UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE MEDICINA 

 
 

 
 
 
 
 
 

Patrícia Aparecida Borim 

 
 
 
 
 
 

 

“Efeito da rapamicina em células de animais com 

encefalomielite autoimune experimental’’ 

 

 
 
 

Dissertação apresentada à Faculdade de 

Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio 

de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para 

obtenção do título de Mestre em Doenças 

Tropicais (AC.: Imunologia Celular).  

 

 

 

 

Orientadora: Profa. Dra. Alexandrina Sartori 

Coorientadora: Profa. Dra. Thais Fernanda de Campos Fraga da Silva 

 
 
 
 
 
 
 

Botucatu-2019



 

 

Patrícia Aparecida Borim 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

Efeito da rapamicina em células de animais com 

encefalomielite autoimune experimental 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Dissertação apresentada à Faculdade de 

Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio 

de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para 

obtenção do título de Mestre em Doenças 

Tropicais (AC.: Imunologia Celular). 

 

 

 

 

 

 

Orientadora: Profa. Dra. Alexandrina Sartori 

Coorientadora: Profa. Dra. Thais Fernanda de Campos Fraga da Silva 

 
 

 
 
 

 

Botucatu-2019 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

Dedicatória 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Aos meus pais, Odemar Luiz Borim e Margarida Messias Borim, pessoas 

importantes da minha vida, dedico esse trabalho com todo meu amor e 

carinho, agradeço imensamente por terem me proporcionado uma estrutura 

emocional sólida que permitiu meu progresso moral e intelectual. Todas as 

minhas boas atitudes eu devo a vocês e é por esses e inúmeros outros motivos 

que sempre os respeitarei e amarei. 

 



 

 

 

 

 

 

 

Epígrafe 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“A verdadeira viagem de descobrimento  

 não consiste em procurar novas paisagens, 

 mas em ter novos olhos” 

                                                                                (Marcel Proust) 



 

 

 

 

 

 

 

 

Agradecimentos 

 

 

 



 

 

Agradecimentos 

 

 

 À minha orientadora Profª. Dra. Alexandrina Sartori, pela confiança 

depositada em mim, por sua dedicação e pelos ensinamentos. Tenho muito 

orgulho de ter sido orientada por uma profissional extremamente comprometida 

a ensinar. 

 

À minha coorientadora Profa Dra. Thais Fernanda de Campos Fraga da Silva, Deus é 

tão maravilhoso, ele faz tantas obras na nossa vida, que eu só tenho a 

agradecer a você. Muito obrigada pela paciência em todas as etapas desse 

projeto. Foi um grande prazer poder trabalhar com uma profissional que eu 

respeito e admiro. Obrigada por confiar sempre no meu potencial, na prática e 

no dia-a-dia, e principalmente pela amizade, carinho e por torcer tanto por 

mim. 

 

Às minhas amigas do laboratório; Larissa Ragozo, Larissa Ishikawa, Luiza 

Mimura, Sofia Zorzella Pezavento, Juliana Toledo e Natalia Munhos. Serei 

eternamente grata por tudo que me foi proporcionado. Agradeço todo o apoio, 

conversas e risadas durante esse período. Obrigada por estarem sempre 

dispostas a me ajudar e sanar minhas dúvidas. Nessa nova jornada que se inicia 

vou levar um pouquinho de cada uma de vocês no meu coração. 

 

À banca do Exame Geral de Qualificação, Prof. Dr. Robson Francisco 

Carvalho e a Profª. Dra. Graziela Gorete Romagnoli Castilho que cederam 

parte de seu precioso tempo para contribuir com meu trabalho. 

 

 



 

 

Aos membros da banca de Defesa, Prof. Dr. Alessandro dos Santos Farias e 

Profª. Dra. Graziela Gorete Romagnoli Castilho, por aceitarem meu convite e 

por compartilharem comigo este momento tão importante e esperado. 

 

À minha amiga Dra Mariana Gatto que me proporcionou a base necessária para 

chegar até aqui. Obrigada por sempre ter acreditado e depositado sua 

confiança em mim ao longo desse tempo que se iniciou ainda no 

aprimoramento. 

 

À minha amiga de moradia e de pós-graduação, Beatriz Soares Pereira, por 

todo o companheirismo e apoio. Sempre juntas nesse árduo caminho da pós 

graduação, te agradeço por compartilharmos momentos de desespero, mas na 

maioria das vezes, momentos de alegria e divertimento. Você entrou na minha 

vida de uma forma especial, me trazendo alegria e me mostrando que uma 

verdadeira amizade existe, nossa amizade é de Deus. 

 

Aos meus avós Laurentina dos Santos e Nelson Lopes e Minha tia Lázara dos 

Santos (in memorian), pessoas que estarão eternamente no meu coração. 

Espero que onde estiverem estejam orgulhosos de mim.  

 

Deus! 

Agradeço a ti por me guiar, iluminar e me dar tranquilidade para seguir em 

frente com os meus objetivos e não desanimar com as dificuldades. Obrigada, 

por me dares muito mais do que eu preciso e por me abençoar muito mais do 

que eu mereço.



 

 

Meus sinceros agradecimentos às seguintes instituições 

 

 

À Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio 

de Mesquita Filho” – FMB /UNESP; 

 

Ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais e à Seção Técnica de 

Pós-Graduação da FMB, em especial à Bruna Quirino Jorgetto. 

 

Ao Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências de 

Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – 

IBB/UNESP; 

 

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) 

pela concessão da bolsa durante o período de realização do mestrado; 

 

À Fapesp pelo auxílio financeiro nº 2013/26257-8. 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

Resumo 



 

 

BORIM, P. A. Efeito da rapamicina em células de animais com encefalomielite autoimune experimental. 

2019. 62 p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista 

(UNESP), Botucatu, 2019. 

 

A rapamicina, também conhecida como sirolimus, é um imunossupressor isolado da bactéria 

Streptomyces hygroscopicus. Este fármaco tem sido empregado clínicamente para o controle 

de rejeição de transplantes de órgãos sólidos, diabetes, esclerose tuberosa, doenças 

neurodegenerativas e inclusive, no controle da esclerose múltipla (EM). O entendimento do 

mecanismo de ação da rapamicina requer o conhecimento da via de sinalização intracelular 

envolvendo os complexos mTOR (mammalian target of rapamycin). Evidências indicam que 

o mTOR está envolvido na ativação pró-inflamatória de leucócitos. Nesse contexto, o objetivo 

geral desta dissertação foi investigar o efeito in vitro da rapamicina em células envolvidas na 

imunopatogênese da encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo murino de 

EM. Células do sisterma nervoso central (SNC) e do baço de camundongos com EAE foram 

tratadas com rapamicina e simultaneamente estimuladas com glicoproteína da mielina de 

oligodendrócitos. A rapamicina reduziu a produção de IL-17 em culturas de células do SNC e 

do baço. Adicionalmente, diminuiu a produção de IFN-γ, TNF-α e IL-10 e a expressão gênica 

de RORc em culturas de células do SNC. A microglia, que é uma célula fagocítica residente 

no SNC e envolvida na neuroinflamação, também foi testada. Em células da microglia 

(linhagem BV-2) estimuladas com LPS, a rapamicina diminuiu a produção de TNF-α e IL-6 e 

também reduziu a mediana da intensidade da fluorescência referente às moléculas MHC II, 

CD40 e CD86. Este efeito imunossupressor foi associado à maior expressão gênica de 

TREM2 e menor expressão gênica de iNOS. Estes resultados indicaram que a rapamicina 

modula negativamente a ativação de células autorreativas e da microglia ativada. Portanto, 

propomos que outras moléculas candidatas à terapia da EM sejam inicialmente rastreadas 

usando essa abordagem. 

 

Palavras-chave: imunomodulador, esclerose múltipla, linfócitos, microglia, mTOR. 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abstract 

 

 

 

 



 

 

BORIM, P. A. Effect of rapamycin on cells from mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. 

2019. 62 p. Master thesis (Master) – Botucatu Medical School, São Paulo State University (UNESP), Botucatu, 

2019. 

 

Rapamycin, also known as sirolimus, is an immunosuppressant produced by the bacterium 

Streptomyces hygroscopicus. Rapamycin has been clinically used for the control of rejection 

of solid organ transplants, diabetes, tuberous sclerosis, neurodegenerative diseases, including 

multiple sclerosis (MS). To better understand the mechanism of action of rapamycin, is 

necessary the knowledge of intracellular signaling of the mTOR (mammalian target of 

rapamycin) complex. Evidence indicates that mTOR is involved in the proinflammatory 

activation of leukocytes. In this scenario, the main objective of this investigation was to 

evaluate the in vitro effect of rapamycin in cells derived from mice with experimental 

autoimmune encephalomielits (EAE) and in a microglia cell line. CNS and spleen cells from 

EAE mice were treated with rapamycin and simultaneosly stimulated with a myelin 

oligodendrocyte glycoprotein peptide. Rapamycin reduced IL-17 production in both, CNS and 

spleen cell cultures. Additionally, rapamycin decreased IFN-γ, TNF-α and IL-10 production 

and RORc mRNA expression in CNS cell cultures. Microglia, that is a phagocytic immune 

cell in the CNS involved in neuroinflammation, was also tested. Microglia (BV-2 lineage) 

treated simultaneously with rapamycin and LPS showed a decreased production of TNF-α and 

IL-6 and also reduced expression of MHC II, CD40 and CD86. This downmodulatory effect 

was associated to upregulated TREM2 mRNA and downregulated iNOS mRNA expression. 

These results indicated that rapamycin downmodulates the activation of autoreactive cells and 

activated microglia. We therefore propose that other MS therapy candidate molecules are 

initially screened by using this approach.    

 

Key words: immunomodulation, multiple sclerosis, lymphocytes, microglia, mTOR. 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Sumário 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

Sumário 

 

Resumo 

Abstract 

Introdução ............................................................................................................................ 18 

Rapamicina  ........................................................................................................................... 18              .. 

