLISE DE ESPECIAÇÃO E FRACIONAMENTO DE BIOCIDAS DE ZINCO (PIRITIONATO DE ZINCO, ZINEB E ZIRAM) UTILIZANDO SPE, DGT, HPLC E ICP-MS EM ÁGUA ESTUARINA Rio Claro - SP 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Geociências e Ciências Exatas Câmpus de Rio Claro ANA MARTA CAVINATO MARCHINI ROLISOLA ANÁLISE DE ESPECIAÇÃO E FRACIONAMENTO DE BIOCIDAS DE ZINCO (PIRITIONATO DE ZINCO, ZINEB E ZIRAM) UTILIZANDO SPE, DGT, HPLC E ICP-MS EM ÁGUA ESTUARINA Rio Claro - SP 2018 Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Geociências e Meio Ambiente - Instituto de Geociências e Ciências Exatas do Câmpus de Rio Claro, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Geociências e Meio Ambiente. Orientador: Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário Rolisola, Ana Marta Cavinato Marchini Análise de especiação e fracionamento de biocidas de zinco (Piritionato de zinco, Zineb e Ziram) utilizando SPE, DGT, HPLC e ICP-MS em água estuarina / Ana Marta Cavinato Marchini Rolisola. - Rio Claro, 2018 122 f. : il., figs., tabs. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Geociências e Ciências Exatas Orientador: Amauri Antonio Menegário 1. Biologia marinha. 2. Anti-incrustantes. 3. Piritionato de zinco. 4. Zineb. 5. Ziram. 6. HPLC. 6. ICP-MS. I. Título. 574.92 R748a Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP - Adriana Ap. Puerta Buzzá / CRB 8/7987 ANA MARTA CAVINATO MARCHINI ROLISOLA ANÁLISE DE ESPECIAÇÃO E FRACIONAMENTO DE BIOCIDAS DE ZINCO (PIRITIONATO DE ZINCO, ZINEB E ZIRAM) UTILIZANDO SPE, DGT, HPLC E ICP-MS EM ÁGUA ESTUARINA Comissão Examinadora Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário (IGCE/CEA/UNESP) – Orientador Prof. Dr. Didier Gastmans (CEA/UNESP) Dra. Lauren Nozomi Marques Yabuki (IGCE/UNESP) Dra. Luciana Polese (CEA/UNESP) Profa. Dra. Anne Hélène Fostier (IQ/UNICAMP) Conceito: Aprovada Rio Claro/SP, 02 de maio de 2018 Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Geociências e Meio Ambiente - Instituto de Geociências e Ciências Exatas do Câmpus de Rio Claro, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Geociências e Meio Ambiente. DEDICATÓRIA Dedico este trabalho A Deus, pela força e fé para superar os momentos de dificuldades. Aos meus filhos Isa e Vitor e ao meu esposo Isnard pelo apoio e compreensão. Aos meus pais João (in memoriam) e Maria. “Na vida, não existe nada a temer, apenas a ser compreendido" (Marie Curie) AGRADECIMENTOS Durante o desenvolvimento deste trabalho obtive ajuda e o apoio de pessoas as quais quero agradecer. Ao Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário, pelo apoio e orientação durante o desenvolvimento desta pesquisa, pelos recursos e infraestrutura disponibilizados. A Dra. Luciana Polese, pelo apoio e explicações referente às técnicas de extração em fase sólida e cromatografia líquida durante o desenvolvimento desta pesquisa. Aos funcionários do Centro de Estudos Ambientais da UNESP, Eleni Nadai Malagutti, Amanda Lodovico Alcântara e Marcos Perdiza pelo apoio técnico. À Rosângela, secretária da pós-graduação, pelas orientações dadas em relação às normas e datas referentes ao curso de doutorado. Aos colegas, Lauren, Karen, Lucia e Everton pelo apoio e amizade. Aos demais alunos do Grupo de Estudo e Desenvolvimento Metodológico em Biogeoquímica (GEMB) pela convivência durante este período. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) que possibilitou a compra de materiais para realização desta pesquisa por meio do processo 2015/03397-4 registrado em nome do Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário (orientador). À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão das bolsas durante a realização desta pesquisa. Resumo Atualmente, cerca de 18 compostos são utilizados como biocidas de reforço (metálicos) em tintas anti-incrustantes, como por exemplo Piritionato de Zinco (Zn(PT)2), Zineb e Ziram. É relevante o desenvolvimento de um método analítico para determinação das concentrações ambientais de biocidas metálicos. O presente estudo teve como objetivos i)desenvolver uma metodologia de extração em fase sólida (SPE) e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada (HPLC) ao espectrômetro de massas com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) para determinação de Zn(PT)2, Zineb e Ziram e ii) quantificar, in lab, a fração lábil total do Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram e in situ, a fração lábil total do zinco, utilizando a técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT) em solução padrão e água estuarina, respectivamente. Na técnica de SPE foi utilizado o sorbente de sílica funcionalizado com fenil apresentando excelente retenção para Zn(PT)2, Zineb e Ziram (94 ± 0,1%, 85 ± 0,04% e 93 ± 0,1%, respectivamente) e recuperações entre 85% e 110%. Na determinação dos biocidas de zinco utilizando o acoplamento HPLC-VGroove-ICP-MS com diluição pós coluna cromatográfica, a fase móvel composta por metanol e 0,006 mol L-1 de acetato de amônio (50:50, v v-1) apresentou o melhor desempenho na separação do Zn(PT)2, Zineb, Ziram. A curva analítica obtida para o Zn(PT)2 apresentou coeficiente de correlação, LD e LQ satisfatórios para os isótopos 64Zn (0,98, 0,575 mg L-1, 1,916 mg L-1), 66Zn(0,99, 0,480 mg L-1 , 1,600 mg L-1), 68Zn(0,98, 0,602 mg L-1, 2,007 mg L-1). Na técnica DGT foi utilizado o agente ligante resina Chelex® 100 para avaliar a labilidade do Zn(PT)2, Zineb e Ziram em água estuarina. Os resultados demonstraram que a fração lábil total do Zn ficou em torno de 100% para o Zineb (111%) e Ziram (109%), ou seja, estes biocidas formaram espécies totalmente lábeis na amostra de água estuarina e para Zn(PT)2 foi de 75% indicando espécies parcialmente lábeis. Os resultados obtidos na técnica SPE, no acoplamento HPLC-VGroove-ICP-MS e DGT demonstraram que os métodos apresentam desempenho satisfatório para a determinação de Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram. Palavras-chave: piritionato de zinco. zineb. ziram. HPLC. ICP-MS. Abstract About 18 compounds are used as booster biocides (metal) in antifouling paints such as Zinc Pyrithione (Zn(PT)2), Zineb and Ziram. It is important to develop an analytical method for determining of the environmental concentrations of zinc biocides. The present study had as objectives i) to develop a solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to the inductively coupled plasma mass spectrometer (ICP-MS) for the determination of Zn(PT)2, Zineb and Ziram and ii) quantify in lab the total labile fraction of Zn(PT)2, Zineb and Ziram and in situ the total labile fraction of zinc using the diffusive gradient in thin films (DGT) technique in standard solution and estuarine water, respectively. In the SPE technique, the silica sorbent functionalized with phenyl presented excellent retention for Zn(PT)2, Zineb and Ziram (94 ± 0.1%, 85 ± 0.04% and 93 ± 0.1%, respectively) and recoveries between 85% and 110%. In the determination of zinc using the HPLC-VGroove-ICP-MS coupling with post-column chromatographic dilution, the mobile phase composed of methanol and 0.006 mol L-1 of ammonium acetate (50:50, v v-1) of presented the best performance in the separation of Zn(PT)2, Zineb and Ziram. The analytical curve obtained for Zn(PT)2 presented satisfactory correlation coefficient, LD and LQ for the isotopes 64Zn (0.98, 0.575 mg L -1, 1.916 mg L-1), 66Zn (0.99, 0.480 mg L-1, 1.600 mg L-1), 68Zn (0.98, 0.602 mg L-1, 2.007 mg L-1). In the DGT technique, the Chelex® 100 resin binder was used to evaluate the lability of the zinc biocides Zn(PT)2, Zineb and Ziram in estuarine water. The results showed that the total labile fraction of Zn was around 100% for Zineb (111%) and Ziram (109%), that is, these biocides formed totally labile species in the estuarine water sample and for Zn(PT)2 was 75% indicating partially labile species. The results obtained in the SPE technique in the HPLC-VGroove-ICP-MS coupling and DGT demonstrated that the methods present satisfactory performance for the determination of Zn(PT)2, Zineb and Ziram. Keywords: zinc pyrithione. zineb. ziram. HPLC. ICP-MS. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Fórmula estrutural do Piritionato de Zinco. ............................................... 25 Figura 2 - Fórmula estrutural do Ziram. ..................................................................... 26 Figura 3 - Fórmula estrutural do Zineb. ..................................................................... 27 Figura 4 - Gradiente de concentração de íons pela técnica DGT (Adaptado de ZHANG e DAVISON, 1995)....................................................................................... 43 Figura 5 - Local de coleta da água do Estuário de Santos/SP. Fonte: Google Maps, 2016. ......................................................................................................................... 50 Figura 6 - Acoplamento HPLC-USN-ICP-MS. 1 - Bomba cromatográfica, 2 - Coluna cromatográfica. .......................................................................................................... 59 Figura 7 - Acoplamento HPLC-APEX-SPIRO-ICP-MS. 1 - Bomba cromatográfica, 2 - Coluna cromatográfica, 3 - Sistema de nebulização APEX, 4 - Dessolvatador SPIRO, 5 - ICP-MS. Fonte: Dados da pesquisa. .................................................................... 62 Figura 8 - Montagem do dispositivo DGT (Adaptado de BENNETT et al., 2011). ..... 63 Figura 9 - Cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zn(PT)2 com a fase móvel 1 (metanol:água (30:70, v v-1) contendo 0,175% (v v-1) de ácido fórmico na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES (n=3). Fonte: Dados da pesquisa. 72 Figura 10 - Cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zineb com a fase móvel 1 (metanol:água (30:70, v v-1) contendo 0,175% (v v-1) de ácido fórmico na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES (n=3). Fonte: Dados da pesquisa. 72 Figura 11 - Cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Ziram com a fase móvel 1 (metanol:água (30:70, v v-1) contendo 0,175% (v v-1) de ácido fórmico na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES (n=3). Fonte: Dados da pesquisa. 73 Figura 12 - Cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zn2+ com a fase móvel 1 (metanol:água (30:70, v v-1) contendo 0,175% (v v-1) de ácido fórmico na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES (n=3). Fonte: Dados da pesquisa. .................................................................................................................................. 73 Figura 13 - Cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zn(PT)2 com a fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES. Fonte: Dados da pesquisa. ..................... 74 Figura 14 - Curva Gaussiana do cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zn(PT)2 com a fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES. Fonte: Dados da pesquisa. ................................................................................................................... 74 Figura 15 - Cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zineb com a fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES. Fonte: Dados da pesquisa. ..................... 75 Figura 16 - Curva Gaussiana do cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zineb com a fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES. Fonte: Dados da pesquisa. ................................................................................................................... 