Universidade Estadual Paulista  

“Júlio de Mesquita Filho” 

 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas 

                        

 

 

 

Capacidade antioxidante de polimetoxiflavonas 

e identificação de seus metabólitos em ratos  

 

 

 

Marilia Caroline Martini Rodrigues 

 

Dissertação apresentada ao 

Programa de Pós-Graduação em 

Alimentos e Nutrição para obtenção 

do título de Mestre em Alimentos e 

Nutrição. 

 

Área de concentração: Ciências 

Nutricionais. 

Orientador: Prof. Dr. Thais Borges 

Cesar. 

 

 

 

 

ARARAQUARA 

2016 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Capacidade antioxidante de polimetoxiflavonas 

e identificação de seus metabólitos em ratos  

 

 

 

Marilia Caroline Martini Rodrigues 

 

Dissertação apresentada ao 

Programa de Pós-Graduação em 

Alimentos e Nutrição para obtenção 

do título de Mestre em Alimentos e 

Nutrição. 

 

Área de concentração: Ciências 

Nutricionais 

Orientador: Prof. Dr. Thais Borges 

Cesar 

 

 

 

 

ARARAQUARA 

2016 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 
 

 

 

 
 

 
 

 

 

 
 

 

 

 
 

 

 

 
 

 
 
 

 

 

     
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – Faculdade de Ciências Farmacêuticas 

UNESP Campus de Araraquara 
 

                   Rodrigues, Marilia Caroline Martini. 
R696c            Capacidade antioxidante de polimetoxiflavonas e identificação 

de seus metabólitos em ratos / Marilia Caroline Martini Rodrigues. 
– Araraquara: [S.n.],  2016. 

                           74 f. : il. 
 

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. 
“Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. 
Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição. Área de 

Concentração em Ciências Nutricionais. 
 

                           Orientadora: Thais Borges Cesar. 
 

       1.  Nobelitina. 2. Tangeretina. 3.  Metabólitos. 4. Atividade 

antioxidante. 5. Retinol. 6. Alfa-tocoferol.  I. Cesar, Thais Borges, 

orient. II. Título. 

33004153070P3 
Esta ficha não pode ser modificada 



 

 

 

 

MARILIA CAROLINE MARTINI RODRIGUES 

 

 

 

Capacidade antioxidante de polimetoxiflavonas e identificação de seus 

metabólitos em ratos  

 

 

 

Dissertação de Mestrado apresentada à 

Faculdade de Ciências Farmacêuticas da 

Universidade Estadual Paulista – UNESP, 

Campus de Araraquara como requisito para 

obtenção do título de Mestra em Alimentos e 

Nutrição. 

 

 

Araraquara, 28 de novembro de 2016. 

 

 

  



 

 

 

 

 

 Agradecimentos Pessoais  

 

Agradeço a Deus pela oportunidade de viver.  

 

Aos meus pais, Evandro e Silvia, à minha irmã, Camila, aos 

meus avós, Geni e Luiz, e à minha tia Rosemeire que sempre me 

apoiaram e me proporcionam a força e a luz para sempre ser 

uma pessoa melhor. 

 

À Karine, minha amiga querida, que abriu as portas de casa no 

momento em que precisei e por toda convivência que sentirei 

muita falta. 

 

À Paula, à Danielle, à Sara, à Marina, à Melaine, à Carol, à 

Olivia, à Renata e à Grace pelos dias de alegria e excelente 

convivência no laboratório. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

Agradecimentos 

 

À orientadora Prof. Dr. Thais Borges Cesar pela competência, 

paciência e carinho com que sempre me ensinou. 

À Danielle Raquel Gonçalves pela grande ajuda no 

desenvolvimento do trabalho e pelo carinho dedicado. 

Ao USDA e principalmente ao pesquisador John A. Manthey e 

pela dedicação e por disponibilizar os compostos desse estudo. 

À pesquisadora Ana Lucia Nasser por toda paciência e 

competência em me ensinar a fazer as análises. 

Ao Carlos Alberto Arcaro Filho pelo aprendizado no manuseio 

dos animais e disponibilidade para me ajudar no decorrer do 

trabalho. 

À Paula Souza Ferreira pela dedicação e carinho em 

praticamente todas as etapas de análises. 

À Marina, à Melaine, à Carol e à Bruna por toda ajuda nas 

análises no laboratório. 

Ao Lucas e ao Willian por toda a ajuda com a manipulação dos 

ratos e amizade. 

Aos professores integrantes da comissão examinadora pelas 

valiosas sugestões ao trabalho. 

A todos do Laboratório de Bioquímica do Departamento de 

Análises Clínicas – UNESP (prof. Iguatemy e profa. Amanda) 

por compartilharem toda experiência de trabalho com animais, 

utilização do biotério e receptividade de sempre. 



 

 

 

 

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível 

Superior (Capes) pela concessão de bolsa. 

Aos docentes e funcionários do Departamento de Alimentos e 

Nutrição pelo ensino e dedicação. 

Ao Conselho da Pós-graduação, em especial à profa. Dra. 

Juliana Álvares Duarte Bonini Campos, pela dedicação e 

confiança. 

Ao Departamento de Alimentos e Nutrição da FCFAr-UNESP, 

pela oportunidade de realização deste trabalho. 

Às funcionárias Claudia e Daniela da Seção de Pós-Graduação 

da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP de 

Araraquara por toda a ajuda, apoio e disponibilidade 

concedidos 

E a todos que direta ou indiretamente fizeram parte desta 

realização. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

RESUMO 

Objetivo: Verificar a capacidade antioxidante das polimetoxiflavonas 

tangeritina (TAN), nobelitina (NOB) no soro sanguíneo e fígado. Métodos: 

Grupos de ratos foram tratados com 200 mg/kg pc/dia de TAN ou NOB, ou 

placebo, por 15 dias. Compostos parentais e seus metabólitos foram 

avaliados no fígado por análise cromatográfica, além de α-tocoferol e retinol 

no soro sanguíneo.  Resultados: Ambos os suplementos TAN e NOB foram 

capazes de reduzir o malonaldeído (MDA) no sangue do rato em 22% e 

18%, respectivamente, mas apenas o NOB aumentou a reação redox em 

3%. os níveis sanguíneos de retinol e α-tocoferol aumentaram sob TAN em 

59% e 20%, respectivamente, mas não foram afetados por NOB. Oito 

metabólitos NOB foram detectados no fígado, mas apenas dois metabólitos 

TAN foram identificados em baixa concentração. Conclusão: o grupo que 

recebeu NOB melhorou a capacidade antioxidante e reduziu a peroxidação 

lipídica, enquanto o aumento dos níveis de retinol e α-tocoferol após a 

suplementação de TAN pode ter contribuído para a diminuição da 

peroxidação lipídica no sangue. 

 

Palavras-chave: nobelitina, tangeretina, metabólitos, atividade antioxidante, 
retinol, alfa-tocoferol 
 
 
 
 
 
  



 

 

 

 

ABSTRACT 
 
Objective: The effects of tangeretin (TAN) and nobiletin (NOB) on 

antioxidant activity in the blood and liver of rats were evaluated. Methods: 

Groups of rats were treated with 200 mg/kg bw/day of TAN or NOB, or 

placebo, for 15 days. Parental compounds and their metabolites were 

assessed in the liver by chromatographic analysis, in addition to α-tocopherol 

and retinol in the blood serum. Results: Both TAN and NOB supplements 

were able to reduce malonaldehyde (MDA) in the rat’s blood by 22% and 

18%, respectively, but only NOB increased redox reaction by 3%. Blood 

levels of retinol and α-tocopherol increased under TAN by 59% and 20%, 

respectively, but were not affected by NOB. Eight NOB metabolites were 

detected in the liver, but only two TAN metabolites were identified in low 

concentration. Conclusion: NOB improved antioxidant capacity and reduced 

lipid peroxidation, while increased levels of retinol and α-tocopherol after 

TAN supplement may have contributed to decreased blood lipid peroxidation.  

 

Keywords: nobiletin, tangeretin, metabolites, antioxidant activity, retinol, 

alpha-tocopherol 



 

 

 

 

Sumário 

 Página 

Resumo VIII 

Abstract IX 

  

Introdução 11 

  

Capítulo 1: Differential Effect of Nobiletin and Tangeretin on the 

Antioxidant Activity and Levels of α-Tocopherol and Retinol in 

Rats 

 

32 

Resumo 33 

Introdução 34 

Métodos 35 

Resultados 41 

Discussão 46 

Conclusão 51 

Acknowledgments 52 

Referências 52 

  

Considerações Finais 59 

Referências 60 

Anexo 74 

 



11 

 

 

 

INTRODUÇÃO  

 

As frutas cítricas são fontes ricas de fitoquímicos, tais como flavonoides, 

carotenoides, vitaminas A, C e E, elementos minerais, entre outros 

compostos (ZHOU, 2012), os quais possibilitam a essas frutas atividades 

biológicas importantes como antioxidantes, anti-inflamatórias, 

hipolipidêmicas, antineoplásicas, neuroprotetoras. Essas atividades estão 

intimamente ligadas à produção de radicais livres no organismo.  

 

Radicais Livres e Antioxidantes 

Os radicais livres (RL) são espécies cujas reatividades resultam da 

presença de um ou mais elétrons desemparelhados na estrutura atômica 

(HALLIWELL, 1997) e que são geradas continuamente durante os processos 

metabólicos. A alta reatividade desses compostos os possibilita reagir com 

biomoléculas tais como carboidratos, lipídios, proteínas e ácidos nucleicos 

(ALVES et al., 2010; FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Existem espécies 

radicalares e não radicalares. Os radicais livres nos quais os elétrons 

desemparelhados encontram-se centrados em átomos de oxigênio ou de 

nitrogênio são denominados espécies reativas de oxigênio (ERO) ou 

espécies reativas de nitrogênio (ERN). Entre as principais ERO radicalares, 

destacam-se o ânion superóxido (O2•-), radical hidroxila (HO•), peroxila 

(ROO•), alcoxila (RO•); e para as não radicalares destacam-se o peróxido de 

hidrogênio (H2O2), ácido hipocloroso/hipoclorito (HOCl/OCl-) e o oxigênio 



12 

 

 

 

singlete (1O2). O óxido nítrico (NO•) e o peroxinitrito (ONOO-) constituem as 

principais ERN.  

