RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 14/10/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus Araraquara Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Panorama químico e biológico do coral-sol Tubastraea tagusensis Virginia Carrara Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas Araraquara-SP 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus Araraquara Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Panorama químico e biológico do coral-sol Tubastraea tagusensis Virginia Carrara Araraquara-SP 2022 Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas Carrara, Virginia. C857p Panorama químico e biológico do coral-sol Tubastraea tagusensis / Virginia Carrara. – Araraquara: [S.n.], 2022. 44 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos. Orientador: Wagner Vilegas. 1. Tubastraea tagusensis. 2. Aplisinopsinas. 3. Espécie invasora. 4. Bioma marinho. I. Vilegas, Wagner, orient. II. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030078P6 Esta ficha não pode ser modificada UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Panorama químico e biológico do coral-sol Tubastraea tagusensisTÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTORA: VIRGINIA CARRARA ORIENTADOR: WAGNER VILEGAS Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Mestra em Ciências, área: Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. WAGNER VILEGAS (Participaçao Virtual) Departamento de Ciencias Biologicas e Ambientais / Instituto de Biociencias UNESP Sao Vicente Profa. Dra. PAULA CHRISTINE JIMENEZ (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências do Mar / UNIFESP Universidade Federal de São Paulo Prof. Dr. DANIEL RINALDO (Participaçao Virtual) Departamento de Química / Faculdade de Ciências de Bauru - Unesp Araraquara, 14 de outubro de 2022 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA - JAÚ, Km 1, 14800903 http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/ciencias-farmaceuticas/CNPJ: 48.031.918/0025-00. AGRADECIMENTOS À Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP. À CAPES, pela bolsa concedida 88887.495578/2020-00. Ao meu Orientador Prof. Dr, Wagner Vilegas por todos os ensinamentos e por me ensinar a gostar de química. Ao meu colega de Laboratório e amigo M.Sc Renan Canute Kamikawachi e sua dedicação a este trabalho. Ao Laboratório de Ecologia e Comportamento Animal (LABECOM) pela contribuição para a avaliação das atividades biológicas. Ao Prof. Dr. Francisco Seikiguchi de Carvalho e Buchmann pela contribuição à etapa de mergulho. Aos pesquisadores Prof. Dr. Marcelo Visentini Kitahara e Dra. Kátia Cristina Cruz Capel pela contribuição à coleta de material e logística de transporte. Ao Prof. Dr. Marcelo Veronesi Fukuda e ao Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZUSP) pelo registro do material. Aos meus pais Isabel C.P. S. Carrara e Wagner Luis Carrara por sempre incentivarem meus estudos. RESUMO Organismos marinhos são utilizados com fins terapêuticos desde a Grécia Antiga. Devido à necessidade de produção de metabólitos secundários para defesa química, organismos sésseis são fonte de moléculas com potencial farmacológico. O gênero de corais invasores Tubastraea (Dendrophylliidae) vem, ao longo dos anos, ameaçando o bioma marinho brasileiro, sobretudo espécies nativas, devido à alta capacidade de reprodução e ao seu provável arsenal químico alelopático. A única forma de contenção dessa espécie é a retirada manual das colônias. O presente estudo teve como objetivo investigar o panorama químico e biológico desse material de descarte do coral-sol, Tubastraea tagusensis. Foram preparados extratos metanólicos, os quais foram analisados por meio de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) acopladas à Espectrometria de Massas (MS). Além disso, foram avaliadas também as atividades antioxidante (DPPH) e a toxicidade aguda em Zebrafish (Danio rerio). Como resultados, no extrato metanólico foram encontradas substâncias formadas por adutos derivados da classe de alcaloides aplisinopsinas, conhecidas por apresentarem atividades antimicrobianas, anticâncer e modelador de neurotransmissores. O extrato apresentou promissora atividade antioxidante (Ec50= 101,00 ug/mL e não apresentou toxicidade aguda em Zebrafish. Essas características sugerem que essa espécie deve ser melhor investigada a fim de se obter novas moléculas