UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE QUÍMICA MÁRCIA DIANA UMEBAYASHI ZANOTI Membranas de Celulose Bacteriana com anti-inflamatório Ibuprofeno para o tratamento de feridas crônicas ARARAQUARA 2017 MÁRCIA DIANA UMEBAYASHI ZANOTI Membranas de Celulose Bacteriana com anti-inflamatório Ibuprofeno para o tratamento de feridas crônicas Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos, para o título de Doutor em Biotecnologia. Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria Minarelli Gaspar Co-orientadores: Prof. Dr. Sidney J. L. Ribeiro Profa. Dra. Helena M. Sonobe Araraquara 2017 DADOS CURRICULARES 1. DADOS PESSOAIS Márcia Diana Umebayashi Zanoti ZANOTI, M. D. U 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2013 - atual Doutorado em Biotecnologia Universidade Estadual Paulista - UNESP Título: Membranas de Celulose Bacteriana com anti-inflamatório Ibuprofeno para o tratamento de feridas crônicas Orientadora: Dra. Ana Maria Minarelli Gaspar Bolsista: CAPES 2009 - 2010 Mestrado em Enfermagem Universidade Federal de São Carlos-UFSCar Título: Perfil epidemiológico dos casos de tuberculose resistente em hospital especializado Orientadora: Dra. Rosely Moralez de Figueiredo 2004 - 2005 Especialização Lato Sensu Unidade Básica de Saúde - Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP-SP Título: Unidade de Saúde da Família Dr. Milton Maguallo - Catanduva Orientadora: Silvia Helena Figueiredo Vendramini 1996 - 1997 Especialização Lato Sensu Administração Hospitalar Universidade de Ribeirão Preto, UNAERP Título: Administração Hospitalar. 1992 - 1995 Graduação em Enfermagem Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto- FAMERP 3. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos - 5 Livros e capítulos - 1 capítulo de livro Trabalhos publicados em anais de eventos científicos - 6 Apresentações de trabalho e ou palestra - 16 Participação em bancas - 14 Participação em bancas de pós-graduação lato sensu - 1 Participação em eventos científicos - 38 Orientações - 14 DEDICATÓRIA Aos meus pais Luiz e Nair, pelos ensinamentos que guardo comigo e me fazem acreditar em mim. Obrigada por me mostrarem o valor da fé em Deus, que tudo providencia a seu tempo. Amo Vocês!!! Aos meus irmãos Célia, José Luiz e Micheli, pelas lições de vida, e cumplicidade nos momentos de dificuldades, amo vocês, eternamente!!! Aos meus sobrinhos Arthur e Gustavo, minha alegria e esperança de um mundo melhor nesse mundo que tudo pode. Ao meu cunhado Heldes Clever, muito obrigado por fazer parte da minha família, você me deu dois lindos presentes! Os meus sobrinhos que tanto amo. Ao João Renato meu marido, companheiro e amigo, pelo incentivo e apoio incondicional em todos os projetos de minha vida. Não foram fáceis esses 4 anos, muitas coisas aconteceram, mas saiba que estar ao seu lado faz de mim uma pessoa forte, feliz e completa. Amo você!!! A todos os amigos que vivenciaram comigo as etapas de construção dessa tese. AGRADECIMENTOS A Deus por ter colocado as pessoas certas em meu caminho; pela paz, conforto e serenidade que me concedeu nos momentos de dificuldade, tribulações e angústia. A minha família, pela base, carinho, incentivo e por acreditar nos meus sonhos. Ao meu marido João Renato, pela paciência, dedicação e incentivo. As amizades que fiz durante o durante o doutorado e permanecerão para sempre, Larissa, Paula, Fernanda e Carol. Ao Rafael, técnico do laboratório, pela colaboração e ajuda. A Gabriela, minha aluna de iniciação científica, que me auxiliou na confecção das membranas. A Vittória, pelo auxílio na aplicação das coberturas. A Profa. Dra. Palmira e o Prof. Dr. Marlus (Laboratório de Fármacos e Medicamentos - FCFar/UNESP) por me autorizarem a usar o laboratório para realização dos ensaios bioquímicos e de permeação. A Dra. Márcia Oyafuso, pela ajuda nos testes bioquímicos e de permeação. A professora Dra. Heloisa por me autorizar a usar o Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (LBBM/UFSCAR) para realização da proliferação celular As funcionárias Fátima e Angela da Faculdade de Odontologia de Araraquara que me autorizaram a usar a seladora do setor. Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Sidney, por permitir o uso do laboratório para preparação das membranas. A Dra. Denise e a Rachel pelo auxílio nos testes químicos. A minha co-orientadora Profa. Dra. Helena, pela confiança e disponibilidade na orientação na parte clínica. Ao professor Clóvis pela colaboração nos testes de entalpia. As funcionárias da Seção de Pós-Graduação e da Biblioteca, em especial à Maria Isabel (Bel) por todo apoio necessário durante esses anos. A minha orientadora e segunda mãe Profa. Dra. Ana Maria, pela disponibilidade, confiança, paciência, dedicação e ensinamentos na construção deste estudo e por me ajudar a me tornar doutora. Meus sinceros agradecimentos e obrigada por fazer parte desta etapa, que não foi fácil nesses 4 anos. Aos pacientes com úlceras venosas e pé diabético, que, embora vivendo com as feridas, não perderam a capacidade de se doar e de sonhar com a cura do corpo e da alma. Aos enfermeiros do SAD, USF, CMS, muito obrigada, sem a ajuda e colaboração de vocês não teria conseguido os pacientes para participarem da pesquisa. A todos os servidores do Instituto de Química de Araraquara. A CAPES pela bolsa concedida. A todos o meu muito obrigado!!! “Espere menos, queira menos. Nem sempre o mais é sinônimo de adição. Recuar é tão necessário quanto ir adiante. Diminuir as expectativas pode nos ajudar a entender melhor a realidade. A vida é sempre boa, mesmo sendo imperfeita”. Pe. Fabio de Melo RESUMO Feridas crônicas são multifatoriais e resultantes do processo de cicatrização inadequada, no qual não ocorre reparação tecidual ordenada e temporal, ou ainda, há ausência de restauração anatômica e funcional completa, comprometendo a vida cotidiana dos indivíduos. Para a melhoria da assistência à saúde destas pessoas, buscou-se uma alternativa de cobertura com a utilização de membrana de celulose bacteriana (CB), por esta ser biodegradável, biocompatível, não tóxica e não alergênica, na aplicação na pele com área queimada ou lesada e para alívio da dor; foi associada à membrana um medicamento anti-inflamatório, aprovado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e já comercializado. Assim, o objetivo deste estudo foi desenvolver cobertura de CB incorporado com anti- inflamatório Ibuprofeno (CB/Ibu) e avaliar a utilização em pacientes com feridas crônicas vasculogênicas de membros inferiores. Foram utilizadas membranas de celulose, obtidas com o cultivo de bactérias Gluconacetobacter xylinus com incorporação do anti-inflamatório Ibuprofeno e avaliadas por diferentes técnicas físico-químicas como MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura), Difração de Raios X, TG (Análise Termogravimétrica), DSC (Calorimetria Exploratória Diferencial), Infravermelho, UV-vis (Espectroscopia Eletrônica na região do UV-Visível); ensaios de proliferação celular com fibroblastos cultivados testes de liberação do Ibuprofeno e da membrana de CB/Ibu e os testes de permeação e retenção de Ibuprofeno e após esta fase, iniciou-se a aplicação da cobertura em pacientes com feridas crônicas como pé diabético e úlcera venosa de membros inferiores acompanhados pelo Serviço de Atendimento Domiciliar, Unidade de Saúde da Família e Centro Municipal de Saúde de um município do interior paulista. A amostra por conveniência foi constituída por 14 pacientes, sendo 10 mulheres e 4 homens; totalizando 17 feridas de etiologia crônica vasculogênica, sendo 8 com úlcera venosa, 5 com pé diabético e um com ferida mista, cuja temporalidade da ferida foi entre 10 dias e 40 anos; com média de idade de 64,71 anos. Houve redução da área e da dor em 9 lesões; cicatrização total de 3 feridas; e o aumento da área em 5 feridas, que pode estar vinculada à etapa de debridamento do processo cicatricial. Os testes físicos e bioquímicos indicaram que a CB/Ibu apresentou características de uma cobertura ideal para a população do estudo e que pode favorecer o processo de cicatrização; como permite troca gasosa, não ocorre extravasamento do exsudato, fácil aplicabilidade entre outras, sendo que o desenvolvimento de coberturas e a avaliação de sua aplicação é altamente complexa, uma vez que os pacientes com feridas crônicas vasculogênicas requer avaliação clínica criteriosa e um seguimento multiprofissional especializado. Palavras-chave: Pé diabético. Úlcera venosa. Celulose. Ibuprofeno. Cicatrização. ABSTRACT Chronic wounds are multifactorial and result from the inadequate healing process, in which there is no organized and temporal tissue repair, or there is no complete anatomical and functional restoration, compromising the daily life of individuals. In order to improve the health care of these people, a cover alternative with the use of bacterial cellulose membrane (CB) was sought because it is biodegradable, biocompatible, non-toxic and non-allergenic, when applied to the skin with burned or Injured and for pain relief; Was associated with the membrane an anti-inflammatory drug, approved by the National Agency of Sanitary Surveillance (ANVISA) and already commercialized. Thus, the objective of this study was to develop coverage of CB incorporated with anti-inflammatory Ibuprofen (CB/Ibu) and to evaluate the use in patients with chronic vasculogenic lower limb wounds. Cellulose membranes were obtained from Gluconacetobacter xylinus bacteria with incorporation of the anti- inflammatory Ibuprofen and evaluated by different physicochemical techniques such as MEV (Scanning Electron Microscopy), X-ray Diffraction, TG (Thermogravimetric Analysis), DSC (Differential Exploration Calorimetry), Infrared, UV-vis (Electronic Spectroscopy in the UV-Visible region); Cell proliferation assays with cultured fibroblasts Ibuprofen and CB / Ibu membrane release tests and Ibuprofen permeation and retention tests, and after this phase, coverage was started in patients with chronic wounds such as diabetic foot and ulcer Of the lower limbs accompanied by the Home Care Service, the Family Health Unit and the Municipal Health Center of a municipality in the interior of São Paulo. The convenience sample consisted of 14 patients, of which 10 were women and 4 were men; Totaling 17 wounds of chronic vasculogenic etiology, 8 with venous ulcer, 5 with diabetic foot and one with mixed wound, whose temporality of the wound was between 10 days and 40 years; With a mean age of 64.71 years. There was reduction of area and pain in 9 lesions; Total healing of 3 wounds; And the increase of the area in 5 wounds, which may be related to the debridement stage of the cicatricial process. The physical and biochemical tests indicated that CB / Ibu presented characteristics of an ideal coverage for the study population and that may favor the cicatrization process; As it allows gas exchange, there is no extravasation of exudate, easy applicability among others, and the development of coverage and assessment of its application is highly complex, since patients with chronic vasculogenic wounds require careful clinical evaluation and specialized multiprofessional follow-up . Keywords: Diabetic foot. Venous ulcer. Cellulose. Ibuprofen. Healing. LISTA DE FIGURAS Figura 1- Composição das camadas da pele. ..........................................................18 Figura 2- Fórmula estrutural do Ibuprofeno..............................................................27 Figura 3- Fluxograma das etapas