0 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL CITOLOGIA DE LAVADO VESICAL PREPARADO POR CITOCENTRIFUGAÇÃO – PADRONIZAÇÃO DO MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS VESICAIS EM CÃES Amanda Leal de Vasconcellos Médica Veterinária 2016 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL CITOLOGIA DE LAVADO VESICAL PREPARADO POR CITOCENTRIFUGAÇÃO – PADRONIZAÇÃO DO MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS VESICAIS EM CÃES Amanda Leal de Vasconcellos Orientadora: Prof.ª Dr. ª Marileda Bonafim Carvalho Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Medicina Veterinária, área de Clínica Médica Veterinária. 2016 2 Vasconcellos, Amanda Leal V331c Citologia de lavado vesical preparado por citocentrifugação: Padronização do método para diagnóstico de doenças vesicais em cães / Amanda Leal de Vasconcellos. – – Jaboticabal, 2016 xix, 96 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016 Orientadora: Marileda Bonafim Carvalho Banca examinadora: Andrigo Barboza De Nardi, Alessandre Hataka, Fábio Nelson Gava, Márcia Mery Kogika Bibliografia 1. Barbotagem. 2. Urotélio. 3. Morfologia celular. 4. Cistite bacteriana. 5. Neoplasia vesical. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:616.62:636.7 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. 3 4 DADOS CURRICULARES DO AUTOR AMANDA LEAL DE VASCONCELLOS – nascida em Vassouras-RJ, aos oito de maio do ano de 1985, filha de Eduardo Apolinário de Vasconcellos e Tania Regina de Paula Leal de Vasconcellos. Em dezembro de 2007, graduou-se em Medicina Veterinária na Universidade de Marília (UNIMAR) em Marília-SP. Nos anos de 2008 e 2009 participou do programa de Residência em Clínica Médica de Pequenos Animais do Hospital Veterinário “Prof. Dr. Vicenti Borelli” da Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade de Marília. Em fevereiro de 2012, obteve o título de Mestre na área de Clínica Médica, do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, câmpus de Jaboticabal-SP. Em março de 2012, ingressou no Curso de Doutorado do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária – área de Clínica Médica, da mesma Instituição de Ensino Superior. Em dezembro de 2014, obteve o título de Especialista em Docência do Ensino Superior, do Programa de Pós-Graduação lato sensu em Docência do Ensino Superior da Universidade de Marília. Em julho de 2015, recebeu o prêmio de melhor trabalho apresentado no Congresso MedVep de Especialidades Veterinárias – Curitiba-PR (segundo lugar), pela Comissão Científica do evento, com o trabalho intitulado “Fatores de risco para cistite bacteriana em cães – Estudo epidemiológico” (Apêndice A). É coautora do capítulo “Neoplasias do sistema urinário” do livro Oncologia em Cães e Gatos – Daleck & De Nardi, 2016. Atualmente é integrante do Grupo de Pesquisa em Nefrologia e Urologia Veterinária – GPNUV da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, câmpus de Jaboticabal-SP, docente das disciplinas de Semiologia, Clínica Médica de Pequenos Animais e Terapêutica no Centro Universitário Regional de Espírito Santo do Pinhal – UniPinhal e docente do Curso de Pós-graduação lato sensu de Clínica Médica e Cirúrgica de Pequenos Animais do Instituto Qualittas. 5 Epígrafe “A possibilidade de realizarmos um sonho, é o que torna a vida interessante.” Paulo Coelho 6 Dedicatória Aos meus fiéis companheiros Penélope, Napoleão, Nicole, Leona e Olívia, e a todos os cães que involuntariamente contribuíram para a realização deste trabalho. 7 AGRADECIMENTOS À Deus em primeiro lugar por ter me dado a vida, o dom e prazer de lidar com os animais, e à Nossa Senhora Aparecida que iluminou meu caminho; Aos meus pais Tania e Eduardo, pelo apoio durante todos os anos de pós- graduação, que não foram poucos, e ao meu irmão Vitor pelas caronas até Ribeirão Preto este ano; À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Marileda Bonafim Carvalho “Mãerileda”, pela orientação, cuidado e carinho, além de todos os conhecimentos transmitidos ao longo destes quase sete anos, que contribuíram e contribuem muito para minha formação profissional e pessoal; Ao meu irmão “nefrético” Marcelo Augusto Moraes Koury Alves “Moreco”, pela