potencialmente interessantes para estudos farmacológicos. Palavras-chave: Tubastraea tagusensis; aplisinopsinas; espécie invasora; bioma marinho. ABSTRACT Marine organisms have been used for therapeutic purposes since Ancient Greece. Due to the need to produce secondary metabolites for chemical defense, sessile organisms are a source of molecules with pharmacological potential. The genus of invasive corals Tubastraea (Dendrophylliidae) has been threatening the Brazilian marine biome over the years, especially native species, due to its high reproductive capacity and its probable allelopathic chemical arsenal. The only way to contain this species is the manual removal of colonies. The present study aimed to investigate the chemical and biological panorama of this waste material from the cup coral, Tubastraea tagusensis. Methanolic extracts were prepared and analyzed by means of high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled to Mass Spectrometry (MS). In addition, antioxidant activities (DPPH) and acute toxicity in Zebrafish (Danio rerio) were also evaluated. As a result, substances formed by adducts derived from the aplysinopsin class of alkaloids were found in the methanolic extract, known to have antimicrobial, anticancer and neurotransmitter modulating activities. The extract showed promising antioxidant activity (Ec50=101,00 ug/mL) and did not show acute toxicity in Zebrafish. These characteristics suggest that this species should be further investigated in order to obtain potentially interesting new molecules for pharmacological studies Keywords: Tubastraea tagusensis; aplysinopsin invasive alien species; marine biome. LISTA DE ABREVIATURAS ACN - Acetronitrila CCD - Cromatografia em camada delgada DMSO - Dimetilsulfóxido DPPH - 2,2-difenil-picrilhidrazila HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência HPLC-ESI-IT-MS - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas MeOH - Metanol MeOH-TtM - Extrato metanólico de Tubastraea tagusensis obtido por maceração MeOH-TtS - Extrato metanólico de Tubastraea tagusensis obtido por Soxhlet MeOH-TtU - Extrato metanólico de Tubastraea tagusensis obtido por maceração assistida por ultrassom MS – Espectrometria de Massas NI - Modo negativo P.A - Para Análise PI - Modo positivo PNM - Produtos Naturais Marinhos PTFE - Politetrafluoretileno RT - Tempo de Retenção UPLC-ESI-IT-MS - Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas UV - Ultravioleta LISTA DE FIGURAS Figura 1: Substâncias presentes em corais com potentes atividades biológicas. Figura 2: Tubastraea tagusensis. Marcelo Visentini Kitahara. Coral-sol. Banco de imagens Cifonauta. Disponível em: http://cifonauta.cebimar.usp.br/media/9664/ Acesso em: 2020-04-19. Figura 3: Análise por CCD dos extratos de Tubastraea tagusensis. A) Revelação com mistura de anisaldeído/ácido sulfúrico: MeOH-TtS (à esquerda) e MeOH-TtM (direita); B) revelação sob luz Ultravioleta 365 nm: MeOH-TtS (à esquerda) e MeOH-TtM (direita). Figura 4: Análise por HPLC-ESI-IT-MS do extrato MeOH-TtS de Tubastraea tagusensis nos modos positivo (abaixo) e negativo (acima). Figura 5: Espectro de massas da substância detectada no pico I (PI). Figura 6: Espectro de massas da substância detectada no pico II (PI). Figura 7: Espectro de massas da substância detectada no pico III (PI). Figura 8: Espectro de massas da substância detectada no pico IV (PI). Figura 9: Espectro de massas da substância detectada no pico V (PI). Figura 10: Espectro de massas da substância detectada no pico VI (NI). Figura 11: Espectro de massas da substância detectada no pico VII (NI). Figura 12: Espectro de massas da substância detectada no pico VIII (NI). Figura 13: Espectro de massas da substância detectada no pico IX (NI). Figura 14: Espectro de massas da substância detectada no pico X (NI). Figura 15: Cromatogramas de íons extraídos dos íons referentes às substâncias II (m/z 239), III (m/z 253), V (m/z 317) e VI (m/z 331) obtidas após análise por HPLC- ESI-IT-MS do extrato MeOH-TtS de Tubastraea tagusensis no modo negativo (NI). Figura 16: Cromatogramas de íons extraídos dos íons referentes às substâncias II (m/z 241), III (m/z 255), V (m/z 319) e VI (m/z 333) obtidos após análise por HPLC- ESI-IT-MS do extrato MeOH-Tt de Tubastraea tagusensis em modo positivo (PI). Figura 17: Esquematização das reações pericíclicas dos adutos. Figura 18: Cromatogramas