UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista Caracterização e avaliação da atividade antimicrobiana de nanomateriais engenheirados com propriedade anti-incrustante sobre microrganismos isolados de ambiente marinho VITHÓRIA CAROLYNA TRINDADE DOS SANTOS SÃO VICENTE - SP 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CÂMPUS DO LITORAL PAULISTA Caracterização e avaliação da atividade antimicrobiana de nanomateriais engenheirados com propriedade anti-incrustante sobre microrganismos isolados de ambiente marinho VITHÓRIA CAROLYNA TRINDADE DOS SANTOS ORIENTADORA: CRISTIANE ANGÉLICA OTTONI CO-ORIENTADOR: DENIS MOLEDO DE SOUZA ABESSA CO-ORIENTADOR: ROBERTO CARLOS DOMINGOS MARTINS Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus do Litoral Paulista, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade de Ambientes Costeiros. SÃO VICENTE - SP 2021 Santos, Vithória Carolyna Trindade dos S237c Caracterização e avaliação da atividade antimicrobiana de nanomateriais engenheirados com propriedade anti-incrustante sobre microrganismos isolados de ambiente marinho / Vithória Carolyna Trindade dos Santos. -- São Vicente, 2021 73 p.: il., tabs., mapas Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, São Vicente Orientadora: Cristiane Angélica Ottoni Coorientador: Denis Moledo de Souza Abessa Coorientador: Roberto Carlos Domingos Martins 1. Nano-anti-incrustante. 2. DCOIT. 3. Bacillus subtillis. 4. Aspergillus niger. 5. Chlorella minutissima. I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Biblioteca e Documentação UNESP – Instituto de Biociências / Campus do Litoral Paulista Dados fornecidos pelo autor A Deus e à minha família, pelo amor, apoio e compreensão. AGRADECIMENTOS A Deus, pela minha vida, e por me permitir nunca desistir dos meus sonhos. A Profa. Dra. Cristiane Angélica Ottoni, pela orientação, amizade e a dedicação com que conduziu a minha formação. Aos meus coorientadores, Prof. Dr. Denis Abessa e Dr. Roberto Martins por me ensinar, auxiliar e acreditar em meu potencial. Aos Profs. Drs. do Instituto de Biociências que conduziram direta ou indiretamente na minha formação. A Flávia Saldanha por todo o ensinamento, auxílio e confiança. A Roberta Merquizo por todo o ensinamento, apoio e risadas. A todas colegas do laboratório Micobio-Nanotec, em especial a Cláudia Aquaroli, pelos momentos felizes e tristes compartilhados e por todo o auxílio. Á CAPES pelo incentivo financeiro para a execução desse trabalho. Ao programa de Pós-Graduação em Biodiversidade de Ambientes Costeiros (PPG- BAC) pela oportunidade da formação acadêmica Ao Instituto de Biociências do Câmpus do Litoral Paulista (IB-CLP) da Universidade Estadual Paulista ―Júlio de Mesquita Filho, Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo, Instituto de Estudos Avançados do Mar (IEAMAR) e Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT), pelo espaço e equipamentos cedidos. A Ana Paula, pelo amor, educação e confiança. Ao Márcio dos Santos, por todo incentivo, amor e confiança. Aos meus irmãos, Lucas, Livia e Maria Valentina pelo amor, carinho e momentos de felicidade. A Sonia Maria pela inspiração pelo conhecimento, amor e sempre acreditar nos meus sonhos. A toda a família Trindade e dos Santos pelo amor e apoio, em especial Waldeli Trindade e Josefa dos Santos pelo amor e carinho. Ao Tiago Zaminelli, por todo o apoio e amizade. Ao Guilherme Rodrigues companheiro da minha vida e companheiro de laboratório. Por acreditar nos meus sonhos mais que eu mesma. Pelo amor, paciência, companheirismo e dedicação. A família Borges, pelo carinho, amor e por me considerar parte da família. A Mili, Maia e Spike, por todo amor e carinho durante todos esses anos. A Prof. Dra. Cristiane Ottoni e ao Guilherme Rodrigues um agradecimento especial, pelo carinho, paciência e por não medirem esforços para realizar meu sonho. “Work gives you meaning and purpose and life is empty without it.” (Stephen Hawking) RESUMO A bioincrustação marinha (BI) é um processo natural de extrema importância para a biodiversidade, onde ocorre o crescimento sucessivo de organismos em uma superfície submersa. No entanto, quando ocorre em estruturas construídas pelo homem, causam diversos problemas socioeconômicos e ambientais. A principal solução para a BI consiste na aplicação de tintas que contêm biocidas anti-incrustantes (BANIN) que impedem a adesão e crescimento destes organismos a uma superfície. Devido às leis ambientais cada vez mais restritivas, as empresas da área têm se dedicado no desenvolvimento de formulações que sejam menos nocivas ao meio ambiente. O objetivo do trabalho foi caracterizar nanomateriais (NM) com propriedades anti-incrustantes e determinar a sua toxicidade em microrganismos isolados da zona costeira brasileira. Os NM constituídos pelo biocida orgânico 4,5-dicloro-2-noctil-4-isotiazolin3-ona (DCOIT), encapsulado em nanocontentores mesoporosos de sílica (SiNC) e revestidos pela prata (Ag), foram caracterizados por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), Espectroscopia de energia dispersiva (Energy Dispersive Spectroscopy - EDS ou EDX), Espalhamento de luz dinâmico (Dynamic Light Scattering - DLS), Potencial Zeta (Pζ) e Índice de polidispersão (Polydispersion Index - PDI). A toxicidade dos NM foi determinada a partir da Concentração mínima inibitória (CIM) e Concentração Mínima Biocida (CBM) em bactérias (Bacillus subtillis, Vibrio aestuarianus, V. parahaemolyticus), fungos (Penicillium citrinum IB-CLP11, P. sclerotigenum IB-CLP17, Aspergillus niger IB- CLP20 e P. polonicum IB-CLP22) e microalga (Chlorella minutíssima BMAK26a). Os NM apresentaram estabilidade e monodispersão de tamanhos como verificado pelas análises de DLS, PDI e Pζ. As micrografias obtidas por MET revelaram a forma esférica com diâmetros de 112, 136, 139 e 133 nm para SiNC, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC- DCOIT-Ag, respectivamente e a análise de EDS confirmou a presença dos elementos presentes nas amostras. O ensaio antimicrobiano em bactérias e fungos mostrou que SiNC apresentou ação antimicrobiana apenas para B. subtillis (CIM = 10 mg·L-1). DCOIT foi tóxico para todas as espécies de bactérias e fungos (CIM = 1 mg·L-1; CBM ≤ 10 mg·L- 1) e Ag sendo o que apresentou maior toxicidade (CBM ≤ 1 mg·L-1). SiNC-DCOIT, SiNC- Ag e SiNC-DCOIT-Ag apresentaram ação antimicrobiana para todas as espécies de bactérias e fungos (CIM = 1 mg·L-1 e CBM ≤ 10 mg·L-1). O ensaio de densidade celular em C. minutissima apresentou menor toxicidade para SiNC (EC50 = 2,24 mg·L-1), SiNC- DCOIT (EC50 = 0,625 mg·L-1), SiNC-Ag (EC50 = 0,584 mg·L-1), quando comparados aos valores estimados para DCOIT (EC50 = 0,040 mg·L-1), Ag (EC50 = 0,021 mg·L-1). A análise da clorofila total apresentou um aumento de 133%, 122% e 120% (SiNC, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT, respectivamente) na concentração de 0,001 mg·L-1 em comparação com o controle. SiNC na concentração de 0,01 e 0,1 mg·L-1 apresentou umaumento de 130% para as duas concentrações. Enquanto que SiNC, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC- DCOIT-Ag na concentração de 1 mg·L-1 apresentou uma diminuição de 28,9%, 81,3%, 85,5% e 92,4% no teor de clorofila total. DCOIT e Ag apresentaram uma maior influência no teor de clorofila, reduzindo em 17,3% e 23,2% em comparação com o controle, respectivamente a 0,01 mg·L-1. O encapsulamento do biocida comprovou ser uma abordagem inovadora e promissora para o desenvolvimento de tintas anti-incrustantes. Palavras-chave: Nano-anti-incrustante; DCOIT; Bacillus subtillis, Aspergillus niger, Chlorella minutissima. ABSTRACT Marine biofouling (BI) is a natural process of extreme importance for biodiversity, where successive growth of organisms occurs on a submerged surface. However, when it occurs on man-made structures, it causes several socioeconomic and environmental problems. The main solution for BI is the application of paints containing anti-fouling biocides (BANIN) that prevent these organisms from adhering and growing on a surface. Due to increasingly restrictive environmental laws, companies in the area have been dedicated to the development of formulations that are less harmful to the environment. The objective of this work was to characterize nanomaterials (NM) with anti-fouling properties and to determine their toxicity on microorganisms isolated from the Brazilian coastal zone. The NM consisting of the organic biocide 4,5-dichloro-2-noctyl-4- isothiazolin3-one (DCOIT), encapsulated in mesoporous silica nanocontainers (SiNC) and coated by silver (Ag), were characterized by Transmission Electron Microscopy (TEM), Energy Dispersive Spectroscopy (EDS or EDX), Dynamic Light Scattering (DLS), Zeta Potential (Pζ) and Polydispersion Index (PDI). The toxicity of NMs was determined from the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Biocidal Concentration (MBC) on bacteria (Bacillus subtillis, Vibrio aestuarianus, V. parahaemolyticus), fungi (Penicillium citrinum IB-CLP11, P. sclerotigenum IB-CLP17, Aspergillus niger IB-CLP20 and P. polonicum IB-CLP22) and microalgae (Chlorella minutíssima BMAK26a). The NMs showed stability and size monodispersity as verified by DLS, PDI and Pζ analyses. Micrographs obtained by TEM revealed spherical shape with diameters of 112, 136, 139 and 133 nm for SiNC, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag and SiNC-DCOIT-Ag, respectively and EDS analysis confirmed the presence of the elements present in the samples. The antimicrobial assay on bacteria and fungi showed that SiNC showed antimicrobial action only for B. subtillis (MIC = 10 mg·L-1). DCOIT was toxic to all species of bacteria and fungi (MIC = 1 mg·L-1; MBC ≤ 10 mg·L-1) and Ag showing the highest toxicity (MBC ≤ 1 mg·L- 1). SiNC-DCOIT, SiNC-Ag and SiNC-DCOIT-Ag showed antimicrobial action for all species of bacteria and fungi (MIC = 1 mg·L-1 and MBC ≤ 10 mg·L-1). Cell density assay on C. minutissima showed lower toxicity for SiNC (EC50 = 2.24 mg·L-1), SiNC-DCOIT (EC50 = 0.625 mg·L-1), SiNC-Ag (EC50 = 0.584 mg·L-1), when compared to the estimated values for DCOIT (EC50 = 0.040 mg·L-1), Ag (EC50 = 0.021 mg·L-1). Total chlorophyll analysis showed an increase of 133%, 122% and 120% (SiNC, SiNC-Ag and SiNC- DCOIT, respectively) at the concentration of 0.001 mg·L-1 compared to the control. SiNC at the concentration of 0.01 and 0.1 mg-L-1 showed an increase of 130% for both concentrations. While SiNC, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag and SiNC-DCOIT-Ag at the concentration of 1 mg·L-1 showed a decrease of 28.9%, 81.3%, 85.5% and 92.4% in total chlorophyll content. DCOIT and Ag showed a greater influence on chlorophyll content, reducing by 17.3% and 23.2% compared to the control, respectively at 0.01 mg·L-1. Encapsulation of the biocide has proven to be an innovative and promising approach for the development of anti-fouling paints. Keywords: Nano-antifouling; DCOIT; Bacillus subtillis, Aspergillus niger, Chlorella minutissima. ÍNDICE GERAL 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 18 2.1 Bioincrustação .........................................................................................................................18 2.1.1 Biofilme .............................................................................................................................20 2.2 Nanomateriais .........................................................................................................................21 2.3 Anti-incrustantes......................................................................................................................25 2.4 Legislação ................................................................................................................................29 2.4.1 Biocidas anti-incrustantes ..............................................................................................29 2.4.2 Nanomateriais ..................................................................................................................31 2.5 Microrganismos testes............................................................................................................32 2.5.1 Bactérias ...........................................................................................................................32 2.5.2 Fungos Filamentosos .....................................................................................................33 2.5.3 Microalga ..........................................................................................................................34 3 OBJETIVO ............................................................................................................. 