amizade, companheirismo, zelo, atenção e colaboração, não só nos momentos de trabalho, mas “na alegria e na tristeza, na saúde e na doença, em todos os momentos mais importantes das nossas vidas de pós-graduandos”; Ao Prof. Dr. Alessandre Hataka pela colaboração importante na minha graduação e residência; sem a seriedade e rigidez com a qual trabalhava e ensinava eu com certeza não seria a profissional que sou! Além da grande colaboração na execução deste trabalho, que sem ele não seria possível; Aos Professores Andrigo Barboza De Nardi, Bruno Watanabe Minto, Paola de Castro Moraes e Julieta Rodine Engarcia de Moraes pela colaboração na banca de qualificação; À Paula Bilbau pela hospedagem e amizade durante minha estadia em Botucatu; Aos meus amigos Reinaldo Juan Garrido Palacios Junior “Flácido”, Mariana Cristina Rondelle, Fernanda Machado, Graziella Freitas Piccin, Jéssica Oliveira Manhães, Ana Guerreiro, Luís Guilherme de Faria, Beatriz Marume Pessoa Alves, João Augusto Leonel, Jorge Cardoso Filho, Laryssa Rosseto, Luciano Moraes Aude e Diva Carla Cordeiro por toda amizade e companheirismo neste período; 8 Aos moradores e agregados da República Nazarena, em especial à Sandrinha, por todas as bagunças, loucuras compartilhadas e conselhos; À República Misto Quente, principalmente à Denise Chung, por permitirem que os cães participassem como controle deste trabalho; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de Doutorado; Ao Serviço de Patologia Veterinária do Hospital Veterinário – Unidade Auxiliar de apoio acadêmico da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Unesp campus de Botucatu-SP, pela colaboração; A todos os funcionários do HV da FCAV/Unesp, campus de Jaboticabal, que indiretamente colaboraram com a realização deste trabalho. Obrigada! viii SUMÁRIO Página RESUMO .................................................................................................................... xi ABSTRACT ............................................................................................................... xii LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................xi LISTA DE TABELAS..................................................................................................xiv LISTA DE FIGURAS...................................................................................................xv CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS..............................................................1 Introdução..................................................................................................................1 Objetivos....................................................................................................................2 Revisão de Literatura................................................................................................3 Referências.............................................................................................................19 CAPÍTULO 2 – PADRONIZAÇÃO DE TÉNICAS PARA LAVADO VESICAL E PREPARAÇÃO DE LÂMINAS PARA INVESTIGAÇÃO CITOLÓGICA EM AMOSTRAS OBTIDAS DE CÃES SADIOS...............................................................32 Introdução................................................................................................................32 Material e Métodos..................................................................................................34 Animais...............................................................................................................34 Constituição do grupo.........................................................................................34 Avaliação dos pacientes.....................................................................................34 Ultrassonografia vesical.....................................................................................35 Lavado vesical....................................................................................................35 Exame citológico de lavado vesical....................................................................35 Análise estatística dos resultados......................................................................37 