496 Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 43, n. 4, p. 496-501, 2006 Avaliação do kit “TF-Test” para o diagnóstico das infecções por parasitas gastrintestinais em ovinos Giuliano LUMINA1 Patrizia Ana BRICARELLO1 Jancarlo Ferreira GOMES2 Alessandro Francisco Talamini do AMARANTE1 Correspondência para: GIULIANO LUMINA Departamento de Parasitologia Instituto de Biologia Universidade Estadual Paulista Caixa Postal 510 18618-000 - Botucatu - SP giulumina@hotmail.com 1 - Departamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual Paulista, Botucatu – SP. 2 - Centro de Pesquisa em Biotecnologia Orion, São Paulo – SP Recebido para publicação: 26/08/2004 Aprovado para publicação: 05/06/2005 Resumo Este estudo teve como objetivos padronizar o kit TF-Test para a quantificação de ovos de parasitas gastrintestinais de ovinos e compará-lo ao método de Gordon & Whitlock modificado (G&W). Vinte quatro cordeiros confinados foram infectados artificialmente com Haemonchus contortus, durante 12 semanas, até o abate, quando foram colhidas amostras fecais e realizada a identificação e contagem dos parasitas abomasais. Nestes animais, ovos de H. contortus foram detectados em 95,8% das amostras fecais por ambos os testes (P>0,05). Os coeficientes de correlação (r) entre a carga parasitária (CP) e os valores de OPG obtidos pelos métodos de G&W e TF- Test foram, respectivamente, de r=0,52 e r=0,51 (dados não transformados) e r=0,85 e r=0,87 (dados transformados em log). Outras 100 amostras fecais foram colhidas de ovinos naturalmente infectados. Nas amostras destes animais, os testes G&W e TF-Test propiciaram o diagnóstico de ovos de estrongilídeos em 85% e 86% das amostras, respectivamente (P>0,05). Pelo TF-Test e pelo G&W, oocistos de Eimeria foram detectados em 33% e em 12% das amostras (P<0,001) e ovos de Strongyloides spp. em 15% e 5% das amostras, respectivamente (P<0,05). Ambos os testes foram precisos para o diagnóstico de estrongilídeos gastrintestinais, porém, o TF-Test foi superior para o diagnóstico de oocistos de Eimeria spp. e de ovos de Strongyloides spp., mas, por outro lado, subestimou o número de ovos de estrongilídeos presente nas amostras. Palavras-chave: Diagnóstico. Haemonchus contortus. OPG. Ovinos. TF-Test. Introdução A quantificação de ovos de nematódeos nas fezes é utilizada para determinar a carga parasitária dos ruminantes, individualmente ou do rebanho1. O método modificado de Gordon & Whitlock (G&W), descrito por Ueno e Gonçalves1, é o mais utilizado. Este método tem com vantagens a simplicidade, a rapidez e o baixo custo para a realização do exame. Porém, possui como inconveniente subestimar o número de ovos presente na amostra2. Além disso, requer amostras fecais frescas refrigeradas para a realização do exame, o que é problema nos casos de propriedades distantes dos laboratórios. O TF-Test® (Produto da Immu- noassay Indústria e Comércio) foi desen- volvido recentemente para diagnóstico de parasitoses gastrintestinais de humanos e tem apresentado excelentes resultados quando comparado a outras técnicas3. Este trabalho teve por objetivos modificar e adaptar o TF- Test para o diagnóstico quantitativo de parasitas gastrintestinais de ovinos. Este método foi avaliado em dois experimentos e comparado com a técnica de G&W. Materiais e Métodos Experimento 1: 24 cordeiros foram mantidos confinados desde o nascimento, livres de infecções por helmintos (12 Santa Inês e 12 Ile de France), em baias com capacidade para 113_04.pmd 19/10/2006, 16:44496 497 Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 43, n. 4, p. 496-501, 2006 seis animais. Aos três meses de idade, os animais foram infectados artificialmente três vezes por semana, com 300 larvas de Haemonchus contortus, ao longo de 12 semanas. O isolado de H. contortus, sensível à ação de anti-helmínticos4, foi gentilmente cedido pelo Dr. F. A. M. Echevarria (EMBRAPA – Bagé). Inicialmente, foram infectados dois cordeiros doadores. Desses animais, foram colhidas fezes para cultura e obtenção de novas larvas infectantes, as quais foram utilizadas para infectar os animais experimentais. Ao final do experimento, amostras fecais foram colhidas de todos os animais para a