1 Embriologia Animal: Referência e Atlas Lethícia Valencise Ana Silvia S Barraviera Seabra Ferreira Talita Sarah Mazzoni Wilma De Grava Kempinas EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Título:  Embriologia Animal: Referência e Atlas  Formato:  Livro Digital  Veiculação:  Digital  ISBN:  978-65-89398-08-0  UNESP - BOTUCATU IBB – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL – LAB REPROTOX Embriologia Animal: Referência e Atlas EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS DEDICATÓRIA A concepção destra obra foi inspirada pela trajetória de um grande Embriologista brasileiro, Dr. Reinaldo Azoubel, in memorian, Professor, Pesquisador e Mentor nas Faculdades de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP e Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP. Com toda a minha admiração, carinho, agradecimento e respeito. Botucatu, abril de 2021. Wilma Kempinas UNESP - BOTUCATU IBB – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL – LAB REPROTOX EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Hero Gondinho Tse, responsável pelo estabelecimento da Disciplina de Embriologia no Instituto Básico de Biologia Médica e Agrícola e, posteriormente, Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP. O laminário que serviu de base a esse Atlas foi implementado pelo Dr. Tse, de quem tive a honra de ser colega de trabalho. Meu respeito e reconhecimento por toda uma vida dedicada à docência de Embriologia. Ao Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP, em especial ao Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, por permitir a realização deste Atlas, por intermédio de suas instalações e insumos gerais, bem como por permitir a hospedagem eletrônica em sua homepage na Internet. À Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, em especial ao Núcleo de Educação a Distância e Tecnologias da Informação em Saúde (NEAD.TIS) pelo apoio para a concretização deste Atlas. À equipe do Laboratório de Biologia e Toxicologia da Reprodução e do Desenvolvimento - ReproTox, atual e egressa, pelo apoio e incentivo. Ao Prof. Deilson Elgui de Oliveira e Sr. Carlos Ramos, coordenador e técnico, respectivamente, do Núcleo de Tecnologias Digitais em Patologia (NTDP) do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, por terem viabilizado a digitalização do laminário do presente Atlas. À Profa. Dra. Irani Quagio-Grassiotto, do Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências de Botucatu, pelo apoio, e por ter possibilitado a utilização do estereomicroscópio para captura de imagens dos embriões totais. À FAPESP, pelo apoio sob a forma de Bolsa de Iniciação Científica para Lethícia Valencise (Processo: 2015/26395-7). Ao CNPq, pela Bolsa de Produtividade em Pesquisa da Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas, em vigência durante a elaboração do presente Atlas (Processo 312118/2017-1). A todos que contribuíram para que esse trabalho se concretizasse.! UNESP - BOTUCATU IBB – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL – LAB REPROTOX EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS AS AUTORAS Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas, Bióloga, Professora Titular aposentada e Professora Voluntária do Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP, onde lecionou Embriologia por mais de 30 anos, junto ao Departamento de Morfologia, para alunos dos cursos de Ciências Biológicas, Ciências Biomédicas, Medicina Veterinária, Zootecnia e Medicina Humana. Atualmente continua atuando como pesquisadora e orientadora na área de Biologia e Toxicologia da Reprodução e do Desenvolvimento. Profa. Dra. Talita Sarah Mazzoni, Bióloga, Professora Adjunta do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL-MG), onde leciona Embriologia, Biologia do Desenvolvimento e Biologia Celular junto ao Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento para os mais diferentes cursos das áreas Biológicas. Desenvolve projetos de pesquisa na área de Biologia da Reprodução e Ensino de Biologia. Dra. Ana Silvia Sartori Barraviera Seabra Ferreira, graduada em Publicidade e Propaganda e doutora em Biologia Geral e Aplicada. Atua como Coordenadora do Núcleo de Educação a Distância e Tecnologias da Informação em Saúde (NEAD.TIS) da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. Lethícia Valencise, graduada em Ciências Biomédicas pelo Instituto de Biociências de Botucatu e doutoranda do Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada da mesma Instituição. UNESP - BOTUCATU IBB – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL – LAB REPROTOX EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS COLABORADORES Stephannie Vieira Cagliarani, que durante o curso de graduação em Ciências Biológicas no Instituto de Biociências de Botucatu, com Bolsa de Apoio Acadêmico e Extensão I, participou ativamente na obtenção, edição e identificação de estruturas desse Atlas. José Eduardo Bozano, Assistente de Suporte Acadêmico II do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional do Instituto de Biociências de Botucatu, responsável pela confecção de grande parte das lâminas histológicas. UNESP - BOTUCATU IBB – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL – LAB REPROTOX EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS APRESENTAÇÃO Esta obra contém imagens protegidas por direito autoral. Todos os direitos reservados e protegidos pela Lei 9.610 de 19/02/1998. Ela pode ser citada da seguinte forma: Valencise L, Ferreira ASBS, Mazzoni TS, Kempinas WG. Embriologia animal: referência e atlas [Internet]. Botucatu: UNESP, IBB – Departamento de Biologia Estrutural e Funcional – Lab REPROTOX; 2021 [cited 2021 Apr 6]. Nenhuma parte deste Atlas, sem autorização prévia por escrito dos autores, poderá ser reproduzida ou transmitida sejam quais forem os meios empregados: eletrônicos, mecânicos, fotográficos, gravação ou quaisquer outros. Essa obra de referência foi concebida, em primeira instância, como subsídio ao estudo prático (presencial ou remoto) de gônadas e de embriões, totais ou seccionados em série, da coleção da Disciplina de Embriologia do Instituto de Biociências de Botucatu, mas poderá também ser utilizado por alunos sem acesso ao laminário completo, bem como ferramenta para pesquisadores na área de Biologia do Desenvolvimento, Toxicologia da Reprodução e do Desenvolvimento, Ciências Morfológicas, Biologia Estrutural e Reprodução Animal, dentre outras. Embriologia Animal pode ser definida como o estudo do desenvolvimento ontogenético pré-natal ou pré-eclosão do ovo. Porém, o processo de fertilização, que dá origem à primeira célula do novo ser, é precedido pela formação dos gametas, células haploides. Por isso, para os propósitos desta obra, o processo da gametogênese, nos ovários e nos testículos de representantes de todas as Classes de Vertebrados, será abordado antes da descrição do desenvolvimento propriamente dito. Cabe-nos ressaltar que as nomenclaturas utilizadas para identificar estruturas nesse Atlas podem variar em diferentes publicações na área de Embriologia, assim como a nomenclatura zoológica. O primeiro animal descrito é o ouriço-do-mar, pertencente ao Filo Equinodermata, o primeiro a apresentar deuterostomia. Essa é uma característica filogenética comum com os Cordados, dentre os quais estão os Vertebrados: Peixes, Anfíbios, Répteis, Aves e Mamíferos. Nesta obra o desenvolvimento do embrião de galinha será enfocado em maior detalhe. Da coleção do Instituto de Biociências de Botucatu, foram utilizadas lâminas contendo embriões de aves, gônadas de ratos, gônadas de pombo, ovário de cadela e de feto humano, placenta e cordão umbilical humanos. As gônadas e embriões de peixes, gônadas de anfíbios, répteis e de aves pertencem à coleção particular da Profa. Talita Mazzoni. As secções sagitais de feto humano foram cedidas pelo Prof. Dr. Reinaldo Azoubel, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP. A forma como os embriões de galinha são coletados e processados até a confecção das lâminas histológicas consta do primeiro capítulo. Todo o material utilizado, sendo parte integrante de um acervo científico universitário, possui protocolo de comitê de ética para pesquisa e/ou ensino aprovado. O conteúdo do Atlas estará em constante atualização. Sugestões para o seu aprimoramento deverão ser enviadas para atlas.embrio.ibb@unesp.br. Saudações! UNESP - BOTUCATU IBB – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL – LAB REPROTOX EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS SUMÁRIO 1. CONFECÇÃO DE LÂMINAS COM EMBRIÕES DE GALINHA 9 ................................................................... 2. GAMETOGÊNESE 17 ............................................................................................................................... 2.1. ESPERMATOGÊNESE 17 ................................................................................................................... 2.1.1. TESTÍCULO DE PEIXE 17 ............................................................................................................ 2.1.2. TESTÍCULO DE ANFÍBIO 21 ....................................................................................................... 2.1.3. TESTÍCULO DE RÉPTIL 25 .......................................................................................................... 2.1.4. TESTÍCULO DE AVE 31 ............................................................................................................... 2.1.5. TESTÍCULO DE MAMÍFERO 37 .................................................................................................. 2.2. OVOGÊNESE 42 ............................................................................................................................... 2.2.1. OVÁRIO DE PEIXE 43 ................................................................................................................. 2.2.2. OVÁRIO DE ANFÍBIO 48 ............................................................................................................ 2.2.3. OVÁRIO DE RÉPTIL 52 ............................................................................................................... 2.2.4. OVÁRIO DE AVE 58 ................................................................................................................... 2.2.5. OVÁRIO DE MAMÍFERO 67 ....................................................................................................... 3. TIPOS DE OVOS E TIPOS DE CLIVAGEM 78 ............................................................................................. 4. DESENVOLVIMENTO INICIAL DO OURIÇO-DO- MAR 80 ......................................................................... 5. DESENVOLVIMENTO INICIAL DOS PEIXES 88 .......................................................................................... 5.1. CORTES SERIADOS TRANSVERSAIS 92 ............................................................................................. 6. EMBRIÃO DE GALINHA COM 18h DE INCUBAÇÃO 102 .......................................................................... 6.1. MONTAGEM TOTAL 102 .................................................................................................................. 6.2. CORTES SERIADOS TRANSVERSAIS 106 ........................................................................................... 7. EMBRIÃO DE GALINHA COM 24h DE INCUBAÇÃO 108 .......................................................................... 7.1. MONTAGEM TOTAL 108 .................................................................................................................. 7.2. CORTE SAGITAL 110 ........................................................................................................................ 7.3. CORTES SERIADOS TRANSVERSAIS 111 ........................................................................................... 8. EMBRIÃO DE GALINHA COM 33h DE INCUBAÇÃO 120 .......................................................................... 8.1. MONTAGEM TOTAL 121 .................................................................................................................. 8.2. CORTES SERIADOS TRANSVERSAIS 124 ........................................................................................... 