RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 18/07/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL PARTICIPAÇÃO DA IRISINA NO CONTROLE CARDIORRESPIRATÓRIO E METABÓLICO DE RATOS ADULTOS Mariana Bernardes Ribeiro Bióloga 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL PARTICIPAÇÃO DA IRISINA NO CONTROLE CARDIORRESPIRATÓRIO E METABÓLICO DE RATOS ADULTOS Mariana Bernardes Ribeiro Orientadora: Profa. Dra. Luciane Helena Gargaglioni Batalhão Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Zootecnia Julho de 2022 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Mariana Bernardes Ribeiro – nascida em 14 de julho de 1997 na cidade de Ituiutaba – MG, filha de Andrea Luciana Bernardes Marquez e de Renato Severino Ribeiro, ingressou no curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Uberlândia –UFU, Campus Pontal em março de 2015. Durante o período de graduação, a aluna realizou duas iniciações científicas sendo uma delas financiada pela CNPq. O estágio curricular foi realizado no Laboratório de Anatomia e Fisiologia Humana do campus e no Laboratório de Fisiologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus Jaboticabal. Colou grau em agosto de 2019 e recebeu o título de Bacharel em Ciências Biológicas. Em março de 2020 iniciou o curso de Mestrado pelo Programa de Pós-graduação em Zootecnia no Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal na Universidade Estadual Paulista – UNESP Campus Jaboticabal, onde foi bolsista CAPES e FAPESP, submetendo-se ao Exame Geral de Qualificação em 28 de setembro de 2020. Dedico aos meus pais Andrea e Renato, pilares da minha formação como ser humano. AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Andrea e Renato, e a minha irmã Nathália, que sempre estiveram ao meu lado me apoiando em todas as etapas da minha vida, torcendo e acreditando na minha capacidade. Muito obrigada por todo carinho e compreensão pela minha ausência. Amo vocês! Ao meu companheiro de vida, o meu melhor amigo, meu namorado Gilberto, por sempre se fazer presente em todos os momentos apesar da distância. Muito obrigada pela sua compreensão e incentivo. O seu amor e o seu apoio foram essenciais para a finalização deste trabalho. À minha orientadora Luciane, por ter depositado em mim sua confiança, por me atender e me acolher com todo amor e paciência em todos os momentos que precisei. Agradeço imensamente por todos os ensinamentos e conselhos prestados. Minha eterna admiração e carinho por você, muito obrigada por tudo! Ao meu co-orientador Luis Gustavo, por ter estado ao meu lado em todas as etapas de execução deste trabalho. Agradeço imensamente por todos os ensinamentos, pelas inúmeras cirurgias e análises feitas juntas, por ser paciente e me auxiliar nos momentos difíceis. Muito obrigada por todo tempo destinado a me ajudar, você foi fundamental! Aos meus amigos e companheiros do laboratório: Sofia, Jessica, Thais, Livia, Geni, Aline, Elisa, Bia Felix, Bia Dominiquini, Ane, Carol, Gleyce, Gabriel, Leticia... muito obrigada por toda ajuda, pela companhia diária, pelos momentos de alegria e risadas e pelos momentos difíceis que vivemos e aprendemos juntos, ter vocês ao meu lado fez com o que o trabalho se tornasse muito mais agradável. Agradeço especialmente a Aline e a Elisa que estiveram ao meu lado no início dessa jornada, me auxiliando dentro e fora do laboratório, eu aprendi muito com vocês e serei eternamente grata. À Sofia, por toda companhia, amizade, ajuda, por todos os finais de semana no lab, por todas as conversas... Muito obrigada por me oferecer um ombro amigo sempre que precisei. A Jessica e a Thais por formar comigo o trio mais diverso que poderia existir, obrigada por todos os momentos juntos. À profa. Kênia por todo auxílio, dicas e ensinamentos para o desenvolvimento deste trabalho. Ao técnico Euclides pelo cuidado com os animais e a Ângela por todo auxílio na rotina do laboratório. Aos animais que deram a vida para a realização deste estudo, o meu profundo respeito e gratidão. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 (processo nº88887.498167/2020-00). Agradeço também a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro e bolsa concedida (processo n° 2020/02918-9) que possibilitou a conclusão desse projeto com sucesso. À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP e o Programa de Pós-Graduação em Zootecnia pelo ensino e estrutura necessários para a execução do meu trabalho. A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho, o meu muito obrigada! II III PARTICIPAÇÃO DA IRISINA NO CONTROLE CARDIORRESPIRATÓRIO E METABÓLICO DE RATOS ADULTOS Resumo: - A irisina é um hormônio constituído por 112 aminoácidos recém-identificado, derivado de uma proteína transmembrana codificada pelo gene fibronectina tipo III contendo 5 genes (FNDC5), que está altamente relacionado à atividade metabólica do músculo esquelético e do tecido adiposo, possuindo uma similaridade de 100% entre ratos e humanos. Sabe-se que a concentração da irisina aumenta durante o exercício físico trazendo efeitos benéficos para vários tecidos, inclusive para o sistema nervoso, promovendo neuroplasticidade, uma vez que a irisina parece estar associada a proliferação e diferenciação neural. Recentemente também foi demonstrado que esse hormônio modula as funções cardiovasculares podendo atuar como um importante mensageiro entre os órgãos para integrar o gasto de energia com a atividade cardiovascular. Entretanto, pouco se sabe sobre a participação da irisina no controle cardiorrespiratório e metabólico. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da injeção intracerebroventricular (icv) de veículo ou irisina (IR, 0,425 e 1,66 µg/µL) no quarto ventrículo (4V) de ratos adultos sobre ventilação (V̇ E), consumo de oxigênio (V̇ O2), equivalente respiratório (V̇ E / V̇ O2), temperatura corporal (TC), pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) durante o estado de vigília e sono frente a exposição ao ar ambiente, hipercapnia (7% CO2) e hipóxia (10% O2). O tratamento com irisina centralmente com a menor concentração (0,425 µg/µL), promoveu uma redução na V̇ E em condições de ar ambiente durante a vigília, culminando em uma hipoventilação (menor V̇ E / V̇ O2). Durante a exposição as condições de ar ambiente, os animais tratados com a maior concentração de irisina (1,66 µg/µL), também apresentaram uma redução da V̇ E e da fR. Os animais tratados com a maior concentração de irisina quando expostos a altos níveis de CO2 apresentaram um aumento na V̇ E, em decorrência de um maior VT e uma redução no V̇ O2, o que acarretou em uma maior hiperventilação (maior V̇ E / V̇ O2) durante a vigília. As duas concentrações de irisina atenuaram a hipotermia induzida pela hipóxia. Em relação aos parâmetros cardiovasculares, a injeção central de irisina na menor concentração causou um aumento significativo na FC em todas as condições durante o sono e a vigília, sem alterar a PAM. Enquanto o tratamento com a maior concentração, promoveu um aumento da FC nos animais quando expostos a hipóxia durante os estados de sono e vigília e durante a hipercapnia em estado de sono. Nossos dados demonstram que a irisina exerce um efeito inibitório no controle da respiração em condição de ar ambiente e potencializa a resposta hiperventilatória sob hipercapnia, promovendo um aumento da V̇ E e inibindo o V̇ O2 durante a vigília. Além disso, essa miocina exerce uma modulação excitatória na FC e atenua a queda da temperatura corporal em condição de baixo O2. Palavras-chave: irisina, metabolismo, miocinas, ventilação IV PARTICIPATION OF IRISIN IN CARDIORRESPIRATORY AND METABOLIC CONTROL OF ADULT RATS Abstract: Irisin is a newly identified hormone consisting of 112 amino acids, derived from a transmembrane protein encoded by the type III fibronectin gene containing 5 (FNDC5), which is highly related to the metabolic activity of skeletal muscle and adipose tissue, having a similarity of 100 % between rats and humans. It is known that the concentration of irisin increases during physical exercise, bringing beneficial effects to various tissues, including the central nervous system, promoting neuroplasticity, since irisin seems to be associated with neural proliferation and differentiation. It has also recently been shown that this hormone modulates cardiovascular functions, possibly acting as an important messenger between organs to integrate energy expenditure with cardiovascular activity. Therefore, the present study evaluated the effect of intracerebroventricular (icv) injection of vehicle or irisin (IR, 0.425 and 1.66 µg/µL) in the fourth ventricle (4V) of adult male rats in ventilation (V̇ E), oxygen consumption (V̇ O2), ventilatory equivalent (V̇ E / V̇ O2), body temperature (TB), mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) in wakefulness and sleep state during room air, hypercapnia (7% CO2) and hypoxia (10% O2). Treatment with irisin centrally with the lowest concentration (0.425 µg/µL), promoted a reduction in V̇ E in room air conditions during wakefulness, culminating in a hypoventilation (lower V̇ E / V̇ O2). During exposure to room air conditions, animals treated with the highest concentration of irisin (1.66 µg/µL) also showed a reduction in V̇ E and fR. The animals treated with the highest concentration of irisin when exposed to high levels of CO2 showed an increase in V̇ E, due to a higher VT and a reduction in V̇ O2, which resulted in hyperventilation (higher V̇ E / V̇ O2) during wakefulness. The both concentrations of irisin attenuated hypoxia-induced regulated hypothermia. Regarding cardiovascular parameters, central irisin injection with the lower concentration caused a significant increase in HR under all conditions during sleep and wakefulness, without altering MAP. The treatment with the highest concentration promoted an increase in HR in the animals when exposed to hypoxia during sleep and wakefulness states and during hypercapnia in sleep state. Our data demonstrate that irisin exerts an inhibitory effect on breathing control and potentiates the hyperventilatory response under hypercapnia, promoting an increase in V̇ E and inhibiting V̇ O2 during wakefulness. In addition, this myokine is excitatory to HR and attenuates the drop in body temperature in low O2 conditions. Keywords: Irisin, myokines, metabolism, ventilation 1 CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS Introdução A principal função da respiração é manter relativamente constante as pressões parciais arteriais de oxigênio (PaO2) e dióxido de carbono (PaCO2), bem como os valores de pH. Esse processo é altamente integrado e envolve uma complexa rede de interação entre encéfalo, medula espinhal, nervos cranianos e espinhais, musculaturas específicas e pulmões, além de neurotransmissores, neuromoduladores e receptores (Del Negro et al., 2018). Por mais de um século, tem havido intenso interesse entre fisiologistas no mecanismo que regula a respiração durante o exercício. O fato muito reconhecido e incontestável é que em humanos saudáveis e na maioria dos outros mamíferos, a hiperpnéia do exercício não está associada ao aumento da PaCO2 ou à uma diminuição na PaO2 (Forster et al., 2012). Durante o exercício físico em indivíduos saudáveis, a ventilação alveolar e a difusão alvéolo-capilar se elevam proporcionalmente ao aumento da taxa metabólica para evitar alterações da PaCO2 e PaO2. Desta forma, ao menos em humanos, durante condições de exercício físico leve ou moderado, as pressões parciais dos gases sanguíneos se alteram minimamente, apesar do aumento da taxa metabólica em decorrência do esforço físico (Dempsey e Rankin, 1967; Forster et al., 1986). Até o presente momento, não há um mecanismo conhecido capaz de detectar diretamente a taxa de troca gasosa nos músculos ou nos pulmões (Forster et al., 2012). Assim, ainda não é totalmente conhecido como os neurônios respiratórios ajustam sua atividade frente ao exercício físico às variáveis que atualmente não podem ser diretamente monitoradas. Algumas hipóteses foram testadas e dados foram obtidos, porém para cada hipótese existem dados contraditórios ou razões para se questionar a validade de cada hipótese (Forster et al., 2012). Nas últimas décadas, diversas pesquisas visaram avaliar a relação entre a contração muscular gerada durante o exercício físico e seus benefícios sobre a resposta sistêmica. Já se sabe que a contração do músculo esquelético libera fatores humorais que regulam as funções metabólicas, as chamadas miocinas. As miocinas são citocinas derivadas do músculo esquelético que desempenham 2 funções fisiológicas e patológicas na manutenção da homeostase, podendo regular o metabolismo de maneira autócrina, parácrina ou endócrina (Goldstein, 1961; So, Kim, Kim e Song, 2014). Até a década de 2000, sabia-se que a interleucina 6 (IL-6), um importante mediador anti-inflamatório, era produzida em resposta à contração muscular (Fischer, 2006). Entretanto, recentemente foram descobertas novas miocinas que vem sendo amplamente investigadas devido ao seu potencial efeito metabólico. Há, por exemplo, a mionectina que está ligada ao metabolismo de ácidos graxos, o ácido beta-amino-isobutírico (BAIBA) cuja saturação resulta em reduções do tecido adiposo, a secreção de proteínas ácidas e ricas em cisteína (SPARC ou osteonectina) que tem um efeito sobre o metabolismo de carboidratos, a musclina que induz a biogênese mitocondrial e a fibronectina tipo III contendo 5 genes (FNDC5), chamada de irisina (Steensberg et al., 2000; Song et al., 2010; Bostrom et al., 2012; Peterson et al., 2014; Subbotina et al., 2015; Stanford e Goodyear, 