A geração de radicais livres constitui um processo contínuo e fisiológico, 

cumprindo funções biológicas relevantes, tais como produção de energia, 

fagocitose, regulação do crescimento celular e síntese de biomoléculas 

importantes (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).  

Durante os processos metabólicos, esses radicais atuam como 

mediadores para a transferência de elétrons nas várias reações bioquímicas, 

porém em condições nas quais ocorre produção excessiva de RL, o 

equilíbrio redox é alterado, ocasionando desequilíbrio entre os sistemas pró 

e antioxidantes, e por consequência, danos oxidativos, que culminam em 

estresse oxidativo (VASCONSELOS et al.,2007; BARREIROS; DAVID; 

DAVID, 2006; FINKEL; HOLBROOK, 2000). Esse desequilíbrio redox 

apresenta efeitos prejudiciais à saúde, principalmente eventos intracelulares 

importantes para o desenvolvimento e complicação de várias doenças, como 

por exemplo, aterosclerose, diabetes mellitus, inflamações, cardiopatias, 

doenças neurodegenerativas (doença de Alzheimer, esclerose múltipla, mal 

de Parkinson), câncer, entre outras (PADURAIU et al., 2013; HALLIWELL; 

GUTTERIDGE, 1995; NIKI, 2010; DURACKOVÁ, 2010; RODRIGUES, 2007; 

VASCONCELOS et al., 2007; VALKO et al., 2006; FINKEL; HOLBROOK, 

2000). 

O excesso de radicais livres no organismo é neutralizado por 

antioxidantes. Eles são capazes de interceptar os radicais livres gerados 

pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre 



13 

 

 

 

os lipídeos, os aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos 

poliinsaturados e as bases do DNA, evitando a formação de lesões e perda 

da integridade celular (BIACHI; ANTUNES, 1999). 

Os antioxidantes são divididos em endógenos (produzidos pelo corpo), 

como a glutationa peroxidase (GPx), a superóxido dismutase (SOD) e a 

catalase (CAT), ou exógenos (absorvidos através de dieta), como o α-

tocoferol (vitamina-E), β-caroteno (pro-vitamina-A), retinol (vitamina A), ácido 

ascórbico (vitamina C), e compostos fenólicos, nos quais se destacam os 

flavonoides (HALLIWELL et al., 1995; PIETTA, 2000; BARREIROS; DAVID; 

DAVID, 2006; BARREIROS et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2009; KAJARIA et 

al., 2012; PADURAIU et al., 2013). 

A atividade antioxidante se refere à capacidade de um composto bioativo 

em manter a estrutura e a função celular eliminando eficazmente os radicais 

livres, inibindo reações de peroxidação lipídica e impedindo outros danos 

oxidativos (BRAVO, 1998). Essa ação inclui a regulação de enzimas 

antioxidantes e detoxificantes, a modulação da sinalização celular redox e a 

expressão de genes (LÓPEZ-ALARCÓNA; DENICOLA, 2013). 

 

Antioxidantes Endógenos e Exógenos 

Vitamina E 

Um potente antioxidante exógeno é a vitamina E, representada pelo alfa-

tocoferol, protege especialmente os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) 

de membranas biológicas e as lipoproteínas da oxidação em hidroperóxidos 

(BRAMLEY et al., 2000). Em humanos as concentrações mais elevadas de 



14 

 

 

 

-tocoferol encontram-se principalmente nas lipoproteínas HDL e LDL 

(DEBIER; LARONDELLE, 2005). 

A vitamina E restringe os radicais livres, extingue o oxigênio singleto 

(1O2), reduzi o ferro ferroso (Fe2+) ao ferro férrico (Fe3+) para minimizar a 

catálise, efeito sinérgico com selênio para proteger as mitocôndrias contra 

danos causados por radicais livres e suas membranas contra danos à 

peroxidação, impedem a oxidação do carotenoide, aumentando a sua 

capacidade antioxidante (LEVANDER; AGER; BECK, 1995; AMITAVA; 

KIMBERLY, 2014). 

Por impedir danos aos tecidos mediados por radicais livres, acredita-se 

que a vitamina E desempenhe um papel fundamental em retardar a 

patogênese de várias doenças degenerativas, como câncer, aterosclerose, 

doenças cardiovasculares, doenças das vias aéreas, Alzheimer, entre outras 

doenças neurológicas (DUTTA; DUTTA, 2003; TRABER, 2007; FARINA; 

ISAAC; LI et al., 2015; MILLER; TURNER; CORNISH, 2015). No fígado, o 

alfa-tocoferol se liga à proteína de transporte do alfa-tocoferol (α-TTP), que o 

libera para ser transportada pela VLDL na corrente sanguínea, podendo ir 

para outros tecidos ou retornar ao fígado (AZZI; STOCKER, 2000; TRABER, 

2007; BORTOLI; COZZOLINO, 2012).  

Vitamina A e precursores  

Outros antioxidantes exógenos importantes são os carotenoides que 

agem como desativadores do oxigênio singleto (1O2) ou como 

sequestradores dos radicais peroxila (LOO•), reduzindo a oxidação do DNA 

e lipídios, que está associada a doenças degenerativas, como câncer e 



15 

 

 

 

doenças cardíacas. carotenoides apolares, como o β-caroteno, são 

regeneradores, combatendo os radicais formados com mais eficiência no 

interior da membrana (WOODALL, et al., 1997). Os retinóides (vitamina A) 

possuem grupos polares que os localizam na membrana celular na região 

próxima à fase aquosa, entretanto, apresentam atividade antioxidante cerca 

de cinco vezes menor que a do β-caroteno. 

Glutationa Peroxidase 

Há ainda as enzimas antioxidantes endógenas, nas quais uma de suas 

principais representantes é a glutationa peroxidase (GPx), uma família de 

múltiplas isoenzimas, encontrada no citosol e nas mitocôndrias, que catalisa 

a redução de H2O2 ou hidroperóxidos orgânicos em água ou álcoois 

correspondentes usando a glutationa reduzida como doador de elétron. Ela é 

responsável pela detoxificação de peróxidos orgânicos e inorgânicos, sendo 

sua ação dependente da glutationa reduzida (GSH), que é oxidada em 

glutationa oxidada (GSSG). Os níveis de GSH são mantidos por meio da 

oxidação do NADPH resultante do ciclo das pentoses (BALLATORI, 2009). 

Além dos antioxidantes endógenos, como já ditos anteriormente, existem, 

os antioxidantes exógenos, adquiridos através da alimentação, como os 

flavonoides.   

 

Flavonoides 

Os flavonoides são o grupo mais comum e amplamente distribuído de 

polifenois de plantas e mais de 5000 diferentes já foram descritos. 

(HARBONE, 1993; YANG et al., 2001; MARCHAND, 2002; MANACH et 



16 

 

 

 

al.,2004; GONÇALVES, 2008). Eles são formados nas plantas a partir dos 

aminoácidos aromáticos fenilalanina e tirosina, e malonato de dietila 

(HARBORNE, 1986). Eles possuem uma estrutura comum consistindo em 2 

anéis aromáticos (A e B) ligados por 3 átomos de carbono, formando 

heterociclo oxigenado (anel C) (MANACH et al.,2004). Segundo Lima (2008), 

os flavonoides estão envolvidos em várias funções na planta: propriedades 

sensoriais (cor, aroma, sabor e adstringência), crescimento, processo 

germinativo da semente, defesa contra pragas, entre outros. Em animais e 

humanos, observa-se que são capazes de reagir com radicais livres, 

neutralizando-os, o que os caracteriza como potentes agentes antioxidantes. 

 

Figura 1. Estrutura molecular dos flavonoides (Fonte Mateus, 2009) 

Os flavonoides têm um papel direto na remoção de espécies reativas de 

oxigênio (ROS), o que pode neutralizar a oxidação lipídica in vitro e melhorar 

a atividade enzimática dos antioxidantes endógenos e diminuir a formação 

de peróxidos in vivo (NAKAO et al., 2011). 



17 

 

 

 

A atividade antioxidante dos ácidos fenólicos está vinculada, 

principalmente, às propriedades redutoras de sua estrutura, as quais atuam 

tanto na captura de espécies reativas, quanto na inativação de metais de 

transição, participando assim, das etapas de iniciação e propagação do 

processo oxidativo (SOUZA et al., 2007). A ressonância do anel aromático 

que compõe a estrutura dos compostos fenólicos é responsável pela 

estabilidade dos produtos intermediários formados durante a interação 

destes compostos com as espécies reativas (RAMALHO; JORGE, 2006). A 

atividade de eliminação de RL parece diretamente relacionada com o 

número de grupos hidroxilos substituídos no anel B, especialmente em C-3'. 

Quando o número de grupos hidroxilo diminui, a capacidade de extinção de 

OH cai rapidamente (HUSAIN et al., 1987). 

Existem, na literatura, controvérsias a respeito do mecanismo de ação 

dos flavonoides. Eles atuam como antioxidantes na inativação dos RL tanto 

nos compartimentos celulares lipofílicos quanto hidrofílicos, doando átomos 

de hidrogênio e inibindo reações em cadeia provocadas pelos RL 

(HARTMAN; SHANKEL, 1990; ARORA et al., 1998). Assim, a ação 

antioxidante eficaz dos flavonoides depende principalmente de três fatores: o 

potencial quelante de metal, que é fortemente dependente de grupos 

hidroxilas e carbonilas em torno da molécula; a presença de substituintes 

doadores de hidrogênio/elétrons, capazes de reduzir os radicais livres; e a 

capacidade do flavonoide de deslocar o elétron não emparelhado, para a 

formação de um radical fenoxil estável (SHAHIDI; AMBIGAIPALAN, 2015). 