9. EMBRIÃO DE GALINHA COM 48h DE INCUBAÇÃO 134 .......................................................................... 9.1. MONTAGEM TOTAL 137 ................................................................................................................. 9.2. CORTES SERIADOS TRANSVERSAIS 139 ........................................................................................... 10. EMBRIÃO DE GALINHA COM 72h DE INCUBAÇÃO 150 ........................................................................ 10.1. CORTE SAGITAL 152 ...................................................................................................................... 10.2 CORTES SERIADOS TRANSVERSAIS 154 .......................................................................................... 11. EMBRIÃO DE GALINHA COM 96h DE INCUBAÇÃO 168 ........................................................................ 12. EMBRIÃO DE GALINHA COM 6 DIAS DE INCUBAÇÃO 170 .................................................................... 13. DESENVOLVIMENTO INICIAL DO SER HUMANO 172 ............................................................................ 14. DESENVOLVIMENTO INICIAL DO RATO 185.......................................................................................... EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 1. CONFECÇÃO DE LÂMINAS COM EMBRIÕES DE GALINHA O embrião de galinha se desenvolve em três semanas e tem sido utilizado como organismo modelo para estudos embriológicos. São apresentados a seguir as etapas de coleta e processamento até a visualização das lâminas digitalizadas. 1. ETAPAS DE COLETA E PROCESSAMENTO 1) Incubação dos ovos: Os ovos são coletados após a postura e incubados em uma estufa com temperatura entre 38 e 42ºC, permanecendo na incubadora durante o período necessário para atingir o estágio de desenvolvimento embrionário desejado. Comumente, são incubados por 18, 24, 33, 48, 72 ou 96 horas. 2) Coleta de embriões: Cada um dos ovos é quebrado e o seu conteúdo exposto numa placa de Petry contendo água. Com o auxílio de tesoura, espátula e pincéis, a membrana vitelínica e o excesso de vitelo são removidos e o embrião retirado. 3) Fixação: Os embriões coletados são fixados em solução Bouin por 24 horas. Para a preparação da solução Bouin é utilizado 75ml de ácido pícrico saturado, 25ml de formaldeído (P.A.) e 5ml de ácido acético glacial. 4) Desidratação: Os embriões fixados são lavados diversas vezes em uma solução de álcool 70% amoniacal até a retirada total da solução de Bouin e transferidos para uma solução de álcool etílico 70%. 5) Triagem: Os embriões são observados com o auxílio de uma lupa e selecionados para montagem total e para cortes seriados, de acordo com o estágio de desenvolvimento embrionário desejado. 6) Coloração: O material selecionado é hidratado e transferido para uma solução de Hematoxilina, na qual permanece até estar totalmente corado. O 9 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS excesso de corante é retirado e o material lavado em água. Em seguida, os embriões utilizados para montagem total são transferidos para uma solução de diferenciador (99ml de álcool etílico 70% + 1ml ácido clorídrico P.A.). 7) Desidratação: Os embriões são desidratados em álcool 70%, 80%, 95% e 100% durante 20 minutos em cada solução, sendo que a cada 10 minutos a solução é substituída. 8) Diafanização: O material é diafanizado em álcool absoluto + xilol, xilol I e xilol II, permanecendo 10, 5 e 3 minutos, respectivamente, em cada uma das soluções. 1.1. Montagem total Cada embrião é depositado sobre uma lâmina com resina Permount ou Entellan (meio de montagem). Para montagem de embriões com uma espessura maior (acima de 33 horas de desenvolvimento), são utilizadas lâminas escavadas. Com o auxílio do microscópio, a posição correta do embrião na lâmina é verificada e, em seguida, a lamínula é colocada para a montagem permanente da lâmina. 1.2. Montagem de cortes seriados 1) Parafinização (infiltração): Os embriões selecionados para cortes seriados são colocados em um frasco contendo 50% de xilol e 50% de paraplast (parafina + plástico), durante 1 hora na estufa a 62ºC, após o derretimento total do paraplast. Em seguida, o material é transferido para o paraplast puro, permanecendo por mais 1 hora na estufa. 2) Inclusão: Cada um dos embriões é colocado numa pequena caixa de papel contendo paraplast fundido, de modo que a região cefálica do embrião permaneça direcionada para uma das paredes da caixa e próximo a ela. Após o tempo mínimo de 4 horas para solidificação do paraplast, os bloquinhos são desbastados com o auxílio de uma chapa quente e presos à madeira. 3) Microtomia: Os cortes seriados de 10µm de espessura são obtidos em micrótomo equipado com navalha de aço e depositados em lâminas 10 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS histológicas obedecendo a posição da esquerda para direita, de cima para baixo e no sentido céfalo-caudal do embrião. As lâminas são limpas com solução de álcool-éter e sobre elas é aplicada albumina + glicerina para garantir a aderência dos cortes à lâmina. As lâminas são transferidas para uma chapa quente para distender os cortes. Em seguida, as lâminas são levadas à estufa, permanecendo “over night”, para o início da desparafinização e aderência dos cortes. 4) Desparafinização: As lâminas recebem 3 banhos de xilol, permanecendo por 15 minutos em cada solução. 5) Hidratação: As lâminas são imersas em soluções de álcool 100%, 90%, 80%, 70% e em água. 6) Coloração: Tradicionalmente, os cortes seriados são corados com Hematoxilina e Eosina (HE). As lâminas são imersas em solução de Hematoxilina por 1.5 minuto; o excesso do corante é retirado e as lâminas são lavadas em água e em álcool 95%. Em seguida, as lâminas são submetidas à coloração de Eosina, permanecendo na solução durante 3 minutos e novamente lavadas em água. 7) Desidratação: A desidratação do material é feita com banhos em álcool 70%, 80%, 90%, álcool absoluto I e álcool absoluto II. 8) Diafanização: A diafanização do material é feita com banhos em álcool absoluto + xilol, xilol I e xilol II. 9) Montagem: As lamínulas são coladas sobre as lâminas utilizando-se um meio de montagem como resina Permount ou Entellan, para a montagem permanente da lâmina histológica. 11 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 1. Confecção de lâminas histológicas para embriologia: preparação dos embriões. 12 Os ovos são coletados após a postura e incubados em uma estufa com temperatura entre 38 e 42ºC. Após a i ncubação , os ovos são selecionados e quebrados a fim de expor o embrião. São feitas 4 incisões nos pontos cardeais para extravasar a gema. O embrião é removido e limpo. EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 2. Confecção de lâminas histológicas para embriologia: preparação dos embriões. 13 Embriões limpos. Lupa utilizada para selecionar os embriões que são mais adequados para a confecção de lâminas com montagens totais ou cortes seriados transversais. Embriões que serão utilizados para preparar lâminas com montagem total. Exemplo de lâmina escavada com um embrião de galinha em montagem total. EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 3. Confecção de lâminas histológicas para embriologia: preparação dos embriões. 14 Os embriões que foram selecionados para a confecção de lâminas com cortes seriados transversais são incluídos em parafina. O material é levado ao micrótomo calibrado para 10µm por corte seriado. Os cortes seriados saem unidos do micrótomo. As lâminas são tratadas com albumina para ajudar a espalhar a água e proporcionar a adesão dos cortes. EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 4. Confecção de lâminas histológicas para embriologia: preparação dos embriões. 15 Cuidadosamente, as fitas contendo os cortes seriados são organizadas em fileiras um pouco menores que as lâminas, uma vez que sofrerão expansão. A lâmina é aquecida em chapa quente para adesão dos cortes seriados. RESULTADO FINAL Acima: Lâmina com cortes seriados transversais. Ao lado: A primeira lâmina contém uma montagem total e as seguintes apresentam cortes seriados transversais. EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 5. Leitura das lâminas histológicas digitalizadas u]lizando o so^ware Pannoramic Viewer. 16 Os cortes seriados são dispostos nas lâminas da esquerda para a direita e de cima para baixo, como exemplifica a figura. Dessa forma, será observado no microscópio óptico cortes mais craniais acima e à esquerda (1) e cortes mais caudais abaixo e à direita (30). Outra alternativa para o estudo das lâminas com cortes seriados é a utilização de softwares específicos como o Pannoramic Viewer. A lâmina é digitalizada e o arquivo gerado corresponde à lâmina rotacionada 90º em sentido horário. Ou seja, no programa, o corte mais cranial é o do canto superior direito, seguido pelo corte abaixo dele e toda essa fileira vertical. Em sequência, observa-se a fileira à esquerda da primeira e assim sucessivamente até atingir o corte mais caudal, localizado no canto inferior esquerdo. Caso a lâmina esteja orientada de forma diferente, sugere-se que sejam observados os cortes dos 4 cantos afim de identificar qual é mais cranial e qual é mais caudal. Após a identificação do mais cranial, seguir a sequência de cortes em direção caudal como demonstrado nas figuras. EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 2. GAMETOGÊNESE A gametogênese é o processo de formação de gametas, células haploides que se fundem e formam o zigoto, uma célula diploide que é responsável pela formação de um novo organismo. Nos machos, é chamada de espermatogênese e origina os espermatozoides. Nas fêmeas, o processo é denominado ovogênese e origina o ovócito secundário. 2.1. ESPERMATOGÊNESE Em mamíferos, de forma geral, a espermatogênese ocorre de maneira similar. Dessa forma, o estudo que será feito a seguir do testículo de rato representa de maneira satisfatória o processo que ocorre em todos os animais dessa classe: o avanço na espermatogênese da periferia para o centro do túbulo seminífero. No gafanhoto, um invertebrado, ela ocorre de maneira diferenciada. O testículo desse inseto é dividido em lóbulos, os quais, por sua vez, estão subdivididos em cistos. Cada cisto contém células germinativas em determinada fase da espermatogênese, sendo que as células menos avançadas se localizam nos cistos mais apicais e as mais avançadas nos basais. Dentre os vertebrados, os peixes e anfíbios possuem, também, espermatogênese cística. Em relação ao tipo de espermatozoide, o flagelado é o mais comum. Apenas alguns invertebrados possuem espermatozoides ameboides, tais quais os vermes do gênero Ascaris, anelídeos e moluscos. 2.1.1. TESTÍCULO DE PEIXE Nos peixes, a espermatogênese é cística. Cada cisto contém células da linhagem germinativa em determinada fase da espermatogênese e elas se mantêm unidas por pontes citoplasmáticas até o momento da espermiogênese, quando, após sua finalização, os espermatozoides são liberados na luz do túbulo seminífero. A seguir, serão exibidas figuras de duas espécies de peixes: Tanichthys albonubes e Gymnocorymbus ternetzi. 17 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 01) Espermatogônia: São as maiores células presentes no testículo. Possuem núcleo esférico e nucléolos evidentes. Embora não sejam diferenciadas neste Atlas, podem ser identificadas espermatogônias primárias e secundárias. As células da linhagem germinativa de um cisto originam todas da mesma espermatogônia primária a qual, por mitose, forma espermatogônias secundárias. Estas formarão os espermatócitos primários. 02) Espermatócito: Os espermatócitos primários são observados em prófase e com núcleo grande ocupando quase toda a célula. Os espermatócitos secundários são células de duração muito curta e, portanto, difíceis de serem observadas nos túbulos seminíferos. São identificados pelas figuras características de metáfase. 03) Espermátide: São células menores que as descritas anteriormente e que apresentam o núcleo condensado. Durante a espermiogênese, os restos citoplasmáticos são fagocitados pela célula de Sertoli. Ao término do processo de diferenciação da espermátide em espermatozoide, este é liberado na luz do túbulo seminífero. 