Resultados...............................................................................................................37 Discussão................................................................................................................43 Conclusões..............................................................................................................48 Referências.............................................................................................................49 CAPÍTULO 3 – CONTRIBUIÇÃO DA CITOLOGIA VESICAL PARA REFINAMENTO DE DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS VESICAIS EM CÃES......................................54 Introdução................................................................................................................54 Material e Métodos..................................................................................................56 Animais...............................................................................................................56 Constituição dos grupos.....................................................................................56 Avaliação dos pacientes.....................................................................................57 ix Sinais do trato urinário inferior (STUI)................................................................57 Ultrassonografia vesical.....................................................................................57 Lavado vesical....................................................................................................58 Exame citológico de lavado vesical....................................................................58 Análise estatística dos resultados......................................................................59 Resultados...............................................................................................................60 Discussão................................................................................................................74 Conclusões..............................................................................................................78 Referências.............................................................................................................79 CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS..............................................................87 Referências.............................................................................................................90 APÊNDICES...............................................................................................................92 Apêndice A – Declaração da premiação de trabalho científico...............................93 Apêndice B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE.....................94 Apêndice C – Coloração de Papanicolaou..............................................................95 Apêndice D – Coloração de Gram...........................................................................96 x xi CITOLOGIA DE LAVADO VESICAL PREPARADO POR CITOCENTRIFUGAÇÃO – PADRONIZAÇÃO DO MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS VESICAIS EM CÃES RESUMO – O objetivo do presente estudo foi padronizar a metodologia de citologia de lavado vesical preparado pelo método de citocentrifugação, avaliar o padrão das células epiteliais de transição em cães e aplicabilidade clínica da citopatologia esfoliativa como método complementar de diagnóstico de doenças vesicais em cães. O estudo foi realizado em duas fases. A primeira incluiu 34 pacientes sem anormalidade ou doença vesical (cães adultos, machos e fêmeas), para padronização da metodologia e caracterização da celularidade normal. Na segunda fase foram avaliados 95 pacientes (cães adultos, machos e fêmeas), com ou sem sinais do trato urinário inferior. Em ambas as fases os cães foram avaliados por meio de exames de rotina, com destaque para sedimentoscopia de urina, urocultura e exame ultrassonográfico da bexiga, além da citologia de lavado vesical preparada pelo método de citocentrifugação (colorações de Papanicolaou, Giemsa, Rosenfeld modificado e Gram – somente na segunda