36 3.1 Objetivo geral ...........................................................................................................................36 3.2 Objetivos específicos ..............................................................................................................36 3.2.1 Caracterizar os nanomateriais por diferentes técnicas morfológicas – Microscopia eletrônica de transmissão e Espectroscopia de Raios X por dispersão e energia (Energy Dispersive Spectroscopy - EDS ou EDX); ...................................................................................36 3.2.2 Caracterizar os nanomateriais por diferentes técnicas estruturais – Espalhamento de Luz Dinâmico (Dynamic Light Scattering - DLS), Potencial Zeta (Pζ), Índice de polidispersão (Polydispersion Index - PDI) e Difração de Raios X (DRX); .............................36 3.2.3 Testes miniaturizados de toxicidade em bactérias marinhas Gram-positiva e Gram- negativas isoladas na zona costeira brasileira; ..........................................................................36 3.2.4 Testes miniaturizados de toxicidade em fungos marinhos isolados na zona costeira brasileira; ..........................................................................................................................................36 3.2.5 Teste miniaturizado de toxicidade em microalga isolada na zona costeira brasileira. 36 4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 37 4.1 Síntese dos nanomateriais ....................................................................................................37 4.2 Caracterização dos nanomateriais .......................................................................................37 4.2.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão ......................................................................37 4.2.2 Espectroscopia de raios X por dispersão em energia ................................................38 4.2.3 Difração de Raios X ........................................................................................................38 4.2.4 Análise de tamanho de partícula, distribuição e índice de polidispersão ................38 4.3 Ensaio de toxicidade...............................................................................................................38 4.3.1 Determinação de Concentração inibítória mínima e Concentração bacterida mínima 38 4.3.2 Determinação de Concentração inibitória mínima e Concentração fungicida mínima 39 4.3.3 Determinação da densidade celular de microalga ......................................................40 4.4 Análise estatística ...................................................................................................................42 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................... 43 5.1 Caracterização dos nanomateriais .......................................................................................43 5.1.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão ......................................................................43 5.1.2 Espectroscopia de energia dispersiva ..........................................................................43 5.1.3 Difração de Raios X ........................................................................................................44 5.1.4 Tamanho de partícula, distribuição e índice de polidispersão ..................................45 5.2 Ensaio de Toxicidade .............................................................................................................49 5.2.1 Determinação de Concentração inibitória mínima e Concentração bactericida mínima 49 5.2.2 Determinação de Concentração inibitória mínima e Concentração fungicida mínima 51 5.2.3 Determinação da densidade celular da Chlorella minutissima .................................53 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 59 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 60 8 ANEXO .................................................................................................................. 71 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Processo de crescimento de diferentes organismos marinhos bioincrustantes. ..................................................................................................................................... 18 Figura 2. Modelo esquemático das etapas da formação de biofilme microbiano presente na bioincrustação. ........................................................................................................ 20 Figura 3. Linha do tempo com acontecimentos relevantes da história das tintas anti- incrustantes. ................................................................................................................. 25 Figura 4. Área do Estuário de Santos com a determinação dos pontos de coleta das amostras das espécies de bactérias Bacillus subtilis, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio aestuarianus isoladas. .................................................................................................. 32 Figura 5. Área da Baía do Araçá - São Sebastião com a determinação do ponto de coleta da amostra das espécies de fungos filamentosos Penicillium citrinum IB-CLP11, Penicillium sclerotigenum IB-CLP17, Aspergillus niger IB-CLP20 e Penicillium polonicum IB-CLP22 isolados. ....................................................................................................... 34 Figura 6. Área de Cananéia - Litoral Paulista com a determinação do ponto de coleta da amostra da espécie de microalga marinha Chlorella minutissima isolada. ................... 35 Figura 7. Microscopia eletrônica de transmissão dos nanomateriais: (a) SiNC; (b) SiNC- DCOIT; (c) SiNC-Ag; (d) SiNC-DCOIT-Ag. ................................................................... 43 Figura 8. Difratogramas de raios X de SiNC, SiNC-Ag, SiNC-DCOIT e SiNC-DCOIT-Ag. ..................................................................................................................................... 45 Figura 9. A imagem representa o diâmetro hidrodinâmico formado, analisado pela técnica DLS (Espalhamento de Luz Dinâmico). ........................................................................ 46 Figura 10. A imagem representa a dupla camada formada e os diferentes potenciais de superfícies que podem ser analisados para identificar a estabilidade dos nanomateriais pela técnica Pζ (Potencial Zeta). .................................................................................. 48 Figura 11. Curva de crescimento da microalga Chlorella minutissima. ......................... 53 Figura 12. Reta de calibração da absorbância da cultura de Chlorella minutissima em função da concentração de células. ............................................................................. 54 Figura 13. Efeito dos MNMEs no crescimento da alga Chlorella minutissima. O valor é a sobrevivência da alga sob tratamento variado em relação ao controle. ........................ 55 Figura 14. Clorofila total da microalga Chlorella minutissima exposta aos MNMEs SiNC, DCOIT, Ag, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag, SiNC-DCOIT-Ag, respectivamente após as 96 horas. ........................................................................................................................... 57 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Toxicidade expressa em Concentração inibitória mínima (CIM), concentração biocida mínima (CBM), concentração de efeito mais baixa observada (LOEC) e concentração efetiva mediana (EC50) para espécies que constituem o biofilme expostas a nanomateriais. ........................................................................................................... 24 Tabela 2. Toxicidade expressa em concentração efetiva mediana (EC50) para espécies presentes no fitoplâncton que constituem o biofilme expostas a biocidas utilizados na TANIN. ......................................................................................................................... 26 Tabela 3. Toxicidade expressa em concentração inibitória mínima (CIM) e concentração efetiva mediana (EC50) para espécies que constituem o biofilme expostas ao biocida DCOIT. ......................................................................................................................... 27 Tabela 4. Toxicidade expressa em concentração inibitória mínima (CIM) e concentração efetiva mediana (EC50) para espécies que constituem o biofilme expostas ao biocida Ag. ..................................................................................................................................... 28 Tabela 5. Análise semi-quantitativa e micrografia das amostras de (a) SiNC; (b) SiNC- DCOIT; (c) SiNC-Ag; (d) SiNC-DCOIT-Ag, com ampliação de 250x. ............................ 44 Tabela 6. Caracterização das amostras de SiNC, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT- Ag (ø =129, 152, 134 and 125 nm para SiNC, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag, respectivamente) .......................................................................................................... 47 Tabela 7. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração biocida mínima (CBM) das amostras de NCs SiNC, DCOIT, Ag, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag contra Bacillus subtillis, Vibrio aestuarianus e Vibrio parahaemolyticus. “nd”: não determinado. ................................................................................................................ 50 Tabela 8. Concentração inibitória mínima (CIM) das amostras de NCs SiNC, DCOIT, Ag, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag contra Penicillium citrinum IB-CLP11, Penicillium clerotigenum IB-CLP17, Aspergillus niger IB-CLP20 e Penicillium polonicum IB-CLP22. “nd”: não determinado……………………………………………………… ....... 52 Tabela 9. Material suplementar com os dados de SiNC, DCOIT e Ag e sua toxicidade para todas as espécies testadas. Concentração inibitória mínima (CIM), concentração biocida mínima (CBM), concentração de efeito não observado (NOEC), concentração de efeito mais baixa observada (LOEC), concentração efetiva mediana (EC50) para espécies expostas a SiNC, DCOIT e Ag. “nd”: não determinado. CBM representa a concentração bactericida / fungicida mínima. ..................................................................................... 71 Tabela 10. Material suplementar com os dados de SiNC, DCOIT e Ag e sua toxicidade para todas as espécies testadas. Concentração inibitória mínima (CIM), concentração biocida mínima (CBM), concentração de efeito não observado (NOEC), concentração de efeito mais baixa observada (LOEC), concentração efetiva mediana (EC50) para espécies expostas a SiNC, DCOIT e Ag. “nd”: não determinado. CBM representa a concentração bactericida / fungicida mínima. ..................................................................................... 