04) Espermatozoide: São as células de núcleo bem condensado e esférico observadas na luz do túbulo seminífero. Possuem flagelo e participam da fecundação, na maioria das vezes, externa. Os espermatozoides dos peixes teleósteos não possuem acrossoma e a fertilização é facilitada pela micrópila, estrutura que será melhor descrita posteriormente. 05) Célula de Sertoli: Nos peixes, a célula de Sertoli comporta-se como a parede dos cistos espermatogênicos. Possui, nessas imagens, um núcleo bem corado e de aspecto triangular. 06) Célula de Leydig: Estão presentes no compartimento intersticial, entre os túbulos seminíferos, junto com tecido conjuntivo, vasos e fibroblastos. Nestas imagens, possuem núcleo de aspecto arredondado. 18 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 6. Corte histológico de testículo de peixe (Tanichthys albonubes) evidenciando o ducto espermático e túbulos seminíferos. Corado em HE. Aumento de 100X. Figura 7. Corte histológico de testículo de peixe (Gymnocorymbus ternetzi) evidenciando um túbulo seminífero (região mais escura) e os cistos. Corado em HE. Aumento de 200X. 19 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 8. Corte histológico de testículo de peixe (Gymnocorymbus ternetzi), evidenciando os cistos com células em diferentes fases da espermatogênese e espermatozoides na luz do tubo. Corado em HE. Aumento de 400X. Figura 9. Corte histológico de testículo de peixe (Gymnocorymbus ternetzi). Corado em HE. Aumento de 1000X. 20 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 10. Corte histológico de testículo de peixe (Gymnocorymbus ternetzi), evidenciando a Célula de Leydig. Corado em HE. Aumento de 400X. 2.1.2. TESTÍCULO DE ANFÍBIO O testículo de anfíbio é revestido por uma túnica albugínea, a qual delimita túbulos seminíferos. Dentro deles, encontram-se células da linhagem germinativa organizadas em cistos. Dessa forma, o processo espermatogênico é similar ao dos peixes: cada cisto contém células da linhagem germinativa no mesmo estágio de diferenciação. A morfologia testicular dos anfíbios também depende das condições de temperatura e umidade, as quais influenciam nas épocas reprodutivas. A seguir, serão apresentados cortes transversais de testículo de Dendropsophus minutus, uma espécie de perereca (anuro). 01) Espermatogônia: São células volumosas com núcleo pouco corado de cromatina descondensada e nucléolos evidentes. Embora não sejam diferenciadas neste Atlas, podem ser identificadas espermatogônias primárias e secundárias. As células da linhagem germinativa de um cisto originam todas da mesma espermatogônia primária a qual, por mitoses, forma espermatogônias secundárias. Estas formarão os espermatócitos primários. 21 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 02) Espermatócito Primário: São um pouco menores que as espermatogônias. Comumente serão observados em prófase I, mas também é possível encontrar em outros estágios da meiose. 03) Espermatócito Secundário: São células de curta duração e, portanto, difíceis de serem observadas. Possuem a cromatina condensada, caracterizando as figuras de metáfase. 04) Espermátide: Oriundas do término da divisão meiótica, são células menores que as anteriores. Podem ser vistas em seu aspecto arredondado com cromatina menos compactada, ou então mais alongadas e com cromatina condensada devido ao avanço no processo de espermiogênese. São encontradas no interior dos cistos ou, em estágios tardios da diferenciação, no lúmen dos túbulos seminíferos, organizadas em feixes paralelos, permanecendo acopladas às Células de Sertoli. 05) Espermatozoide: Os espermatozoides de anfíbio possuem a cabeça alongada e núcleo com cromatina extremamente condensada. São encontrados soltos no lúmen do túbulo seminífero. 06) Célula de Sertoli: Formam as paredes dos túbulos seminíferos e possuem o núcleo com aspecto piramidal que pode ter um nucléolo visível. 07) Célula de Leydig: Estão localizadas no interstício próximo a vasos e possuem núcleo redondo ou oval, sendo que nucléolos podem ser ou não evidentes. 22 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 11. Corte histológico de testículo de anfíbio (Dendropsophus minutus). Corado em HE. Aumento de 70X. Figura 12. Corte histológico de testículo de anfíbio (Dendropsophus minutus). Corado em HE. Aumento de 500X. 23 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 13. Corte histológico de testículo de anfíbio (Dendropsophus minutus), evidenciando um túbulo seminífero (mais escuro) com cistos contendo células em diferentes fases da espermatogênese. Corado em HE. Aumento de 500X. Figura 14. Corte histológico de testículo de anfíbio (Dendropsophus minutus). Corado em HE. Aumento de 400X. 24 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 15. Corte histológico de testículo de anfíbio (Dendropsophus minutus). Corado em HE. Aumento de 340X. 2.1.3. TESTÍCULO DE RÉPTIL Os répteis apresentam testículos tubulares, nos quais diversas gerações de células germinativas se desenvolvem de maneira sincronizada e, durante seu desenvolvimento, estas se deslocam ao longo do epitélio germinativo, a partir da membrana basal até a lúmen do túbulo seminífero, enquanto se dá o processo de espermatogênese. Durante este processo, as células germinativas iniciais (espermatogônias) se dividem por mitose e/ou entram em meiose até se diferenciarem em espermatozoides. Para representar os répteis, serão apresentadas figuras de testículo do lagarto Tropidurus sp. 01) Espermatogônia: Estão localizadas na base do epitélio seminífero sobre com a membrana basal. Durante a espermatogênese, proliferam por mitose, produzindo uma grande população de espermatogônias (espermatogônia A) e/ou entram em meiose (espermatogônia B), dando origem aos espermatócitos primários. As espermatogônias são células arredondadas com núcleos esféricos, contendo heterocromatina granular com um ou dois nucléolos evidentes. 25 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 02) Espermatócito: São células esféricas com núcleo arredondado e basofílico. Por estarem em prófase, seus núcleos apresentam diferentes padrões de condensação da cromatina (de granular a filamentosa), caracterizando os espermatócitos primários. Os espermatócitos secundários são menores que os primários e identificados pelas figuras características de metáfase. Por se tratar de uma fase mais rápida, sua observação no epitélio germinativo é mais rara. 03) Espermátide: Em seus estágios iniciais (espermátide arredondada), são células esféricas e menores, em comparação com os espermatócitos secundários. Apresentam núcleo esférico com cromatina finalmente granular. Ao passar pela espermiogênese, as espermátides sofrem mudanças morfológicas, que incluem a formação do sistema acrossomal, condensação e alongamento do núcleo e formação do flagelo. Seu estágio final (espermátide alongada) é caracterizado pela fácil visualização do flagelo projetando-se para o lúmen. A espermátide final está prestes a ser liberada no lúmen. 04) Espermatozoide: São células de núcleo alongado e bastante condensado. São observados no lúmen do túbulo seminífero. Possuem flagelo longo e fino. Os espermatozoides maduros serão transportados através dos ductos eferentes para o epidídimo, onde irão sofrer maturação final e ganharão alta motilidade. Esses espermatozoides ficarão estocados no epidídimo até a próxima cópula. 05) Célula de Sertoli: As células de Sertoli formam um epitélio permanente nos répteis e são distribuídas em torno da circunferência dos túbulos seminíferos, estando apoiadas sobre a membrana basal. Têm um núcleo basal, frequentemente de formato triangular com um ou dois nucléolos. 06) Célula de Leydig: Estão presentes no compartimento intersticial, entre os túbulos seminíferos. São células arredondadas com núcleo arredondado, descompactado e nucléolo evidente. Além das células de Leydig, observam-se no compartimento intersticial os componentes do tecido conjuntivo, constituído por fibroblastos, colágeno, células mióides, fibras nervosas e vasos sanguíneos. 26 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 16. Corte histológico de testículo de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando a túnica albugínea e os túbulos seminíferos. Corado em HE. Aumento de 40X. Figura 17. Corte histológico de testículo de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando os túbulos seminíferos e o interstício. Corado em HE. Aumento de 100X. 27 Tn – Túnica Albugínea Tb – Túbulo Seminífero In – Tn – Túnica Albugínea Tb – Túbulo Seminífero In – Interstício EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 18. Corte histológico de testículo de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando o epitélio germinativo de um túbulo seminífero. Corado em HE. Aumento de 200X. Figura 19. Corte histológico de testículo de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando o espaço intersticial, com células de Leydig, vasos sanguíneos e células mioides. Corado em HE. Aumento de 400X. 28 Mi – Células Mioides Vs – Vaso Seta – Células de Leydig EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 20. Corte histológico de testículo de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando o túbulo seminífero, com células em diversas fases da espermatogênese e células de Sertoli. Corado em HE. Aumento de 400X. Figura 21. Corte histológico de testículo de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando os espermatócitos secundários e as espermátides alongadas. Corado em HE. Aumento de 400X. 29 Eg – Espermatogônia Ed – Espermátide Ep – Espermatócito Primário Seta – Células de Sertoli Es – Espermatócito secundário Ea – Espermátide alongada EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 22. Corte histológico de epidídimo de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando os espermatozoides no lúmen do ducto epididimário. Corado em HE. Aumento de 200X. Figura 23. Detalhe do ducto epididimário de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando o epitélio pseudoestratificado e o lúmen com grande quantidade de espermatozoides. A região da cabeça dos espermatozoides cora-se em azul, enquanto os flagelos em rosa. Corado em HE. Aumento de 400X. 30 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 2.1.4. TESTÍCULO DE AVE O testículo das aves é envolto por uma cápsula fibrosa, a túnica albugínea, e contém tecido intersticial e túbulos seminíferos, assim como o testículo dos mamíferos. O tecido intersticial contém as células de Leydig, produtoras de andrógenos; os túbulos seminíferos contêm células de Sertoli e as células da linhagem germinativa. Os testículos das aves são localizados dentro da cavidade abdominal e em algumas espécies de aves estes órgãos são assimétricos e passam por alterações anuais de tamanho. Estas alterações são em virtude da reprodução sazonal, na qual os testículos involuem em períodos não reprodutivos. A seguir, serão apresentados cortes histológicos de testículo de pombo (Columba sp.) e codorna (Coturnix sp.). 01) Espermatogônia: As espermatogônias estão localizadas na periferia do túbulo seminífero e podem proliferar por mitose, gerando novas espermatogônias, ou iniciar o processo de meiose e originar espermatócitos primários. São células de núcleo pequeno. 02) Espermatócito: Os espermatócitos primários são células geralmente observadas em prófase I e, ao final da primeira divisão meiótica, dão origem aos espermatócitos secundários. Estes, por sua vez, comumente são observados em metáfase II. 03) Espermátide: As espermátides estão localizadas mais próximas da luz do túbulo seminífero e podem ser observadas espermátides redondas ou alongadas, dependendo do avanço no processo de espermiogênese. 04) Espermatozoide: Os espermatozoides de aves não passeriformes (como pombo e codorna) comumente é semelhante ao dos répteis, sendo filiforme e alongado. 05) Célula de Sertoli: As células de Sertoli estão localizadas na periferia dos túbulos seminíferos e possuem núcleo que pode conter nucléolo evidente. 