18 

 

 

 

Os flavonoides que possuem um grupamento hidroxila livre são mais 

fisiologicamente ativos do que os compostos metilados em sua atividade de 

eliminação de RL. Portanto, flavonoides que possuem um radical hidroxila 

têm uma maior capacidade de varrimento de espécies de RL, ao passo que 

os flavonoides totalmente metoxilados, como as polimetoxiflavonas, podem 

efetivamente inibir as enzimas como a sintase induzível do óxido nítrico 

(iNOS) e NADPH oxidase, que geram radicais livres como NO e ânion 

superóxido, obtendo também um potencial antioxidante (MURAKAMI et al., 

2000; CHOI et al., 2007; LI et al., 2007).  

 

Polimetoxiflavonas 

Existe uma subclasse de flavonoides denominada flavonas 

polimetoxiladas ou polimetoxiflavonas (PMF) localizadas principalmente na 

casca de cítricos; possuem sucessivas metilações em seus grupos 

hidroxílicos e alta solubilidade em lipídios (ROBBARDS; ANTALOVICH, 

1997; GORINSTEIN et al., 2001). Elas possuem um derivado benzogama-

pirano na posição C3 (Figura 2), e também exercem função de defesa contra 

patógenos causadores de doenças nas plantas (DEL RIO et al., 1998).  



19 

 

 

 

 

Figura 2. Estrutura molecular de polimetoxiflavonas isoladas a partir de 

frutas cítricas (Fonte: UCKOO, 2012) 

 

Cerca de vinte PMF têm sido isoladas e identificadas a partir de 

diferentes espécies cítricas. Os tipos e concentração destes compostos 

variam entre os diferentes alimentos de origem vegetal (DUGO et al.,1995; 

LI et al.,2006), ocorrendo em maior abundância na casca da laranja (Citrus 

sinensis) e tangerina (Citrus reticulata) (MANTHEY et al., 2001). Mouly e col. 

(1999) isolaram do suco de laranjas comerciais várias PMF, como a 

sinensetina, a hexametoxiflavona, a nobelitina, a heptametoxiflavona, a tetra-

O-metil escutelareína e a tangeritina. Foi confirmado que esses flavonoides 

se encontravam no pericarpo do fruto e que, provavelmente, sua quantidade 

no suco depende do processo de extração utilizado. 

A tangeritina (TAN) e a nobelitina (NOB) constituem as principais PMF 

encontradas nas espécies cítricas; já a isosakuranetina (ISR), a sinensetina 

(SIN), a tetrametilescutelareina (TMS) e a heptametoxiflavona (HMF) estão 



20 

 

 

 

presentes em menores quantidades nas frutas cítricas (MANTHEY et al., 

2011).  

A TAN tem cinco grupos metoxi (-COH3) sobre o núcleo flavona 

distribuídos nas posições 5, 6, 7, 8 - do anel A e 4' - do anel B (Figura 3). 

Sua denominação IUPAC é: 5,6,7,8,4’-pentametoxiflavona.  

 

Figura 3. Estrutura molecular da TAN (Fonte: Nielsen et al., 2000) 

A NOB tem seis grupos metoxi (-COH3) sobre o núcleo flavona 

distribuídos nas posições 5, 6, 7, 8 - do anel A e 3', 4' do anel B (Figura 4). 

Alguns de seus nomes IUPAC são: 2-(3,4-dimetoxifenil)-5,6,7,8-tetrametoxi-

4H-1-benzopiran-4-o, ou 5,6,7,8, 3′,4′-hexametoxiflavona (LI et al., 2014). É 

uma das mais estudadas PMF, por ser a mais abundante em cascas de 

cítricos (LI et al., 2006).  

 

Figura 4. Estrutura molecular da NOB (Fonte: Singh et al., 2011) 

 



21 

 

 

 

Atividades das PMF 

Pesquisadores têm voltado sua atenção para o estudo da 

farmacocinética das PMF, por possuírem importante ação farmacológica 

(MANTHEY et al., 2011; ASAMI et al., 2010) como anti-inflamatórios 

(MANTHEY et al., 2001; LI et al., 2006; SHIN, et al., 2012), 

anticarcinogênicos (MANTHEY et al., 2001; LAI et al., 2011; QIU et al., 

2010), hipolipidêmicos (KUROWSKA; MANTHEY, 2004; WHITMAN et al., 

2005; LI et al., 2006) e prevenção e tratamento da obesidade (SERGEEV et 

al., 2009). 

A tangeritina e a nobelitina têm propriedades citotóxicas sobre as células 

cancerígenas e função de ajudar na circulação sanguínea de pacientes com 

doenças coronarianas (DEPYPERE et al., 2000). Esses compostos atuam 

na prevenção do câncer, uma vez que interagem com radicais livres, os 

quais contribuem para a carcinogênese (IWASE et al., 2001).  

Estudos epidemiológicos têm mostrado a importância dos flavonoides 

cítricos na saúde. Kean e colaboradores (2015) apontaram que a ingestão 

regular de alimentos ricos em flavonoides cítricos está associada a um risco 

reduzido de doenças crônicas. Kurowska e Manthey (2004) demonstraram 

que estes compostos também podem reduzir a produção hepática de 

lipoproteínas contendo colesterol, reduzindo, assim, a concentração de 

colesterol total no plasma e, consequentemente, o risco de doenças 

cardiovasculares. 

Dados apontam que a TAN e a NOB têm potente atividade inibidora 

contra o fator de necrose tumoral-α (TNFα) em monócitos humanos 



22 

 

 

 

estimulados com lipopolissacarídeos (LPS) (MANTHEY et al.,2001). A TAN e 

a NOB inibiram o crescimento de carcinoma de célula escamosa humana 

(HTB43), ao passo que outros flavonoides como a quercetina e o tamoxifeno 

(diidroquercetina) não tiveram efeito algum (KANDASWAMI et al., 1991). 

Essas duas PMF também são capazes de inibir a proteína iNOS induzida 

por LPS (IHARA et al., 2012), e também a expressão do RNA mensageiro 

responsável pela supressão da ativação de fator de transcrição nuclear 

Kappa-B (NFκ-B) e a fosforilação de p38-MAPK (proteína quinase ativada 

por mitógeno) (MANTHEY; BENDELE, 2008; HAGENLOCHER et al, 2016). 

A TAN e a NOB exercem papel primordial na resposta inflamatória, 

acarretando em decréscimo nas concentrações de NO (óxido nítrico) e 

citocinas, que por sua vez ocasionam menor adesão e influxo de leucócitos, 

controlando assim, a resposta inflamatória (MAIA, 2015). 

Choi e col. (2007) comprovaram efeitos anti-inflamatórios da NOB sobre 

as células RAW 264.7 (macrófagos) ativadas por LPS com a diminuição da 

produção de RO, e para a NOB e TAN com atividade inibidora da produção 

de NO. 

Jang e col. (2013) mostraram que a NOB e a TAN inibiram a expressão 

de IL-4, TNF assim como a ativação de NF-kB, AP-1 e p38 no tecido da pele 

de ratos, e que essas PMF reduziram a expressão de IL-4 e TNF em células 

RBL-2H3 (células de leucemia com receptores de IgE de elevada afinidade). 

Tangeritina 

TAN também desempenha um papel múltiplo na proliferação de células 

cancerosas e na fase metastática por inibir a adesão e invasão celular 



23 

 

 

 

(KAWAII et al.,1999), modular o sistema enzimático de metabolização de 

drogas (CANIVENC-LAVIER et al.,1996; SIESS et al.,1996), induzir os 

leucócitos à inibição parcial do desenvolvimento de HL-60 (originadas de 

paciente com leucemia promielocítica aguda, não têm marcadores 

específicos para células linfoides, mas expressam receptores de superfície 

para fragmentos FC e proteínas do sistema de complemento) (HIRANO, 

ABE, OKA, 1995). A Tan promove, ainda, um mecanismo de inibição das 

células cancerígenas mamárias humanas e a citólise na qual ela inibe a 

fosforilação da quinase de sinalização extracelular regulada (ERK) 

(SLAMBROUCK et al., 2005). Apesar de não ser uma boa captadora de 

radicais livres, ela inibe a atividade da 15-lipoxigenase (15-LOX, com ação 

pró-inflamatória), sugerindo que ele pode exercer um efeito modulador sobre 

a oxidação lipídica enzimática (MALTERUD; RYDLAND, 2000). Ela é capaz 

de aumentar a comunicação intercelular por junções de hiato (gap junction) 

entre células normais e células mutantes e, assim, inibe a proliferação de 

células cancerígenas (CHAUMONTET et al., 1994). TAN pode prender o 

ciclo celular na fase G1 por inibir cinases dependentes de ciclina (CDK) e 

pelo aumento de proteínas inibidoras de CDK (PAN et al., 2002;. MORLEY 

et al., 2007). 

TAN tem o potencial de reduzir colesterol e TG e modular o metabolismo 

de lipoproteínas contendo ApoB pela ativação de receptores ativados por 

proliferadores de peroxissomas (PPARs), que são fatores de transcrição 

pertencentes à família de receptores nucleares que regulam a homeostase 

da glicose, metabolismo de lipídeos e inflamação (TAVARES; HIRATA, 



24 

 

 

 

HIRATA, 2007), reduzir o potencial de apoB e modular o metabolismo de 

lipoproteína contendo através da ativação do receptor ativado por 

proliferador de peroxissoma (PPAr) (KUROWSKA; MANTHEY, 2004; 

KUROWSKA et al., 2004). 

Lee e col. (2016) observaram que a TAN inibiu significativamente a 

produção de NO, TNF-α, IL-6 e IL-1β em células BV2 (células imunes da 

micróglia-SNC) estimuladas com LPS, alem de inibir expressões de mRNA 

induzidas por LPS de sintase de óxido nítrico indutível (iNOS) e citocinas, 

uma vez que a iNOS medeia a síntese de NO, indicando que a TAN suprimiu 

os mediadores pró-inflamatórios. 

HO-1 é uma enzima anti-inflamatória e antioxidante bem conhecida 

regulada através da via de sinalização Nrf2/ARE (KEUM, 2012). Lee e col. 