quantificação de ovos pelos métodos de G&W1 e pelo TF-Test® (Imunoassay, Ind. Ltda). No mesmo dia, os animais foram abatidos para a contagem e identificação dos nematódeos presentes no abomaso1, o que permitiu estimar a carga parasitária de H. contortus. Experimento 2: Foram colhidas 100 amostras fecais de animais de diferentes raças e idades, de quatro propriedades da região de Botucatu- SP, mantidos em pastagem e infectados naturalmente por parasitas gastrintestinais. As amostras de fezes foram processadas pelos métodos de G&W e TF-Test. Determinação da carga parasitária (CP) de H. contortus: O abomaso de cada animal do experimento 1 foi removido e seu conteúdo colhido em balde graduado. Posteriormente, submetido à digestão artificial1 para a recuperação de nematódeos imaturos presentes na mucosa. Alíquotas de 5% do conteúdo do abomaso e de 10% do material da digestão foram colhidas, acondicionadas em frascos plásticos e preservadas em formol (5%). Todos os helmintos presentes no material foram identificados e contados de acordo com os diferentes estágios de desenvolvimento. Na análise dos resultados foram utilizados os dados referentes à carga parasitária total que incluiu parasitas imaturos e adultos. Contagem de ovos por grama de fezes (OPG) pelo “TF-Test”: Ao invés de três coletas em dias alternados (indicado pelo fabricante para aumentar a sensibilidade diagnóstica em humanos), foi realizada apenas uma coleta, para simplificar e viabilizar o uso do kit em animais de produção. Foi utilizado 1 g de fezes por tubo coletor (total de 3 g/kit). O seguinte protocolo foi adotado no processamento das amostras fecais: a) triturar as fezes dos tubos com a colher coletora do kit. Fechar a tampa e homogeneizar o material; b) acrescentar uma gota de detergente neutro incolor e 3 mL de acetato de etila p.a. por tubo coletor. Fechar os tubos e homogeneizar o material; c) encaixar os tubos coletores no conjunto de filtros e centrifugar por 1 minuto a 350 g; d) desprender o conjunto trio filtro mais os tubos coletores-usuário do tubo de centrifugação; e) descartar o material sobrenadante com a utilização de um sifão, deixando o sedimento e mais a quantidade sobrenadante na graduação de 1 mL; f) transferir 10 µL do material homogeneizado para lâmina riscada para quantificação; g) adicionar a quantidade de uma gota de solução fisiológica para a leitura microscópica e cobrir o material com uma lamínula de 22x22 mm; h) contar os ovos de helmintos e oocistos de protozoários em aumento de 100x. Os ovos contidos nos 3 g de fezes foram concentrados em 1 mL de líquido, que foi homogeneizado e dele retirado 10 µL. Assim, cada ovo equivaleu a 100. O valor obtido foi dividido por 3, para obtenção de ovos por grama de fezes. Análise estatística: Para comparar a sensibilidade das técnicas, os dados referentes às contagens de ovos de nematódeos foram analisados pelo método Qui-Quadrado(χ2). Também foi realizada a análise de regressão3, com os dados não transformados e transformados em log10 (x + 1). Os dados transformados referentes às contagens de OPG foram submetidos à análise de variância (One way 113_04.pmd 19/10/2006, 16:44497 498 Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 43, n. 4, p. 496-501, 2006 Tabela 3 - Concordância entre os resultados positivos e negativos obtidos pelos métodos de Gordon & Whitlock modificado (G&W) e TF-Test para diagnóstico de endoparasitas em ovinos naturalmente infectados (Experimento 2; n=100). Botucatu, SP, 2002 c2 = Teste Qui-quadrado de concordância (McNemar) Tabela 2 - Coeficiente de correlação de Pearson (r) e análise de regressão linear entre os resultados obtidos pelos métodos de Gordon & Whitlock, modificado (G&W) e TF-Test (TFT) referentes às contagens de ovos de Estrongilídeos, de ovos de Strongyloides e de oocistos de Eimeria spp., em ovinos naturalmente infectados (Experimento 2; n=100). Botucatu, SP, 2002 *Dados transformados: log10 (x+1) *Dados transformados: log10 (x+1) Tabela 1 - Correlação de Pearson (r) e análise de regressão linear entre a carga parasitária (CP) de H. contortus e os valores de OPG pela técnica de Gordon & Whitlock modificada (G&W) e TF-Test (TFT), em cordeiros artificialmente infectados (Experimento 1; n=24). Botucatu, 2002 analysis of variance) e as médias obtidas pelas duas técnicas foram comparadas pelo teste de Tukey. Para as análises citadas, foi utilizado o programa Minitab, versão 11. Para avaliar os resultados concordantes entre as técnicas, foi aplicado o teste de McNemar5. Resultados Experimento 1: Todos os animais apresentaram-se infectados com H. contortus. A carga parasitária variou de 220 a 3620 exemplares 113_04.pmd 19/10/2006, 16:44498 499 Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 43, n. 4, p. 496-501, 2006 de H. contortus. A contagem de ovos pelo método de G&W variou de 0 a 49500 OPG, enquanto pelo TF-Test variou de 0 a 11567 OPG. Em média os animais apresentaram 9296 OPG e 2344 OPG pelas técnicas de G&W e TF-Test, respectivamente (P<0,05). Quanto à sensibilidade, as técnicas TF-Test e G&W foram coincidentes, detectando ovos de H. contortus em 95,8% dos animais. Apenas um animal não apresentou ovos nas fezes, coincidentemente, este foi o animal que apresentou a menor carga parasitária (n=220). Os coeficientes de correlação (r) entre os valores de OPG pelos testes TF- Test e G&W foram semelhantes (Tabela 1), tanto com os dados transformados (r=0,98; P<0,001) como com os dados não transformados (r=0,97; P<0,001). O coeficiente de correlação obtido entre os valores de OPG pelo TF-Test e a Carga Parasitária (CP) foi mais elevado para os dados transformados (r=0,87; P<0,001) do que para os não transformados (r=0,51; P<0,001). Resultado similar foi observado entre os valores de OPG pelo G&W x CP (Tabela 1). Experimento 2: Em média, os 100 animais apresentaram 2733 OPG e 1029 OPG pelos métodos de G&W e TF-Test, respectivamente (P>0,05). No entanto, quando foram eliminados da análise os nove animais com OPG=0 , as médias de OPG pelo G&W e TF-Test (2971 OPG e 1118 OPG, respectivamente) diferiram estatisticamente (P<0,05). Nos animais infectados naturalmente, foram detectados ovos de estrongilídeos em 85% e 86% das amostras analisadas pelo G&W e TF-Test, respectivamente (χ2=0,04; P=0,841). Para Eimeria spp. houve diferença entre as técnicas (χ2=12,6; P<0,001), com 33% das amostras positivas para oocistos no TF-Test e 12% no G&W. O mesmo ocorreu no diagnóstico de ovos de Strongyloides spp., com 15% das amostras positivas no TF-Test e 5% no G&W (χ2=5,56; P<0,02). Coeficientes de correlação elevados entre TF-Test e G&W ocorreram apenas nas análises realizadas entre a contagem de ovos de estrongilídeos (Tabela 2). Porém, ao contrário do que ocorreu no Experimento 1, o coeficiente de correlação com os dados transformados (r=0,58; P<0,001) foi menor do que com os dados não transformados (r=0,94; P<0,001). A concordância entre os resultados positivos e negativos obtidos pelo G&W e TF-Test estão apresentados na tabela 3. Os resultados obtidos entre TF-Test e G&W para o diagnóstico de estrongilídeos demonstrou que a discordância entre as técnicas não foi significativa (P=1,0). No entanto, houve discordância significativa entre os testes em relação ao diagnóstico de oocistos de Eimeria spp. e os ovos de Strongyloides spp. Neste caso o TF-Test apresentou maior sensibilidade. Discussão A avaliação qualitativa comprovou a eficiência de ambos os testes para o diagnóstico de estrongilídeos gastrintestinais. Estes resultados estão de acordo com Hoshino-Shimizu et al.3 que relataram semelhança entre o TF-Test e outras técnicas utilizadas em humanos. Entretanto, estes autores observaram que o TF-Test foi significantemente superior às demais técnicas, nos casos de baixa carga parasitária (OPG <100). Os resultados da tabela 1 indicam uma estreita relação dos resultados obtidos com as duas técnicas com o resultado da carga parasitária (r=0,87 para TF-Test X CP e r=0,85 para G&W X CP). Esses resultados concordam com os de Roberts e Swan6 e Amarante7, que obtiveram um alto coeficiente de correlação (0,83 e 0,91, respectivamente), quando relacionaram a técnica de G&W com a carga parasitária, confirmando a estreita associação entre o OPG e o número de exemplares de H. contortus. No estudo de concordância entre os resultados do Experimento 1, pôde-se observar que as duas técnicas foram 100% coincidentes para 113_04.pmd 