06) Célula de Leydig: Localizada no interstício do testículo. Possui núcleo arredondado ou ovalado, sendo que o nucléolo pode ou não ser evidente. Seu 31 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS citoplasma é maior em épocas reprodutivas em virtude de maior produção androgênica. Figura 24. Corte histológico de testículo de codorna (Coturnix sp) evidenciando a túnica albugínea, um túbulo seminífero e o interstício. Corado em HE. Aumento de 40x. Figura 25. Corte histológico de testículo de codorna (Coturnix sp) evidenciando os túbulos seminíferos e o interstício. Corado em HE. Aumento de 100x. 32 Tb – Túbulo Seminífero In – Interstício EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 26. Corte histológico de testículo de codorna (Coturnix sp) evidenciando algumas células da linhagem germinativa, além da célula de Sertoli (seta) e do interstício com vasos sanguíneos (vs) e célula de Leydig (ponta de seta). Corado em HE. Aumento de 400x. 33 Ep – Espermatócito primário Ed – Espermátide redonda Ea – Espermátide alongada Z – Espermatozoide Eg – Espermatogônia EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 27. Corte histológico de testículo de codorna (Coturnix sp) evidenciando o epitélio germinativo, formado pelas células germinativas e célula de Sertoli (seta). Note as células de Leydig (ponta de seta) próximas aos vasos sanguíneos (vs) no interstício. Corado em HE. Aumento de 400x. 34 Ep – Espermatócito primário Ed – Espermátide redonda Ea – Espermátide alongada Z – Espermatozoide Eg – Espermatogônia EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 28. Corte histológico de testículo de pombo (Columba sp.) evidenciando a túnica albugínea, um túbulo seminífero e o interstício. Corado em HE. Aumento de 50x. Figura 29. Corte histológico de testículo de pombo (Columba sp.) evidenciando os túbulos seminíferos e o interstício. Corado em HE. Aumento de 100x. 35 Tb – Túbulo Seminífero In – Interstício EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 30. Corte histológico de testículo de pombo (Columba sp.) evidenciando algumas células da linhagem germinativa. Corado em HE. Aumento de 200x. Figura 31. Corte histológico de testículo de pombo (Columba sp.). Corado em HE. Aumento de 200x. 36 Ea – Espermátide alongada Seta – Célula de Sertoli Ponta de seta – Célula de Leydig Ep – Espermatócito primário Ed – Espermátide redonda Ea – Espermátide alongada EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 2.1.5. TESTÍCULO DE MAMÍFERO O testículo é revestido por uma espessa camada de tecido conjuntivo, a túnica albugínea, e apresenta duas porções distintas em seu interior: os túbulos seminíferos e o interstício. Neste atlas, o testículo dos mamíferos será representado por cortes histológicos de testículo de rato albino (Rattus norvegicus albinus). A) Os túbulos seminíferos contêm o epitélio germinativo ou seminífero, responsável pela espermatogênese, constituído por células de sustentação, as células de Sertoli e as células da linhagem germinativa. Ressalta-se que nem todos os túbulos visualizados terão a mesma aparência e associação de células germinativas, visto que os túbulos seminíferos estão em um determinado estágio da espermatogênese, o que promove a produção ininterrupta do gameta masculino, diferentemente do feminino. As células presentes nos túbulos seminíferos são: 01) Célula de Sertoli: É a célula somática que fica na periferia do túbulo seminífero e tem como funções principais a sustentação das células germinativas, por meio de reentrâncias que auxiliam na trajetória do gameta em formação até a luz do tubo, e sua proteção, proporcionada pela barreira hematotesticular. Além disso, sua atuação durante a embriogênese é fundamental, dado que produz o Hormônio Anti- Mülleriano, auxiliando na diferenciação genital masculina. Ela possui o núcleo com aspecto piramidal e pouco corado, com nucléolo evidente. 02) Espermatogônia: Também na periferia do túbulo, esta célula diploide é a primeira da linhagem germinativa. Pode ser identificada pelo núcleo com cromatina densa e aspecto bem arredondado. Ela se divide por mitose e produz novas espermatogônias (renovação do epitélio germinativo), ou passa por crescimento para originar o próximo tipo celular da espermatogênese. O crescimento e diferenciação desta célula marcam o início da puberdade, quando estímulos hormonais causam sua saída da quiescência. 03) Espermatócito Primário: É uma célula diploide originada pelo crescimento da espermatogônia, e é, portanto, a maior da linhagem germinativa. Localiza-se ligeiramente mais ao centro do túbulo que as células anteriores. Seu núcleo apresenta cromatina condensada e, a partir da Meiose I, essa célula originará o Espermatócito Secundário. 37 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 04) Espermatócito Secundário: Célula haploide de curta duração e difícil de ser observada em cortes histológicos. Neste Atlas, para fins didáticos, células que estiverem em metáfase com os cromossomos condensados localizados na região equatorial serão consideradas Espermatócitos Secundários. No entanto, elas podem representar tanto a Metáfase I (transição de Espermatócito I para Espermatócito II) quanto a Metáfase II (transição de Espermatócito II para Espermátide). Também é localizada ligeiramente mais ao centro do túbulo. 05) Espermátide: Pode ser observada em duas diferentes formas: a. Espermátide redonda: Células arredondadas e bem coradas, visíveis do centro para a periferia do túbulo; b. Espermátide alongada: Células bem coradas e mais alongadas, especialmente devido à perda de citoplasma no processo de espermiogênese (diferenciação da espermátide em espermatozoide). 06) Espermatozoide: Nota-se a cabeça alongada com formato de foice - característico do espermatozoide de rato - e a projeção da cauda para a luz do tubo. Quando estiver pronto, ele se desprenderá do epitélio em direção à luz do túbulo pelo processo chamado de espermiação. Este é o gameta masculino. Porém, ele não está completamente maturado, visto que a maturação se completa no epidídimo com aquisição de motilidade, com posterior capacitação no trato genital feminino para poder fecundar o ovócito secundário da fêmea. 07) Corpos residuais: Ao longo do processo de espermiogênese, as espermátides perdem citoplasma. O citoplasma descartado forma os corpos residuais, pequenas circunferências coradas de roxo, que serão fagocitados pela célula de Sertoli. 08) Células Mioides: Ficam ao redor dos túbulos seminíferos e promovem sua contração para expelir os espermatozoides que estão prontos para passar pelo epidídimo. São células com características de células musculares lisas, achatadas e alongadas. B) O interstício é constituído por tecido conjuntivo, espaço linfático, capilares sanguíneos e uma célula característica, a célula de Leydig. Para efeito da Disciplina de Embriologia será dada ênfase sobre as células de Leydig. 38 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Célula de Leydig: As células responsáveis pela produção de testosterona possuem núcleo arredondado e nucléolo evidente. Sua localização próxima aos capilares sanguíneos pode ser facilmente associada à importância da distribuição da testosterona pelo sistema vascular a todo o organismo. 39 Figura 32. Corte histológico de testículo de rato (Rattus norvegicus albinus) evidenciando a túnica albugínea e os túbulos seminíferos. Corado em HE. Aumento de 100x. Tn – Túnica Albugínea Tb – Túbulo Seminífero In – Interstício Tb – Túbulo Seminífero In – Interstício EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 33. Corte histológico de testículo de rato (Rattus norvegicus albinus) evidenciando os túbulos seminíferos. Corado em HE. Aumento de 100X. Figura 34. Corte histológico de testículo de rato (Rattus norvegicus albinus) evidenciando o espaço intersticial, com células de Leydig e vasos, e células mióides. Corado em HE. Aumento de 400X. 40 Mi – Células Mioides Vs – Vaso Seta – Células de Leydig EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 35. Corte histológico de testículo de rato (Rattus norvegicus albinus) evidenciando o túbulo seminífero, com células em diversas fases da espermatogênese e células de Sertoli. Corado em HE. Aumento de 400X. Figura 36. Corte histológico de testículo de rato (Rattus norvegicus albinus) evidenciando os espermatócitos secundários e espermátides alongadas. Corado em HE. Aumento de 400X. 41 Eg – Espermatogônia Ed – Espermátide Ep – Espermatócito Primário Seta – Células de Sertoli Es – Espermatócito secundário Ea – Espermátide alongada EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 37. Corte histológico de testículo de rato (Rattus norvegicus albinus), mostrando os corpos residuais e cabeças e caudas de espermatozoides. Corado em HE. Aumentos de 120X e 450X, respectivamente. 2.2. OVOGÊNESE A ovogênese comumente resulta na liberação de pequena quantidade de gametas femininos por vez, diferente da espermatogênese, que libera milhões de espermatozoides a cada ejaculação. Entretanto, no início de cada ciclo, um grupo de folículos ovarianos é recrutado. Destes, parte pode ser ovocitado e parte entrará num processo de degeneração (atresia folicular). As fêmeas de organismos que dependem da fecundação externa, por outro lado, como ouriço-do-mar e peixe, são exceções: ovocitam de centenas a milhares de gametas. Após a ovocitação, as células somáticas remanescentes no ovário (células foliculares e das tecas) formarão uma estrutura endócrina responsável pela produção de hormônios necessários para a manutenção de uma possível gestação. 42 Cb – Cabeça do Espermatozoide Cd – Cauda do Espermatozoide EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 2.2.1. OVÁRIO DE PEIXE Os peixes são vertebrados de fertilização interna ou externa, que dependem da água para a sua reprodução e desenvolvimento. Os ovários de peixe são órgãos saculares e cavitários, revestidos internamente pelo epitélio germinativo. Externamente, os ovários são revestidos por uma túnica albugínea que emite projeções irregulares para o interior do órgão, denominadas de lamelas ovígeras, nas quais ocorrem o desenvolvimento ovocitário, a partir do epitélio germinativo. Grande parte dos peixes são animais ovíparos, mas mesmo nos peixes vivíparos ou ovovivíparos é necessário que durante a ovogênese ocorra o acúmulo de vitelo (vitelogênese) que irá nutrir o futuro embrião. Além disso, muitos ovócitos são maturados simultaneamente para que ocorra a fecundação, seja esta interna ou externa. Os ovários de peixe representados a seguir pertencem à espécie Tanichthys albonubes. 01) Ovogônia: Células de citoplasma claro e escasso, com núcleo descompactado e volumoso. São as primeiras células da linhagem germinativa feminina e estão dispostas em ninhos celulares, junto ao epitélio germinativo. Neste, as ovogônias são encontradas isoladas entre as células epiteliais ou envolvidas por células pré- foliculares 02) Ovócito inicial: É a célula originada a partir da primeira divisão meiótica das ovogônias. São encontrados nos ninhos celulares e, ao serem completamente envolvidos pelas células pré-foliculares, originam os primeiros folículos ovarianos, que deixam o ninho e começam a se desenvolver, entrando em crescimento primário e secundário. 03) Ovócito em crescimento primário: O crescimento primário é caracterizado pelo aumento do volume citoplasmático do ovócito pré-vitelogênico. Este não apresenta ainda grânulos citoplasmáticos de vitelo, porém, há a formação de alvéolos corticais, cujo conteúdo é liberado no espaço peri-vitelínico no momento da fertilização para evitar a polispermia. O núcleo contém inúmeros nucléolos dispostos em sua periferia e o ovócito é revestido pela camada folicular. 43 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 04) Ovócito em crescimento secundário: É marcado especialmente pelo processo de vitelogênese (inicial, intermediária e final), que promove um novo e maior aumento do volume citoplasmático do ovócito. Na vitelogênese inicial, os grânulos de vitelo começam a ser depositados. Na vitelogênese intermediária, os grânulos de vitelo ocupam uma parte maior do citoplasma e, no ovócito em crescimento secundário com vitelogênese final, ele é totalmente tomado por grânulos de vitelo. O ovócito em crescimento secundário é revestido por um envoltório folicular completo: zona pelúcida, camada folicular e teca folicular. Ademais, possui a micrópila: estrutura em formato de funil que permite a passagem do espermatozoide para o interior do folículo ovariano. É protegida pela célula micropilar até o momento da fecundação. Momentos antes da ovulação, o ovócito finaliza sua maturação e seu núcleo torna-se excêntrico, ao se deslocar até a micrópila. 