Esclerose múltipla e encefalomielite autoimune experimental  ................................................ 22 

Aspectos terapêuticos na EM  ................................................................................................. 24 

Microglia: participação na imunopatogênese e alvo terapêutico da rapamicina  .................... 26 

Justificativa  .......................................................................................................................... 29 

Objetivos  .............................................................................................................................. 30 

Protocolos experimentais ..................................................................................................... 31 

Métodos  ................................................................................................................................ 33 

Animais  ................................................................................................................................. 33 

Indução de EAE e avaliação clínica  ...................................................................................... 33 

Análise histopatológica  ......................................................................................................... 33 

Cultura de células esplênicas  ................................................................................................ 34 

Cultura de células do SNC  ..................................................................................................... 34 

Cultura de linhagem celular BV-2  ......................................................................................... 35 

Quantificação de citocinas por ELISA  ................................................................................... 35 

Quantificação de citocinas por CBA  ...................................................................................... 35 

Extração de RNA  ................................................................................................................... 36 

Ensaio de RT-qPCR  ............................................................................................................... 36 

Atividade celular  ................................................................................................................... 37 

Imunofenotipagem celular por citometria de fluxo  ................................................................. 38 

Análise estatística  .................................................................................................................. 38 

Resultados  ............................................................................................................................ 39 

Características clínicas e histopatológicas dos animais com EAE  ......................................... 39 

A rapamicina reduz a produção de IL-17 por células esplênicas de animais com EAE  .......... 40 

A rapamicina diminui a produção de citocinas encefalitogênicas  .......................................... 40 

A rapamicina induz um perfil M2 em células da micróglia  .................................................... 43 

Discussão  .............................................................................................................................. 46 

Considerações finais  ............................................................................................................ 51        

Referências  ........................................................................................................................... 52 



 

 

ANEXO 

Anexo I – Certificado CEUA Nº 1118 .............................................................................................. 62 

 

 

   

 

 

 

 

 

  

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Capítulo 1 

 

 

 

 

 

 

 

 



18 

Introdução

 
 
1. Rapamicina 

 

A rapamicina, também conhecida como sirolimus, é uma lactona macrocíclica isolada 

da bactéria Streptomyces hygroscopicus. Como esta bactéria foi isolada de uma amostra de 

solo obtida na Ilha de Rapa Nui (Ilha de Páscoa), esta lactona recebeu a denominação de 

rapamicina. Inicialmente a rapamicina foi identificada como um antibiótico/antifúngico 

(VÉZINA; KUDELSKI; SEHGAL, 1975). Desde sua aprovação pela US Food and Drug 

Administration (FDA), em 1999, suas propriedades têm sido melhor caracterizadas e seu 

emprego clínico foi ampliado incluindo o controle de rejeição de transplantes de órgãos 

sólidos (SAUNDERS; METCALFE; NICHOLSON, 2001) diabetes, esclerose tuberosa, 

doenças neurodegenerativas e também do processo de envelhecimento (LI; KIM; BLENIS, 

2014). Na década de 80, cientistas descobriram que este fármaco também inibia o crescimento 

de tumores e desde 2007 dois derivados, Temsirolimus da Pfizer e Everolimus da Novartis, 

foram aprovados para uso em vários tipos de câncer, sendo administrados isoladamente ou em 

combinação com outros fármacos (DAI et al., 2012).  

Como já mencionado, a rapamicina tem sido empregada para impedir rejeição de 

transplantes de órgãos sólidos, principalmente de rim. Entretanto esse medicamento pode 

desencadear efeitos colaterais em 10% dos pacientes e esses efeitos incluem: infeções, febre, 

cicatrização lenta, níveis baixos de diferentes células sanguíneas, níveis baixos de potássio e 

fosfato, níveis elevados de gorduras, colesterol, glicose e marcadores de degradação dos 

tecidos e de função hepática e renal, linfocele, dor em diversas partes do corpo, taquicardia, 

pressão arterial elevada, problemas intestinais, proteinúria, distúrbios menstruais, erupção 

cutânea e até acne (CHMP, 2018). Entretanto a agência europeia de medicamentos concluiu 

que os benefícios da rapamicina são superiores aos seus riscos e que o medicamento pode ser 

utilizado de forma segura e eficaz quando sob preescrição médica.  

Nosso interesse neste fármaco reside nas suas propriedades imunossupressoras e no 

seu potencial de prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas, em especial no 

contexto da esclerose múltipla (EM). O entendimento do mecanismo de ação da rapamicina 

requer o conhecimento da via de sinalização intracelular envolvendo os complexos mTOR 

(mammalian target of rapamycin). Estes dois complexos são conhecidos como mTORC1 e 

mTORC2 e ambos estão envolvidos em processos fundamentais em diversas funções 



19 

celulares (SAXTON; SABATINI, 2017). A estrutura básica destes complexos é a mesma e 

inclui três moléculas:  mTOR, DEPTOR e mLST8. No caso do mTORC1 estas moléculas 

estão associadas com mais duas moléculas, RAPTOR e PRAS40, e no caso do mTORC2 

estão associadas a três moléculas adicionais, RICTOR, mSin1 e PROTOR (YIP et al., 2010). 

TOR é uma serina treonina quinase de elevado peso molecular (~290 KDa) que pertence à 

família das fosfatidilinositol quinases. Os sinais que ativam essas vias bem como as 

respectivas funções celulares afetadas estão esquematizados na figura A.  

 

 

 

Figura A. Estrutura e funções do mTOR. mTOR existe em dois complexos funcionalmente 

distintos denominados mTORC1 e mTORC2. Exposição aguda ou crônica à rapamicina 

determina  inibição de mTORC1 e mTORC2, respectivamente. Figura retirada de (LI; KIM; 

BLENIS, 2014).  

 

Como mostrado na figura A estes complexos regulam respostas celulares distintas.  O 

complexo mTORC1 integra vários sinais oriundos de fatores de crescimento, oxigênio, nível 

energético e nutrientes (aminoácidos por exemplo) para promover o crescimento celular e 

proliferação. A ativação desta via promove processos anabólicos tais como síntese de 

proteínas, lipídios e nucleotídeos, estimulação de vias de metabolismo energético (glicólise e 

glutaminólise) e inibição de processos catabólicos como por exemplo, autofagia (TEE, 2018).  

De forma distinta do mTORC1, o mTORC2 só responde a fatores de crescimento e 



20 

regula outras funções celulares, sendo a organização da actina/citoesqueleto e a sobrevivência 

celular as mais conhecidas (TEE, 2018). A atividade imunossupressora da rapamicina e seus 

derivados (rapalogs) se deve principalmente ao seu efeito inibidor sobre o mTORC1. Como 

ilustrado na figura B, a rapamicina forma um complexo com moléculas FKBP12 e este 

complexo inibe a função do mTORC1 (inibição alostérica). 

 

 

 

Figura B. Inibição do mTORC1 por rapamicina. Mecanismo de ação de  FK506 e  

rapamicina na ativação de linfócitos T. O FK506 liga-se ao FKBP12 citosólico formando o 

complexo FKBP12-FK506. Este complexo inibe a desfosforilação de NFATs dependente de 

calcineurina (CaN) no citoplasma e previne sua translocação nuclear e a transcrição de genes 

de ativação de células T. A rapamicina também forma um complexo com FKBP12. No 

entanto, este complexo tem como alvo mTORC1 bloqueando a progressão do ciclo celular. 

Figura retirada de (TONG; JIANG, 2015).  

 

Uma das principais atividades supressoras atribuídas à rapamicina é a inibição da 

proliferação das células T induzida por IL-2 (BENJAMIN et al., 2011). Além de exercer 

potente efeito imunossupressor em linfócitos específicos para o antígeno, a rapamicina 

também modula a imunidade adaptativa através de interação com células da imunidade inata 

(células dendríticas e macrófagos) (KATHOLNIG et al., 2013). Os possíveis efeitos da 

inibição do mTORC1 na resposta imune são ilustrados na figura C. Como pode se observar, o 

efeito da rapamicina é complexo e inclui também alguns efeitos positivos na resposta imune 



21 

como, por exemplo, ativação de células dendríticas e de células TCD8+ de memória em 

resposta à vacinação por vírus. 

 

Figura C. Efeito da rapamicina sobre a resposta imune. Os efeitos da rapamicina sobre a 

resposta imune são geralmente de supressão e estão associados com o mTORC1. Entretanto, 

alguns efeitos ativadores e sobre a angiogênese também foram constatados. Figura retirada de 

(GEISSLER, 2015).  

 

A escolha da rapamicina para ser testada neste trabalho foi baseada inicialmente na 

sua atividade imunossupressora sobre várias doenças autoinflamatórias e autoimunes 

incluindo colite (YIN et al., 2013), miosite (PREVEL et al., 2013), síndrome linfoproliferativa 

autoimune (TEACHEY et al., 2006) e diabetes (HE et al., 2016). Também consideramos o 

fato de que a sinalização via mTOR está envolvida em várias etapas do funcionamento normal 

e anormal do sistema nervoso central (SNC) (TAKEI; NAWA, 2014). 

Em função de suas propriedades imunossupressoras, a rapamicina poderá ser 

futuramente empregada no tratamento da EM. Alguns ensaios pré-clínicos foram realizados 

com modelos experimental desta doença e os resultados serão descritos no final deste 

capitulo. 

 

 



22 

2. Esclerose múltipla e encefalomielite autoimune experimental 

 

A EM é uma das patologias progressivas mais prevalentes do SNC. É considerada um 

distúrbio autoimune caracterizado por inflamação, desmielinização e extensão variável de 

perda axonal (GHASEMI; RAZAVI; NIKZAD, 2017). Afeta aproximadamente 2,5 milhões 

de pessoas em todo o mundo, sendo mais comum em adultos jovens (DENDROU; FUGGER; 

FRIESE, 2015). É causa de grande impacto socioeconômico, pois esses adultos jovens estão 

em idade economicamente ativa, constituindo família e construindo carreira profissional 

(DENDROU; FUGGER; FRIESE, 2015). 

A prevalência da EM é estimada em aproximadamente 2,3 milhões de pessoas em 

todo o mundo, sendo que a incidência é 2 a 3 vezes superior no sexo feminino (ALONSO; 

HERNÁN, 2008; BROWNE et al., 2014). Acomete 30 pessoas para cada 100.000 habitantes 

na Europa, seguida pelo Mediterrâneo Oriental (14,9 a cada 100.000), Continente Americano 

(8.3 a cada 100.000) e com menor prevalência na África (0,3 a cada 100.000) (WORLD 

HEALTHY ORGANIZATION, 2008). Atualmente estima-se que 35 mil brasileiros estejam 

afetados pela doença, sendo a maior prevalência em Santos e Itapira no estado de São Paulo 

(FRAGOSO; PERES, 2007). 