(2016) mostraram que a TAN aumentou os níveis de mRNA e de proteína da 

HO-1 aumentando a atividade de ligação de DNA de Nrf2 ao local de ARE, 

revelando que a TAN desempenha não apenas papéis anti-inflamatórios, 

mas também papéis antioxidantes em células BV2 estimuladas por LPS. 

Nobelitina (NOB) 

Yoshimizu e col. (2004) demonstraram que a NOB, em comparação com 

42 flavonoides, foi a que teve atividade anti-proliferativa mais forte contra 

seis linhagens de células cancerosas humanas. Além de inúmeras 

atividades farmacológicas a ela associadas, tais como antidemência, 

antiapoptótica, antioxidante e efeitos anti-inflamatórios (ISHIWA et al.,2000; 

NAGASE et al., 2005; WALLE, 2007).  



25 

 

 

 

NOB foi capaz de atenuar o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) 

em células HepG2, inibindo a adesão, invasão e migração das mesmas 

(SHI; LIAO; SHIH; TSAI, 2013). NOB também possui caráter anti-

inflamatório, uma vez que ela suprimiu a produção de prostaglandina E2 

(PGE2) e a expressão da proteína COX-2 in vitro, após estímulos 

associados à inflamação, e envolvidos na carcinogênese do cólon de 

humanos e roedores (KOHNO et al., 2001). 

Administração oral de 200mg/kg de peso de NOB em camundongos 

ob/ob (modelo para obesidade) reduziu nível de glicose sanguíneo em 

animais jejuados ou não (LEE et al., 2010). Em um modelo com ratos 

obesos, alimentados com dieta rica em gordura, o tratamento com NOB 

diminuiu o ganho de peso corporal, o peso do tecido adiposo branco e TG 

plasmático, melhorou níveis de adiponectina plasmática e tolerância à 

glicose, devido à regulação da expressão de genes relacionados com o 

metabolismo de lipídeos e de adipocinas, e também pela regulação da 

expressão de marcadores inflamatórios e a atividade da via de sinalização 

de insulina (LEE et al., 2013).  

Whitman e col. (2005) demonstraram que a NOB pode reduzir as 

concentrações circulantes de lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) 

e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) no sangue, e pode inibir 

diretamente a formação de células espumosas derivadas de macrófagos no 

local da lesão. Ainda nesse estudo, foi verificado que a NOB reduziu as 

concentrações plasmáticas de triglicerídeos (TG) e colesterol, e reduziu TG 

hepático. 



26 

 

 

 

Li e col. (2007) observaram os efeitos anti-inflamatórios da NOB através 

da inibição significativa da produção de ROS intracelular induzida por LPS 

ou juntamente com os seus metabolitos (3'- e 4'-desmetilnobiletina) e a 

desdemetilação (3', 4'-didemetilNOB) diminuindo a produção de NO induzida 

por LPS e expressão de proteína iNOS e COX-2 em RAW264.7, no qual os 

metabolitos tiveram uma melhor atividade anti-inflamatória do que a própria 

NOB. 

Yoshigai e col. (2013) mostraram que a NOB exerceu atividade anti-

inflamatória em hepatócitos suprimindo tanto a produção de óxido nítrico 

(NO) induzida pela IL-1β como a expressão de iNOS. 

 

Metabolismo dos flavonoides/PMF 

O metabolismo dos flavonoides (Figura 6) depende da forma na qual eles 

se encontram no alimento, podendo estar na forma aglicona ou glicosilada 

(conjugados à molécula de carboidrato), a qual apresenta menor reatividade 

e maior solubilidade em água (SANTOS, 2009). A naringina e hesperidina 

são formas glicosídicas de flavanonas presentes em frutas cítricas, nas 

quais a deglicosilação é necessária para que o composto seja absorvido 

pela borda em escova das vilosidades intestinais, uma vez que somente a 

forma aglicona e os conjugados à glicose podem ser absorvidos no intestino 

delgado (KUMAR; PANDEY, 2013).  

As flavonas metoxiladas têm uma grande vantagem sobre as outras em 

relação à biodisponibilidade oral. Aparentemente os compostos que contêm 

apenas um ou dois grupamentos metoxis podem ser metabolicamente mais 



27 

 

 

 

estáveis do que as flavonas polimetoxiladas, pois se sugere que a estrutura 

molecular é mais estável, embora sejam necessários mais estudos nesta 

área (WALLE, 2007) 

As PMF se apresentam na forma aglicona, os grupos metoxis da 

molécula possuem uma natureza hidrofóbica quando comparados com os 

grupos hidroxis, o que torna as PMF (NOB, TAN E HMF) mais lipofílicas do 

que flavonoides poli-hidroxilados, tais como a quercetina, a luteolina e 

naringina (MURAKAMI et al., 2001). Em decorrência disso, as PMF têm 

maior permeabilidade através do intestino delgado e são mais prontamente 

absorvidas na circulação sanguínea (MURAKAMI et al., 2001; WALLE, 2007; 

ASSINI et al., 2013). 

Uma vez na corrente sanguínea as PMF chegam ao fígado (hepatócitos) 

no qual elas podem sofrer o processo de conjugação, por meio de metilação, 

sulfatação e/ou glucuronidação (conjugação ao ácido glucurônico), a fim de 

aumentar sua afinidade pela água (hidrofilicidade) e facilitar a excreção, 

esse mecanismo pode ocorrer também no intestino, nos enterócitos 

(CROZIER et al.,2009; MAIA, 2015).  

A excreção dos flavonoides pode ser realizada por meio da bile ou pelo 

sistema urinário. No rim, os flavonoides também podem sofrer conjugação e 

serem excretados na urina. Já a excreção biliar pode contribuir para 

reabsorção intestinal devido à ação enzimática bacteriana, alterando a meia 

vida dos flavonoides (BOHN, 2014; MAIA, 2015). No cólon, os flavonoides 

glicosilados podem sofrer a ação de enzimas provenientes da microbiota 

local, como a β-glucuronidase, sendo degradados e absorvidos na forma de 



28 

 

 

 

seus metabólitos (aglicona/ácidos fenólicos), via sistema porta-hepática 

(THILAKARATHNA; RUPASINGHE, 2013). 

Citocromo P450 (CYP) é o sistema enzimático chave envolvido no 

metabolismo das PMF, e é capaz de catalisar reações de hidroxilação e de 

desmetilação. A via metabólica da PMF é considerada idêntica entre as 

espécies. O número e a posição dos grupos hidroxila e metoxila no anel B 

das PMF têm uma grande influência sobre o metabolismo das mesmas 

(BREINHOLT et al., 2003; NIELSEN et al., 1998; LI, 2009). As posições 3' e 

4' no anel B das PMF são os sítios primários de biotransformação. A partir 

de estudos in vitro em células Caco-2, foi observado que a NOB fica 

acumulada na monocamada das células (MURAKAMI et al., 2001) e após 4h 

de incubação mais de 48% dela permeia para o lado basolateral (como a 

veia porta), mostrando que a NOB tem elevada permeabilidade e uma 

tendência a acumular-se no compartimento intracelular (LI, 2009). A NOB 

possui uma propriedade distinta de acumular-se em uma grande variedade 

de órgãos, incluindo o estômago, intestino delgado e grosso, fígado e rim 

durante o período de 1-4h após uma dose única (MURAKAMI et al., 2001, 

2002). 



29 

 

 

 

 

Figura 6. Metabolismo dos flavonoides. SGLT-1: transporte de glicose 

sódio dependente-1. LPH: enzima lactase florizina hidrolase (MAIA, 

2015). 

Existem poucos estudos sobre a biodisponibilidade oral de 

metoxiflavonas ou polimetoxiflavonas. A NOB foi administrada em ratos, em 

conjunto com a luteolina não metilada (5,7,3',4'-tetrahidroxiflavona) em 

doses de 25 mg/kg, e seu conteúdo no fígado e nos rins foi maior que os 

níveis de luteolina (MURAKAMI et al., 2002). A TAN foi administrada a 

hamsters como 1% da sua dieta durante 35 dias, e foi encontrada 

considerável absorção intestinal, com base na excreção urinária de vários 



30 

 

 

 

metabolitos destes animais, e também detectados no soro e órgãos desses 

animais (KUROWSKA; MANTHEY, 2004). Manthey e col. (2011) em uma 

análise comparativa entre a absorção de NOB e TAN em ratos, observaram 

que a administração oral em óleo vegetal apresentou níveis séricos de NOB 

maiores que os de TAN. Esta descoberta sugeriu uma diferença 

potencialmente significativa na biodisponibilidade de NOB e TAN e, como 

consequência, possíveis diferenças na eficácia destes dois compostos, 

quando administrados em animais. 

A solubilidade da TAN/NOB foi observada por Li e col. (2009), por meio 

do ensaio LYSA (lyophilisation solubility assay), no qual é considerada uma 

alta solubilidade, valores maiores que 500µg/mL, média entre 100 e 

200µg/mL, e baixa solubilidade valores menores que 100µg/mL. Em geral, a 

solubilidade das PMF é muito baixa, sendo que a das PMF hidroxiladas é 

maior do que as totalmente metoxiladas, como por exemplo, a solubilidade 

da 5-demetilNOB (32µg/mL), 3’-demetilNOB (29µg/mL) e 4’-demetilNOB 

(22µg/mL) é mais alta do que a da NOB (12µg/mL). Outro exemplo é a 

solubilidade de 3-hidroxi-5,6,7,8,3’,4’-hexametoxiflavona (ou 3-hidroxiNOB) 

(37µg/mL), que é muito mais alta do que a da HMF (8µg/mL). Assim, quanto 

mais grupos hidroxila as PMF tiverem, melhor será a sua solubilidade, e o 

grupo hidroxila na posição 3 do anel C das PMF tende a aumentar muito a 

solubilidade das PMF: a solubilidade da 3-hidroxiNOB (37µg/mL) é muito 

mais alta do que a da 3’-metoxiNOB (ou HMF) (8µg/mL) (LI et al., 2009).  