05) Folículo pós-ovulatório: É o envoltório folicular remanescente que permanece no ovário, após a liberação do ovócito durante a ovulação. É formado pelas células foliculares e células da teca. Figura 38. Corte histológico de um ovário de peixe (Tanichthys albonubes). Visão geral apresentando luz e lamela. Corado em HE. Aumento de 40X. 44 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 39. Corte histológico de um ovário de peixe (Tanichthys albonubes), evidenciando uma ovogônia e um ovócito em crescimento primário. Corado em HE. Aumento de 400X. 45 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 40. Corte histológico de um ovário de peixe (Tanichthys albonubes), evidenciando um ovócito em crescimento secundário com vitelogênese final. Em foco, a região da micrópila e a célula micropilar. Corado em HE. Aumentos de 100X e 400X, respectivamente. 46 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 41. Corte histológico de um ovário de peixe (Tanichthys albonubes), evidenciando um folículo atrésico, alvéolos corticais e grânulos de vitelo de dois ovócitos em crescimento secundário. Corado em HE. Aumento de 100x. Figura 42. Corte histológico de um ovário de peixe (Tanichthys albonubes), evidenciando um folículo pós- ovulatório, um ovócito em crescimento primário e um ovócito em crescimento secundário. Corado em HE. Aumento de 200x. 47 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 2.2.2. OVÁRIO DE ANFÍBIO As gônadas femininas dos anfíbios, assim como as masculinas, passam por alterações morfológicas dependendo de umidade e temperatura, correlacionados com a sazonalidade dos ciclos reprodutivos. Sendo assim, dependendo da época que o ovário for coletado, serão observados ovócitos mais ou menos desenvolvidos. De maneira similar aos peixes, os anfíbios liberam uma grande quantidade de ovócitos maduros ao mesmo tempo. Isso ocorre mediante o estímulo do macho durante a cópula e a fecundação é externa no ambiente aquático. Os ovários de anfíbios são multilobados e contém as células germinativas femininas. Elas serão classificadas em: ovogônia, ovócito inicial, ovócito I (pré- vitelogênico), ovócito II (pré-vitelogênico), ovócito III (vitelogênico) e ovócito IV (maduro). Essa classificação não é referente à ploidia da célula, apenas ao estágio em que se encontra o folículo. Os cortes histológicos a seguir são de duas espécies diferentes de anfíbios da ordem dos Anuros, Rana catesbiana e Dendropsophus minutus. 01) Ovogônia: É a menor célula da linhagem germinativa que será observada e encontra-se na periferia do ovário. 02) Ovócito inicial: É a célula originada a partir da primeira divisão meiótica das ovogônias. É o menor ovócito encontrado e seu núcleo granulado encontra-se nas primeiras etapas da prófase da meiose I. 03) Ovócito I (pré-vitelogênico): O núcleo é visível com cromatina em grumos (cromossomos plumosos), contém nucléolos de tamanhos variados e ocupa grande parte do ovócito. Ele é envolto por uma camada granulosa e uma tecal. O citoplasma é basofílico e não há grânulos de vitelo. 04) Ovócito II (pré-vitelogênico): O núcleo apresenta nucléolos de variados tamanhos. Podem ser notados alguns alvéolos corticais no citoplasma que perde gradualmente sua basofilia pelo aparecimento do corpo de Balbiani e aumento da quantidade de organelas, sendo menos basófilo que o do Ovócito I. A zona pelúcida começa a ser produzida, mas nem sempre é visível neste estágio. 48 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 05) Ovócito III (vitelogênico): Mais opaco, nesse estágio, inicia-se a vitelogênese, ou seja, o acúmulo de grânulos de vitelo no citoplasma e ele fica com aparência mais rosada (acidófila). A zona pelúcida apresenta-se mais espessa. A pigmentação citoplasmática começa a ocorrer. 06) Ovócito IV (maduro): Maior célula que será observada. Possui muitos grânulos de vitelo acumulados e núcleo excêntrico voltado para o polo animal. Nesse estágio, é possível a diferenciação entre polo animal e vegetal pela presença de pigmento no polo animal, conferindo uma cor mais escurecida e castanha. Figura 43. Corte histológico de um ovário de anfíbio (Rana catesbiana), evidenciando ninho de ovogônias (periferia do ovário) e ovócitos iniciais envoltos por células pré-foliculares. Corado em HE. Aumento de 400X. 49 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 44. Corte histológico de um ovário de anfíbio (Rana catesbiana), evidenciando um ovócito I envolto pelas células foliculares e células da teca. Corado em HE. Aumento de 400X. Figura 45. Corte histológico de um ovário de anfíbio (Rana catesbiana), evidenciando um ovócito II, caracterizado pela presença do corpo de Balbiani. Corado em HE. Aumento de 400X. 50 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 46. Corte histológico de um ovário de anfíbio (Dendropsophus minutus), evidenciando ovócitos II e III, com citoplasma com grânulos de vitelo. Corado em azul de toluidina. Aumento de 100X. Figura 47. Corte histológico de um ovário de anfíbio (Dendropsophus minutus) evidenciando ovócito IV, repleto por grânulos de vitelo (v), envolto pelas células foliculares e zona pelúcida. No detalhe, o polo animal com pigmento citoplasmático de um ovócito IV de Rana catesbiana Corado em HE. Aumentos de 40X e 80X, respectivamente. 51 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 48. Corte histológico de um ovário de anfíbio (Rana catesbiana), evidenciando ovócito IV com células foliculares associadas. Corado em HE. Aumento de 20X. 2.2.3. OVÁRIO DE RÉPTIL Os répteis são vertebrados de fertilização interna, que se tornaram totalmente independentes da água para se reproduzirem. Embora o desenvolvimento embrionário, na maioria das espécies, seja do tipo externo, ou seja, fora do corpo materno, o embrião se desenvolve dentro de uma casca protetora, que compõe o ovo. O ovo é constituído por diversas estruturas que permitem o desenvolvimento embrionário. Uma destas estruturas é o saco vitelínico, constituído por grande quantidade de vitelo, que fornece suprimentos energéticos para o desenvolvimento embrionário. A formação de grânulos de vitelo ocorre durante a ovogênese. Assim, os ovários dos reptilianos mudam drasticamente em formato e tamanho de acordo com o estágio do ciclo reprodutivo em que se encontram. 52 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Os ovários dos répteis são órgãos pares de contorno irregular devido à presença de folículos ovarianos em diferentes estágios de crescimento. Os elementos germinativos encontrados nos ovários são: 1) ovogônias, localizadas no córtex ovariano, 2) oócitos, em diferentes etapas da prófase I da meiose nos folículos em desenvolvimento, 3) folículos atrésicos em estágios de regressão e 4) folículos pós- ovulatórios ou corpo lúteo formado após a ovulação. Os cortes histológicos de ovário de réptil deste atlas pertencem a uma espécie de lagarto (Tropidurus sp.), além disso, é mostrada uma figura de ovo de lagartixa (Hemidactylus frenatus). Assim como nos mamíferos, cada ovócito está abrigado em uma estrutura denominada de folículo ovariano, os quais serão descritos a seguir: 1) Ovogônia: São células diploides, encontradas em um nicho de proliferação celular no epitélio da face dorsal do ovário, denominado de ninho germinativo. São células ovaladas com núcleo volumoso contendo cromatina finamente granulada e nucléolo evidente. 2) Folículo primordial: É formado por um ovócito primário em prófase I (diplóteno), envolto por uma camada de células foliculares pavimentosas e/ou cúbicas. 3) Folículo pré-vitelogênico: Corresponde às fases de folículo primário e folículo em crescimento. Ainda possuem um ovócito primário, porém esses folículos apresentam diferenças quanto ao tamanho do ovócito e organização do epitélio folicular. O ovócito primário inicia seu crescimento, enquanto a camada granulosa passa a apresentar diâmetro variável, sendo constituída por 3 tipos celulares: células pequenas, intermediárias e piriformes. Entre a camada granulosa e o ooplasma, inicia-se a deposição de uma camada glicoproteica – a zona pelúcida. Ao redor da camada granulosa, observa-se uma ou duas camadas da teca. Ainda nesta etapa, o núcleo do ovócito migra gradualmente para o polo animal. Por estar estacionado em diploteno I, notam-se com facilidade seus cromossomos plumosos, bem como uma grande quantidade de pequenos nucléolos. 4) Folículo vitelogênico: O ovócito, agora com núcleo excêntrico (localizado no polo animal) apresenta crescimento rápido com deposição de grânulos de vitelo. Gotículas de lipídeos também poder ser formadas nessa fase. A teca passa a ser constituída por várias camadas, tornando-se cada vez mais vascularizada. A zona 53 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS pelúcida torna-se mais desenvolvida. Próximo à maturação do folículo, as células piriformes são progressivamente reduzidas a células ovoides, diminuindo a espessura da camada granulosa, que passa a ser constituída novamente apenas por células cuboides. 5) Folículo atrésico: São os folículos que não atingiram sua maturação e entram em degeneração. São reconhecidos pela desorganização celular e rompimentos de estruturas, embora a teca permaneça altamente vascularizada. Tanto os folículos pré-vitelogênicos quanto os vitelogênicos podem sofrer atresia. 6) Folículo pós-ovulatório x corpo lúteo: Após a liberação do ovócito, o folículo, agora pós-ovulatório, apresenta uma cavidade irregular central e uma camada folicular retraída, circundada pela camada tecal. Em espécies vivíparas, a granulosa aumenta em espessura e forma múltiplas camadas celulares, que são invadidas por camadas tecais. A cavidade central do corpus lúteo é rapidamente ocupada pela hipertrofia e hiperplasia celular da camada granulosa. A morfologia do corpo lúteo permanece nestas condições durante toda a gestação. Antes do parto e ao final do desenvolvimento embrionário, o corpo lúteo é gradualmente regenerado. Em espécies ovíparas, a atividade máxima do corpo lúteo é estendida até que ocorra a oviposição. Na Figura 54 observa-se o oviduto de Tropidurus sp., formado por um epitélio pseudoestratificado. De acordo com a época de seu ciclo reprodutivo, as criptas e glândulas que o constitui podem estar mais desenvolvidas. 54 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 49. Corte histológico de ovário de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando os folículos ovarianos. Corado em HE. Aumento de 40X. Figura 50. Corte histológico de ovário de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando um ninho germinativo, formado por ovogônias e ovócitos em prófase I, além dos folículos primordial e primário. Corado em HE. Aumento de 400X. 55 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 51. Corte histológico de ovário de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando folículos pré-vitelogênicos e seus envoltórios. Corado em HE. Aumentos de 150X e 400X, respectivamente. Figura 52. Corte histológico de ovário de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando folículo vitelogênico e seus envoltórios. Corado em HE. Aumentos de 40X e 200X, respectivamente. 56 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 53. Detalhes de folículos vitelogênicos de lagarto (Tropidurus sp.). Notar a diferença da constituição da camada granulosa entre os dois folículos. As células piriformes degeneram com o avanço do desenvolvimento folicular. Corado em HE. Aumento de 200X. Figura 54. Corte histológico do oviduto de lagarto (Tropidurus sp.), evidenciando as glândulas e criptas presentes no epitélio. Corado em HE. Aumentos de 40X e 200X, respectivamente. 