fase). Os resultados obtidos indicaram que a técnica empregada no estudo para recuperação celular realizada com barbotagens de três ciclos utilizando 1mL/kg de solução salina, se mostrou eficaz para avaliação de células uroteliais de cães sadios. Com o segundo estudo, que incluiu pacientes com doença vesical, concluiu-se que o conjunto de avaliações para o diagnóstico de doença vesical empregado são complementares e as contribuições de cada exame variam de acordo com o tipo de enfermidade a ser diagnosticada. A citologia de lavado vesical se mostrou como exame tão relevante quanto a sedimentoscopia no que se refere às características de sensibilidade e especificidade para detectar sadios e doentes, mas com as vantagens de conferir refinamento aos diagnósticos ou viabilizar o diagnóstico não concluído pelos exames anteriores. Palavras-chave- barbotagem, urotélio, morfologia celular, cistite bacteriana, neoplasia vesical xii CYTOLOGY OF CYTOCENTRIFUGED BLADDER WASHING – STANDARDIZATION METHOD FOR BLADDER DISEASES DIAGNOSES IN DOGS ABSTRACT- The objective of this study was to standardize the methodology for cytology bladder washing prepared by cytospin method to evaluate the pattern of epithelial transition cells in dogs and the clinical applicability of exfoliative cytology as a complementary method for of bladder diseases diagnosis in dogs. The study was conducted in two phases. The first one included 34 patients without bladder abnormality or disease (adult dogs, male and female), for standardization of the methodology and characterization of the typical cellularity. In the second phase it was evaluated a group of 95 patients (adult dogs, male and female), with or without lower urinary tract signs. In both phases the dogs were evaluated by routine tests, especially sediment of urine, urine culture and ultrasound bladder examination, as well as cytology of bladder washing prepared by cytospin (stains of Papanicolaou, Giemsa, Rosenfeld modified and Gram - only in the second phase). The results indicated that the technique used in the study for cell recovery, performed with three barbotage cycles using 1 mL/kg of saline, was effective for urothelial cells evaluation from healthy dogs. In the second study, which included patients with bladder disease, it is concluded that the employed set of evaluations for bladder disease diagnosis are complementary and the contributions of each test vary with the type of disease to be diagnosed. The cytology of bladder washing showed was as relevant as the sediment, considering the sensitivity and specificity to detect healthy and sick patients, but with the advantages of giving refinement to enable diagnosis or the diagnosis not completed by previous tests. Keywords- barbotage, urothelium, cellular morphology, bacterial cystitis, bladder neoplasia. xiii LISTA DE ABREVIATURAS CAR – Com alteração relevante CB – Cistite bacteriana CCT – Carcinoma de células de transição CET – Células epiteliais de transição CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais CLV – Citologia de lavado vesical DV – Doença vesical EPM – Erro padrão da média GPNUV – Grupo de Pesquisa em Nefrologia e Urologia Veterinária IC – Intervalo de confiança LMS – Leiomiossarcoma N – Bexiga normal PIB – Processo inflamatório bacteriano PIBCA – Processo inflamatório bacteriano crônico ativo PIBN – Processo inflamatório bacteriano neutrofílico PI – Processo inflamatório PII – Processo inflamatório inespecífico PIN – Processo inflamatório neutrofílico PISCA – Processo inflamatório sem causa aparente SAR – Sem alteração relevante SIU – Sinal de inflamação urotelial SIUbac – Sinal de inflamação urotelial e bacteriúria SNUV – Serviço de Nefrologia e Urologia Veterinária SPNeo – Sugestivo de processo neoplásico SRD – Sem raça definida STUI – Sinais de trato urinário inferior UP/C – Razão proteína/creatinina urinária xiv LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. Características dos 34 cães sem sinais clínicos ou laboratoriais de doença vesical, avaliados para determinação de padrões citológicos normais de lavado vesical. 39 Tabela 2. Dados de estatística descritiva de variáveis relativas aos pacientes e às amostras de urina, coletadas imediatamente antes do lavado vesical, de 36 cães com bexiga normal e 59 com doença vesical. 