ELISANGELA JERONYMO STIPP BRAMBILLA ���������� �� ������������������ �������� �������� �� ������������������ �������� �������� �� ������������������ �������� �������� �� ������������������ �������� �� ���� ����� ����� ����� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������� TESE DE DOUTORADO Botucatu 2008 ELISANGELA JERONYMO STIPP BRAMBILLA “DUPLA INERVAÇÃO MUSCULAR COM NEURORRAFIA TÉRMINO-LATERAL: ESTUDO EM RATOS” Orientador: Prof. Dr. Fausto Viterbo Botucatu 2008 Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Bases Gerais da Cirurgia. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP Bibliotecária responsável: Selma Maria de Jesus Stipp Brambilla, Elisangela Jeronymo. Dupla inervação muscular com neurorrafia término-lateral: estudo em ratos / Elisangela Jeronymo Stipp Brambilla. – Botucatu : [s.n.], 2009. Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2009 Orientador: Fausto Viterbo Assunto CAPES: 40102084 1. Paralisia facial - Cirurgia - Estudos experimentais 2. Eletrofisiologia 3. Nervos - Enxerto CDD 617.52 Palavras chave: Eletrofisiologia; Histologia; Neurorrafia término-lateral; Nervo periférico; Ratos ELISANGELA JERONYMO STIPP BRAMBILLA “DUPLA INERVAÇÃO MUSCULAR COM NEURORRAFIA TÉRMINO-LATERAL: ESTUDO EM RATOS” COMISSÃO JULGADORA TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR Presidente e orientador: Prof. Dr. Fausto Viterbo 2o. Examinador: Dr. José Carlos Marques de Faria 3o. Examinador: Dr. Amilton Antunes Barreira 4o. Examinador: Dr. José Antonio Garbino 5o. Examinador: Dra. Suzana Fabíola Müeller Botucatu, 17 de fevereiro de 2009. DEDICATÓRIA ��� ���� ��������������� ���������������� �������� ���������������������� ���� !� ���"� “Menininha não cresça mais não, Fique pequenininha na minha canção.” (Toquinho) � � #��������� ���# ���� ���� ����� ����� �� ������� ����� ����� �� � �� �� ���� ���������$�� �� ������� ����� ���� �"� “Foi a tua mão que encontrei estendida, quando realmente precisei de um amigo. Foram teus olhos que fixei, quando me senti só. Tuas palavras me orientaram, mostrando o caminho correto, que eu não encontrava. Teu sorriso consolou-me. Sua força interior era tudo que precisava.” (Desconhecido) � � AGRADECIMENTOS � � #%����� �� ���� A realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta ou indireta de muitas pessoas. Manifesto minha gratidão a todas elas e de forma particular: Ao Curso de Pós-Graduação em Bases Gerais da Cirurgia da Faculdade de Medicina de Botucatu por permitir o desenvolvimento deste projeto; Aos Departamentos de Cirurgia e Ortopedia e de Urologia por possibilitarem a realização deste trabalho cedendo suas dependências e equipamentos; A todos os funcionários do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu em especial: à Maria Cecília Salgado Mercadante por ensinar-me a técnica de neurorrafia, essencial neste trabalho; e à Irene Spago pelo auxílio técnico durante as cirurgias, convívio que possibilitou o nascimento de uma grande amizade; A todos os funcionários do Departamento de Urologia em especial ao José Lucas de Carvalho por todo o auxílio na confecção das lâminas histológicas; Ao Biotério Central da UNESP por fornecer os animais utilizados neste estudo; Aos funcionários da Seção de Pós-graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu Janete, Andrea, Lilian, Nathanael e Regina por todo auxílio, dedicação e atenção sempre que necessitei; AGRADECIMENTOS À secretária do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia, Simone Barroso Corvino Camargo. Ao Serviço de Biblioteca e Documentação da UNESP, Campus de Botucatu, pelo auxílio na localização de artigos científicos. A Selma Maria de Jesus pela elaboração da ficha catalográfica; À Rosangela e à Malu, do ponto de apoio da FAPESP, por toda dedicação ao tirar dúvidas e resolver problemas relacionados aos relatórios e prestações de contas; Aos colegas de curso Susana Fabíola Mueller, Adriana Maria Romão e Fábio José Reis que muitas vezes tornaram mais agradável a permanência no laboratório. Aos funcionários do GAP – Grupo de Apoio à Pesquisa, em especial à Liciana pelo auxílio na análise; À FAPESP – Fundo de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro; Os meus sinceros agradecimentos. AGRADECIMENTOS #%����� �� ��������� � �� Aos meus pais Flavio e Ana Maria por todo o amor, dedicação, por toda ajuda prestada nos momentos necessários, pelo exemplo de honestidade e retidão responsável pela formação do meu caráter. “Os nossos pais amam-nos porque somos seus filhos, é um fato inalterável. Nos momentos de sucesso, isso pode parecer irrelevante, mas nas ocasiões de fracasso, oferecem um consolo e uma segurança que não se encontram em qualquer outro lugar.” (Bertrand Russell) Ao Prof. Dr. Fausto Viterbo pela orientação que muito influenciou meu crescimento pessoal e maturidade profissional. “Por mim continuaria aqui a conversar, Com o mestre há sempre muito a aprender e estudar. Amanhã já da Páscoa, aproveitando a vinda, Permites que formule outras questões ainda? Com muito esforço estou me dedicando a estudo, Muito já sei, porém, almejo saber tudo.” (JW Goethe) Acima de tudo, a Deus por ter dado vida e saúde a mim e a todos os que me ajudaram na realização deste trabalho, A mais profunda gratidão. “Qualquer trabalho científico, qualquer descoberta, qualquer invenção é um trabalho universal. Ele está condicionado, em parte pela cooperação de contemporâneos, em parte pela utilização do trabalho de seus predecessores.” K. Marx PRÓLOGO PRÓLOGO Durante realização do nosso curso de Pós-Graduação em Bases Gerais da Cirurgia, Área: Agressão, Reparação, Regeneração e Transplante de Tecidos e de Órgãos junto ao Laboratório Experimental de Cirurgia e Ortopedia, da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, participamos de várias atividades de pesquisa desenvolvidas, as quais permitiram a divulgação parcial dos resultados em Congressos e/ou enviados para publicações em anais e revistas, conforme indicado abaixo: TRABALHOS APRESENTADOS EM REUNIÕES CIENTÍFICAS STIPP EJ, ROMÃO AM, GARBINO JA, VITERBO F, SALGADO MH. Standardization of Neuro-physiological tests on the rat sciatic nerve. 9º International Microsurgery Symposium, promovido pela Disciplina de Cirurgia Plástica da FMB, UNESP, Botucatu, realizado na Clínica de Cirurgia Plástica Dr. Fausto Viterbo nos dias 20 e 21 de outubro de 2005. STIPP EJ. Bases gerais da EMG na experimentação. Curso de Regeneração de nervo periférico – aspectos cirúrgicos e experimentais, na X Semana da Bio, realizado no Instituto de Biociências da UNESP Campus de Botucatu, nos dias 18, 19 e 20 de Agosto de 2006. STIPP EJ, VITERBO F. Dupla inervação muscular com neurorrafia término-lateral. Estudo em ratos. Curso de Regeneração de nervo periférico – aspectos cirúrgicos e experimentais, na X Semana da Bio, realizado no Instituto de Biociências da UNESP – Campus de Botucatu, nos dias 18, 19 e 20 de Agosto de 2006. PRÓLOGO STIPP EJ, VITERBO F, LABBÉ D, GARBINO JA. Analysis of tibial cranial muscle after muscular double innervation with end-to-side neurorrhaphy. III Encontro de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, realizado no período de 20 a 22 de setembro de 2007. STIPP EJ, VITERBO F, LABBÉ D, GARBINO JA. Double muscular innervation with end-to-side neurorrhaphy. Experimental study in rats. 10th International Microsurgery Symposium, promovido pela Disciplina de Cirurgia Plástica da Faculdade de Medicina, UNESP – Botucatu, realizado nos dias 19 e 20 de Setembro de 2008. TRABALHOS PUBLICADOS EM REVISTAS ROMÃO AM, VITERBO F, STIPP E, GARBINO JA, RODRIGUES JA. Muscle electro stimulation of the cranial tibial muscle after crushing of the common fibular nerve: neurophysiologic and morphometric study in rats. Revista Brasileira de Ortopedia 2007; 42(3): 41-6. STIPP EJ, VITERBO F, LABBÈ D, GARBINO JA. Analysis of tibial cranial muscle after muscular double innervation with end-to-side neurorrhaphy. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases 2007, 13(4): 911. ROMÃO AM, VITERBO F, STIPP EJ, GARBINO JA, RODRIGUES JA. Electro-stimulation of the tibial cranial muscle after fibular nerve crushing: study in rats. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases 2007, 13(4): 897. PRÓLOGO TRABALHOS ENVIADOS PARA PUBLICAÇÃO EM REVISTAS VITERBO F, ARM AH, STIPP EJ, REIS FJ. End to side neurorrhaphy: past, present and future. Reconstructive Microsurgery Supplement. STIPP EJ, ROMÃO AM, GARBINO JA, VITERBO F, SALGADO MH. Effect of nerves and muscles exposition in neuro-physiological tests in rats. RESUMO RESUMO Várias técnicas são utilizadas para o tratamento da paralisia facial, entre elas o enxerto de nervo transfacial e a transposição muscular. Estas técnicas foram associadas utilizando neurorrafia término-terminal (NTT) para tornar o músculo temporal duplamente inervado, porém, a secção de nervos saudáveis pode levar à atrofia ou enfraquecimento muscular. Os objetivos deste trabalho foram analisar a ocorrência da dupla inervação muscular através da neurorrafia término-lateral (NTL), avaliar a imediata inervação muscular através da NTL, evitando atrofia muscular e avaliar a ocorrência de degeneração Walleriana no segmento distal à NTL no nervo receptor. Foram utilizados 140 ratos Wistar divididos em sete grupos experimentais. O G1 foi o grupo controle de normalidade e o G2 o controle de desnervação. Em 80 ratos foi realizada a dupla inervação muscular (DIM) suturando o segmento proximal do nervo tibial (NT) na lateral intacta do nervo fibular comum (NFC). Estes ratos foram divididos em quatro grupos: G3 no qual os animais foram sacrificados após 120 dias; G4 onde 120 dias após a realização da DIM, o NFC foi seccionado proximal à NTL, estes animais foram sacrificados após 30 dias da secção; no G5 os animais foram sacrificados após 150 dias; no G6 120 dias após a realização da DIM, o NFC e o NT foram seccionados proximalmente à NTL e os animais foram sacrificados após 30 dias das secções; e no G7 o nervo fibular comum foi seccionado e, após 30 dias, o segmento proximal do NT foi suturado à lateral do coto distal do NFC e os animais foram sacrificados 120 dias após a NTL. Após realização dos testes da marcha e eletrofisiológico, os músculos tibiais craniais direitos (MTCD) foram removidos e pesados e os segmentos de nervo de interesse também foram coletados. Foram realizadas análises histomorfométricas das fibras do MTCD e fibras nervosas. Os resultados obtidos demonstraram que não houve alteração histológica do MTCD nos grupos de DIM; houve diminuição do diâmetro axonial nos segmentos de NFC distais à NTL no G3, G5 e G7. Os resultados obtidos no G4 mostraram que o NT não manteve a inervação muscular após a secção do NFC, observando-se atrofia das fibras musculares. Os resultados do teste eletrofisiológico e de diâmetro mínimo no G4 confirmaram a reinervação do NFC distal à NTL, após ocorrência de degeneração Walleriana. Foi observado