75 Figura 17 - Cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Ziram com a fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES. Fonte: Dados da pesquisa. ..................... 76 Figura 18 - Cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zn2+ com a fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES. Fonte: Dados da pesquisa. ..................... 76 Figura 19 - Curva Gaussiana com base no cromatograma da injeção de 200 µL de 10 µg L-1 de Zn2+ com a fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) obtido por HPLC-USN-ICP OES. Fonte: Dados da pesquisa. ................................................................................................... 77 Figura 20 - Monitoramento dos isótopos A) 52Cr, 53Cr e B) 64Zn, 66Zn e 68Zn em diferentes tempos da fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) utilizando o acoplamento HPLC-USN-ICP-MS (1º Dia). Fonte: Dados da pesquisa........................................................................... 78 Figura 21 - Monitoramento dos isótopos A) 52Cr, 53Cr e B) 64Zn, 66Zn e 68Zn em diferentes tempos da fase móvel 2 (metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) utilizando o acoplamento HPLC-USN-ICP-MS (2º Dia). Fonte: Dados da pesquisa........................................................................... 79 Figura 22 - Depósito de carbono nos cones do ICP-MS: a) skimmer e b) amostragem após dois dias de trabalho (1° e 2° dia de trabalho) utilizando o acoplamento HPLC- USN-ICP-MS. ............................................................................................................ 80 Figura 23 - Cromatogramas do A) Zn2+, B) Zn(PT)2, C) Zineb e D) Ziram obtido por HPLC-USN-ICP-MS utilizando a fase móvel contendo metanol:água (30:70, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa, dwell time: 20 ms, V injeção: 200 µL - 10 µg L-1. Fonte: Dados da pesquisa. ......................................................... 80 Figura 24 - Monitoramento dos isótopos A) 52Cr, 53Cr e B) 64Zn, 66Zn e 68Zn em diferentes tempos da fase móvel 2 (metanol:água (5:95, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) utilizando o acoplamento (HPLC-USN-ICP-MS (3° dia). Fonte: Dados da pesquisa. .......................................................................... 81 Figura 25 - Cromatogramas do A) Zn2+, B) Zn(PT)2, C) Zineb e D) Ziram obtidos por HPLC-USN-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (5:95, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa), dwell time: 20 ms, V injeção: 200 µL - 50 µg L-1. Fonte: Dados da pesquisa. ............................................................................ 82 Figura 26 - Contagens do Zn na água ultrapura no modo de leitura transiente com dwell time de A) 10 ms, B) 250 ms e C) 500 ms obtido por VGroove-ICP-MS. Fonte: Dados da pesquisa. ................................................................................................... 84 Figura 27 - Cromatograma do Zn2+ com dwell time A) 10 ms e B) 500 ms (tat = 20 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50: 50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa), Vinjeção: 100 µL - 500 µg L-1 Fonte: Dados da pesquisa. ...................................................................... 85 Figura 28 - A) Cromatograma do branco (metanol 50% (v v-1) Vinjeção: 100 µL em duplicata, tat = 20 min) apresentando o valor de t0 obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS e fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do branco. Fonte: Dados da pesquisa. ........ 86 Figura 29 - A) Cromatograma do Zn2+( Vinjeção = 100 µL - 500 µg L-1 na solução de metanol 50% (v v-1) em duplicata, tat = 20 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS e fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zn2+. Fonte: Dados da pesquisa.............. 86 Figura 30 - A) Cromatograma do Zn(PT)2 (Vinjeção = 100 µL - 500 µg L-1 na solução de metanol 50% (v v-1) em duplicata, tat = 20 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS e fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zn(PT)2. Fonte: Dados da pesquisa. ....... 87 Figura 31 - A) Cromatograma do branco (metanol 50% (v v-1) (Vinjeção = 200 µL, tat = 30 min) apresentando o valor de t0 obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS e fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do branco. Fonte: Dados da pesquisa. .................... 88 Figura 32 - A) Cromatograma do Ziram (Vinjeção: 100 µL - 500 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 20 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Ziram. Fonte: Dados da pesquisa. .................................... 88 Figura 33 - A) Cromatograma do Ziram (Vinjeção: 200 µL – 500 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 20 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Ziram. Fonte: Dados da pesquisa. .................................... 89 Figura 34 - A) Cromatograma do branco (metanol 50% (v v-1), Vinjeção: 200 µL, tat = 30 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do branco. Fonte: Dados da pesquisa. .................................................... 89 Figura 35 - A) Cromatograma do Ziram (Vinjeção: 200 µL – 500 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 30 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Ziram. Fonte: Dados da pesquisa. .................................... 90 Figura 36 - A) Cromatograma do Zineb (Vinjeção: 200 µL – 500 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 30 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zineb. Fonte: Dados da pesquisa. .................................... 90 Figura 37 - A) Cromatograma do Zn2+ (Vinjeção: 100 µL – 500 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 20 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zn2+. Fonte: Dados da pesquisa. ...................................... 91 Figura 38 - A) Cromatograma do branco (metanol 50% (v v-1), Vinjeção: 200 µL, tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do branco. Fonte: Dados da pesquisa. .................................................... 91 Figura 39 - A) Cromatograma do Ziram (Vinjeção: 200 µL – 500 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Ziram. ................................................................................ 92 Figura 40 - A) Cromatograma do Zn2+ (Vinjeção: 200 µL – 800 µg L-1 em metanol 50% (v v-1) tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zn2+. .................................................................................. 92 Figura 41 - A) Cromatograma do branco (metanol 50% (v v-1), Vinjeção: 200 µL, tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do branco. Fonte: Dados da pesquisa. .................................................... 93 Figura 42 - A) Cromatograma do Zineb (Vinjeção: 200 µL – 800 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zineb. ................................................................................ 93 Figura 43 - A) Cromatograma do Zn2+ (Vinjeção: 200 µL – 800 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zn2+. .................................................................................. 93 Figura 44 - A) Cromatograma do branco (metanol 50% (v v-1), Vinjeção: 200 µL, tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS e fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do branco. Fonte: Dados da pesquisa. ........................................................................... 94 Figura 45 - A) Cromatograma do Zineb (Vinjeção: 200 µL - 1.000 µg L-1 em metanol 50% (v v-1) tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zineb. ................................................................................ 95 Figura 46 - A) Cromatograma do Zn2+ (Vinjeção: 200 µL - 800 µg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 60 min) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS utilizando a fase móvel 2 (metanol:água (50:50, v v-1) e 0,02 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa) e B) Curva gaussiana do Zn2+. .................................................................................. 95 Figura 47 - Curva de calibração do Zn(PT)2 dissolvido em CH3OH 50% (v v-1) (1° dia) obtido por HPLC-VGroove-ICP-MS e fase móvel 2 (metanol:água (70:30, v v-1) e 0,006 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa. Fonte: Dados da pesquisa. 96 Figura 48 - Cromatograma da injeção do branco demonstrando a queda das contagens de Zn ocasionadas pela formação de bolhas na saída da coluna ao utilizar a fase móvel contendo 0,033 mol L-1 de acetato de amônio na bomba A (30%) e metanol 100% (v v-1) na bomba B (70%) (vazão = 0,5 mL min-1 e dwell time = 500 ms). Fonte: Dados da pesquisa....................................................................... 97 Figura 49 - Cromatograma da curva de calibração do Zn(PT)2 em solução de CH3OH 50% (v v-1) demonstrando instabilidade do sistema cromatográfico ocasionada pela formação de bolhas ao utilizar a fase móvel contendo 0,033 mol L-1 de acetato de amônio na bomba A (30%) e metanol 100% (v v-1) na bomba B (70%) (vazão = 0,5 mL min-1 e dwell time = 500 ms). ......................................................................... 98 Figura 50 - A) Cromatograma do branco (metanol 70% (v v-1), Vinjeção: 50 µL, tat = 20 min) obtido por HPLC-APEX-SPIRO-ICP-MS utilizando a fase móvel contendo metanol:água (70:30, v v-1) e 0,01 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa e B) Curva gaussiana do branco. ................................................................................. 99 Figura 51 - A) Cromatograma do Zn(PT)2 (Vinjeção: 50 µL - 7 mg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 20 min) obtido por HPLC-APEX-SPIRO-ICP-MS utilizando a fase móvel contendo metanol:água (70:30, v v-1) e 0,01 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa e B) Curva gaussiana do Zn(PT)2. ................................................................ 99 Figura 52 - A) Cromatograma do Zn2+ (Vinjeção: 50 µL - 7 mg L-1 em metanol 50% (v v-1), tat = 20 min) obtido por HPLC-APEX-SPIRO-ICP-MS utilizando a fase móvel contendo metanol:água (70:30, v v-1) e 0,01 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa e B) Curva gaussiana do Zn2+. Fonte: Dados da pesquisa. ........................ 100 Figura 53 - Curva analítica do Zn(PT)2 em CH3OH 70% (v v-1) obtido por HPLC- APEX-SPIRO-ICP-MS e fase móvel contendo metanol:água (70:30, v v-1) e 0,01 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa. Fonte: Dados da pesquisa. .............. 101 Figura 54 - Massa de Zn retida em função do tempo por DGT-Chelex® 100 durante 18 h de imersão na amostra sintética contendo 93 ± 0,5 µg L-1 de Zn(PT)2 (n=2). Fonte: Dados da pesquisa....................................................................................... 104 Figura 55 - Massa de Zn retida em função do tempo por DGT-Chelex® 100 durante 18 h de imersão na amostra sintética contendo 94 ± 0,6 µg L-1 de Zineb (n = 2). Fonte: Dados da pesquisa....................................................................................... 105 Figura 56 - Massa de Zn retida em função do tempo por DGT-Chelex® 100 durante 18 h de imersão na amostra sintética contendo 72 ± 0,6 µg L-1 de Ziram (n = 2). Fonte: Dados da pesquisa....................................................................................... 105 Figura 57 - Massa de Zn retida em função do tempo por DGT-Chelex® 100 durante 18 h de imersão na amostra de água do Estuário de Santos/SP contendo 112,4 ± 1,8 µg L-1 de Zn(PT)2 (n = 2). ........................................................................................ 