obtidos pelas análises por UPLC-ESI-IT-MS dos extratos de Tubastraea tagusensis obtidos por maceração (acima), soxhlet (no meio) e ultrassom (embaixo). Acima de cada pico foram anotados os íons [M-H]-. Figura 19: Curva de inibição do potencial oxidativo de MeOH-TtS e do padrão Trolox. LISTA DE TABELAS Tabela 1: Moléculas derivadas de Aplisinopsinas identificadas nos extratos de Tubastraea tagusensis e Tubastraea coccinea (Carpes et al., 2019) - Adaptado Tabela 2: Substâncias identificadas por meio de HPLC-ESI-IT-MS no extrato MeOH- TtS, com base nas moléculas descritas por Carpes et.al (2019, Tabela 1). Tabela 3: Avaliação da atividade antioxidante do extrato MeOH-TtS Tubastraea tagusensis e de Trolox (padrão). Experimento realizado em triplicata ± desvio padrão. Sumário 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 11 2 OBJETIVO .......................................................................................................... 15 3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 16 3.1 COLETA ................................................................................................................ 16 3.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS .................................................................................... 16 3.2.1 Extração por Soxhlet ........................................................................................ 16 3.2.2 Extração por Maceração. ................................................................................. 16 3.2.3 Extração por Maceração assistida por ultrassom ............................................. 17 3.3 CLEAN-UP ............................................................................................................. 17 3.4 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS ................................................................................ 17 3.4.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD). .................................................... 17 3.4.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado à Espectrometria de Massas (HPLC-ESI-IT-MS). ............................................................................................. 18 3.4.3 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas (UPLC-ESI-IT-MS). ............................................................................................. 18 3.5 AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS ................................................................. 18 3.5.1 Avaliação da atividade antioxidante. ................................................................ 18 3.5.2 Avaliação de Toxicidade aguda em zebrafish. ................................................. 19 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 19 4.1 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD). ...................................................... 19 4.2 IDENTIFICAÇÃO DAS MOLÉCULAS PRESENTES NO EXTRATO MEOH-TTS DE TUBASTRAEA TAGUSENSIS. ............................................................................................................ 20 4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE. ............................................................... 34 4.4 TOXICIDADE AGUDA EM ZEBRAFISH. ........................................................................ 36 5 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 38 6 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 39 11 1 INTRODUÇÃO A pesquisa e o desenvolvimento de novos fármacos são de suma importância para a indústria farmacêutica, sendo a base para a competitividade entre as empresas desse ramo. Apesar do desenvolvimento de novas técnicas de elaboração de fármacos e de abordagem que envolve a síntese, os produtos naturais e seus derivados representam a maioria dos medicamentos utilizados atualmente (BERLINCK et al., 2017). Constantemente, pesquisas relatam a descoberta de novas classes de substâncias de origem vegetal e animal, evidenciando a importância dos produtos naturais como fonte abundante de estruturas químicas diversas e promissoras para a indústria farmacêutica. Assim, faz-se necessária a pesquisa multidisciplinar em química de produtos naturais, a fim de explorar novas fontes de biomoléculas (BERLINCK et al., 2017). Os oceanos são uma importante fonte de produtos naturais devido à sua vasta biodiversidade