RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 21/02/2022. UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Campus de Botucatu Instituto de Biociências SISTEMA FOLICULAR: UM NOVO PROTOCOLO PARA A MATURAÇÃO OOCITÁRIA IN VITRO. EFEITOS NA DIFERENCIAÇÃO DO COMPLEXO CUMULUS-OÓCITO E PRODUÇÃO EMBRIONÁRIA ANA CAROLINE SILVA SOARES Botucatu – SP 2020 UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Campus de Botucatu Instituto de Biociências SISTEMA FOLICULAR: UM NOVO PROTOCOLO PARA A MATURAÇÃO OOCITÁRIA IN VITRO. EFEITOS NA DIFERENCIAÇÃO DO COMPLEXO CUMULUS-OÓCITO E PRODUÇÃO EMBRIONÁRIA ANA CAROLINE SILVA SOARES Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP, para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia e Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. José Buratini Junior Co-orientador: Prof. Dr. Alberto Maria Luciano Botucatu – SP 2020 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 Soares, Ana Caroline Silva. Sistema folicular : um novo protocolo para a maturação oocitária in vitro. Efeitos na diferenciação do complexo cumulus-oócito e produção embrionária / Ana Caroline Silva Soares. - Botucatu, 2020 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: José Buratini Junior Coorientador: Alberto Maria Luciano Capes: 21000000 1. Técnicas In Vitro. 2. Técnicas de maturação in vitro de oócitos. 3. Oócitos. 4. Oogênese. Palavras-chave: OPU; PIV; maturação in vitro; oócito; vesícula germinativa. 4 “Nada na vida deve ser temido, somente compreendido. Agora é hora de compreender mais para temer menos.” Marie Curie 5 Sumário Agradecimentos...................................................................................................................06 Resumo................................................................................................................................07 Introdução............................................................................................................................08 Revisão de Literatura...........................................................................................................09 Fisiologia do ciclo estral bovino.............................................................................09 Fisiologia da maturação..........................................................................................14 Configuração da cromatina em vesícula germinativa.............................................18 Hipótese................................................................................................................................22 Objetivo geral.......................................................................................................................22 Capítulo I..............................................................................................................................23 Abstract....................................................................................................................24 Introduction..............................................................................................................24 Materials and methods.............................................................................................25 Results......................................................................................................................26 Discussion................................................................................................................28 References................................................................................................................29 Capítulo II............................................................................................................................31 Abstract....................................................................................................................34 Introduction.............................................................................................................35 Materials and methods............................................................................................37 Results......................................................................................................................41 Discussion................................................................................................................42 References................................................................................................................46 Figures.....................................................................................................................50 Considerações Finais...........................................................................................................54 Referências..........................................................................................................................56 6 Agradecimentos Aos meus familiares por se fazerem presentes apesar da distância e pelo apoio e amor incondicional. Ao meu orientador, José Buratini pela confiança e companheirismo que me motivam a seguir com entusiasmo. Aos co-orientadores Alberto Luciano e Valentina Lodde, por formar e transformar minha visão sobre a ciência e sobre a vida. Ao Eduardo por ser exemplo na vida acadêmica e no amor, caminhar de mãos dadas com você deixa a vida mais leve. Aos colegas de laboratório, Thaisy, Jhessica, Isabela e Isabella, pela prontidão e disposição com os problemas do dia a dia e madrugada a fora. Mais uma vez à Thaisy, pelo sertanejo e por ter assumido a responsabilidade. Ao Rodrigo por ser amigo fiel e estar comigo no bom e mau comportamento, nas boas e péssimas ideias durante todo o caminho acadêmico. Às companheiras de jornada Fernanda, Priscila e Elisa por dividirem as angústias, vitórias e insumos laboratoriais, pela mão amiga na vida e nos experimentos; compartilhar tantos momentos com vocês deixou a vida mais feliz. Ao Ramon, por ser o Ramon. Ao Anthony por dividir as alunas, o conhecimento e a amizade. Aos amigos do “coffee break”, Vinícius, Maycon, Larissa, Gabriela e Rie pelos momentos de alegria e descontração mesmo nos dias ruins. À Fernanda Drudi por compartilhar a casa e pela intensa amizade. Aos professores e funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, pelo apoio diário e dedicação ao trabalho. Aos membros da banca pela disponibilidade e por me permitirem a oportunidade de enriquecer o conhecimento. À Capes e à Fapesp, pela concessão da bolsa de doutorado (2016/21671-9) e pelo suporte financeiro para realização deste trabalho (2017/07588-4). 