107 Figura 58 - Massa de Zn retida em função do tempo por DGT-Chelex® 100 durante 18 h de imersão na amostra de água do Estuário de Santos/SP contendo 119,2 ± 1,2 µg L-1 de Zineb (n = 2). ............................................................................................ 107 Figura 59 - Massa de Zn retida em função do tempo por DGT-Chelex® 100 durante 18 h de imersão na amostra de água do Estuário de Santos/SP contendo 92,9 ± 1,4 µg L-1 de Ziram (n = 2). ............................................................................................ 107 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Condições analíticas de métodos para análise de biocidas. .................... 40 Tabela 2 - Parâmetros operacionais do ICP OES utilizados no acoplamento HPLC- USN-ICP OES. .......................................................................................................... 58 Tabela 3 - Parâmetros operacionais do ICP-MS utilizadas no acoplamento HPLC- VGroove-ICP-MS. ..................................................................................................... 60 Tabela 4 - Parâmetros utilizados na determinação do Zn por HPLC-VGroove-ICP- MS. ............................................................................................................................ 61 Tabela 5 - Quantificação do Zn no metanol não tratado e tratado com a resina Chelex® 100 (200 - 400 mesh, forma sódio). ............................................................. 64 Tabela 6 - Concentrações de metais determinadas na etapa de limpeza do sorbente Sepra Fenil por ICP OES (vista axial). ...................................................................... 66 Tabela 7 - Concentrações de metais determinados por ICP OES (vista axial) no processo de descontaminação do papel filtro com HNO3 10% (v v-1) (n = 15). ......... 67 Tabela 8 - Retenção do Zn(PT)2, Zineb e Ziram pelo sorbente Sepra Fenil na SPE em 40 mL de amostra sintética fortificada com 40 µg L-1 dos biocidas de zinco. ...... 68 Tabela 9 - Concentração e massa de Zn em 40 mL da amostra de água do Estuário de Santos/SP fortificada com 100 µg L-1 dos biocidas de zinco referente a SPE...... 69 Tabela 10 - Recuperação de Zn em 40 mL da amostra de água do Estuário de Santos/SP fortificada com 100 µg L-1 dos biocidas de zinco). ................................... 70 Tabela 11 - Valores de R2, SD, LD e LQ obtidos da curva de calibração do Zn(PT)2 utilizando HPLC-VGroove-ICP-MS. ........................................................................... 96 Tabela 12 - Valores de SD, LD e LQ da curva de calibração determinados por HPLC- APEX-SPIRO-ICP-MS e fase móvel contendo metanol:água (70:30, v v-1) e 0,01 mol L-1 de acetato de amônio na porção aquosa. .......................................................... 102 Tabela 13 - Concentração de Zn nas soluções padrões (amostra sintética) durante o período de imersão DGT-Chelex® 100 (n = 2). ....................................................... 103 Tabela 14 - Massa de zinco retida pelo gel de resina Chelex® 100 durante 18 h de imersão na solução padrão dos biocidas de zinco obtido por ICP OES (n = 2). ..... 103 Tabela 15 - Razão CDGT/ CSol dos biocidas metálicos na amostra sintética (n = 2). 104 Tabela 16 - Teor total de metais na água do Estuário de Santos/SP. ..................... 106 Tabela 17 - Concentração de Zn na amostra de água do Estuário de Santos/SP durante o período de imersão (n = 2). ..................................................................... 106 Tabela 18 - Razão CDGT/CSol dos biocidas metálicos na amostra de água do Estuário de Santos/SP (n = 2). .............................................................................................. 108 Tabela 19 - Teor total e dissolvido de metais no Estuário de Santos/SP durante o período de imersão de 18 h determinados por CCT-ICP-MS. ................................. 109 Tabela 20 - Especiação do Zn utilizando o programa CHEAQS Pro. ...................... 109 LISTA DE EQUAÇÕES Equação 1 ................................................................................................................. 32 Equação 2 ................................................................................................................. 33 Equação 3 ................................................................................................................. 33 Equação 4 ................................................................................................................. 33 Equação 5 ................................................................................................................. 33 Equação 6 ................................................................................................................. 33 Equação 7 ................................................................................................................. 43 Equação 8 ................................................................................................................. 43 Equação 9 ................................................................................................................. 44 Equação 10 ............................................................................................................... 44 Equação 11 ............................................................................................................... 44 Equação 12 ............................................................................................................... 44 Equação 13 ............................................................................................................... 54 Equação 14 ............................................................................................................... 54 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A - Área AAS - Espectrometria de Absorção Atômica CLAE - Cromatografia líquida de Alta Eficiência C - Concentração CCT - Collision Cell Technology Ce - Concentração do Eluído Cs - Concentração da Solução Cu(PT)2 - Piritionato de Cobre CuPT+ - Complexo de Piritionato de Cobre D - Coeficiente de Difusão DAD - Diode Array Detector DMSO - Dimetilsulfóxido ∆g - Espessura do gel Δt’r - Variação entre os tempos de retenção efetivos Eh - Potencial de oxidação-redução EC10 - Effective Concentration (10 %) EC50 - Effective Concentration (50 %) EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic acid ESI-MS - Electrospray Ionisation Mass Spectrometry F - Fluxo fe - Fator de Eluição FE - Fase Estacionária Fe(PT)3 - Piritionato de Ferro Flame-AAS - Flame Atomic Absorption Spectroscopy FM - Fase Móvel GPC - Gel Permeation Column HPLC - High Performance Liquid Chromatography HPLC-UV - High Performance Liquid Chromatography - Ultraviolet Detector HSA - 1-Hexanesulfonic Acid Sodium Salt ICP-MS - Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry IMO - International Maritime Organization LC-APCI-MS - Liquid Chromatography/Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry LC-MS/MS - Liquid Chromatography Tandem-Mass Spectrometry Log Kow - Coeficiente de partição octanol/água m – Massa Me - Massa eluída Mr - Massa retida MEPC - Marine Environment Protection Committee MePT2/3 - Complexos metálicos com dois ou três ligantes de piritionato M1 - Produto de degradação do Irgarol 1051 N - Número de Pratos Teóricos Nef - Número de Pratos Teóricos Efetivos NaPT - Piritionato de Sódio PFA - Perfluoroalcoxi R2 - Coeficiente de correlação Rs - Resolução RSD - Relative Standard Desviation Si-PH - Sílica funcionalizada com fenil SPE - Solid-Phase Extraction TBT - Tributyltin TLC - Thin-Layer Chromatography TMD - Teflon Membrane Desolvator TPT - Triphenyltin t - Tempo tr - Tempo de Retenção t’r - Tempo de Retenção Efetivo t0 - Tempo Morto UV-VIS - Ultraviolet-Visible Spectrophotometry Vác - Volume de ácido Vgel - Volume do gel Zn(PT)2 - Piritionato de Zinco Wb - Largura da base do pico cromatográfico W0,5 - Largura da base do pico cromatográfico na meia-altura SUMÁRIO 1 - INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 21 2 - HIPÓTESE E OBJETIVOS ................................................................................... 24 3 - REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................... 25 3.1 - Características Gerais do Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram .......................... 25 3.2 - Espectrometria de Massas Acoplada a Plasma Induzido.................................. 27 3.3 - Extração em Fase Sólida .................................................................................. 30 3.4 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência .......................................................... 32 3.4.1 - Fundamentação ............................................................................................. 32 3.4.2 - Aplicação ........................................................................................................ 33 3.5 - Técnica de Difusão em Filmes Finos por Gradiente de Concentração ............. 43 4 - MATERIAIS E REAGENTES ............................................................................... 46 4.1 - Equipamentos e Acessórios .............................................................................. 46 4.2 - Reagentes, Padrões, Soluções e Solventes ..................................................... 47 5 - MÉTODOS ........................................................................................................... 48 5.1 - Local de amostragem ........................................................................................ 49 5.1.1 - Amostragem para imersão in lab (DGT) e SPE ............................................. 49 5.1.2 - Amostragem para determinação do teor total e teor dissolvido ..................... 50 5.2 - Tratamento do Metanol com Chelex® 100 ......................................................... 51 5.3 - Extração em Fase Sólida (SPE) ........................................................................ 52 5.3.1 - Descontaminação do sorbente Sepra Fenil ................................................... 52 5.3.2 - Descontaminação do papel de filtro quantitativo ............................................ 52 5.3.3 - Teste de retenção do Zn(PT)2, Zineb e Ziram pelo sorbente Sepra Fenil na amostra sintética ....................................................................................................... 53 5.3.4 - Capacidade sortiva do sorbente Sepra Fenil ................................................. 54 5.3.5 - Teste de retenção e recuperação do Zn(PT)2, Zineb e Ziram pelo sorbente Sepra Fenil na amostra de água do Estuário de Santos/SP ..................................... 54 5.3.6 - Limite de detecção e limite de quantificação do método de SPE ................... 56 5.4 - Preparo da Fase Móvel para HPLC .................................................................. 56 5.5 - Testes preliminares utilizando o acoplamento HPLC-USN-ICP OES ............... 57 5.6 - Otimização do ICP-MS ...................................................................................... 59 5.7 - Acoplamento HPLC-USN-ICP-MS .................................................................... 59 5.8 - Acoplamento HPLC-VGroove-ICP-MS .............................................................. 60 5.9 - Acoplamento HPLC-APEX-SPIRO-ICP-MS ...................................................... 61 5.10 - Técnica DGT ................................................................................................... 