no NT, proximal à NTL, diminuição do diâmetro mínimo axonial, indicando a ocorrência de degeneração da fibra axonial. Constatamos, pela primeira vez, a degeneração que ocorre quando o coto proximal de um nervo seccionado é RESUMO suturado à lateral de um nervo normal ou em degeneração. Algum fator deve ser liberado, causando a degeneração das fibras do coto proximal do nervo seccionado. Os resultados permitiram concluir que a DIM não ocorreu através da NTL; o NT não foi capaz de manter a inervação do MTCD após secção do NFC proximal à NTL; houve degeneração Walleriana do segmento de nervo distal à NTL e ocorrência de reinervação do NFC pelo NT. Palavras chave: Eletrofisiologia; Histologia; Neurorrafia término-lateral; Nervo periférico; Ratos ABSTRACT ABSTRACT Among several techniques for facial palsy treatment, we have the transfacial nerve graft and the muscular transposition. Nowadays, these methods were associated using end–to–end neurorraphy (EEN). Even though the temporalis muscle became double innervated, the health nerve section possibly leads the muscular atrophy or even its weakness. The aim of this study was to analyze, through end-to-side neurorrhaphy (ESN), the double innervation of the muscle, the immediately muscular innervation and also evaluate the Wallerian degeneration occurrence in the distal segment of receptor nerve. One hundred forty Wistar rats were divided in seven experimental groups, 20 animals per group. The G1 was the sham group; G2 the control dennervation group. In 80 rats the double muscular innervations (DMI) was performed, the proximal segment of tibial nerve (TN) was sutured laterally to the intact peroneal nerve (PN). These 80 rats were divided in four groups: in G3 the animals were killed after 120 days; in G4, post 120 days, the peroneal nerve was cut proximal the ESN and after more 30 days the animals were killed; in the group G5 the rats were killed after 150 days; in G6 post 120 days, the peroneal and also the tibial nerves were cut proximal to the ESN and the animals were killed 30 days after the second surgery. Finally in the G7 the fibular nerve was sectioned and after 30 days, the proximal end of tibial nerve was sutured laterally to the peroneal distal stump. These rats (G7) were killed 120 days post ESN. The animals were submitted to walking track analysis and electrophysiological tests. After that, the right tibial cranial muscle (RTCM) was removed and the aim nerve segments were collected and weighted. The rats were killed with high doses of intraperitoneal sodium pentobarbital. Histomorphometrical analysis of TCM and nervous fiber was performed. The results showed no histological RTCM alterations in DMI groups; the nerve fiber diameter was smaller at PN distal to the ESN in G3, G5 and G7. In G4 the results showed that TN did not keep the muscle innervations after PN section, leaded up to muscle fibers atrophy. The electrophysiological test and minor diameter results in G4 confirmed the PN reinnervation, after the Wallerian degeneration of the nerve fibers occurrence. An axonal diameter reduction was observed in the TN, proximal to the ESN, which suggest a nerve fiber degeneration. Probably, for the first time, we detect a phenomenon that occurs when the proximal stump is sutured at the side of a normal or degenerating nerve. Some factor may be released promoting the degeneration of the axonal proximal stump. The results allowed the following conclusions: the double muscular innervations did not occur through ESN, the TN did not keep the RTCM innervations after PN section proximal to the ESN, there is Wallerian degeneration of the nerve fibers in the segment distal to ESN and finally, the reinnervation occurred in the PN through ESN. Key words: Electrophisiology; Histology; End-to-side-neurorrhaphy; peripheral nerve; rats LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Esquema da cirurgia realizada no G1 45 Figura 2 – Esquema da cirurgia realizada no G2 46 Figura 3 – Esquema da cirurgia realizada no G3 46 Figura 4 – Esquema da cirurgia realizada no G4 47 Figura 5 – Esquema da cirurgia realizada no G5 47 Figura 6 – Esquema da cirurgia realizada no G6 48 Figura 7 – Esquema da cirurgia realizada no G7 49 Figura 8 – Esquemas das cirurgias realizadas nos grupos G1, G2, G3, G4, G5, G6 e G7 50 Figura 9 – Teste da marcha (walking track analysis) 51 Figura 10 – Medidas realizadas para cálculo do índice funcional do nervo ciático (IFC) e do índice funcional do nervo fibular comum (IFFC) 52 Figura 11 – Exemplo de teste para os quais foram atribuídos os valores arbitrários de ETOF, NTOF, EPL, ETS, EIT 53 Figura 12 – Teste eletrofisiológico 54 Figura 13 – Músculo tibial cranial e segmentos de nervo coletados e enviados para histologia conforme grupo experimental 56 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 14 – Escolha do corte histológico e das 10 imagens, de diferentes campos, salvas para posterior medida de área e menor diâmetro das fibras musculares 57 Figura 15 – Escolha aleatória de cinco fibras musculares em uma mesma imagem 58 Figura 16 – Processamento histológico dos segmentos de nervo (N1, N2 e N3) em resina Araldite® 60 Figura 17 – Seleção das fibras axoniais para medidas de área axonial, diâmetro axonial e área da bainha de mielina 62 Figura 18 – Massa dos ratos (g) 63 Figura 19 – Índice funcional do nervo ciático 64 Figura 20 – Índice funcional do nervo fibular comum 65 Figura 21 – Amplitude (mV) antes da secção e antes do sacrifício no G4 66 Figura 22 – Latência (ms) antes da secção e antes do sacrifício no G4 67 Figura 23 – Amplitude (mV) antes das secções e antes do sacrifício no G6 67 Figura 24 – Latência (ms) antes das secções e antes do sacrifício no G6 68 Figura 25 – Amplitude (mV) antes da NTL e antes do sacrifício no G7 68 Figura 26 – Latência (ms) antes da NTL e antes do sacrifício no G7 69 Figura 27 – Amplitude (mV) 70 Figura 28 – Latência (ms) 70 Figura 29 – Massa do músculo tibial cranial (g) 72 Figura 30 – Área das fibras do músculo tibial cranial direito (μm2) 73 Figura 31 – Diâmetro mínimo das fibras do músculo tibial cranial direito (μm) 74 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 32 – Fibras do músculo tibial cranial direito 77 Figura 33 – Densidade axonial (axônio/μm²) no segmento de nervo N1 78 Figura 34 – Área do axônio (μm²) no segmento de nervo N1 79 Figura 35 – Diâmetro mínimo do axônio (μm) no segmento de nervo N1 79 Figura 36 – Área da bainha de mielina (μm²) no segmento de nervo N1 80 Figura 37 – Imagens representativas do segmento de nervo N1 dos grupos G1, G2, G3, G4, G5, G6 e G7 82 Figura 38 – Densidade axonial (axônio/μm²) no segmento de nervo N2 83 Figura 39 – Área do axônio (μm) no segmento de nervo N2 84 Figura 40 – Diâmetro mínimo do axônio (μm) no segmento de nervo N2 84 Figura 41 – Área da bainha de mielina (μm²) no segmento de nervo N2 85 Figura 42 – Imagens representativas do segmento de nervo N2 dos grupos G1, G3, G4, G5, G6 e G7 87 Figura 43 – Densidade axonial (axônio/μm²) no segmento de nervo N3 88 Figura 44 – Área do axônio (μm²) no segmento de nervo N3 89 Figura 45 – Diâmetro mínimo do axônio (μm) no segmento de nervo N3 90 Figura 46 – Área da bainha de mielina (μm²) no segmento de nervo N3 91 Figura 47 – Imagens representativas do segmento de nervo N3 dos grupos G3, G4, G5, G6 e G7 92 Figura 48 – Densidade axonial (axônio/μm2) nos segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G3 93 Figura 49 – Diâmetro mínimo axonial (μm) nos segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G3 93 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 50 – Densidade axonial (axônio/μm2) nos segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G5 94 Figura 51 – Diâmetro mínimo axonial (μm) nos segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G5 95 Figura 52 – Densidade axonial (axônio/μm2) nos segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G7 96 Figura 53 – Diâmetro mínimo axonial (μm) nos segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G7 96 Figura 54 – Esquemas dos trabalhos de Battista et al. (1981); Al-Qattan (2000); Aszmann et al. (2003); Furukawa et al. (2008) 115 LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Massas iniciais e finais dos ratos 64 Tabela 2 – Índice funcional do nervo ciático 65 Tabela 3 – Índice funcional do nervo fibular comum 66 Tabela 4 – Amplitude e latência antes da secção/NTL ou do sacrifício nos grupos G4, G6 e G7 69 Tabela 5 – Teste eletrofisiológico: comparação entre os grupos 71 Tabela 6 – Massa do músculo tibial cranial 72 Tabela 7 – Análise morfométrica do músculo tibial cranial direito 74 Tabela 8 – Resultados obtidos nos testes funcionais e morfometria das fibras musculares 75 Tabela 9 – Densidade axonial no segmento de nervo N1 78 Tabela 10 – Análise morfométrica dos axônios do segmento de nervo N1 80 Tabela 11 – Área da bainha de mielina do segmento de nervo N1 81 Tabela 12 – Densidade axonial no segmento de nervo N2 83 Tabela 13 – Análise morfométrica dos axônios do segmento de nervo N2 85 Tabela 14 – Área da bainha de mielina do segmento de nervo N2 86 Tabela 15 – Densidade axonial no segmento de nervo N3 88 Tabela 16 – Análise morfométrica dos axônios do segmento de nervo N3 90 Tabela 17 – Área da bainha de mielina do segmento de nervo N3 91 LISTA DE TABELAS Tabela 18 – Comparação entre os segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G3 94 Tabela 19 – Comparação entre os segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G5 95 Tabela 20 – Comparação entre os segmentos de nervo N1 e N3 no grupo G7 96 Tabela 21 – Resultados da morfometria das fibras nos segmentos de nervo N1, N2 e N3 98 SUMÁRIO SUMÁRIO LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE TABELAS Resumo Abstract 1. INTRODUÇÃO 24 1.1. Anatomia do nervo 24 1.2. Lesão do nervo 25 1.3. Regeneração de nervo 27 1.4. Técnicas de Reparo Cirúrgico 29 1.5. Paralisia facial 35 2. OBJETIVOS 43 3. MÉTODO 44 3.1. Animais 44 3.2. Cirurgia 44 3.3. Testes realizados 51 3.4. Coleta das peças histológicas e sacrifício 55 3.5. Processamento histológico do músculo tibial cranial 56 3.6. Processamento histológico dos segmentos de nervo 58 3.7. Análise Estatística 62 4. RESULTADOS 63 4.1. Massa corporal 63 4.2. Teste de avaliação da marcha 64 4.3. Teste eletrofisiológico 66 4.4. Massa do músculo tibial cranial 71 4.5. Análise morfométrica do músculo tibial cranial 73 SUMÁRIO 4.6. Análise morfológica do músculo tibial cranial 76 4.7. Análise morfométrica do segmento de nervo N1 76 4.8. Análise morfológica do segmento de nervo N1 81 4.9. Análise morfométrica do segmento de nervo N2 83 4.10. Análise morfológica do segmento de nervo N2 86 4.11. Análise morfométrica do segmento de nervo N3 88 4.12. Análise morfológica do segmento de nervo N3 91 4.13. Comparação entre os segmentos de nervo N1 e N3 no G3 93 4.14. Comparação entre os segmentos de nervo N1 e N3 no G5 94 4.15. Comparação entre