71 LISTA DE SIGLAS ABDI - Agência brasileira de desenvolvimento industrial ACVM - Act Agricultural Compounds and Veterinary Medicines Act 1997 AFS - Anti-Fouling System Ag - Prata AgNO3 - Nitrato de Prata AgNP - Nanopartícula de Prata AGVET - Agricultural and Veterinary Chemicals Code Act 1994 AN - Ágar nutriente ANTIN - Anti-incrustantes ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária APVMA - Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority BANIN - Biocidas Anti-Incrustantes BD - Batata Dextrose BDA - Batata Dextrose Ágar BHI - Brain Heart Infusion BI - Bioincrustação BMAK - Banco de Microrganismos Aidar & Kutner BPD - Biocidal Products Directive CBM - Concentração Biocida Mínima ou Concentração Bacterícida Mínima CFM - Concentração Fúngica Mínima CIM - Concentração Inibitória Mínima CO2 - Dióxido de Carbono CTAB - Cetil Brometo De Trimetilamônio CuPT - Piritiona de Cobre DCOIT - 4,5-dicloro-2-noctil-4-isotiazolin3-ona DLS - Espalhamento de Luz dinâmico DRX - Difração de Raios X EC50 - Concentração Efetiva Mediana EDS ou EDX - Espectroscopia de energia dispersiva EPS - Substâncias Poliméricas Extracelulares ERMA - Environmental Risk Management Authority New Zealand EUA - Estados Unidos da América FDA - Food and Drug Administration IB-CLP - Instituto de Biociências- Câmpus Litoral Paulista IBN - Iniciativa Brasileira de Nanotecnologia IO - Instituto Oceanográfico IPT - Instituto de Pesquisa Tecnológica JPMA - Japan Paint Manufacturers’ Association LC50 - Concentração letal mediana LOEC - Concentração de Efeito Mais baixa Observada MEPC - Comitê de Proteção do Meio Ambiente Marinho MET - Microscopia Eletrônica de Transmissão MH - Muller Hinton Broth MICROMAR - Laboratório de Microbiologia Marinha MNMEs - Micro-Nanomateriais Estruturados NM - Nanomateriais NOEC - Concentração de efeito não observado OCDE - Organização para a Cooperação e Desenvolvimento OMI - Organização Marítima Internacional PCPA - Pest Control Products Act PDI - Índice de Polidispersão PMRA - Pest Management Regulatory Agency Pζ- Potencial Zeta SiNC - Nanocontentores Mesoporosos de Sílica SiO2 - Dióxido de Silício SiO2NPs - nanopartículas de dióxido de silício Smallmatek - Small Materials and Technologies, Lda TANIN - Tintas Anti-Incrustantes TBT – Tributilestanho TCMTB - Benzotiazol-2-iltio tiocianato de metila TEOS - Tetraetilortossilicato TiO2NP - Nanopartícula de Dióxido de Titânio TPT - Trifenilestanho TSA - Ágar triptona de soja UFC - Unidades Formadoras de Colônias US-EPA - United States Environmental Protection Agency Uv-Vis – Ultravioleta Visível ZnPT - Piritiona de Zinco 16 1 INTRODUÇÃO O ambiente marinho (AM) tem sofrido de forma severa, especialmente na última década, em decorrência da contínua exposição a compostos antropogênicos. Neste contexto, ações relacionadas ao monitoramento ambiental, intrinsecamente associada à preservação da biodiversidade, são iminentes (Machado et al., 2020). Dentre os diversos organismos que compõem o AM, os microrganismos desempenham um papel fundamental associado à sua função ecológica (Sen et al., 2021; Hermoso et al., 2021). Também, são reconhecidamente considerados como um dos principais agentes no processo de bioincrustação (Luo et al., 2017). A bioincrustação (BI) é definida como a colonização em qualquer superfície sólida, viva ou morta, natural ou artificial, por microrganismos e, sequencialmente, por macrorganismos (Hayek et al., 2021). Este processo se inicia com a adsorção de diversos nutrientes e matéria orgânica presente no ambiente a uma superfície. O biofilme formado viabiliza o crescimento de organismos maiores, que se aderem de forma sucessiva à superfície (Chen et al., 2021). Muito embora a BI seja importante para o desenvolvimento da cadeia trófica, contribuindo para a biodiversidade e produtividade biológica local (Hayek et al., 2021; Farkas et al., 2021), quando esse processo ocorre em estruturas construídas pelo homem, os organismos incrustantes não só colocam em perigo o desenvolvimento da economia marinha, mas também, dificultam a exploração humana do oceano (Gu et al., 2020). Séculos atrás, metais pesados, como cobre, chumbo, arsênico e mercúrio eram utilizados como anti-incrustantes (ANTIN) em cascos de navios. Com o passar do tempo, esses ANTIN foram proibidos devido aos riscos que apresentam ao meio ambiente, com exceção do cobre, que ainda é permitido. Desde a década de 1950, um potente biocida de amplo espectro, tributilestanho (TBT), foi incorporado a várias formulações de revestimento para cascos de navios (Szeto et al., 2020). Contudo, na década de 1970, na França, foram investigados os efeitos tóxicos do TBT liberado dos revestimentos de ANTIN. A extrema toxicidade do TBT foi observada em muitos organismos aquáticos, para além daqueles que estão diretamente associados ao fenômeno da BI. Devido à esta detecção nociva ao ambiente supracitado, muitos países restringiram a sua utilização. Com base nas recomendações da Convenção Internacional a respeito do Controle de Sistemas Anti-incrustantes Nocivos para Navios realizada no ano de 2001, o uso de TBT foi proibido a partir de setembro do ano de 2008. Em decorrência deste fato, os 17 fabricantes de revestimentos ANTIN restringiram de suas formulações o estanho (Han et al., 2021). Como alternativa ao TBT, o biocida, diclorometilisotiazolinona (DCOIT, Sea- Nine 211), aprovado em 1994 pelos Estados Unidos e em 2014 pela União Europeia, ganhou espaço, uma vez que, apresenta uma rápida degradação e menores danos ao meio ambiente (Jesus et al., 2021). Toxicologicamente, o DCOIT demonstra elevada atividade antimicrobiana, sobretudo com relação a bactérias e fungos (Castro et al., 2011). Este biocida também foi referenciado como um agente que causa distúrbios em enzimas de neurotransmissão, citotoxicidade, estresse oxidativo dentre outros aspectos negativos. Jesus et al. (2021) e Su et al. (2018) reforçam a necessidade de maiores estudos relacionados à toxicidade e impactos ambientais do DCOIT, previamente a sua comercialização. Neste contexto, diante da necessidade crescente de se desenvolver estratégias inovadoras para prevenir a deterioração das estruturas marinhas e, que ao mesmo tempo, não sejam agressivas ao meio ambiente, os revestimentos à base de nanomateriais têm sido descritos como uma possível alternativa. Estratégias que utilizam o encapsulamento e imobilização de compostos ativos ANTIN em nanocontentores "inteligentes" estão em expansão. Os nanocontentores "inteligentes" são materiais nanoestruturados que liberam os compostos ativos de forma controlada, evitam o contato entre as espécies ativas e a matriz de revestimento e fornecem uma barreira de proteção do composto ativo para o meio ambiente (Avelelas et al., 2017; Miller et al., 2020). Estudos sobre uma nova formulação de DCOIT incorporado em nanocontetadores de sílica com revestimento de prata foram realizados por Jesus et al. (2021), Santos et al. (2020) e Figueiredo et al. (2020) sinalizando a eficiência desses materiais como ANTIN, uma vez que, a sua exposição a organismos como, crustáceos e microcrustáceos, apresentaram uma menor toxicidade em comparação aos biocidas equivalentes, DCOIT e Ag, respectivamente. Diante do exposto, no presente estudo, foi realizada a caracterização e avaliada a ação antimicrobiana de uma nova geração do agente anti-incrustante DCOIT, encapsulado em nanocontentores de sílica (SiNC) e revestidos com prata (Ag). 18 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Bioincrustação O oceano abrange cerca de 70% da superfície terrestre sendo o principal meio aquaviário do transporte de cargas mundial. Deste modo, é inegável e imprescindível destacar a sua importância do ponto de vista econômico de diversos setores industriais. A indústria de transporte marítimo é fortemente afetada pela BI, uma vez que, está associada à redução do desempenho dos navios. Existem mais de 4000 espécies presentes nos oceanos que podem contaminar a superfície submersa dos cascos, colocando em risco a biodiversidade (Farkas et al., 2021). A BI é um fenômeno no qual diferentes organismos colonizam de maneira acelerada estruturas naturais e sintéticas submersas em um ambiente aquático. Existem dois grupos principais, composto por diversos organismos incrustantes. Com base em seu tamanho, esses grupos são classificados em microrganismos e macrorganismos. Os organismos incrustantes passam por quatro estágios principais de progressão: adsorção, consolidação, microincrustação e macroincrustação (Fig. 1) (Abioye et al., 2019). Figura 1. Processo de crescimento de diferentes organismos marinhos bioincrustantes. Fonte: Adaptado de Li e Ning (2019). A primeira etapa da BI ocorre com a formação de uma película na superfície submersa em decorrência da aglomeração de moléculas orgânicas, como polissacarídeos, proteínas, proteoglicanos e moléculas inorgânicas. Após a aglomeração das moléculas orgânicas e inorgânicas, inicia-se a segunda etapa que consiste na formação de um biofilme microbiano que contém principalmente bactérias, cianobactérias, dinoflagelados, fungos e protozoários. O biofilme é uma camada 19 microbiana que coloniza substratos naturais ou artificiais. Estas camadas microbianas apresentam diversos níveis de complexidade estrutural e funcional. Tais camadas são controladas por processos físicos, químicos e biológicos, incluindo interações com topografia, ambientais, ciclagem de nutrientes e matéria orgânica e fotossíntese, que afetam diretamente o funcionamento do ecossistema (Caruso et al., 2020). A terceira etapa é caracterizada pela adesão de organismos maiores como diatomáceas, cracas, larvas e esporos de macroalgas. A quarta e última etapa consiste na colonização e desenvolvimento de espécies marinhas maiores de invertebrados como poliquetas, cracas, mexilhões e algas (Agostini et al., 2020). Ainda que a BI seja um processo natural, quando associada a estruturas produzidas pelo homem, pode causar severos impactos econômicos, principalmente associados à indústria naval (Pradhan et al., 2018). De acordo com Abioye et al. (2019), em decorrência de fatores associados a este fenômeno, existe uma perda econômica anual de 200 bilhões de euros. A BI pode desencadear entupimento de tubulações, aumentando o peso da embarcação e, consequentemente, afetar a superfície dos cascos, deixando-os irregulares, rugosos e corroídos, elevando o atrito e, por consequência, a redução de sua velocidade. Além disso, o aumento do gasto do combustível amplia as emissões de CO2, influenciando diretamente no efeito estufa (Abioye et al., 2019). Em adição, as camadas de biofilme podem também abrigar e facilitar o crescimento de microrganismos patogênicos afetando a saúde pública (Joyce et al., 2019). Segundo Ygit et al. (2019), a BI gera diversos impactos econômicos devido ao crescimento sucessivo das espécies que se aderem aos cascos das embarcações e, também, na água de lastro também gera impactos ambientais, contribuindo para a introdução de espécies invasoras, que podem competir e/ou extinguirem espécies nativas, alterando a cadeia alimentar e reduzindo a biodiversidade do ecossistema. A consequência desse impacto, também pode envolver a redução das populações de espécies de interesse comercial gerando um impacto social para as comunidades que dependem financeiramente desses organismos. Assim, esforços para prevenir a BI são altamente benéficos para economia e meio ambiente. 