62 6 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 64 6.1 - Tratamento do Metanol com Chelex® 100 ......................................................... 64 6.2 - Extração em Fase Sólida - Sorbente em Massa Sepra Fenil ............................ 65 6.2.1 - Descontaminação do sorbente Sepra Fenil ................................................... 65 6.2.2 - Descontaminação do papel de filtro quantitativo ............................................ 67 6.2.3 - Teste de retenção do Zn(PT)2, Zineb e Ziram pelo sorbente Sepra Fenil na amostra sintética ....................................................................................................... 67 6.2.4 - Capacidade sortiva do sorbente Sepra Fenil ................................................. 68 6.2.5 - Teste de retenção e recuperação do Zn(PT)2, Zineb e Ziram pelo sorbente Sepra Fenil na amostra de água do Estuário de Santos/SP ..................................... 69 6.2.6 - Limite de detecção e limite de quantificação do método de SPE ................... 71 6.3 - Acoplamentos envolvendo HPLC ...................................................................... 71 6.3.1 - Testes preliminares utilizando o acoplamento HPLC-USN-ICP OES ............ 71 6.3.2 - Acoplamento HPLC-USN-ICP-MS ................................................................. 78 6.3.3 - Acoplamento HPLC-VGroove-ICP-MS ........................................................... 83 6.3.3.1 - Influência do dwell time no pico cromatográfico .......................................... 84 6.3.3.2 - Tempo de retenção do Zn2+ e Zn(PT)2 ........................................................ 85 6.3.3.3 – Tempo de retenção do Ziram, Zineb e Zn2+ ............................................... 87 6.3.3.4 - Curva de calibração do Zn(PT)2 .................................................................. 95 6.3.4 - Acoplamento HPLC-Apex-Spiro-ICP-MS ....................................................... 98 6.3.4.1 - Tempo de retenção do Zn(PT)2 e Zn2+ ........................................................ 98 6.3.4.2 - Curva de calibração do Zn(PT)2 ................................................................ 101 6.4 - Técnica DGT ................................................................................................... 102 7 - CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES .............................................................. 110 8 - REFERÊNCIAS .................................................................................................. 112 21 1 - INTRODUÇÃO A contaminação do ambiente aquático por metais é oriunda principalmente de atividades antrópicas impactantes. Em áreas de intensa atividade náutica, como portos, marinas e docas, o risco de contaminação é expressivo devido à circulação de navios e embarcações. Para evitar a incrustação biológica, os navios e embarcações realizam um tratamento no casco com tinta anti-incrustante. A incrustação biológica, a qual os cascos dos navios imersos no mar estão sujeitos resulta na diminuição significativa da eficiência operacional com consequente aumento dos custos, devido principalmente ao aumento no consumo de combustível. Este aumento no consumo de combustível ocorre porque a incrustação torna a superfície dos cascos irregular, aumentando o arrasto e reduzindo a velocidade. A incrustação de 10 μm no casco de um navio pode significar um aumento de 0,3 a 1% no consumo de combustível (CHAMP e LOWENSTEIN, 1987; SANTALLA, 2008). Desta forma, a aplicação de tintas anti- incrustantes ajuda a prevenir o estabelecimento e crescimento de algas, mexilhões e outros organismos marinhos nos cascos dos navios e das embarcações. Existem diferentes tipos de tintas anti-incrustantes. Nas tintas de livre associação (“free-association”), o biocida é fisicamente misturado na matriz da tinta e liberado para o meio aquático por difusão, com tempo de duração de dois anos. Já nas tintas de autopolimento (“self-polishing”), uma substância tóxica é quimicamente ligada a um polímero causando um atraso na liberação do biocida para a água, com tempo de duração de cinco a sete anos. As tintas ablativas/erodíveis (“ablative/hydration”) possuem alta proporção de ligantes de secagem física, não tóxicos e solúveis em água do mar, combinados com substâncias poliméricas capazes de controlar, por processos físicos, a velocidade da dissolução. Em contato com a água, os biocidas dissolvem-se juntamente com o ligante solúvel. Possuem efetividade superior a três anos. Por fim, as tintas isentas de biocidas (“biocide-free”) que são compostas por silicones ou fluoropolímeros. São hidrofóbicas e possuem superfícies ultralisas, que asseguram baixo atrito, de modo que os organismos incrustantes são incapazes de se fixar e aderir a elas. Contudo, ao final de três anos de exposição em água do mar, apenas conseguem evitar a incrustação em cerca de 20%, sendo eficientes somente em navios de alta velocidade (≥22 nós) (HOCH, 22 2001; DOS SANTOS, 2008; ALMEIDA et al., 2007a; ALMEIDA et al., 2007b; TAKAHASHI, 2009). Por muitos anos, tintas à base de compostos orgânicos de estanho, tais como tributilestanho (TBT, Tributyltin) e trifenilestanho (TPT, Triphenyltin), foram amplamente utilizadas para este fim. No entanto, a partir da década de 80 o uso passou a ser controlado devido ao seu potencial risco ao ecossistema, alcançando notoriedade como compostos altamente tóxicos, afetando inclusive organismo não alvo, tais como peixes, bivalves, gastrópodes, crustáceos e algas (FELIZZOLA, 2005; ALMEIDA et al., 2007a; ALMEIDA et al., 2007b; CASTRO et al., 2011). O Comitê de Proteção do Ambiente Marinho (MEPC, Marine Environment Protection Committee) da Organização Marítima Internacional (IMO, International Maritime Organization), interessada na segurança da navegação e prevenção da poluição marinha adotou uma resolução, em 1990, recomendando aos governos que adotassem medidas para eliminar as tintas anti-incrustantes à base de TBT. Em 1999, a IMO adotou uma resolução que serviu como instrumento mundial de comunicação do MEPC sobre os efeitos nocivos dos sistemas anti-incrustantes utilizados em embarcações. A resolução se referia à proibição global da aplicação de compostos organoestânicos em embarcações a partir de 1º de janeiro de 2003, sendo o prazo limite de 1º de janeiro de 2008 para a circulação de navios contendo esses compostos aplicados em seus cascos (DOS SANTOS, 2008). A proibição global da aplicação de compostos organoestânicos em embarcações impulsionou o desenvolvimento e aplicação de uma nova geração de biocidas anti-incrustantes. Em todo o mundo cerca de 18 compostos são atualmente utilizados como biocidas de reforço em tintas anti-incrustantes. Os mais utilizados são: Clorotalonil, Diclofluanida, Diuron, Irgarol 1051, Sea-Nine 211, 2,3,5,6- tetracloro-4-(metillsulfonil) piridina (TCMS-piridina), (tiocianometiltio)benzotiazol (TCMTB), Piritionato de zinco [Zn(PT)2], Piritionato de cobre [Cu(PT)2], Zineb, Folpet, Mancozeb, Tiram, Ziram para uso amador e profissional (THOMAS, 1998; VOULVOULIS et al., 1999; BOXALL et al., 2000; YEBRA et al., 2004; CHAMBERS et al., 2006; PARKS et al., 2010). O biocida Piritionato de Zinco (complexo de zinco-2-mercaptopiridina-1-óxido) foi introduzido em 1991 pela Arch Chemicals (Norwalk, EUA) como um substituto do TBT em tintas anti-incrustantes. Este composto também é conhecido por sua ação 23 bactericida e fungicida em xampus anticaspa e outros produtos cosméticos (FENN e ALEXANDER, 1988; MARALDO e DAHLLÖF, 2004). Vários estudos foram realizados em relação a fotodegradação do Zn(PT)2 em água destilada e água do mar, respectivamente, principalmente em termos de cinética de degradação (SAKKAS et al.,2006). A fotodegradação do Zn(PT)2 é uma transformação rápida, com meias-vidas variando de minutos a horas, dependendo da fonte de luz e da matriz aquosa (NEIHOF, 1979; MARALDO e DALHLLÖF, 2004; TURLEY et al., 2005). Sugere-se que o Zn(PT)2 persiste no ambiente marinho, onde a influência da luz é limitada, tais como águas e sedimentos sombreados sob locais de estacionamento em marinas e portos (MARALDO e DAHLLÖF, 2004), podendo se acumular no sedimento como Piritionato de Manganês [Mn(PT)2] e Cu(PT)2 (GALVIN, ÂNGULO e MELLADO, 1995; GALVIN, MELLADO e NEIHOF et al., 1998). Bellas (2005), investigou a toxicidade do Zn(PT)2 nos estágios iniciais de desenvolvimento da ascidia Ciona intestinalis. As anormalidades morfológicas larvais foram estudadas após a exposição de embriões de ascidia Ciona intestinalis em diferentes estágios de desenvolvimento e as concentrações médias efetivas (EC50, effective concentration (50 %)) variaram entre 226-590 nmol L-1. Os efeitos tóxicos do Zn(PT)2 na solução larval foram detectados a partir de 9 nmol L-1 (EC10, effective concentration (10 %)). O desenvolvimento embrionário também foi utilizado para estudar a perda de toxicidade em soluções de Zn(PT)2 expostas à luz solar direta e a luz UV do laboratório e os resultados mostraram que a toxicidade das soluções Zn(PT)2 apenas diminuiu, mas não desapareceu após 4 h de exposição direta à luz solar (EC50 = 484 nmol L-1) ou à luz UV (EC50 = 453 nmol L-1), em comparação com as soluções de controle Zn(PT)2 preparadas em condições escuras. Com base nos dados obtidos, concluiu-se que as concentrações máximas permitidas de Zn(PT)2 com efeito tóxico nas larvas ascidian Ciona intestinalis são de 9 nmol L-1. Em relação a toxicidade, estudos com culturas em suspensão de células de peixe e ovos e embriões de ouriço-do-mar demonstraram que o Zn(PT)2 é mais tóxico que o Irgarol® 1051, Diuron® e Sea-Nine® 211. O Zn(PT)2 e Cu(PT)2 demonstraram toxicidade acima de 0,01 fg L-1 e 1 pg L-1, respectivamente (OKAMURA et al., 2002; KOBAYASHI e OKAMURA, 2002; BELLAS, GRANMO e BEIRAS, 2005). 24 O desenvolvimento de métodos analíticos para determinar as concentrações ambientais de Zn(PT)2, Cu(PT)2 e outros biocidas metálicos como o Ziram e Zineb são de grande relevância, pois o conhecimento da distribuição das espécies químicas em águas naturais sustenta a compreensão da geoquímica e da absorção de nutrientes e substâncias tóxicas pela biota. Cada vez mais se reconhece que a avaliação de riscos representados por metais traços em águas demanda conhecimento de sua especiação (ZHANG, 2004). A análise de especiação, que compreende as atividades analíticas de identificação e/ou medição das quantidades de uma ou mais espécies químicas individuais numa amostra (TEMPLETON et al., 2000) torna-se indispensável para a compreensão da disponibilidade dos metais presentes nos biocidas metálicos. Portanto, ao ser realizado o acoplamento de um cromatógrafo líquido de alta eficiência a um ICP-MS, é possível aliar o poder de separação do primeiro à elevada seletividade e sensibilidade do segundo, sendo, por isso, a técnica mais utilizada para a análise de especiação química. Dentro deste contexto, foi proposta uma investigação envolvendo a determinação de Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram utilizados nos cascos de embarcações marítimas e a labilidade dos biocidas de zinco em água estuarina. Durante o processo de investigação, foi utilizada a técnica de extração em fase sólida no desenvolvimento de uma metodologia específica para a determinação de Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram que pudesse ser utilizada posteriormente no acoplamento da cromatografia líquida com a espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado. As informações referentes a labilidade dos biocidas de zinco em solução padrão e amostra real foram obtidas por meio da técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração. 