os segmentos de nervo N1 e N3 no G7 95 5. DISCUSSÃO 99 5.1. Teste da Marcha 103 5.2. Teste Eletrofisiológico 105 5.3. Análise do músculo tibial cranial 107 5.4. Análise dos segmentos de nervo N1, N2 e N3 110 5.5. Nervo fibular comum distal à NTL (N1) 111 5.6. Nervo tibial proximal à NTL (N2) 113 5.7. Nervo fibular comum proximal à NTL (N3) 116 5.8. Considerações finais 117 6. CONCLUSÕES 121 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 122 INTRODUÇÃO 1. INTRODUÇÃO 1.1. Anatomia do nervo Os nervos são formados por diferentes tecidos que têm como função a nutrição e proteção das fibras nervosas preservando a continuidade axonial (Da-Silva, 1995a, 1995b). As fibras nervosas são envolvidas por uma cadeia de células de Schwann justapostas. As células de Schwann existem no nervo em duas formas, as células formadoras da bainha de mielina e as não formadoras da bainha de mielina (Frostick & Kemp, 1998). Dependendo da presença da bainha de mielina, as fibras nervosas podem ser classificadas como mielínicas ou amielínicas (Hollinshead & Rose, 1991; Erhart, 1992; Da-Silva, 1995a). Nas fibras mielínicas um axônio está associado a uma célula de Schwann formadora da bainha de mielina; enquanto que, nas fibras amielínicas, uma célula de Schwann envolve grande número de axônios, sem formar a bainha de mielina. As fibras mielínicas e as amielínicas estão envolvidas por uma matriz colagenosa frouxa denominada endoneuro (Lundborg, 1987). Esta matriz é constituída, principalmente, por fibras colágenas do tipo III (Da-Silva, 1995b). Também são observados fibroblastos, destituídos da membrana basal, células de Schwann, mastócitos e células endoteliais (Da-Silva, 1995a). O endoneuro tem uma relação especial com as fibras nervosas desde que as fibrilas colagenosas endoneurais estão distribuídas ao redor de cada fibra nervosa para formar a parede de sustentação chamada de tubos endoneurais (Lundborg, 1987). 25 INTRODUÇÃO As fibras nervosas estão reunidas em fascículos. Estes são envolvidos por uma camada multilamelar mecanicamente forte, o perineuro (Lundborg, 1987). O perineuro é formado por tecido conjuntivo dos tipos I e III (Montes et al., 1984), e por fibroblastos dispostos em lamelas que atuam como uma barreira difusora e mecânica ao trauma externo, ajudando a preservar o microambiente intrafascicular (Olsson & Kristensson 1971, 1973). O número de lamelas varia com o diâmetro dos fascículos (Lundborg, 1987). Envolvendo todos os fascículos em um único feixe está o epineuro. Este serve como uma barreira protetora para os fascículos durante os movimentos corporais e protegem os fascículos de traumas externos. A quantidade de epineuro varia entre os nervos, e é mais abundante ao redor das articulações. No epineuro estão presentes fibroblastos, macrófagos e mastócitos como em qualquer tecido conjuntivo frouxo (Lundborg, 1987). 1.2. Lesão do nervo Os nervos, assim como os demais tecidos do organismo, estão sujeitos a doenças inflamatórias, traumáticas, metabólicas, tóxicas, genéticas e neoplásicas (Girolami et al., 2000). Estas doenças levam a diferentes tipos e graus de lesões prejudicando os movimentos ou a função da área inervada (Ramón & Cajal, 1928; Politis et al., 1982; Lundborg et al., 1986). A perda da função de um nervo sensitivo provoca alterações da sensibilidade abrangendo desde a percepção exacerbada até redução ou ausência de sensibilidade na área afetada. Enquanto que a lesão das fibras de um nervo motor resulta na redução até a ausência dos movimentos ou do controle dos movimentos. As lesões de nervos receberam diversas classificações. As mais conhecidas são a de Seddon (1943) e a de Sunderland (1968). Seddon (1943) definiu três graus de lesão do nervo: neuropraxia, axoniotmese e neurotmese. A neuropraxia, ou lesão tipo I de Sunderland (1968), é caracterizada pela perda de condução sem alterações estruturais no axônio. A lesão apresenta-se exclusivamente na bainha de mielina (Ferreira, 1999) e as chances de recuperação funcional são altas (Lundborg, 1987). A velocidade de 26 INTRODUÇÃO condução pode apresentar-se diminuída se estiver associada à desmielinização, retornando ao normal com a remielinização (Kimura, 1987). Axoniotmese, ou lesão tipo II de Sunderland (1968), é a perda da continuidade axonial resultando em degeneração Walleriana do segmento distal. Neste tipo de lesão os tubos endoneurais permanecem intactos, o que torna o prognóstico bom, apesar da ocorrência de degeneração axonial (Lundborg, 1987; Dimeglio, 1990). Segundo Kimura (1987), estudos de condução nervosa no local da lesão são inábeis em diferenciar neuropraxia de axoniotmese, pois o bloqueio total da condução pode ocorrer em ambas. Porém, a velocidade de condução pode permanecer normal na axoniotmese parcial, onde algumas fibras nervosas permanecem funcionais (Eyzaguirre & Fidone, 1977). A neurotmese (Seddon, 1943) é a lesão que resulta da secção total do nervo. A regeneração é possível, porém incompleta e pobremente organizada (Kimura, 1987). Segundo Lundborg (1987) a neurotmese é a perda da continuidade de alguns ou de todos os elementos remanescentes do nervo, incluindo tubos endoneurais, perineuro e epineuro. Sunderland (1968) propôs três subdivisões à neurotmese de Seddon. Na lesão do tipo III o perineuro e a arquitetura da bainha são preservados, enquanto que o axônio e o tecido circundante estão danificados. A regeneração ocorre, mas é menos efetiva que na axoniotmese. Na lesão do tipo IV o perineuro também é danificado, mas o nervo mantém sua continuidade. Neste tipo de lesão alguma regeneração pode ocorrer, porém, mal orientada e requer intervenção cirúrgica. Enquanto que a lesão do tipo V representa a completa separação dos cotos nervosos com perda de continuidade, o nervo deve ser suturado, frequentemente requerendo enxerto de nervo (Kimura, 1987). 27 INTRODUÇÃO 1.3. Regeneração de nervo Após uma lesão de nervo ocorre uma série de alterações celulares no segmento distal do nervo e em alguns nodos terminais do coto proximal (De Medinaceli & Merle, 1991; Frostick et al., 1998; Ferreira, 1999). Estas alterações foram relatadas por Waller, em 1850; futuramente, após estudos mais profundos de Ranvier, em 1878, e Ramón-y-Cajal, em 1928, foram possíveis a observação e a descrição da degeneração da bainha de mielina (Koeppen, 2004). A evolução da degeneração Walleriana depende do animal utilizado (McDonald, 1972; Lubinska, 1975; Blundon et al., 1990; Chaudhry et al., 1992); da idade dos animais (Chaudhry et al., 1992; Perry et al., 1992); do tipo de fibra analisada, mielínica ou amielínica (Lubinska, 1975; Veronesi & Boyes, 1988; Martinez & Canavarro, 2000); do tipo de lesão (Lubinska, 1975; Bouldin & Cavanagh, 1979; Gold et al., 1992); e, até mesmo, de fatores ambientais, como a temperatura (Lubinska, 1975; Blundon et al., 1990; Perry et al., 1990; Chaudhry et al., 1992). Segundo Beirowski et al. (2005), a degeneração é direcionada de proximal para distal, após secção do nervo, e de distal para proximal, após esmagamento das fibras. No segmento distal do nervo lesado ocorre proliferação de células de Schwann, porém, estas não apresentam função fagocitária, que é realizada por macrófagos que migram de fora do nervo (Beuche & Friede, 1984). Além dos macrófagos, migram, em menor quantidade, linfócitos e leucócitos polimorfonucleares (Griffin et al., 1993; Mueller et al., 2003). Esta resposta imunológica facilita a remoção de axônios e debris de mielina (Perrin et al., 2005) e a produção de citocinas e fatores neurotróficos que são benéficos para a regeneração axonial (Dahlin, 1995). Após degeneração dos constituintes neurais permanecem os tubos de células de Schwann e colágeno, ou bandas de Büngner, reiniciando o processo de remielinização de brotamentos axoniais (Koeppen, 2004). A coluna de células de Schwann é uma via indispensável para o crescimento axonial, providenciando ambiente favorável para a regeneração. O 28 INTRODUÇÃO axônio em regeneração cessará de crescer caso adentre o tecido conectivo ao invés da coluna de células de Schwann (Ide, 1996). Os axônios no coto proximal de um nervo lesado produzem grande número de brotamentos colaterais e terminais que avançam em direção ao coto distal (Lundborg, 1987). Os brotamentos colaterais são produzidos nos nodos de Ranvier localizados próximos ao coto proximal da lesão (Hopkings & Slak, 1981; McQuarrie, 1985). Múltiplos brotamentos podem ser produzidos por nodo. Esta característica explica os achados de que muitos axônios são encontrados dentro do tubo de lâmina basal derivados das fibras mielinizadas no coto proximal (Ide & Kato, 1990). Na porção mais distal de cada brotamento há o cone de crescimento onde podem ser observadas filopodias. Estas filopodias exploram o ambiente através de movimentos constantes. Os cones de crescimento preferem substratos que apresentem adesividade, sendo que as propriedades físicas e químicas do substrato são essenciais para o desenvolvimento dos cones de crescimento (Lundborg, 1987). Os brotamentos crescem do coto proximal do nervo em direção ao segmento distal. Devido ao grande número de brotamentos que invadem as colunas de células de Schwann no coto distal, o número total de axônios no segmento distal pode exceder, consideravelmente, o número de axônios do coto proximal. No entanto, com o tempo, o número de axônios diminui, à medida que os brotamentos que não realizaram conexão com o órgão alvo desaparecem. O primeiro relato de regeneração nervosa foi feito por Galen (131- 201 d.C). No entanto, a primeira referência cirúrgica de reparo de lesões nervosas data de alguns séculos mais tarde, com Rhazes (850-932) e Avicenna (980-1037) (Brushart & Seiler, 1987; Sunderland, 1991; Zhao et al., 1992). 