A solubilidade mínima aceitável que é necessário para um fármaco ativo 

por via oral ou nutriente também depende da permeabilidade. Li e col. (2009) 



31 

 

 

 

concluíram que a permeabilidade das PMF é de média a elevada, o que 

significa que elas podem atravessar facilmente a membrana fosfolipídica, 

devido à presença de vários grupos metoxis. TAN possui a maior 

permeabilidade (1,62x10-6cm/s), seguido da NOB (1,38x10-6cm/s). 

Os efeitos benéficos de polifenóis dependem tanto do seu consumo 

quanto de sua absorção e biodisponibilidade, a qual pode variar de acordo 

com a estrutura molecular do composto (MANACH et al., 2004). Vários 

estudos indicam que os metabolitos formados a partir da metabolização 

sofrida pelos compostos durante a passagem pelo intestino e fígado, têm 

ação superior ao composto original, e são, portanto, os responsáveis pelos 

efeitos benéficos observados (LI et al., 2009; MANTHEY et al., 2011).  

Juntamente com o rápido desenvolvimento em tecnologias de purificação 

e identificação de compostos bioativos de plantas, estudos sobre compostos 

cítricos bioativos e atividades antioxidantes irão atrair mais e mais atenção 

no futuro (ZOU, 2015). 

Assim, este trabalho teve como objetivo, avaliar a capacidade 

antioxidante e a peroxidação lipídica no soro sanguíneo e fígado de ratos 

tratados, por via oral, com as polimetoxiflavonas, TAN e NOB, por meio dos 

métodos ABTS e TBARS, além de α-tocoferol, β-caroteno e retinol no soro 

sanguíneo e glutationa peroxidase no fígado desses animais; e identificar os 

metabólitos formados na urina desses ratos.  

 

 



32 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Capitulo 1. 

Differential effect of nobiletin and tangeretin on the antioxidant 

activity and levels of α-tocopherol and retinol in rats 

Rodrigues, M.C.M.; Gonçalves, D.R.; Baeta, D; Manthey, J.A.; Cesar, T.B. 



33 

 

 

 

ABSTRACT 

 
Polymethoxylated flavones (PMFs) have been associated with increased 

antioxidant activity in animal models. The effects of tangeretin (TAN) and 

nobiletin (NOB) on antioxidant activity in the blood and liver of rats were 

evaluated. Groups of rats were treated with 200 mg/kg bw/day of TAN or 

NOB, or placebo, for 15 days. Parental compounds and their metabolites 

were assessed in the liver by chromatographic analysis, in addition to α-

tocopherol and retinol in the blood serum. Both TAN and NOB supplements 

were able to reduce malonaldehyde (MDA) in the rat’s blood by 22% and 

18%, respectively, but only NOB increased redox reaction by 3%. blood 

levels of retinol and α-tocopherol increased under TAN by 59% and 20%, 

respectively, but were not affected by NOB. Eight NOB metabolites were 

detected in the liver, but only two TAN metabolites were identified in low 

concentration. In Conclusion, NOB improved antioxidant capacity and 

reduced lipid peroxidation, while increased levels of retinol and α-tocopherol 

after TAN supplement may have contributed to decreased blood lipid 

peroxidation.  

Keywords: nobiletin, tangeretin, metabolites, antioxidant activity, retinol, 

alpha-tocopherol 

 
 

  



34 

 

 

 

1. INTRODUCTION 

 

Blood levels of antioxidants can vary in response to normal oxidative 

metabolism, controlling the production of reactive oxygen species (ROS) that 

damage cell molecules. However, in the course of the infection or 

inflammation that follows most human diseases, there is a greater demand 

for antioxidants to neutralize oxidative damage [1]. Diets containing plenty of 

fruits and vegetables may meet those demands, but dietary supplements can 

be designed to offer a variety of antioxidants in ample amounts. Antioxidants 

extracted from citrus fruits, such as vitamin C, carotenoids, flavanones 

(hesperidin and naringenin), and polymethoxyflavones (PMFs), such as 

nobiletin (NOB) and tangeretin (TAN), can be used as nutraceuticals to 

benefit health [2]. Currently, the use of supplements by the general 

population has been encouraged by broad segments of society, such as 

health professionals, the pharmaceutical industry and social networks, as an 

alternative and faster way to improve well-being by combating conditions 

associated with unhealthy and stressful lifestyles. Despite apparent benefits, 

the extensive use of supplemental antioxidants can unbalance the redox 

state, causing negative effects, depending on the dose and the physiological 

state [1]. The benefits of NOB and TAN supplementation are associated with 

their ability to block oxidative stress and modulate enzymes that cause the 

accumulation of free radicals and ROS [3-5]. This leads to inhibition of early 

stages of inflammation and overproduction of pro-inflammatory cytokines 

such as tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin 1b (IL-1b), 

interleukin 6 (IL-6), and nitric oxides (NO) [6-7]. These combined effects 

improve overall redox balance and decrease systemic and local inflammation 

[8], mitigating damage caused by disease-or drug-induced oxidative stress 

[9]. Although the protective activity of PMFs has been demonstrated in 

animals [3, 9-10] and humans [11], the effect of regular ingestion of higher 

doses under physiological conditions is still unknown. It was suggested that 

the indiscriminate use of antioxidants, not clinically prescribed, could disturb 

the oxidative balance, limit the extent of its effect, or even act as a pro-



35 

 

 

 

oxidant agent [12]. Therefore, it is relevant to know whether supplementation 

of a given dose of NOB and TAN, under physiological conditions, will 

contribute to the stability of the antioxidant system or lead to undesirable 

effects [13]. More research is warranted for recommendation of these 

supplements, aimed at maintaining health, preventing diseases, or treating a 

specific pathology [11]. The main objective of this study was to evaluate 

biological parameters related to the antioxidant activity of NOB and TAN, 

after systematic supplementation of 200 mg/kg of body weight (bw)/day for 

15 days in apparently healthy animals. This translated dose for an average 

70 kg person is about 2.3 g/day [14], and it is considered a high dose since 

the general recommendation of citrus bioflavonoids for humans is around 500 

mg/d to provide protection against chronic diseases [15]. The hypothesis of 

this study is that systematic doses of NOB or TAN (200 mg/kg/d) maintain 

the redox balance in the blood and liver, due to the increased availability of 

endogenous antioxidant compounds, which are spared with the 

supplementation of PMFs. For this purpose, blood concentrations of α-

tocopherol (vitamin E) and retinol (vitamin A derivative) were measured, as 

well as the levels of hepatic glutathione peroxidase (GPx), and the 

antioxidant effect of NOB and TAN on lipid peroxidation and total antioxidant 

capacity in the blood. The second objective was to quantify the hepatic 

production of NOB and TAN metabolites, which are eventually associated 

with health benefits. 

 

2. MATERIAL AND METHODS 

 

2.1 Purification of Tangeritin and Nobiletin 

Cold pressed orange oil residues containing around 10% PMFs, 

obtained from a local flavoring company, were initially purified by silica gel 

column chromatography (Biotage), using linear gradients of hexane and ethyl 

acetate for partial separation of tangeretin [(TAN) 5,6,7,8,4’-pentamethoxy-

flavone] and nobiletin [(NOB) 5,6,7,8,3’,4’-hexamethoxyflavone]. Purification 

of TAN and NOB compounds were obtained by reverse phase liquid 



36 

 

 

 

chromatography (RediSep C18 Reverse Phase) with linear gradients of 

methanol/aqueous formic acid, followed by crystallization with acetone and 

hexane. The purity of TAN and NOB was >95% compared to authentic 

standards using methods previously reported [16]. The diagram in Figure 1 

briefly describes the purification process. 

 

2.2 Animals and treatment  

Thirty male rats (Wistar) weighing 150-200 g from the Animal Center 

of São Paulo State University (UNESP) were housed in individual metabolic 

cages and were adapted for 7 days to the environmentally controlled 

temperature (23 ± 1 °C), humidity (55 ± 5%) and a 12 h light/dark cycle. Rats 

had free access to water and a commercial diet (Presence Nutricao Animal® 

) throughout the 15 days of the experiment under the same conditions. The 

basic composition of the rat chow contained: bran of soybean, wheat, and 

rice; ground whole corn; refined soybean oil; meat and fish meal; dextrin; 

sodium chloride; calcium iodate; and trace minerals and vitamins. High-

Performance Liquid Chromatography (HPLC) analysis of the commercial rat 

chow showed retinol and α-tocopherol occurred at concentrations of 0.04 and 

1.10 mg per 20 g of commercial chow, respectively. This protocol was 

conducted in compliance with recommendations of the Brazilian College of 

Animal Experimentation (COBEA) and the experimental procedures received 

prior institutional approval by the Ethical Board for Animal Experimentation, 

School of Pharmaceutical Sciences, UNESP (Protocol # 68/2015). 

 



37 

 

 

 

 

Figure 1. Flowchart of Nobiletin (NOB) and Tangeritin (TAN) purification by 
reverse phase liquid chromatography (adapted from Gonçalves et al, 2019) 
 

2.3 Experimental design  

The purified TAN and NOB were mixed separately with commercial 

plain yogurt (Nestle® ) with a homogenizer operating at 820 × g for 10 

Distillation residues of cold-pressed range oil (~10% PMF) 
from local fruit flavor company 

Residues mix w/ methanol (1/1, v/v) and stirred overnight 
at room temperature.  PMF-methanol solution was 

decanted and saved, while remaining residue was twice 
processed. All three solutions were combined and 

evaporated to 50% PMF.  