2 - HIPÓTESE E OBJETIVOS Esta pesquisa teve como principais hipóteses: i) a extração em fase sólida, em batelada, utilizando o sorbente Sepra Fenil poderia ser utilizado para a separação e pré-concentração de Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram ii) a cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas com plasma induzido seria capaz de determinar o Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram iii) a técnica de difusão em filmes finos utilizando a resina Chelex®-100 poderia ser capaz de 25 fornecer informações sobre a labilidade do Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram em água estuarina. Com base nas hipóteses, os objetivos desta pesquisa foram: i) desenvolver uma metodologia de extração em fase sólida, cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas com plasma acoplado indutivamente para determinação de Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram e ii) quantificar in lab a fração lábil total do Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram e in situ a fração lábil total do zinco utilizando a técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração em solução padrão e água estuarina. 3 - REFERENCIAL TEÓRICO 3.1 - Características Gerais do Piritionato de Zinco, Zineb e Ziram A remoção de tinta anti-incrustante por raspagem, jateamento ou manuseamento de resíduos geralmente ocorre em marinas e portos, e os resíduos finos são prontamente transportados para o meio marinho, onde se intercalam com sedimentos, criando "hotspots" de contaminação (SINGH e TURNER, 2009). O Piritionato de Zinco foi recentemente incorporado em tintas anti- incrustantes como um biocida de reforço, que é liberado lentamente na água à medida que a tinta envelhece. O Piritionato de Zinco (bis[1-hydroxi-2(1H)-piridinationato-O,S]-T-4 de zinco) (Figura 1) possui massa molar igual a 317,68 g mol-1, fórmula molecular C10H8N2O2S2Zn, solubilidade em água de 8 mg L-1 (ADVISORY COMMITTEE ON PESTICIDES, 2013), coeficiente de partição octanol/água (Log Kow) de 0,90 à 25 °C (NAR, 2001). Figura 1 – Fórmula estrutural do Piritionato de Zinco. Os complexos de piritionato são neutros, hidrofóbicos e possui alta afinidade com a matéria orgânica. A molécula de piritionato, como tal, pode ser fotolizada a 26 comprimentos de onda entre 320-355 nm (NEIHOF et al., 1979), ou degradada por oxidação química ou biológica (TURLEY et al., 2000). O íon zinco, ao qual ligantes de piritionato ligam-se, pode ser trocado por outros íons metálicos, formando outros complexos metálicos com dois ou três ligantes de piritionato (MePT2/3), ou a complexos de piritionato simples como o Piritionato de Sódio (NaPT) e o complexo de Piritionato de Cobre (CuPT+) (SUN et al., 1964 apud WOLDEGIORGIS et al., 2007). No meio marinho, a presença de outros ligantes, tanto orgânicos quanto inorgânicos, influenciará a distribuição dos complexos. A ordem de estabilidade do complexo que pode ser considerada é: Na < Fe < Mn < Zn < Cu (WOLDEGIORGIS et al., 2007). Ditiocarbamatos são fungicidas que podem ser classificados em três grupos diferentes dependendo de sua estrutura química: dimetilditiocarbamato, etilenobisditiocarbamato e propilenobisditiocarbamato. Ferbam, Tiram e Ziram são classificados como dimetilditiocarbamato, Mancozeb, Maneb, Metiram, Nabam e Zineb são etilenobisditiocarbamato e propineb pertence a propilenobisditiocarbamato (CODEX COMMITTEE ON PESTICIDE RESIDUES, 2007). O Ziram (Zinco-bis-dimetilditiocarbamato-Zn(DMDC)2) (Figura 2) é classificado como um dimetilditiocarbamato utilizado como fungicida agrícola, antioxidante na indústria de borracha e acelerador do processo de vulcanização (AGARWAL et al., 2005). Possui massa molar de 305,82 g mol-1, fórmula molecular (CH3)2NCSSZnSCSN(CH3)2, Log Kow 1,23 e solubilidade em água na faixa de 1,58 – 18,3 mg L-1 (TOMLIN, 1997 apud VAN WEZEL e VAN VLAARDINGEN, 2004). Figura 2 – Fórmula estrutural do Ziram. O Zineb (zinco-etileno-1,2-bis-ditiocarbamato- ZnEBDC) (Figura 3), também um fungicida, possui massa molar igual a 275,75 g mol-1, fórmula molecular C4H6N2S4Zn, solubilidade em água 10 mg L-1 e Log Kow de 0,8 (HELLIO e YEBRA, 2009). 27 Figura 3 – Fórmula estrutural do Zineb. Muitas determinações de ditiocarbamatos implicam na sua decomposição em dissulfeto de carbono, ou derivatização para metilditiocarbamatos seguido por titrimetria, espectrometria, cromatografia gasosa ou cromatografia líquida de alta eficiência (PALOV e RENZO, 1986 apud MORIWAKI et al., 2001). A especiação química de ditiocarbamatos é muito significante devido as diferentes toxicidades e propriedades dos compostos (FRANEKIĆ et al., 1994). 3.2 - Espectrometria de Massas Acoplada a Plasma Induzido A espectrometria de massas acoplada a plasma induzido (ICP-MS, Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) é uma técnica com elevada sensibilidade e seletividade que permite a determinação simultânea de quase todos os elementos da tabela periódica, com limites de detecção na ordem de µg L-1. Ao acoplar um cromatógrafo líquido de alta eficiência a um ICP-MS, permite-se aliar o poder de separação do primeiro à elevada seletividade e sensibilidade do segundo, sendo, por isso, a técnica mais utilizada para a análise de especiação química. A técnica ICP-MS tem como principal vantagem a possibilidade de análise multielementar (e isotópica) sequencial rápida, aliada à alta sensibilidade. Utiliza como fonte de ionização um plasma de argônio de energia alta (até 1,5 kW) e um espectrômetro de massas de alta ou baixa resolução (setores magnético e elétrico, ou quadrupolo). Cerca de 90% dos elementos da tabela periódica podem ser determinados, com limites de detecção na ordem de 0,001 a 0,1 µg L-1 (HARRIS, 2005). O princípio da técnica de ICP-MS é baseado no uso de um plasma a alta temperatura capaz de gerar íons positivamente carregados. O instrumento é composto de quatro partes principais: sistema de introdução de amostra, tocha, 28 interface e o espectrômetro de massas (JARVIS et al., 1992; HOOLER, SKOOG, CROUCH, 2009). A amostra é introduzida, na maioria dos casos, na forma líquida, bombeada até o sistema de introdução de amostras no plasma, que é composto de uma bomba peristáltica, um nebulizador pneumático e uma câmara de nebulização. Ela emerge, com auxílio da bomba peristáltica, da câmara de nebulização do nebulizador como um aerossol, e através de um tubo injetor chega à base do plasma. No plasma, a amostra é seca, vaporizada, atomizada e ionizada, sendo transformada de um aerossol líquido para partículas sólidas e então em um gás ionizado. Quando a amostra finalmente chega à zona analítica do plasma, com temperatura em torno de 6.000 K a 7.000 K, há apenas átomos e íons no estado gasoso. Há energia suficiente no plasma capaz de remover elétrons do átomo e gerar um íon. A geração, transporte e detecção de um número significante desses íons carregados positivamente, é que fornece ao ICP-MS a capacidade de detecção ultra traço (THOMAS, 2001; HARRIS, 2005). Os nebulizadores pneumáticos utilizados no ICP-MS são divididos de acordo com seu desenho geométrico: (i) desenhos concêntricos e (ii) de fluxo cruzado, isto é, ortogonais. Além do nebulizador concêntrico com e sem capilar de amostra recuado, também existem dois desenhos ortogonais, o fluxo cruzado e o nebulizador com ranhura em V (VGroove). O nebulizador VGroove é utilizado na nebulização de amostras viscosas ou amostras contendo quantidades elevadas de sólidos totais dissolvidos e até lamas (SHARP, 1988; TODOLÍ, MERMET, 2008 apud BINGS, ORLANDINI VON NIESSEN, SCHAPER, 2014). A taxa de consumo de amostras do nebulizador VGroove pode chegar até 5 mL min-1 (MONTASER, 1998). Os nebulizadores ultrassônicos (USN) são mais eficientes quando comparados com os nebulizadores pneumáticos, pois produzem um volume maior de névoa de amostra aumentando o fluxo do analito no plasma. No entanto, o fornecimento intensificado do analito ao plasma é frequentemente acompanhado por um volume adicional de solvente líquido e vapor. Mesmo nos casos em que a corrente do fluxo do USN é direcionada por meio de uma combinação aquecedor- condensador para reduzir o fluxo de solvente. Os elementos com energia de ionização maiores, como os não-metais, são mais suscetíveis a interferências e quedas de ionização causadas pelos efeitos do solvente sobre o plasma. Este 29 fenômeno é observado no caso de solventes orgânicos (KWOK, CARR, WEBSTER, CARNAHAN, 2006). A cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao ICP-MS é uma técnica poderosa para análise de especiação de elementos traços devido à sua alta seletividade e sensibilidade. Um grande número de compostos não identificados precisam ser separados e os sistemas de pares de íons ou de fase reversa são frequentemente usados para esse fim, devido à sua alta eficiência de separação. Entretanto, o ICP-MS não é muito tolerante em relação às altas concentrações de solventes orgânicos que são utilizados em cromatografia líquida de fase reversa (BENDAHL e GAMMELGAARD, 2005). A introdução de solventes orgânicos no ICP-MS pode ocasionar a supressão do sinal, pois a intensidade está diretamente relacionada com a concentração (acima de 3%) de metanol (HU et al., 2004). O sistema de dessolvatação é utilizado para remover o solvente orgânico da fase móvel e opera em duas etapas separadas (i) o aerossol é aquecido de modo a promover a evaporação do solvente, aumentando assim a eficiência do transporte, (ii) uma fração significativa do vapor do solvente gerado é removida baixando a temperatura ou usando uma membrana (MCLAREN, LAM, GUSTAVSSON, 1990; GUSTAVSSON, HIETALA, 1990; BRENNER, ZHU, ZANDER, 1996 apud SÁNCHEZ et. al, 2017). Existem vários sistemas de dessolvatação comercialmente disponíveis, entre eles o chamado APEX. O APEX é um nebulizador acoplado com um sistema de dessolvatação específico (TODOLI e MERMET, 2006). Este sistema de introdução de amostra se conecta diretamente ao injetor da tocha do ICP. Isso permite que o sistema APEX seja configurado para auto-aspiração com taxas de 20 μL min-1 a 400 μL min-1. O sistema APEX foi desenvolvido pela Elemental Scientific e possui um nebulizador de microfluxo de PFA (perfluoroalcoxi), uma câmara de nebulização ciclônica aquecida, um loop de condensador e um condensador multipasso resfrigerado por Peltier. O sistema também envolve uma porta de gás adicional, recomendada principalmente para a introdução de gás nitrogênio, para aumentar a sensibilidade e reduzir os níveis de óxido. Permite a análise de amostras corrosivas, solventes orgânicos e amostras de alto teor de sólidos dissolvidos, proporcionando um aumento substancial na sensibilidade. (ELEMENTAL SCIENTIFIC, 2014 E 2016). 30 O módulo de dessolvatação Spiro TMD (TMD, Teflon® Membrane Desolvator) é recomendado para amostras aquosas e orgânicas/hidro-orgânicas e pode ser usado com ou sem o APEX. O Spiro TMD usa uma membrana de Teflon® aquecida, para aumentar a capacidade de remover vapor de água e solvente orgânico do aerossol. (ELEMENTAL SCIENTIFIC, 2012). Baseado no fato que a fase móvel utilizada nesta pesquisa contém metanol, optou-se por testar/utilizar (i) o nebulizador ultrassonico (ii) o sistema de dessolvatação APEX acoplado ao SPIRO (iii) o nebulizador VGroove. 