de produção da cobertura CB, CB/Ibu e de sua aplicação...................................................................................................32 Figura 4- Membrana de Celulose Bacteriana úmida.................................................34 Figura 5- Esquema da célula de difusão (Microette Plus-Hanson Research®) empregada nos estudos de liberação e permeação cutânea in vitro........38 Figura 6- Fotos do equipamento Microette Plus-Hanson Research® empregada nos estudos de liberação e permeação cutânea in vitro..................................38 Figura 7- Espectro UV-vis de CB com ATCC, segundo tempo de cultivo.................48 Figura 8- Comparação microscópica da membrana seca de CB e de CB/Ibu em diferentes concentrações, com ampliação de 30000X. ............................50 Figura 9- Espectroscopia de Energia Dispersiva de membrana produzida por (ATCC 23769).......................................................................................................51 Figura 10- Espectroscopia vibracional da área de incidência do Infravermelho na CB de ATCC pura............................................................................................52 Figura 11- Avaliação da CB pura, do Ibuprofeno puro e das membranas CB/Ibu, com diferentes concentrações, segundo os espectros do FTIR...............53 Figura 12- Teste de difração de Raios X, na CB pura e CB/Ibu, em diferentes concentrações.........................................................................................55 Figura 13- Difração de Raios X do Ibuprofeno puro..................................................56 Figura 14- Caracterização Térmica - Termogravimetria da CB da cepa ATCC, segundo perda de massa........................................................................58 Figura 15- Calorimetria do Ibuprofeno e da CB/Ibu em diferentes concentrações...59 Figura 16- Curva analítica do Ibuprofeno obtida por espectrofotometria de absorção no ultravioleta..........................................................................................63 Figura 17- Ensaio do perfil de liberação do Ibuprofeno em 24 horas........................65 Figura 18- Ensaio do perfil de liberação do Ibuprofeno da membrana de CB em 24 horas.......................................................................................................66 Figura 19- Ensaio de permeação da membrana de CB/Ibu em 24 horas.................67 Figura 20- Retenção do Ibuprofeno no tecido cutâneo.............................................69 Figura 21- Capacidade de proliferação celular de fibroblastos na CB, CB/Ibu e nos respectivos controles...............................................................................70 Figura 22- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...75 Figura 23- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...76 Figura 24- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...78 Figura 25- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...79 Figura 26- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...80 Figura 27- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...81 Figura 28- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...82 Figura 29- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...83 Figura 30- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...85 Figura 31- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...86 Figura 32- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...87 Figura 33- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...87 Figura 34- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...89 Figura 35- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...90 Figura 36- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...91 Figura 37- Foto do primeiro e do último dia da aplicação da cobertura de CB/Ibu...91 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Produção da cobertura de CB úmida da cepa de ATCC segundo tempo de crescimento e espessura obtida, com respectivos valores de desvio padrão. .....................................................................................................46 Tabela 2- Entalpias do Ibuprofeno sódico e da CB/Ibu, em diferentes concentrações. ...................................................................................................................61 Tabela 3- Curvas de Tensão, Deformação e Módulo de Young das membranas de CB pura e CB/Ibu, com as respectivas média e desvio padrão................61 Tabela 4- Análise dos dados da regressão obtidos a partir da curva analítica do Ibuprofeno por espectrofotometria de absorção no ultravioleta................64 Tabela 5- Caracterização da ferida, segundo tipo, tempo de existência e de tratamento com CB/Ibu e dimensões das áreas inicial e final, durante o seguimento domiciliário da amostra do estudo.........................................72 Tabela 6- Avaliação e evolução da utilização da CB/Ibu na amostra do estudo com tempo máximo de até 30 dias de tratamento............................................74 Tabela 7- Avaliação e evolução da utilização da CB/Ibu na amostra do estudo com tempo de tratamento acima de 30 dias até 50 dias..................................74 Tabela 8- Avaliação e evolução da utilização da CB/Ibu na amostra do estudo com 120 dias de tratamento..............................................................................74 Tabela 9-Agrupamento das medicações, segundo classe farmacológica, utilizada pela amostra do estudo.............................................................................95 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16 1.1 Úlcera venosa (UV) ............................................................................................ 19 1.2 Pé diabético (PD) ............................................................................................... 20 1.3 Tratamentos ....................................................................................................... 22 1.4 Membranas de Celulose bacteriana (CB) ........................................................ 24 1.5 Anti-inflamatórios .............................................................................................. 27 1.6 O papel do enfermeiro no tratamento de feridas ............................................ 28 2 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 31 2.1 Objetivos Específicos ....................................................................................... 31 3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 32 3.1 Etapa 1- Produção da cobertura de CB/Ibu: ensaios físicos - químicos e de proliferação celular ................................................................................................. 33 3.1.1 Preparo das Mantas de CB .............................................................................. 33 3.1.2 Preparação da Membrana de CB /Ibu .............................................................. 34 3.1.3 Esterilização das membranas de CB/Ibu .......................................................... 35 3.1.4 Técnicas de Caracterização ............................................................................. 35 3.1.5 Preparação da curva analítica do Ibuprofeno ................................................... 36 3.1.6 Estudo de liberação do Ibuprofeno em solução tampão fostato ....................... 37 3.1.7 Estudo de liberação da membrana de CB ........................................................ 38 3.1.8 Estudo de liberação do Ibuprofeno na membrana de CB ................................. 39 3.1.9 Estudo da permeação cutânea in vitro ............................................................. 39 3.1.10 Estudo de retenção cutânea in vitro ............................................................... 40 3.1.11 Preparo das amostras para o ensaio de proliferação ..................................... 40 3.1.12 Cultura celular ................................................................................................ 41 3.1.13 Proliferação Celular - Ensaio do AlamarBlue® ............................................... 41 3.2 Etapa 2 – Avaliação das úlceras em pacientes com feridas vasculares crônicas.................................................................................................................... 42 3.2.1 Avaliação das úlceras dos participantes do estudo ....................................... 43 3.2.2 Critérios de inclusão e exclusão .................................................................... 44 3.2.3 Análise estatística ......................................................................................... 45 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 46 4.1 Etapa 1 - Produção da cobertura de CB/Ibu: ensaios físicos - químicos, e de proliferação celular ......................................................................................... 46 4.1.1 Caracterização das membranas de CB......................................................... 46 4.1.1.1 Ensaios de crescimento em massa e espessura de CB ............................ 46 4.1.1.2 Caracterização morfológica da membrana de CB e CB/Ibu ....................... 49 4.1.1.3 Caracterização Estrutural da membrana de CB ......................................... 51 4.1.1.4 Difração de Raios X ................................................................................... 54 4.1.1.5 Caracterização Térmica - Termogravimetria .............................................. 58 4.1.1.6 Ensaios mecânicos .................................................................................... 61 4.1.1.7 Curva de analítica do Ibuprofeno ............................................................... 63 4.1.1.8 Liberação acumulativa do Ibuprofeno ........................................................ 64 4.1.1.9 Liberação do Ibuprofeno na membrana de celulose bacteriana ................. 65 4.1.1.10 Permeação cutânea in vitro da membrana de celulose bacteriana com Ibuprofeno .............................................................................................................. 67 4.1.1.11 Retenção cutânea da celulose bacteriana com Ibuprofeno...................... 68 4.1.1.12 Proliferação celular................................................................................... 70 4.2 Etapa 2 - Avaliação da utilização da CB/Ibu em pacientes com feridas vasculares crônicas ............................................................................................. 71 4.2.1 Avaliação das feridas na amostra do estudo ................................................. 71 5 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 102 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 103 APÊNDICE .............................................................................................................. 113 ANEXO 1 ................................................................................................................. 117 ANEXO 2 ................................................................................................................. 