A etiologia da EM né multifatorial, acredita-se que o resultando da interação entre 

fatores ambientais e genéticos (MARRIE, 2004). Um forte candidato genético responsável 

pela maior susceptibilidade é o alelo HLA-DRB1*1501 (SCHMIDT; WILLIAMSON; 

ASHLEY-KOCH, 2007). Outros aspectos relevantes determinados através de estudos 

epidemiológicos são os fatores ambientais tais como infecção pelo vírus Epstein–Barr, 

tabagismo e nível de exposição solar. Tem sido descrito que nas regiões setentrionais, onde a 

prevalência de EM é mais elevada, a exposição solar é menor e faz com que os níveis de 

vitamina D, os quais são estimulados pela luz solar, sejam menores. Os efeitos moduladores 

da vitamina D tanto na imunidade inata quanto adaptativa poderão explicar a relevância deste 

fator ambiental na patogênese da EM (ASCHERIO; MUNGER; LÜNEMANN, 2012; 

PIERROT-DESEILLIGNY; SOUBERBIELLE, 2010).  

A apresentação clínica da EM pode variar bastante entre os pacientes sendo 

geralmente caracterizada por ataxia, hemiparesia ou paraparesia. É caracterizada por 

episódios agudos (surtos) da doença, com perda gradual e progressiva da função neurológica. 

Pode ser classificada em quatro subtipos ou formas independentes: remitente-recorrente, 

progressiva primária, progressiva secundária e progressiva recorrente, sendo o primeiro 

subtipo a forma mais comum e que ocorre em 85% dos casos (SUNEETHA; RAJA 



23 

RAJESWARI, 2016). 

A dificuldade do diagnóstico se deve à variedade de sintomas e semelhança dos 

mesmos com manifestações clínicas encontradas em outras patologias do SNC (DENDROU; 

FUGGER; FRIESE, 2015). A maioria dos pacientes apresenta inicialmente um quadro 

transitório de sintomas com períodos de exacerbação e remissão da doença, seguido por fase 

secundária progressiva que caracteriza-se por perdas irreversíveis e neurodegeneração 

(FLETCHER et al., 2010; KAPPOS et al., 2010).  

Parte significativa do conhecimento acerca da imunopatogênese da EM advém de 

dados obtidos no principal modelo animal correspondente, conhecido como encefalomielite 

autoimune experimental (EAE). Além de permitir estudos sobre a imunopatogênese, este 

modelo animal também é amplamente utilizado para investigar alternativas de tratamentos 

imunomoduladores. Distintos antígenos derivados do SNC têm sido utilizados para induzir a 

EAE em diferentes linhagens de camundongos (MIX et al., 2010). São exemplos de alguns 

dos antígenos empregados na indução da EAE: proteína básica de mielina (MBP), 

glicoproteína de mielina do oligodendrócito (MOG) e peptídeos derivados destas proteínas. A 

indução da doença no animal requer imunização com o antígeno emulsificado com Adjuvante 

Completo de Freund (ACF) e a inoculação de toxina derivada da bactéria Bordetella 

pertussis. Diferentes animais podem ser utilizados para indução de EAE, incluindo primatas e 

roedores. Dentre estes, as linhagens de camundongos isogênicos têm sido amplamente 

empregadas, possibilitando variações no desenvolvimento da EAE que permitem responder 

de maneira mais adequada aos diferentes questionamentos. As linhagens de camundongos 

isogênicos C57BL/6 e SJL têm sido utilizadas como modelos para mimetizar decurso crônico 

e/ou de exacerbação-remissão, respectivamente, que são as formas mais freqüentes de EM 

(CROXFORD; KURSCHUS; WAISMAN, 2011; GOLD; LININGTON; LASSMANN, 

2006). A imunização de camundongos C57BL/6 com o peptídeo 35-55 derivado de MOG, por 

exemplo, desencadeia uma doença neurológica caracterizada por paralisia e também um 

extenso processo de desmielinização. Os animais desenvolvem doença crônica que perdura 

por, pelo menos, 45 dias (BERNARD et al., 1997).  

Em termos de imunopatogênese, dados derivados de doença humana e experimental 

indicam que o desenvolvimento da doença inclui as seguintes etapas: 

I. ativação periférica de linfócitos T específicos para mielina (ALMOLDA; 

GONZÁLEZ; CASTELLANO, 2010); 

II. migração destas células para o SNC (SCHULZ; ENGELHARDT, 2005); 



24 

III. reativação das células T no SNC por reconhecimento de autoantígenos na 

superfície de células apresentadoras de antígenos (LODYGIN; FLÜGEL, 2016); 

IV. inflamação local (neuroinflamação) associada com ativação do inflamassoma e 

geração de estresse oxidativo (FREEMAN; TING, 2016); 

V. desmielinização e disfunção neuroral (LUBETZKI; STANKOFF, 2014; OSORIO-

QUEREJETA et al., 2017).  

A EAE tem sido classicamente considerada uma doença mediada por células Th1 

específicas para mielina que migram da periferia para o SNC. Esta participação tem sido 

confirmada através de diferentes procedimentos experimentais. Por exemplo, células Th1 

específicas para mielina transferem adotivamente a doença e também tem sido 

demonstradoque as citocinas pró-inflamatórias produzidas por estas células, tais como IFN-γ 

e TNF-α, danificam a bainha de mielina (KLINKERT et al., 1997; SUN et al., 2004).  

 De maneira similar ao que é observado na EM, as celulas Th17 desempenham um 

papel crítico na patogênese da EAE. Por exemplo, animais deficientes de IL-17 desenvolvem 

EAE mais tardiamente e com sintomatologia mais branda (KOMIYAMA et al., 2006). A 

observação de que células Th17 específicas para mielina podem determinar o 

desenvolvimento da EAE após transferência adotiva destas células comprovam a relevância 

do seu papel na EAE (AWASTHI; MURUGAIYAN; KUCHROO, 2008). Além disto, esta 

citocina participa da ruptura da barreira hematoencefálica (BHE), o que é considerado um 

evento essencial para o início da inflamação local. A IL-17 também auxilia na migração de 

células inflamatórias para o SNC e estimula a produção de espécies reativas de oxigênio 

acarretando redução da expressão de moléculas de junção das células endoteliais (HUPPERT 

et al., 2010).  

Células da imunidade inata, tais como neutrófilos e macrófagos, também participam 

ativamente da doença determinando disfunções neurológicas (GANDHI; LARONI; 

WEINER, 2010; HEMMER; KERSCHENSTEINER; KORN, 2015; HERNÁNDEZ-PEDRO 

et al., 2013). Outra população celular importante neste processo é a microglia. As células da 

microglia fazem parte do grupo denominado células da neuroglia existentes no SNC: 

astrócitos, oligodendrócitos e microglia. Como o nome indica, as células da microglia são 

menores. Estas células compartilham várias propriedades com os macrófagos sendo 

consideradas células da imunidade inata residentes no SNC.  

 

 

 



25 

3. Aspectos terapêuticos na EM 

  

O tratamento da EM tem como objetivo principal impedir a progressão da doença e, 

portanto, o agravamento da incapacidade neurológica (COMPSTON, 2004) O tratamento 

disponível para os pacientes com EM varia nos diferentes países, mas de maneira geral, são 

baseados principalmente em fármacos imunomoduladores visando redução da gravidade e da 

frequência de recidivas, uma vez que não há cura para a doença (DAMAL; STOKER; 

FOLEY, 2013). Os corticosteroides são usualmente utilizados na fase aguda da doença 

enquanto que fármacos imunomoduladores, tais como o IFN-β e o acetato de glatirâmer, são 

utilizados em pacientes com quadros de exacerbação e remissão da doença (GOLD; 

WOLINSKY, 2011; RUDICK, 2005). Esses dois medicamentos impedem ativação, 

proliferação e migração de células inflamatórias para o SNC (GOLD; WOLINSKY, 2011).  

 Pacientes que não respondem bem a essa primeira linha de tratamento são submetidos 

ao uso do natalizumabe, um anticorpo monoclonal que se liga à cadeia α4 da integrina VLA-

4, inibindo a adesão entre linfócitos e células endoteliais dos vasos sanguíneos no SNC, 

reduzindo assim o tráfego de linfócitos através da BHE (POLMAN et al., 2006). O 

fingolimode, disponibilizado para uso clínico desde 2010, sequestra os linfócitos nos órgãos 

linfóides secundários atuando sobre o receptor para esfingosina-1-fosfato (S1P). Essa terapia 

é capaz de reduzir o infiltrado inflamatório no SNC por impedir a migração de linfócitos 

ativados e também por possuir um efeito neuroprotetor direto nas células do SNC (AKTAS et 

al., 2010; SLOWIK et al., 2015).  

Apesar da variedade de condutas terapêuticas aprovadas para o tratamento da EM, 

essas medicações possuem custo muito elevado, estão associadas com vários efeitos colaterais 

e não são eficazes em todos os pacientes. Portanto, ainda há a necessidade de se investigar 

novas estratégias terapêuticas.  

 Como dissemos anteriormente, o potencial terapêutico da rapamicina vem sendo 

testado em modelo experimental e também em pacientes com EM (BAGHERPOUR et al., 

2018). A participção da via de sinalização da rapamicina (mTOR) em doenças neurológicas 

vem sendo amplamente estudada. Um aspecto importante que decorreu da descoberta de 

mTOR é que os inibidores farmacológicos desta via, como sirolimus e everolimus, mostraram 

benefícios clínicos em alguns distúrbios neurológicos, como na esclerose tuberosa, e já são 

considerados para ensaios clínicos em epilepsia, autismo, demência, traumatismo crânio 

encefálico e acidente vascular cerebral (CRINO, 2016).  