3.3 - Extração em Fase Sólida A extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction) é uma técnica de separação líquido-sólido que se fundamenta nos mecanismos de separação da cromatografia líquida de baixa pressão, a qual emprega uma pequena coluna aberta contendo a fase sólida denominada cartucho de extração (LANÇAS,2004). Os principais objetivos da SPE são promover a extração e, em alguns casos, a concentração dos analitos de interesse, a remoção dos interferentes e a estocagem da amostra (LANÇAS, 2004; JARDIM, 2010). Em geral, a SPE ocorre por meio de algumas etapas. Primeiramente, ativa-se o adsorvente presente no cartucho e o solvente utilizado dependerá do material a ser ativado e da matriz da amostra. Em seguida, adiciona-se a amostra, com fluxo inferior a 2 mL min-1, sendo que os analitos devem ficar retidos no adsorvente e os interferentes da matriz devem passar através do cartucho. Finalmente ocorre a eluição do(s) analito(s) utilizando um solvente orgânico com maior força de eluição. (LINGEMAN e HOEKSTRA-OUSSOREN, 1997; LANÇAS, 2004). A razão entre o volume inicial de amostra aplicado no cartucho e o volume final de solução concentrada é denominado fator de concentração. A concentração pode aumentar de um fator de 100 até 5.000, sendo uma característica vantajosa para a análise qualitativa e quantitativa a nível de traços. Os principais mecanismos de separação utilizado na SPE são a adsorção, partição (fase normal e fase reversa), troca iônica e exclusão por tamanho (JARDIM, 2010). Em cromatografia líquida e na SPE o termo fase normal é empregado para designar o modo cromatográfico em que a fase estacionária (adsorvente) é mais polar que a fase móvel. E, quando a fase estacionária é menos polar que a fase 31 móvel, o termo utilizado é fase reversa. A fase estacionária que apresentar um grupo funcional apolar (C18, C8, C2, fenil, etc.) é denominada fase reversa e a que apresentar grupo funcional polar (OH, CN, NH2, etc.) é denominada fase normal. Os grupos funcionais apolar e polar apresentam-se ligados quimicamente à sílica (LANÇAS,2004). Grunnet e Dahllöf (2005) utilizaram a técnica de SPE para pré-concentrar Zn(PT)2 e Cu(PT)2 a partir da água do mar. O cartucho utilizado foi o Strata X (6 mL, 200 mg de sorbente polimérico, fase reversa, Phenomenex) e detecção por espectrometria na região do ultravioleta visível (UV-VIS, Ultraviolet-visible Spectrophotometry) com arranjo de diodos. O cartucho foi pré-condicionado com 6 mL de solvente de eluição (mistura de acetonitrila:metanol:água deionizada – 70:20:10, v v-1), seguido de lavagem com 6 mL de água deionizada. A amostra (1 L) foi percolada através do cartucho com fluxo de 10 a 15 mL min-1 sob vácuo. Para remover os compostos de sais retidos, o cartucho foi lavado com 6 mL de água deionizada e deixado secar sob vácuo durante 1 a 2 min. Finalmente, os compostos foram eluídos cinco vezes com 1 mL de solvente de eluição cada vez, evaporados num banho de água quente sob uma corrente de N2 suave até aproximadamente 1 mL e analisados por cromatografia líquida de alta eficiência. No desenvolvimento de um método para determinar Zn(PT)2 em amostras de água de rio, Bones e colaboradores (2006) utilizaram coluna de sílica monolítica Onyx C18 (10 mm x 4,6 mm, Phenomenex) de fase reversa para a SPE on-line de 200 mL da amostra. A remoção da interferência da matriz ocorreu pela incorporação de uma coluna de aço inoxidável (33,0 mm x 4,6 mm) empacotada com sílica de troca aniônica Vydac 301SC antes da coluna Onyx C18. A coluna cromatográfica Vydac 301SC foi condicionada com 0,2 mol L-1 de acetato de amônio e água antes do uso. A análise das amostras foi realizada por cromatografia líquida com fonte de ionização química à pressão atmosférica acoplada a espectrometria de massas (LC- APCI-MS, Liquid Chromatography/Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry). Bajia e Ohja (2013) utilizaram um cartucho de C18 para pré-concentrar complexos metálicos de ditiocarbamatos após o processo de síntese. O cartucho C18 foi condicionado com metanol e eluído com acetonitrila. O instrumento utilizado foi o HPLC acoplado ao ICP-MS. No ICP-MS, a câmara de nebulização foi refrigerada para reduzir a carga do solvente no plasma. Após a eluição da coluna, as amostras 32 passavam pelo detector de UV e depois para o ICP-MS. Foram obtidos resultados separados de UV e ICP-MS para cada amostra. Segundo os autores, essa configuração experimental contribuiu para a identificação e determinação do pico cromatográfico. 3.4 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 3.4.1 - Fundamentação A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o termo usado em português para denominar a tradução da sigla HPLC, High Performance Liquid Chromatography (LANÇAS, 2009). A cromatografia é um processo pelo qual os componentes de uma mistura podem ser separados e baseia-se no equilíbrio de concentração dos componentes de interesse entre duas fases imiscíveis. Uma é chamada de fase estacionária (FE), porque é imobilizada dentro de uma coluna (cilindro rígido de aço ou vidro) ou fixado sobre um suporte, enquanto a segunda, chamada fase móvel (FM), se move através da primeira. As fases são escolhidas de modo que os componentes da amostra tenham solubilidades diferentes em cada fase (ROUESSAC e ROUESSAC, 2007). Os parâmetros cromatográficos (tempo de retenção, fator de retenção, fator de separação, número de pratos teóricos e resolução) são importantes para serem utilizados na identificação dos compostos separados, avaliar o desempenho da coluna cromatográfica e auxiliar na otimização do processo de separação (CHUST, 1990; CIOLA, 2003; COLLINS, BRAGA e BONATO, 2004; LANÇAS, 2004). O tempo de retenção (tr) é o tempo decorrido do instante em que a amostra é injetada até o instante máximo do pico (CHUST, 1990). O tempo morto (t0) é a medida da retenção de um soluto que não interage com a coluna cromatográfica, ou seja, é o tempo do sistema desde o injetor até o detector (COLLINS, BRAGA e BONATO, 2004). Logo, a parte do tempo em que as moléculas da amostra ficam retidas na fase estacionária (t’r – tempo de retenção efetivo) é obtida pela equação: t’r = tr – t0 (Equação 1) 33 A eficiência da coluna cromatográfica é estabelecida pelo número de pratos teóricos (N) calculados. Quanto maior o N, maior será a eficiência da coluna cromatográfica indicando melhor separação. Define-se N como um equilíbrio de distribuição do soluto entre as duas fases (móvel e estacionária); quanto maior o N, mais equilíbrios existirão e a separação será potencializada. O N é calculado a partir do cromatograma de acordo com a equação abaixo, onde tr é o tempo de retenção e Wb a largura da base do pico cromatográfico (LANÇAS, 2009): N = 16 (tr/Wb)2 (Equação 2) Se o pico cromatográfico obtido for mal resolvido (não houver boa separação) ou a linha de base variar severamente, pode-se calcular N a partir da largura da base do pico cromatográfico na meia-altura W0,5 de acordo com (LANÇAS, 2009): N = 5,545 (tr/W0,5)2 (Equação 3) O número de pratos teóricos efetivos (Nef) é calculado substituindo-se tr por t’r como mostra as Equações 4 e 5 (LANÇAS, 2009): Nef = 16 (t’r/W0,5)2 (Equação 4) Nef = 5,545 (t’r/W0,5)2 (Equação 5) A medida quantitativa da separação cromatográfica entre dois picos é definida por meio da resolução (Rs), sendo influenciada por dois fatores: a largura da base (Wb) e a variação entre os tempos de retenção (Δt’r). A Equação 6 demonstra a equação da resolução: Rs = Δt’r / ½ (wb1 + wb2) (Equação 6) 3.4.2 - Aplicação Os efeitos ambientais e toxicológicos de um elemento dependem da forma ou espécie do elemento presente na amostra original. A determinação do teor total de elementos pela maioria dos detectores espectroscópicos não fornece esta 34 informação crucial. No entanto, a cromatografia acoplada aos detectores específicos de elementos pode fornecer análise de especiação envolvendo identificação e determinação das formas físico-químicas individuais de um elemento presente na amostra de interesse (LIN et al., 2016). A piritiona (2-piridinatiol-1-óxido) pode ser quantificada como o complexo de zinco (II) [Zn(PT)2] por meio de cromatografia em camada delgada (TLC, Thin-Layer Chromatography). Quantidades em micrograma de Zn(PT)2 ou [14C]Zn(PT)2 foram separadas de impurezas em placas (20 x 20 cm) de sílica gel (250 µm) GF (Analtech, EUA) por adição de uma mistura de clorofórmio:metanol (98:2, v v-1). O sulfato ferroso foi utilizado como um reagente para visualizar a mancha que por sua vez foi quantificada por espectrodensitometria a 535 nm. (SEYMOUR e BAILEY, 1981). Gustafsson e Fahlgren (1983) determinaram Tiram, Ziram e Zineb por cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultravioleta (HPLC-UV, High Performance Liquid Chromatography - Ultraviolet Detector) após duas técnicas de extração separadas. No cromatógrafo líquido foi usado uma coluna de aço inox (200 mm x 4 mm) e pré-coluna (50 mm x 4 mm). Ambas as colunas foram empacotadas com Nucleosil RP-18 (5 µm). A fase móvel utilizada foi água:acetonitrila (60:40, v v-1) com fluxo de 1,2 mL min-1 (fase reversa). A detecção foi realizada a 272 nm com um detector ultravioleta de comprimento de onda variável. O Tiram foi extraído com clorofórmio e o extrato foi injetado diretamente no HPLC. Ziram e Zineb foram extraídos a partir da superfície de maçãs, peras, batatas, tomates, morangos e alface com solução aquosa alcalina de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA, ethylenediamine tetraacetic acid) e cisteína, subsequentemente os ânions foram extraídos em um solvente orgânico como par iônico com hidrogenossulfato de tetrabutilamônio e derivatizado com iodometano em uma etapa. O tempo de retenção para o Ziram foi 7 min e 11 min para o Zineb com recuperação de 73,3 ± 2,9% (n=3) para Zineb e 91,2 ± 0,3% (n=3) para o Ziram na amostra fortificada com 0,5 mg L-1. Para determinar o Piritionato de Zinco em produtos cosméticos comerciais, o Zn(PT)2 foi pré-marcado com N-dansilaziridina e determinado por HPLC. Foram utilizadas a coluna cromatográfica de fase reversa Develosil C8-3 (150 mm x 4,6 mm, 3 µm, Nomura Chemical) a 40 °C e a fase móvel composta por solvente A (0,1 mol L-1 de perclorato de sódio em acetonitrila:água (45:55, v v-1)) e solvente B 35 (acetonitrila) no modo gradiente. O efluente da coluna foi monitorado com excitação a 333 nm e emissão a 540 nm no detector de fluorescência. O gráfico de calibração para o Zn(PT)2 foi linear na faixa de 1,6 – 66 ng e o coeficiente de variação (n = 5) foi 0,9% para 17 ng de Zn(PT)2. Os valores de recuperação obtidos para Zn(PT)2 nos produtos cosméticos comerciais variaram entre 99,1% e 100,5% (KONDOH e TAKANO, 1987). Nakajima, Yasuda e Nakazawa (1990) desenvolveram um procedimento simples e rápido para a determinação de Zn(PT)2 em xampu anticaspa por HPLC. O Zn(PT)2 das amostras foi convertido no complexo de cobre (II) estável pela adição de solução de sulfato cúprico seguida de extração com clorofórmio. A HPLC foi realizada numa coluna Nucleosil 5C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm) utilizando metanol:água (60:40, v v-1) como fase móvel e detecção ultravioleta (320 nm). O tempo de retenção obtido foi de 15 min e o gráfico de calibração foi linear entre 0,1 - 0,5 µg para Zn(PT)2. As recuperações de quatro amostras de xampus foram de 98,0% a 100,6% com alta precisão. Lo, Ho e Hung (1996) utilizaram métodos de HPLC e espectrometria de absorção atômica (AAS) para distinguir os fungicidas Propineb, Zineb, Maneb e Mancozeb. HPLC-UV a 272 nm foi empregada para analisar os derivados metil do Zineb e Propineb e suas formulações. As separações foram realizadas utilizando-se uma coluna analítica Lichrospher 60 RP-select B (125 mm x 4 mm, 5 