120 16 1 INTRODUÇÃO A temática ferida envolve diversos aspectos, classificações e diferentes tipos de lesões ou traumas, com especificidades. No entanto, é necessário identificar as características de cada ferida, avaliando o paciente de forma integral, nos diferentes contextos socioculturais e de assistência à saúde aos quais estão inseridos, para possibilitar a análise das peculiaridades de cada contexto e planejar a assistência de enfermagem e da equipe multiprofissional para atender a demanda de necessidades de saúde da clientela (BRITO et al., 2013). Conceitualmente, ferida é a perda da integridade de um tecido do corpo, independente da sua extensão, causada por qualquer tipo de impacto físico, químico, mecânico ou desencadeado por qualquer doença, que aciona as defesas do organismo para o contra ataque (BRITO et al., 2013). O desenvolvimento de doenças crônicas nas pessoas pode resultar em diferentes tipos de feridas, dentre estas, as feridas agudas e crônicas. Feridas agudas cicatrizam espontaneamente sem complicações através de três fases do processo de cicatrização: inflamação, proliferação e reparação (LAZARUS et al., 1994). Fase Inflamatória: inicia no momento que ocorre a lesão, até um período de três a seis dias, em que ocorrem:  Etapa trombocítica  ativação da cascata de coagulação  hemostasia;  Etapa granulocítica  grande concentração de leucócitos com fagocitose das bactérias, “limpeza do local da ferida”;  Etapa macrofágica  os macrófagos liberam enzimas, substâncias vasoativas e fatores de crescimento. Fase Proliferativa: caracterizada pela divisão celular e ocorre, em aproximadamente, três semanas:  Desenvolvimento do tecido de granulação  células endoteliais, fibroblastos e queratinócitos; 17  Elaboração de colágeno  formado continuamente no interior da lesão. Fase Reparadora: início em torno da terceira semana após o início da lesão, podendo se estender por até dois anos:  Diminuição da vascularização e dos fibroblastos;  Aumento da força tênsil;  Reordenação das fibras de colágeno. Feridas crônicas são resultantes da não ocorrência do processo de reparação tecidual ordenada e temporal adequados ou as feridas com restauração anatômica e funcional inadequado (LAZARUS et al., 1994). Neste estudo, optou-se pela abordagem de feridas vasculares, a úlcera venosa (UV) e a lesão do pé diabético (PD), por constituírem um problema de saúde pública importante, tanto no Brasil como no mundo, com repercussões fisiológicas, psicossociais e culturais. Para aprofundar sobre feridas crônicas, retomamos a fisiologia da pele (Figura 1), que é composta por epiderme, derme e tecido conjuntivo subcutâneo, e na ferida crônica houve falha no processo normal da reparação tecidual. 18 Figura 1 - Composição das camadas da pele. Fonte: Barros (2012). Nos países ocidentais, 5% da população adulta apresenta úlcera crônica (UC) nos membros inferiores. Sua etiologia está associada a diversos fatores como doença venosa crônica, hipertensão arterial, anemia falciforme, trauma físico, alterações nutricionais, dentre outras. Apesar da grande variedade de fatores etiológicos, as principais causas de úlceras crônicas dos membros inferiores são as doenças venosa e arterial. Cerca de 60 a 70% destas são resultantes de problemas venosos, denominado de úlcera venosa (UV) e de 10 a 25% à insuficiência arterial, a qual pode coexistir com doença venosa (úlcera mista), apesar de que em 3,5% dos pacientes, dificilmente a etiologia é identificada (ABBADE, 2006; SALOMÉ; BLANES; FERREIRA, 2011). Na Europa e Austrália, a incidência oscila entre 0,3 a 1% no total da população, enquanto no restante do mundo é em torno de 2,7% (SILVA; MOREIRA, 2011). Devido às terapêuticas prolongadas, a pessoa com ferida crônica necessita de atendimento multiprofissional, que o afasta do emprego inúmeras vezes e, muitas vezes, acaba se aposentando precocemente. Todos esses fatores causam importante encargo aos sistemas previdenciário e de saúde, além de interferir na qualidade de vida dos pacientes (ABBADE, 2006). 19 O diagnóstico da UC é muito importante, e se baseia inicialmente no exame clínico. A dor é um dos sintomas mais frequentes e possui intensidade variável; úlceras pequenas com associação de atrofia branca e úlceras profundas, localizadas na região maleolar, são as mais dolorosas (ABBADE, 2006). Bertranou e Vélez (1997) chamam atenção para a necessidade do diagnóstico correto e do tratamento precoce, pois a cronicidade da lesão e a idade são fatores de risco no processo de cicatrização. 1.1 Úlcera venosa (UV) A úlcera venosa (UV) é uma lesão cutânea, está associada à insuficiência venosa crônica, que acomete o terço inferior das pernas (CARMO et al., 2007). A estimativa da prevalência de UV é entre 0,2 e 1%, da população no Brasil, sejam portadoras de UV e que interfere negativamente na qualidade de vida dessa população e gera altos custos para o Sistema Único de Saúde (SUS) (SILVA et al., 2012). No Brasil, a estimativa é de que 3% da população apresenta a UV, com aumento para 10%, entre pessoas com diabetes (REIS et al., 2013). Pessoas em diferentes faixas etárias apresentam UV, porém os mais acometidos são os idosos, principalmente do sexo feminina. Essa predominância está provavelmente relacionada aos hormônios femininos e à gravidez, pois os distúrbios hormonais predispõem a insuficiência venosa crônica e, consequentemente, a formação de UV. (MACEDO et al., 2013; FRADIQUE et al., 2011; LUCAS et al., 2008; ABBADE & LASTORIA, 2006). Considera-se que a cura da UV ocorre com correções cirúrgicas para melhorar a insuficiência venosa crônica. No Brasil, o acesso aos serviços da Especialidade Vascular nem sempre está disponível, por isso, o paciente necessita de acompanhamento clínico da lesão (YAMADA et al., 2005). Sabe-se, porém, que o tratamento cirúrgico aumenta o risco de trombose venosa profunda. 20 A literatura indica que 40% dos pacientes experimentam limitações nas atividades de lazer por causa da UV, de nível moderado a severo e 33% apresentam problemas em suas atividades diárias. A maioria dos estudos descreve isolamento social maior neste tipo de clientela em relação aos pacientes sem úlcera. Alguns pacientes evitam a atividade física por acreditarem que esta contribua para o desenvolvimento de novas úlceras (PERSOON et al., 2004). Friedberg, Harrison e Graham (2002) verificaram que, embora muitos pacientes apresentem déficits na mobilidade, apenas 15% possuem cuidadores em casa. Os autores sugerem a possibilidade de internação hospitalar para o suprimento das necessidades destes indivíduos. O déficit de mobilidade ocasionado pela UV tem efeitos negativos diretos sobre as atividades laborais, que ficam limitadas pelas dificuldades de mobilização corporal. As finanças podem ser afetadas, em caso de inviabilidade empregatícia. Os pacientes diante de tal situação mostram emoções negativas tais como o medo, isolamento social, raiva, depressão e a autoimagem prejudicada (PIEPER; SZCZEPANIAK; TEMPLIN, 2000). Portanto, as pessoas com UV podem apresentar sintomas como dor, feridas exsudativas e com odor fétido, alteração da autoimagem corporal, diminuição da mobilidade e desconforto devido aos curativos. Isso pode levar ao isolamento social e a alterações na saúde física e mental, com possível impacto à qualidade de vida (QV). 1.2 Pé diabético (PD) Diabetes mellitus (DM) é um dos principais problemas mundiais de saúde, por ser uma doença com elevada morbimortalidade (ZERVOS, 1998). Uma de suas complicações mais frequentes é o pé diabético (PD), caracterizado pela presença de lesões nos pés em decorrência das alterações vasculares e/ou neurológicas do DM (ZERVOS, 1998; ZANGARO & HULL, 1999). O PD é uma complicação crônica, que ocorre em média após 10 anos de evolução do DM e é a causa mais comum de amputações, que podem, em casos 21 mais graves, ser incapacitantes (FLORES VILCA, 1997). Por isso, sugere-se que uma intervenção intensiva possa prevenir o aparecimento ou atenuar a evolução do PD (MAYFIELD et al., 1995). Fatores como idade, tipo e tempo de diagnóstico do DM, controle da glicemia, tabagismo, alcoolismo, obesidade, hipertensão arterial e falta de bons hábitos higiênicos no cuidado com os pés estão vinculados aos riscos de complicações. Tais fatores favorecem a formação de úlcera, infecção e necrose, podendo levar em amputação, sendo responsável por uma grande parte das internações prolongadas de pacientes diabéticos (GAMBA, 1998; ZANGARO & HULL, 1999). No Brasil, o DM também é causa importante de amputações de membros inferiores, sendo um considerável fator de maior incapacidade, invalidez, aposentadoria precoce e mortes evitáveis (GAMBA, 1998). Além destes graves problemas, devem-se levar em consideração os gastos e as internações prolongadas que causam grande prejuízo ao sistema público de saúde (ALCANTARA; FLORES; GARMENDIA, 1999; MILMAN et al., 2001). A ulceração é a causa mais comum de amputações não traumáticas de membros inferiores em países industrializados, ocorrendo em 15% dos diabéticos e é responsável por 6% a 20% das hospitalizações (CARVALHO et al., 2004). Entretanto, nos países em desenvolvimento, a temática do PD ainda é pouco estudada, sendo que a prevalência é ainda maior e crescente, em decorrência das precárias condições de vida, bem como das dificuldades de acesso aos serviços de saúde e ausência de integração das ações de promoção, prevenção e tratamento (SANTOS; OLIVEIRA; COLET, 2010; SANTOS, 2008). No Brasil, um estudo multicêntrico realizado em nove capitais identificou uma prevalência de 7,6% entre pessoas de 30 a 69 anos de idade, sendo que, destas, quase a metade ainda desconhecia ter DM. Além disso, aproximadamente 25% dos diabéticos, previamente diagnosticados, não realizavam qualquer tipo de tratamento. A análise estimativa revela que, entre 1995 e 2025, o número de indivíduos diabéticos crescerá em 42% nos países industrializados e 170% nos países em desenvolvimento (NARAYAN et al., 2000). 22 Milman et al. (2001) afirmam que a lesão no pé do paciente diabético é uma complicação crônica reconhecida como a causa mais comum de amputações não traumáticas. Hess (2002) explica que a úlcera diabética decorre de alterações estruturais e funcionais no pé. A perda da sensibilidade impede que o paciente perceba a agressão tecidual e a diminuição do fluxo sanguíneo e a fragilidade cutânea reduzem a resistência do tecido às tensões aumentadas, ou até mesmo, as normais. O surgimento de uma ferida em um organismo desencadeia uma cascata de reações celulares e bioquímicas para a reparação do tecido lesionado. Em pacientes diabéticos, este reparo é lento, em decorrência de vários fatores como a diminuição do processo de cicatrização devido à produção excessiva de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), à diminuição do Óxido Nítrico (NO), à diminuição da resposta aos Fatores de Crescimento (GFs) e das proteínas da via de sinalização da insulina (BREM; TOMIC CANIC, 2007). A presença da disfunção endotelial pela incapacidade das artérias e arteríolas em desempenhar suas funções na regulação do tônus vascular, em resposta a um estímulo apropriado, resulta em microambiente isquêmico. Esta disfunção está associada à diminuição da biodisponibilidade do NO, à diminuição da produção pelo endotélio e/ou ao aumento da inativação do NO por ROS (KANETO et al., 2010). Assim, a excessiva produção de ROS em pacientes diabéticos é um fator primário que contribui para a deficiência de cicatrização de feridas assim como prejuízo da angiogênese. Outro aspecto importante é que o óxido nítrico endotelial é capaz de ativar a mobilização de derivados endoteliais de células progenitoras da medula óssea para o leito da ferida. Estas células desempenham uma função importante no processo de neovascularização (KANETO et al., 2010; GALLAGHER et al., 2007). 1.3 Tratamentos O tratamento de feridas envolve aspectos sistêmicos e locais, que são desenvolvidos por profissionais de diferentes áreas. 