29 INTRODUÇÃO 1.4. Técnicas de Reparo Cirúrgico Quando a lesão no nervo causa interrupção da continuidade axonial, sem perda de tecido, com possibilidade de aproximação dos cotos, é utilizada neurorrafia para reaproximação direta destes cotos (Braun, 1982). Nestes casos a sutura livre de tensão é fundamental para evitar a isquemia e a fibrose (Terzis et al., 1975; Sunderland, 1978). As técnicas de reparo cirúrgico do nervo alcançaram grande progresso após a introdução do uso do microscópio por Smith (1964), o que tornou possível a obtenção de melhores resultados funcionais. Watchmaker & Mackinnon (1997) afirmaram que, para a obtenção de resultados satisfatórios em um reparo de nervo, é fundamental a utilização de equipamentos como lupa ou microscópios, material adequado e específico, conhecimento da técnica microcirúrgica, reparo primário sempre que possível, caso seja necessário, o reparo secundário deve ser realizado em até três semanas, com aproximação dos cotos livres de tensão, optar pela interposição de enxerto quando houver perda de tecido nervoso (“gap”) e realizar a reeducação sensitiva e motora para melhorar os resultados. Em 1947, Seddon afirmou que o enxerto de nervo autógeno era a única alternativa eficaz no tratamento de lesões com perda de tecido nervoso, e que o diâmetro do enxerto não deveria ser maior que o do nervo receptor para evitar a necrose central. Porém, muitos outros tecidos têm sido utilizados: enxerto de um segmento de vaso sangüíneo na posição normal (Bunnell & Boyes, 1939; Fields et al., 1989; Fawcett & Keynes, 1990) ou ao avesso (Ferrari et al., 1999); enxerto venoso preenchido com músculo esquelético (Battiston et al., 2000; Fornaro et al., 2001); tubo de pericárdio bovino (Virmond & Pereira, 2000); tubo fibrocolagenoso envolto em fáscia (Watanabe et al., 2001). Por outro lado, o uso de material sintético no reparo de nervo, como polietileno, silicone, metal, plástico, celulose, polímero de ácido glicólico, combinados ou não com agentes bioquímicos neurotróficos, tem sido defendido por muitos autores (Lundborg et al., 1982; Fields et al., 1989; Evans et al., 30 INTRODUÇÃO 1991; Frykman, 1993; Dellon, 1994; Watchmaker & Mackinnon, 1997; Watanabe et al., 2001; Wang et al., 2005). Em todas estas técnicas é importante a união adequada dos cotos para que o axônio em regeneração alcance a extremidade distal do nervo lesado. Esta observação levou muitos autores a estudar a regeneração nervosa através de adesivos biológicos (Cooper & Falb, 1968; Boedts & Boukaert, 1984; Boedts, 1987; Moy et al., 1988; Nishihira & McCafrey, 1989; Jin et al., 1990; Daunois & Sébille, 1991; Bertelli & Mira, 1993). Dentre os adesivos biológicos utilizados que alcançaram boa regeneração nervosa, podemos citar a cola de fibrina derivada de veneno de serpente (Viterbo et al., 1993b; Reis et al., 1998; Vicente et al., 1998; Reis & Rodrigues, 2000). Payne et al. (2002) utilizaram grampos de titânio e afirmaram que esta é uma alternativa rápida e que os resultados foram similares aos obtidos com fio monofilamentar de náilon. Porém, havendo a possibilidade, a reaproximação dos cotos através de sutura direta do nervo, ou seja, neurorrafia témino-terminal (NTT), é preferível a todas estas técnicas, pois apresenta os melhores resultados (Terzis et al., 1975; Millesi, 1982; Ide, 1983; Lundborg, 1987; Zhao et al., 1997; Santamaria et al., 1999; Yüksel et al., 1999; Rovak et al., 2001). Neurorrafia término-terminal A NTT pode ser realizada através de suturas epineurais, perineurais ou epiperineurais. Segundo Braun (1982), a sutura epineural é relativamente não traumática e de fácil execução, devido às características do epineuro, que permitem aproximar os cotos distais e proximais sem entrar em contato direto com os elementos neurais verdadeiros. Além disso, esta sutura preserva o tecido conjuntivo rico em vasos sanguíneos existentes abaixo do epineuro, de grande importância para evitar a formação de tecido cicatricial. Evans et al. (1991) compararam a NTT realizada com os fascículos alinhados ou não. Segundo estes autores, a recuperação funcional na 31 INTRODUÇÃO neurorrafia com o correto alinhamento dos fascículos foi superior, e afirmaram que o alinhamento fascicular é fator importante no reparo de um nervo. Porém, segundo Lundborg (1987, 2000), não é um fator imprescindível. A sutura perineural foi realizada por diversos autores visando à obtenção de um perfeito alinhamento entre os fascículos de um nervo seccionado (Rosegay & Edwards, 1980; Braun, 1982; Stopiglia & Erhart, 1987). Este tipo de sutura permite a boa orientação fascicular em nervos monofasciculares ou com poucos fascículos (Millesi, 1973; Bora et al., 1976; Orgel & Terzis, 1977; Terzis, 1979; Kline et al., 1981; Kutz et al., 1981; Millesi, 1981). Segundo Bora (1967), esta técnica apresenta a desvantagem de causar lesões no suprimento vascular do nervo durante a dissecção dos fascículos para seu alinhamento. Trabalhos realizados comparando as técnicas de neurorrafia epineural ou perineural não demonstraram diferença significativa entre as duas técnicas (Braun, 1982; Lundborg, 1987). Ferreira et al. (1974) e Venault et al. (1981) afirmaram que, em nervos multifasciculares, uma melhor coaptação é obtida por meio da aproximação individual de fascículos através da associação de duas técnicas de sutura, a epineural e a perineural (fascicular). A sutura epiperineural foi proposta por Ferreira et al. (1974), aconselhando a utilização de mínima tensão na sutura. A NTT é a forma mais compatível com o processo anatomopatológico da regeneração nervosa, ou seja, existência de um coto proximal com axônios em regeneração penetrando em um tubo endoneural vazio após degeneração Walleriana. Assim, esta técnica deve ser a técnica de escolha quando se dispõe de um coto proximal e outro distal (Viterbo, 1992a). Em casos onde há perda do coto proximal, a opção é seccionar um nervo vizinho e suturar seu coto proximal ao coto distal do nervo lesado. Porém, esta técnica causa prejuízo funcional ao nervo doador e às estruturas por ele inervadas (Harris & Tindall, 1991; Lohman et al., 1997). 32 INTRODUÇÃO Uma opção para evitar o sacrifício do nervo doador é a neurorrafia término-lateral (NTL), onde um nervo é suturado na lateral de outro, este último servindo como nervo doador. Neurorrafia término-lateral A NTL foi executada pela primeira vez, em 1895, por Ballance (apud Ballance et al., 1903) que suturou o coto distal do nervo facial seccionado à uma incisão na lateral do nervo acessório espinhal para tratamento da paralisia facial. Estes autores observaram retorno dos movimentos faciais, associados com movimentos dos ombros. Kennedy (1899) sugeriu técnica similar à de Ballance et al. (1903), porém, realizou uma incisão maior no nervo doador deixando intacto apenas o epineuro do lado oposto à NTL, obtendo os mesmos resultados (apud Papalia et al. 2007). Outros autores relataram o uso do nervo hipoglosso para a NTL (Sherren, 1906), mas a inconveniência dos movimentos associados persistiu. Sherren (1906) sugeriu que fosse realizada incisão longitudinal ou transversal no nervo doador para aumentar o contato entre os axônios deste e do nervo receptor. Estes métodos apresentavam prejuízos funcionais como resultado da desnervação de músculos inervados pelos nervos acessório espinhal e nervo hipoglosso. Provavelmente, esta foi a causa que levou Babcock (1927) a sugerir o abandono desta técnica. Desde então, houve uma interrupção no relato de utilização de NTL até a publicação de Krivolutskaia et al. (1989). Estes autores trataram alguns casos de paralisia do ramo mandibular suturando seu coto distal à lateral do ramo bucal do nervo facial. Antes da sutura, estes autores realizaram ranhuras na lateral do nervo doador com uma agulha. Estes autores afirmaram terem alcançado completa recuperação funcional em quatro dos sete pacientes operados. May et al. (1991) suturaram o coto distal do nervo facial lesado ao nervo hipoglosso parcialmente seccionado e minimizaram subsequentes danos funcionais à língua. 33 INTRODUÇÃO Em todas estas técnicas foi criada uma lesão na lateral do nervo doador no local da NTL. Tanto as incisões (Ballance et al., 1903; Sherren, 1906; May et al., 1991) ou ranhuras (Krivolutskaia et al., 1989), quebraram as barreiras de tecido conectivo permitindo o crescimento de axônios para dentro dos nervos receptores. Além disso, a secção de fibras axoniais do nervo doador no local da incisão levava a uma união término-terminal entre os tubos endoneurais do nervo doador e do nervo receptor. Em 1992, Viterbo et al. introduziram a NTL sem lesão no nervo doador. No primeiro estudo em ratos, eles suturaram o coto distal do nervo fibular comum na lateral do nervo tibial, sem incisão ou abertura de janela epineural. Nenhum prejuízo ao nervo doador ou às estruturas por ele inervadas foi observado. Estes autores relataram um novo fenômeno, o crescimento de axônios do nervo intacto para o coto distal do nervo receptor. Os resultados obtidos por Viterbo et al. (1992) foram confirmados por trabalhos posteriores (Lundborg et al., 1994b; Lohman et al., 1997; Ting et al., 1998; Rovak et al., 2000; Matsuda et al., 2005). A grande discussão passou a ser a possível contaminação motora do coto distal por axônios originários do coto proximal, pois isto invalidaria a conclusão apresentada por Viterbo et al. (1992, 1994a). Para prevenir a contaminação do coto proximal, Viterbo et al. (1992, 1994a); Zhang et al. (1998) e Kalliainen et al. (1999), inseriram o coto proximal do nervo fibular comum em músculos adjacentes. Outros modelos foram apresentados como o modelo de mínima lesão de Terzis (Noah et al., 1997a). Neste modelo, os autores utilizaram um enxerto de nervo cruzando para o lado contralateral, isolando a área da NTL do coto proximal do nervo obturador, evitando sua contaminação. Variações desta técnica foram apresentadas (Rovak et al., 2000; Goheen-Robillard et al., 2002). Estes trabalhos confirmaram a reinervação do nervo receptor, sem a possibilidade de contaminação motora. Após confirmação da eficácia da NTL através de diversos estudos experimentais, que demonstraram que brotamentos colaterais, tanto de nervos sensoriais quanto de nervos motores, reinervaram nervos receptores (Noah et al., 1997b; Shah et al., 1997; Zhao et al., 1997) e que os resultados eram 34 INTRODUÇÃO comparáveis aos obtidos com NTT (Lohman et al., 1997; Yüksel et al., 1999; Kalliainen et al., 1999) vários trabalhos surgiram relatando seu uso clínico. Aplicação clínica da neurorrafia término-lateral A NTL tem sido utilizada para recuperação de lesões de nervos nos membros superiores. Viterbo et al. (1995) realizaram vários enxertos utilizando NTL para unir o nervo frênico aos troncos C5 e C6 do plexo braquial avulsionado. Os autores relataram que exames de eletromiografia revelaram o aumento de uma para três unidades motoras nos músculos tríceps, peitoral maior e infra-espinhal após um ano da cirurgia. Afirmaram que pacientes com lesões graves de plexo braquial podem esperar melhoras motoras no membro superior devido às neurotizações obtidas com NTL. Franciosi et al. (1998) relataram o tratamento de três pacientes com rupturas das raízes C5, C6 e C7 usando NTL. O nervo musculocutâneo foi cortado e suturado à lateral do nervo ulnar. Os autores relataram o retorno de contração do músculo bíceps após um período de quatro a seis meses. No mesmo ano, Mennen (1998a) sugeriu a utilização de NTL no reparo de lesões do plexo braquial. Ele concluiu que, na maioria dos casos, esta técnica demonstrou-se simples e com bons resultados. Outros dois trabalhos publicados por Mennen, em 2003, relataram a recuperação quase total da sensibilidade e/ou da função motora (Mennen, 2003; Mennen et al., 2003). Ogun et al. (2003) utilizaram NTL para unir o nervo mediano lateralmente ao nervo ulnar. Após 38 meses, eles obtiveram recuperação da sensibilidade em todos os pacientes. No entanto, a recuperação motora foi observada em apenas um de três pacientes. Eles concordaram que a NTL é uma boa alternativa para o enxerto de nervo em pacientes que apresentem