20 2.1.1 Biofilme A formação do biofilme é composta por quatro etapas, inicialmente ocorre o transporte de bactérias para a superfície (Fig. 2a), devido a fatores associados à gravidade, dinâmica de fluidos e mobilidade celular (Flemming et al., 2020). Sequencialmente, ocorre a adesão reversível. Nesta etapa (Fig. 2b), diferentes fatores físico-químicos como rugosidade, hidrofobicidade/hidrofilicidade, porosidade e topologia dos poros da superfície são responsáveis pela aderência das células bacterianas a uma superfície. Assim como, a presença de flagelos, pelos, fímbrias e glicocálice afetam significativamente o grau de adesão, uma vez que, estes apêndices auxiliam as células a permanecerem fixas mesmo quando atuam forças repulsivas (Mahamuni-Badiger et al., 2020). A terceira etapa (Fig. 2c) consiste na adesão irreversível, onde as bactérias interagem com o filme primário e, em minutos, ocorre a fixação permanente das células por conta de compostos adesivos como substâncias poliméricas extracelulares (EPS) presentes no meio. Na última etapa, o crescimento dessas células supracitadas chega ao ponto de maturação. A maturação ocorre devido a presença de nutrientes no biofilme e proporciona o assentamento e o crescimento de invertebrados e algas (Fig. 2d) (Antunes et al., 2018; Amara et al., 2018). Figura 2. Modelo esquemático das etapas da formação de biofilme microbiano presente na bioincrustação. Fonte: Adaptado de Amara et al. (2018) 21 2.2 Nanomateriais O desenvolvimento da nanotecnologia levou a um enorme investimento na produção de nanomateriais (NM). Os nanomateriais são materiais que exibem pelo menos uma única entidade morfológica, como dimensão arquitetônica, tamanho granular, dimensão de partículas e assim por diante, em nanoescala ou abaixo de 100 nm (Idumah et al., 2020). Quando o tamanho de um material é reduzido para a faixa nanométrica, as propriedades químicas, físicas e biológicas do material mudam e se tornam totalmente diferentes das propriedades de seus átomos individuais, moléculas ou materiais em larga escala. Isso ocorre, pois há uma modificação na superfície do material, a superfície modificada é uma ferramenta poderosa que aprimora as propriedades do material ao transmitir os grupos funcionais desejados em sua superfície sem comprometer as propriedades em massa (Mathew et al., 2019; Jawed et al., 2020). No início do ano 2000, a primeira geração de NM foi amplamente utilizada na forma de nanoestruturas passivas (função estacionária). As nanoestruturas passivas incluem revestimentos nanoestruturados, dispersão de nanopartículas, superfícies nanopadronizadas, engenharia de ultraprecisão, materiais bulk (metais nanoestruturados, polímeros e cerâmicas). Estes materiais nanoestruturados têm estruturas estacionárias ou quase-estacionárias e funções associadas ao comportamento mecânico ou reatividade química. A segunda geração destes materiais foi iniciada no ano de 2005, sendo classificadas como nanoestruturas ativas. As nanoestruturas ativas possuem funções que evoluem, isto é, mudam o seu estado durante sua operação (Lai et al., 2018). A introdução de novas tecnologias atreladas à nanotecnologia promoveu a partir do ano de 2010, o desenvolvimento da terceira geração de NM. Esta geração se destaca pelo desenvolvimento de sistemas de nanosistemas, uso em várias sínteses e técnicas de montagem, tais como: biomontagem, redes em nanoescala, em multiescala e em arquiteturas hierárquicas, robótica em superfícies, nanosistemas modulares, processos quimiomecânicos de montagem molecular, sistemas em nanoescala baseados em quântica. A quarta geração iniciada no ano de 2015 foi impulsionada por envolver nanosistemas moleculares heterogêneos, onde cada molécula no nanosistema tem uma estrutura específica e um papel diferente. Moléculas poderiam ser usadas como dispositivos e fundamentalmente novas funções poderiam emergir destas estruturas e arquiteturas engenheiradas. Tal situação se aproximaria do modo de funcionamento dos 22 sistemas biológicos, mas na comparação com eles: são à base de água, processam a informação de forma relativamente lenta, e têm múltiplas escalas hierárquicas. Atualmente nesta geração, os NM são produzidos para a interação direta com sistemas biológicos (Lai et al., 2018). Os NM podem ser produzidos a partir do método bottom-up ou top-down. O método bottom-up consiste em construir estruturas átomo a átomo ou molécula por molécula. No método top-down, a produção do NM é iniciada por processos de trituração e moagem, ou seja, macroscópica e segue uma sequência de processos até atingir a escala desejada. As sínteses dos NM podem ter origem em fontes naturais e antropogênicas, incluindo metabolismos microbianos, fontes hidrotermais e poeira vulcânica. Os micro-nanomateriais estruturados (MNMEs) de fontes antropogênicas são projetados com características aprimoradas, que incluem propriedades ópticas, térmicas e elétricas, condutividade, solubilidade e reatividade. Portanto, em comparação com as formas naturais, esses materiais têm interações distintas com constituintes bióticos e abióticos do ambiente. Essas propriedades exclusivas dos MNMEs resultam em aplicações amplamente difundidas em produtos comerciais e trazem benefícios para vários setores industriais, como alimentos, cosméticos, pesticidas e produtos farmacêuticos (El-saied et al., 2020). Novos NM ANTIN foram desenvolvidos recentemente usando nanocontentores mesoporosos de sílica (SiNC) para encapsular o biocida DCOIT, sendo posteriormente revestidos de um agente antimicrobiano, normalmente a Ag. Os SiNC possuem um núcleo vazio e uma concha com mesoporosidade gradual que confere capacidade de carga significativa e permite a liberação prolongada e estimulada do biocida, como pH, proporcionando uma carga ambiental segura do biocida, juntamente com o direcionamento específico. Estes nanocontentores também possuem boa biocompatibilidade, elevada capacidade de carregamento, versatilidade em se fixar a ligantes alvo, ampliando assim, o reconhecimento celular específico. Em acréscimo, a sua porosidade pode ser ajustável e bem definida, tornando estes MNMEs adequados para entrega de drogas (Vazquez et al., 2017). Quando utilizado como aditivo de revestimento, a vida útil do biocida é ampliada e o teor percentual do ingrediente ativo principal no revestimento também é bastante reduzido. A empresa Small Materials and Technologies, Lda (Smallmatek), situada em Aveiro, Portugal, tem desenvolvido e produzido nos últimos anos nanomateriais de engenharia funcionalizados, incluindo os utilizados no presente estudo. De acordo com Santos et al. (2020) e Eivazzadeh-Keihan 23 et al. (2020) a inserção destes compostos em revestimentos de proteção para aplicações marítimas é promissora. É imprescindível destacar, que para aplicações marítimas este tipo de compostos incorporados aos revestimentos sejam estáveis e apresentem ação antimicrobiana, impedindo assim, a formação do biofilme. A aplicação de revestimentos anti-incrustantes eficientes pode gerar uma economia de milhões de dólares no custo das operações de manutenção, ou mesmo prevenir danos aos ecossistemas. Os revestimentos anti- incrustantes frequentemente incluem biocidas para prevenir o crescimento de microrganismos indesejados, como bactérias, cianobactérias, fungos, protozoários e microalgas, e macroincrustantes, como briozoários, macroalgas, vermes tubulares e mexilhões (Jesus et al., 2021). O mercado de NM pode chegar a US $100 bilhões em 2025 (Allan et al., 2021). A produção de NM é uma área de inovação de produtos que está se desenvolvendo mais rapidamente do que as estruturas regulatórias. Os MNMEs podem sofrer alterações durante sua fabricação, uso e subsequente, entrada e passagem pelo ambiente. Estas alterações podem afetar suas formas químicas e físicas, reatividade, mobilidade potencial, detectabilidade e toxicidade (Kralova e Jampilek, 2021). Devido ao incremento da utilização desses MNMEs, os mesmos são considerados nos dias atuais contaminantes emergentes. Gutner-Hoch et al. (2019) reforça que é imprescindível a uma alargada avaliação da toxicidade de micro e nanomateriais previamente a sua inserção no mercado e, consequentemente, exposição ao meio ambiente. A interação de compostos antropogênicos com a microbiodiversidade marinha (bactérias, fungos, microalgas) é considerada a primeira etapa da incorporação de poluentes na cadeia trófica. As formas como os MNMEs atuam na microbiodiversidade marinha ainda são pouco conhecidas e variam de acordo com a espécie de estudo e as características dos NM (Allan et al., 2021). Os efeitos dos MNMEs são estudados utilizando diversos organismos (Tab. 1), sendo que, para ecossistemas de água doce e marinho, as algas são os representantes mais comuns, devido ao seu valor ecológico que constitui a base das cadeias tróficas (Arze et al., 2020). 24 Tabela 1. Toxicidade expressa em Concentração inibitória mínima (CIM), concentração biocida mínima (CBM), concentração de efeito mais baixa observada (LOEC) e concentração efetiva mediana (EC50) para espécies que constituem o biofilme expostas a nanomateriais. Organismos Espécies Nanomateriais Tamanho (nm) Toxicidade (mg·L-1) Referências Bactérias Bacillus subtilis AgNP 24,2 CIM 15,6 CBM 31,2 Erjaee et al. (2017) Vibrio parahaemolyticus AgNP 30-60 CIM 6,8 CBM 27,3 Rajesh et al. (2020) Escherichia coli AgNP 15-20 CIM 25 Ahmad et al. (2017) Vibrio fisheri SiNC 100-150 EC50 17,1 Figueiredo et al. (2019) SiNC-DCOIT 100-150 EC50 2,51 SiNC-Ag 100-150 EC50 1,14 SiNC-DCOIT-Ag 100-150 EC50 0,646 Fungos Pennicilium expansum AgNP 15-220 EC50 2 Neethu et.al. (2018) Aspergillus fumigatus AgNP 20,56 CIM 1 Xue et al. (2016) Aspergillus flavus AgNP 20,56 CIM 2 Xue et al. (2016) Aspergillus sp. AgNP 15,5 CIM 1-2 Singh et. al. (2014) Microalgas Dunaliella salina AgNP 12,65 EC50 0,480 Johari et al. (2018) Thalassiosira pseudonana AgNP ≠ tamanhos LOEC 0,16 Burchardt et al. (2012) Phaeodactylum tricornutum SiNC 100-150 EC50 2,03 Figueiredo et al. (2019) SiNC-DCOIT 100-150 EC50 0,036 SiNC-Ag 100-150 EC50 2,87 SiNC-DCOIT-Ag 100-150 EC50 0,012 Perifíton Perifíton misto AgNP 35 EC50 3,73 Gil-Allué et al. (2015) 25 2.3 Anti-incrustantes Os anti-incrustantes (ANTIN) são biocidas incorporados na composição das tintas anti-incrustantes (TANIN), cuja principal função é impedir o crescimento de microrganismos que aderem às superfícies submersas. De acordo com a cronologia referente a utilização de TANIN (Fig.3), folhas de chumbo e cobre são descritas como os primeiros materiais ANTIN utilizados em embarcações. Com o aparecimento de novas tecnologias e legislações mais restritivas, os biocidas utilizados foram substituídos (Konstantinou et al., 2004; Amara et al., 2018). Figura 3. Linha do tempo com acontecimentos relevantes da história das tintas anti-incrustantes. (Adaptado de Amara et al., 2018). A primeira geração de TANIN apresentava em sua composição óxidos de zinco (ZnO) e cobre (CuO). A durabilidade destas tintas foi estimada em tempo inferior a um ano. Muito embora apresentassem ação ANTIN para a maioria dos organismos, foi reportada a resistência de algumas espécies de algas. Em meados da década de 1960, uma segunda geração de TANIN com formulações contendo biocidas organoestânico, principalmente o tributilestanho (TBT) e o trifenilestanho (TPT), foram vastamente exploradas devido a eficiente ação ANTIN e elevada durabilidade. Contudo, a utilização desses compostos, também apresentou elevada toxicidade para espécies não alvo. Diante desta problemática, a Organização Marítima Internacional (OMI) propôs no ano de 2001 banimento mundial dos biocidas organoestânicos (Abreu, 2016). Devido às limitações impostas pela OMI, o interesse industrial para o desenvolvimento de tintas utilizando biocidas de terceira geração foi ampliado. Os biocidas que fazem parte da formulação das TANIN de terceira geração pertencem ao grupo de compostos orgânicos e organometálicos. Os principais compostos são o Irgarol 1051, Diuron, DCOIT, Benzotiazol-2-iltio tiocianato de metila (TCMTB). Os biocidas DCOIT, Piritiona de cobre (CuPT) e Piritiona de zinco (ZnPT) são frequentemente incorporados às TANIN (Tab. 2). Estes biocidas apresentam um tempo de degradação 1500-300 AC 1800-1900 Década de 1960 2008 2001 Atualmente 1ª Geração TANIN Utilização de metais pesados 2ª Geração TANIN 3ª Geração TANIN e novas tecnologias “Convenção AFS” entrou em vigor OMI – “Convenção AFS” para eliminar TBT 26 mais rápido que os biocidas convencionais e se comportam de forma eficiente quando encapsulados em nanomateriais (Avelelas et al., 2017). Tabela 2. Toxicidade expressa em concentração efetiva mediana (EC50) para espécies presentes no fitoplâncton que constituem o biofilme expostas a biocidas utilizados na TANIN. Anti- incrustante Espécies Exposição Toxicidade (mg L-1) Referências Irgarol 1051 Vibrio fisheri EC50 (15min) 50,8 Férnandez-Alba et al. (2002) Chroococcus minor EC50 (96h) 0,008 Zhang et al. (2008) Dunaliella tertiolecta EC50 (24h) 0,001 Gatidou e Thomaidis (2007) Várias espécies EC50 (72h) 0,441 Nystrom et al. (2002) Diuron Synechococcus sp. EC50 (96h) 0,110 Bao et al. 2011) Raphidocelis subcapita EC50 (72h) 0,001 Mezcua et al. (2002) Pyrocystis lúnula EC50 (24h) 19 Bao et al. (2011) Pyrocystis lúnula EC50 (24h) 19 Stauver et al. (2008) ZnPT Synechococcus sp. EC50 (96h) 0,022 Bao et al. (2011) Tetraselmis chuii EC50 (96h) 0,280 Avelelas et al. (2017) Pyrocystis lúnula EC50 (24h) 0,0004 Bao et al. (2011) CuPT Synechococcus sp. EC50 (96h) 0,022 Bao et al. (2011) Tetraselmis chuii EC50 (96h) 0,300 Avelelas et al. (2017) Pyrocystis lúnula EC50 (24h) 0,023 Bao et al. (2011) TBT Vibrio fisheri EC50 (15min) 0,011 Férnandez-Alba et al. (2002) Scenedesmus vacuolatus EC50 (24h) 0,01475 Arrhenius et al. (2006) Skeletonema marinoi EC50 (96h) 0,00355 Xie et al. (2011) Asterionella japônica EC50 (96h) 0,00315 O DCOIT é amplamente utilizado em aplicações marinhas como alternativa ao TBT (Amara et al., 2018). Quando comparado ao TBT, apresenta melhor comportamento ambiental. Este biocida é facilmente biodegradado, possuindo um tempo de meia-vida no ambiente marinho compreendido entre 1 a 3 dias. Na última década, muitos estudos destacam que o DCOIT (Tab. 3) apresenta efeitos tóxicos nos organismos marinhos (Aidarova et al., 2018). Su et al. (2018), reforçam a necessidade de estudos complementares associados à toxicidade e, consequentemente, potenciais impactos ambientais. 