57 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 55. Ovos fecundados de lagartixa doméstica (Hemidactylus frenatus), evidenciando o embrião em formação sobre o saco vitelínico no polo animal. Aumento de 6X. 2.2.4. OVÁRIO DE AVE Em algumas espécies de aves, os ovários são assimétricos e apenas o oviduto e o ovário do lado esquerdo são desenvolvidos. O ovário de ave é ovoide e pode ser subdividido em duas regiões: córtex e medula. Na região cortical ocorre o desenvolvimento folicular. Ao longo do desenvolvimento folicular, grânulos de vitelo são depositados no ovócito e deslocam o núcleo para uma posição excêntrica. Assim como nos machos, aves sazonais podem apresentar diferenças no peso dos ovários em épocas reprodutivas e não-reprodutivas, sendo o ovário pequeno fora do período de postura. Após a maturidade sexual, a região cortical e medular do ovário perdem seus limites, embora seja possível distinguir regiões com folículos imaturos e folículos em desenvolvimento, em tamanhos variados. A seguir, são demonstrados cortes histológicos de ovário de pombo (Columba sp.) e codorna (Coturnix sp.). 01) Ovogônias: Os ovários da maioria das aves adultas não apresentam ovogônias. Elas estão presentes no ovário, somente por alguns poucos dias após o nascimento do filhote, quando entram em meiose, dando origem aos ovócitos. Dependendo da 58 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS espécie, as ovogônias estão presentes somente durante o período embrionário, como ocorre nos mamíferos. 02) Ovócitos: Os ovócitos encontram-se no interior dos folículos ovarianos que estão unidos à superfície do ovário por um pedículo. Com o desenvolvimento do folículo, os ovócitos passam a acumular vitelo em seu citoplasma. Seu núcleo é chamado de vesícula germinativa quando localizado no centro o ovócito e de disco germinativo após sua migração para o polo animal, tornando-se excêntrico e discoidal. Os ovócitos das aves são os maiores dentre os animais e variam e tamanho e volume, de acordo com a espécie. 03) Folículo primordial: Localizam-se na região cortical do ovário e invadem o estroma ovariano para iniciar seu desenvolvimento. Cada folículo primordial é formado pelo ovócito primário envolvido por uma camada de células foliculares achatadas. 04) Folículo primário: Ainda possui um ovócito primário, porém agora ele está envolto por uma camada de células foliculares cúbicas. 05) Folículo secundário: O ovócito cresce significativamente e as células foliculares multiplicam-se, formando diversas camadas (camada granulosa). Essas células iniciam a produção da zona pelúcida que se deposita ao redor o ovócito. Ao redor das células foliculares, a teca interna e a teca externa iniciam sua diferenciação, tornando-se bastante desenvolvida. A teca interna é formada por fibroblastos, fibras colágenas e outros tipos celulares que, juntos, compõem uma compacta cápsula ao redor do folículo. A teca externa é mais espessa, sendo constituída também por fibroblastos, fibras colágenas e grande quantidade de vasos sanguíneos. Durante o desenvolvimento dos folículos secundários, tem início a deposição de vitelo no citoplasma do ovócito, marcando o período de vitelogênese. Agora esses ovócitos podem ser classificados como ovócitos vitelogênicos. Esses ovócitos se desenvolverão até atingirem seu tamanho máximo, caracterizando um folículo maduro e apto a sofrer ovulação. 06) Folículo pós-ovulatório e folículo atrésico: O folículo pós-ovulatório é o folículo remanescente presente no ovário após a ovulação e regride rapidamente, formando um folículo atrésico. Em aves, o termo folículo atrésico é usado para se 59 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS referir aos folículos em processo de eliminação, seja após a ovulação ou em casos de folículos que não conseguiram se desenvolver completamente e acabam por degenerar. Diferente do que ocorre nos mamíferos, o folículo pós-ovulatório, nas aves, não se transformará em um corpo lúteo. 07) Oviduto: O oviduto é formado por 4 partes - infundíbulo, magno, istmo e útero. O ovócito liberado na ovulação será capturado pelo oviduto e conduzido até a cloaca. Normalmente a fecundação ocorre na região proximal do oviduto, conhecida como infundíbulo. Nas aves, pode haver uma polispermia fisiológica, porém somente um dos pro-núcleos masculinos irá se fundir com o pro-núcleo feminino para formar o ovo ou zigoto. Durante seu trajeto até a cloaca, o ovo é envolto pelo albúmen na porção constituída pelo magno, e posteriormente recebe as membranas da casca ao longo de sua passagem pelo istmo. Finalmente, ao chegar na porção distal do oviduto, conhecida como útero, a casca, formada por carbonato de cálcio, é depositada sobre as membranas que envolvem o ovo. O útero é contínuo à vagina que se conecta à cloaca da ave para a postura do ovo no meio externo. Figura 56. Aparelho reprodutor de codorna (Coturnix sp.). OE: ovário esquerdo, In: infundíbulo, Ma: magno, OdE: oviduto esquerdo, Is: istmo, U: útero, V: vagina, Cl: cloaca, ov: ovo. 60 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 57. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando a região cortical e região medular. Corado em HE. Aumento de 40x. Figura 58. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando os folículos primordiais. Corado em HE. Aumento de 400x. 61 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 59. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando um folículo primário. Corado em HE. Aumento de 400x. 62 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 60. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando um folículo secundário. Corado em HE. Aumento de 400x. Figura 61. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando um folículo secundário em desenvolvimento. O núcleo se torna periférico. Gr: granulosa, Ti: teca interna, Te: teca externa, vs: vaso sanguíneo. Corado em HE. Aumentos de 40x e 200x, respectivamente. 63 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 62. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando um folículo secundário em início de vitelogênese. Zp: zona pelúcida (zona radiata), Gr: granulosa, Ti: teca interna, Te: teca externa, vs: vaso sanguíneo. Corado em HE. Aumentos de 40x e 200x, respectivamente. Figura 63. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando um folículo maduro. Note o núcleo excêntrico, constituindo o disco germinativo. Zp: zona pelúcida, Gr: granulosa, T: teca. Corado em HE. Aumentos de 40x e 100x, respectivamente. 64 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 64. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando um folículo atrésico. Gr: granulosa, T: teca, Ov: ovócito em degeneração. Corado em HE. Aumentos de 40x e 200x, respectivamente. Figura 65. Corte histológico de ovário de codorna (Coturnix sp.), evidenciando um folículo pós-ovulatório. Note as células foliculares e tecais remanescentes. Corado em HE. Aumento de 100x 65 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 66. Corte histológico do oviduto de codorna (Coturnix sp.) – região do magno – evidenciando um as pregas da mucosa, formada por células ciliadas (Cc) e células secretoras (Cs). Ponta de seta: região dos cílios das células epiteliais. Corado em HE. Aumentos de 40x e 200x, respectivamente. Figura 67. Corte histológico de ovário de pombo (Columba sp.). Corado em HE. Aumento de 200x. 66 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 68. Corte histológico de ovário de pombo (Columba sp.). Corado em HE. Aumento de 50x. 2.2.5. OVÁRIO DE MAMÍFERO Podem ser identificadas duas regiões distintas no ovário: o córtex e a e medula. As células germinativas femininas estão localizadas sempre na região cortical. Esse posicionamento é devido ao período de diferenciação gonadal durante o desenvolvimento intrauterino, no qual as células localizadas no córtex da gônada indiferenciada formarão os folículos na fêmea e a medula formará os túbulos seminíferos no macho. As ovogônias, células germinativas precursoras femininas, originam todos os ovócitos primários das fêmeas antes do nascimento. O ovócito está abrigado em uma estrutura denominada de folículo durante todo seu percurso, a qual é responsável por sua nutrição e proteção. Neste Atlas, para fins didáticos, os folículos foram divididos em: primordial, primário, em crescimento e maduro. Além disso, o ovário de mamífero será representado pelo ovário de cadela (Canis lupus 67 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS familiaris), ovário de rata albina (Rattus norvegicus albinus) e ovário de gata (Felis catus). 01) Folículo primordial: Caracterizado por um ovócito primário paralisado na prófase I e envolvido por uma camada de células foliculares achatadas. Ao nascer, a fêmea apresenta apenas esse tipo de folículo. 02) Folículo primário: Ainda possui um ovócito primário, porém agora ele está envolto por uma camada de células foliculares cúbicas. Além disso, ao redor do ovócito está a zona pelúcida, formada por glicoproteínas espécie-específicas e fundamental para o reconhecimento do ovócito pelo espermatozoide. 03) Folículo em crescimento: O ovócito primário, neste estágio, está circundado por duas ou mais camadas de células foliculares cúbicas, caracterizando a camada granulosa. Envolvendo a camada granulosa, é possível observar outras duas camadas celulares: teca interna - vascularizada e produtora de andrógenos (por exemplo, testosterona) - e teca externa - fibrosa. Além das funções anteriormente citadas, a camada granulosa converte esses hormônios em estrógenos através da enzima aromatase. A zona pelúcida apresenta-se mais espessa. 04) Folículo antral: À medida em que o folículo amadurece, uma cavidade preenchida por líquido folicular se desenvolve entre as células da camada granulosa. O ovócito completa a primeira etapa da meiose, inicia a segunda etapa e estaciona na metáfase II, passando a ser denominado ovócito secundário. À medida em que o folículo aumenta de tamanho, passa a ser chamado de folículo maduro. O ovócito II prende-se à camada granulosa através do cumulus oophorus e é externamente envolto pela zona pelúcida e pela corona radiata, as quais permanecem ao redor do ovócito após a ovulação. Externamente, as tecas encontram-se mais desenvolvidas. Dá-se o nome de Folículo de Graaf ao folícuro maduro pré- ovulatório. 05) Folículo atrésico: Apenas alguns folículos terão seus ovócitos secundários ovocitados durante um ciclo de maturação folicular, os demais sofrerão atresia folicular (degeneração) - inclusive por influência dos folículos dominantes. É possível identificar um folículo atrésico por ser disforme e apresentar células foliculares com núcleos picnóticos (cromatina extremamente condensada) soltas na luz do folículo. 68 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 06) Corpo Lúteo: Após a ovulação, o antro e as células remanescentes da granulosa e das tecas formam o corpo lúteo. Ele possui aspecto amarelado e é uma glândula responsável pela secreção de estrógeno e progesterona, hormônios necessários para a preparação do útero para receber um embrião, persistindo ativo até a formação da placenta (corpo lúteo gravídico). Caso não ocorra a fertilização, o corpo lúteo começa a involuir e forma o corpo albicans, uma espécie de cicatriz. Figura 69. Corte histológico de ovário de cadela (Canis lupus familiaris). Corado em HE. Aumento de 10X. 69 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 70. Corte histológico de ovário de cadela (Canis lupus familiaris), evidenciando um folículo primordial. Corado em HE. Aumento de 500x. Figura 71. Corte histológico de ovário de cadela (Canis lupus familiaris), evidenciando um folículo primário. Corado em HE. Aumento de 500x. 70 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 72. Corte histológico de ovário de cadela (Canis lupus familiaris), evidenciando um folículo em crescimento. Corado em HE. Aumento de 400x. Figura 73. Corte histológico de ovário de cadela (Canis lupus familiaris), evidenciando um folículo em crescimento com início do surgimento do antro. Corado em HE. Aumento de 200x. 71 Cg – Camada Granulosa Tc – Células da Teca Ov – Núcleo do ovócito Seta – Zona Pelúcida An – Antro Folicular Ov – Ovócito Tc – Células da Teca Seta – Zona Pelúcida EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 74. Corte histológico de ovário de cadela (Canis lupus familiaris), evidenciando um folículo antral, em processo de maturação. Corado em HE. Aumento de 200x. Figura 75. Corte histológico de ovário de cadela (Canis lupus familiaris), evidenciando um folículo atrésico com suas com núcleos picnóticos na região do antro (pontos escuros). Corado em