grande distância entre as extremidades dos nervos lesados. Voche (2005) e Voche & Ouattara (2005) trataram lesões traumáticas nas mãos e dedos utilizando NTL com janela epineural, com resultados comparados aos de enxertos de nervos ou veias, confirmando os 35 INTRODUÇÃO resultados de Mennen (1998a, 2003) e Mennen et al. (2003). Millesi (2004) também utilizou NTL em trauma de plexo braquial relatando bons resultados. A NTL também tem sido utilizada na recuperação da sensibilidade. Viterbo et al. (1993a) relataram o uso de NTL, após remoção de enxerto de nervo sural, entre o coto distal do nervo sural e a lateral do nervo fibular comum superficial. Afirmaram que, apesar da remoção do nervo sural, os pacientes não apresentaram área de anestesia naquela região, mostrando que esta técnica previne sequelas sensoriais. Santamaria et al. (1999) compararam NTT e NTL sem remoção de janela epineural para promover a recuperação de sensibilidade ao toque, dor, sensações térmicas após utilização de retalhos inervados pelo nervo radial para reconstrução de hemiglossectomia. Os resultados de sensibilidade à dor, obtidos com o uso de NTL, foram inferiores aos obtidos com o uso de NTT, mas a recuperação sensorial ocorreu em todos os pacientes. Viterbo & Ripari (2002, 2008) descreveram o uso de NTL para restaurar a sensibilidade em pacientes paraplégicos. Estes autores ligaram, através de enxerto de nervo sural, os nervos intercostais acima da lesão e o nervo ciático com NTL, em dois pacientes. O primeiro paciente recuperou, após quatro anos, sensibilidade de 2 g em T10 a L1 e 300 g em L2 e L3. O segundo, após três anos, recuperou sensibilidade de 2 g em T10, 4 g em T11 e 300 g em T12, e relatou que podia sentir quando a bexiga urinária estava cheia. Após a cirurgia, os pacientes não apresentaram mais úlceras de pressão. Outra utilização clínica da NTL tem sido no tratamento da paralisia facial (Viterbo, 1993; Yoleri et al., 2000; Galli et al., 2002; Koh et al., 2002; Kumar & Hassan, 2002; Yamamoto et al., 2003; Frey et al., 2006). 1.5. Paralisia facial Pacientes com paralisia facial perdem o movimento da musculatura da mímica facial, de grande importância na comunicação, pois é através dela que se expressam sentimentos e emoções. Os efeitos da paralisia facial são debilitantes com uma variabilidade de possíveis problemas funcionais e estéticos (Tate & Tollefson, 2006). Além disso, o impacto da desfiguração facial 36 INTRODUÇÃO pode resultar em medo de lugares públicos e prejudicar a socialização. Portanto, a paralisia facial pode alterar a vida social do paciente, assim como determinar importante prejuízo psicológico, principalmente em crianças (Millesi, 1990; Lenert et al., 1998). A paralisia facial caracteriza-se por perda da competência oral através da dificuldade na fala e incontinência salivar e para líquidos. Lacrimejamento, ectropio paralítico da pálpebra inferior e lagoftalmo podem levar à exposição da córnea, com ulceração e mesmo amaurose. Disfunção da válvula nasal também é frequente (Tate & Tollefson, 2006). A causa mais comum de paralisia facial é idiopática (paralisia de Bell). Outras etiologias variam com o nível de lesão do nervo facial. As lesões intracranianas podem ser congênitas (agenesia do núcleo do nervo facial ou anomalias vasculares) ou adquiridas (doenças degenerativas do sistema nervoso central, trauma ou tumores como o neurinoma do nervo acústico). No segmento intratemporal do nervo facial, as lesões são, em sua maioria, traumáticas, devido a fraturas na base do crânio ou infecções, relacionadas com patologias do ouvido médio, ou são iatrogênicas durante cirurgias otológicas. E, no segmento extratemporal do nervo facial, o trauma é a principal causa da paralisia facial, seguida de neoplasias benignas ou malignas e cirurgia da glândula parótida (Vlastou, 2006). A paralisia facial pode ser unilateral ou bilateral, total ou parcial, e pode ter diversas etiologias que devem ser estudadas antes de um possível tratamento cirúrgico (Alix et al., 2002). Segundo Falcione et al. (2003), os fatores que influenciam o resultado do tratamento são a etiologia da paralisia, tipo de lesão, grau de perda tecidual, vascularidade dos tecidos circundantes, idade e condição geral do paciente, o local da lesão e, principalmente, a duração da paralisia. De acordo com Vlastou (2006), estes dois últimos fatores determinam o método de reconstrução e consequente resultado dos procedimentos cirúrgicos. Atualmente, apesar do desenvolvimento de técnicas e instrumentos, não existe método para recuperação, totalmente satisfatória, de uma função tão delicada e complexa como a dos músculos da mímica facial (Jergovic et al., 37 INTRODUÇÃO 2001). Portanto, todo o esforço deve ser feito no sentido de preservar ou restabelecer as unidades neuromusculares (Vlastou, 2006). Entre os diversos métodos para o tratamento da paralisia facial estão os métodos de regeneração neural e os de transposição muscular. Métodos neurais Os métodos de regeneração neural utilizados para o tratamento da paralisia facial são: reparo primário do nervo facial, interposição de enxertos de nervo, e enxerto de nervo transfacial. O reparo primário do nervo facial é realizado em situações de trauma através de neurorrafia término-terminal. Segundo Tate & Tollefson (2006), muitos fatores limitam o uso desta técnica incluindo perda de segmentos de nervo e acesso cirúrgico para manuseio de segmentos intracraniano e intratemporal. A interposição de enxertos de nervo é utilizada quando há a necessidade de sacrifício do nervo facial durante ressecção de tumores da glândula parótida, lesões no osso temporal e cânceres de pele invasivos, onde há a necessidade de obtenção de adequadas margens oncológicas (Tate & Tollefson, 2006). Muitos nervos doadores estão disponíveis, mas o auricular maior e o sural são ideais em termos de acessibilidade, conteúdo axonial e comprimento (Bascom et al., 2000). Segundo Vlastou (2006), o enxerto de nervo transfacial é indicado quando o coto proximal do nervo facial não está acessível. A utilização do nervo facial contralateral fornece impulsos neurais do lado normal para o lado paralisado através do enxerto de nervo transfacial, provendo a reinervação dos grupos musculares correspondentes. Scaramella (1971) foi o primeiro a utilizar o enxerto de nervo transfacial. Ele suturou o ramo cervical do nervo facial normal a um enxerto de nervo sural, passando sob o mento, e conectado à extremidade distal do tronco do nervo facial paralisado. Em um segundo caso ele utilizou o ramo bucal como nervo doador. 38 INTRODUÇÃO No mesmo ano, Smith (1971) descreveu a técnica em que posicionou o enxerto de nervo sural na região supra-labial, ligando o ramo bucal-zigomático do nervo facial normal aos ramos periféricos no lado paralisado. Este autor afirmou ter obtido melhor simetria em três pacientes operados. Esta técnica foi modificada por Anderl (1973) através da utilização de múltiplas neurorrafias entre os ramos do nervo facial. Em 23 pacientes foram utilizados quatro enxertos de nervo sural, o primeiro posicionado na região frontal ligando o ramo zigomático do lado doador e o lado paralisado; dois enxertos foram posicionados acima do lábio, ligando diferentes grupos de fascículos, ao lado paralisado; e o último enxerto foi utilizado para tratar o segmento mandibular marginal. O autor afirmou que apenas quatro dos 23 pacientes apresentaram resultado pobre. Conley & Backer (1979) suturaram o coto proximal do nervo hipoglosso ao coto distal do tronco do nervo facial utilizando NTT. Os autores classificaram os movimentos como bons em 77% dos pacientes. Afirmaram que as vantagens desta técnica são, entre outras, melhora do tono facial e movimentos faciais voluntários controlados pela língua. Todas estas técnicas utilizaram enxerto de nervo transfacial com NTT em ambos os lados. No lado sadio, a neurorrafia é utilizada em ramos menos calibrosos, pois a secção de ramos mais calibrosos causariam paralisia facial também no lado normal. No lado paralisado é realizada secção do tronco do nervo facial, onde o enxerto é suturado. A desvantagem deste método é necessidade de aplicação tardia, pois, o tempo ideal de aplicação da NTT, é de seis meses a um ano após o início da lesão, para certificar de que não há nervos distais sadios (Tate & Tollefson, 2006); necessidade de secção de nervos normais para realização da NTT, o que limita o número de enxertos a serem utilizados, pois um grande número de enxertos poderia provocar uma paralisia facial no lado normal (Viterbo, 1992b). Viterbo (1992b) propôs a técnica do enxerto de nervo transfacial com neurorrafia término-lateral. Nesta técnica é realizada uma incisão pré-auricular, e o enxerto de nervo sural é suturado ligando o tronco do nervo facial sadio ao tronco do nervo facial lesado através de NTL, sem seccioná-los. De acordo 39 INTRODUÇÃO com o autor, a vantagem desta técnica é possibilitar uma aplicação precoce, pois não há necessidade de secção de nervos, possivelmente funcionais, no lado lesado, e não causar lesão no nervo doador, o que permitiria a utilização de inúmeros enxertos. Em 1993, Viterbo descreveu uma modificação desta técnica para utilização em pacientes com paralisia facial superior a um ano. Nesta técnica uma das extremidades do nervo sural é suturada à lateral intacta do nervo facial sadio através de NTL, e a outra extremidade é suturada, após secção, ao coto distal do tronco do nervo facial lesado com NTT. A vantagem desta técnica é não causar lesão no nervo facial sadio e, teoricamente, aumentar a qualidade da inervação no lado lesado. Se a paralisia facial estiver instalada há mais de um ano e meio, não existe mais possibilidade de reconstrução nervosa (Chuang & Wei, 1989; Tate & Tollefson, 2006; Vlastou, 2006), pois, após este tempo a atrofia das placas motoras já está estabelecida, e, portanto, não é possível a reinervação neuromuscular das unidades funcionais da face (Gagnon & Molina-Negro, 1989). Assim, novos complexos neuromusculares deverão ser transferidos para reabilitação do lado facial paralisado (Vlastou, 2006). Uma alternativa é a transposição muscular. Transposição muscular Muitos músculos têm sido utilizados na transposição muscular, dentre eles: o platisma (Edgerton et al., 1975); músculos do pé, como o extensor dos dedos (Vedung et al., 1984) e o abdutor do hálux (Jiang et al., 1995); músculo esternocleidomastóideo (Schottstaedt et al., 1955); reto abdominal (Koshima et al., 1997a); reto femoral (Koshima et al., 1994; Koshima et al., 1997b); latíssimo dorsal (Harii et al., 1998); gracilis (Gousheh et al., 1995; Ferreira & Marques de Faria, 2002; Kumar & Hassan, 2002); serratus anterior (Buncke et al., 2002) e peitoral menor (Terzis, 1989; Scevola et al., 2003). Outra técnica utilizada na reabilitação do movimento da mímica facial é a transposição de músculos da mastigação, conhecida desde o início do século XX, como