7 Resumo A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos tem sido utilizada para aumentar a fertilidade e a velocidade do melhoramento genético em rebanhos de corte e leite, embora sua eficiência seja reconhecidamente baixa, principalmente em rebanhos leiteiros. A maturação oocitária in vitro (MIV) é considerada o principal gargalo tecnológico da PIV já que os protocolos vigentes não refletem a fisiologia e determinam descompasso entre a maturação nuclear e citoplasmática do oócito. Os oócitos submetidos à MIV são oriundos de folículos em diferentes fases de desenvolvimento e heterogêneos quanto ao grau de condensação da cromatina e estoques de transcritos importantes para o desenvolvimento embrionário inicial. Este projeto investigou um novo sistema para MIV, que inclui estratégia para obtenção de população homogênea de oócitos associado a um sistema de cultivo sequencial ajustado à fase de maturação dos oócitos recuperados, denominado fase pré-MIV do Sistema Folicular, que mimetiza as condições intrafoliculares antes da ovulação. Os experimentos aqui propostos têm como objetivo a caracterização da população oocitária quanto a configuração da cromatina nas raças Holandesa e Nelore, além da validação de uma estratégia para obtenção de oócitos homogêneos de doadoras Holandesas com e sem a associação da fase pré-MIV do Sistema Folicular na modulação do estágio de vesícula germinativa (GV – “germinal vesicle”). Este projeto direciona o estudo para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de protocolos para a sincronização ovariana das vacas doadoras e para os cultivos sequenciais, que buscam mimetizar as condições intrafoliculares visando melhorar as taxas de blastocisto tanto em quantidade quanto em qualidade. 8 Introdução O emprego das biotécnicas da reprodução tem como um de seus objetivos otimizar o potencial reprodutivo da fêmea por meio do aproveitamento daquelas células germinativas que entrariam em atresia fisiológica, uma vez que os ovários de um animal em idade reprodutiva estão repletos de folículos imaturos que não chegam a ovular. Com isto, diversas biotecnologias reprodutivas têm sido aprimoradas, tais como superovulação seguida de transferência de embriões (TE) e produção in vitro de embriões (PIV), esta última compreendendo a maturação in vitro (MIV), a fecundação in vitro (FIV) e o cultivo in vitro (CIV). Essas biotecnologias, embora comercialmente viáveis, tiveram progresso limitado nos últimos anos, e o aumento da eficiência destas teria grande impacto sobre a produção de embriões bovinos e, consequentemente, sobre a produtividade dos rebanhos. Especialmente agora, com a disponibilidade de novas abordagens genômicas para a identificação precoce de animais superiores, o que impulsiona o melhoramento animal (Webb and Buratini 2016). Contudo, os sistemas de cultivo não conseguem mimetizar em laboratório o ambiente in vivo, o que resulta em descompasso entre a maturação nuclear e citoplasmática dos oócitos e alterações epigenéticas nos embriões, que comprometem a eficiência da PIV (Machatkova et al. 2004). A maturação oocitária apresenta-se como um dos principais gargalos da PIV, já que sua eficiência é amplamente superior quando realizada in vivo (Rizos et al. 2002; Farin et al. 2007). O ambiente folicular permite que o oócito se mantenha em parada meiótica, denominada também como estágio de vesícula germinativa (GV – “germinal vesicle”) e, posteriormente, após o pico ovulatório do hormônio luteinizante (LH), fatores intrafoliculares induzem a retomada da meiose e a diferenciação do cumulus (revisado por Gilchrist 2011). 9 Como descrito por Lodde et al. 2007, a condensação da cromatina de oócitos bovinos no estágio de GV ocorre de maneira gradual até a quebra da vesícula germinativa (GVBD – “germinal vesicle breakdown”). A crescente condensação da cromatina é acompanhada pela redução da atividade transcricional do oócito em fases sequenciais conhecidas como GV0, GV1, GV2 e GV3. A grande maioria dos oócitos presentes em folículos antrais jovens encontra-se em GV0, quando são transcricionalmente ativos, mas incapazes de progredir até a meiose II (MII). A competência para completar a MII e para a fecundação aumenta gradativamente entre GV1 e GV3. Oócitos bovinos obtidos post mortem a partir de ovários de abatedouro ou através de aspiração folicular in vivo por OPU (“ovum pick up”) em momentos aleatórios do ciclo estral são heterogêneos do ponto de vista da fase de maturação nuclear, distribuindo-se entre GV0 e GV3. Os protocolos correntes para MIV-PIV submetem essa população heterogênea de oócitos a um protocolo de cultivo único com estímulo gonadotrófico suprafisiológico que, independentemente da fase de maturação em que o oócito se encontra, precipita a interrupção da comunicação cumulus-oócito e, consequentemente, a condensação da cromatina, antes que os transcritos oocitários necessários para sustentar o desenvolvimento embrionário inicial se acumulem (Lodde et al. 2007, 2008; Luciano et al. 2011). O conhecimento dos mecanismos intrafoliculares que controlam a maturação oocitária e sua aplicação nos sistemas de cultivo apresenta-se como alternativa promissora para a melhoria da MIV, que deve proporcionar a progressão da meiose em perfeita sincronia com a maturação do citoplasma do oócito (Sánchez and Smitz 2012). Visando melhorar a MIV, várias modificações no sistema de cultivo têm sido propostas, tais como o estabelecimento de duas fases de cultivo, incluindo uma fase de pré- maturação do complexo cumulus-oócito na presença de inibidores da maturação nuclear, 10 majoritariamente inibidores de fosfodiesterases oocitárias ou moduladores de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) (Albuz et al. 2010; Richani et al. 2014; Santiquet et al. 2017; Razza et al. 2018). Esses agentes farmacológicos elevam a concentração de AMPc no oócito, o que retarda a retomada da meiose (Sirard and Coenen 1993; Machatkova et al. 2004). Recentemente nosso laboratório iniciou o desenvolvimento de um sistema para MIV com duas fases de cultivo denominado Sistema Folicular. O intuito do Sistema Folicular é expor, em um primeiro momento, os complexos cumulus-oócito (COCs) a um ambiente semelhante ao encontrado no folículo dominante, capaz de promover melhor sintonia entre a maturação nuclear e citoplasmática do oócito, bem como a diferenciação adequada das células do cumulus e a manutenção funcional das junções comunicantes entre cumulus e oócito (fase pré-MIV). Em seguida, na segunda fase do cultivo (fase MIV), o Sistema Folicular objetiva induzir a maturação final do COC pela ativação da cascata bioquímica e molecular de indução ovulatória iniciada nas células do cumulus por meio de agentes fisiológicos (Soares et al. 2017). Associado ao Sistema Folicular, utilizamos neste trabalho estratégias para a sincronização da atividade folicular na vaca doadora antes da OPU a fim de proporcionar uma população mais homogênea de oócitos e em estágio de maturação compatível com o sistema de cultivo. O presente trabalho teve como objetivo identificar os padrões de configuração da cromatina em estágio de GV em gado de leite Bos taurus (Holandês) e de corte Bos indicus (Nelore). Além da validação de protocolo de sincronização da atividade folicular e avaliação da produção embrionária em doadoras da raça Holandesa, também avaliamos parâmetros da associação da sincronização com a fase pré-MIV do Sistema Folicular. Neste trabalho, o foco principal dos estudos são vacas Holandesas devido às taxas extremamente baixas atingidas 11 por esta raça na PIV em virtude de sua baixa qualidade oocitária inerente a condições metabólicas particulares (Sartori et al. 2010; Leroy et al. 2011; Baruselli et al. 2012). 54 Considerações finais Ao longo do desenvolvimento deste projeto, algumas alterações precisaram ser feitas para melhorar o conteúdo do trabalho. Substituímos a investigação dos efeitos do sistema folicular sobre a expressão gênica nas células do cumulus, como citado no título do trabalho, por uma série de experimentos a campo que permitiram o aperfeiçoamento das estratégias de sincronização para a raça Holandesa, além de uma estratégia capaz de modular o estágio de GV por meio de cultivo pré maturação in vitro, e os impactos do protocolo sobre a produção e qualidade embrionária. Nossos resultados demonstram relatos nunca citados na literatura, como a ocorrência de diferentes padrões de configuração da cromatina na população de oócitos recuperados em um dia aleatório do ciclo estral entre vacas Nelore e Holandesa, elucidando mais um parâmetro dentre as diferenças na fisiologia reprodutiva nestas duas raças. Esses padrões distintos podem ajudar a explicar, pelo menos em parte, o desempenho superior das doadoras Nelore em protocolos para PIV. Além disso, desenvolvemos um protocolo de sincronização para vacas Holandesas que proporciona a obtenção de uma população oocitária majoritariamente em GV2 e com maior competência para o desenvolvimento, e a modulação dessa população quando associada à fase pré-MIV de cultivo do sistema folicular resulta em uma população de oócitos predominantemente em GV3. Nossos achados corroboram com trabalhos anteriores que indicaram que o estágio de GV2 representa a categoria mais preparada para o desenvolvimento subsequente, sendo considerado o “padrão ouro” para a PIV. Demonstramos que quando a população de oócitos submetidos à MIV se apresenta majoritariamente em estágio de GV2, pode ser alcançado um desempenho muito maior, aumentando a taxa de blastocisto em cerca de 90% quando 55 comparada à obtida utilizando uma população de oócitos não sincronizada. Além disso, a qualidade embrionária tende a aumentar também. Em conclusão, os dados aqui apresentados contribuem para elucidar diferenças na fisiologia reprodutiva e no desempenho entre raças bovinas, além de revelar que estratégias capazes de modular a população de oócitos em relação à configuração da cromatina provam ser uma ferramenta importante para identificar as necessidades específicas de cada categoria e, em seguida, cultivá-las com fatores que melhorem sua competência para desenvolvimento. Essa abordagem fomenta iniciativas atreladas ao desenvolvimento de protocolos que podem ser adotados para cada situação específica. Identificar e explorar esses parâmetros é de extrema importância para o aprimoramento de biotecnologias reprodutivas. 56 Referências Aardema H., Roelen B. A., van Tol H. T., Oei C. H., Gadella B. M., and Vos P. L. (2013). Follicular 17β-estradiol and progesterone concentrations and degree of cumulus cell expansion as predictors of in vivo-matured oocyte developmental competence in superstimulated heifers. 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