19/10/2006, 16:44499 500 Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 43, n. 4, p. 496-501, 2006 a detecção de ovos de H. contortus. Assim, ficou claro que contagens de OPG podem ser utilizadas com segurança para estimar o grau da infecção de um rebanho ovino. Pelo “TF-Test” o número de ovos de estrongilídeos foi subestimado em comparação com a técnica de G&W, mas por outro lado foi superior para o diagnóstico de oocistos de Eimeria spp. e ovos de Strongyloides spp.. Essas diferenças, entre os resultados obtidos com as duas técnicas, talvez se devam ao tamanho das estruturas pesquisadas. Os ovos de estrongilídeos são maiores e talvez tenham ficado retidos nas malhas do kit, ou talvez muitos deles não tenham sedimentado com a centrifugação empregada. Esse problema não ocorreu com os ovos de Strongyloides spp. e com os oocistos de Eimeria spp. que são bem menores1. Portanto, outros estudos serão necessários para aprimorar o TF- Test para o diagnóstico quantitativo de ovos de estrongilídeos. Rossanigo e Gruner2 demonstraram que pela técnica de G&W modificada por Raynald8, utilizando sulfato de magnésio no lugar de cloreto de sódio, apenas 16,5% dos ovos presentes nas amostras eram detectados em comparação com a técnica de extração de ovos e contagem, depois de três centrifugações. Esses autores perceberam a necessidade da centrifugação das amostras para detecção mais acurada dos ovos dos parasitas; entretanto, mesmo após esta falha ter sido detectada, a técnica de G&W continuou sendo a mais utilizada, por ser de execução mais fácil e mais rápida que o método ao qual foi comparada. Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que esse problema é ainda mais acentuado na técnica TF-Test. A avaliação do TF-Test poderia ter sido mais satisfatória se o método de enriquecimento parasitário (três coletas em dias alternados), como indica o fabricante, fosse utilizado nesse estudo; pois é sabido que apenas uma coleta de fezes não é suficiente para a detecção dos parasitas no caso de infecções leves9. As três coletas em dias alternados constituem uma opção para minimizar as variações do número de ovos nas fezes9,10. Segundo Ward, Lyndal-Murphy e Baldock et al.10, a contagem de ovos por grama de fezes também pode ser influenciada pela produção fecal, idade e espécie do parasita, variação biológica na fecundidade dos helmintos, estado imune do hospedeiro, além dos fatores sazonais. Em animais de produção, a prática de uma coleta de fezes é a maneira mais simples para a realização de um exame parasitológico e como o objetivo principal desse trabalho foi adaptar o TF-Test para utilização rotineira em ovinos, optou-se por apenas uma coleta. O método G&W é realizado com amostras fecais refrigeradas11. Isto constitui um fator limitante para as propriedades distantes dos laboratórios e que necessitam desse exame rotineiramente. Essa limitação, entretanto, não ocorre com o uso do TF-Test que apresenta uma solução neutra de formalina a 10%; a solução mais empregada na conservação de materiais biológicos. Deve-se lembrar que o emprego do TF-Test no diagnóstico de parasitas gastrintestinais de ovinos exige um laboratório com centrífuga e outros suprimentos básicos que a técnica requer, além da aquisição dos kits pelos produtores. Em condições de campo, há necessidade ainda de se avaliar o custo/benefício da utilização desta técnica. Como conclusão, foi possível adaptar e utilizar o TF-Test para o diagnóstico dos parasitas gastrintestinais de ovinos. Para o diagnóstico de estrongilídeos, o TF-Test foi qualitativamente semelhante ao G&W, mas quantitativamente, o TF-Test subestimou o número de ovos nas amostras. Entretanto, para detecção de oocistos de Eimeria spp. e ovos de Strongyloides spp., o TF-Test foi superior. O TF-Test pode ser indicado para amostras fecais colhidas em localidades distantes dos laboratórios onde serão realizados os testes, pois as mantêm preservadas por longo período. Agradecimentos Aos técnicos Maria Ângela B. Gomes e Valdir A. Paniguel e a pós-graduanda Raquel A. da Rocha pelo auxílio nas atividades de campo e laboratório. O primeiro autor foi bolsista da CAPES. 