23 O tratamento local é denominado curativo, que constitui o procedimento de limpeza e oclusão da lesão, com o objetivo de auxiliar o restabelecimento da integridade do tecido ou prevenir a colonização dos locais de inserção de dispositivos invasivos diagnósticos ou terapêuticos (por exemplo, cateteres, drenos) (DECLAIR, 2002). Hoje no mundo há diversos tipos de coberturas que podem ser utilizados nas diferentes etapas de tratamento das feridas, das quais não podemos esquecer da higienização, debridamento, diminuição da comunidade bacteriana, controle do exsudato, estímulo à granulação e proteção da reepitelização (SMANIOTTO et al., 2012). O tratamento das UV pode ser difícil, em razão das alterações próprias da doença, como comorbidades associadas, idade avançada, eczema e dermatoesclerose (SILVA et al., 2012). A terapêutica envolve vários fatores, entre eles a correção da condição de base e o uso de medidas locais para ocorrer à cicatrização (MIOT et al., 2009), e várias coberturas são utilizados para o tratamento como carvão ativado, coberturas com carvão e prata para lesões com grande quantidade de exsudato, hidrocolóides nas lesões pequenas e médias, antibióticos e colagenase (ABBADE & LASTORIA, 2006). Segundo o protocolo clínico brasileiro e internacional, não se deve utilizar antibióticos tópico em feridas colonizadas, pois constantemente ocorrem reações alérgicas nos pacientes, sendo estas reações barreiras para a cicatrização (SILVA et. al., 2012). Estudos em pacientes com UV mostram altos números de sensibilização de contato com antibióticos utilizados em pacientes (SILVA et al., 2012). Os pés dos pacientes diabéticos são tidos como alvos da maioria dos comprometimentos do DM e possuem 25% de chance de desenvolver úlceras (BOULTON, 2005; RODRIGUES; SILVA; HONORIO, 2009). Segundo o Consenso Internacional do PD (CIPD), o PD é uma das complicações mais frequentes, resultante de um aglomerado de fatores, incluindo a vasculopatia e a neuropatia, além de determinar ulceração, infecção e/ou destruição dos tecidos profundos (BAKKER & SCHAPER, 2012), sendo as principais 24 responsáveis pelo elevado número de amputações não traumáticas em países desenvolvidos, além de gerarem um alto potencial incapacitante na população (VIEIRA-SANTOS et al., 2008). Estimativas revelam que a cada 30 segundos ocorre uma amputação decorrente de complicações do DM no mundo (BOULTON, 2005). As coberturas com princípios ativos possuem ação local dependendo de sua composição química. Esses princípios atuam no debridamento enzimático e no controle das bactérias durante o preparo do leito de uma ferida (SMANIOTTO et al., 2012; FRANCO; GONÇALVES, 2008). A variedade de coberturas no mercado é cada vez maior como placas de carvão ativado, hidrocolóides, hidrogéis, sulfadiazina de prata, papaína e outras coberturas específicas para cada caso, associadas a antibióticos, anti-inflamatórios, anti-plaquetários entre outros. Há uma grande pressão da indústria farmacêutica para novas formas de tratamento, mas ainda não existem coberturas ideais para tratar todo tipo de ferida, porém um arsenal terapêutico capaz de ajudar o reparo tecidual em várias situações é uma realidade. Cabe aos profissionais da saúde realizar a melhor escolha, sem nunca esquecer o quadro sistêmico que está envolvido no tratamento de uma ferida. 1.4 Membranas de Celulose bacteriana (CB) A bactéria Gluconacetobacter xylinus foi descrita pela primeira vez por Brown em 1886 (IGUCHI; YAMANAKA; BUDHIONO, 2000). Entre as bactérias que possuem a capacidade de produzir celulose, é a mais eficiente e por esta razão a mais estudada (BIELECKI et al., 2005). Microrganismos do gênero Gluconacetobacter são facilmente encontrados em frutas, vegetais, vinagre, sucos de frutas e bebidas alcoólicas (KLEMM et al., 2005). É considerada uma bactéria gram-negativa, aeróbia, que possui habilidade para sintetizar celulose abundantemente em um meio de cultura, que apresente como nutrientes fontes de carbono e nitrogênio (IGUCHI, YAMANAKA; BUDHIONO, 2000; KLEMM et al., 2005). 25 Quanto à estrutura química a CB é semelhante à celulose produzida pelas plantas. Entretanto, ela é obtida na forma de um hidrogel altamente hidratado (99% água), sendo quimicamente pura (livre de lignina, hemicelulose e pectinas) e apresenta cadeias de celulose nanométrica (“nanocelulose”). A membrana de CB é biodegradável, biocompatível, não tóxica e não alergênica (KLEMM et al., 2005; KLEMM et al., 2001). Esta morfologia nanométrica confere a CB grande área superficial, surpreendente capacidade de absorção e retenção de água, elasticidade, além moldável (IGUCHI; YAMANAKA; BUDHIONO, 2000; KLEMM et al., 2005). Devido a estas propriedades peculiares, apresenta aplicações em diversas áreas do conhecimento, incluindo indústrias têxteis e alimentos (fibras dietéticas, “Nata de Coco”), produção de dispositivos opto-eletrônicos (LEGNANI et al., 2008), e principalmente na Medicina (substitutos temporários da pele, tubos para cirurgia, lentes de contato), entre outras (BARUD, 2010). A ideia de utilizar a CB para o tratamento de feridas e queimaduras na pele iniciou-se com a empresa Johnson & Johnson em 1987. Após esse período, uma empresa brasileira, BioFill Produtos Biotecnológicos (Curitiba, PR Brasil) investigou as propriedades únicas do biopolímero celulose e criou um novo sistema de tratamento de feridas baseado em CB produzida por Gluconacetobacter. A sua linha de produtos inclui o Biofill® e Bioprocess®, usados no tratamento de queimaduras e úlceras, como pele artificial temporária (CZAJA et al., 2006). Quando a membrana de CB seca ou úmida é aplicada sobre a área queimada ou lesada, ela alivia a dor quase completamente e possui facilidade de adesão ao leito da ferida (CABRAL et al., 2006); este efeito é observado somente se a epiderme estiver exposta, sugerindo a utilização da membrana em queimaduras de segundo e terceiro grau (CABRAL et al., 2006). A membrana de celulose não necessita de troca diária e pode ser utilizada para feridas crônicas, como as causadas por diabetes, úlceras de pressão ou por outras condições com debridamento mecânico (CABRAL et al., 2006). Diversos trabalhos relatam também que estas membranas apresentam efeito hemostático e não antigênico (CABRAL et al., 2006). 26 A cobertura não precisa ser trocada, o que em casos de queimaduras é uma grande vantagem, porque a troca retira parte do tecido em formação. Ela protege o tecido enquanto o organismo renova a pele por baixo. Quando ocorre a cicatrização, a membrana de CB resseca e cai naturalmente (MATEOS, 2004). Outro fator interessante é que durante o processo de cicatrização, a membrana de CB não apresenta descontinuidade ou perfurações, sendo capaz de bloquear a passagem de bactérias e diminuir as perdas de proteínas e eletrólitos (CZAJA et al., 2006). Ela também bloqueia a radiação ultravioleta (UVA-UVC), é permeável a gases e impermeável a líquidos, e devido a sua transparência, permite- se constante avaliação da cicatrização da lesão, sem remoção do mesmo, possibilitando troca única (CZAJA et al., 2006). O tempo para a reconstituição da epiderme é inferior quando comparado a coberturas tradicionais. Quando a cicatrização se inicia, a membrana perde sua aderência sobre a área lesada, tornando-se quebradiça e com descolamento gradual (CABRAL et al., 2006). Outro fato relevante é que o tratamento com a membrana CB permite a redução do tempo de hospitalização e, consequentemente, aumento na qualidade de vida do paciente (CABRAL et al., 2006). Entretanto, uma limitação advém do fato de as membranas de CB não apresentarem atividade anti-inflamatória (MANEERUNG; TOKURA; RUJIRAVANIT, 2008). Uma possibilidade de ampliar a versatilidade de aplicações da membrana de CB trata-se da infusão de novos compostos em sua nanoestrutura. Quando obtida em meio de cultura estático (membrana úmida) a membrana apresenta uma estrutura porosa, permitindo, portanto, a impregnação de anti-inflamatórios, os quais podem ser difundidos da membrana para as lesões e, consequentemente, acelerando o seu processo de cicatrização. A proposta principal desta pesquisa foi desenvolver coberturas à base de CB associado ao anti-inflamatório Ibuprofeno, com liberação para regeneração tecidual da ferida. 27 1.5 Anti-inflamatórios Os anti-inflamatórios tópicos vêm sendo utilizados por décadas para alívio das dores. Esta forma de administração reduz as reações adversas por potencializar o efeito local e minimizar a toxicidade sistêmica. A concentração plasmática máxima obtida após aplicação tópica é menor que 15% da concentração obtida por via oral (PEREIRA; RIBEIRO; CICONELLI, 2006). Os fármacos de administração tópica exercem seu efeito na periferia, próximo ao sítio de aplicação (FLORES; CASTRO; NASCIMENTO, 2012); os anti- inflamatórios, não hormonais são os mais usados na prática clínica, em específico o Ibuprofeno, cujo mecanismo de ação consiste na inibição da enzima ciclo-oxigenase tipo 1 e 2, reduzindo a síntese de prostaglandinas e da sensibilização de terminações nervosas nos tecidos periféricos, sítio comum de dor e inflamação, sua estrutura plana está apresentada na Figura 2. Sua aplicação tópica é interessante por promover concentrações terapêuticas no tecido alvo, mantendo os níveis séricos insuficientes para gerar reações adversas (FLORES; CASTRO; NASCIMENTO, 2012). O Ibuprofeno é muito usado na terapêutica, sendo que é praticamente solúvel em água e facilmente solubilizado em álcool, acetona, éter e em cloreto de metila (JORGENSEN; FRIIS; GOTTRUP, 2006). Figura 2- Fórmula estrutural do Ibuprofeno. Fonte: Andrioli (2014). 28 Esse fármaco vem se apresentando muito promissor como relaxante em queimaduras de graus variados, pois ele alivia a dor intensa (JORGENSEN; FRIIS; GOTTRUP, 2006). Jorgensen, Friis, Gottrup (2006) desenvolveram um curativo de espuma com Ibuprofeno e realizaram um teste em vivo em 10 pacientes e observaram que pelo menos em 9 testados ocorreu uma redução da dor no local da ferida quando submetidos ao curativo. Constatou-se uma liberação do anti-inflamatório sobre a ferida, porém se observou-se que a liberação do fármaco através do curativo a base de espuma mostrou-se desregulada e não controlada. Segundo Gottrup (2007) o curativo de espuma de poliuretano é hidrofílica, macia e não aderente, impregnada com o anti-inflamatório Ibuprofeno na concentração de 0,5mg/cm², o qual teve bons resultados; no quesito dor, os pacientes referiram melhora significativa e diminuição ou eliminação do uso de outros analgésicos e/ou anti-inflamatórios orais. 