27 Tabela 3. Toxicidade expressa em concentração inibitória mínima (CIM) e concentração efetiva mediana (EC50) para espécies que constituem o biofilme expostas ao biocida DCOIT. Organismos Espécies Exposição Toxicidade (mg L-1) Referências Bactérias Bacillus subtillis CIM (24 h) 21,2 Erjaee et al. (2017) E. coli CIM (24 h) 15,6 Vibrio fischeri EC50 (30 min) 0,600 Georgantzopoulou et al. (2012) Vibrio fischeri EC50 (15 min) 0,464 Rosen et al. (2008) Fungos Aspergillus flavus CIM (120 h) 70 Ismaiel e Tharwat (2014) Penicillium vulpinum CIM (120 h) 60 Penicillium cirinum CIM 0,8 Chen et al. (2018) Aspergillus niger CIM 0,4 Fitoplâncton Isochrysis galbana EC50 (48 h) 0,081 Wilson e Freeburg (1980) Phaeodactylum tricornutum EC50 (72 h) 0,070 Figueiredo et al. (2017) Dunaliella salina EC50 (72 h) 0,218  Johari et al. (2018) Pseudokirchneriella subcapitata EC50 (48 h) 0,0011 Angel et al. (2013) Ceratocory shorrida EC50 (24 h) 0,008 Rosen et al. (2008) Pyrocystis pseudonoctiluca EC50 (24 h) 0,038 Lingulodinium polyedrum EC50 (24 h) 0,006 Gymnodinium splendens EC50 (48 h) 0,021 Wilson e Freeburg (1980) Gutner-Hoch et al. (2019) destacam que a liberação controlada de biocidas mediada por MNMEs é promissora. Segundo os autores, os MNMEs utilizados para o encapsulamento ou imobilização não apresentam toxicidade, sendo uma alternativa inovadora na redução de possíveis impactos ambientais. Além disso, apresentam benefícios em termos de estabilidade e durabilidade dos revestimentos ANTIN. Os MNMEs incluem principalmente, hidróxidos de camada dupla, SiNC e microcápsulas de poliuréia. Os MNMEs podem ser revestidos por diversos materiais, incluindo a Ag. O uso multifacetado da Ag com várias aplicações comerciais é antigo. A prata atualmente é 28 comumente utilizada em escala nanométrica, sendo incorporada a dispositivos médicos, impregnada em implantes poliméricos, equipamentos esportivos, dentre outras aplicações (Mohanta et al., 2020; Erjaee et al., 2017). A sua principal função está associada a ação antimicrobiana e, por consequência, elevada ação inibitória na formação de biofilmes (Tab.4). Neste sentido e diante da necessidade crescente de mercado naval, a Ag é amplamente explorada nas formulações de TANIN (Abreu, 2016). Tabela 4. Toxicidade expressa em concentração inibitória mínima (CIM) e concentração efetiva mediana (EC50) para espécies que constituem o biofilme expostas ao biocida Ag. Organismos Espécies Exposição Toxicidade (mg L-1) Referências Bactérias Vibrio fischeri EC50 (15 min) 0,012 Fernández-Alba et al. (2002) EC50 (30 min) 0,299 Figueiredo et al. (2019) Pseudomonas atlântica CIM 0,1 Jacobson e Willingham (2000) Pseudomonas náutica CIM 0,1 Fitoplâncton Phaeodactylum tricornutum EC50 (72 h) 0,004 Figueiredo et al. (2017) Selenastrum capricornotum EC50 (72 h) 0,003 Fernández-Alba et al. (2002) Emiliania huxleyi EC50 (72 h) 0,0004 Devilla et al. (2005) Perifíton Perifíton misto EC50 (72 h) 0,026 Arrhenius et al. (2006) 29 2.4 Legislação 2.4.1 Biocidas anti-incrustantes A legislação para biocidas anti-incrustantes (BANIN) foi elaborada com o objetivo de controlar a comercialização e utilização destes produtos de forma indiscriminada, permitindo assim, uma maior proteção do meio ambiente (Thomas e Brooks, 2010). Estudos realizados na baía da França no ano de 1982, constataram efeitos tóxicos de compostos orgânicos de estanho, como o TBT, em ecossistemas marinhos (Alzieu, 1991). Baseado nos resultados, no ano de 1988, a Organização Marítima Internacional (OMI) em parceria com o Comitê de Proteção do Meio Ambiente Marinho (MEPC), avaliou o efeito dos biocidas de compostos orgânicos de estanho utilizados nas formulações das TANIN. Posteriormente, em 1999 a OMI adotou a Resolução A.895(21), restringindo o uso desses compostos principalmente em embarcações de pequeno porte (Price e Readman, 2013). Em 2001, a OMI estabeleceu uma convenção internacional que entrou em vigor em setembro de 2008, proibindo o uso desses compostos em TANIN. No Brasil, a Marinha do Brasil suspendeu o uso de tintas antivegetativas à base de TBT em seus navios em 2003 e, em 2007, aplicou uma regulamentação, a NORMAM 23, para restringir o uso de compostos organoestânicos em todos os sistemas antivegetativos de todas as embarcações brasileiras registradas de pequenas embarcações de lazer a navios (Toste et al., 2011). Contudo, somente no ano de 2010, o TBT foi definitivamente banido, conforme o Decreto Legislativo Nº 797. Mesmo antes da aprovação do decreto, em 2008, alguns países da União Europeia e o Japão adotaram regulamentações propondo um sistema de pintura ANTIN livre de TBT (Abreu, 2016). Em 2002 o Brasil assinou a Convenção Anti-Fouling System (AFS) estando ainda sujeita à ratificação pelo Congresso Nacional. Em 2007 no Brasil a regulamentação NORMAM-23/DPC realizada pela Marinha do Brasil e Diretoria de Portos e Costas foi adotada no país onde estabelece procedimentos sobre o controle do uso de sistemas ANTIN danosos ao meio ambiente marinho ou à saúde humana. A Convenção AFS foi aprovada em 2010 e em apenas 2014 entrou em decreto com o DEC Nº 8.345 foi introduzido no Brasil onde aborda trata sobre a convenção OMI para sistemas anti-incrustantes (OMI, 2014; Pereira e Ankjaergaard, 2009; Abreu, 2016). Alguns países possuem o seu próprio sistema de aplicação específica a produtos ANTIN, onde alguns incorporam um esquema de registro, enquanto outros usam apenas 30 um esquema de notificação. Na Europa a legislação de ANTIN pode ser aplicada pela Diretiva de Produtos Biocidas (BPD), onde os estados membros da União Européia podem incorporar as regulamentações. Nos Estados Unidos da América (EUA), as TANIN são controladas pela Lei Federal de Inseticidas, Fungicidas e Rodenticidas, sendo a aprovação desses compostos concedida pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (US-EPA). Da mesma forma que nos EUA, no Canadá os biocidas são classificados como pesticidas antimicrobianos, são regulamentadas pela Lei de Produtos de Controle de Pragas (PCPA), que é administrado pela Health Canada’s Pest Management Agência Reguladora (PMRA) e, também, precisam ser aprovadas antes de vendidas e aplicadas (Pereira e Ankjaergaard, 2009; Abreu, 2016). Na oceania, a Austrália considera as TANIN como produtos químicos agrícolas, a fabricação, o fornecimento e a venda de tintas anti-incrustantes são regulamentados por meio de a Lei do Código de Químicos Agrícolas e Veterinários de 1994 (o código Agvet) que é administrado pela Australian Pesticides e Autoridade de Medicamentos Veterinários (APVMA). Na Nova Zelândia as TANIN foram registradas e aprovadas pela Lei de Substâncias Perigosas e Novos Organismos 1996 (Lei HSNO). A Autoridade de Gestão de Risco Ambiental da Nova Zelândia (ERMA) avalia e aprova substâncias perigosas sob a Lei HSNO e coloca controles ou condições sobre a substância para gerenciar seu risco para o meio ambiente (ACVM Act) (Pereira e Ankjaergaard, 2009). Na Ásia, o Japão desenvolveu a Associação dos Fabricantes de Tintas (JPMA) que introduziu um sistema autorregulatório de gerenciamento para fornecer informações de conformidade relacionadas à Convenção OMI e informações relacionadas aos armadores, operadores de navios, governo autoridades responsáveis e outros órgãos relacionados, examinando tintas fabricadas e distribuídas por membros regulares da JPMA, membros apoiantes ou empresas não associadas. Em Hong Kong, China as TANIN são consideradas pesticidas e são controladas pelo Regulamento de Pesticidas Cap. 133, que é administrado pelo Departamento de Agricultura, Pesca e Conservação que propõe que o produto anti-incrustante importado, fornecido e vendido para uso em Hong Kong deve obter um registro específico. As legislações que tratam especificamente do marketing e do uso de TANIN é o ponto principal para os órgãos reguladores que trabalham com esta classe de produtos. Há a necessidade de que as regulamentações acompanhem as revoluções tecnológicas desses produtos (Pereira e Ankjaergaard, 2009). 31 2.4.2 Nanomateriais A produção de MNMEs tem evoluído exponencialmente, entretanto, as agências reguladoras mundiais ainda esbarram em diversos aspectos associados às definições dos materiais que compõem esta classe, proteção à saúde pública e ao meio ambiente. No Brasil, no ano de 2011, a Agência brasileira de desenvolvimento industrial (ABDI) desenvolveu o estudo intitulado “Nanotecnologias: subsídios para a problemática dos riscos e regulação”, cujo objetivo foi disponibilizar informações consolidadas a pesquisadores, empresários e entidades que lidam com o assunto, no que diz respeito aos riscos da nanotecnologia e suas implicações sobre as questões regulatórias (ABDI, 2011). O Projeto de Lei n° 6741, que entrou em vigor no ano de 2013, dispôs sobre a política nacional associada ao uso da nanotecnologia no país. Em 2014, o Comitê Interno de Nanotecnologia da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), instituiu a Portaria Nº 1.358, com a finalidade de coordenar as ações institucionais na área da nanotecnologia julgadas prioritárias. Em geral, essa norma obriga o registro a informar sobre a natureza nanotecnológica dos produtos e processos sujeitos à vigilância sanitária, monitorar e regulamentar todo o uso de nanomateriais e todos os processos e partes que o envolvem (ANVISA, 2014). No ano de 2019, foi aprovado o Projeto de Lei n° 880 que dispôs estímulos ao desenvolvimento científico, à pesquisa, à capacitação científica e tecnológica e à inovação nanotecnológica. No mesmo ano, a Portaria n° 3.459 foi introduzida para instituir a Iniciativa Brasileira de Nanotecnologia (IBN), como política nacional para o desenvolvimento da nanotecnologia, com intuito de criar, integrar e fortalecer ações governamentais na área, com foco na promoção da inovação na indústria brasileira e no desenvolvimento econômico e social. Os sistemas regulamentorios de aplicação e utilização de NM são específicos para cada país. A Food and Drug Administration (FDA) é a agência responsável pela promoção da saúde pública que controla e supervisiona a aplicação de NMs nos EUA. Na União Europeia a European Chemicals Agency (ECHA) é a agência responsável pela regulamentação de NM e que visa gerir os aspectos técnicos, científicos e regulamentativos de todos os produtos químicos (ABDI, 2011). 