Alguns estudos empregando a rapamicina no modelo de EAE sugerem que este 



26 

fármaco possa ser uma opção terapêutica para o tratamento da EM. Hou e colaboradores 

(HOU et al., 2017) mostraram que a terapia com rapamicina inibiu o desenvolvimento da 

EAE, reduzindo o infiltrado inflamatório no SNC. Os autores associaram o efeito protetor à 

inibição da via de sinalização mTOR-STAT3, impedindo a função e a diferenciação das 

células Th1. No modelo de EAE do tipo recorrente-remitente (EAE-RR), a rapamicina 

preveniu a indução e a progressão da doença. Este efeito benéfico foi associado à supressão 

da função das células T efetoras e aumento simultâneo da porcentagem de células T 

reguladoras (ESPOSITO et al., 2010). Análises histopatológicas em amostras de cérebro 

revelaram uma melhora na mielinização da substância branca em animais tratados com 

rapamicina. Além disso a rapamicina foi capaz de reduzir os sinais de dor neuropática 

(O’CONNOR et al., 2008).  

O tratamento de células da microglia com rapamicina evidenciou que o mTOR 

controla seletivamente a ativação microglial em resposta às citocinas pró-inflamatórias 

induzidas por lipopolissacarídeo (LPS) (DELLO RUSSO et al., 2009). Os autores sugerem, 

portanto, que esse fármaco pode ser uma ferramenta farmacológica útil para reduzir a 

neuroinflamação (DELLO RUSSO et al., 2009).  

 

4. Microglia: participação na imunopatogênese e alvo terapêutico da rapamicina 

 

Células da microglia desenvolvem-se a partir de uma célula progenitora microglial 

eritro-mielóide presente no saco vitelino e que migram para o cérebro nos primeiros dias de 

desenvolvimento. A diferenciação destas células é, portanto, distinta de outros macrófagos 

teciduais que têm um desenvolvimento mais tardio e passam pelo fígado fetal antes de migrar 

para seus tecidos específicos (GINHOUX; GUILLIAMS, 2016; KIERDORF et al., 2013).  

De forma similar aos macrófagos, as células da microglia expressam moléculas de 

histocompatibilidade (MHC) I e II, secretam citocinas pró e anti-inflamatórias e expressam 

receptores para Fc e para componentes do sistema complemento (LUO et al., 2017). Estas 

células participam tanto da patogênese quanto da reparação do tecido nervoso lesado. No 

primeiro caso da patogênese funcionam como células apresentadoras de antígenos (APCs), 

secretam citocinas pró-inflamatórias e danificam a bainha de mielina e os oligodendrócitos 

(LULL; BLOCK, 2010). Por outro lado, podem promover remielinização através da 

expressão de moléculas anti-inflamatórias, fagocitose de debris e reparo do tecido lesado 

(MCMURRAN et al., 2016). Estas funções aparentemente antagônicas têm sido associadas 

com fenótipos distintos da microglia classificados como M1 e M2, de forma similar à 



27 

classificação adotada para os macrófagos. A microglia M1 promove inflamação e danos nos 

oligodendrócitos enquanto que a microglia M2 regula funções imunes promotoras de reparo 

no SNC. A microglia M1 produz mediadores pró-inflamatórias tais como IL-1β, TNF-α e NO 

sintase. Já a microglia M2 produz citocinas anti-inflamatórias, como por exemplo IL-10, 

expressa receptor para manose e secreta arginase (XU et al., 2017).  

 Em termos de polarização das células da microglia, são discutidos na literatura dois 

aspectos considerados importantes no contexto desse projeto. O primeiro deles refere-se a 

ativação clássica denominada perfil M1, o qual caracteriza um fenótipo pró-inflamatório. O 

processo de polarização para o perfil M1 dependente dos estímulos iniciais recebidos por 

estas células e resulta na produção de citocinas inflamatórias e espécies reativas de oxigênio, 

podendo determinar a morte destas células e danos no tecido (CHERRY; OLSCHOWKA; 

O’BANION, 2014). O segundo aspecto se refere à possibilidade de alteração do perfil M1 das 

células da microglia para o perfil M2, visando neuroproteção. O perfil M2 apresenta um 

fenótipo anti-inflamatório envolvido na reparação e eliminação de detritos teciduais (GIUNTI 

et al., 2014).  

Como esclarecido anteriormente, células Th1 e Th17 específicas para mielina são 

fundamentais na imunopatogênese da EAE. Também é sabido que o IFN-γ produzido por 

células Th1 é um polarizador potente de macrófagos para o perfil M1. Neste contexto, se 

acredita que níveis elevados desta citocina contribuem para a polarização M1 da microglia na 

EM e na EAE. Evidências indicam a participação da microglia na desmielinização: 

localização com lesões na bainha de mielina, presença de proteína básica da mielina (MBP) 

dentro dessas células, atenuação da doença experimental em camundongos com microglia 

depletada e atenuação doença em animais tratados com inibidores de microglia (BHASIN; 

WU; TSIRKA, 2007; CHERRY; OLSCHOWKA; O’BANION, 2014; HEPPNER et al., 

2005).  

Muitos trabalhos têm sido realizados para investigar a possível participação da célula 

da microglia em processos neurodegenerativos. Uma opção bastante prática neste sentido é o 

uso de linhagens celulares de microglia tais como N9 e BV-2 (BLASI et al., 1990; 

CORRADIN et al., 1993). A linhagem BV-2 (código BCRJ 0356) foi gerada a partir de tecido 

cerebral de camundongo neonato da linhagem C57BL/6 e a imortalização destas células foi 

conseguida  por infecção com um retrovírus recombinante (v-raf/v-mic) (BLASI et al., 1990). 

Estas células são levemente aderentes, crescem tanto aderidas quanto em suspensão e são, em 

termos morfológicos, fenotípicos e funcionais semelhantes aos macrófagos. Esta linhagem 

celular tem sido considerada um substituto válido para estudos com microglia primária 



28 

(GIULIAN; BAKER, 1986). Neste sentido, Henn et al. (HENN et al., 2009) avaliaram vários 

parâmetros tais como resposta ao estímulo com LPS, através de análise proteômica e 

transcriptômica, produção de NO e resposta à presença de IFN-γ. Ficou demonstrado que esta 

linhagem celular responde de forma bastante similar a da microglia primária. Os autores 

também constataram que esta célula interage de forma apropriada com linfócitos T e 

neurônios (HENN et al., 2009).  

  Estudos envolvendo células da microglia constituem uma área em evidente expansão 

em pesquisa biomédica. Estes estudos vêm sendo realizados tanto com cultivos primários de 

microglia derivada do SNC de animais de experimentação quanto de linhagem celulares de 

microglia murina ou humana imortalizadas. A linhagem murina BV-2 é considerada um 

substituto válido para microglia primária em diferentes tipos de estudo (HENN et al., 2009) e 

por isso foi utilizada neste projeto. 

Vários protocolos experimentais tem demonstrado que a rapamicina é capaz de 

modular a microglia. Xie e colaboradores (XIE et al., 2014) injetaram este fármaco no cérebro 

de ratos 6 horas após infarto isquêmico. Este tratamento reduziu o volume da lesão, melhorou 

as deficiências comportamentais e reduziu significativamente a produção de citocinas pró-

inflamatórias por macrófagos e microglia. Utilizando este mesmo modelo de infarto 

isquêmico em camundongos, Li e colaboradores (LI; KIM; BLENIS, 2014) observaram, que 

os inibidores de mTORC1, sirolimus e everolimus, também determinaram redução no 

tamanho das lesões e queda na produção de citocinas pró-inflamatórias. Segundo os autores, 

este efeito foi devido a uma mudança no fenótipo da microglia de M1 para M2. 

 Em modelo de doença de Parkinson (JIN et al., 2018), a rapamicina induziu aumento 

da autofagia associado com polarizaçao das células da microglia para M2. Já está bem 

estabelecido que a autofagia é um mecanismo celular fundamental para manter a homeostasia 

celular. Durante este fenômeno a célula digere constituintes do seu citoplasma para 

reciclagem, para eliminação de organelas danificadas e também para eliminar patógenos 

intracelulares (GLICK; BARTH; MACLEOD, 2010). Bussi e colaboradores. (BUSSI et al., 

2017) observaram que a rapamicina inibiu a produção de citocinas e de óxido nitrico em 

células da microglia da linhagem BV-2 estimuladas com LPS através de ativação de autofagia 

nestas células. 

 

 

    



29 

Justificativa

 

 

A rapamicina possui um potente efeito imunossupressor, principalmente sobre os 

linfócitos T, mas também sobre células da resposta imune inata, incluindo macrófagos e 

microglia. Isso se deve ao seu efeito inibidor sobre o alvo mTOR que desempenha importante 

papel no metabolismo e na ativação celular. O potencial da rapamicina no tratamento de 

doenças neurodegenerativas, como a EM, se deve em parte à sua capacidade de atravessar 

facilmente a BHE, exercendo assim efeito direto sobre leucócitos residentes ou infiltrantes no 

SNC.  

Nossa hipótese de trabalho é que a rapamicina tenha efeito supressor in vitro sobre 

células esplênicas e derivadas do SNC de camundongos com EAE e também sobre linhagem 

celular da microglia. Esta possível imunossupressão ocorreria pela ação da rapamicina sobre o 

complexo mTOR, resultando no bloqueio da progressão do ciclo celular e da sinalização da 

IL-2, interferindo assim na diferenciação e ativação de células T e células da microglia.   

Considerando que a rapamicina já vem sendo testada em modelos animais e também 

em pacientes com EM e ainda a necessidade de estratégias alternativas e eficazes para estudos 

de seleção de novos fármacos, acreditamos que, se confirmada nossa hipótese, outras 

moléculas candidatas à terapia de doenças neurodegenerativas possam ser inicialmente 

rastreadas usando essa abordagem. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



30 

 

Objetivos 

 
 

Objetivo geral 

 

Investigar o efeito in vitro da rapamicina em células envolvidas na imunopatogênese 

da EAE. 

  

 Objetivos específicos 

 

I. Avaliar o efeito da rapamicina na expressão gênica dos fatores de transcrição associados 

às subpopulações de linfócitos T auxiliares (Th1/Th2/Th17/Treg) em células esplênicas 

e células do SNC de camundongos com EAE. 

II. Avaliar o efeito da rapamicina na produção de citocinas associadas às subpopulações de 

linfócitos T auxiliares (Th1/Th2/Th17/Treg) por células esplênicas e células do SNC de 

camundongos com EAE. 