65 Tabela 3. Sumário de resultados das avaliações e diagnósticos da condição vesical de 95 pacientes da espécie canina encaminhados para o Serviço de Nefrologia e Urologia Veterinária – FCAV/Unesp Jaboticabal, para diagnóstico ou check-up. 68 Tabela 4. Sumário das análises de tabelas de contingência para determinação das características de desempenho de exames para diagnóstico de doenças vesicais em cães, tendo como referência (padrão ouro) o diagnóstico conclusivo. 69 Tabela 5. Sumário das análises de tabelas de contingência para determinação das características de desempenho para diagnóstico de neoplasia vesical em cães, tendo como referência (padrão ouro) o diagnóstico conclusivo. 69 xv LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Representação esquemática do urotélio humano adaptado 15 Figura 2. Fotomicrografias de citologia de lavado vesical preparado por citocentrifugação de animais normais (400x). Colorações de Papanicolaou, Giemsa, Rosenfeld modificado e Gram. 40 Figura 3. Fotomicrografia de citologia de lavado vesical preparado por citocentrifugação de cadela normal (400 x 2,5). Coloração de Giemsa. 42 Figura 4. Representação gráfica dos diagnósticos conclusivos dos 95 pacientes avaliados. 64 Figura 5. Representação gráfica dos dados de (A) massa corporal e idade dos pacientes sadios e com doença vesical avaliados e (B) pH, densidade e razão proteína/creatinina das amostras de urina coletadas imediatamente antes da lavagem vesical. 66 Figura 6. Representação gráfica das bactérias isoladas da urina de 45 cães com cistite bacteriana. 67 Figura 7. Fotomicrografias de citologia de lavado vesical preparado pelo método de citocentrifugação de cadela com carcinoma de células de transição (400x). Colorações de Papanicolaou, Giemsa, Rosenfeld modificado e Gram. 70 Figura 8. Fotomicrografia de citologia de lavado vesical preparado por citocentrifugação de cadela com carcinoma de células de transição (100x). Giemsa. 71 Figura 9. Fotomicrografias de citologia de lavado vesical preparado pelo método de citocentrifugação de cadela com cistite bacteriana causada por Klebsiella spp (400x). Colorações de Papanicolaou, Giemsa, Rosenfeld modificado e Gram. 72 Figura 10 Fotomicrografias de citologia de lavado vesical preparado 73 xvi pelo método de citocentrifugação de animais com cistite bastonetes Gram-positivos e cocos Gram-negativos (400x). Coloração de Gram. Figura 11 Fotomicrografia de citologia de lavado vesical preparado por citocentrifugação de cadela com cistite bacteriana e carcinoma de células de transição (400x). Coloração de Rosenfeld modificado. 73 1 CAPÍTULO 1 – Considerações gerais Introdução Assim como os humanos, os cães são acometidos por diversos tipos de doenças vesicais e distúrbios da micção. Na prática veterinária é possível constatar que as alterações mais comuns ao trato urinário inferior incluem cistite bacteriana (40%), incontinência urinária (24%) e urolitíase (18%), como relatado (BARSANTI, 2006; LULICH et al., 2008; VASCONCELLOS, 2012; VASCONCELLOS et al., 2016). Estima-se que 14% dos cães sejam acometidos por cistite bacteriana em algum momento de sua existência e que esta enfermidade corresponda a 10% das doenças infeciosas de cães atendidos na rotina de clínicas e hospitais veterinários (OSBORNE; STEVENS, 1999; BARSANTI, 2006; LING, 2008). Os caninos domésticos também podem ser acometidos por outras afecções vesicais, destacando-se as cistites fúngicas, parasitárias e química, neoplasias vesicais, doenças congênitas e lesões traumáticas (CARVALHO et al., 2016; OSBORNE; LULICH; ALBASAN, 2011; PRESSLER, 2011). Apesar da grande variedade etiopatogênica, as afecções vesicais podem se manifestar clinicamente de modo muito semelhante, o que dificulta a distinção. E não raramente, nos casos crônicos, os sinais estão ausentes. Tais condições podem gerar dificuldades no diagnóstico ou mesmo resultar em diagnóstico tardio, fatos que contribuem para o desenvolvimento de complicações. Neste cenário, o exame urológico adequado de rotina muitas vezes não é suficiente para identificar a etiologia da doença e evitar o uso indiscriminado