Recover PMF-contained methanol solution was mixed with 
Toluene 

Separation on silica flash-chromatography (Biotage) with 
linear gradients of hexane and ethyl acetate to partial 

separations of PMFs 

Isolation of Tangeritin (TAN), Nobiletin (NOB) and other 
PMFs was in Reverse-Phase Liquid Chromatography 

(methanol/0.5% formic acid) 

Final purification by recrystallization with hexane, methanol, 
at -20C, followed by washes 4C.hexane 

TAN and NOB 95% purified  



38 

 

 

 

minutes at a controlled ambient temperature (25 °C) (Figure 2). After the 

adaptation period, rats were assigned into three groups according to similar 

mean values of body weight: control group (n = 10), NOB group (n = 10), and 

TAN group (n = 10). Each experimental group was treated with 200 

mg/kg/day of NOB or TAN mixed in 1 mL plain yogurt by gavage once a day 

at 4:30 PM. The selected dose of 200 mg/kg bw/day in the current study was 

based on the protective effects of NOB and TAN against induced brain and 

liver damage in rats without toxic events [6-7, 9]. The control group received 

1 mL of plain yogurt (Nestlé) as a placebo. Body weight was checked every 

three days for the PMF dose adjustment. After 15 days of treatment, the rats 

were euthanized by decapitation and blood samples were collected in 

heparinized tubes (Hemofol®, 5000 UI/mL, Brazil). Blood serum was 

obtained by centrifugation (10,000 × g for 15 min at 25 °C), and livers were 

removed and frozen (-80 °C) until further analysis. 

 

Figure 2. Experimental design. After the acclimation period (7 days), 
Nobiletin (NOB) and Tangeretin (TAN) groups received, by gavage once a 
day a solution of NOB or TAN (200mg/kg) in 1ml of vehicle (plain yogurt). 
Control group received 1mL of vehicle for 15 days. 

 

2.4 Antioxidant capacity in the blood serum and liver  

Blood serum oxidative stress was measured by comparing levels of serum 

lipid peroxidation using thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) and 



39 

 

 

 

quantified as μM malondialdehyde (MDA) [17]. Malondialdehyde (MDA) is 

the end product of lipid peroxidation and reacts with thiobarbituric acid (TBA) 

to form the MDA-TBA adduct in a 1:2 ratio with TBA. The absorbance of each 

test was obtained in a 96-well microplate reader at 540 nm. Total antioxidant 

capacity in blood serum was measured as the Trolox equivalent antioxidant 

capacity (TEAC) using the 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic 

acid (ABTS) assay [18]. The absorbance was measured at 734 nm to verify 

the formation of ABTS+ and, to prepare the calibration curve, Trolox (Sigma) 

was used as a standard. All analyzes were performed in triplicate. To assess 

liver oxidative stress, the organs were thawed and one gram of each was 

homogenized in 4 mL of 1.15% potassium chloride at 4 °C, centrifuged 

(10,000 × g for 10 min at 4 °C), and the supernatants collected. Levels of 

proteins in liver supernatants were determined using bovine serum albumin 

as standard for the assay [19]. Liver MDA values were given in μM MDA per 

mg protein. Liver glutathione peroxidase (GPx) activity was determined and 

the results were expressed as mmol of NADPH consumed/min/mg protein 

(liver) [20]. Bovine serum albumin was also used as the protein standard in 

the glutathione peroxidase (GPx) activity. 

 

2.5 Analysis of retinol, α-tocopherol, and β-carotene in the blood serum  

Retinol (≥ 95% pure), α-tocopherol (≥ 95% pure), and β-carotene (≥ 

95% pure) were purchased from Sigma® . This analysis and preparation of 

the standards and blood samples were according to [21]. Sample preparation 

was in glass tubes, cover with aluminum foil to minimize light-induced 

degradation of vitamins. Blood serum samples (200 μL) were combined with 

methanol (600 μL), thoroughly mixed, and centrifuged at 10,000 × g for 4 min 

at room temperature. Supernatants were collected and reduced to dryness 

under nitrogen flow, and the residues were dissolved into the mobile phase. 

Chromatographic analysis was performed with Ultra-Performance Liquid 

Chromatograph (UPLC) (Shimadzu Nexera X2), equipped with a photodiode 

array UV-Vis detector (PDA-SPD-M20A), auto sampler (Shimadzu Nexera 

X2 SIL-30 AC), and column compartment/heater, both enabling the control of 



40 

 

 

 

the temperature. An Acquity UPLC C18 column (2.0 mm × 200 mm, 2.2 μm 

particles) was used for separation. Isocratic acetonitrile-methanol-

dichloromethane (75:5:20, v/v/v) was used as mobile phase; the flow rate 

was 0.3 mL/min. UV detection was accomplished at 325 nm for retinol, 450 

nm for β-carotene, and 292 nm for α-tocopherol [21]. Injection volume was 7 

μL and the compounds were separated within 10 min. Data were collected 

and processed by LabSolutions Shimadzu Corporation software. 

 

2.6 Detection of liver PMF metabolites  

To analyze the metabolites in rat liver, 2.0 mL of methanol was added 

to each tube containing the complete freeze-dried supernatant of 1.0 g of 

homogenized tissue. The methanol-added samples were dispersed in a 

vortex at high speed for 2 min. The samples were centrifuged for 10 min 

10,000 × g at room temperature under vacuum in a Savant concentrator. The 

clear supernatants were placed into individual 4 mL vials. The remaining 

sample precipitates were reextracted using the above procedure. The first 

and second supernatants were combined and evaporated at 60 °C under 

vacuum to near dryness then mixed with methanol to 2.0 mL and clarified 

through a 0.45-micron PTFE filter. Detection and analysis of the metabolites 

in the liver samples were performed by HPLC (Waters 2695 Alliance®), 

connected in parallel with a Photodiode Array Detector (PDA), and a 

Micromass ZQ quadrupole Mass Spectrometer with an electrospray 

ionization source (ESI), using a Waters C8 XBridge (4.6 × 150 mm) column, 

using linear gradients of aqueous 0.5% formic acid and acetonitrile, (90/10; 

v/v), as described previously [22]. Detection of the NOB and TAN metabolites 

were by positive ion ESI-MS using single ion monitoring and by UV 

absorbance with a Waters 996 diode-array detector. Rat liver metabolites 

were quantified by comparisons with previously purified 4’-hydroxy-NOB, 

NOB4’-glucuronide, 4’-desmethyl TAN and Tan-4’-O-glucuronide standards 

[23]. 

 

2.7 Statistical analysis  



41 

 

 

 

The results of metabolites in rat livers are described in table and 

chromatogram charts. The variables to assess lipid peroxidation and 

antioxidant capacity in rat blood serum and liver were expressed as mean ± 

SD, and differences were considered statistically significant when p ≤ 0.05. 

Data were statistically compared using one-way analysis of variance 

(ANOVA) and SIDAK as post-hoc. Analyses were performed in SPSS 

Statistics software (v.21, SPSS: An IBM Company, Chicago, IL). 

 

3. RESULTS  

 

3.1 Body weight and food intake  

At the beginning of the supplementation period, there were no 

differences among body weights of the groups: control, TAN, and NOB 

(Figure 3), but on the 7th day, the rats supplemented with TAN had a higher 

body weight than the controls, while the weight of NOB rats was intermediate 

between the TAN and controls. At the end of the experiment (15th day), the 

rats treated with TAN gained 26% more weight in comparison to NOB and 

controls (Figure 3 and Table 1). At the end of the experiment, the animals 

with the highest body weight were also those that ingested the highest daily 

and total amount of food (Table 1 and Figure 3). Consequently, they also had 

higher energy consumption (Table 1), as all rats were fed ad libitum with the 

same diet. Therefore, the discrepancy in weight gain between TAN and the 

other groups may be based on the greater appetite of these individuals, or on 

other unmeasured variables. Although the sample size was calculated taking 

into account differences within and between groups (ANOVA one-way), there 

are limitations in interpreting unexpected results, as the estimate is based on 

the main hypothesis previously determined. 



42 

 

 

 

  
Figure 3. Body weight and food intake of rats treated with standard diet 
(control group), and diet supplemented with 200mg/kg.bw of tangeretin (TAN 
group) or nobiletin (NOB group) during the experimental period of 15 days. 
 

Table 1. Effect of NOB and TAN on body weight, food and energy intake in 
rats fed with normal caloric diet (AIN-93) 
 

Group Control NOB TAN 

 (n=10) (n=10) (n=10) 

Initial Weight (g) 186 ± 14a 181 ± 15a 175 ± 9a 

Final Weight (g) 262 ± 16b 267 ± 21b 289 ± 11a 

Weight Gain (15 d) 76 ± 13a 86 ± 23a 114 ± 6b 

Intake (g/d) 21.4 ± 2.4b 21.8 ± 1.9b 25.1± 2.6a 

Energy Intake (kcal/d) 81 ± 9b 83 ± 7b 96 ± 10a 

Data are presented as mean ± SD.  
One-way analysis of variance (ANOVA) and SIDAK post-hoc. Different letters show that 

there is statistical difference between groups (p≤0.05) 
 

3.2 Redox status and antioxidant capacity  

170

200

230

260

290
B

o
d

y 
w

ei
gh

, g

15

20

25

30

0 7 14

Fo
o

d
 in

ta
ke

, g

Treatment Day

TAN NOB Ctr

\\-----\\

a

ab

b

a

b

b

b

a

bb

a

b



43 

 

 

 

Both TAN and NOB administered to healthy rats reduced the blood 

serum MDA in comparison to the control group. MDA values decreased by 

an average of 22% with TAN, while NOB reduced the blood serum MDA by 

18% (p ≤ 0.05) (Table 2). The serum antioxidant activity tested by the ABTS+ 

assay increased 3% in the NOB group (p ≤ 0.05), while there was no change 

in the TAN group. Yet, α-tocopherol increased 20%, and retinol increased 

59% in the group treated with TAN (p ≤ 0.05), but NOB and control showed 

no changes (Table 2). Chromatographic analysis of blood serum did not 

detect β-carotene in samples from any group. Analysis of liver peroxidation 

showed no significant differences among the three groups. Interventions with 

either PMF had no effects on the GPx levels in the liver. 

 

Table 2. Antioxidant capacity in the blood serum and liver of rats 
supplemented with daily dose (200 mg/kg bw) of tangeretin (TAN), nobiletin 
(NOB) or vehicle (Control). 
 