2016). A irisina é um peptídeo formado por 112 aminoácidos clivado de uma proteína de membrana tipo 1 presente em miócitos e é codificada pelo gene FNDC5 (Bostrom, 2012; Hecksteden et al., 2013; Ohtaki, 2016). Especificamente, o FNDC5 é uma proteína formada por um peptídeo sinalizador com 29 aminoácidos, um domínio de fibronectina com 94 aminoácidos e uma terminação carboxila (Bostrom, 2012), possuindo uma similaridade de 100% entre ratos e humanos (Aydin et al., 2014). A irisina é secretada principalmente no músculo esquelético, preferencialmente pelas fibras musculares oxidativas (Bostrom et al., 2012). Recentemente, também foi demonstrado sua secreção pelo pâncreas, músculo cardíaco, glândulas sebáceas e tecido adiposo (Munoz et al., 2018). A liberação de irisina é induzida pelo exercício físico e sua ação periférica promove profundas alterações no tecido adiposo, estimulando fatores intracelulares com funções na biogênese mitocondrial, como por exemplo, na expressão de proteínas desacopladoras mitocondriais (UCP1) (Vaughan et al., 2014; Chen et al., 2015). Alguns estudos visando explicar os mecanismos moleculares da irisina encontraram que o tratamento com a r-irisina (irisina humana purificada) in vitro utilizando cultura de adipócitos, aumentou a expressão de UCP1 por meio do aumento da fosforilação da proteína quinase 3 ativada por mitógeno p38 (MAPK p38) e quinases reguladoras (Zhang et al., 2014). Assim, uma das funções mais importantes da irisina é a regulação da termogênese, devido a sua capacidade de aumentar o gasto energético, promovendo uma perda de massa corporal e redução à resistência à insulina (Bostrom, 2012). Estudos também demostraram que a irisina pode atuar como uma adipocina (Moreno-Naverrete et al., 2013; Roca-Rivada et al., 2013), bem como uma potencial “neurocina” (Huh et al., 2012; Dun et al., 2013). Embora o papel da irisina no encéfalo ainda não seja claro, estudos demonstraram que a irisina aplicada centralmente aumenta a proliferação de células neuronais do hipocampo de camundongos (Moon et al., 2013). Neste contexto, estudo de Piya et al. (2014) demonstrou a presença de irisina no fluído cérebro espinhal de humanos e receptores para essa miocina no hipotálamo, sugerindo a participação central desse hormônio no controle do metabolismo. Adicionalmente, Dun et al. (2013) reportaram a expressão de irisina e FNDC5 em células de Purkinje do cerebelo de roedores, assim como em neurônios e neuroglia (Dun et al., 2013; Aydin et al., 2014; Gur et al., 2017). De forma interessante, recentemente foi demonstrado que a irisina também participa do controle cardiovascular (Zhang et al., 2015). Segundo os autores, a irisina atuando no sistema nervoso central (SNC) aumenta o débito cardíaco e a pressão arterial ativando os neurônios do núcleo paraventricular hipotalâmico. Já a irisina periférica derivada do músculo esquelético, em resposta ao exercício ou aos estímulos de frio, pode impedir a elevação da pressão arterial induzida pela ativação simpática (Zhang et al., 2015). Desta forma, os pesquisadores sugerem que a irisina pode atuar como um importante mensageiro entre os órgãos ligando a atividade do músculo esquelético ao encéfalo, tecido adiposo e sistema cardiovascular para integrar o gasto de energia com a atividade cardiovascular. Mais recentemente, o estudo de Gamal et al. (2020) demonstrou que pacientes com artrite reumatóide que apresentavam melhor qualidade de sono, também tinham maiores concentrações de irisina plasmática. Desta forma, os autores sugerem que a irisina pode estar relacionada com a melhora da qualidade do sono em humanos. A expressão e atuação da irisina em vários tecidos demonstra seu papel importante nos diversos sistemas fisiológicos, mas são necessários mais 4 estudos para confirmar e melhor compreender as funções específicas da irisina, como por exemplo sobre o sistema de controle respiratório (Panati et al., 2016). Como previamente mencionado, não se sabe ainda o que causa o aumento da ventilação durante o exercício físico, uma vez que a PaCO2 e PaO2 variam minimante. Provavelmente mediadores, como as miocinas, podem fazer parte dessa via de sinalização entre atividade muscular e ajuste da ventilação. 47 References Anju TR, Jayanarayanan S, Paulose CS (2011) Decreased GABAB receptor function in the cerebellum and brain stem of hypoxic neonatal rats: Role of glucose, oxygen and epinephrine resuscitation. Journal of Biomedical Science 18. Aydin S, Kuloglu T, et al. 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