de antibióticos. Assim, faz-se necessário a realização de exames complementares laboratoriais e de imagem, para o refinamento diagnóstico e instituição da terapia apropriada. Quando o paciente é atendido em serviço especializado, a avaliação de rotina para doenças vesicais inclui anamnese, exame físico, exames laboratoriais como hemograma, bioquímica sérica e urinária, urinálise e urocultura, além de exames de imagem conforme cada caso em particular. A prática mostra que este conjunto de exames é suficiente para conclusão diagnóstica, na maioria dos casos. Contudo, não raramente, são requeridas avaliações adicionais, principalmente nos casos 2 complicados por fatores predisponentes ou pelo desenvolvimento simultâneo de duas afecções vesicais distintas. Quando necessário, podem ser indicados outros exames, tais como biópsia, tomografia e cirurgia exploratória. Embora estes procedimentos possam levar ao diagnóstico conclusivo, os custos, riscos para o paciente e resultados frustrantes frequentemente são fatores impeditivos. Contudo, a disponibilização de algum exame de execução rápida, custo baixo, minimamente invasivo e de pouco risco para o paciente, pode constituir alternativa viável. A citopatologia esfoliativa, vem sendo utilizada na medicina para diagnóstico e acompanhamento de casos de neoplasia vesical, em função da praticidade, baixo custo e confiabilidade dos resultados. Assim, considerou-se a hipótese de que a avaliação citopatológica, devidamente adaptada para exame vesical de cães pode constituir método alternativo para complementação diagnóstica. A literatura veterinária revela que este tema não tem sido explorado. Embora a citologia vesical seja, ocasionalmente, citada como uma possibilidade, não existem dados para viabilizar sua aplicação prática. Deste modo, justifica-se um estudo sistematizado que possa oferecer resultados relacionados à padronização e aplicação dos métodos, de acordo com os objetivos que se seguem. Objetivos Geral Padronizar a metodologia e avaliar a aplicabilidade clínica da citopatologia esfoliativa como método complementar de diagnóstico de doenças vesicais em cães. Específicos 1. Estabelecer um protocolo de lavado vesical apropriado para a obtenção de células epiteliais de transição, dentre outros elementos figurados. 2. Padronizar a técnica para recuperação das células e outros elementos, e preparação de lâminas por citocentrifugação. 3. Executar as avaliações citológicas de lâminas coradas pelas técnicas de Papanicolaou, Giemsa, Rosenfeld modificado e Gram. 3 4. Avaliar as contribuições dos diferentes corantes para identificação e análise morfológica dos elementos presentes nas preparações. 5. Analisar a performance da citologia de lavado vesical preparado pela técnica de citocentrifugação, em relação ao desempenho da avaliação de rotina para conclusão diagnóstica. Revisão de literatura A bexiga, também denominada vesícula urinária, é um órgão cavitário musculomembranoso que tem como principal função servir de reservatório temporário para a urina produzida pelos rins (CARVALHO, 2014). O tamanho e a posição, da vesícula urinária dos cães, variam de acordo com o volume da urina nela armazenada. A bexiga vazia é pequena, tem formato globular e localização quase inteiramente pélvica; quando distendida por urina, apresenta formato de pera projetando-se para a cavidade abdominal. A uretra, que comunica o trato urinário com o meio externo, se apresenta como continuação do colo vesical e termina no óstio uretral externo (FLETCHER; CLARKSON, 2011; CARVALHO, 2014; KOGIKA; WAKI, 2015). A parede vesical é constituída pelo detrusor, composto por três camadas de musculatura lisa recoberta, externamente, por uma camada serosa. A superfície luminal da bexiga é revestida por submucosa e mucosa (KOSS, 1977; LULICH et al., 2008; CARVALHO, 2014). O revestimento interno da bexiga, assim como o da pelve renal, ureteres e uretra são constituídos por epitélio altamente especializado, denominado urotélio ou epitélio de transição (KOSS, 1977; ALM; COLLEN, 1982; FLETCHER; CLARKSON, 2011; CARVALHO, 2014; KOGIKA; WAKI, 2015; WAKI; KOGIKA, 2015). O trato urinário normal é estéril, desde os rins até a metade proximal da uretra, a partir da qual existem microrganismos residentes que compõem a microbiota local. Estes microrganismos, eventualmente, podem estar implicados em infecção de trato urinário, contudo, constituem parte dos mecanismos de defesa (BARTGES, 2004; BARSANTI, 2006; SENIOR, 2011; OLIN; BARTGES, 2015). 