que, em alguns locais, estima-se que seja maior até mesmo que a de florestas tropicais (HAEFNER, 2003). Desde o século V a.C., organismos marinhos são usados com propósito medicinal. Relatos da medicina tradicional grega evidenciam o uso desses organismos como fonte terapêutica para o tratamento de enfermidades ginecológicas a partir de esponjas associadas a algas, enzimas do estômago e gordura de pinípedes. A medicina tradicional chinesa também relata a produção de medicamentos a partir de algas como fonte de iodo para controle de disfunções da tireoide (VOULTSIADOU, 2007). Produtos naturais marinhos (PNM) são derivados, em sua maioria, de organismos sésseis, como corais, algas e esponjas, os quais não possuem defesa física, necessitando, assim, de meios químicos de defesa antipredatória e como mecanismos auxiliares para a competição. Essas defesas químicas geralmente estão na forma de metabólitos secundários de alta complexidade, com grande diversidade estrutural e 12 altamente potentes, apresentando características únicas, diferentes dos produtos naturais de origem terrestre (ALTMANN, 2017; MATULJA et al., 2022). Esses PNM são fonte valiosa de novas estruturas químicas com atividades biológicas promissoras, com grande potencial para a determinação de novos mecanismos de ação (KHALIFA et al., 2019; SHINDE et al., 2019). Moléculas derivadas de organismos marinhos apresentam diversos efeitos biológicos, sendo que mais de 50% deles referem-se às atividades citotóxica e antiproliferativa. Invertebrados marinhos apresentam atividades antiviral, antioxidante, antibacteriana, entre outras, sendo as esponjas e os cnidários os maiores produtores desses metabólitos (ALTMANN, 2017; KHALIFA et al., 2019; CARROLL et al., 2021). Os corais apresentam moléculas com potente atividade citotóxica, como o acetato de asperidiol (encontrado em Pseudoplexaura flagellosa) e os michaolídeos (Lobophytum michaelae) (WANG & DUH, 2012; BAUER et al., 2018). Moléculas presentes em corais também apresentam atividades imunossupressora (Yalogene A), antidiabética (Sarcophytonolide e Cembrene C), antiviral (Lobophynin C e Ehrenberoxide A, B e C) e antibacteriana (Sarcophytol B), ativos contra Bacillus cereus, Staphylococcus albus e Vibrio parahaemolynticus (Figura 1) (ELKHAWAS et al., 2020). É interessante observar que muitas das atividades biológicas observadas nos PNM estão envolvidas nos testes iniciais necessários na pesquisa de novas drogas, e que o isolamento dessas substâncias aumenta significativamente a cada ano (ALTMAN, 2017). Atualmente, a Citarabina (Cytosar-U®), o Fosfato de Fludarabina (Fludara®) e outros dez medicamentos sintetizados a partir PNM já foram aprovados para o tratamento de câncer, e esse número tende a aumentar nos próximos anos (MATULJA et al., 2022). Medicamentos com outras propriedades também já foram aprovados: Vidarabina (Vidarabine®), antiviral derivado da esponja Tectitethya crypta, e Ziconotida (Prialt®), analgésico derivado do molusco Conus magus (KIJJOA et al., 2004; MALVE, 2016; FDA, 2022). 13 Figura 1. Substâncias presentes em corais, com potentes atividades biológicas. Com o desenvolvimento de novas técnicas de coleta, triagem de metabólitos e testes biológicos, o estudo de PNM torna-se mais acessível. Apesar disso, poucos organismos marinhos, em especial corais, foram estudados na busca de novas substâncias bioativas. Isso ocorre devido às suas próprias peculiaridades, como o alto custo de coleta, quantidade de material disponível para exploração, divergências nas classificações taxonômicas, visto que muitas espécies apresentam pequenas alterações morfológicas, e complexidade das moléculas, desperdiçando o alto potencial desses organismos (MARTINS et al., 2018; ALTMANN, 2017; SHINDE et al., 2019). Os PNM muitas vezes são oriundos de espécies de grande importância ecológica ou ameaçadas, o que não ocorre com organismos invasores, que ameaçam a biodiversidade nativa. Como essas espécies também podem produzir substâncias 14 com relevantes atividades biológicas (antiviral, antibacteriana, antioxidante, citotóxica etc.), elas podem surgir como alternativa sustentável para o desenvolvimento de fármacos (MOLLO, 2022). Ecologicamente, os corais do gênero Tubastraea (Dendrophylliidae) representam um dos principais problemas ambientais marinhos brasileiros (SILVA et al., 2011). Isso é particularmente grave no caso do