1.6 O papel do enfermeiro no tratamento de feridas O papel do enfermeiro no cuidado das feridas é de extrema importância, que compreende desde as avaliações dos custos destinados ao tratamento, da qualidade de vida do doente, do processo de cicatrização e adoção de novas tecnologias de tratamento para fundamentar a prática e aprofundar as questões vinculadas à assistência (SILVA et al., 2009; SILVA; MOREIRA, 2011) Ao abordarmos o papel do enfermeiro no cuidado de UV e PD, é imprescindível ter em mente que esse profissional é um gestor em saúde que atua em várias vertentes dos processos assistenciais. No que se refere ao cuidado desses pacientes, o papel do enfermeiro ultrapassa as questões de prevenção e avaliação do diagnóstico de risco, estendendo-se ao nível de fornecer apoio educacional e mental a esses clientes (SILVA et al., 2009). Por essa razão, o enfermeiro procura orientá-los a obter meios adaptativos que os levem à superação da sua condição clínica, projetando a recuperação efetiva 29 e, consequentemente, que resulte em melhoria da qualidade de vida (COSTA et al., 2011). A qualidade de vida dos pacientes é apontada por autores como um instrumento efetivo na sua melhoria e recuperação. Desse modo, é preciso ter em mente que ter uma boa qualidade de vida para pacientes portadores de UV consiste na realização de atividades cotidianas, participação de atividades sociais com amigos e familiares, bem como na minimização do aspecto estético provocado pela úlcera (SILVA; MOREIRA, 2011). O conhecimento do enfermeiro acerca da situação do paciente com feridas no aspecto biopsicossocial permite a elaboração de um plano focado na necessidade do cliente, a fim de promover a melhoria da sua condição de vida (SILVA; MOREIRA, 2011; SILVA; GUIMARAES, 2008). Essa conduta do enfermeiro é consequência do seu papel de educador; portanto, quando se trabalha as orientações ao paciente, desenvolvem-se meios para a adaptação de sua condição clínica, promovendo assim uma melhoria no processo de recuperação e na qualidade de vida desse cliente (COSTA et al., 2011). As pessoas com UV e PD podem apresentar sintomas como dor, feridas exsudativas e com odor fétido, alteração da autoimagem corporal, diminuição da mobilidade e desconforto devido aos curativos. Isso pode levar ao isolamento social e a alterações na saúde física e mental, com possível impacto à sua QV. Por isso, há necessidade de intervenções holísticas para melhorar a efetividade do tratamento e, consequentemente, a qualidade de vida (ARAUJO et al., 2016). Na Unidade de Saúde da Família (USF), o enfermeiro destaca-se no atendimento à pessoa com feridas, porém se identificou em pesquisa qualitativa realizada em um município de Minas Gerais, que ocorreu falta de preparo profissional para atender às especificidades e à complexidade demandada por essa clientela e houve precariedade das condições de trabalho na Atenção Básica (ARAUJO et al., 2016). Devido ao potencial impacto negativo da UV e PD na QV das pessoas e à falta de padronização e capacitação para seu atendimento, alguns instrumentos foram desenvolvimentos para avaliar e medir quantitativamente esse impacto. O 30 instrumento Charing Cross Venous Ulcer Questionnaire (CCVUQ) foi criado e validado em Londres, traduzido e adaptado para o vernáculo brasileiro, para avaliar a qualidade de vida em pessoas com UV (COUTO, 2012). O conhecimento do mecanismo molecular do processo de cicatrização, aliado à prática clínica do tratamento de feridas, traz ao enfermeiro novos investimentos na prevenção, condutas coerentes na condução do preparo do leito da ferida e escolha de coberturas adequadas. É importante salientar que a abrangência do cuidado vai além do tratamento local da ferida, considerando os aspectos sistêmicos de controle dos níveis glicêmicos, as condições nutricionais e de hidratação que interferem, diretamente, no processo de cicatrização, e ainda as condições de higiene como aspecto importante na prevenção de infecções. Mediante a observância desses cuidados, sabe-se que é fundamental considerar a atuação do enfermeiro no processo de educação em saúde do paciente e família, objetivando o sucesso terapêutico (ARAÚJO et al., 2016). O enfermeiro está diretamente relacionado ao cuidado a indivíduos portadores de feridas, nos diversos níveis de atenção à saúde. Para tanto, deve-se resgatar a responsabilidade de realizar uma avaliação clínica, mantendo a observação intensa com relação aos fatores locais e sistêmicos que condicionam o surgimento da ferida e o processo de cicatrização. Desse modo, a visão clínica no cuidado a tais indivíduos possibilita relacionar alguns pontos importantes que influenciam neste processo, como o controle da patologia de base, aspectos nutricionais, infecciosos, medicamentosos, e, também, a qualidade do cuidado educativo junto a tais indivíduos (SILVA; MOREIRA, 2011; SILVA; GUIMARAES, 2008). Além do mais, não podemos deixar de considerar os aspectos sociais, econômicos e culturais em que os indivíduos portadores de feridas estão inseridos, de forma a promover um cuidado de enfermagem contextualizado, holístico e de qualidade (OLIVEIRA et al., 2012). 31 2 OBJETIVO GERAL O objetivo desta pesquisa foi desenvolver e caracterizar uma cobertura composta por membrana de celulose bacteriana com anti-inflamatório Ibuprofeno (CB/Ibu) para aplicação em pacientes com feridas crônicas de etiologia venosa e diabética de membros inferiores, que realizam acompanhamento clínico no Serviço de Atendimento Domiciliar (SAD), Unidade de Saúde da Família (USF) e Centro Municipal de Saúde (CMS) do Município de Araraquara-SP. 2.1 Objetivos Específicos Etapa 1  Preparar e caracterizar as membranas de CB/Ibu;  avaliar o perfil de liberação do fármaco com auxílio de dissolutor;  avaliar a permeabilidade cutânea e Células do tipo Franz;  testar in vitro a citotoxicidade; Etapa 2  Aplicar a cobertura CB/Ibu e avaliar semanalmente os pacientes com feridas crônicas de úlceras venosas e/ou pé diabético de membros inferiores, em seguimento clínico no Serviço de Atendimento Domiciliar (SAD), Unidade de Saúde da Família (USF) e Centro Municipal de Saúde (CMS) pelo período máximo de 120 dias. 32 3 MATERIAIS E MÉTODOS A Figura 3 descreve o desenvolvido do trabalho. Figura 3- Fluxograma das etapas de produção da cobertura CB, CB/Ibu e de sua aplicação. Fonte: Elaborado pela autora Preparação da CB Impregnação CB/Ibu Técnicas de caracterização MEV Permeação e retenção cutânea Curva Analítica TG e DSC UV - VIS FTIR Difração RX Ensaios mecânico s Liberação do Ibu Ensaio in vivo Ensaio in vitro Liberação CB/Ibu Liberação da CB SAD/USF/CMS E T A P A 2 E T A P A 1 33 3.1 Etapa 1- Produção da cobertura de CB/Ibu: ensaios físicos - químicos e de proliferação celular 3.1.1 Preparo das Mantas de CB As mantas de CB foram preparadas no Laboratório de Materiais Fotônicos do Instituto de Química-UNESP (Araraquara), Figura 4. O cultivo das bactérias Gluconacetobacter xylinus (ATCC 23769) ocorreu em bandejas de 30x50cm, com tempo de 48, 72, 96 e 120 horas a 28°C. O meio de cultura utilizado foi a estática, após pesagem em balança de alta precisão, cujas características eram: 2% (m/v) glicose, 0,5% (m/v) peptona, 0,5% (m/v) extrato de levedura, 0,27% (m/v) fosfato dissódico anidro e 0,115% (m/v) ácido cítrico monohidratado, sendo que o meio de cultura foi esterilizado em autoclave por 20 minutos a 120ºC. Para a remoção das bactérias, a membrana passou por um tratamento com uma solução diluída de hidróxido de sódio 2% por 20 minutos a 80°C, sendo posteriormente lavada exaustivamente com água destilada e armazenadas em um Becker de 2 litros com água deionizada em geladeira. Em seguida, as membranas de CB foram recortadas com tesoura em tamanhos de aproximadamente 10x10cm, que foram pesadas e medidas em relação à espessura. 34 Figura 4 - Membrana de Celulose Bacteriana úmida. Fonte: Elaborado pela autora 3.1.2 Preparação da Membrana de CB /Ibu Após todo o procedimento para a preparação das mantas de CB, essas membranas foram cortadas ainda úmidas em pedaço de 10x10cm, calculado a quantidade de Ibuprofeno nas diferentes concentrações 0,5mg/cm²; 0,25 mg/cm² e 0,1mg/cm², pesado em balança de alta precisão, colocado o Ibuprofeno em placa de petri (após feito uma desinfecção de baixo nível com álcool 70% nas placas), diluído com 1 mL de água destilada, colocado o pedaço recortado na placa, homogeneizado várias vezes e colocado em estufa a 28°C por 24 horas. Após, essas membranas foram retiradas da placa, analisadas e caracterizadas por meio de diferentes testes químicos. 35 3.1.3 Esterilização das membranas de CB/Ibu Após a impregnação e a secagem, as membranas de CB/Ibu, foram embaladas em papel grau cirúrgico e enviadas para esterilização por raios gama na empresa Embrarad, em Cotia (SP). A radiação foi de 15 KGy, conforme estudo de Weska, Moraes, Beppu (2009) com membranas densas de fibroína, antes e após a esterilização por óxido de etileno, raio gama, radiação ultravioleta e autoclave a vapor, que mostrou que nenhum método degradou a membrana. 3.1.4 Técnicas de Caracterização As membranas foram caracterizadas por meio de diferentes técnicas como Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Análise Termogravimétrica (TG), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Difração de Raios X e Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho (FTIR) no laboratório de Materiais Fotônicos, do Departamento de Química Geral e Inorgânica, no Instituto de Química - UNESP, Araraquara. As técnicas utilizadas na caracterização dos materiais foram:  Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV): são as principais ferramentas disponíveis para o estudo da estrutura fina da morfologia de materiais. As micrografias de varredura foram obtidas pelo equipamento JEOL JSM – 7500F Scanning Electron Microscope. As amostras foram recobertas com 10nm de carbono em um metalizador Coating System BAL-TEC MED 020 e mantidas em dessecador até o momento de análise;  Difração de Raios X: essa técnica permite realizar estudos morfológicos em materiais, determinando sua estrutura cristalina e sua fração percentual cristalina, para determinação da célula unitária de um dado elemento;  Análise Termogravimétrica (TG), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC): As curvas TG foram obtidas utilizando-se um equipamento TA Instruments e célula SDT. As condições utilizadas nos experimentos foram: 36 atmosfera de nitrogênio com fluxo contínuo de 70 mL e razão de aquecimento de 10°C por minuto. As curvas DSC foram obtidas utilizando-se um DSC modelo Q100 TA Instruments. As condições utilizadas nos experimentos foram atmosfera de nitrogênio com fluxo contínuo de 70 mL e razão de aquecimento de 10oC por minuto. Como referência usou-se cadinho de alumínio vazio.  Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho: Os espectros vibracionais na região do infravermelho para as amostras sólidas foram obtidos no espectrômetro FTIR, modelo Spectrum 2000 da Perkin Elmer em pastilhas de brometo de potássio (KBr). Espectro de amostra de CB foi realizado sob as seguintes condições: porcentagem de transmitância (%T) com um acúmulo de 32 varreduras, com resolução de 2 cm-1, na faixa de absorção de 4000-400 cm-1. As amostras foram trituradas e diluídas junto a uma pastilha de KBr.  Espectrofotocopia Eletrônica na região do UV-Visível: os espectros de UV-vis foram obtidos no espectrôfotometro de UV-Visível, modelo Varian Cary 500 e no Dimat/Dimci/Inmetro da Perkin Elmer, modelo Lambda 950. As medidas foram obtidas no intervalo de 200 a 600 nm com resolução de 1 nm.  Ensaios mecânicos: foram realizados em um equipamento DMA 2980V 1.7B Dynamic Mechanical Analyzer da TA Instruments, sendo 1 Newtom/min até 18 Newton (rampa de força), módulo – DMA Controlador de força, garra – Tração para filmes, força estática – 0,01N, temperatura da isoterma 35°C, tempo da isoterma 2 minutos em atmosfera – ar estático. O padrão utilizado consiste em uma lâmina de aço com dimensões: 30,50 mm de comprimento, 6,20 mm de largura e 0,15 mm de espessura. 3.1.5 Preparação da curva analítica do Ibuprofeno Os testes de liberação do Ibuprofeno da membrana pura, da CB/Ibu e os testes de permeação e retenção de Ibuprofeno foram realizados no Laboratório do Departamento de Fármacos e Medicamentos (FCFar/UNESP), de Araraquara. 