4 Além da defesa propiciada pela microbiota, diversos mecanismos atuam para proteger o trato urinário contra infecções e, em parte, contra a formação de urólitos. O fluxo urinário normal é um mecanismo eficiente de defesa. O esvaziamento periódico da bexiga faz com que 95% dos microrganismos presentes e não aderidos, sejam removidos. As bactérias normalmente estão presentes na uretra distal, contudo, a alta pressão dentro da uretra e suas contrações espontâneas ajudam a prevenir a ascensão dos microrganismos (OSBORNE; STEVENS, 1999; BARTGES, 2004; SENIOR, 2011). A urina frequentemente é bacteriostática e, algumas vezes bactericida, dependendo da sua composição. As concentrações altas de substâncias como a ureia, os ácidos orgânicos, os carboidratos de baixo peso molecular e as mucoproteínas previnem as infecções bacterianas. Variações do pH (ácido) e da densidade urinária (urina concentrada) têm efeito inibidor de crescimento bacteriano (BARSANTI, 2006; SENIOR, 2011; OLIN; BARTGES, 2015). Os demais recursos de defesa são exercidos pelo próprio urotélio por meio da camada de glicosaminoglicano que recobre a camada luminal de células que ajudam a prevenir a aderências de bactérias. Contudo, havendo aproximação ou invasão bacteriana, o urotélio pode ser defendido por imunoglobulinas (IgA) e pela esfoliação celular (LING, 2008; SENIOR, 2011). Apesar dos diversos mecanismos que constituem barreiras contra infecção bacteriana, o trato urinário inferior é alvo frequente de invasão por microrganismos. São descritos inúmeros fatores que podem predispor à cistite bacteriana (CB), incluindo alterações anatômicas, doenças endócrinas, metabólicas ou neurológicas, doença renal crônica, neoplasias, urolitíase, má formação do trato genital, dentre outras. Tais condições podem comprometer os mecanismos naturais de defesa por causarem diminuição da capacidade imunológica sistêmica e local ou por induzirem postergação máxima da micção ou impossibilidade de esvaziamento vesical (FORRESTER et al., 1999; CETIN et al., 2003; BARSANTI, 2006; SENIOR, 2011; SYCAMORE et al., 2014; WONG; EPSTEIN; WESTROPP, 2015; VASCONCELLOS et al., 2016). Outros fatores inerentes às características dos animais podem ter relação com a ocorrência de CB. Por ordem decrescente de frequência, a CB acomete 5 fêmeas castradas, machos castrados, fêmeas intactas e, raramente, machos intactos (OSBORNE; STEVENS, 1999; BARSANTI, 2006; SYCAMORE et al., 2014; VASCONCELLOS et al., 2016). Entretanto, algumas publicações com séries de casos clínicos descrevem a predominância do acometimento dos machos sobre as fêmeas (FERIAN et al., 2007; PAPPAÍARDO et al., 2007) ou não observam relação entre CB e sexo (CARVALHO et al., 2014). Ainda existem controvérsias em relação à predisposição racial e faixa etária para a ocorrência de CB em cães. Norris et al. (2000) descreveram maior ocorrência em cães das raças Pastor Alemão, Poodle, Labrador, Teckel, Doberman e SRD. Contudo, Pappaíardo et al. (2007), Carvalho et al. (2014) e Vasconcellos et al. (2016) relataram predomínio de casos em cães SRD, enquanto Cetin et al. (2003) não encontraram associação entre raça e CB. Segundo Osborne e Stevens (1999), a CB ocorre com maior frequência em cães com menos de dois anos ou acima de seis anos de idade. Contudo, publicações mais recentes, da literatura brasileira, apontam maior frequência em cães com mais de oitos anos de idade (CARVALHO et al., 2014; KOGIKA; WAKI, 2015; VASCONCELLOS et al., 2016). A prevalência de CB em cães idosos pode ter relação com a existência de comorbidades comuns a essa faixa etária e também com diagnóstico tardio de casos crônicos, assintomáticos ou de recorrência (VASCONCELLOS et al., 2016). A maior parte das infecções bacterianas do trato urinário inferior ocorrem pela migração ascendente de bactérias de origem dermal ou intestinal, as infeções de origem hematógena são menos frequentes (BARSANTI, 