o músculo masseter (Baker & Conley, 1979; Correia & 40 INTRODUÇÃO Zani, 1973) e o temporal (Gilles, 1934; May & Drucker, 1993). A vantagem desta técnica é que estes músculos são inervados pelo nervo trigêmeo, portanto, não são comprometidos pela lesão no nervo facial. Através desta técnica, ao morder, o paciente sorri (Baker & Conley, 1979; May, 1984). O músculo temporal é geralmente o escolhido para transposição, pois seu vetor de tração coincide com o do músculo zigomático, responsável pelo sorriso. Gilles (1934) propôs a liberação da parte posterior do músculo temporal de sua origem rebatendo-o por cima do arco zigomático, sendo suturado ao sulco nasolabial, após alongamento com enxerto de fáscia lata. A desvantagem deste método é o volume antiestético na região zigomática, causado pelo rebatimento do músculo temporal. Em 1953, MacLaughlin propôs a mobilização ortodrômica do músculo temporal, onde o músculo era deslizado por baixo do arco zigomático após osteotomia do processo coronóide, via incisão intra-oral. O músculo temporal era, então, ligado ao músculo orbicular da boca através de uma tira de fáscia lata. Diferentemente da técnica de Gilles, o músculo não tinha seu sentido invertido. Breidahl (1996) sugeriu procedimento semelhante ao de MacLaughlin, porém, com abordagem extra-oral e retirada do arco zigomático. Um enxerto de fáscia lata era suturado ao tendão do músculo temporal e ao músculo orbicular da boca, próximo à comissura labial. Posteriormente, Viterbo & Faleiros (1999) propuseram técnica semelhante à de Breidahl, porém sem ressecção do arco zigomático. Segundo os autores, a vantagem desta técnica é que o tempo cirúrgico é menor e a cirurgia pode ser feita com anestesia local, além de possibilitar melhor resultado estético. Labbé & Huault (2000) descreveram a técnica chamada mioplastia de alongamento do músculo temporal, suturando seu tendão diretamente ao músculo orbicular da boca, sem enxerto de fáscia lata. O arco zigomático é removido para expor o processo coronóide, e novamente posicionado e fixado após a anteriorização do músculo temporal. Segundo os autores, os resultados obtidos foram excelentes. 41 INTRODUÇÃO Em 2003, Labbé et al. relataram aperfeiçoamento em sua técnica de alongamento do temporal adicionando um enxerto de nervo transfacial. A extremidade superior do nervo sural foi suturada de maneira término-terminal a um dos ramos do nervo temporal profundo, que foi seccionado. A outra extremidade foi suturada a um ramo distal do nervo facial sadio (palpebral inferior ou zigomático) realizando uma dupla inervação do músculo temporal, via seus nervos originais e via enxerto transfacial. Esta técnica permite que o músculo temporal seja acionado precocemente, após algumas semanas, ao morder, determinando o sorriso voluntário e, tardiamente, após a regeneração dos axônios via enxerto de nervo transfacial, de forma espontânea. Labbé et al. (2003) afirmaram que o enxerto de nervo parece ajudar a transposição muscular a obter melhor função facial e, portanto, aumenta a qualidade do sorriso espontâneo. Indicaram a dupla inervação do músculo temporal para crianças, adultos jovens ou naqueles pacientes onde a realização de fisioterapia é dificultada. Ao seccionar um dos ramos do nervo temporal profundo Labbé et al. (2003) realizaram uma desnervação de parte do músculo temporal. Desta maneira, estas fibras musculares estão sujeitas a uma reinervação através do enxerto de nervo sural, que, se tratando de um enxerto longo, pode não ocorrer adequadamente ou mesmo não ocorrer, levando a uma atrofia muscular e, consequentes prejuízos funcionais ao paciente. Uma alternativa para evitar a secção de um dos ramos do nervo temporal profundo e risco de atrofia muscular, seria a realização da dupla inervação muscular através de NTL, suturando a extremidade do enxerto de nervo sural à lateral do ramo do nervo temporal profundo. Assim, o músculo temporal não correria o risco de perder sua força ou sofrer desnervação. Porém, seria possível a ocorrência de dupla inervação muscular através de NTL? Ou seja, o enxerto de nervo sural e o nervo temporal profundo inervariam, simultaneamente, o músculo temporal? Se a dupla inervação não ocorresse, o nervo temporal profundo poderia ser seccionado proximalmente à NTL em um segundo tempo cirúrgico. Nesta situação, seria possível que o enxerto inervasse imediatamente o músculo temporal evitando sua atrofia? 42 INTRODUÇÃO Sabendo-se que as colunas de células de Shwann ou bandas de Bügner, formadas após degeneração Walleriana, é uma via indispensável para que ocorra reinervação do órgão alvo (Cajal, 1928 apud Ide, 1996), o nervo receptor sofreria degeneração Walleriana anterior à inervação pelo enxerto de nervo? 43 OBJETIVOS 2. Objetivos 1. Analisar a ocorrência de dupla inervação muscular através de NTL, ou seja, se tanto a NTL quanto a inervação original do músculo, interferem, simultaneamente, na contração e trofismo muscular. 2. Avaliar a imediata inervação muscular através da NTL, após secção do nervo receptor, evitando atrofia muscular. Ou seja, se o enxerto é capaz de determinar a inervação logo após a secção do nervo receptor proximalmente à neurorrafia. 3. Avaliar a ocorrência de degeneração Walleriana no segmento distal à NTL no nervo receptor. MÉTODO 3. MÉTODO Este trabalho foi realizado no Centro de Pesquisa Experimental da Faculdade de Medicina da UNESP – Campus de Botucatu, no Laboratório de Cirurgia e Ortopedia (cirurgias e teste da avaliação da marcha) e no Laboratório de Urologia (teste eletrofisiológico, coleta das peças histológicas, sacrifício dos animais e confecção das lâminas histológicas). 3.1. Animais Todo o procedimento está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), sob o protocolo nº. 427 da Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina da UNESP – Campus de Botucatu (Anexo 1). Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da UNESP – Campus de Botucatu. Foram utilizados 140 ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar, machos, pesando, em média, 195,6 (± 18,8) g. Os animais foram divididos, através de sorteio, em sete grupos experimentais. As cirurgias foram realizadas conforme o grupo no qual o animal foi incluído. 3.2. Cirurgia Todos os procedimentos cirúrgicos e de coleta foram realizados pelo pesquisador, padronizando-se o método. 45 MÉTODO Precedendo cada procedimento cirúrgico os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (30 mg/Kg, i.p.), realizada tosquia e assepsia com PVPI (polivinilperrolidona-iodo). Em todos os animais foi realizada incisão de dois centímetros no membro posterior direito. Os nervos ciático, fibular comum e tibial foram dissecados. Os animais foram divididos, aleatoriamente, entre os grupos experimentais. No grupo G1 ou controle de normalidade, nenhum outro procedimento foi realizado além da dissecção nervosa (Fig. 1). Os animais foram sacrificados aos 120 dias. Figura 1 – Esquema da cirurgia realizada no G1. NFC = nervo fibular comum; NT = nervo tibial; MTCD = músculo tibial cranial direito. No grupo G2 ou controle de desnervação, o nervo fibular comum foi seccionado e os cotos proximal e distal foram invertidos 180 graus, inseridos em musculatura adjacente e fixados de forma a não permitir a reinervação (Fig. 2). Os animais foram sacrificados aos 120 dias. NF NT NF NT MTCD NFC NT NFC NT 46 MÉTODO NF NT NF NT NF NT Figura 2 – Esquema da cirurgia realizada no G2. NFC = nervo fibular comum; MTCD = músculo tibial cranial direito. No grupo G3 o nervo tibial foi seccionado e o coto proximal suturado na face lateral do nervo fibular comum, sem abertura de janela epineural. Os animais foram sacrificados após 120 dias (Fig. 3). Figura 3 – Esquema da cirurgia realizada no G3. NFC = nervo fibular comum; NT = nervo tibial; MTCD = músculo tibial cranial direito. No grupo G4 foi realizado o mesmo procedimento do grupo G3, ou seja, seccção do nervo tibial e sutura de seu coto proximal na lateral intacta do nervo fibular comum. Após 120 dias, o nervo fibular foi seccionado proximal à neurorrafia e os cotos invertidos e suturados em musculatura adjacente. Os animais foram sacrificados após 30 dias da segunda cirurgia (Fig. 4). Este grupo foi criado para verificar se a dupla inervação seria capaz de manter a inervação do músculo tibial cranial após secção do nervo fibular comum. NFNF MTCD NFC MTCD NFC NT NFC NT NFC NT 47 MÉTODO Figura 4 – Esquema da cirurgia realizada no G4. A = cirurgia realizada conforme G3; B = cirurgia realizada após 120 dias; NFC = nervo fibular comum; NT = nervo tibial; MTCD = músculo tibial cranial direito. No grupo G5 foi realizado o mesmo procedimento do grupo G3, ou seja, seccção do nervo tibial e sutura de seu coto proximal na lateral intacta do nervo fibular comum, porém, neste grupo, os animais, diferentemente do G3, foram sacrificados com 150 dias (Fig. 5). Este grupo foi criado porque no grupo G4 os animais mantiveram a neurorrafia término-lateral por 150 dias. Figura 5 – Esquema da cirurgia realizada no G5. NFC = nervo fibular comum; NT = nervo tibial; MTCD = músculo tibial cranial direito. NF NT NF NT NF NT A NF NT NF NT B NF NT NF NT NF NT MTCD NFC NT MTCD NFC NT MTCD NFC NT NFC NT NFC NT NFC NT 48 MÉTODO No grupo G6 foi realizado o mesmo procedimento do grupo G3, ou seja, seccção do nervo tibial e sutura de seu coto proximal na lateral intacta do nervo fibular comum. Após 120 dias, os nervos tibial e fibular comum foram seccionados proximal à neurorrafia, invertidos 180 graus, inseridos em musculatura adjacente e fixados para evitar a reinervação. Os animais foram sacrificados 30 dias após as secções (Fig. 6). Este é um grupo desnervado para comparação ao G4. Figura 6 – Esquema da cirurgia realizada no G6. A = cirurgia realizada conforme G3; B = cirurgia realizada após 120 dias; NFC = nervo fibular comum; NT = nervo tibial; MTCD = músculo tibial cranial direito. No grupo G7 o nervo fibular comum foi seccionado 30 dias antes da cirurgia proposta no grupo G3, ou seja, seccção do nervo tibial e sutura de seu coto proximal na lateral intacta do nervo fibular comum. Os animais foram sacrificados após 120 dias da realização da NTL (Fig. 7). Este grupo foi criado para compararar a dupla inervação com a reinervação através de NTL. NF NT NF NT NF NT A NF NT NF NT B MTCD NFC NT MTCD NFC NT NFC NT NFC NT 49 MÉTODO Figura 7 – Esquema da cirurgia realizada no G7. A = desnervação do músculo tibial cranial direito; B = cirurgia realizada após 30 dias; NFC = nervo fibular comum; NT = nervo tibial; MTCD = músculo tibial cranial direito. As cirurgias foram realizadas com o auxílio de microscópio cirúrgico DF Vasconcelos com aumento de 16 vezes. Para as neurorrafias foram utilizados quatro pontos simples com fio de náilon 10-0. Após o procedimento descrito, a incisão foi suturada com pontos simples utilizando fio mononáilon 4-0. Os animais foram mantidos em caixas apropriadas contendo cinco