µm, Merck) e uma pré-coluna com empacotamento similar (4 mm x 4 mm) na temperatura ambiente. A fase móvel utilizada foi água:acetonitrila (60:40, v v-1) com vazão de 1 mL min-1 e o tempo de retenção do Zineb obtido foi 6,03 min. Um método simples e seletivo de HPLC foi utilizado para análise de fungicidas ditiocarbamatos e xantogenatos (ditiocarbonatos) em águas naturais utilizando detecção por arranjo de diodos (DAD, Diode Array Detector) com alcance de 200-355 nm. O procedimento baseia-se na formação de um complexo ditioligante-Cu (II) 1:1 e sua separação como um par iônico com hexanosulfonato na coluna de fase reversa Altima C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) e fase móvel composta por solução tampão:metanol (70:30, v v-1). A solução tampão consistiu de 2 a 3 mmol L-1 de acetato de sódio (pH entre 4 e 5), 100-200 µmol L-1 de sulfato de cobre e 2 a 4 mmol L-1 de sal de sódio do ácido 1-hexanossulfônico (HSA, 1- Hexanesulfonic acid sodium salt - reagente de par iônico). Os compostos foram detectados no comprimento de onda de máxima absorção (260-287 nm) do 36 complexo ligante-Cu (II). Os valores de limite de detecção do método foram 20 nmol L-1 para dimetilditiocarbamato (3 µg L-1 para Ziram), 33 nmol L-1 para etilenobisditiocarbamato (9 µg L-1 para Maneb) (WEISSMAHR, HOUGHTON e SEDLAK, 1998). Para determinar Zn(PT)2 em amostras aquosas, Thomas (1999) desenvolveu um método que utiliza a transquelação do Zn(PT)2 no complexo estável de Cu(II) antes da análise por LC-APCI-MS. A fase móvel (modo gradiente) utilizada foi metanol e água. A porcentagem de metanol variou de 50% para 100% em 10 min, permanecendo em metanol (100%) durante 5 min. A coluna analítica empregada foi PEEK (150 mm x 4, 6 mm, 5 µm). O Zn(PT)2 foi extraído como piritionato de cobre utilizando diclorometano com recuperação adequada (77 ± 17%, n=6) a partir de 2 litros de amostras de água do mar. O limite de detecção obtido foi 20 ng L-1, utilizando monitoramento de íons selecionados. Moriwaki, Yamaguchi e Fukushima (2001) desenvolveram uma metodologia para detecção de Ziram por LC-APCI-MS. A utilização de uma coluna C18 para a separação por HPLC mostrou que o Ziram não foi retido. Contudo, utilizando uma coluna de permeação em gel (GPC, Gel Permeation Column) TSK-GEL-2500 (150 mm x 2 mm) e metanol (100%, v v-1) como fase móvel, o padrão de Ziram apresentou um tempo de retenção de 5 min. Um gráfico de calibração foi construído com quatro soluções padrão com valores de concentração entre 2 e 20 µg mL-1 e observou-se boa linearidade (R2 > 0,99). Os autores concluíram que para aplicar o método à análise ambiental, seria necessário melhorar a sensibilidade do método e a separação das colunas para evitar a interferência das matrizes ambientais. Além disso, deve ser estabelecida uma técnica para a extração de Ziram de água. Os autores sugeriram que a seletividade e possivelmente a sensibilidade seriam melhoradas utilizando a espectrometria de massas sequencial. Doose e colaboradores (2004) investigaram o comportamento cromatográfico dos complexos metálicos Piritionato de Zinco [Zn(PT)2], Piritionato de Ferro [Fe(PT)3] e cobre [Cu(PT)2] pelo uso combinado da espectrometria na região do ultravioleta visível (UV-VIS), espectrometria de massas com ionização por eletrospray (ESI-MS, Electrospray Ionisation Mass Spectrometry), cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por arranjo de diodos (HPLC-DAD, High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detection) e cromatografia líquida de alta eficiência com espectrometria de massas com ionização por eletrospray (HPLC-ESI-MS, High 37 Performnce Liquid Chromatography with Electrospray Ionisation Mass Spectrometry). As colunas cromatográficas utilizadas foram LiChrosorb® RP-18 (250 mm x 4,6 mm, Merck), Chromolith Performance® RP-18e (100 mm x 4,6 mm, Merck), Chromolith SpeedROD® RP-18e (50 mm x 4,6 mm, Merck), Nucleosil® 100-5 C18 HD (125 mm x 2 mm, Agilent), EcoCART LiChrospher® RP-select B (125 mm x 3 mm, Merck), Polyspher® RP-18 (150 mm x 4,6 mm, Merck), Purospher STAR® RP- 18e (250 mm x 2 mm, Merck), Kromasil® RP-18 (250 mm x 4,6mm, EKA Chemicals) e MetaSil Basic® RP-8 (250 mm x 4,6 mm, Varian). A fase móvel (modo isocrático) foi composta por metanol:água (30:70, v v-1) contendo 0,175% (v v-1) de ácido fórmico na porção aquosa e vazão de 1 mL min-1. O Zn(PT)2 e Fe(PT)3 não foram identificados por meio de HPLC-DAD e HPLC-ESI-MS com qualquer coluna empregada. A análise de piritionato por HPLC é possível, desde que a fase estacionária seja livre de metal. Além disso, a tendência de oxidação da piritiona requer que o potencial de oxidação-redução (Eh) da fase estacionária seja menor que o Eh do analito. O material utilizado para colunas Chromolith® parece adequado para evitar a oxidação, bem como trans-metalização. No entanto, a fim de obter tempos de retenção adequados a coluna deve ser mais polar e menos hidrofóbica. As fases estacionárias com derivados fenílicos também podem ser apropriadas para a análise de piritiona. Agarwal, Aggarwal e Singh (2005) desenvolveram um método para extrair e quantificar resíduos de Ziram e Zineb em amostras de água de neblina. O método baseia-se na liberação de uma quantidade equivalente de zinco dos fungicidas e sua subsequente determinação por espectrofotometria visível ou por espectroscopia de absorção atômica com chama (Flame-AAS, Flame Atomic Absorption Spectroscopy). Para a espectrofotometria, a amostra composta por até 48 μg de Ziram e 42 μg de Zineb foi extraída primeiro com clorofórmio. Os resultados da recuperação mostraram que apenas o teor de Ziram foi extraído com o clorofórmio. Em seguida, tratou-se a amostra com tiocianato de amônio e tensoativos (cloreto de cetilpiridínio- CPC e polioxietileno(9,5)-4-terc-octilfenol-TX-100) e extraiu-se com tolueno para remover a interferência de zinco inorgânico e outros íons metálicos (caso estivessem presentes na amostra). O resíduo foi ainda utilizado para a determinação de Zineb. O extrato de clorofórmio e o resíduo foram então digeridos separadamente com ácido nítrico para liberar Zn (II), e foram então analisados espectrofotometricamente com 4-(2-piridilazo)-resorcinol no meio micelar (TX-100) para a determinação de 38 Ziram e Zineb, respectivamente. O complexo mostra comprimento de onda máximo a 495 nm e a absortividade molar em termos de Ziram/Zineb foi determinada como sendo 8,05 x 104 L mol-1 cm-1. Os limites de detecção para Ziram e Zineb obtidos foram 20 e 21 µg L-1, respectivamente. O Zn presente no extrato de clorofórmio e no resíduo foram diretamente analisados utilizando espectrometria de absorção atômica com chama sem passar pelo processo de digestão, e Ziram e Zineb foram determinados, respectivamente. Os intervalos de concentração ótimos foram de 0,9 - 4,8 mg L-1 e 0,8 - 4,3 mg L-1, enquanto que os limites de detecção foram 145 e 144 µg L-1. O estudo do destino ambiental do composto anti-incrustante Zn(PT)2 na água do mar foi realizado com determinação simultânea de Zn(PT)2 e Cu(PT)2 utilizando uma pré-coluna C18 (4 mm x 3,0 mm, Phenomenex), uma coluna analítica Jupiter C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm, Phenomenex) e um detector de arranjo de diodos. As separações cromatográficas foram realizadas utilizando a fase móvel composta por solvente A: 0,4% (m v-1) Zn(NO3)2 (nitrato de zinco) em metanol:água (20:80, v v-1) e solvente B: 0,4% (m v-1) de Zn(NO3)2 em metanol:água (77:23, v v-1) no modo gradiente. O Zn(PT)2 foi detectado a 270 nm, o Cu(PT)2 a 320 nm, e o padrão interno xileno cianol a 616 nm. O limite de detecção do método analítico foi de 2 µmol L-1 e 1 µmol L-1 para Zn(PT)2 e Cu(PT)2, respectivamente (GRUNNET e DAHLLÖF, 2005). Um método foi desenvolvido para a determinação de Zn(PT)2 em amostras de água de rio usando colunas de sílica monolíticas em fase reversa para SPE on-line de grande volume de amostra em conjunto com remoção da matriz on-line utilizando uma coluna de troca aniônica forte por LC-APCI-MS. As separações foram realizadas em fase reversa no modo gradiente utilizando-se a coluna de sílica monolítica Chromolith Performance RP-18e (100 mm x 4,6 mm) e como fase móvel metanol de 30% a 90% (v v-1) e solução tampão de acetato de amônio 10 mmol L-1. Os valores de limite de detecção e de quantificação em amostras de água de rio fortificadas, usando um volume de 200 mL de amostra, foram 18 ng L-1 e 62 ng L-1, respectivamente. A porcentagem de recuperação média obtida com água de rio fortificada a 1 µg L-1 foi de 72 ± 9% (n = 3 extrações). A precisão do método de 27%, expressa como desvio padrão relativo (RSD, Relative Standard Desviation) foi obtida após 10 repetições de análises completas. A linearidade foi determinada na faixa de concentração de 0,25 - 10 µg L-1 com R2 = 0,9802. O método foi utilizado para 39 investigar o destino ambiental do Zn(PT)2 em águas e seu coeficiente de partição entre as fases de sedimento e água (BONES, THOMAS e PAULL, 2006). Um procedimento analítico foi desenvolvido por HPLC acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS, Liquid Chromatography Tandem- Mass Spectrometry) para a determinação simultânea de biocidas de reforço (Sea- Nine® 211, Diclofluanida, Diuron®, Irgarol® 1051 e Piritionatos) e produto de degradação de Irgarol 1051 (M1) em sedimento do Vietnã. A separação cromatográfica dos biocidas de reforço foi realizada utilizando-se uma coluna de sílica C30 (50 mm x 2.1 mm, 5 µm) e fase móvel contendo metanol e água no modo gradiente. A porcentagem de metanol variou de 50% para 100% em 20 min, permanecendo em metanol (100%) durante 10 min. Os valores de limite de detecção, recuperação e de RSD dos biocidas de reforço, obtidos no sedimento seco, foram entre 0,04 - 2 µg kg-1, 71 - 108% e 1,5 - 12%, respectivamente. Um método analítico para a determinação simultânea de três biocidas de reforço (Sea- Nine 211, Diuron e Irgarol 1051) e M1 em moluscos também foi desenvolvido por LC-MS/MS. Os valores de recuperação e de RSD obtidos para os biocidas de reforço nas amostras biológicas foram de 60 - 99% e 3,4 - 6,8% (HARINO et al., 2006). A Tabela 1 apresenta um resumo das condições analíticas para a análise de biocidas metálicos. 