32 2.5 Microrganismos testes 2.5.1 Bactérias O gênero Bacillus é constituído por bactérias Gram-positivas em forma de bastonetes. As bactérias deste gênero podem formar biofilme e, também, produzir metabólitos de importância industrial. Bacillus subtilis é uma das principais representantes desse gênero. Esta bactéria é muito utilizada como modelo de estudo, uma vez que não é patogênica e, também, é de fácil cultivo (Lee et al., 2021; Guo et al., 2021). As bactérias do gênero Vibrio são Gram-negativas em forma de bastonetes curvos com flagelo. As espécies mais comuns são as Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio aestuarianus. Estas espécies são conhecidas por estarem associadas a doenças infecciosas e gastroenterite. A V. parahaemolyticus e V. aestuarianus, estão presentes em água doce e salgada, são aeróbias facultativas, oxidativas positivas e não produzem esporos. São também conhecidas por serem patogênicas oportunistas (Xu et al., 2018; Nguyen et al., 2021). As bactérias pertencentes aos gêneros Bacillus e Vibrio foram isoladas de amostras de sedimentos coletados em diferentes pontos do Estuário de Santos (Fig. 4). As amostras foram processadas pelo Laboratório de Microbiologia Marinha (MICROMAR), do Instituto de Biociências do Campus do Litoral Paulista (IB-CLP), da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP). Figura 4. Área do Estuário de Santos com a determinação dos pontos de coleta das amostras das espécies de bactérias Bacillus subtilis, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio aestuarianus isoladas. (Fonte: Autor) 33 2.5.2 Fungos Filamentosos Estima-se que o Reino Fungi contenha sete filos principais e 1,5 milhão de espécies. Ascomycota é o maior grupo e inclui alguns gêneros importantes como Penicillium e Aspergillus. Diversas espécies desse gênero são utilizadas para a fermentação de uma grande variedade de produtos fúngicos, como penicilina, álcool e ácido cítrico. Os polissacarídeos compreendem outro grupo de compostos derivados de fungos naturais que têm valor médico considerável. Espécies como Penicillium citrinum, Penicillium sclerotigenum e Penicillium polonicum podem ser fitopatogênicas causando diversos danos na área agrícola (Carvalho et al., 2021). O gênero Aspergillus é muito utilizado para a produção de diversos processos industriais como na área de alimentos e produção comercial de ácidos, pertencem ao filo Ascomycota e podem estar presentes tanto em ambiente terrestre, quanto aquático. Algumas espécies desse gênero podem ser fitopatogênicas e patogênicas (Ohte et al., 2020). Aspergillus niger é um dos microrganismos mais aplicado na biotecnologia, um patógeno oportunista que vem sendo utilizado a décadas para produção de enzimas de interesse industrial e produção de ácidos (Ma et al., 2021). Com o aumento da busca de novos metabólitos e moléculas biologicamente ativas, os fungos marinhos cada vez mais têm sido estudados. Amin et al. (2020) e Yurchenko et al. (2021) destacam que as linhagens fúngicas isoladas do ambiente marinho são promissoras para aplicações industriais, uma vez que, são capazes de sobreviver em um ambiente extremo com elevada salinidade e produzir moléculas complexas com propriedades biotecnológicas. As linhagens de fungos filamentosos do gênero Penicillium e Aspergillus de origem marinha provenientes da Coleção de Cultura do Instituto de Biociências-Câmpus do Litoral Paulista (IB-CLP), foram isoladas da Baía do Araçá, São Sebastião/ SP (Fig. 5), de acordo com os padrões da American Public Health Association. 34 Figura 5. Área da Baía do Araçá - São Sebastião com a determinação do ponto de coleta da amostra das espécies de fungos filamentosos Penicillium citrinum IB-CLP11, Penicillium sclerotigenum IB-CLP17, Aspergillus niger IB-CLP20 e Penicillium polonicum IB-CLP22 isolados. (Fonte: Autor) 2.5.3 Microalga As microalgas do gênero Chlorella são unicelulares, esféricas e sem flagelo. Pertencem ao filo Chlorophyta e são encontradas na água doce e salgada. A reprodução ocorre de forma assexuada e as melhores condições de cultivo são em elevada concentração de nutrientes e luminosidade. São muito utilizadas industrialmente devido ao rápido crescimento e fácil cultivo (Cao et al., 2021). A microalga Chlorella minutissima é encontrada em ambiente ducícola ou marinho. Pertencente à classe das Chlorophyceae, C. minutissima contém pigmentos verdes fotossintetizantes clorofila a e b em seus cloroplastos (Sharan & Nara, 2020). Chandra & Ghosh (2019) e Khan et al. (2018), destacam a importância dessa espécie, devido à ampla utilização para produção de biodiesel, tratamento de efluentes e produção de metabólitos de interesse biotecnológico. Em adição, esta espécie é referenciada como organismos presente na BI (Fanesi et al., 2021). A linhagem da microalga C. minutissima BMAK26a de origem marinha proveniente do Banco de Microrganismos Aidar & Kutner (BMAK) do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo, foi isolada do ambiente marinho na cidade de Cananéia (Fig. 6). 35 Figura 6. Área de Cananéia - Litoral Paulista com a determinação do ponto de coleta da amostra da espécie de microalga marinha Chlorella minutissima isolada. (Fonte: Autor.) 36 3 OBJETIVO 3.1 Objetivo geral O objetivo geral do trabalho foi caracterizar os nanomateriais (MNMEs) com propriedades anti-incrustantes e determinar a sua toxicidade em microrganismos isolados da zona costeira brasileira. 3.2 Objetivos específicos 3.2.1 Caracterizar os nanomateriais por diferentes técnicas morfológicas – Microscopia eletrônica de transmissão e Espectroscopia de Raios X por dispersão e energia (Energy Dispersive Spectroscopy - EDS ou EDX); 3.2.2 Caracterizar os nanomateriais por diferentes técnicas estruturais – Espalhamento de Luz Dinâmico (Dynamic Light Scattering - DLS), Potencial Zeta (Pζ), Índice de polidispersão (Polydispersion Index - PDI) e Difração de Raios X (DRX); 3.2.3 Testes miniaturizados de toxicidade em bactérias marinhas Gram-positiva e Gram-negativas isoladas na zona costeira brasileira; 3.2.4 Testes miniaturizados de toxicidade em fungos marinhos isolados na zona costeira brasileira; 3.2.5 Teste miniaturizado de toxicidade em microalga isolada na zona costeira brasileira. 37 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Síntese dos nanomateriais Os MNMEs com ação anti-incrustante foram projetados e sintetizados pela empresa portuguesa Smallmatek, Lda. Para o processo de síntese SiNC foi preparado por uma microemulsão de óleo em água contendo o surfactante cetil brometo de trimetilamônio (CTAB), seguido por uma hidrólise e uma condensação de tetraetilortossilicato (TEOS) na interface da microemulsão. Após obter o produto precipitado, o mesmo foi filtrado e lavado com água deionizada. O encapsulamento do biocida DCOIT em SiNC foi realizado a partir de uma solução de óleo em água. Os materiais foram homogeneizados em uma solução de amônia com posterior adição do DCOIT previamente diluído em uma solução aquosa contendo xileno e CTAB. Na última etapa TEOS foi adicionado. A adesão de Ag à superfície de SiNC e SiNC-DCOIT pela exposição dos materiais à uma solução de nitrato de prata (AgNO3), seguida pela reação espontânea da redução de Ag na superfície de SiO2. Na última etapa, os compostos passaram por uma secagem de 140°C (Maia et al., 2015; Figueiredo et al., 2019). 4.2 Caracterização dos nanomateriais A caracterização dos MNMEs foi realizada em nível estrutural e morfológico (Fig. 7). Para as análises de espalhamento de luz dinâmico (DLS), potencial zeta (Pζ) e índice de polidispersão (PDI), foram preparadas dispersões coloidais (0,001, 1,0 e 10 mg·L-1) dos materiais em água Milli-Q a 35 de salinidade. 4.2.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão As caracterizações morfológicas e medida de diâmetro dos MNMEs foram realizadas utilizando o microscópio de transmissão eletrônica LEO 906E, Zeiss, Alemanha, operado a 200 kV. Para a preparação das amostras, as dispersões coloidais dos MNMEs foram depositadas por gotejamento em grades de cobre recobertas com carbono (IIett et al., 2020; Prasad et al., 2020). 38 4.2.2 Espectroscopia de raios X por dispersão em energia As razões atômicas foram obtidas por análise de energia dispersiva de raios-X (Energy Dispersive Spectroscopy - EDX ou EDS), usando um microscópio eletrônico de varredura Philips XL30, com um feixe de elétrons de 20 keV e equipado com um microanalisador EDAX DX-4. 4.2.3 Difração de Raios X A identificação das fases cristalinas presentes nas amostras ocorreu utilizando um difratômetro Rigaku, modelo Miniflex II com fonte de radiação Cu Kα (0.15406 nm), sendo utilizada para a análise uma pequena quantidade da MNMEs previamente depositada em um suporte de vidro contendo graxa de silicone. 4.2.4 Análise de tamanho de partícula, distribuição e índice de polidispersão O tamanho da partícula foi analisado por espalhamento de luz dinâmico (Dynamic Light Scattering - DLS), enquanto que, a carga foi determinada pelo potencial zeta (Pζ). Também foi determinado índice de polidispersão (Polydispersion Index - PDI). Todas as análises foram realizadas utilizando o equipamento Dynamic Light Scattering (Zetasizer Nano, ZS90). 4.3 Ensaio de toxicidade 4.3.1 Determinação de Concentração inibítória mínima e Concentração bacterida mínima As bactérias marinhas Gram-positiva Bacillus subtillis e Gram-negativa Vibrio aestuarianus e Vibrio parahaemolyticus foram previamente crescidas “overnight” em meio de cultura Brain Heart Infusion (BHI). A concentração celular foi ajustada a 1,0x105 UFC de acordo com o protocolo de Silva et al. (2007). Para o teste de determinação das concentrações inibítórias mínimas (CIM) foi utilizada a metodologia adaptada proposta por Mann e Markham (1998). Os ensaios foram realizados de forma miniaturizada, utilizando placas de 96 poços. Inicialmente todos os poços foram preenchidos com 170 μL de inóculo, com 39 salinidade ajustada a 35. A salinidade foi ajusta a partir da proporção de 35 g de sal marinho para 1 litro de meio de cultura (Marui et al.,2021). Nas colunas 1 e 2, controle positivo, foram inseridos 190 μL do meio de cultura Muller Hinton (MH), isento de ágar, com salinidade ajustada a 35. Para cada nanomaterial (SiNC, DCOIT, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag, SiNC-DCOIT-Ag) foi inserido um volume de 20 μL de dispersão coloidal nas colunas de 3 a 11, em concentrações compreendidas entre 0,001; 0,01; 0,1; 1 e10 mg·L- 1. Ao controle negativo, coluna 12, foi inserido um volume de 20 μL de solução de AgNO3, concentração 10 mg·L-1. Um volume de 10 μL de solução de resazurina a 0,01% foi adicionado a todos os poços após 24 h de incubação. A resazurina é um corante que serve como um indicador redox. Tem uma cor azul e uma baixa fluorescência intrínseca. Depois de entrar na célula, em resposta à atividade metabólica das células vivas, a resazurina é reduzida a resorufina, que tem uma cor rosa e é fluorescente. Dessa forma o corante é utilizado para identificação da viabilidade celular (Needs etal., 2021). O tempo de incubação total foi de 48 horas a 37°C. Findado este período, foi determinada a concentração mínima inibitória (CIM). Um segundo teste foi realizado de acordo com o protocolo adaptado descrito por Abbaszadeh et al. (2014) e Li et al. (2016) sendo denominado a concentração mínima biocida (CBM). Tanto CIM como CBM foram realizados em triplicata. Um segundo teste foi realizado de acordo com o protocolo adaptado descrito por Abbaszadeh et al. (2014) e Li et al. (2016) sendo denominado a CBM. Foram retirados 10 µL de cada poço com ausência de crescimento visível e transferidos para placas que continham meio ágar triptona de soja (TSA) por um período de 24 h. Após o período de incubação, foram considerados como bactericidas os compostos que inibiram 100% do crescimento do microrganismo. Tanto CIM como CBM foram realizados em triplicata. 