III. Avaliar o efeito da rapamicina na produção de citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-10), na 

expressão gênica de moléculas envolvidas com ativação (TREM2, ARG1, iNOS e NF-

κB) e na expressão de moléculas de superfície (MHC II, CD40 e CD86) em linhagem 

celular da microglia. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



31 

 

Protocolos experimentais 

 

 

Protocolo experimental I 

 

Objetivo: avaliar o efeito da rapamicina na expressão gênica dos fatores de transcrição e na 

produção de citocinas associados às subpopulações de linfócitos T auxiliares 

(Th1/Th2/Th17/Treg) em células esplênicas e células do SNC de camundongos com EAE. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



32 

 

Protocolo experimental II 

 

Objetivo: avaliar o efeito da rapamicina na produção de citocinas, na expressão gênica de 

moléculas envolvidas com ativação e na expressão de moléculas de superfície em células da 

microglia da linhagem celular BV-2. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



33 

 

Métodos 

 
 

1. Animais  

Foram utilizadas fêmeas de camundongos C57BL/6 com 9 semanas de idade, 

provenientes da Universidade de São Paulo (USP, Ribeirão Preto, SP, Brasil) e mantidas em 

condições ambientais de esterilidade através de rack ventilada (Alesco®, Monte Mor, SP, 

Brasil) no biotério do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de 

Biociências de Botucatu (IBB-UNESP, Botucatu, SP, Brasil). Cada gaiola continha no 

máximo cinco camundongos, com ração comercial e água filtrada ad libitum, ambas 

autoclavadas. Os animais foram eutanasiados com anestésico (xilazina e quetamina) e 

perfundidos com tampão fosfato estéril antes da coleta do material biológico. Os 

experimentos foram realizados segundo os regulamentos do Comitê de Ética e Uso de 

Animais (protocolo 1118-CEUA IBB, Unesp, Botucatu, SP, Brasil). 

 

2. Indução de EAE e avaliação clínica 

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) foi induzida por imunização 

subcutânea no dorso com 100 μg de MOG35-55 (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, 

Genemed Synthesis Inc., Texas, EUA) emulsificada com de adjuvante completo de Freund 

(ACF, Sigma-Aldrich Corp., Missouri, EUA) contendo Mycobacterium tuberculosis (2 ou 4 

mg/mL). No dia da imunização e 48 horas depois, os animais foram inoculados com 200 ηg 

de toxina derivada de Bordetella pertussis (Sigma) via intraperitoneal. O escore clínico da 

doença foi avaliado diariamente até a fase aguda, no dia 16 após indução da EAE. A 

gravidade da doença foi definida seguindo a escala de escore clínico: 0- ausência de sinais 

clínicos: 1- cauda frouxa; 2- perda da tonicidade do movimento do quadril; 3- paralisia parcial 

das patas traseiras; 4- paralisia total das patas traseiras; 5- tetraplegia ou morte.  

 

3. Análise histopatológica 

Amostras de medula lombar dos animais com EAE foram coletados 16 dias após a 

indução da EAE. Este órgão foi fixado em formalina tamponada (10%) durante 24 horas, 

lavado em água corrente durante 18 horas e, em seguida, incluído em Paraplast Plus 

(McCormick). As amostras foram cortadas com 5 μm de espessura com auxílio de um 

micrótomo (Leica, RM2245). As lâminas foram coradas com Hematoxilina-Eosina (H&E) e 



34 

com Luxol Fast Blue (LFB) e três amostras de cada grupo foram analisadas em microscópio 

óptico (Olympus BX60) no aumento de 10X. As imagens foram adquiridas por meio de 

câmera digital acoplada ao microscópio. 

 

4. Cultura de células esplênicas  

Os baços dos animais com EAE foram coletados e processados assepticamente. Para 

cultura de células esplênicas, este órgão foi desagregado mecanicamente com pistilo e as 

hemácias foram lisadas com tampão contendo NH4Cl por 5 min. à temperatura ambiente. Esta 

supesão foi centrifugada e o pellet de células ressuspenso em meio RPMI-1640 (Sigma) 

contendo soro bovino fetal (10%, Gibco), L-glutamina (2 μM, Sigma) e 

antibiótico/antimicótico (0,1%, Sigma). Para a indução da produção de citocinas, as células 

totais foram distribuídas em placas de 48 poços (5x106 células/poço em 1mL), estimuladas 

com MOG (20 μg/mL) e simultaneamente tratadas com rapamicina (10 e 20 nM) e então 

incubadas em estufa à 37°C e 5% CO2 durante 48 horas. Os sobrenadantes foram coletados e 

armazenados a -20°C para posterior dosagem de citocinas e as células foram armazenadas a -

80°C para posterior análise de expressão gênica por PCR.  

 

5. Cultura de células do SNC 

Amostras de cérebro e medula espinhal (porção cervical e torácica) dos animais com 

EAE foram coletadas e processadas assepticamente. Para cultura de células, o SNC foi 

desagregado mecanicamente com pistilo e incubado com colagenase D (2,5 mg/mL, Roche) e 

10 uL de DNAse (100 ug/mL) em 4 mL de meio RPMI-1640 durante 45 minutos em estufa de 

CO2 a 37°C. Após este período as amostras foram processadas em cellstrainerse transferidas 

para tubos contendo HBSS (Hank'sBalanced Salt Solution). Os tubos foram centrifugados a 

450 x g por 7 minutos e os pellets foram então ressuspendidos em 6mL de Percoll 37% (GE 

Healthcare). Esta suspensão foi adicionada lentamente sobre 3 mL de Percoll 70% em tubos 

de 15 mL e centrifugada a 950 x g por 20 minutos à temperatura ambienteem centrífuga com 

o freio e aceleração desativados. Ao final da centrifugação, a fase superior contendo grande 

concentração de mielina foi coletada por sucção e desprezada. O anel contendo células 

mononucleares foi coletado e transferido para tubos de 15 mL aos quais se adicionou RPMI-

1640 suplementado contendo soro bovino fetal (10%, Gibco), L-glutamina (4 μM, Sigma), 

aminoácidos não essenciais (1%, Sigma), piruvato (1%, Sigma) e antibiótico/antimicótico 

(0,1%, Sigma). As células foram então centrifugadas a 450 x g a 4°C por 10 minutos. Para a 

indução da produção de citocinas, as células totais foram distribuídas em placas de 24 poços 



35 

(5x105 células/poço em 0,5 mL), estimuladas com MOG (50 μg/mL) e simultaneamente 

tratadas com rapamicina (10 e 20 nM) e então incubadas em estufa à 37°C e 5% CO2 durante 

48 horas. Os sobrenadantes foram coletados e armazenados a -20°C para posterior dosagem 

de citocinas e as células foram armazenadas a -80°C para posterior análise de expressão 

gênica por PCR. 

 

6. Cultura de linhagem celular BV-2 

Células da microglia da linhagem celular BV-2 (BCRJ, código 0356) foram cultivadas 

e expandidas em frascos de cultura contendo uma área de superfície de 25 cm2, com meio 

DMEM-High Glucose (Gibco) suplementado contendo soro bovino fetal (10%, Gibco), 

piruvato (1%, Sigma) e antibiótico/antimicótico (0,1%, Sigma). Para a indução da produção 

de citocinas, as células foram distribuídas em placas de 24 poços (5x105 células/poço em 0,5 

mL)  e incubadas por 2,5 horas para aderência em estufa à 37°C e 5% CO2. Após retirada das 

células não aderentes, as células restantes foram tratadas com rapamicina (10 e 20 nM) e 

simultaneamente estimuladas com LPS (100 ng/mL, 0111:B4, Sigma) e então incubadas em 

estufa a 37°C e 5% CO2 durante 24 horas. Os sobrenadantes foram coletados e armazenados a 

-20°C para posterior dosagem de citocinas. As células foram desaderidas utilizando cell 

scraper e preparadas para análises de citometria de fluxo ou armazenadas a -80°C para 

posterior análise de expressão gênica por PCR. Algumas células, sob as mesmas condições 

citadas acima, foram cultivadas sobre lamínulas de vidro para posterior coloração com 

Panótico Rápido (Laborclin, Pinhais, PR, Brazil), seguindo instruções do fabricante. 

 

7. Quantificação de citocinas por ELISA 

As citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-5, IL-6, IL-17, IL-10 e TGF-β, foram 

quantificadas no sobrenadante de culturas de células esplênicas e da linhagem celular BV-2 

por ensaio imunoenzimático utilizando o kit comercial para camundongos (R&D Systems) 

segundo as instruções do fabricante. Os resultados foram adquiridos em leitor BioTek® a 450 

nm no Departamento de Microbiologia e Imunologia (IBB-UNESP, Botucatu, SP, Brasil) e as 

análises foram realizadas no software GEN5 Data Analysis Software.  

 

8. Quantificação de citocinas por CBA 

A quantificação de citocinas do sobrenadante de culturas de células do SNC foi 

realizada através do método de CBA (Cytometric Beads Array), segundo as instruções do 

fabricante, utilizando kit comercial para detecção de IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL4, IL-10, IL-6 e 



36 

IL-17A (Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit – BD Biosciences). Após distribuir 50 μl das 

beads de captura nos tubos de ensaio, foram adicionados 25 ul de cada amostra e então 

incubados durante 2 horas e protegido de luz. As leituras foram realizadas no citômetro de 

fluxo FACS Canto II (BD Biosciences) no Departamento de Microbiologia e Imunologia 

(IBB-UNESP, Botucatu, SP, Brasil). 

 

9. Extração de RNA  

O RNA total das amostras do SNC foi extraído utilizando o kit RNeasy Mini 

(Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. O pellet de células do baço e células da 

microglia (linhagem BV-2) foram extraídos utilizando o reagente TRIzol™ (Life 

Technologies, Austin, TX, EUA). O RNA extraído foi ressuspenso em 20 µL de água ultra-

pura e livre de endonucleases (DEPC). As amostras de RNA foram quantificadas através do 

equipamento NanoDrop 2000 e então 200 ηg de RNA foram convertidos em cDNA utilizando 

o kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade (Life Technologies) de acordo 

com as instruções do fabricante. 