Tissue Antioxidants Parameters 
Control NOB TAN 

(n=10) (n=10) (n=10) 

Blood 
Serum 

MDA (µM/L) 1.48 ± 0.40a 1.21 ± 0.26b 1.15 ± 0.39b 

  (%) (-18%) (-22%) 

ABTS (mM/L) 1.68 ± 0.06b 1.73 ± 0.05a 1.70 ± 0.02ab 

  (%) (3.0%) (1.2%) 

α-
tocopherol 

(µM) 6.63 ± 0.89b 6.18 ± 1.72b 7.97 ± 1.04a 

  (%) (-6.8%) (20%) 

retinol (µM) 1.35 ± 0.13b 1.27 ± 0.49b 2.14 ± 0.4 7a 

  (%) (-5.9%) (59%) 

Liver 

MDA (µM/g) 0.40 ± 0.18a 0.48 ± 0.14a 0.54 ± 0.11a 

  (%) (20%) (35%) 

GPx (mmol/min/mg) 0.08 ± 0.02a 0.06 ± 0.01a 0.07 ± 0.03a 

  (%) (-25%) (-13%) 

 
Data are presented as mean ± SD.  
Antioxidant variables: MDA (malondialdehyde), ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline -

6-sulfonic acid, α-tocopherol), -tocopherol (vitamin E) and retinol (derivative of vitamin A) 
were measured in the blood serum, while the activity of MDA and GPx (glutathione 
peroxidase) were measure in the liver.  

% is percent difference between experimental group (NOB or TAN) versus Control. 
One-way analysis of variance (ANOVA) and SIDAK post-hoc. Different letters show that 
there is statistical difference between groups (p≤0.05). 
 
 

3.3 PMF metabolites in rat liver  



44 

 

 

 

Profiles of glucuronide and sulfate conjugates, as well as hydroxylated 

aglycone metabolites in the livers of TAN and NOB-fed rats were analyzed by 

HPLC-ESI-MS and PDA (UV) detection [22]. Protonated molecular masses 

([M + H]+) and retention times of these compounds are shown in Table 3, 

and the MS and UV chromatograms are shown in Figure 4. The ESI-MS of 

the conjugated compounds exhibited neutral losses of 176 atomic mass units 

(amu), suggesting losses of glucuronic acid substituents, or 80 amu for the 

loss of a sulfate group. HPLC-MS analysis of the individual liver extracts 

showed two TAN metabolites: T1 (TAN-4’-O-glucuronide) at an average liver 

concentration of 0.011 ± 0.0046 µg/g FW and T2 (4’-desmethyl TAN, i.e., 4’-

hydroxy-5,6,7,8- tetramethoxyflavone) at an average liver concentration of 

0.031 ± 0.0054 µg/g FW. Trace levels of other metabolites exhibiting 359 m/z 

fragment ions were also detected in a pooled and concentrated liver extract 

(data not shown), but were not quantifiable in the individual liver extracts. 

HPLC-MS analyses of the individual liver extracts additionally showed eight 

NOB metabolites, N1-N8 (Table 3), and most of them were similar to those 

previously reported in rat blood serum [24]. The ESI-MS, elution time, and 

concentration of each of these compounds, as well as their suggested 

molecular compositions, are listed in Table 3. From these measured 

concentrations, total amounts of the cumulative TAN metabolites (0.042 µg/g 

FW), occurred at 170 times lower than the cumulative levels of the NOB 

metabolites (7.18 µg/g FW). A substantial portion of the NOB metabolites 

occurred as a NOB-O-sulfate (N5) at 2.74 µg/g FW. Also, unlike TAN, NOB 

metabolism in the rat livers produced measurable levels of di-desmethyl 

metabolites [(M+H)+ (389)-2(CH2)] = 375 m/z, including metabolites N4A 

and N4B. Of the NOB metabolites, most occurred as conjugates of 

glucuronic acid and sulfate, and a smaller portion of the metabolites occurred 

as free aglycones (a cumulative average of 1.75 µg/g FW). Only trace levels 

of the original NOB and TAN were detected in the individual liver extracts. 

 



45 

 

 

 

 

Figure 4. Profile of UV chromatogram (330 nm) of NOB (A) and TAN (B) 
metabolites in the rat’s liver. The molecular masses of the ions (M + H)+ 
hydroxylated, glucuronide and sulfated are listed in Table 2. 
 

Table 3. Proposed structure, elution time and liver concentration of 
metabolites of rat supplemented with tangeritin and nobiletin  
 

Metabolites Proposed Structure 
[M + H]+1 ESI-

MS+ 
Elution time 

(min) 
Liver (µg/g) 

NOB 1 NOB-O-glucuronide  565/389 20.3 1.18 ± 0.64 



46 

 

 

 

NOB 2 NOB-O-glucuronide  565/389 20.7 1.39 ± 0.58 

NOB 3 NOB-O-glucuronide  565/389 17.6 0.12 ± 0.09 

NOB 4 di-desmethyl NOB 375 21.8 0.10 ± 0.05 

NOB 5 NOB-O-sulfate 469/389 22.9 2.74 ± 1.22 

NOB 6 mono-desmethyl NOB 469 23.3 0.64 ± 0.29 

NOB 7 mono-desmethyl NOB 469 24.8 0.15 ± 0.11 

NOB 8 mono-desmethyl NOB 455 25.8 0.86 ± 0.44 

   NOB         7.18 

TAN 1 TAN-4-O′-glucuronide 
359 

19.7 
0.011 ± 
0.005 

TAN 2 
4′-O-hyroxy-5,6,7,8-
pentamethoxy flavone 

535 
25.8 

0.031 ± 
0.005 

   TAN  0.042 

 
NOB (1,2,3,4,5,6,7 and 8): Eight metabolites detected in the liver of NOB-treated rats. Two 
metabolites are hydroxylated aglycones with protonated molecular masses of 389 amu (NOB 
1) and 375 amu (NOB 4), two conjugated with glucuronic acid, 565 amu (NOB 3) and 551 
amu (NOB 4), and four conjugated with sulfate groups, 469 amu (NOB 5, NOB 6, NOB 7) 
and 455 amu (NOB 8).   
TAN (1 and 2): Two metabolites detected in the liver of animals supplemented with TAN 
identified as hydroxylated aglycone with protonated molecular masses of 359 amu (TAN 1) 
and one glucuronic acid conjugate, 535 amu (TAN 2).  

 

4. DISCUSSION  

This study showed that systematic doses of NOB or TAN (200 

mg/kg/d) as dietary supplements for rats during a short time interval (15 

days) reduced lipid peroxidation by 20% in circulating blood. In addition, a 

significant increase in the blood antioxidant capacity was observed after NOB 

treatment (3%, p ≤ 0.05). At the end of the supplementation period, 

significant levels of NOB and TAN metabolites were detected in the liver, but 

not the parental compounds, suggesting that they were bio transformed 

before, or soon after, reaching the organ. The antioxidant activity measured 

in the hepatic tissue did not change with either supplement, but higher levels 

of retinol and α-tocopherol were detected in the blood after TAN oral 

administration. Animals treated with NOB had weight gain similar to the 

control group fed a standard diet, but the TAN group had higher intake and 

consequently higher body weight at the end of the experiment. 



47 

 

 

 

Supplementation of NOB and TAN, or placebo, was performed by gavage 

and therefore had no direct effect on the flavor of the food. This is important 

because NOB and TAN are very bitter compounds [25]. Feng et al. [26] 

suggested an anti-obesity effect of TAN due to lower weight gain and body 

fat in rats that consumed 0.04% and 0.08% TAN mixed with a high-fat diet. 

Compared to the current experiment, these doses were 4.6 to 9.1 times 

higher, the initial body weight was 50% higher and, the intervention was 

longer (6 wk). In contrast, Nery et al. [27] found similar results to the current 

study in mice fed a highfat diet plus 100 mg/kg bw TAN for 4 weeks. The 

authors showed an increase in weight gain compared to the standard diet, 

but no change in animals fed a high-fat diet without TAN. It has been 

recognized that the biological performance of flavonoids is dependent on 

their bioavailability, which can be very low due to the hydrophobic nature of 

these compounds. Glycosylated flavonoids, such as hesperidin, naringin, and 

eriocitrin, are mainly absorbed in the distal portion of the large intestine 

(colon), after deglycosylation by bacteria from the intestinal microbiota [23]. 

In contrast, polymethoxylated aglycones, such as NOB and TAN, show 

higher oral bioavailability than flavanones due to the lipophilic nature of 

multiple methoxy groups that decrease their hydrophilicity [28]. Such 

compounds are absorbed in the small intestine by passive diffusion, 

undergoing oxidative demethylation by cytochrome P450 in the intestinal wall 

(phase I metabolism), and can be conjugated by UGTs and SULTs enzymes 

(phase II metabolism). In the liver, phase II enzymes can produce 

glucuronate, sulfate, or methylate metabolites, which are much more 

hydrophilic. Part of them is secreted into the bile, performing the 

enterohepatic cycle, which increases the residence time and the effect of 

these compounds. Hepatic metabolites of NOB and TAN reach the 

bloodstream and peripheral tissues, and finally, they are eliminated by the 

urinary system or feces [2]. NOB and TAN are the main fraction of PMFs in 

the citrus peel, representing about 95% of the total PMF in balanced 

quantities [29]. However, they differ in bioaccessibility and absorption, with 

NOB being more bioavailable than TAN [5, 30]. Previously, we have shown 



48 

 

 