40 Tabela 1 - Condições analíticas de métodos para análise de biocidas. Analito Técnica Cromatográficaa Detecçãob Coluna/Fase Estacionária Fase Móvel Referência Zn(PT)2 TLCa Espectroden- sitometriab placas (20 x 20 cm) de sílica gel (250 µm) GF clorofórmio:metanol (98:2, v v-1) SEYMOUR e BAILEY, 1981 Tiram, Ziram e Zineb HPLCa UVb Nucleosil RP-18 (200 mm x 4 mm, 5 µm) água:acetonitrila (60:40, v v-1) (modo isocrático) GUSTAFSSON e FAHLGREN, 1983 Zn(PT)2 HPLCa Fluorescênciab Develosil C8-3 (150 mm x 4,6 mm, 3 µm) Solvente A: 0,1 mol L-1 de perclorato de sódio em acetonitrila:água (45:55, v v-1) Solvente B: acetonitrila (100%, v v-1) (modo gradiente) KONDOH e TAKANO, 1987 Zn(PT)2 HPLCa UVb Nucleosil 5C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm) metanol:água (60:40, v v-1) (modo isocrático) NAKAJIMA, YASUDA e NAKAZAWA (1990) Propineb, Zineb, Maneb e Mancozeb HPLCa AASb Lichrospher 60 RP-select B (125 mm x 4 mm, 5 µm) água:acetonitrila (60:40, v v-1) (modo isocrático) LO, HO e HUNG (1996) Ziram Maneb HPLCa DADb Altima C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) solução tampão:metanol (70:30, v v-1) (modo isocrático) WEISSMAHR, HOUGHTON e SEDLAK, 1998 40 41 Analito Técnica Cromatográficaa Detecçãob Coluna/Fase Estacionária Fase Móvel Referência Zn(PT)2 LCa APCI-MSb PEEK (150 mm x 4,6 mm, 5 µm) Solvente A: metanol:água (50:50, v v-1) Solvente B: metanol (100%, v v-1) (modo gradiente) THOMAS (1999) Ziram LCa APCI-MSb C18 e TSK-GEL-2500 GPC (150 mm x 2 mm) metanol (100%, v v-1) (modo isocrático) MORIWAKI, YAMAGUCHI e FUKUSHIMA (2001) Zn(PT)2 Fe(PT)3 Cu(PT)2 HPLCa UV-VISb ESI-MSb DADb LiChrosorb® RP-18 (250 mm x 4,6 mm), Chromolith Performance® RP-18e (100 mm x 4,6 mm), Chromolith SpeedROD® RP-18e (50 mm x 4,6 mm), Nucleosil® 100-5 C18 HD (125 mm x 2 mm), EcoCART LiChrospher® RP-select B (125 mm x 3 mm), Polyspher® RP-18 (150 mm x 4,6 mm), Purospher STAR® RP- 18e (250 mm x 2 mm), Kromasil® RP-18 (250 mm x 4,6mm) e MetaSil Basic® RP-8 (250 mm x 4,6 mm) metanol:água (30: 70, v v-1) contendo 0,175% (v v-1) de ácido fórmico na porção aquosa (modo isocrático) DOOSE et al., (2004) Ziram Zineb Espectrofotometria visível e Flame-AAS Extração com clorofórmio AGARWAL, AGGARWAL e SINGH (2005) 41 42 Analito Técnica Cromatográficaa Detecçãob Coluna/Fase Estacionária Fase Móvel Referência Zn(PT)2 Cu(PT)2 HPLCa UV-VISb Jupiter C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) Solvente A: 0,4% (m v-1) Zn(NO3)2 em GRUNNET e DAHLLÖF, 2005 metanol:água (20:80, v v-1) Solvente B: 0,4% (m v-1) Zn(NO3)2 em metanol:água (77:23, v v-1) (modo gradiente) Zn(PT)2 LCa APCI-MSb Chromolith Performance RP-18e (100 mm x 4,6 mm) metanol de 30% a 90% (v v-1) e solução tampão de acetato de amônio 10 mmol L-1 (modo gradiente) BONES, THOMAS e PAULL, 2006 Sea-Nine® 211, Diclofluanida, Diuron®, Irgarol® 1051 e Piritionatos) e produto de degradação de Irgarol 1051 (M1) LCa MS/MSb Sílica C30 (50 mm x 2.1 mm, 5 µm) metanol e água (modo gradiente) HARINO et al., 2006 42 43 3.5 - Técnica de Difusão em Filmes Finos por Gradiente de Concentração A técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT, Technique of Diffusive Gradientes in Thin Films) está fundamentada na 1ª Lei de Fick e foi desenvolvida por Davison e Zhang (1994). Um fluxo de íons metálicos difunde da solução para o gel de ligação (agente ligante) através de uma camada de gel de agarose ou poliacrilamida (agente difusivo) formando um gradiente de concentração (Figura 4). Figura 4 - Gradiente de concentração de íons pela técnica DGT (Adaptado de ZHANG e DAVISON, 1995). O fluxo (F, em mol cm-2 s-1) de íons metálicos através do gel pode ser determinado de acordo com: F = D C ∆g-1 (Equação 7) onde, D = coeficiente de difusão do íon no interior do gel (cm2 s-1); C = concentração (mol cm-3); ∆g = espessura do gel por onde há difusão do íon (cm). Por outro lado, o fluxo (F, em ng cm-2 s-1) em relação à massa (m, em ng) de íons metálicos que atravessam a área (A = 3,14 cm2) do gel durante um intervalo de tempo (t, em segundos), é definido por: F = m (A t)-1 (Equação 8) 44 Assim, a concentração do analito na solução da amostra pode ser determinada por meio da combinação das Equações 7 e 8. Cs= m ∆g (D t A)-1 (Equação 9) A massa do íon metálico que difunde através da camada do gel pode ser obtida pela medida direta da concentração desse íon retido na camada do gel de ligação (Ce, concentração do eluído - ng cm-3). Para tal considera-se o volume de ácido (Vác, em cm3) usado para remover o íon do gel, o volume do gel (Vgel - em cm3) que contém a resina e o fator de eluição (fe) refere-se à fração do metal ligado na resina que foi removida para a solução através do ácido. m = Ce (Vác+ Vgel) fe-1 (Equação 10) Inserindo-se na Equação 8 o valor da massa do íon retido pelo agente ligante determinado pela Equação 9, obtém-se a concentração da solução (Cs, em ng cm-3) referente aos íons cineticamente lábeis existentes na amostra. O coeficiente de difusão é determinado expressando a Equação 9 da seguinte maneira: D = m ∆g (Cs t A)-1 (Equação 11) Para remover os íons metálicos da resina, adiciona-se um volume de ácido em um tubo contendo a resina sob agitação constante por 24 h. Em seguida, a concentração do íon é determinada por uma técnica analítica apropriada (COLAÇO, 2012). Segundo Zhang e Davison (1995), sabendo-se o valor da massa do analito nas soluções do eluído e de imersão, calcula-se o fe conforme a Equação 12: fe = Me Mr -1 (Equação 12) onde, 45 Me = massa eluída (em ng), refere-se ao analito removido do agente ligante ou do gel difusivo pelo procedimento de eluição. Mr = massa retida (em ng), refere-se à diferença entre a massa do analito antes e depois da imersão do agente ligante ou do gel difusivo. Os dispositivos DGT são facilmente utilizados in situ em ambientes de água doce (rios e lagos), estuários e em águas salgadas (marinhas rasas e profundas). Ao ficarem imersos em sistemas aquáticos, os dispositivos DGT determinam as espécies lábeis presentes na solução (ZHANG e DAVISON, 1995). A análise da fração lábil dos metais é um aspecto importante em avaliações ambientais e no controle e atenuação de contaminações, já que estas espécies podem estar vinculadas com a fração biodisponível (ZHANG e DAVISON, 1995). Garmo e colaboradores (2003) avaliaram a resina Chelex® 100 como agente ligante da técnica DGT para 55 elementos. A eficiência de eluição do Zn obtida com 10 mL de HNO3 1 mol L-1 foi de 96,3% (RSD = 1,6%) e foi superior a obtida por Zhang e Davison (1995) com 1 mL de HNO3 1 mol L-1 (80,3% e RSD = 5,5%). A técnica DGT foi utilizada para a determinação das concentrações lábeis de Zn, Cu, Ni e Pb em resposta as atividades de barco na região sul da Baía Moreton e Gold Coast Broadwater em Queesland na Austrália. As concentrações obtidas pela DGT-Chelex para Zn variaram de 3,3 ± 0,4 µg L-1 até 38,4 ± 31,3 µg L-1 (WARNKEN et al., 2004). Conforme o Manual de Instruções das resinas Chelex® 100 e Chelex 20 (BIO- RAD, 1993), essas resinas são copolímeros de estireno-divinilbenzeno contendo íons iminodiacetatos emparelhados que atuam como grupos quelantes na ligação de íons metálicos polivalentes. A resina quelante de Chelex® 100 é classificada como uma resina de troca catiônica fracamente ácida em virtude dos seus grupos ácido carboxílico, mas difere dos trocadores comuns devido à sua elevada seletividade para íons metálicos e a sua maior força de ligação. O fator de seletividade refere-se a medida da afinidade de um material por um íon particular relacionado com a afinidade de um íon de referência. 46 4 - MATERIAIS E REAGENTES Todos os materiais, reagentes, equipamentos e acessórios para o desenvolvimento desta pesquisa estavam disponíveis nos laboratórios do Centro de Estudos Ambientais da UNESP (Rio Claro/SP). 4.1 - Equipamentos e Acessórios Segue a lista dos equipamentos e acessórios utilizados:  Agitador magnético (Fisatom - modelo 752, Brasil);  Agitador orbital (Hoeter Pharmacia Biotech - modelo PR70, EUA);  Balança analítica (Gehaka, Brasil);  Bomba cromatográfica (Gilson - modelo 321 pump, França);  Bomba cromatográfica SpectraSYSTEMTM (Thermo Electron, EUA);  Coluna cromatográfica Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm, Phenomenex, EUA);  Coluna cromatográfica Luna Fenil (150 mm x 4,6 mm, 5 µm Phenomenex, EUA);  Compressor Aspirador (modelo 089-CAL, FANEM, Brasil);  Cuba de ultrassom (Cristófoli, Brasil);  Dispositivos DGT (pistão - 2,5 cm de diâmetro e tampa com janela de 2 cm) (DGT Research Limited, Reino Unido);  Espectrômetro de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (modelo iCAP 6000 Series, Thermo Scientific, Alemanha);  Espectrômetro de massas com plasma indutivamente acoplado (modelo XSeries 2, Thermo Scientific, Alemanha);  Estufa de temperatura controlada (Tecnal - modelo Te-390, Brasil);  Capela de fluxo laminar (Marconi, Brasil);  Destilador de ácido (distillacid system, Berghof, Alemanha);  Filtro de nylon de 0,22 µm (disco) (Allcrom, Brasil);  Filtro de seringa Chromafil® Xtra CA-45/25 (Marcherey-Nagel, Alemanha);  Galão plástico de 25 L;  Geladeira (Eletrolux, Brasil); 47  Loop de injeção de 200 µL em aço inox (Rheodyne, Canadá);  Loop de injeção de 50 µL em aço inox (Rheodyne, Canadá);  Medidor de pH e condutividade (Jenway - modelo 430, Starffordshire, Reino Unido);  Nebulizador Apex PFA ST-2723 (nebulizador microconcêntrico de teflon, Elemental, EUA);  Nebulizador Mira Mist® (Burgener Research Inc., Canadá);  Nebulizador VGroove (Glass Expansion, Australia);  Nebulizador ultrassônico (modelo UAT6000+, CETAC, EUA);  Papel filtro quantitativo C42 faixa azul, diâmetro de 12,5 cm (Unifil, Alemanha);  Pipeta Finnpipette (modelo 4500, Thermo Fisher, Canadá);  Pipeta PIPETMAN Classic® (Gilson, EUA);  Seringa de vidro de 500 µL (Hamilton CO., EUA);  Sistema de dessolvatação SPIRO (Elemental, EUA);  Sistema de nebulização APEX Q (Elemental, EUA);  Sistema de purificação de água (modelo Direct - Q® 5 UV, Millipore, EUA);  Termômetro;  Válvula de injeção para HPLC (modelo 7120, Rheodyne, Canadá);  Vidrarias. 4.2 - Reagentes, Padrões, Soluções e Solventes Em todos os experimentos realizados os reagentes utilizados foram de grau analítico:  Acetato de amônio (CAS 631-61-8, LABSYNTH, Brasil);  Acetonitrila UHPLC (CAS 75-05-8, Panreac, Espanha);  Ácido nítrico (CAS 7697-37-2, Merck, Alemanha);  Dimetilsulfóxido (CAS 67-68-5, LABSYNTH, Brasil);  Hidróxido de sódio (CAS 1310-73-2, Merck, Alemanha);  Membrana filtro nitrato de celulose - discos de 2,5 cm de diâmetro, porosidade de 0,45 μm e espessura entre 115 μm e 145 μm (Sartorius Stedim Biotech Ltda, Brasil); 48  Metanol UV-IR-HPLC (CAS 67-56-1, Panreac, Espanha);  Nitrato de sódio (CAS 7631-99-4, LABSYNTH, Brasil);  Piritionato de zinco ≥ 95% (CAS 13463-41-7, Sigma-Aldrich, Brasil);  Resina Chelex® 100 - forma sódio, 200 - 400 mesh (CAS 68954-42-7, Bio- Rad, Canadá);  Solução padrão monoelementar de Zinco 1.000 ± 3 mg L-1 (SpecSol, Brasil);  Solução tune A 10 mg L-1 (Inorganic Ventures, EUA);  Sorbente Sepra Fenil (50 µm, 65 Å, Phenomenex, EUA);  Zineb Pestanal® 97% (CAS 12122-67-7, Sigma-Aldrich, Brasil);  Ziram Pestanal® 97% (CAS 137-30-4, Sigma-Aldrich, Brasil). A água usada no preparo das soluções foi purificada em sistema purificador modelo Direct - Q® 5 UV (Millipore, EUA) com resistividade 18,2 MΩ.cm-1 e o ácido nítrico (HNO3) foi purificado por destilação “subboiling”. As soluções estoque de 200 mg L-1 dos biocidas metálicos foram preparadas por dissolução de 0,0102 g de Zn(PT)2, 0,0091 g de Zineb e 0,0095 g de Ziram em 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). As soluções foram armazenadas na geladeira a 4 °C e no escuro. As soluções estoque foram preparadas a cada mês. A solução tune A 10 µg L-1, utilizada na otimização do ICP-MS, foi preparada pela diluição de 0,5 mL de uma solução contendo os elementos Ba, Be, Bi, Ce, Co, In, Li, Ni, Pb e U 10 mg L-1 e 10 mL de HNO3 (subboiling) em 500 mL de água ultrapura. A solução do padrão interno 100 µg L-1, utilizada no ICP-MS, foi preparada pela diluição de 5 mL de uma solução contendo os elementos Bi, Ho, In, 6Li, Sc, Tb e Y 10 µg mL-1 e 10 mL de HNO3 concentrado (subboiling) em 500 mL de água ultrapura. 5 - MÉTODOS Os recipientes (plástico e vidro) e os dispositivos DGT (tampa e pistão) foram deixados em contato com solução de HNO3 3,2 mol L-1 por, no mínimo, 4 h, lavando- os sete vezes com água deionizada e três vezes com água ultrapura e secos em capela de fluxo laminar. As soluções utilizadas neste estudo foram armazenadas em 49 recipientes que passaram pelo processo de descontaminação, garantindo assim, a ausência de metais. 5.1 - Local de amostragem O Estuário de Santos tem um forte impacto de efluentes industriais e domésticos e intensa atividade de navios no Porto de Santos/SP (CHATARINHO et al., 2015). De acordo com o documento “Mensário Estatístico do Porto de Santos” publicado mensalmente pela Companhia Docas do Est