 

10. Ensaio de RT-qPCR 

A expressão de TBX21 (Mn00450960_m1), RORc (Mm01261022_m1), GATA3 

(Mm00484683_m1), FoxP3 (Mm00475162_m1), ARG1 (Mm00475988_m1), 

TREM2(Mm00451744_m1), iNOS (Mm00440502_m1), e NF-ҝB (Mm00482418_m1) foi 

analisada em comparação com os níveis de GAPDH (Mm99999915_m1). Os níveis de 

GAPDH (house keeping gene) não foram alterados pelos tratamentos ou estímulos (figura 

suplementar 1). As reações de PCR em tempo real foram realizadas usando os Ensaios de 

Expressão Gênica TaqMan™ de acordo com as recomendações do fabricante 

(AppliedBiosystems, Carlsbad, CA, EUA). Os níveis de expressão gênica foram 

representados como diferença de expressão relativa usando o método 2−ΔΔCt (LIVAK; 

SCHMITTGEN, 2001). 

 



37 

 

Figura suplementar 1. Efeito da rapamicina na expressão de GAPDH. Células totais do 

baço (5 x106 células/poço) e do SNC (5 x105 células/poço) de camundongos C57BL/6 com 

EAE foram estimuladas in vitro com MOG (20 e 50 ug/mL) e simultaneamente tratadas com 

rapamicina (10 e 20 nM) e incubadas por 48 horas. Células da alinhagem microglial BV-2 

foram estimuladas in vitro com LPS (100 ng/mL) e simultaneamente tratadas com rapamicina 

(10 e 20 nM) e incubadas por 24 horas. Após o período de cultura, as células foram utilizadas 

para avaliar a expressão do mRNA do gene endógeno GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate 

Dehydrogenase). Dados expressos em média ± erro padrão da média, n=8, somatório de 3 

experimentos independentes. ANOVA com pós teste de Tukey, letras diferentes representam 

diferença entre os grupos, p<0,05. 

 

11. Atividade celular 

O MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) é um sal 

solúvel em água que reage com as desidrogenases mitocondriais presentes apenas em células 

metabolicamente ativas resultando na produção de cristais de formazana de cor roxa, 

insolúveis em água. Esse sal é, portanto, utilizado para verificar a metabolismo mitocondrial e 

consequentemente a atividade metabólica celular (RAI et al., 2018). A tividade metabólica da 

linhagem BV-2 foi averiguada após 24 horas de cultura. O sobrenadante foi desprezado e as 

células ressuspensas em RPMI-1640 contendo MTT (5 mg/mL). A placa foi então incubada 

por 2 horas em estufa a 37°C em 5% CO2 e, após este período, centrifugada por 5 

minutos/1500 rpm. O sobrenadante foi retirado e as células ressuspensas em 100 uL de 

Dimetilsulfóxido (DMSO). Após 5 minutos os resultados foram adquiridos em leitor BioTek® 

a 540 nm no Departamento de Microbiologia e Imunologia (IBB-UNESP, Botucatu, SP, 

Brasil). O índice de atividade metabólica foi calculado de acordo com a equação: DO da 

cultura teste / DO da cultura controle. 

 

 



38 

12. Imunofenotipagem celular por citometria de fluxo 

As células da linhagem BV-2 foram incubadas com os seguintes anticorpos marcados 

com fluorocromos (eBioscience): anti-CD11b-PerCP (M1/70), anti-MHC II-APC 

(M5/114.15.2), anti-CD40-FITC (1C10) e anti-CD86-PE (GL1). Após incubação por 30 min 

a 4°C, as células foram lavadas com tampão AutoMacsRunning Buffer (MiltenyiBiotec) e 

ressuspendidas no mesmo tampão. As amostras foram fixadas em paraformaldeído a 1% e as 

leituras foram feitas utilizando-se o citômetro de fluxo FACS Canto II (BD Biosciences) do 

Instituto de Biociências (UNESP, Botucatu, SP) com o software FACS Diva, e os dados 

foram analisadas com o software FlowJo (TreeStar). 

 

13. Análise estatística 

Inicialmente, todas as amostras foram testadas quanto à normalidade. No caso das 

variáveis paramétricas, os valores obtidos foram apresentados em média e erro padrão da 

média (SEM); a comparação entre dois grupos foi realizada por teste t não pareado e entre 

mais de 3 grupos foi realizada por ANOVA seguida de teste de Tukey. O nível de 

significância adotado foi de 5% e os dados foram analisados pelo pacote estatístico SigmaPlot 

for Windows version 2.0 (1995, Jandel Corporation, Califórnia, EUA). Os gráficos foram 

feitos utilizando o programa Graph Pad Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, 

California, United States). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



39 

Resultados 

 
 
1. Características clínicas e histopatológicas dos animais com EAE 

Conforme esperado, as fêmeas de camundongos C57BL/6 imunizadas com MOG 

desenvolveram os sinais clínicos da encefalomielite autoimune experimental (EAE), 

caracterizados por paralisia (figura 1A) e perda de peso corpóreo (figura 1B). Animais que 

atingiram, pelo menos, o escore dois foram utilizados no estudo. Como mostrado na figura 

1C, observamos infiltrado inflamatório co-localizado com áreas de desmielinização 

principalmente na substância branca da medula lombar. 

 
Figura 1. Características clínicas e histopatológicas dos animais com encefalomielite 

autoimune experimental utilizados nos experimentos. C57BL/6 fêmeas foram imunizadas 

com MOG via subcutânea no dorso e inoculadas com toxina pertussis. O escore clínico (A) 

foi observado diariamente durante 16 dias. A perda de peso (B) foi calculada através do 

percentual de diferença entre o peso final (dia 16) e o peso inicial (0). O processo inflamatório  

(hematoxilina-eosina - H&E) e a desmielinização (luxol fast blue – LFB) na medula lombar 

(C) foram avaliados em animais controles (CTL) e animais com EAE (escores 2 e 4) em 

microscópio ótico comum no aumento de 10X e encontram-se em destque na figura. ANOVA 

com pós teste de Tukey, p<0,05, n=4/grupo experimental. 



40 

 2. A rapamicina reduz a produção de IL-17 por células esplênicas de animais com EAE 

Acredita-se que a resposta imune periférica seja um evento importante na 

imunopatogênese da EM. Por isto avaliamos, inicialmente, o efeito in vitro da rapamicina 

sobre células esplênicas. As células esplênicas totais foram estimuladas in vitro com MOG na 

presença de rapamicina e cultivadas por 48 horas. Após este período, avaliamos a expressão 

relativa de fatores de transcrição e a produção de citocinas consideradas assinaturas de 

subpopulações de linfócitos T. A presença de 10 e 20 nΜ de rapamicina não afetou a 

expressão de TBX21 (figura 2A), RORc (figura 2B), GATA3 (figura 2C) e FoxP3 (figura 

2D).  

Em relação à produção de citocinas, o tratamento com rapamicina diminuiu de forma 

significativa a produção de IL-17 (figura 2F). Os níveis de IFN-γ, IL-5, IL-2, TNF-α e IL-6 

(figura 2E,G-J) foram discretamente diminuídos na presença de rapamicina. 

 

3. A rapamicina diminui a produção de citocinas encefalitogênicas  

Avaliamos a seguir o efeito da rapamicina em células mononucleares eluídas do SNC 

de camundongos com EAE. De maneira similar ao baço, as células do SNC foram 

estimuladas in vitro com MOG na presença de rapamicina e cultivadas por 48 horas. Após 

este período, avaliamos a expressão relativa de fatores de transcrição e a produção de 

citocinas consideradas assinaturas das principais subpopulações de linfócitos T. Como pode 

se observar na figura 3, não ocorreu redução na expressão de TBX21 (figura 3A) e FoxP3 

(figura 3C). No entanto, o tratamento com rapamicina determinou redução significativa na 

expressão de RORc (figura 3B). O cálculo da relação entre a expressão de FoxP3 e RORc 

permite visualizar uma proporção maior de Tregs em comparação com as células Th17 (figura 

3D).  

Em relação à produção de citocinas a rapamicina diminuiu significativamente a 

produção de IFN-γ (figura 3E), IL-17 (figura 3F), IL-10 (figura 3H) e TNF-α (figura 3I). A 

presença de rapamicina não afetou significativamente a produção de IL-2 (figura 3G), IL-6 

(figura 3J) e TGF-β (figura 3K). 

 
 
 
 
 
 
 
 



41 

 

Figura 2. Efeito da rapamicina na expressão de fatores de transcrição e na produção de 

citocinas por células esplênicas. Células totais do baço de camundongos C57BL/6 com EAE 

foram estimuladas in vitro com MOG (20 ug/mL) e simultaneamente tratadas com rapamicina 

(10 e 20 nM). Após 48 horas de cultura (5 x106 células/poço) as células foram utilizadas para 

avaliar a expressão dos fatores de transcrição TBX21 (A), RORc (B), GATA3 (C) e FOXP3 

(D) e o sobrenadante foi utilizado para quantificação das citocinas IFN-γ (E), IL-17 (F), IL-

5(G), IL-2 (H), TNF-α (I), IL-6 (J) IL-10 (K) e TGF-β (L). Dados expressos em média ± erro 

padrão da média, n=8, somatório de 3 experimentos independentes. ANOVA com pós teste de 

Tukey, sem tratamento vs rapamicina 10 nM vs rapamicina 20 nM, p<0,05. 

 



42 

 
Figura 3. Efeito da rapamicina na expressão de fatores de transcrição e na produção de 

citocinas por células do SNC. Células totais do SNC de camundongos C57BL/6 com EAE 

foram estimuladas in vitro com MOG (50 ug/mL) e simultaneamente tratadas com rapamicina 

(10 e 20 nM). Após 48 horas de cultura (5 x105 células/poço) as células foram utilizadas para 

avaliar a expressão dos fatores de transcrição TBX21 (A), RORc (B) e FOXP3 (C) e o 

sobrenadante foi utilizado para quantificação das citocinas IFN-γ (E), IL-17 (F), IL-2 (G), IL-

10 (H),TNF-α (I), IL-6 (J) e TGF-β (K). A razão (D) entre células reguladoras (TREG) e 

células efetoras (Th17) foi calculada utilizando os valores de expressão dos genes FOXP3 e 

RORc, respectivamente. Dados expressos em média ± erro padrão da média, n=8, somatório 

de 3 experimentos independentes. ANOVA com pós teste de Tukey, sem tratamento vs 

rapamicina 10 nM vs rapamicina 20 nM, p<0,05. 