 

that oral administration of 50 mg/kg bw of NOB, solubilized in corn oil, 

produced a higher content of metabolites in the blood of rats than the same 

dose of TAN, suggesting greater bioavailability of NOB [31]. We also showed 

that NOB produced eight metabolites, four glucuronides, and four aglycones, 

but TAN produced only two, an aglycone and a glucuronic acid conjugate 

[31]. In the present study, we detected TAN and NOB metabolites in the 

livers of each supplemented group, demonstrating that oral administration of 

200 mg/kg bw of TAN or NOB was bioaccessible. Chromatographic analysis 

of the liver, obtained from all groups, revealed two metabolites of TAN, a 

hydroxylated aglycone, and a glucuronide metabolite, while eight metabolites 

of NOB were detected, four hydroxylated aglycones, three glucuronides and 

one sulfate metabolite, but no parental compounds. Other authors have 

described similar quantities of TAN and NOB metabolites [5, 31-33]. In our 

study, a 170 times higher concentration of total NOB metabolites in the liver 

was found in comparison to TAN metabolites. These results suggest that 

NOB metabolites presumably reached the bloodstream improving the 

antioxidant capacity in the blood, while very low levels of TAN metabolites 

were transported out of liver cells. Some recent work has focused on the 

activity of the main metabolites of NOB and TAN, such as 5-dimethyl NOB [5-

hydroxy-6,7,8,3’,4’-pentamethoxyflavone) and 5-dimethyl TAN (5-hydroxy-

6,7,8,4’-tetramethoxyflavone). These compounds decreased lipid 

peroxidation and ROS production in Saccharomyces cerevisiae, a eukaryote 

model under oxidative stress [5]. Another study showed the anti-inflammatory 

effect of the most abundant colonic metabolite of NOB in mice, 3’,4’-

didemethyl NOB (3’,4’-dihydroxy-5,6,7,8-tetramethoxyflavone), which was 

able to inhibit NO production and iNOS and COX-2 gene expression, by 

suppression of nuclear translocation of NF-κB and AP-1 transcription factors 

in RAW 264.7 macrophages [32]. Assessing the activity of antioxidant 

compounds in control animals helps to understand how to avoid oxidative 

stress and consequent biochemical and physiological damage. This is one of 

the main benefits of dietary supplements that attract consumers who seek to 

prevent the degenerative diseases due to aging. In this sense, our results 



49 

 

 

 

showed that healthy rats supplemented orally with NOB, increased the 

antioxidant capacity of the blood by 3%, assessed by ABTS, while reducing 

lipid peroxidation by 18%, assessed by blood MDA levels. In turn, the TAN 

did not show a significant change in the antioxidant capacity in the blood, but 

its intake was associated with a 22% reduction in serum MDA levels, 

suggesting a protective effect against lipid peroxidation. It is interesting to 

note that previously we had found similar protective effects against oxidative 

stress and inflammation from citrus flavanones to C57BL/6J mice fed a 

highfat diet [34]. The efficiency of oral intake of PMFs, with regard to the 

mechanism of action and safety, is another relevant topic to consider for their 

preventive use. Previous results indicate the benefits of NOB and TAN at a 

dose similar to this study, 200 mg/kg bw/day, without mentioning any toxic 

effects [6-7, 9]. However, these studies used experimental models of 

oxidative stress induced by chemical agents or diseases. For example, the 

neuroprotective role of TAN was investigated in an experimental model of 

pilocarpine-induced epilepsy in rats previously supplemented with 50, 100, or 

200 mg/kg bw/day. It was observed that the TAN inhibited the lesions in a 

dose-dependent manner, and 200 mg/kg being the most effective dose to 

reduce neuronal loss, with the number of viable cells in the injured animals 

similar to the control group [9]. In another study, doses of 100 or 200 mg/kg 

bw/day of NOB administered intragastrically to rats for 9 days, before the 

induced ischemic brain injury, inhibited overproduction of pro-inflammatory 

cytokines, such as TNF-α, IL-1b, IL-6 and NO, suggesting anti-inflammatory 

and neuroprotective effects [6]. Intraperitoneal injection with 200 mg/kg bw of 

alcoholic extract containing NOB and TAN significantly attenuated brain 

damage in a rat ischemiareperfusion model [7]. It was previously mentioned 

that in the absence of oxidative damage induction, TAN did not influence any 

redox balance marker in the liver after four weeks of intervention [35]. These 

results are in accordance with the present study, which found no changes in 

the MDA or GPx in the liver of TAN-treated animals. In addition, experimental 

models of injury induction by drugs or pathologies showed that 

supplementation with TAN or NOB provided protection to the liver and 



50 

 

 

 

extrahepatic tissues, assessed by tissue and inflammatory markers. For 

example, restoration of superoxide dismutase (SOD), GPx, and catalase 

levels have been observed in the liver and other organs, and a reduction in 

systemic lipid peroxidation, with decreased levels of MDA and NO in the 

bloodstream, in mice previously treated with high doses of ethanol [3]. Pre-

treatment with NOB in acute liver damage induced by concanavalin A in mice 

reduced the levels of liver enzymes alanine aminotransferase and aspartate 

transaminase, decreased the intracellular generation of ROS, and 

suppressed the release of inflammatory cytokines TNF-α and interferon 

gamma (IFN-γ) [24]. In another study with cisplatin-induced acute liver 

damage in rodents, TAN decreased TNF-α and interleukin 10 (IL-10) 

inflammatory markers, lipid peroxidation (MDA), inflammatory systemic NO 

responses and increased glutathione (GSH), and GPx activities, improving 

liver function [36]. It has been suggested that the mechanisms underlying 

TAN protection against hepatocyte-induced oxidative damage occur by the 

positive regulation of molecular signaling pathways, such as heme 

oxygenase 1 (HO-1), neurofibromatosis type 2 (Nrf2), NAD(P)H quinone 

dehydrogenase 1 (NQO-1) and mitogenactivated protein kinase (MAPK) [37]. 

NOB and TAN express greater anti-inflammatory potential than glycoside 

flavonoids, such as hesperidin and narirutin, with NOB having the greatest 

anti-inflammatory effect among all, and the apparent anti-inflammatory 

capacity of TAN is, very likely, due to its cytotoxicity [4]. NOB metabolites 

show antioxidant activity by inhibiting the production of intracellular ROS [38] 

and blocking the expression of the nitric oxide synthases (iNOS) and 

cyclooxygenase 2 (COX-2) protein in murine macrophages [32-33, 38]. In an 

inflammatory skin model, 3’,4’-dihydroxy-5,6,7,8-NOB inhibited MAPK and 

improved intracellular signaling pathway important in regulating the cell cycle 

(PI3K/Akt), leading to negative regulation of nuclear factor kappa-light-chain-

enhancer of activated B cells (NF-κB) and decreasing the accumulation of 

ROS [39]. TAN metabolites were able to enhance antioxidant capacity and 

cell survival, as well as inhibit inflammatory responses through 

downregulation of NF-kB, TNF-α, INOS signaling pathways [39], and up-



51 

 

 

 

regulation of Nrf2 expression that mediates these protective impacts [38]. 

Numerous studies confirm that exogenous antioxidants from dietary fruits 

and vegetables work together with endogenous antioxidants against 

oxidative stress [40]. Thus, it is expected that the supplements of TAN and 

NOB jointly with endogenous vitamins, such as α-tocopherol and retinol, will 

help to balance the antioxidant status in animals. However, in the present 

study, increased levels of retinol and α-tocopherol under TAN treatment, 

suggested that TAN may interfere in the balance of these vitamins. 

Previously it was shown that female rats exposed to dimethylbenz(a)- 

anthracene (DMBA) induced breast cancer, underwent a chemotherapeutic 

effect with TAN, protecting tissue damage, reducing lipid peroxidation, 

increasing antioxidant enzymes, and preserving antioxidant compounds, 

such as vitamin C and E [41]. On the other hand, the higher levels of 

antioxidant vitamins can be associated with an unbalance of the circulating 

antioxidants, which suggested some degree of toxicity for TAN. In a very 

interesting study, a U-shaped curve for the toxicity of TAN was detected, 

meaning that repetitive lower doses of TAN (50 to 100 mg/kg bw) can be as 

toxic to cells and tissues as acute and larger doses (1000 to 3000 mg/kg bw). 

According to these authors, supplementation of potential consumers with 

TAN will require much more extensive evaluations to establish its safety 

profile [13]. 

 

5. CONCLUSIONS  

This study showed that systematic doses of NOB and TAN reduced 

lipid peroxidation, but only NOB increased the antioxidant capacity in the 

blood. Significant levels of NOB and TAN metabolites were found in the liver, 

suggesting that the parent compounds were absorbed and bio transformed 

after oral ingestion. High blood levels of retinol and α-tocopherol after 

ingestion of TAN showed a metabolic pathway distinct for this PMF. 

Therefore, we conclude that under physiological conditions, regular doses of 

TAN and NOB can improve antioxidant activity, but prolonged use of TAN 



52 

 

 

 

should be treated with caution, and broader studies of liver toxicity at different 

doses should be further explored, including clinical studies. 

 

6. ACKNOWLEDGMENTS  

Author thanks Coordination for Higher Education Staff Development 

(CAPES) of Brazil for the scholarship granted to Marilia C M Rodrigues for 

her Master Degree in Flood Science and Nutrition; Ana Lucia M. Nasser for 

the technical support; and Dr Elizabeth Baldwin (ARS-USDA) for the 

technical review of this study, and Veronica Cook for English review. We also 

thank the USDA for the supply of PMF compounds, the UNESP School of 

Pharmacy for the financial support. 

 

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Considerações Finais 
 

As PMF são amplamente metabolizadas após seu consumo, por via 

oral, possuem capacidade de reduzir os níveis dos biomarcadores de 

peroxidação lipídica sanguínea e a nobelitina foi capaz de ter uma atividade 

antioxidante sanguínea expressiva. Por meio deste estudo foi possível, 

também, identificar uma variedade de metabólitos gerados a partir da 

administração de TAN ou NOB, tanto em sua forma hidroxilada, quanto 

conjugadas a grupos sulfatos ou ao ácido glucurônico. Os tratamentos não 

alteraram os níveis de glutationa-peroxidase (GPx) porém, no grupo tratado 

com TAN, houve um aumento nos níveis de α-tocoferol e o retinol, sendo 

observada uma prevenção do gasto de antioxidantes já presentes no 

organismo dos ratos. 

Para uma próxima etapa sugere-se o isolamento dos metabolitos 

encontrados neste estudo, além de testes in vitro e in vivo com estes, para a 

verificação de seus efeitos benefícios e de suas doses necessárias para 

essa obtenção. 



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