4.3.2 Determinação de Concentração inibitória mínima e Concentração fungicida mínima Para o teste de determinação das concentrações mínimas inibitórias (CIM) foi utilizada a metodologia adaptada proposta por Mann e Markham (1998). Suspensões de esporos de fungos marinhos Penicillium citrinum IB-CLP11, Penicillium sclerotigenum IB- CLP17, Aspergillus niger IB-CLP20 e Penicillium polonicum IB-CLP22 foram preparadas com base na ABNT-NBR 14941 (2011). Os fungos foram crescidos em meio de cultura 40 Batata Dextrose Ágar (BDA) a 30°C por um período de sete dias. Após este período, foi adicionada sobre a placa 10 mL de solução salina com Tween 80. As suspensões de esporos foram transferidas para um frasco Falcon e homogeneizadas em uma plataforma agitadora a 30ºC por e 150 rpm por cinco minutos. Na sequência, as suspensões foram filtradas em algodão de vidro. As concentrações foram ajustadas com o auxílio de uma Câmara de Neubauer a 1,0x105 esporos·mL-1 em meio Batata Dextrose (BD). Os ensaios foram realizados de forma miniaturizada, utilizando placas de 96 poços. Inicialmente todos os poços foram preenchidos com 170 μL de inóculo, com salinidade ajustada a 35. Nas colunas 1 e 2, controle positivo, foram inseridos 190 μL do meio de cultura BD, isento de ágar, com salinidade ajustada a 35. Para cada nanomaterial (SiNC, DCOIT, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag, SiNC-DCOIT-Ag) foi inserido um volume de 20 μL de dispersão coloidal nas colunas de 3 a 11, em concentrações compreendidas entre 0,001-10 mg·L-1. Ao controle negativo, coluna 12, foi inserido um volume de 20 μL de solução de AgNO3, concentração 10 mg·L-1. Um volume de 10 μL de solução de Resazurina a 0,01% foi adicionado a todos os poços após 24 h de incubação. O tempo de incubação total foi de 72 horas a 30°C, findado este período, foi determinada a CIM. Um segundo teste foi realizado de acordo com o protocolo adaptado descrito por Abbaszadeh et al. (2014) e Li et al. (2016) sendo denominado a CFM. Foram retirados 10 µL de cada poço com ausência de crescimento visível e transferidos para placas que continham meio BDA por um período de 7 dias. Após o período de incubação, foram considerados como fungicidas os compostos que inibiram 100% do crescimento do microrganismo. Tanto CIM como CFM foram realizados em triplicata. 4.3.3 Determinação da densidade celular de microalga A microalga Chlorella minutissima foi cedida pelo Banco de Microrganismos Aidar & Kutner (BMAK) do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo. A cultura foi mantida no Laboratório de Micologia e Aplicações Biotecnológicas e Nanotecnológicas, em meio de cultura líquido Guillard, sob condições controladas de temperatura (23±1°C) e iluminação (fluxo de fótons de aproximadamente 70 µmol de fóton m-2s-1), com fotoperíodo de 12:12 horas (claro:escuro). Diariamente, ocorreu contagem celular com o auxílio de uma Câmara de Neubauer para a construção da curva de crescimento e determinação da fase exponencial. 41 O protocolo experimental para determinação de toxicidade em microalgas seguiu a norma ABNT NBR 12648 (2013). Este método consiste na exposição dos organismos- teste aos diferentes tratamentos, durante um período de 96 h. A toxicidade foi determinada pela inibição do crescimento da biomassa algácea nos recipientes-teste, comparado ao controle negativo, sob as mesmas condições de ensaio. 4.3.3.1 Curva de crescimento A construção da curva de crescimento foi realizada com a retirada diária de uma alíquota de 20 μL do cultivo. Com o auxílio de uma Câmara de Neubauer, as células foram contadas. O ponto anterior à entrada na fase estacionária foi determinado como o ponto de coleta do inóculo utilizado para os ensaios de toxicidade. 4.3.3.2 Curva padrão de calibração Uma curva padrão de calibração foi construída utilizando um cultivo de C. minutissima crescida até o pico da fase exponencial. Com o auxílio de uma Câmara de Neubauer, foram preparadas soluções padrão de C. minutissima nas concentrações de 2500, 5000, 10000, 20000, 40000, 80000 e 160000 cel·mL-1. Para cada solução padrão, um volume de 200 μL foi inserido individualmente em 8 poços de uma microplaca de 96 poços. Na sequência, com o auxílio de um espectrofotômetro UV-Vis, com comprimento de onda ajustado a 680 nm, foram efetuadas as leituras. Como controle negativo foi utilizado um branco com 200 μL de meio de cultura (Dubois et al., 1956). 4.3.3.3 Densidade celular Os testes de inibição de densidade celular foram realizados em microplacas de 96 poços, contendo o inóculo ajustado à densidade celular de 1,0x104 cel·mL-1 em meio de cultura Guillard. A biomassa algácea foi determinada após 24, 48, 72 e 96 horas de exposição por meio da densidade óptica das microalgas em um espectrofotômetro UV-Vis, com leitura da absorbância luminosa a 680 nm. A incubação total ocorreu em um período de 96 horas, mantendo a temperatura 23±1°C. O teste foi realizado em quadruplicata. 42 Ao final, a biomassa inicial de cada réplica das soluções-teste e controle (sem amostra tratada) foi subtraída da obtida após o período de exposição, calculando-se assim a biomassa produzida durante o ensaio. Para definir a concentração celular pela absorbância, foi utilizada a curva padrão de calibração previamente preparada, descrita no item 4.3.3.2. 4.3.3.4 Determinação da Clorofila Total Para estimar o conteúdo de clorofila total, foi necessário realizar a extração e solubilização de pigmentos em acetona e depois preparar as soluções para serem levadas ao espectrofotômetro. A clorofila foi extraída no escuro a 4°C após 96 h de uma amostra de microalgas concentrada em uma solução aquosa de acetona a 80% e determinada por medição do comprimento de onda do extrato usando um espectrofotômetro, o ensaio foi feito utilizando a solução de acetona 80% como o branco. O sobrenadante foi aspirado e as absorbâncias foram analisadas em 665 e 645 nm. As medidas de absorbância resultantes foram traduzidas para um teor de clorofila de acordo com a seguinte equação (Lichtenthaler, 1987): 𝐶𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 17,3 × 𝐴𝑏𝑠645 + 7,81 × 𝐴𝑏𝑠649 4.4 Análise estatística A inibição do crescimento (%) de cada espécie foi determinada de acordo com o método da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento (OCDE). Os valores de concentração efetiva (EC50) após 96 h foi calculado com o software GraphPad Prism v6.0 usando a equação de regressão não linear que melhor se ajusta aos dados, considerando o R2 valor, a soma absoluta dos quadrados e os intervalos de confiança de 95%. 43 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 Caracterização dos nanomateriais 5.1.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão O microscópio eletrônico de transmissão emite um feixe de elétrons sob alta tensão, a partir de uma coluna de elétrons. Os elétrons são focalizados a partir de lentes eletromagnéticas em direção à amostra, desencadeando uma interação. Essa interação permite que os elétrons que constituem o feixe produzam diferentes tipos de radiação, que são analisadas pelo detector e traduzidas como imagem para um computador acoplado. De acordo com a Figura 7 (a-d) obtidas por MET, os MNMEs possuem forma esférica e regular, apresentando o tamanho médio de 112, 136, 139 e 133 nm para SiNC, SiNC- DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag, respectivamente. Foi possível observar aglomerados de Ag provenientes do metal AgNO3 nas imagens obtidas. Figura 7. Microscopia eletrônica de transmissão dos nanomateriais: (a) SiNC; (b) SiNC-DCOIT; (c) SiNC- Ag; (d) SiNC-DCOIT-Ag. 5.1.2 Espectroscopia de energia dispersiva Os resultados indicados pela técnica de EDS são importantes, permite o mapeamento composicional e semi quantitativo de nanomateriais (Angwin et al., 2019). Como apresentado na Tabela 5, as amostras apresentaram a composição atômica prevista. (b) a) (a) (c) (c) (d) d(a ) ) 44 Tabela 5. Análise semi-quantitativa e micrografia das amostras de (a) SiNC; (b) SiNC-DCOIT; (c) SiNC- Ag; (d) SiNC-DCOIT-Ag, com ampliação de 250x. Amostra Elemento (mol%) Micrografia SiNC C O Si Total 34,39 43,28 22,33 100,00 SiNC-Ag O Si Ag Total 61,93 37,22 0,85 100,00 SiNC-DCOIT O Si Cl Zn Mo Total 59,14 37,16 2,86 0,30 0,54 100,00 SiNC-DCOIT-Ag O Si S Cl Zn Ag Total 57,22 36,24 1,79 2,88 0,73 1,14 100,00 5.1.3 Difração de Raios X A análise de difração de raios X (DRX) fornece informações detalhadas sobre a estrutura atômica e molecular das amostras, como também, posições, composições químicas, tensões na sua rede cristalina e fases cristalinas. Para a análise da amostra um feixe de raios X incide sobre o material e um detector identifica o feixe de raios que emergem da amostra. Ao interagir com a estrutura atômica do material, o feixe é difratado pelos átomos e a informação é processada e repassada para um computador acoplado. O resultado do DRX é importante para compreender tanto as posições, como as intensidades dos efeitos de difração, é uma propriedade física fundamental dos (a) (b) (a) (c) (c) (d) d(a ) ) 45 materiais, servindo para rápida identificação e entendimento completo de sua estrutura (Chirayil et al., 2017). De acordo com a Figura 8 o pico de difração em 2ɵ =25º é proveniente da sílica, sendo observada em todos os difratogramas de raios X. Nas composições de SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag é possível observar os padrões característicos da Ag. De acordo com o DRX existem dois picos distintos correspondendo às reflexões (111) e (220) que confirmam a estrutura cúbica de face centrada da Ag. Figura 8. Difratogramas de raios X de SiNC, SiNC-Ag, SiNC-DCOIT e SiNC-DCOIT-Ag. 5.1.4 Tamanho de partícula, distribuição e índice de polidispersão A técnica DLS, é utilizada para obter a medida do diâmetro hidrodinâmico das partículas nanométricas em suspensão. A técnica se baseia em dois conceitos que se relacionam com as partículas presentes no meio: o movimento browniano e o espalhamento de luz. As partículas e moléculas em suspensão estão em constante movimento, este movimento constante e aleatório é chamado de movimento browniano, é induzido por um constante bombardeamento de moléculas do solvente, que estão se movendo, devido à sua energia térmica. O espalhamento de luz acontece quando um laser emite uma iluminação em direção a partícula ou molécula, estas espalham a radiação em todas as direções e a partir disso, a flutuação da intensidade de luz fornece informações sobre o coeficiente de difusão da partícula e do seu diâmetro hidrodinâmico para um detector. O diâmetro hidrodinâmico pode variar de 1 a 2000 nm, fornece SINC SINC-Ag SINC-DCOIT SINC-DCOIT-Ag 46 informações como intensidade, tamanho e área de contato superficial de uma partícula em uma suspensão (Fig. 9) (Chirayil et al., 2017). Figura 9. A imagem representa o diâmetro hidrodinâmico formado, analisado pela técnica DLS (Espalhamento de Luz Dinâmico). Fonte: Adaptado de Guivar (2015). A medição no instrumento de DLS, se inicia com um laser monocromático com um comprimento de onda de 633 nm, a luz emitida converge para um centro focal na amostra por meio de uma lente de focalização. A luz é espalhada pelas partículas em todos os ângulos e direções. O DLS detecta este espalhamento para um ângulo fino. As flutuações de intensidade de luz espalhadas são convertidas em pulsos elétricos, os quais são alimentados a um correlacionador digital. O correlacionador gera uma função de autocorrelação, a partir da qual se relaciona com o coeficiente de difusão das partículas, e estes, por sua vez, com o tamanho das partículas (Chirayil et al., 2017). O diâmetro hidrodinâmico obtido por DLS (Tab. 6) indica que o tamanho dos nanomateriais analisados variaram entre 205,72 a 252,50 nm. A diferença de tamanho obtida por DLS em comparação aos determinados por MET decorre do fato de que os nanomateriais estão em meio líquido e em contínuos deslocamentos aleatórios denominados de movimento Browniano. Em acréscimo, os diâmetros de SINC e SINC- DCOIT são similares, enquanto que, com a adesão de Ag, ocorreu um incremento no diâmetro, variando entre 220 a 230 nm, respectivamente. Segundo Letzel et al. (2018), os valores obtidos são influenciados pelo revestimento metálico incorporado. 