 



43 

4. A rapamicina induz um perfil M2 em células da microglia 

Como a microglia é uma das populações de células do sistema imune residentes no 

SNC e que participa ativamente da EAE, testamos o efeito da rapamicina em células BV-2, 

uma linhagem microglial de origem murina. 

Inicialmente investigamos o efeito da rapamicina na atividade metabólica, como 

indicado na figura 4A. O ensaio do MTT mostrou que o tratamento com rapamicina (10 e 20 

nΜ) não afetou a atividade metabólica destas células. No entanto, a estimulação com LPS, 

utilizado como controle positivo de ativação da microglia, reduziu significativamente a 

atividade mitocondrial destas células, mesmo na presença de rapamicina. O tratamento com 

rapamicina restaurou, pelo menos em parte, as projeções citoplasmáticas inicialmente 

reduzidas devido à estimulação com LPS (figurta 4B).  

Em relação à produção de citocinas, como esperado, o estímulo com LPS determinou 

aumento significativo das três citocinas avaliadas: TNF-α, IL-6 e IL-10. O tratamento com 

rapamicina determinou queda significativa na produção de TNF-α (figura 4C) e IL-6 (figura 

4D) e diminuição discreta na produção de IL-10 (figura 4E). 

Avaliamos a seguir o efeito da rapamicina na polarização da microglia através da 

expressão de genes relacionados ao perfil M2 (TREM2 e ARG1) e de genes relacionados ao 

perfil M1 (iNOS, NF-kB). O tratamento com rapamicina induziu expressão significativamente 

maior de TREM2 (figura 5A) e expressão reduzida, apesar de não significativa, de ARG1, 

iNOS e NF-kB (figura 4B-D). Também foi avaliada a intensidade média de fluorescência 

(MFI) das moléculas de superfície MHC II, CD40 e CD86 (figura 5E). Como esperado e 

mostrado na figura 5 (F-H), o estímulo com LPS determinou aumento significativo nos níveis 

de expressão destas três moléculas. A adição de rapamicina nas culturas estimuladas com LPS 

determinou redução significativa na expressão das mesmas. 

 

 



44 

 
 

Figura 4. Efeito da rapamicina na atividade metabólica e na produção de citocinas por 

células da microglia. Cultura de células da linhagem BV-2 foi estimulada in vitro com LPS 

(100 ng/mL) na presença de rapamicina (10 e 20 nM). Após 24 horas de cultura (5x105 

células/poço) foi avaliada a atividade mitocondrial pelo ensaio do MTT (A) e a morfologia 

pela coloração com Panótico (B) e foi realizada a dosagem de citocinas no sobrenadante: 

TNF-α (D), IL-6 (E) e IL-10 (F). Dados expressos em média ± erro padrão da média, n=8, 

representativo de 3 experimentos independentes. Teste t, sem estímulo vs com estímulo, 

*representa p<0,05; ANOVA com pós teste de Tukey, sem tratamento vs rapamicina 10nM vs 

rapamicina 20 nM, letras diferentes representam p<0,05. 

 

 



45 

 
 

Figura 5. Efeito da rapamicina na polarização da microglia. Culturas de células da 

linhagem BV-2 foram estimuladas in vitro com LPS (100 ng/mL) na presença de rapamicina 

(10 e 20 nM). Após 24 horas de cultura (5x105 células/poço), as células foram utilizadas para 

avaliar a expressão de mRNA para: TREM2 (A), ARG1 (B), iNOS(C) e NF-κB (D), e 

imunofenotipadas por citometria de fluxo. Foram adquiridos 50 mil eventos e as células foram 

analisadas quanto à intensidade média de fluorescência (E) de MHC II (F), CD40 (G) e CD86 

(H). Dados expressos em média ± erro padrão da média, n=5-6, representativo de 2 

experimentos independentes. Teste t, sem estímulo vs com estímulo, *representa p<0,05; 

ANOVA com pós teste de Tukey, sem tratamento vs rapamicina 10 nM vs rapamicina 20 nM, 

letras diferentes representam p<0,05 

 

 

 



46 

Discussão 

 
 

A rapamicina foi inicialmente descoberta como um metabólito antifúngico produzido 

por Streptomyces hygroscopicus (LI; KIM; BLENIS, 2014). Entretanto posteriormente ficou 

demonstrado que também era dotada de atividade antiproliferativa e imunossupressora e, por 

isso, foi sugerida para o tratamento de pacientes transplantados para evitar rejeição (VÉZINA; 

KUDELSKI; SEHGAL, 1975) e de pacientes com determinadas neoplasias 

(MUKHOPADHYAY et al., 2016). Recentemente, tem sido sugerida a utilização da 

rapamicina para tratamento de doenças degenerativas, como Alzheimer, Parkinson, 

Huntington e atrofia espinocerebelar dominante (ASO; FERRER, 2013). 

Uns poucos trabalhos têm indicado que a rapamicina é capaz de controlar o 

desenvolvimento da encefalomielite autoimune experimental (EAE) em camundongos SJL 

(ESPOSITO et al., 2010) e C57BL/6  (HOU et al., 2017) e que podemos, portanto, considerá-

la na terapia da esclerose múltipla (EM). Em apenas um estudo publicado foi testada a 

eficácia da rapamicina em pacientes com EM. Após 6 meses de tratamento com este 

medicamento, Bagherpour e colaboradores (BAGHERPOUR et al., 2018) observaram 

redução do tamanho das placas e aumento da expressão do FOXP3 nestes pacientes. Nesse 

contexto, o principal objetivo desta investigação foi caracterizar o potencial imunomodulador 

da rapamicina em células derivadas de um órgão linfoide secundário e também do sistema 

nervoso central (SNC). A linhagem de células da microglia, BV-2 foi usada para ensaios 

adicionais.  

 As células empregadas para testar o potencial imunomodulador da rapamicina foram 

retiradas de camundongos C57BL/6 com EAE, que desenvolveram uma patologia típica 

identificada pelo aparecimento de escores clínicos, pela perda de peso corporal e infiltração 

inflamatória e desmielinização no SNC. Foram realizados três experimentos independentes, 

sendo que as células foram obtidas na fase aguda da EAE, ou seja, 16 dias após indução da 

doença. Apesar de algumas diferenças, nos três experimentos o escore clínico mínimo 

atingido pelos animais foi 2 e apenas no experimento 2 os animais atingiram o escore clínico 

4.  

 Utilizamos neste trabalho duas concentrações de rapamicina, 10 e 20 nΜ. Zheng e 

colaboradores (ZHENG; DING; JAHAN, 2014) mostraram que concentrações de rapamicina 

de 0, 1, 5, 10 e 20 nΜ apresentavam baixa toxicidade em culturas de células endoteliais de 

hemangioma de camundongo. Fletcher e colaboradores (FLETCHER et al., 2013) utilizando 



47 

10 e 20 nΜ de rapamicina relataram que o tratamento in vitro com rapamicina em modelo 

com acidente vascular encefálico (AVC), melhorou a viabilidade dos neurônios. O trabalho de 

Zhong e colaboradores (ZHONG et al., 2012), utilizando a dose de 10 nΜ de rapamicina na 

linhagem microglial BV-2, demonstrou que esta concentração de rapamicina não alterou a 

viabilidade destas celulas. 

Inicialmente testamos e comparamos o efeito da adição de rapamicina em células 

esplênicas e em células derivadas do SNC, no que diz respeito à expressão dos fatores de 

transcrição das principais subpopulações de células T e à produção de citocinas. Este 

procedimento pretendia reproduzir o possível efeito in vivo da rapamicina tanto nas células 

reativas que ainda estavam no órgão linfoide secundário como também nas células reativas 

que já atingiram o SNC. Para tanto, adicionamos o estímulo específico peptídeo da 

glicoproteína da mielina de oligodendrócitos (MOG) e o imunossupressor (rapamicina) 

concomitantemente.  

Contrariamente à nossa expectativa, o fator de transcrição TBX21, que propicia a 

produção da citocina inflamatória IFN-γ e a diferenciação de células Th1 (SZABO et al., 

2000), não foi afetado pela rapamicina nem no baço nem nas células do SNC. Já em relação 

ao RORc, que é o fator de transcrição assinatura de células Th17 (CASTRO et al., 2017), 

constatamos que a rapamicina determinou modulação evidente em células do SNC mas não 

do baço. Este achado foi considerado altamente relevante porque as células Th17 

desempenham um papel patogênico reconhecido em ambas, EAE e EM (MCGINLEY et al., 

2018). Os resultados do tratamento experimental da encefalomielite com rapamicina 

sustentam este achado mostrando que este fármaco suprimiu a via de sinalização mTOR - 

STAT3 que é importante para a resposta Th17 (HOU et al., 2017). 

O fato da rapamicina ter modulado o RORc no SNC mas não no baço, pode estar 

associado à cinética de migração das células durante o desenvolvimento da EAE, com maior 

acúmulo de células Th17 no SNC. O trabalho realizado por (MURPHY et al., 2010), 

descreveu a cinética de células T CD4+ secretoras de IFN-γ, de IL-17 ou de ambas as 

citocinas. No 14º dia após indução da EAE, os autores observaram maior percentual de 

células T CD4+ que secretam IFN-γ, mas não IL-17 (células Th1), no baço. Em contraste com 

a periferia, em amostras de cérebro os autores observaram maior percentual de células T 

CD4+ que secretam IL-17 (células Th17), IFN-γ (células Th1) ou ambas as citocinas (células 

Th1/Th17). Já em amostras de medula espinhal, a cinética é similar ao baço, com maior 

percentual de células T CD4+ que secretam IFN-γ, mas não IL-17 (células Th1).  

O fator de transcrição Foxp3 é considerado crucial para a diferenciação de células T 



48 

reguladoras (LI et al., 2015). Está bem estabelecido que a capacidade da rapamicina em 

controlar o desenvolvimento de EAE se deve, pelo menos em parte, à expansão dessas células 

(ESPOSITO et al., 2010). No entanto, não encontramos aumento significativo na expressão 

do RNA mensageiro de Foxp3 em culturas de baço e de SNC. Este resultado foi atribuído à 

exigência de condições muito rigorosas para a expansão de Treg, que incluí níveis elevados 

de IL-2 (BATTAGLIA; STABILINI; RONCAROLO, 2005), como também requer longos 

períodos de incubação, populações de células purificadas e estímulos definidos como 

CD3/CD28 (HE et al., 2017). 