37 Foram pesados 10 mg de Ibuprofeno, em balança de alta precisão (SIMADZU modelo AY 220), colocado em balão volumétrico de 10 mL, após dissolvido em tampão fosfato com 0,05M pH 7,2; considerado como solução estoque. Apos feito cálculo Ci. Vi=Cf. Vf, (Ci é a concentração inicial, Vi é o volume inicial e Cf é a contração final e o Vf é o volume final) para cada concentração final. A curva analítica de Ibuprofeno foi obtida a partir de diferentes concentrações desse fármaco diluído em solução tampão fosfato em 0,05M pH 7,2. Cada concentração foi preparada e analisada em triplicata por espectrofotometria de absorção no ultravioleta com comprimento de onda de absorção em 232 nm. As médias das absorbâncias, referentes a cada concentração, foram utilizadas para a construção de uma curva analítica. A equação da reta e o coeficiente de correlação foram calculados pela análise de regressão linear. 3.1.6 Estudo de liberação do Ibuprofeno em solução tampão fostato Para o estudo de liberação foram pesados 14,75 mg de Ibuprofeno em balança de alta precisão, colocado em um balão volumétrico de 10 mL e diluído com 5 mL de tampão fosfato 0,05 mol/L pH 7,2, considerado solução estoque. Após, cada célula doadora (Figuras 5 e 6) foi preenchida com 7 mL de tampão fosfato pH 7,2; uma membrana sintética de acetato de celulose 0,45 µm foi colocada separando o líquido da célula doadora, colocado uma fixação através de uma garra e colocado 295 µl de Ibuprofeno, da solução estoque, em seguida foram fechadas essas células doadoras e colocados em banho a 32,5°C, sob agitação mecânica constante a 300 rpm. As alíquotas de 2 mL foram coletadas conforme demonstra na Figura 6, nos tempos de 10 minutos, 30 minutos, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e de 24 horas, e analisadas por espectrofotometria de absorção no ultravioleta com o comprimento de onda a 232 nm. Os ensaios foram realizados em 6 réplicas e, após cada coleta, o volume do meio foi reposto automaticamente e utilizadas nos cálculos da quantidade real permeada. 38 Figura 5- Esquema da célula de difusão (Microette Plus-Hanson Research ®) empregada nos estudos de liberação e permeação cutânea in vitro. Fonte: Bemvindo (2006) Figura 6- Fotos do equipamento Microette Plus-Hanson Research ® empregada nos estudos de liberação e permeação cutânea in vitro. Fonte: Elaborado pela autora 3.1.7 Estudo de liberação da membrana de CB Para o estudo foi colocado a membrana pura no compartimento, substituindo a membrana sintética de acetato de celulose. 39 As alíquotas de 2 mL foram coletadas, nas mesmas condições que o item 3.1.6. 3.1.8 Estudo de liberação do Ibuprofeno na membrana de CB Para o estudo foi colocado a membrana impregnada com Ibuprofeno 0,5 mg/cm², substituindo a membrana sintética. As alíquotas de 2 mL foram coletadas, nas mesmas condições que a liberação do Ibuprofeno no item 3.1.6. 3.1.9 Estudo da permeação cutânea in vitro Para a realização do estudo de permeação e retenção cutânea de Ibuprofeno, foram utilizadas peles da orelha de porco, não escaldadas, fornecidas pelo Frigorífico Olhos D’água, logo após o abate rotineiro de animais para o consumo, não havendo necessidade de aprovação pelo comitê de ética. As orelhas foram lavadas em água destilada e dissecadas com o auxílio de uma pinça e bisturi. Em seguida, lavadas e dermatomizadas a 500 µm, obtendo-se o estrato córneo, epiderme e parte da derme. O estudo utilizou células de difusão tipo Franz com 1,77 cm² de área efetiva para liberação. O compartimento receptor foi preenchido com meio receptor tampão fosfato 0,05M pH 7,2. Cada pele da orelha de porco foi colocada na célula entre o compartimento doador e receptor, evitando a formação de bolhas. Acima da pele foi colocado uma membrana impregnada com Ibuprofeno com 0,5 mg/cm², após tampado e o sistema fechado com garra metálica. Foram utilizadas as mesmas condições de agitação, temperatura e tempo de coleta que o descrito para a liberação do Ibuprofeno no item 3.1.6. 40 3.1.10 Estudo de retenção cutânea in vitro Para análise de retenção cutânea, cada pele foi retirada do equipamento, após as 24 horas de ensaio de permeação cutânea in vitro. A membrana foi mantida em uma placa de vidro para a retirada do estrato córneo por tape stripping, para não haver perda do princípio ativo. Para tanto, foram utilizadas 16 fitas adesivas, descartando-se a primeira fita. As fitas foram transferidas para um tubo de ensaio com 5 mL de metanol, agitadas em vórtex por um minuto e posteriormente submetidos ao banho de ultrassom por 30 minutos. A solução foi filtrada em membrana com porosidade de 0,45 µm e analisadas por espectrofotometria de absorção no ultravioleta. Após a retirada do estrato córneo, verificou-se a retenção do fármaco na derme e epiderme, fragmentando o restante da membrana com o auxílio de uma tesoura. Os fragmentos foram colocados em tubo de ensaio com 5 mL de metanol e centrifugados, seguindo 30 minutos em banho de ultrassom e mais uma vez centrifugados por 5 minutos e após homogeneizados em equipamento tipo Turrax por um minuto. A solução foi filtrada em papel filtro e depois em membrana de 0,45µm e analisadas por espectrofotometria de absorção no ultravioleta. 3.1.11 Preparo das amostras para o ensaio de proliferação As amostras foram cortadas em círculos de cerca de 1 cm de diâmetro, obtendo-se quatro amostras de cada uma das membranas (celulose pura e CB/Ibu). Para esterilização das amostras, as mesmas foram mantidas no fluxo laminar sob luz ultra-violeta (UV) por 30 minutos. Após a esterilização, as membranas foram colocadas no interior de poços de uma placa TCPS com 24 poços estéreis. A placa foi mantida mais 30 minutos em fluxo laminar sob luz UV. Finalmente, os poços contendo amostras foram preenchidos com 200 µl de meio de cultura, e a placa foi mantida a 37°C com 5% de CO2 “overnight” no dia anterior ao do plaqueamento. 41 3.1.12 Cultura celular Fibroblastos da linhagem L929 (camundongo) foram mantidos em meio DMEM (Vitrocell®) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina (100 mg/mL) a 37ºC, 5% CO2. O meio de cultura foi trocado a cada dois dias. Para o ensaio de proliferação celular foi utilizado o reagente (alamarBlue®). As células foram tripsinizadas ao atingirem cerca de 80% de confluência, contadas em câmara de Neubauer e plaqueadas a 4 x 104 células poço sobre as amostras dos filmes. Para o controle, adicionou-se a mesma concentração de células em quatro poços vazios. 3.1.13 Proliferação Celular - Ensaio do AlamarBlue® Os ensaios de proliferação celular com fibroblastos foram realizados no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (LBBM/UFSCar), em São Carlos. O ensaio do alamarBlue foi utilizado para medir quantitativamente a proliferação, a viabilidade e a citotoxicidade relativa em várias linhagens celulares humanas ou animais, de bactérias ou de fungos (ABD SEROTEC, 2008). O alamarBlue apresenta um indicador de oxido-redução (REDOX), que tanto fluoresce como muda sua cor em resposta à redução química, a qual é resultado do crescimento celular em meio de cultura. O crescimento celular contínuo mantém um ambiente reduzido (fluorescente vermelho). Já a inibição do crescimento celular mantém um ambiente oxidado (não-fluorescente, azul) (ABD SEROTEC, 2008). Para verificar a influência da composição dos filmes no crescimento e viabilidade celular ao longo do tempo, fez-se o ensaio do reagente alamarBlue (Life Technologies™) dissolvido em 10% no meio de cultura. Antes do ensaio, o meio de cultura foi aspirado e, após aspiração, acrescentou-se 600 µl de solução de alamarBlue nos poços contendo as amostras de filmes e nos poços controle (sem amostras de filmes), e em dois poços vazios (controle negativo do alamarBlue). 42 As placas foram mantidas a 37°C + 5% CO2 por 4 horas. Após este período, 200 µl do sobrenadante de cada um dos poços foram transferidos para uma microplaca de 96 poços para a realização da leitura. Para calcular a porcentagem de redução relativa, também foi acrescentado, em quatro poços da microplaca de leitura, 200 µl de solução de Alamar Blue® completamente reduzido, que foi obtido autoclavando esta solução por 15 minutos, seguindo as orientações do fabricante (ABD SEROTEC, 2008). Fez-se a leitura da placa medindo os valores de fluorescência em um fluorímetro (SpectraMax i3 – Molecular Devices™), utilizando o espectro de 544 nm de excitação e 590 nm de emissão. Os valores de fluorescência, obtidos de cada uma das amostras, foi comparado com a média dos valores de fluorescência obtidos da solução de alamarBlue completamente reduzida, obtendo a porcentagem de redução relativa, de acordo com a equação 1: Equação 1 O ensaio foi feito em 3 e 5 dias, após o início do cultivo das células sobre os filmes. Os dados foram analisados estatisticamente, plotados em gráficos e interpretados. 3.2 Etapa 2 – Avaliação das úlceras em pacientes com feridas vasculares crônicas Para esta etapa, seguiu-se os preceitos da legislação sobre pesquisa envolvendo seres humanos (CONEP), Resolução 466 de 2012, assegurando o anonimato, confidencialidade das informações e a possibilidade de interrupção da participação da pesquisa, a qualquer tempo, sem prejuízo no atendimento realizado pelo SAD, USF e CMS, de Araraquara-SP. Os riscos previstos para os participantes desta pesquisa estavam relacionados à ocorrência de desconforto físico no local da ferida. Nestes casos, foi 43 assegurado que o estudo seria interrompido e o paciente encaminhado para os profissionais, nos seus respectivos locais de seguimento clínico, que eram no SAD, USF e CMS, além de uma avaliação de uma enfermeira estomaterapeuta em relação à utilização da cobertura de CB/Ibu e avaliação da ferida do paciente, para às devidas providências. A cobertura de CB/Ibu foi aplicada em uma amostra não probabilística, por conveniência de pacientes que eram acompanhados pelo SAD ou USF ou CMS no município de Araraquara-SP, após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Paulista – UNIP, CAAE: 36527414.7.0000.5512, com Parecer número: 911.647 (Anexo 1). Também foi solicitada aos participantes, a autorização para o registro fotográfico da evolução da ferida com a utilização da cobertura CB/Ibu. 3.2.1 Avaliação das úlceras dos participantes do estudo As úlceras dos participantes do estudo foram avaliadas antes, semanalmente durante e no máximo de 120 dias, com aplicação das membranas (CB/Ibu) nos curativos, realizados pela pesquisadora. A partir de fotografias com uma câmera digital (Sony Cyber-shot 14.1 mega pixels), as úlceras dos participantes, tiveram sua área total analisada através do software ImageJ 1.49, disponível gratuitamente na rede e desenvolvido por Wayne Rasband do Research Services Branch, National Institutes of Health - NIH (Bethesda, Maryland, EUA). Inicialmente, em do menu o ImageJ foi programado para calcular áreas de imagens, habilitando a caixa “Area”. Assim, quando a imagem era aberta pressionando-se , no menu e em seguida, era feita a calibração do ImageJ, com base em distância conhecida. Utilizando a ferramenta “Straight” do ImageJ, foi definido na régua (na direção da úlcera) o limite correspondente à 5 cm. Em do menu buscou-se na caixa “Distance in pixels”, o valor em pixels correspondente à dimensão estabelecida previamente com a régua. Era digitado então na caixa “Know distance“ o número “5” e digitado “cm” na caixa “Unit of lenght”. A caixa “Global” deve estar sempre habilitada. Abaixo, aparecia o valor da 44 relação entre a distância conhecida e desconhecida em pixels/cm. O software foi calibrado para cada imagem da ferida em análise. Com a ferramenta “Freehand selections” era traçado o contorno do leito da ferida, desconsiderando as áreas já reepitelizadas. Por fim, pressionando em do menu , obteve- se o valor da área traçada em cm2, tendo como base a calibração realizada em . Posteriormente aos cálculos das áreas de cada ferida pelo software ImageJ, era realizado o cálculo do índice de cicatrização das feridas (ICU) pela seguinte equação 2: Equação 2 Valores de ICU maiores que zero e menores que 1 foram estabelecidos para representar a diminuição da área lesada (reepitelização parcial), valores menores que zero para representar o aumento da área lesada e valores iguais a 1 para representar a reepitelização total, conforme Caetano et al. (2009) e Minatel et al. (2009). A área inicial da ferida para cada paciente foi determinada pela imagem do primeiro dia de tratamento e a área final pela imagem do último dia de tratamento ou dia da cura total. 