113_04.pmd 19/10/2006, 16:44500 501 Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 43, n. 4, p. 496-501, 2006 The evaluation of “TF-Test” kit for diagnosis of gastrointestinal parasite infections in sheep Abstract This study was performed to standardize parasite egg counting in feces of sheep by TF-Test, in addition to compare this test to the Gordon & Whitlock technique (G&W). Twenty-four lambs were artificially infected with Haemonchus contortus throughout 12 weeks. At the end of this time, faecal samples were taken and animals were slaughtered for worm identification and counting. G&W and TF- Test methods were carried out on each fecal sample. Both tests showed Haemonchus eggs in 95.8% of the samples (P>0.05). The correlation coefficients (r) between fecal egg counts (FEC) using G&W x Total Worm Count (TWC) were r=0.52 (not transformed data) and r=0.85 (transformed data); between FEC by TF-Test x TWC were r=0.51 (not transformed data) and r=0.87 (transformed data). Other 100 fecal samples were taken from naturally infected sheep. In these animals, the G&W and TF-Test methods showed 85% and 86% of fecal samples positive for Strongylidea eggs, respectively (P>0.05). Also in those animals, Eimeria oocysts were found in 33% of fecal samples by TF-Test, whereas in the G&W only 12% were positive (P<0.001). For Strongyloides spp., TF-Test showed 15% of positive fecal samples, whereas G&W showed 5% (P<0.05). In conclusion, both methods were efficient to diagnose gastrointestinal nematodes and TF-Test was superior to diagnose oocysts of Eimeria spp. and eggs of Strongyloides spp; conversely, Strongylidea eggs counting using TF- Test was underestimated. Key words: Diagnostic. FEC. Haemonchus contortus Sheep. TF-Test. Referências 1 UENO, H.; GONÇALVES, P. C. Manual para diagnóstico das helmintoses de ruminantes. 4. ed. Tokyo: Japan International Cooperation Agency, 1998. 143 p. 2 ROSSANIGO, C. E.; GRUNER, L. Accuracy of two methods for counting eggs of sheep nematode parasites. Vet. Parasitol., v. 39, p. 115-121, 1991. 3 HOSHINO-SHIMIZU, S.; GOMES, J.F.; DIAS, L.C.S. Parasitos intestinais: técnicas tradicionais e conjuntos comerciais. J. Bras. Patol., v. 37,p. 21, 2001. Suplemento. 4 ECHEVARRIA, F. A. M.; ARMOUR, J.; DUNCAN, J. L. Efficacy of some anthelmintics on an ivermectin- resistant strain of Haemonchus contortus in sheep. Vet. Parasitol., v. 39, p. 279-284, 1991. 5 CURI, P. R. Metodologia e análise da pesquisa em ciências biológicas. Botucatu: Gráfica e Editora Tipomic, 1997. 263 p. 6 ROBERTS, J. L.; SWAN, R. A. Quantitative studies of ovine haemonchosis. I. Relationship between faecal egg counts and total worm counts. Vet. Parasitol., v. 8, p.165-171, 1981. 7 AMARANTE, A. F. T. Relationship between faecal egg counts and total worm counts in sheep infected with gastrointestinal nematodes. Brazil. J. Vet. Parasitol., v. 9, n. 1, p. 45-50, 2000. 8 RAYNALD, J. P. Etude de l’efficacité d’une technique de coproscopie quantitative pour le diagnostic de routine et le contrôle des infestations parasitaires des bovins, ovins, équins et porcins. Ann. Parasitol. Hum. Comp., v. 45, p. 321-342, 1970. 9 ARAÚJO, A. J. U. S.; KANAMURA, H. Y.; DIAS, L. C. S.; GOMES, J. F.; ARAÚJO, S. M. Coprotest Quantitativo: Quantificação de ovos de helmintos em amostras fecais utilizando sistema de diagnóstico comercial. J. Bras. Patol. Med. Lab., v. 39, n. 2, p. 115- 124, 2003. 10 WARD, M. P.; lyndal Murphy,M.;Baldock, Evaluation of a composite method for counting helminth eggs in cattle faeces. Vet. Parasitol., v.73, p.181-187, 1997. 11 URQUHART, G. M.; ARMOUR, J.; DUNCAN, J. L.; DUNN, A. M.; JENNINGS, F. W. Parasitol. Vet. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1990. 306 p. 113_04.pmd 19/10/2006, 16:44501 << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /All /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Warning /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJDFFile false /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /ColorConversionStrategy /LeaveColorUnchanged /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /SyntheticBoldness 1.00 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveEPSInfo true /PreserveHalftoneInfo 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