coral-sol (Tubastraea tagusensis) (Figura 2), um coral azooxantelado (não apresenta associação com algas) que ocupa superfícies marinhas verticais de diferentes profundidades (PAULA & CREED, 2005). Ele é natural da região do Pacífico e foi introduzido em águas nacionais no final dos anos 80, incrustado em navios e plataformas de petróleo da Bacia de Campos - RJ e atualmente infesta grande parte do litoral brasileiro (SANTOS et al., 2019; WORMS, 2020). Por ser uma espécie invasora e, consequentemente, sem predadores, modifica ambientes recifais e ameaça espécies endêmicas e bentônicas, como o coral endêmico Mussismilia hispida, crustáceos, poliquetas, entre outros, além de peixes associados que se alimentam desses invertebrados, causando assim grande impacto à biodiversidade nativa, principalmente em áreas marinhas protegidas (SILVA et al., 2011; SILVA et al., 2019; DOS SANTOS et al., 2013). Figura 2. Imagem de Tubastraea tagusensis. Fonte: Marcelo Visentini Kitahara. Coral-sol.Banco de imagens Cifonauta. Disponível em: http://cifonauta.cebimar.usp.br/media/9664/. Acesso em 2020-04- 19. 15 Sua vantagem sobre as espécies nativas é resultado de uma estratégia reprodutiva de sucesso, rápido crescimento e possível arsenal químico. Estudos apontam que esses animais produzem e liberam metabólitos secundários que agem como inibidores alelopáticos contra competidores, seja impedindo o assentamento larval ou por atividade citotóxica, resultando, junto a outras características, em uma enorme disseminação da espécie invasora (LAGES et al., 2010; 2012; MIRANDA et al., 2016; SANTOS et al., 2013; SANTOS et al., 2019). A atual forma de contenção dessa espécie baseia-se na remoção manual das colônias por mergulhadores. Por ser um trabalho árduo, concentra-se em locais de maior importância ecológica como o Refúgio de Vida Silvestre do Arquipélago dos Alcatrazes-Litoral Norte - SP e o Parque Marinho da Laje de Santos, na Baixada Santista. Após a remoção, as colônias são levadas a terra para serem eliminadas (ICMBIO, 2019). Sob uma perspectiva mais positiva, metabólitos secundários com essas características podem ter importantes atividades biológicas e farmacológicas. Metabólitos secundários da classe aplisinopsinas foram encontrados em corais gênero Tubastraea, com atividades anticâncer, antimicrobiana e moduladora da regulação de serotonina (BIALONSKA & ZJAWIONY, 2009). Diante do problema multidisciplinar apresentado pela espécie Tubastraea tagusensis, o presente trabalho investigou o panorama químico do coral e seu eventual potencial biológico, analisando os organismos descartados originados de uma contenção manual realizada para controle ambiental na Ilha de Búzios, São Sebastião, SP. 2 OBJETIVO Investigar o panorama químico dos metabólitos secundários de Tubastraea tagusensis, a partir do material de descarte proveniente da contenção manual realizada para controle da espécie, através de técnicas cromatográficas e espectrométricas, em busca de substâncias com potencial uso farmacológico. 38 5 CONCLUSÃO No presente estudo, foram encontrados, no extrato metanólico de Tubastraea tagusensis, adutos formados por duas unidades de derivados de aplisinopsinas, resultado diferente daquele encontrado por Carpes e seus colaboradores (2019). Tais adutos apresentam alta complexidade e não são artefatos provenientes do método de extração. Além disso, o extrato metanólico obtido por meio de Soxhlet, apresentou atividade antioxidante significativa, com Ec50= 101,00 ug/mL, no teste realizado com DPPH, e não apresentou toxicidade aguda em Zebrafish (Danio rerio). O conjunto desses resultados indica que a capacidade invasiva do coral-sol, Tubastraea tagusensis, pode ser racionalmente utilizada para gerar uma nova fonte a prospecção de bioprodutos com atividades biológicas relevantes. 39 6 REFERÊNCIAS ALTMANN, Karl-Heinz. Drugs from the oceans: Marine natural products as leads for drug discovery. Chimia, v.71, n.10, p.646–651, 2017. BAKER, J.T.; WELLS, R.J. Biological active substances from Australian marine organisms. Natural Products as Medicinal Agents, p. 281,1981. BAUER, K.; PUYANA, M.; CASTELLANOS, L.; TELLO, E. New diterpenes isolated from the colombian caribbean soft coral Pseudoplexaura flagellosa and their cytotoxic properties. Records of Natural Products, v.13, n.3, p.243–253, 2018. 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