3.2.2 Critérios de inclusão e exclusão Fizeram parte da pesquisa pacientes portadores de feridas crônicas de etiologia vascular, como pé diabético ou úlcera venosa, de ambos o sexo, maiores de 18 anos, moradores da cidade de Araraquara, que aceitaram participar da pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2). ICU = Área inicial – Área final Área inicial 45 3.2.3 Análise estatística A análise estatística e os gráficos foram feitos por meio de análise ANOVA two-way, com auxílio do software GraphPad Prism® (GraphPad, San Diego, CA, USA), com pós teste de Bonferroni. Valores p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes (n=4). 46 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados e a discussão desta pesquisa são apresentados em duas etapas: Etapa 1, em relação aos dados de desenvolvimento dos parâmetros ensaios físicos - químicos e de proliferação celular da produção da cobertura CB/Ibu; e na Etapa 2, a avaliação da evolução da utilização da CB/Ibu em pacientes com feridas vasculares crônicas e avaliação da evolução do processo de cicatrização. 4.1 Etapa 1 - Produção da cobertura de CB/Ibu: ensaios físicos - químicos, e de proliferação celular 4.1.1 Caracterização das membranas de CB 4.1.1.1 Ensaios de crescimento em massa e espessura de CB Foram realizadas várias técnicas de caracterização da membrana de CB pura. Na Tabela 1 e no Gráfico 1 estão representadas a relação do tempo de crescimento da bactéria American Type Culture Collection (ATCC) 23769 e a sua espessura obtida pelas membranas de CB, em 48, 72, 96 e 120 horas de produção. Observou-se que em relação à espessura e a transparência da membrana de CB, foram facilmente controladas, por meio do tempo de cultivo da bactéria (BARUD, 2010). Tabela 1- Produção da cobertura de CB úmida da cepa de ATCC segundo tempo de crescimento e espessura obtida, com respectivos valores de desvio padrão. ATCC Tempo de crescimento (horas) Média de espessura (mm) 48 1,1±0,02 72 1,3±0,02 96 1,6±0,02 120 1,9±0,07 Fonte: Elaborado pela autora 47 Gráfico 1- Relação entre o tempo de crescimento da cepa ATCC e a espessura da membrana úmida. Fonte: Elaborado pela autora Gráfico 2- Relação entre o tempo de crescimento e a média da massa obtida pela membrana CB 10x10cm com cepa ATCC. Fonte: Elaborado pela autora 48 Com o Gráfico 2 relacionamos o tempo de cultivo da bactéria e o seu crescimento em massa úmida para as membranas de CB ATCC. Houve um forte indício de que o aumento da massa se referia à presença de celulose, o que foi confirmado pelas medidas de Espectrofotômetro da Região do UV-vis (Figura 7). Por outro lado, na Figura 7, a porcentagem de transmitância (porcentagem de luz que atravessa a membrana) na região visível do espectro eletromagnético diminuiu em função do aumento da massa de CB. Esses resultados podem ser considerados relevantes, pois a transmitância foi normalizada pela espessura. Outra propriedade fundamental é a transparência da membrana seca de CB por possibilitar a avaliação do processo cicatricial sem a remoção da mesma (CASTRO; RIBEIRO FILHO; NOGUEIRA, 1988). Figura 7- Espectro UV-vis de CB com ATCC, segundo tempo de cultivo. 200 300 400 500 600 0 10 20 30 40 50 60 70 80 % T ra n sm itâ n ci a Comprimento de onda (nm) (a) (b) (c) (d) Fonte: Elaborado pela autora a: 2 dias de cultivo; b: 3 dias de cultivo; c: 4 dias de cultivo; d: 5 dias de cultivo. 49 4.1.1.2 Caracterização morfológica da membrana de CB e CB/Ibu A Figura 8 demonstra a membrana produzida com Gluconacetobacter xylinus (ATCC 23769) por imagem de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Observamos uma estrutura compacta formada por fibras longas, com centenas de mícrons de espessura nanométrica, denominadas de “nanoceluloses” (CZAJA et al., 2006). A CB apresentou na sua estrutura fitas ultrafinas com comprimentos que variaram de 1 a 9 nm e que formam uma densa estrutura reticulada, estabilizada por extensas ligações de hidrogênio, conforme relatado por Henrique; Cereda; Sarmento (2008). Além disso, observam-se fitas ultrafinas com comprimentos que variaram de 3- 8 nm e uma densa estrutura reticulada, estabilizada por extensas ligações de hidrogênio, como evidenciado por Czaja et al. (2006). As Figuras 8B, 8C e 8D demonstram a CB/Ibu em diferentes concentrações; não se observou nenhuma alteração na morfologia das membranas com Ibuprofeno, comparativamente à morfologia da membrana de CB pura (Figura 8A). Trovatti et al. (2012) recomenda a utilização da CB por sua estrutura nanométrica, de morfologia fibrilar tridimensional e ramificada, o que permite ampla aplicação na área biomédica. 50 Figura 8- Comparação microscópica da membrana seca de CB e de CB/Ibu em diferentes concentrações, com ampliação de 30000X. 8A- CB pura 8B- CB/Ibu 0,5 mg/cm2 8C- CB/Ibu 0,25mg/cm2 8D- CB/Ibu 0,1mg/cm2 Fonte: Elaborado pela autora Na Figura 9 são apresentados os resultados da espectroscopia de energia dispersiva (EDS) da CB ATCC. 51 Figura 9- Espectroscopia de Energia Dispersiva de membrana produzida por (ATCC 23769). Fonte: Elaborado pela autora Ao final do processo de produção de CB, tornou-se necessário a purificação das membranas para remoção de sais e bactérias, que poderiam estar presentes entre as fibras de celulose. O procedimento mais utilizado é a purificação com meio alcalino, geralmente em solução diluída de hidróxido de sódio, que foi adotado em outros estudos, com comprovação de sua eficácia técnica (WU; LIA, 2008). Este resultado obtido por Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS), Figura 9, indica fortemente a eficiência alcançada com o processo de purificação da membrana. Ainda, observou-se que apenas os constituintes orgânicos estavam presentes, sendo que a presença de carbono e oxigênio foi decorrente da estrutura química de CB. 4.1.1.3 Caracterização Estrutural da membrana de CB Os resultados de espectroscopia vibracional na região do infravermelho para a membrana de CB ATCC estão demonstrados na Figura 10. 52 Figura 10- Espectroscopia vibracional da área de incidência do Infravermelho na CB de ATCC pura. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 T ra n s m it â n c ia ( % ) Numero de onda (cm -1 ) CB (ATCC) Fonte: Elaborado pela autora As principais bandas que caracterizaram a CB foram: 3500 cm-1: estiramento OH; 2900 cm-1: estiramento CH de alcanos e estiramento assimétrico CH2; 2700 cm- 1: estiramento simétrico CH2; 1640 cm-1: deformação OH; 1400 cm-1: deformação CH2; 1370 cm-1: deformação CH3; 1340 cm-1: deformação OH e 1320-1030 cm-1: deformação CO, dados semelhantes a esses foram encontrados por Kakuráková et al (2002). A Gluconacetobacter xylinus (ATCC 23769) confirmou o perfil espectral característico de celulose, e também não indicou a formação de subprodutos ou contaminantes, o que confirmou a eficiência do processo de purificação realizado. As principais bandas que caracterizaram a CB (Figura 10) foram representadas pelo traçado do gráfico “e”, e suas respectivas atribuições, que foram: 3500 cm-1: estiramento OH; 2900 cm-1: estiramento CH de alcanos e estiramento assimétrico CH2; 2700 cm-1: estiramento simétrico CH2; 1640 cm-1: deformação OH; 1400 cm-1: deformação CH2; 1370 cm-1: deformação CH3; 1340 cm-1: deformação OH e 1320- 1030 cm-1: deformação CO (KAKURÁKOVÁ et al., 2002). 53 No Ibuprofeno (traçado de gráfico “10a”) as principais bandas observadas foram: 1550, 1357, 1287, 1064, 790 e 585 cm-1, que corroboram os resultados de Solano, (2013), Carmignan et al., (2006) e Pere, (2014), que descreveram bandas do Ibuprofeno, com picos característicos situados em 1721 cm-1 e 1185 cm-1, o que representa os grupos C=O e C-O do grupamento carboxila da molécula, além dos picos situados em 1273, 1232, 870 e 779 cm-1, referentes à presença de hidrocarboneto aromático, com deformação angular do grupo C-H (no plano). Figura 11- Avaliação da CB pura, do Ibuprofeno puro e das membranas CB/Ibu, com diferentes concentrações, segundo os espectros do FTIR. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 CB/Ibu 0,1 CB/Ibu 0,25(c) (b) T ra n s m it â n c ia ( u .a .) Número de onda (cm -1 ) (a) Ibuprofeno (e) CB/Ibu 0,5 (d) CB Fonte: Elaborado pela autora a: Ibuprofeno; b:CB/Ibu 0,5 mg/cm²; c: CB/Ibu 0,25 mg/cm²; d: CB/Ibu 0,1 mg/cm²; e: CB pura. Em um estudo de Wahab, Khan, Khan (2013) com o ibuprofeno puro foram observados picos característicos em 1706 cm-¹, que correspondem ao ácido 54 carboxílico (COOH) presente no ibuprofeno. Outros picos menores nesta região 1200-1000 cm- 1 foram relacionados ao anel benzênico. Nessa pesquisa, observou-se que os espectros das amostras de CB/Ibu (traçado gráfico “b”, “c” e “d”, Figura 11), foram semelhantes, revelando que não houve o surgimento de novas bandas. Os espectros obtidos, a partir das CB/Ibu, revelaram a presença de picos característicos do fármaco Ibuprofeno, sobrepostos aos da CB, sem alteração visível nos seus comprimentos de onda. Resultados semelhantes foram relatados por Carmignan et al. (2006). 4.1.1.4 Difração de Raios X A Figura 12 representa os resultados do teste de Difração de Raios X para as membranas de CB pura e CB/Ibu, em diversas concentrações e a Figura 13, a difração de Raios X do Ibuprofeno puro. 55 Figura 12- Teste de difração de Raios X, na CB pura e CB/Ibu, em diferentes concentrações. 10 20 30 40 50 (c) CB/Ibu 0.25 (d) CB/Ibu 0.5 (b) CB/Ibu 0.1 In te n s id a d e ( u .a .) 2( o ) (a) CB pura Fonte: Elaborado pela autora a: CB pura; b: CB/Ibu 0,1mg/cm²; c: CB/Ibu 0,25mg/cm² ; d: CB/Ibu 0,5mg/cm². 56 Figura 13- Difração de Raios X do Ibuprofeno puro. 10 20 30 40 50 In te n s id a d e ( u .a .) 