HE. Aumento de 200x. 72 An – Antro Folicular Co – Cumulus oophorus Cr – Corona radiata Ov – Ovócito Tc – Células da Teca Cg – Camada Granulosa Seta – Zona Pelúcida EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 76. Corte histológico de ovário de cadela (Canis lupus familiaris), evidenciando um corpo lúteo. Corado em HE. Aumento de 50x. Figura 77. Corte histológico de ovário de rata (Rattus norvegicus albinus), evidenciando a tuba uterina e corpos lúteos. Corado em HE. Aumento de 15x. 73 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 78. Corte Histológico de ovário de rata (Rattus norvegicus albinus), evidenciando um folículo primordial. Corado em HE. Aumento de 500x. Figura 79. Corte Histológico de Ovário de rata (Rattus norvegicus albinus), evidenciando um folículo primário. Corado em HE. Aumento de 400x. 74 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 80. Corte Histológico de ovário de rata (Rattus norvegicus albinus), evidenciando um folículo em crescimento. Corado em HE. Aumento de 300x. Figura 81. Corte histológico de ovário de rata (Rattus norvegicus albinus), evidenciando um folículo antral, em processo de maturação. Corado em HE. Aumento de 150x. 75 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 82. Corte histológico de ovário de rata (Rattus norvegicus albinus), evidenciando corpos lúteos. Corado em HE. Aumento de 60x. Figura 83. Corte histológico de ovário de gata (Felis catus), evidenciando um folículo de Graaf. Corado em HE. Aumento de 100x. 76 An – Antro Folicular Co – Cumulus oophorus Cr – Corona radiata Ov – Ovócito Tc – Células da Teca Cg – Camada Granulosa Seta – Zona Pelúcida EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 84. Corte histológico de ovário de ovário de gata (Felis catus), evidenciando corpo lúteo e folículo atrésico. Corado em HE. Aumento de 100x. 77 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 3. TIPOS DE OVOS E TIPOS DE CLIVAGEM O ovo ou zigoto, nos diferentes animais, é constituído por partes distintas de material nutritivo (vitelo) e material formativo (polo animal). O vitelo, substância nutritiva do ovo, provém do gameta feminino e é importante tanto para vertebrados com fecundação externa (peixes e anfíbios), quanto para aqueles que se desenvolvem no interior de ovos com casca calcárea (répteis e aves). Os ovos são classificados de acordo com a quantidade e a distribuição de vitelo presente em seu citoplasma, implicando em diferentes padrões de clivagem ou segmentação. O vitelo inibe o processo de clivagem, portanto, quanto maior a quantidade de vitelo, menor é a velocidade do processo de segmentação. Ovos poder ser denominados de: 1) Oligolécitos ou Isolécitos: por apresentar pouca quantidade de vitelo disperso homogeneamente no citoplasma da célula, apresentam segmentação holoblástica (total) igual. 2) Mesolécitos ou Heteroléticos: a quantidade moderada de vitelo encontra-se dispersa pelo ovo, formando regiões distintas com pouco vitelo (polo animal, contendo o núcleo) e muito vitelo (polo vegetativo). Assim, a segmentação do ovo é holoblástica (total) desigual, resultando em células filhas (blastômeros) com tamanhos diferentes (micrômeros e macrômeros). 3) Megalécitos ou Telolécitos: a grande quantidade de vitelo no citoplasma impede a segmentação total do ovo. Assim, a divisão celular ocorrerá somente numa região discoidal livre de vitelo, onde se localiza o núcleo, formando o polo animal. Esse tipo de segmentação é conhecido como meroblástica (parcial) discoidal. 4) Centrolécitos: O vitelo concentra-se na região central do ovo, ao redor de seu núcleo e impede a divisão citoplasmática nesta região. O núcleo, por sua vez, divide-se repetidamente, migrando para a periferia citoplasmática, que sofrerá segmentação. Assim, esse tipo de segmentação é denominado de meroblástica (parcial) superficial. 78 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 85. Principais tipos de ovos existentes, classificados de acordo com a quantidade e distribuição de vitelo no citoplasma. Os ovos da maioria dos mamíferos podem ser classificados como isolécito ou alécito (desprovido de vitelo). Núcleo (n), vitelo (v), polo animal (pa), polo vegetativo (pv). 79 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 4. DESENVOLVIMENTO INICIAL DO OURIÇO-DO- MAR O ouriço-do-mar é um invertebrado marinho pertencente ao Filo Echinodermata, o primeiro a apresentar deuterostomia, uma característica dos Cordados. Como visto no capítulo anterior, o ovo do ouriço-do-mar é do tipo oligolécito (pouca quantidade de vitelo), assemelhando-se aos de mamíferos. Por essa razão, sua clivagem (do tipo holoblástica total) será utilizada aqui para ilustrar, comparativamente, a clivagem que ocorre nos mamíferos. Nessa lâmina com estágios iniciais do desenvolvimento do ouriço-do-mar, observar-se-á o zigoto e o processo de clivagem: sucessivas divisões celulares mitóticas sem que ocorra recuperação do citoplasma, gerando células-filhas cada vez menores que a célula-mãe. O resultado dessas clivagens é a formação dos blastômeros, com tamanhos aproximadamente iguais (clivagem total igual de ovo oligolécito), localizados nos polos animal e vegetativo. Ademais, é possível observar a blastulação e gastrulação deste animal. As fases de fertilização, clivagem e blastulação caracterizam o Período de Pré-Morfogênese, enquanto a gastrulação remete ao Período de Morfogênese Primária. 01) Zigoto ou célula-ovo: Célula única originada pela fusão dos pró-núcleos feminino e masculino, durante o processo de fecundação. 02) Estágio de 2 blastômeros: Após a primeira clivagem, observa-se dois blastômeros, os quais possuem metade do tamanho do zigoto. Ambos possuem tamanhos iguais por se tratar de uma clivagem holoblástica igual. 03) Estágio de 4 blastômeros: Após a clivagem das células do estágio anterior (segunda clivagem), observa-se um agrupado de 4 blastômeros de mesmo tamanho. 04) Estágio de 8 blastômeros: Após a terceira clivagem, é possível observar 8 blastômeros. 05) Mórula: Após sucessivas clivagens, forma-se uma estrutura que contém entre 32 e 64 blastômeros. A partir desse estágio, encontra-se dificuldade para contar o 80 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS número total de blastômeros, já que se encontram com tamanho reduzido e extremamente compactados. Devido a este fato, essa estrutura assemelha-se a uma amora. 06) Blástula: Após diversas divisões mitóticas, as células passam a se organizar de maneira diferente. Durante o processo de blastulação, ocorre um influxo de água do meio ambiente, afastando alguns blastômeros para a periferia e dando origem a uma cavidade. Os blastômeros da periferia recebem o nome de blastoderme (porção mais escura) e a cavidade repleta de líquido recebe o nome de blastocele; a estrutura completa (blastoderme + blastocele) denomina-se blástula. Observação: No desenvolvimento dos mamíferos a estrutura formada durante a blastulação é denominada blastocisto. Essa estrutura é constituída pelo trofoblasto, embrioblasto e cavidade blastocística. O trofoblasto corresponde à blastoderme e dará origem à porção fetal da placenta. O embrioblasto é um aglomerado de células que se projeta na cavidade blastocística e dará origem ao embrião propriamente dito. A cavidade blastocística corresponde à blastocele e é preenchida por líquido proveniente do útero e dos próprios blastômeros. Figura 86. Comparação entre uma blástula e um blastocisto. 07) Gástrula: Durante o processo de gastrulação ocorre a invaginação (embolia) do epitélio do polo vegetativo em direção ao polo animal, formando uma estrutura 81 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS tubular na blastocele. Nos equinodermas essa estrutura corresponde ao intestino primitivo, também chamado de arquêntero, cuja parede é revestida por endoderme. Nesse mesmo momento dá-se a formação do blastóporo, abertura que originará o ânus, seguida da ruptura da região de contato do arquêntero - que se alongou até o ectoderme (folheto mais externo) do polo animal - com o estomodeu, originando a abertura da boca. O folheto mesodérmico tem origem a partir de células do polo vegetativo e células oriundas do fundo do arquêntero, as quais migram em direção à blastocele. Portanto, os principais movimentos morfogenéticos na gastrulação do ouriço-do-mar são a invaginação ou embolia e migração celular. 08) Larva Pluteus: A Larva Pluteus possui dois braços orais e dois braços anais que têm espículas calcárias, formadas pela ingressão de micrômeros. Ela é um organismo que já pode nadar e alimenta-se de plâncton. Observação: Na espécie humana a gastrulação inicia-se com a formação da linha primitiva. O processo, assim como para as galinhas (que são o modelo de estudo utilizado nos próximos capítulos), dará origem aos três folhetos embrionários: endoderme, mesoderme e ectoderme. Entretanto, a formação do intestino primitivo inicia-se apenas com o dobramento do embrião. Figura 87. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando um Zigoto. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. 82 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 88. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando dois blastômeros. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. Figura 89. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando quatro blastômeros e um zigoto. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. 83 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 90. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando oito blastômeros e um zigoto. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. Figura 91. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando dois, quatro e oito blastômeros. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. 84 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 92. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando uma mórula. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. Figura 93. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando uma blástula com blastocele e blastoderme. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. 85 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 94. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando uma gástrula. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. Figura 95. Lâmina de ouriço-do-mar, evidenciando uma larva Pluteus. Corado com vermelho Congo. Aumento de 400x. 86 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 96. Lâmina de ouriço-do-mar com várias fases do desenvolvimento inicial. Corado com vermelho Congo. Aumento de 50x. 87 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 5. DESENVOLVIMENTO INICIAL DOS PEIXES Os peixes são vertebrados de vida aquática e a maioria deles apresenta fertilização externa e desenvolvimento indireto. Enquanto os ovos são formados no ovário, uma complexa série de camadas de proteínas extracelulares é produzida, originando o córion. Apesar de ter estrutura e desenvolvimento diferentes do córion dos vertebrados Amniotas, esse envoltório externo dos peixes tem igualmente a função de proteção. Após a fertilização o ovo absorve água e ocorre a formação do espaço perivitelínico, o que faz com que o córion se separe da parede do saco vitelínico. Os peixes ósseos (teleósteos) possuem um desenvolvimento inicial similar ao das aves por apresentarem clivagem meroblástica discoidal e, da mesma forma, a blastulação ocorre numa área restrita denominada blastodisco. O vitelo não sofre divisão celular e ocupa grande parte do ovo telolécito. Em peixes elasmobrânquios, por outro lado, o ovo é heterolécito e a clivagem é holoblástica desigual, como nos anfíbios. Neste Atlas será focado o desenvolvimento dos teleósteos, como o Danio rerio, conhecido popularmente como paulistinha ou zebrafish, Cyprinus carpio (carpa comum) e o acará Amatitlania nigrofasciata, um ciclídeo americano. Independente da espécie, o desenvolvimento embrionário dos teleósteos segue o mesmo padrão, variando somente no tempo de diferenciação. Assim, espécies menores diferenciam-se mais rapidamente, enquanto espécies de grande porte desenvolvem-se mais lentamente. O desenvolvimento embrionário do zebrafish, por exemplo, é rápido e compreende o período desde a fecundação até o término do segundo dia (48h). Ainda assim, como nos demais teleósteos, os órgãos continuam a se desenvolver, ainda que em uma velocidade mais lenta do que antes. A clivagem e blastulação ocorrem até cerca de 5h após a fecundação e após esse período, tem início a formação da gástrula. A epibolia do blastoderme, liderada pela camada sincicial de vitelo (formada pelo despejo de citoplasma e núcleo na célula de vitelo pelas células que a margeiam), reveste toda a massa de vitelo do ovo e inicia-se na blastulação, sendo continuada na gastrulação. Durante a gastrulação também ocorrem os movimentos morfogenéticos de involução, convergência e extensão. O embrião 88 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS propriamente dito será formado a partir da convergência de células profundas do blastoderme que migraram e formarão o escudo embrionário, no momento que cerca de 50% da epibolia está completada. O blastoderme dará origem aos três folhetos germinativos. Figura 97. Ovo de Amatitlania nigrofasciata, evidenciando uma blástula. A região mais escurecida marca o processo de epibolia e é possível observar os grânulos de vitelo (GV). Embora não se saiba ao certo a origem da endoderme, supõe-se que ela se forme a partir dos bordos do blastoderme ou por rearranjo de suas células profundas (endomesoderme). No primeiro caso, os bordos do blastoderme são equivalentes ao lábio dorsal do blastóporo nos anfíbios. No bordo posterior do blastoderme forma-se o escudo embrionário e é também o sítio de origem dos rudimentos dos órgãos. Dessa forma, o escudo embrionário é, também, importante para a definição dos eixos embrionários, atuando na formação da placa pré-cordal e da notocorda. Uma diferença interessante no desenvolvimento embrionário dos peixes é a neurulação. Enquanto a maioria dos vertebrados passa por neurulação primária e secundária, os peixes têm apenas a neurulação secundária. Ela consiste no espessamento da placa neural com a formação de um cordão medular e posterior canalização, formando o tubo neural. 89 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Com aproximadamente 16h de desenvolvimento, as vesículas encefálicas primárias de zebrafish estão passando pelo processo de diferenciação em vesículas encefálicas secundárias, a vesícula óptica está visível e ocorre o início da formação do placoide ótico. Alguns somitos começam a se diferenciar em dermátomo, miótomo e esclerótomo. Figura 98. Ovo de Amatitlania nigrofasciata, evidenciando um embrião no estágio de nêurula com cerca de 24h de desenvolvimento. É possível observar os somitos, vesículas ópticas, córion, espaço perivitelínico e grânulos de vitelo (GV). Pouco tempo depois, o placoide ótico torna-se vesícula ótica e inicia-se o desenvolvimento do cerebelo. Com 22h de desenvolvimento, os rudimentos da epífise e do hipotálamo são formados no diencéfalo e o placoide olfatório se desenvolve no telencéfalo. Entre 24 e 48h de desenvolvimento, alguns autores chamam o embrião de Danio rerio de faríngula. Essa denominação se deve à formação dos arcos faríngeos. Nesse período também ocorre a delimitação das 5 vesículas encefálicas secundárias devido à separação do rombencéfalo em metencéfalo e mielencéfalo. 90 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 99. Ovo de Danio rerio, evidenciando um embrião com cerca de 24h de desenvolvimento. O sistema circulatório desenvolve-se bastante durante o período de faríngula. O coração começa a bater e suas câmaras são delimitadas, tendo início a circulação embrionária. Os seis arcos aórticos são formados e, diferentemente dos demais vertebrados estudados neste Atlas, eles não regridem. Pelo contrário, persistem e são responsáveis pela oxigenação do sangue nas brânquias. As carótidas levam sangue à cabeça e veias cardinais anteriores drenam. Outras estruturas que se formam no período de faríngula são: os brotos das nadadeiras, rudimento do fígado, primórdio da bexiga natatória, ductos pronéfricos. Esses últimos fazem parte dos rins pronéfricos. No entanto, ainda haverá o desenvolvimento dos rins mesonéfricos, os quais serão os definitivos. A bexiga natatória é o órgão cheio de gás responsável por auxiliar os peixes ósseos a controlar sua profundidade dentro da água. O embrião de zebrafish pode eclodir a qualquer momento entre o segundo e terceiro dia de desenvolvimento. Mesmo tendo eclodido, continua a se desenvolver na mesma taxa até término do quarto dia. Nesse período, ocorre a abertura da boca 91 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS e desenvolvimento completo das brânquias, bem como continua a formação dos órgãos e demais estruturas. Neste estágio, o peixe em desenvolvimento é denominado de larva. A larva já é um organismo capaz de se movimentar e alimentar. Ainda assim, passará por algumas modificações antes de se tornar um indivíduo juvenil e posteriormente adulto. A seguir, serão apresentados cortes seriados transversais de embriões, larvas e juvenis de Cyprinus carpio. 5.1. CORTES SERIADOS TRANSVERSAIS Embrião de Cyprinus carpio com 67h de desenvolvimento Figura 100. Corte histológico transversal de embrião de Cyprinus carpio com 67h de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 72,10x. 92 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 101. Corte histológico transversal de embrião de Cyprinus carpio com 67h de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 72,10x. Figura 102. Corte histológico transversal de embrião de Cyprinus carpio com 67h de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 124,60x. 93 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Larva de Cyprinus carpio com 7 dias de desenvolvimento Figura 103. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 7 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 41,60x. Figura 104. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 7 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 49,90x. 94 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Larva de Cyprinus carpio com 18 dias de desenvolvimento Figura 105. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 18 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 41,60x. Figura 106. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 18 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 41,60x. 95 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 107. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 18 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 41,60x. Figura 108. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 18 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 41,60x. 96 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 109. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 18 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 66,4x. Figura 110. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 18 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 66,4x. 97 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 111. Corte histológico transversal de larva de Cyprinus carpio com 18 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 65x. Juvenil de Cyprinus carpio com 30 dias de desenvolvimento Figura 112. Corte histológico transversal de um juvenil de Cyprinus carpio com 30 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 34,70x. 98 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 113. Corte histológico transversal de um juvenil de Cyprinus carpio com 30 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 24,10x. Figura 114. Corte histológico transversal de um juvenil de Cyprinus carpio com 30 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 20,10x. 99 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 115. Corte histológico transversal de um juvenil de Cyprinus carpio com 30 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 20x. Figura 116. Corte histológico transversal de uma juvenil de Cyprinus carpio com 30 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 20x. 100 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS Figura 117. Corte histológico transversal de um juvenil de Cyprinus carpio com 30 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 20x. Figura 118. Corte histológico transversal de um juvenil de Cyprinus carpio com 30 dias de desenvolvimento. Corado em HE. Aumento de 20x. 101 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS 6. EMBRIÃO DE GALINHA COM 18h DE INCUBAÇÃO No desenvolvimento inicial do embrião de galinha, que desenvolve um ovo megalécito ou telolécito completo, diferentemente do embrião de ouriço-do-mar, a clivagem é meroblástica (parcial) discoidal: ocorre apenas no blastodisco e o vitelo não cliva. A mórula deste embrião é de curta duração e bem diferente da mostrada no desenvolvimento do ouriço-do-mar: não apresenta a aparência característica de amora, mas sim, mostra-se como uma massa discoidal de células – chamada de blastoderme - aderida ao grande vitelo. Assim como a mórula, a blástula das aves terá aparência achatada sobre o vitelo, com uma luz – blastocele – extremamente reduzida. Com a formação da blástula, o blastodisco pode ser subdividido em área pelúcida, mais central e translúcida, e área opaca, periférica e opaca devido à aderência de partículas do vitelo. A primeira origina tanto o epiblasto quanto o hipoblasto e caracteriza o disco bilaminar. Nesse estágio, ocorre a postura do ovo e é necessário submetê-lo à incubação para o estudo do desenvolvimento embrionário. A análise dos embriões de galinha neste Atlas baseia-se na observação de lâminas histológicas, sendo que a descrição do desenvolvimento embrionário se iniciará pelo embrião com 18h de incubação, que ilustra o processo de gastrulação, responsável, dentre outras coisas, pelo estabelecimento dos três folhetos embrionários. Durante a gastrulação o animal em desenvolvimento apresenta mudanças importantes quanto à forma e tamanho e passa a ser denominado embrião. Por isso, em etapas anteriores ele pode ser chamado de pré-embrião. Esse processo é, em linhas gerais, semelhante nos Amniotas. 6.1. MONTAGEM TOTAL Em primeiro plano observa-se que a estrutura é piriforme. No centro encontra-se a linha primitiva, o blastóporo das aves, formada pela proliferação e migração celular de células epiblásticas em direção ao plano mediano caudal do disco embrionário bilaminar. Ao longo da linha primitiva ocorre a invaginação das células do 102 EMBRIOLOGIA ANIMAL: REFERÊNCIA E ATLAS epiblasto pelo sulco primitivo e bordas primitivas. Na extremidade anterior da linha primitiva forma-se o nó primitivo ou nó de Hensen, cujo sulco denomina-se fosseta primitiva. O nó primitivo, região por onde as células migrarão para originar o processo notocordal, equivale ao lábio dorsal do blastóporo de anfíbios. A linha primitiva define o eixo embrionário, sendo possível a identificação das regiões cranial, caudal, dorsal, ventral, e os lados direito e esquerdo do embrião. A linha primitiva é importante para a migração celular que dará origem aos três folhetos germinativos a partir do epiblasto: endoderme, mesoderme e ectoderme, constituindo o embrião trilaminar. 01) Área pelúcida: É a região do disco embrionário que corresponde ao embrião propriamente dito, localizada sobre a blastocele, cavidade cheia de líquido. É piriforme, mais clara e central na imagem. 02) Área opaca: Região periférica à área pelúcida que tem esse nome devido à opacidade causada por reter partículas de vitelo, além de ilhotas sanguíneas. 03) Membrana bucofaríngea: Observa-se na porção cranial do embrião uma região que possui apenas ectoderme e endoderme fortemente aderidas. Esse local é onde está a membrana bucofaríngea, que irá se romper com o desenvolvimento do embrião para permitir a comunicação da cavidade oral com a faringe. A endoderme da membrana bucofaríngea tem origem a partir de células hipoblásticas cilíndricas, que formam uma área circular espessada, a placa pré-cordal, que é um importante organizador da cabeça. 04) Linha primitiva: Formada por sulco e bordas primitivas. 05) Sulco primitivo: Depressão da linha primitiva, com aspecto de uma linha clara, por onde migram células do epiblasto para, inicialmente, substituir o hipoblasto, formando a endoderme intraembrionária, e células que formarão o folheto intermediário, o mesoderme. As células epiblásticas