animais cada, em temperatura controlada (25 ± 2ºC), ciclo claro-escuro de 12 horas com ração e água ad libitum, até o momento do sacrifício. A Figura 8 mostra os esquemas das cirurgias realizadas nos grupos utilizados neste trabalho. NFNF A NF NT NF NT B MTCD NFC MTCD NFC NT NFC NT NFC NT 50 MÉTODO NF NT NF NT NF NT G3/G5 G6 G4 G7 Figura 8 – Esquemas das cirurgias realizadas nos grupos G1, G2, G3, G4, G5, G6 e G7. NF NT NF NT NF NT A N F N T N F N T B NF NT NF NT NFNF G2 G1 MTCD NFC NT MTCD NFC N F N T N F N T N F N T A N F N T N F N T B MTCD MTCD NT NT NFC NFC NFNF A NF NT NF NT B MTCD MTCD NT NFC NFC MTCD NFC NT MTCD MTCD NT NT NFC NFC 51 MÉTODO 3.3. Testes realizados Todos os testes foram realizados e os resultados analisados pelo pesquisador padronizando-se o método. Teste de avaliação da marcha O teste de avaliação da marcha (Walking track analysis) foi realizado no dia pré-determinado para o sacrifício de cada animal, de acordo com a data de realização da cirurgia. As patas traseiras de cada animal foram umedecidas em tinta nanquim preta, e, os animais induzidos a andar por um corredor de 78 cm X 9 cm, sobre uma folha de papel branco com dimensões apropriadas (Fig. 9). Figura 9 – Teste da marcha (walking track analysis). As pegadas deixadas na folha de papel branco foram analisadas através das medidas da distância entre os dedos da pata experimental (E) e os dedos da pata normal (N) à frente (TOF); a distância do calcanhar aos dedos (PL); distância entre o primeiro e quinto dedos (TS); distância entre o segundo e quarto dedos (IT) (Fig. 10). A partir destas medidas foram realizados os 52 MÉTODO cálculos do índice funcional do nervo ciático (IFC), segundo De Medinacelli et al. (1982)1 e o índice funcional do nervo fibular comum (IFFC), segundo Bain et al. (1989)2: (1) IFC = ETOF – NTOF + NPL – EPL + ETS – NTS + EIT – NIT x 220 NTOF EPL NTS NIT 4 (2) IFFC = 174,9 x EPL – NPL + 80,3 x ETS – NTS – 13,4 NPL NTS Figura 10 – Medidas realizadas para cálculo do índice funcional do nervo ciático (IFC) e do índice funcional do nervo fibular comum (IFFC). Em alguns casos, os animais caminharam sobre o dorso da pata (Fig. 11) e, portanto, nenhuma medida pôde ser feita no lado experimental. Nestes casos, atribuíram-se os seguintes valores arbitrários: ETOF = um terço da distância entre duas pegadas normais; NTOF = dois terços da mesma distância; EPL = 80 mm; ETS = 6 mm e EIT = 6 mm, conforme De Medinacelli et al. (1982). EIT NIT ETS NTS EPL NPL ETOF NTOF 53 MÉTODO Figura 11 – Exemplo de teste para os quais foram atribuídos os valores arbitrários de ETOF, NTOF, EPL, ETS, EIT. Teste eletrofisiológico Para a realização do teste eletrofisiológico a temperatura ambiente foi mantida em torno de 25ºC. Nos grupos G1, G2, G3 e G5, o teste eletrofisiológico foi realizado em um único momento: imediatamente antes do sacrifício dos animais. E nos grupos G4, G6 e G7 em dois momentos, antes da secção nervosa (G4 e G6) ou da neurorrafia (G7) e imediatamente antes do sacrifício dos animais. Após anestesia com pentobarbital sódico (30 mg/kg, i.p.), os animais foram imobilizados em decúbito ventral. Foi realizada, após tosquia e assepsia, uma ampla incisão no membro posterior direito permitindo acesso aos nervos ciático, fibular comum e tibial, e músculo tibial cranial. O potencial de ação composto foi registrado por eletrodos de agulha ativo e de referência (Fig. 12c). O eletrodo ativo foi implantado no centro do músculo tibial cranial, e o de referência próximo ao tendão de inserção do músculo (Fig. 12a). A avaliação das propriedades funcionais do músculo foi feita através de estímulos elétricos deflagrados por um eletrodo bipolar, especialmente desenvolvido para este propósito, cujo cátodo e ânodo estavam distantes 2 mm (Fig. 12b). O eletrodo de estimulação bipolar foi posicionado diretamente sobre o nervo ciático, de modo que, nos grupos G3, G4, G5, G6 e G7, a estimulação foi feita proximal à neurorrafia, possibilitando a propagação dos impulsos elétricos através dela (Fig. 12a). 54 MÉTODO A frequência do estímulo foi fixada em 1 pps e a duração em 100 μs. A intensidade de estímulo utilizada, constante em todos os animais, foi de 5,1 volts. Os dados de amplitude e latência foram comparados entre os sete grupos. Foi utilizado o eletromiógrafo da marca Sapphire II 4ME (Fig. 12d). Figura 12 – Teste eletrofisiológico. a – posicionamento dos eletrodos; b – eletrodo de estimulação bipolar; c – eletrodos de captação em agulha; d – eletromiógrafo. Nos animais que não apresentaram resposta muscular ao estímulo elétrico os valores de latência tenderam ao infinito, sendo atribuído um valor altíssimo (1000 ms) para efeito de cálculo. a b c d 55 MÉTODO 3.4. Coleta das peças histológicas e sacrifício Após a realização do teste eletrofisiológico, procedeu-se à coleta de segmentos dos nervos fibular comum e tibial, assim como à coleta do músculo tibial cranial direito e esquerdo de cada rato. Os músculos tibiais craniais esquerdos foram pesados sem o tendão e descartados. A média das massas destes músculos (E) foi utilizada para comparação com os grupos experimentais. Os músculos tibiais craniais direitos foram pesados sem o tendão e mantidos imersos em nitrogênico líquido (-196ºC) até o momento do processamento histológico. Os segmentos de nervo coletados foram fixados e mantidos em solução de Karnovisk e refrigerados a 4ºC até o momento do processamento histológico. N1 é o segmento de nervo fibular comum distal à NTL; N2 é o segmento de nervo tibial proximal à NTL; N3 é o segmento de nervo fibular comum proximal à NTL; N4 é o segmento “T” correspondente à NTL; os cotos inseridos em musculatura adjacente também foram coletados, N5 coto proximal do nervo fibular comum; N6 coto distal do nervo tibial e N7 coto proximal do nervo tibial (Fig. 13). Após a coleta das peças histológicas de interesse, os animais receberam dose letal de pentobarbital sódico, administrado intraperitonealmente. 56 MÉTODO Figura 13 – Músculo tibial cranial e segmento de nervo coletados e enviados para histologia conforme grupo experimental. 3.5. Processamento histológico do músculo tibial cranial Os músculos tibiais craniais direitos, congelados em nitrogênio líquido, foram submetidos a secções transversais de 7 μm em criostato Leica CM1850. As secções foram realizadas na região central, transversalmente ao maior eixo do músculo. Foram realizados de 4 a 6 cortes de um mesmo músculo possibilitando a escolha de um corte com menos artefatos histológicos durante a análise. Os cortes histológicos foram corados pela técnica de Hematoxilina – Eosina (HE). As lâminas foram identificadas com o número de registro no laboratório para que o pesquisador não soubesse a que animal ou grupo pertencia. A numeração real foi revelada apenas para a análise estatística. Digitalização das imagens da lâmina histológica do músculo tibial cranial. As lâminas histológicas foram observadas ao microscópio óptico em menor aumento (50 vezes) para escolha do corte histológico com menos artefatos. Foi utilizado aumento de 200 vezes para a análise das fibras musculares. ����� MTC = Músculo tibial cranial NF = Nervo fibular comum NT = Nervo tibial N4, N5, N6 E N7 = Corte longitudinal N1=Corte transversal distal à neurorrafia em NF N2=Corte transversal proximal à neurorrafia em NT N3 = Corte transversal proximal à neurorrafia em NF N5 N4 N7 N6 N3 N1 N2 MTC NF NT 57 MÉTODO As imagens foram capturadas por uma câmera digital Leica DFC 280 e salvas em microcomputador Pentium IV 3.2 HT, 1 GB DDR, HD 80 GB. Foram salvas, aleatoriamente, 10 imagens de diferentes campos de um mesmo corte histológico (Fig. 14). Figura 14 – Escolha do corte histológico e das 10 imagens, de diferentes campos, salvas para posterior medida de área e menor diâmetro das fibras musculares. Medidas de área e menor diâmetro das fibras musculares As imagens digitalizadas e salvas foram analisadas através de medidas de área e menor diâmetro das fibras musculares. As medidas foram feitas de modo semi-automático utilizando-se software Sigma Pro Image Analysis, versão 5 da Jandel Scientific Corporation. As fibras foram medidas, aleatoriamente, tomando-se uma fibra de cada quadrante da imagem e uma central. Portanto, foram medidas 5 fibras por imagem salva (Fig. 15), ou seja, 50 fibras por lâmina. Os resultados obtidos de área e menor diâmetro das fibras foram organizados em uma tabela e, então, calculada a média das medidas obtidas para cada animal. A partir destas médias foi realizada a análise estatística para comparação entre os grupos. 58 MÉTODO Figura 15 – Escolha aleatória de cinco fibras musculares em uma mesma imagem. 3.6. Processamento histológico dos segmentos de nervo Os segmentos de nervo N1, N2 e N3 (Fig. 13), fixados em solução de Karnovisk, foram processados pela técnica de resina Araldite 502® para microscopia eletrônica. Após fixação por um período superior a 24 horas em solução de Karnovisk, e lavagem em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3) por três vezes com duração de cinco minutos cada vez, os segmentos de nervo sofreram uma pré- coloração com tetróxido de ósmio (1:1) por duas horas. Após nova lavagem com tampão fosfato, foi realizada desidratação por uma bateria de concentrações crescentes de acetona (50%, 70%, 90% e 100%). A inclusão em resina Araldite® foi realizada em duas etapas: em uma solução de resina e acetona (1:1), permanecendo por 24 horas em dissecador; e em resina, após 10 minutos em dissecador, permanecendo em estufa a 37ºC por uma hora. O emblocamento foi realizado posicionando-se o segmento de nervo em resina Araldite® e mantido em estufa a 60ºC por 48 horas para polimerização (Fig. 16). 59 MÉTODO Antes do corte histológico os blocos foram trimados, ou seja, preparados para o corte através da eliminação do excesso de resina ao redor do segmento de nervo. Esta trimagem foi realizada em lupa Carl Zeiss Jema adaptada, em aumento de 1,6 x, com auxílio de uma lâmina Gillette®. Com o bloco preparado foram realizados cortes transversais semi- finos (0,5 μm) em micrótomo Leica MZ6. Após o corte, a lâmina foi aquecida sobre uma chapa a 45ºC para secagem e pré-aderência. A seguir a lâmina permaneceu em estufa a 60ºC por 12 horas para aderência do corte à lâmina de vidro. A coloração foi realizada manualmente, lâmina por lâmina, com azul de toluidina 1% durante 5 minutos. Após a secagem a lamínula foi colada e a lâmina identificada com o número de registro no laboratório. Os segmentos de nervo N5, N6 e N7 (Fig. 13), foram incluídos em parafina e corados pela técnica de Hematoxilina – Eosina. Estes segmentos foram avaliados quanto à formação de neuromas de amputação. Os segmentos de nervo N4 foram corados pelo método de Bielschowsky e analisados quanto ao crescimento dos axônios do nervo doador para dentro do nervo receptor. Digitalização das imagens das lâminas histológicas de nervos As lâminas histológicas foram observadas ao microscópio óptico em aumento de 100 vezes para escolha do corte histológico com menos artefatos. Foi utilizado aumento de 400 vezes para a análise das fibras nervosas. As imagens foram capturadas por uma câmera digital Leica DFC 280 e salvas em microcomputador Pentium IV 3.2 HT, 1 GB DDR, HD 80 GB. Foram salvas duas imagens de diferentes campos de um mesmo corte histológico. 