47 Tabela 6. Caracterização das amostras de SiNC, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag (ø =129, 152, 134 and 125 nm para SiNC, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag, respectivamente) Amostra Concentração (mg·L-1) DLS (nm) (Pζ) PDI SiNC 0,001 203,37 30,90 0,45 0,1 210,33 27,23 0,50 10 226,21 29,34 0,55 SiNC-DCOIT 0,001 202,67 12,15 0,58 0,1 206,12 11,26 0,44 10 231,11 13,93 0,52 SiNC-Ag 0,001 220,30 -29,09 0,51 0,1 232,80 -30.95 0,56 10 246,45 -28,99 0,50 SiNC-DOIT-Ag 0,001 225,72 -25,22 0,49 0,1 239,33 -23,13 0,51 10 251,50 -25,34 0,54 O Pζ é uma técnica utilizada para prever e controlar a estabilidade de suspensões ou emulsões coloidais. A maioria dos MNMEs em contato com um líquido adquirem uma carga elétrica em sua superfície, isso acontece devido a dissociação, ionização de grupos funcionais na superfície da partícula e pela adsorção diferencial de íons da solução na superfície. Essa carga afeta a distribuição de íons na vizinhança, aumentando a concentração de contra-íons junto à superfície formando-se uma dupla camada elétrica na interface da partícula com o líquido. A dupla camada elétrica formada se divide na região interna, que inclui íons ligados à superfície e a região externa, onde a distribuição dos íons é determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Essas regiões em conjunto com a superfície da partícula, geram diferentes potenciais a serem analisados como o potencial de superfície, potencial stern e potencial zeta (Fig. 10). A partir desses potenciais é possível analisar a estabilidade das partículas no meio encontrado e entender seu estado de agregação, precipitação e coagulação (Clogston e Patri, 2010; Ahmadi et al., 2011). 48 Figura 10. A imagem representa a dupla camada formada e os diferentes potenciais de superfícies que podem ser analisados para identificar a estabilidade dos nanomateriais pela técnica Pζ (Potencial Zeta). Fonte: Adaptado de Guivar (2015). Esse potencial pode ser determinado a partir da correlação da carga efetiva das partículas com a repulsão eletrostática e estabilidade da suspensão. Para a medição do potencial é realizada a laser doppler electrophoresis, um campo elétrico é aplicado na amostra, e as partículas com carga irão migrar para o eletrodo de carga oposta com uma velocidade proporcional a magnitude da sua carga, essa velocidade da carga está relacionada ao Pζ. A amostra é colocada em cubetas com a presença de 2 eletrodos, um positivo e um negativo, é aplicado uma carga elétrica e as partículas migram para o eletrodo de carga oposta. Um feixe de laser passa através da amostra na célula capilar durante a eletroforese e o espalhamento de luz do movimento da partícula tem a frequência mudada, a mudança da frequência é relacionada a velocidade que as partículas migram. A partir disso, quanto maior o Pζ, mais provável que a suspensão seja estável, pois as partículas carregadas se repelem umas às outras e essa força supera a tendência natural à agregação. A partir disso, a alta estabilidade é identificada quando o valor de Pζ é menor do que -30mV ou maior do que +30mV (Clogston e Patri, 2010; Ahmadi et al., 2011). O PDI é utilizado para descrever informações sobre a homogeneidade da distribuição dos MNMEs, dessa forma quanto maior o valor indicado, maior a distribuição e dispersão de tamanhos dos materiais, ou seja, maior a variedade de tamanhos diferentes ou polidispersão dos MNMEs. A partir disso, a faixa de 0 a 0,05 de PDI indica uma população monodispersa, a faixa de 0,05 a 0,08 população quase monodispersa, 0,08 a 49 0,3, população com baixa polidispersividade, 0,3 a 0,6, população com média polidispersividade e acima de 0,7, população muito polidispersa. Devido à mutabilidade presentes em processos de fabricação, raramente se consegue a monodispersão dos produtos, mas ainda sim, é ideal que o PDI tenha valor mais próximo ao 0, população monodispersa, respectivamente (Chirayil et al., 2017). O índice de polidispersividade (PDI) obtido foi entre 0,44 e 0,58 indicando polidispersividade média. O valor do potencial Zeta (Pζ) de superfície de SINC e SINC- DCOIT, enquanto que, SINC-Ag e SINC-DCOIT-Ag apresentaram superfícies negativas em meio aquoso. Considerando o elevado valor em módulo do Pζ e polidispersividade média, a tendência destes MNMEs se agregarem é baixa. Algumas dessas características vistas durante a caracterização, também foram observadas por Saman et al. (2020) que caracterizou SINC e observou seus aglomerados em formato “cauliflower”. De acordo com o estudo, esse fenômeno ocorre pela capacidade de adsorção desses nanomateriais. Esses agrupamentos formam partículas volumosas que influenciam diretamente a polidispersão e estabilidade. A caracterização físico-química dos MNMEs é imprescindível, uma vez que, permite relacionar seus efeitos no meio e, consequentemente, nos mais diversos organismos. Portanto, para estudos de toxicidade esse processo é de extrema importância para compreender e aplicar esses ensaios (Khan et al., 2019). 5.2 Ensaio de Toxicidade 5.2.1 Determinação de Concentração inibitória mínima e Concentração bactericida mínima A tabela 7 apresenta a atividade antibacteriana dos MNMEs e seus precursores contra bactérias isoladas da zona costeira brasileira. Dentre as bactérias selecionadas para o estudo, apenas Bacillus subtilis apresentou inibição em seu crescimento, efeito bacteriostático. quando exposta a SiNC na concentração de 10 mg·L-1. Por sua vez, o biocida DCOIT na forma livre, em concentração de 1 mg·L-1, apresentou ação bacteriostática. Após 24 horas, o DCOIT perdeu a capacidade de inibir o crescimento de todas as espécies. DCOIT na concentração de 10 mg·L-1, foi bactericida para todas as espécies. De acordo com os resultados obtidos, o DCOIT encapsulado não apresentou o mesmo comportamento detectado no ensaio com DCOIT na forma livre. Michailidis et al. (2020) destaca que o DCOIT interage covalentemente com a superfície de SiNC, 50 permitindo que essa interação forneça propriedades ANTIN para as formulações de revestimento, prolongando seu desempenho ANTIN. Tabela 7. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração biocida mínima (CBM) das amostras de NCs SiNC, DCOIT, Ag, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag contra Bacillus subtillis, Vibrio aestuarianus e Vibrio parahaemolyticus. “nd”: não determinado. NC-Anti-IN (mg·L-1) B. subtilis V.aestuarianus V.parahaemolyticus CIM CBM CIM CBM CBM CBM SiNC 10 nd nd nd nd nd DCOIT 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 Ag nd ≥1 nd ≥1 nd ≥1 SiNC-DCOIT 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 SiNC-Ag 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 SiNC-DCOIT-Ag 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 A prata é reconhecida pela ação antimicrobiana e apresentou ação bactericida para todas as espécies a partir da concentração de 1 mg·L-1. Isso pode ser justificado, pois este material na forma ionizada é altamente reativo e se liga às proteínas do tecido promovendo mudanças estruturais na parede celular bacteriana e na membrana nuclear levando à distorção celular e morte. Ag também se liga ao DNA e RNA bacteriano por meio de desnaturação e inibição da replicação bacteriana (Pugazhendhi et al. 2018). O uso de Ag em escala nanométrica é hoje considerado uma das estratégias mais promissoras no combate à formação de biofilme. As dispersões coloidais dos nanocontentores SiNC-DCOIT, SINC-Ag e SiNC- DCOIT-Ag apresentaram efeito bacteriostático na concentração de 1 mg·L-1. Foi observado, efeito bactericida nas espécies B. subtilis, V. estuarinos e V. parahaemolyticus na concentração de 10 mg·L-1. Resultados similiares também foram observados por Maia et al. (2015). Maia et al. (2015) expuseram a bactéria E. coli ao biocida DCOIT na forma livre e encapsulada, SiNC -COIT. De acordo com os resultados obtidos, após 45 minutos de exposição, o DCOIT na forma livre apresentou Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 16 ppm, enquanto que, para SiNC-DCOIT a Concentração Biocida Mínima (CBM) foi igual a 80 ppm. A baixa toxicidade de SiNC também foi obsevada por Erdinçmer e Sponza (2020) avaliaram a atividade antimicrobiana de SiO2NP sobre o gênero Vibrio sp. De acordo 51 com o estudo, a bactéria Vibrio fischeri apresentou resistência ao material, EC50= 31,457 mg·L-1. Os autores observaram que as bactérias Gram-negativas são mais resistentes em comparação à bactéria Gram-positiva. Resultados similares foram obtidos com Yusof et al. (2020) utilizando a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus e a Gram- negativa E. coli. Segundo Sirelkhatim et al. (2015) a parede celular das bactérias Gram- positivas possui uma membrana citoplasmática com multicamadas de polímero de peptidoglicano e uma parede celular mais espessa, enquanto que, as bactérias Gram- negativas são compostas por duas membranas celulares, uma membrana externa e uma membrana plasmática com uma fina camada de peptidoglicano. Durante os experimentos não foi detectada alteração de pH. 5.2.2 Determinação de Concentração inibitória mínima e Concentração fungicida mínima Em todas as concentrações selecionadas para o estudo (Tabela 8), o nanocontentor SiNC não comprometeu a viabilidade das espécies fúngicas. O efeito antibacteriano de SiNC observado sem comprometer células eucariotas também foi observado por Fellahi et al. (2013) que avaliaram a atividade antibacteriana de substratos de nanofios de Si com incorporação de Ag e Cu. De acordo com os resultados, as nanoestruturas apresentaram forte toxicidade contra E. coli. Contudo, foi também observado que nanofios de sílica com Ag incorporada são biocompatíveis a células eucariotas. Su et al. (2010) observaram também uma elevada atividade antibacteriana de nanofios a base de Si com biocompatibilidade a células eucariotas. Esses estudos sinalizam a possibilidade do desenvolvimento composto a base de sílica, especialmente em escala nanométrica com Ag incorporada com um bom potencial para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos aplicados a diversas áreas (Malarkodi et al., 2014). O DCOIT, em concentração de 1 mg·L-1, apresentou ação fungistática. Após 24 horas de exposição, as espécies Penicillium citrinum, IB-CLP11, Aspergillus niger IB- CLP20 e Penicillium polonicum IB-CLP22 apresentaram crescimento. Enquanto que, o biocida na concentração de 10 mg·L-1 foi fungicida para todas as espécies. A utilização do corante rezasurina permitiu que fosse observado a perda das propriedades do DCOIT durante o experimento. Comparando com o DCOIT encapsulado, foi observado que o 52 mesmo não perdeu sua atividade, sendo liberado gradativamente e retendo sua efetividade por um maior período de tempo. Tabela 8. Concentração inibitória mínima (CIM) das amostras de NCs SiNC, DCOIT, Ag, SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag contra Penicillium citrinum IB-CLP11, Penicillium clerotigenum IB- CLP17, Aspergillus niger IB-CLP20 e Penicillium polonicum IB-CLP22. “nd”: não determinado. NC-Anti-IN (mg·L-1) Penicillium citrinum Penicillium clerotigenum Aspergillus niger Penicillium polonicum CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM SiNC nd nd nd nd nd nd nd nd DCOIT 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 Ag nd ≥1 nd ≥1 nd ≥1 nd ≥1 SiNC-DCOIT 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 SiNC-Ag 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 SiNC-DCOIT-Ag 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 1 ≥10 A prata em concentração de 1 mg·L-1, apresentou ação fungicida para todas as espécies. É sabido que compostos