2 ( o ) Ibuprofeno Fonte: Elaborado pela autora Na Figura 12, traçado de gráfico “a”, os dois picos intensos, localizados em 15 e 22,5 graus, foram atribuídos à CB. Cada pico difratado apresentou uma contribuição das difrações correspondentes às fases Iα e Iβ, referente às sobreposições das reflexões dos planos 100Iα, 110Iβ e 010Iα em 15° e dos planos 110 Iα e 200 Iβ em 22,5° (sobreposição) (BARUD, 2010). Na Figura 13 observou-se picos afinados em torno de 11, 22 e 30°, juntamente com outros picos de menor intensidade, o que indica que o Ibuprofeno puro é um fármaco altamente cristalina, segundo Wahab, Khan, Khan (2013). No difratograma da CB pura (traçado “a”), dois picos de difração intensos localizados em 15 e 22,5° foram observados. Cada pico difratado apresentou uma contribuição das difrações correspondentes às fases I α e I β, referente às sobreposições das reflexões dos planos 100Iα, 110Iβ e 010Iα em 15° e dos planos 110 Iα e 200 Iβ em 22,5° (sobreposição) (BARUD, 2010). No difratograma da amostra CB/Ibu de concentração 0,5mg/cm² (traçado gráfico “d” da Figura 12) não ocorreu alteração dos picos localizados em 15 e 22,5°, 57 o que indica que a incorporação da CB/Ibu não afetou a cristanilidade da CB. Nas demais concentrações de 0,25 mg/cm² e 0,1 mg/cm² (traçado gráfico “c” e “b”, respectivamente da Figura 12), houve alteração nos padrões de difração, o que pode estar relacionado à presença do Ibuprofeno, inserido na estrutura da CB (MORAES, 2013; TROVATTI et al., 2012). Os dados de difração de Raios X foram utilizados para estimar a cristalinidade, de acordo com um método, conhecido como Método de Segal (BARUD, 2010; SEGAL et al.,1954), que utiliza a equação 3. Nesta equação, utiliza- se a altura do pico (200) e o mínimo entre os picos (200) e (100), assumindo-se que a Intensidade do pico (200), representa a parte cristalina e a parte amorfa é representada pela intensidade da difração em 2 = 18°. Assim, temos: Equação 3 CrI= [I(200) – I (am)] / I(200)] Onde CrI é o índice de cristalinidade, I(200) é a intensidade do pico (200) (2=22,5) e I(am) é a intensidade do mínimo entre os picos (110) e (200), sendo 2 = 18°. Nesta pesquisa, a cristalinidade da CB/Ibu 0,5mg/cm², foi correspondente à 80%, da CB/Ibu 0,25mg/cm² à 83% e CB/Ibu 0,1mg/cm² à 82%, dados bastante semelhantes e que corroboram com o índice de cristalinidade para a CB pura de 81%, encontrado por Barud (2010). A cristalinidade do Ibuprofeno puro encontrada por Solano (2013) foi de 80,3%. O que se observou em alguns trabalhos como de Gao et al. (2010) com a adição de um sal à matriz de celulose como sais de fosfato e cálcio, é que ocorre uma diminuição na cristalinidade da CB, em função das ligações de hidrogênio formadas entre a CB e o sal. Nesta pesquisa, a adição do sal não ocasionou a diminuição da cristalinidade da celulose (os valores de cristalinidade obtidas pelas amostras CB/Ibu foram próximos e/ou ligeiramente superiores aos encontrados para CB pura), o que indica que as ligações de hidrogênio da celulose foram mantidas e a CB foi reforçada pela 58 adição do sal de Ibuprofeno. Isto provavelmente está relacionado à formação de algumas ligações de hidrogênio entre a CB e o Ibuprofeno, porém, sem desfazer as ligações de hidrogênio intramoleculares da CB. Este reforço foi confirmado pelos resultados do ensaio mecânico. 4.1.1.5 Caracterização Térmica - Termogravimetria A Figura 14 representa a curva termogravimétrica e curva DTG (TG/DTG), obtidas para CB ATCC. Figura 14- Caracterização Térmica - Termogravimetria da CB da cepa ATCC, segundo perda de massa. 0 100 200 300 400 500 600 0 20 40 60 80 100 P e rd a d e m a s s a ( % ) Temperatura �(°C) T=358°C Fonte: Elaborado pela autora Nas curvas TG/DTG observou-se a perda de massa de aproximadamente 5% na faixa de temperatura entre 45 e 150ºC. Essa perda de massa pode ser atribuída à desidratação da CB, como, por exemplo, evaporação de água adsorvida. Um evento acentuado com grande perda de massa (aproximadamente 60%) foi observado na 59 faixa de temperatura, que compreendeu o intervalo de 250ºC e 400ºC, assim como máximo de perda, quando se aproximou de 360°C como pode ser verificado nas duas curvas DTG (BARUD, 2010). Pode-se inferir que não houve diferença na estabilidade térmica da membrana produzida pela bactéria Gluconacetobacter xylinus (ATCC 23769). Conforme revelou a Temperatura onset (Tonset) indicada na curva DTG, com a linha pontilhada, a decomposição ocorre em temperaturas praticamente iguais. Observando-se que não possui resíduos nas curvas TG, também pode-se inferir que não houve presença de sais ou outros contaminantes, somente a formação de resíduos carbonáceos. Figura15- Calorimetria do Ibuprofeno e da CB/Ibu em diferentes concentrações. -50 0 50 100 150 200 (d) CB/Ibu 0.5 (c) CB/Ibu 0.25 (b) CB/Ibu 0.1 F lu x o d e C a lo r (m W .m g -1 ) Temperatura (  C) (a) Ibuprofeno Fonte: Elaborado pela autora a: Ibuprofeno; b: CB/Ibu 0,1mg/cm²; c: CB/Ibu 0,25mg/cm²; d: CB/Ibu 0,5mg/cm² Observou-se que o ponto de fusão do Ibuprofeno (traçado de gráfico “15 a”) 60 ocorreu a 100°C, onde foi observado um pico endotérmico afinado. Um pico endotérmico alargado, com o máximo em 126°C, também foi observado, o que pode ser atribuído às moléculas de água adsorvidas (Vaz, 2012). O valor do ponto de fusão encontrado neste trabalho foi diferente do encontrado por Wahab; Khan, Khan (2013) de 76.94°C. Essa alteração também aconteceu na interação CB/Ibu, onde foi verificado uma diminuição nos picos, nas diferentes concentrações, contudo podemos concluir semelhantemente à Wahab; Khan, Khan (2013), ou seja, a perda do pico pode decorrente da conversão da forma cristalina para a forma amorfa do fármaco. Nos traçados de gráfico “15 b” e “15 c”, as curvas DSC mostraram picos endotérmicos alargados com os máximos em 104°C e 114°C, respectivamente, referentes possivelmente à presença de água adsorvida. O pico afinado, em torno de 100°C, da fusão do Ibuprofeno, não foi observado, provavelmente, em decorrência da baixa concentração do fármaco nas amostras de CB/Ibu 0,1 mg/cm2 e de CB/Ibu 0,25 mg/cm2. A curva DSC da amostra CB/Ibu 0,5 mg/cm2 (traçado gráfico “15 d”) mostra um pico endotérmico afinado em ~93°C, referente à fusão do Ibuprofeno. Um pico endotérmico alargado, com o máximo em 117°C, também foi observado (referente à água adsorvida). Uma terceira banda, alargada e de menor intensidade, com o máximo em 244°C, estava presente, o que pode estar relacionada à degradação da molécula de Ibuprofeno. Estes resultados apontaram que, somente nesta concentração, comparativamente às estudadas nesta pesquisa, foi possível observar o comportamento térmico do Ibuprofeno inserido na matriz de CB. Na entalpia conforme a Tabela 2, o pico do Ibu ∆Hf = 120,3 J/g e o pico total de ∆Hp = 314,9 J/g, essa diferença foi a água. O Ibu na membrana de CB na porcentagem de 0,5 mg/cm2, apresentou uma fração na forma cristalina, mas nas outras porcentagens somente apareceu água. 61 Tabela 2- Entalpias do Ibuprofeno sódico e da CB/Ibu, em diferentes concentrações. ∆Hp J∕g Tp Ibuprofeno sódico Pico Total (Ibu + H2O) 314,9 T1= 100,580C T2= 118,970C Ibuprofeno sódico Ibu cristalino ∆Hf=120,3 T=100,580C T onset= 99,070C CB/Ibu 0,5 mg/cm2 Total (Ibu+H2O) 96,14 T1= 93,190C T2= 117,080C CB/Ibu 0,5 mg/cm2 Ibu Cristalino ∆Hf=10,71 T= 93,190C T onset= 86,260C CB/Ibu 0,25 mg/cm2 81,51 112,810C CB/Ibu 0,1 mg/cm2 119,2 103,430C Fonte: Elaborado pela autora 4.1.1.6 Ensaios mecânicos Os ensaios mecânicos possibilitaram a obtenção dos resultados de Tensão, Deformação e Módulo de Young das membranas de CB, produzidas por Gluconacetobacter xylinus (ATCC 23769) (Tabela 3). Tabela 3- Curvas de Tensão, Deformação e Módulo de Young das membranas de CB pura e CB/Ibu, com as respectivas média e desvio padrão. Amostra Tensão (MPa) Deformação (%) Módulo de Young (MPa) CB-Pura 41,5 ± 4,0 2,5± 0,3 1,5± 0,2 CB-Ibu 0,1mg/cm² 69,6± 3,7 1,2± 0,2 3,0± 0,4 CB-Ibu 0,25mg/cm² 93,0± 7,6 1,4± 0,1 5,3± 0,2 CB-Ibu 0,5mg/cm² 84,1± 2,3 2,3± 0,4 6,6± 0,2 Fonte: Elaborado pela autora 62 No caso da CB, a densidade das ligações de hidrogênio foi superior à daquela encontrada na celulose das plantas, pois o diâmetro das fibras foi menor e que constitui uma das principais razões da CB apresentar um elevado módulo de Young (BARUD, 2010). Os resultados de Gonsales et al. (2013) para CB pura (159± 23 MPa e Módulo Young 17 ± 1 MPa), são maiores em relação aos encontrados neste trabalho (tensão na ruptura 41,5± 4 MPa e módulo de Young 1, 5 ± 0,2MPa e, que também, divergem dos dados de Lin et al (2013) para CB pura (14,7±2,0MPa e módulo de Young 33,5±4,1). Alguns fatores podem alterar a resistência à tração de amostras celulósicas, entre eles, (1) a capacidade média de suporte de carga das fibras individuais; (2) o número de fibras de qualquer seção transversal dada disponível para a transferência de carga e (3) a uniformidade da transferência de carga permitida pela estrutura da rede (CSÓKA et al., 2012). Fatores como espessura da membrana e condições de síntese da mesma, também podem afetar as propriedades mecânicas da CB. Os resultados dos ensaios mecânicos podem variar entre diferentes situações, como tempo de cultura, suplemento médio ou pós-tratamento (CAI; YANG, 2011). Observou-se que o alongamento até a ruptura aumentou, de acordo com as diferentes concentrações de Ibuprofeno 0,1mg/cm² (69,6 ± 3,7) 0,25mg/com² (93,0 ± 7,6) e 0,5mg/cm² (84,1 ± 2,3). Com a incorporação de Ibuprofeno, possivelmente ocorreu uma interação entre as cadeias da CB e a molécula de Ibuprofeno, sendo que este atuou com rigidez e diminuiu a plastificação das cadeias de celulose. O aumento desta propriedade é um fator importante na preparação de dispositivos biocompatíveis para uso na área biomédica (GONSALES et al., 2013). Em trabalho relatado na literatura, a incorporação de poliuretano em CB produziu um decréscimo significativo da tensão na ruptura (12 ± 2 MPa) e no módulo de Young (2,57 ± 0,02 MPa) das amostras, em comparação à membrana de CB pura (159 ± 23 MPa e 17 ± 1 MPa). Porém, quando se avaliou o alongamento, houve um aumento até a ruptura para a membrana de PU/CB (7 ± 1%) quando comparada às membranas puras de CB (3,2 ± 0,3%) e de PU (3,8 ± 0,4%) (GONSALES et al., 2013). 63 Com os resultados deste estudo corroboramos que o aumento na resistência pode ser importante na confecção de dispositivos flexíveis e biocompatíveis para uso na área biomédica como a confecção de coberturas de CB/Ibu para as úlceras venosas crônicas. 4.1.1.7 Curva de analítica do Ibuprofeno Moffat; Osselton; Widdop (2004) descreveram várias metodologias para determinação do Ibuprofeno, entre elas encontra-se a espectrofotometria de absorção no ultravioleta. Para tal, uma curva analítica do fármaco foi construída, utilizando-se soluções de Ibuprofeno, com comprimento de onda de 232nm, com R²= 0,99479, sendo que o critério mínimo aceitável pela ANVISA é de 0,99 (ANVISA, 2003). A curva de concentração do Ibuprofeno versus as absorbâncias, assim como a equação da reta e coeficiente de correlação encontram-se na Figura 16. Figura 16- Curva analítica do Ibuprofeno obtida por espectrofotometria de absorção no ultravioleta. 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 In te ns id ad e (u .a .) Concentraçao (mg/ml) R2 = 0.99479 y=0.041 + 11.625*x Fonte: Elaborado pela autora 64 Na faixa de concentração testada, com o método usado, houve um comportamento linear significativo. A ausência de erro sistemático constante também foi verificada, uma vez que os valores do intervalo de confiança do intercepto incluíram o valor zero (Tabela 4). Tabela 4- Análise dos dados da regressão obtidos a partir da curva analítica do Ibuprofeno por espectrofotometria de absorção no ultravioleta. Parâmetros de regressão Valores Intercepto (intervalo de confiança) 0,041 Inclinação (intervalo de confiança) 11,625 R² 0,99479 Fonte: Elaborado pela autora 4.1.1.8 Liberação acumulativa do Ibuprofeno A Figura 17 ilustra o ensaio do perfil de liberação do Ibuprofeno. 65 Figura 17- Ensaio do perfil de liberação do Ibuprofeno em 24 horas. 0 5 10 15 20 25 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Ibuprofeno L ib e ra ça o d e I b u p ro fe n o ( m g ) Tempo (horas) Fonte: Elaborado pela autora O perfil de liberação do Ibuprofeno, obtido pelo método da diálise, além de apresentar um maior volume envolvido, as partículas ficaram separadas do meio por uma membrana, o que facilitou as coletas. No entanto, ocorreu um lento equilíbrio da concentração de fármaco entre membrana e o meio, devido à pequena área de superfície da mesma. Isto pode limitar a análise precisa dos percentuais iniciais de libe