60 MÉTODO 61 MÉTODO Medidas de área e menor diâmetro das fibras nervosas As imagens digitalizadas e salvas foram analisadas através de medidas de área e menor diâmetro dos axônios, densidade axonial e área da bainha de mielina. As medidas foram feitas de modo semi-automático utilizando-se software Sigma Pro Image Analysis, versão 5 da Jandel Scientific Corporation. Após abrir a imagem a ser analisada, foi realizado um aumento (“zoom”) e este campo foi medido em 50 imagens, obtendo-se uma área média de 5128,17 μm². Todas as fibras nervosas inteiras presentes nesta área, com exceção das fibras que apresentaram artefatos de fixação, foram medidas e contadas. Após contagem das fibras nervosas calculou-se a densidade axonial, medida em axônio/μm², através da fórmula: Densidade axonial = número de axônios/5128,17 μm² Foram realizadas as medidas da área e diâmetro mínimo da fibra nervosa e do axônio (Fig. 17). As medidas da área da bainha de mielina foram obtidas subtraindo-se a área axonial da área da fibra nervosa. Os resultados obtidos de área e menor diâmetro axonial foram organizados em uma tabela e, então, calculada a média das medidas obtidas para cada animal. A partir destas médias foi realizada a análise estatística para comparação entre os grupos. 62 MÉTODO Figura 17 – Seleção das fibras axoniais para medidas de área axonial, diâmetro axonial e área da bainha de mielina. Fibras inteiras circuladas internamente (axônio) em azul e externamente (fibra nervosa) em amarelo. 3.7. Análise Estatística Para a comparação dos sete grupos entre si, foi utilizada Análise de Variância (ANOVA), seguida pelo Teste de Tukey, se detectada diferença estatística. Quando comparados as massas iniciais às massas finais dos ratos, ou os dados do estudo eletrofisiológico antes das secções nervosas (G4 e G6) ou da NTL (G7) e antes do sacrifício dos animais, foi utilizado teste “t” pareado. Para comparação das medidas de diâmetro mínimo nos segmentos N1 e N3 nos grupos G3, G5 ou G7, foi utilizado teste “t” de Student. Em todas as análises foi utilizado nível de significância p<0,05. RESULTADOS 4. RESULTADOS 4.1. Massa corporal Quando avaliadas as massas corporais, medidas antes da cirurgia (inicial) e antes do sacrifício (final) dos ratos, não foi observada diferença estatística. Houve aumento significativo de massa, em todos os animais observados, quando comparadas as massas iniciais com as finais (Fig. 18 e Tabela 1). Figura 18 – Massa dos ratos (g). No gráfico estão representadas as médias e os respectivos desvios padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). a a a a a a a b b b b b b b 64 RESULTADOS Tabela 1 – Massas iniciais e finais dos ratos Grupo Massa (g) Inicial Final G1 196 ± 25 a 479 ± 47 b G2 192 ± 12 a 475 ± 67 b G3 197 ± 20 a 497 ± 53 b G4 198 ± 17 a 499 ± 56 b G5 201 ± 22 a 494 ± 75 b G6 199 ± 21 a 519 ± 52 b G7 186 ± 8 a 537 ± 74 b Letras diferentes indicam diferença estatística. 4.2. Teste de avaliação da marcha A Figura 19 e Tabela 2 mostram os resultados do índice funcional do nervo ciático (IFC) de cada grupo, expressos como porcentagem de perda da função normal. Os grupos G3 (-38,4 ± 8,8) e G5 (-45,1 ± 12,2) não diferiram, estatisticamente, entre si ou dos grupos G6 (-77,2 ± 13,5) e G7 (-70,8 ± 7,7). O G4 (-83,1 ± 6,0) não diferiu do grupo G7 ou dos grupos G2 (-109,3 ± 7,2) e G6. Figura 19 – Índice funcional do nervo ciático. No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). a b c bd c bc cd 65 RESULTADOS Tabela 2 – Índice funcional do nervo ciático GRUPO IFC G1 11,9 ± 7,5a G2 -109,3 ± 7,2b G3 -38,4 ± 8,8c G4 -83,1 ± 6,0bd G5 -45,1 ± 12,2c G6 -77,2 ± 13,5bc G7 -70,8 ± 7,7cd Letras diferentes indicam diferença estatística. Os resultados do índice funcional do nervo fibular comum (IFFC) estão representadas na Figura 20 e Tabela 3. Apenas o grupo G2 (-81,5 ± 9,0) diferiu dos demais grupos. Figura 20 – Índice funcional do nervo fibular comum. No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). a b a a a a a 66 RESULTADOS Tabela 3 – Índice funcional do nervo fibular comum GRUPO IFFC G1 -8,5 ± 6,7a G2 -81,5 ± 9,0b G3 -29,8 ± 12,4a G4 -25,0 ± 7,6a G5 -30,0 ± 10,9a G6 -34,5 ± 8,7a G7 -33,7 ± 4,1a Letras diferentes indicam diferença estatística. 4.3. Teste eletrofisiológico As Figuras 21 e 22 mostram, respectivamente, os resultados obtidos de amplitude e latência dos testes eletrofisiológicos realizados antes da secção do nervo fibular comum e, após 30 dias, imediatamente antes do sacrifício dos animais do grupo G4. A amplitude diminuiu significativamente, de 18,7 (± 1,7) mV para 4,6 (± 1,5) mV, após a secção do nervo fibular comum (Fig. 21 e Tabela 4), porém não foi observada diferença estatística quando analisados os resultados de latência (1,6 ± 0,1 ms e 1,8 ± 0,3 ms) (Fig. 22 e Tabela 4). Figura 21 – Amplitude (mV) antes da secção e antes do sacrifício no G4. No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). a b 67 RESULTADOS Figura 22 – Latência (ms) antes da secção e antes do sacrifício no G4. No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). O teste eletrofisiológico realizado antes das secções dos nervos fibular comum e tibial e, após 30 dias, imediatamente antes do sacrifício, dos animais do grupo G6 mostrou diminuição significativa da amplitude, de 17,4 (± 2,0) mV para 0,5 (± 0,5) mV, após as secções (Fig. 23 e Tabela 4). Observou- se também diferença estatisticamente significante entre os resultados de latência, que aumentou de 1,7 (± 0,2) ms tendendo para o infinito, ou seja, ausência de latência (Fig. 24 e Tabela 4). Figura 23 – Amplitude (mV) antes das secções e antes do sacrifício no G6. No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). a a a b 68 RESULTADOS Figura 24 – Latência (ms) antes das secções e antes do sacrifício no G6. No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). Quando analisados os resultados do grupo G7 observou-se aumento significativo da amplitude, de zero para 11,2 (± 0,9) mV (Fig. 25 e Tabela 4), e uma diminuição estatisticamente significativa na latência de infinito para 2,3 (± 0,1) ms (Fig. 26 e Tabela 4). Figura 25 – Amplitude (mV) antes da NTL e antes do sacrifício no G7. No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). a b a b 69 RESULTADOS Figura 26 – Latência (ms) antes da NTL e antes do sacrifício no G7. No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). Tabela 4 – Amplitude e latência antes da secção/NTL ou do sacrifício nos grupos G4, G6 e G7 Grupo Secção/NTL Sacrifício G4 Amplitude (mV) 18,7 ± 1,7a 4,6 ± 1,5b Latência (ms) 1,6 ± 0,1a 1,8 ± 0,3a G6 Amplitude (mV) 17,4 ± 2,0a 0,5 ± 0,5b Latência (ms) 1,7 ± 0,2a �b G7 Amplitude (mV) 0a 11,2 ± 0,9b Latência (ms) �a 2,3 ± 0,1b Letras diferentes indicam diferença estatística. Quando todos os grupos foram comparados entre si, não foi observada diferença estatística de amplitude entre os grupos G1 (29,1 ± 1,8 mV) e G3 (22,1 ± 2,7 mV). O grupo G3 não se diferenciou do grupo G5 (21,5 ± 1,9 mV). Os grupos G2 (zero), G4 (4,9 ± 1,6 mV) e G6 (0,5 ± 0,5 mV) apresentaram amplitude estatisticamente menor que os grupos G1, G3 e G5 (Fig. 27 e Tabela 5). O grupo G4 não se diferenciou do grupo G7 (11,1 ± 0,98). a b 70 RESULTADOS Figura 27 – Amplitude (mV). No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). Os resultados de latência antes do sacrifício dos animais em cada grupo estão representados na Figura 28 e Tabela 5. Não houve diferença significativa quando comparados os grupos G1 (1,6 ± 0,1 ms), G3 (1,9 ± 0,1 ms), G4 (1,9 ± 0,3 ms), G5 (1,8 ± 0,04 ms) e G7 (2,3 ± 0,1 ms). Os grupos G2 e G6 não diferiram entre si, mas diferiram dos demais. Figura 28 – Latência (ms). No gráfico estão representadas as médias e os respectivos erros padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). a b bd b ac c d a b a a a a b 71 RESULTADOS Tabela 5 – Teste eletrofisiológico: comparação entre os grupos Grupo Amplitude (mV) Latência (ms) G1 29,1 ± 1,8a 1,6 ± 0,1a G2 0b �b G3 22,1 ± 2,7ac 1,9 ± 0,1a G4 4,9 ± 1,6bd 1,9 ± 0,3a G5 21,5 ± 1,9c 1,8 ± 0,04a G6 0,5 ± 0,5b �b G7 11,1 ± 0,98d 2,3 ± 0,1a Letras diferentes indicam diferença estatística. Em todos os animais, exceto os dos grupos G2 e G6, ao se deflagrar estímulos no nervo ciático foi observada extensão do pé com contração do músculo tibial cranial. 4.4. Massa do músculo tibial cranial Não foi observada diferença estatística entre as massas dos músculos tibiais craniais dos grupos G1 (0,897 ± 0,02g), G3 (0,818 ± 0,03 g), G5 (0,885 ± 0,04 g) e grupo Média MTCE (E) (0,859 ± 0,01 g). Estes grupos apresentaram massa muscular significativamente maior comparado aos grupos G2 (0,187 ± 0,03 g), G4 (0,431 ± 0,04 g), G6 (0,345 ± 0,02 g) e G7 (0,469 ± 0,03 g) (Fig. 29 e Tabela 6). Todos os grupos apresentaram massa muscular maior que o grupo G2 (controle de desnervação). 72 RESULTADOS Figura 29 – Massa do músculo tibial cranial (g). No gráfico estão representadas as médias e os respectivos desvios padrões. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). Tabela 6 – Massa do músculo tibial cranial Grupos Massa MTCD (g) Massa MTCE (g) (MTCD/MTCE x 100) % G1 0,897 ± 0,02 a 0,826 ± 0,02* 109 G2 0,187 ± 0,03 b 0,798 ± 0,02* 23 G3 0,818 ± 0,03 a 0,850 ± 0,01 96 G4 0,431 ± 0,04 c 0,873 ± 0,02* 49 G5 0,885 ± 0,04 a 0,871 ± 0,02 102 G6 0,345 ± 0,02 c 0,866 ± 0,02* 40 G7 0,469 ± 0,03 c 0,922 ± 0,02* 51 Média MTCE (E) 0,859 ± 0,01 a - Letras diferentes indicam diferença estatística. * diferença estatística quando comparado ao grupo correspondente. A massa do MTCE dos animais do grupo G1 (0,826 ± 0,02 g) apresentou valor estatisticamente menor (p = 0,014) quando comparado à massa do MTCD (0,897 ± 0,02 g) no grupo G1. Não foi observada diferença estatística quando comparados os MTCD e MTCE nos grupos G3 e G5 (Tabela 6). c a a a a b c c 73 RESULTADOS 4.5. Análise morfométrica do músculo tibial cranial Quando comparadas as medidas das áreas das fibras do músculo tibial cranial de cada grupo (Fig. 30 e Tabela 7), os grupos G3 (1942,3 ± 153,0 μm2) e G5 (2131,4 ± 166,2 μm2) não diferiram entre si ou do grupo G1 (2044,3 ± 184,9 μm2). Estes grupos apresentaram fibras musculares com áreas estatisticamente maiores que os grupos G2 (290,5 ± 36,3 μm2) e G6 (648,8 ± 37,6 μm2), grupos desnervados, e grupos G4 (1135,4 ± 157,8 μm2) e G7 (1216,7 ± 105,9 μm2), onde ocorreu reinervação. O grupo G2 (290,5 ± 36,3 μm2) apresentou fibras musculares menores que os demais grupos. O grupo G4 (1135,4 ± 157,8 μm2) não apresentou diferença estatística quando comparado aos grupos G6 (648,8 ± 37,6 μm2) e G7 (1216,7 ± 105,9 μm2).