A comparação entre a produção de citocinas em culturas de baço e em culturas do 

SNC indicou que as células derivadas do SNC eram mais fortemente moduladas pela 

rapamicina. Esse achado assemelha-se ao supracitado e relacionado aos fatores de transcrição. 

Portanto, é possível que a atividade da rapamicina dependa da origem celular, estado de 

ativação e talvez da quantidade de células específicas que estão sendo testadas. Neste sentido, 

tem fundamento acreditar que a proporção de células específicas para MOG no SNC de 

camundongos com EAE é muito maior do que no baço desses animais.  

Considerando que a estimulação específica do TCR é um dos principais eventos que 

desencadeia a ativação do mTOR (HAMILTON et al., 2014; WAICKMAN; POWELL, 

2012), podemos inferir que as células ativadas seriam os principais alvos desse fármaco. 

Além disso, resultados preliminares, não apresentados nesta dissertação, mostraram uma 

modulação significativa da rapamicina sobre células esplênicas oriundas de animais normais 

estimuladas com a concanavalina A (ConA), que é um ativador policlonal. Sendo assim, a 

capacidade imunomoduladoras da rapamicina é provavelmente afetada pelo ambiente 

inflamatório, o que condiz com nossos achados.  

No que diz respeito à produção de citocinas pelas células eluídas do SNC, a adição de 

rapamicina reduziu significativamente a produção de IFN-γ, IL-17 e TNF-α, enquanto a 

produção de IL-10, IL-6, IL-2 e TGF-β foi levemente reduzida. Este é um assunto complexo, 

mas, à luz da literatura, essa inibição pode ser atribuída a diferentes mecanismos como 

redução na apresentação de antígenos (THOMSON; TURNQUIST; RAIMONDI, 2009) e/ou 

regulação negativa dos fatores de transcrição de células T diretamente ou através do bloqueio 

do ciclo celular de T dependente de IL-2 (GONZALEZ MURCIA et al., 2013). Neste 

contexto, a inibição da IL-17 pode ser atribuída à inibição da expressão de RORc. Por outro 

lado, a produção de IFN-γ e TNF-α não parece estar relacionada à inibição de TBX21, 

estando possivelmente associado a outros mecanismos. 

Considerando a literatura que associa a sensibilidade de mTORC1 e mTORC2 à 



49 

concentrações distintas de rapamicina  (TOSCHI et al., 2009)  e o fato do mTORC1 promover 

diferenciação Th1 e Th17 enquanto o mTORC2 medeia a polarização Th2 (DELGOFFE et 

al., 2011), acreditamos que o protocolo adotado neste trabalho favoreceu a via metabólica 

associada ao mTORC1. 

A metodologia utilizada para isolamento de leucócitos do SNC possibilita a retirada de 

células mononucleares residentes (neurônios, astrócitos, oligodendrócitos, microglia), que não 

expressam ou apresentam baixa expressão de CD45, e células mononucleares infiltrantes 

(leucócitos), que apresentam elevada expressão de CD45 (PINO; CARDONA, 2011). Dentro 

da população CD45+, que incluí todos os leucócitos infiltrantes, está também a microglia, 

uma célula da resposta imune inata residente do SNC. Associando a molécula CD11b, um 

receptor de complemento 3 que é expresso em fagócitos, é possível distinguir a população de 

microglia (CD45LowCD11b+) e macrófagos infiltrantes (CD45HighCD11b+) dos demais 

leucócitos presentes no SNC (MURPHY et al., 2010).  Considerando que nossas culturas 

foram realizadas com células mononucleares totais, é possível que a rapamicina esteja 

afetando diretamente células da resposta imune inata, incluindo a microglia, o que poderia 

explicar a baixa produção de TNF-α sem a modulação de células Th1.  

Como a microglia desempenha um papel fundamental nos distúrbios neurológicos, 

sendo capaz de promover tanto a progressão da doença quanto a homeostase do SNC (DU et 

al., 2017; SZEPESI et al., 2018), dependendo de seu perfil de ativação, testamos sua 

suscetibilidade à imunomodulação pela rapamicina. Também consideramos o fato de que 

evidências experimentais indicam o envolvimento do mTOR na ativação pró-inflamatória da 

microglia (DELLO RUSSO et al., 2009). Sendo assim, na etapa final deste projeto 

investigamos o efeito da rapamicina em uma linhagem microglial conhecida como BV-2. Esta 

linhagem é considerada um substituto válido para realizar diferentes investigações no sentido 

de subsidiar os resultados encontrados em culturas primárias (HENN et al., 2009).  

Iniciamos esta etapa analisando a atividade metabólica de células BV-2 após 24 horas 

de contato com rapamicina. As duas concentrações testadas não determinaram efeito 

citotóxico sobre as células quando adicionadas sozinhas. No entanto, a adição do LPS alterou 

a ativiade metabólica destas células e a rapamicina não reverteu este processo. Outro achado 

interessante é a diminuição de projeções citoplasmáticas observadas nas culturas estimuladas 

com LPS. Ao serem estimuladas, seja por estímulos patológicos ou fisiológicos, a microglia 

ativada perde as longas extensões típicas da fase de repouso e passa a apresentar extensões 

ameboides e começa a produzir uma série de fatores que são estímulo-dependentes (LUO; 

CHEN, 2012). Este achado foi o primeiro indício de que a rapamicina poderia modular a 



50 

microglia.  

Para avaliar a ativação da microglia, analisamos também a produção de citocinas em 

sobrenadante de cultura. Similarmente a outros relatos da literatura, a adição de rapamicina 

nas células BV-2 estimuladas com LPS reduziu a produção de citocinas pró-inflamatórias  

(HAN et al., 2013; YE et al., 2017). Essa inibição tem sido associada à ativação da autofagia 

(BUSSI et al., 2017; YE et al., 2017) e isso é relevante porque a perda da função autofágica 

no SNC tem sido associada com doenças neurodegenerativas (PLAZA-ZABALA; SIERRA-

TORRE; SIERRA, 2017). Para concluir esta investigação, testamos se a rapamicina seria 

capaz de reprogramar a microglia com um fenótipo M1 para um fenótipo M2. A definição de 

vários estados de ativação dos macrófagos está bem estabelecida pela literatura. Comparando 

com macrófagos periféricos, a microglia tem características semelhantes mas também únicas 

no que diz respeito à polarização de fenótipos. O interesse em compreender a modulação e 

polarização de fenótipos da microglia reside no fato de ser esta uma alternativa terapêutica 

com potencial para o tratamento de doenças neurodegenerativas que afetam milhares de 

pessoas no mundo inteiro (CHERRY; OLSCHOWKA; O’BANION, 2014). 

 Historicamente, classifica-se a resposta (ativação) sofrida por essas células em clássica 

e alternativa. A ativação clássica (M1) corresponde ao fenótipo pró-inflamatório/tóxico, 

caracterizada pela liberação de iNOS (induciblenitric oxide synthase), citocinas inflamatórias 

como TNF-α e IL-1β e radicais livres (MI et al., 2018). Por outro lado, o fenótipo anti-

inflamatório/protetor é voltado para a reparação tecidual, é representado pela ativação 

alternativa (M2), na qual há aumento de expressão de ARG-1 (arginase 1), produção de 

citocinas anti-inflamatórias e expressão de alguns receptores, como por exemplo o TREM2 

(Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2). TREM2 é um receptor que pertence à 

família TREM expresso em macrófagos ativados, células dendríticas imaturas, osteoclastos e 

principalmente na microglia, fazendo parte da resposta imune inata (COLONNA, 2003; 

FORD; MCVICAR, 2009). Este desempenha algumas funções importantes na vigilância 

imunológica, incluindo interações célula-célula e retirada de detritos teciduais 

(TAKAHASHI; ROCHFORD; NEUMANN, 2005). 

No presente estudo, observamos uma modulação negativa da expressão de mRNA 

iNOS e uma regulação positiva de mRNA TREM2. Essas alterações têm sido 

consistentemente associadas a uma polarização da microglia para um fenótipo M2, promovida 

pela expressão de TREM2, um fator importante na troca dos fenótipos da microglia (JIANG 

et al., 2016; MACHADO-PEREIRA et al., 2017; ZHENG et al., 2018). Estes marcadores de 

ativação microglial são úteis em estudos principalmente em doenças neurodegenerativas nas 



51 

quais fica evidenciada a ativação dessas células (FRANK-CANNON et al., 2009). 

O efeito da rapamicina sobre as células da microglia foi ainda mais acentuado em 

relação à expressão de moléculas envolvidas na apresentação de antígenos (MHCII, CD40 e 

CD86). Observamos uma diminuição significativa destes marcadores, o que aponta 

claramente para a capacidade da rapamicina de diminuir o potencial dessas células em 

apresentar antígenos no SNC. Além da apresentação de antígenos, as interações entre CD40-

CD40L foram relatadas como importantes na patogênese da EAE (CHITNIS; KHOURY, 

2003), sendo que a não expressão de CD40 ou CD40L pode bloquear o desenvolvimento da 

doença (CHITNIS; KHOURY, 2003). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



52 

Considerações finais 
 

 

Nesta investigação demonstramos que a rapamicina pode atuar in vitro tanto na 

periferia quanto no SNC e que este fármaco interfere em vários níveis incluindo a síntese e 

expressão de fatores de transcrição e também a expressão de moléculas envolvidas nos 

processos de ativação de linfócitos T. Em resumo, ilustrado na figura abaixo, estes resultados 

indicam que o potencial imunomodulador da rapamicina foi, em muitos aspectos, confirmado 

pela utilização de ensaios ex vivo e in vitro com células derivadas de camundongos com EAE 

e com linhagem microglial (BV-2), respectivamente.   

Portanto, propomos que outras moléculas candidatas à terapia de EM sejam 

inicialmente rastreadas usando essa abordagem. Esta alternativa experimental não tem sido 

explorada de forma evidente mas constitui, em nossa opinião, uma possibilidade que oferece 

algumas vantagens. Neste sentido ressaltamos o uso de um número significativamente menor 

de animais e o barateamento da investigação uma vez que, no caso especial da EAE, a 

indução da doença é bastante dispendiosa.  

 

 

 
 

 

 

 



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