2006; SENIOR, 2011; THOMPSON et al., 2011; OLIN; BARTGES, 2015). As bactérias isoladas com maior frequência da urina de cães são as gram- negativas Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp., e as gram-positivas Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. (BARSANTI, 2006; SENIOR, 2011; VASCONCELLOS et al., 2016). Outras bactérias isoladas com menor frequência, nos casos de CB, incluem Enterococcus spp. (FORRESTER et al., 1999; NORRIS et al., 2000; SEGUIN et al., 2003; BALL et al., 2008), Corynebacterium urealyticum (NORRIS et al., 2000; BALL 6 et al., 2008; VARGES et al., 2009), Citrobacter spp. (FORRESTER et al., 1999; NORRIS et al., 2000; BALL et al., 2008), Serratia spp. (FORRESTER et al., 1999; NORRIS et al., 2000; ISHII et al., 2011), Acinetobacter spp., Morganella morganii, Lactobacillus spp., Pasteurella multocida (NORRIS et al., 2000; BALL et al., 2008), Mycoplasma spp., Providencia spp., Salmonella spp., Micrococcus spp., Bordetella spp., Eubacterium spp., Haemophilus spp., Oligella spp., Rhodotorula spp., Actinomyces spp. (NORRIS et al., 2000), Bacillus spp., Bacteroides spp., Clostridium spp. (BALL et al., 2008), e Yersinia spp. (ISHII et al., 2011). Dentre as bactérias causadoras de CB, a E. coli é a mais isolada nas culturas de urina e os relatos indicam predominância em torno de 40% a 70% dos casos (FORRESTER et al., 1999; NORRIS et al., 2000; SEGUIN et al., 2003; BALL et al., 2008; SENIOR, 2011; THOMPSON at al., 2011; SYCAMORE et al., 2014; OLIN; BARTGES, 2015). Em estudo realizado no Brasil, Carvalho et al. (2014) isolaram E. coli da urina de 55% dos pacientes com CB, seguido de 20% de Staphylococcus spp. e os outros 25% de outros dez gêneros bacterianos. Pena et al. (2010) também no Brasil, verificaram que de 348 cães com diagnóstico presuntivo de CB, foram isolados estafilococos em 70 animais, diferindo dos outros estudos. A espécie mais frequente foi Staphylococcus pseudintermedius (32,8%), seguida por S. saprophyticus. Os autores enfatizam o fato de que 77,1% dos isolados apresentaram resistência múltipla aos antimicrobianos, em teste in vitro feito com os principais representantes de seis classes dos medicamentos mais utilizados em nosso meio. Em estudo americano realizado por Windahl et al. (2014), de 623 pacientes com cistite bacteriana, houve predomínio de E. coli em 429 pacientes (68,9%), seguido de Staphylococcus spp. (18,4%). Wong; Epstein e Westropp (2015), também relataram maior ocorrência de E. coli (52,5%) seguido de Staphylococcus spp. (13,6%) em 1028 uroculturas realizadas em cães. As cistites bacterianas além de se apresentarem de maneira aguda ou crônica com ou sem sinais clínicos, podem ser apresentadas de forma simples ou complicada. A coexistência de infecção e outras alterações vesicais, primárias ou secundárias, caracteriza a cistite complicada (LULICH; OSBORNE, 1995; 7 FORRESTER et al., 1999; BARTGES, 2004; BARSANTI, 2006; LULICH et al., 2008; SENIOR, 2011). Também são consideradas cistites complicadas as condições nas quais, em decorrência da infecção crônica, ocorrem outras alterações no trato urinário ou reprodutor tais como urolitíase, divertículo, pielonefrite, prostatite ou casos de infecção por mais de um microrganismo (LULICH; OSBORNE, 1995; BARSANTI, 2006; LULICH et al., 2008; SENIOR, 2011). Um único microrganismo patogênico é isolado na urina de cães em 75% dos casos, e 20% e 5% das infeções são causadas por dois e três microrganismos distintos, caracterizando infeções mistas (OLIN; BARTGES, 2015). Outro tipo de cistite complicada é a condição denominada cistite polipoide que envolve reação tecidual de origem epitelial, que pode se apresentar como uma massa única ou como espessamento e irregularidades difusas na parede vesical. Proteus spp é o gênero bacteriano comumente associado com este tipo de lesão (OLIN; BARTGES, 2015). Sua etiologia ainda permanece desconhecida, mas sugere-se que esteja associada com cistites crônicas, cateterização transuretral da bexiga e urolitíase, ou seja, relacionado à inflamação ou irritação persistente da mucosa vesical (PHILLIPS, 2011). A hipótese de que as formações polipoides possam ser um fenômeno pré-neoplásico, tem sido considerada (WOLFE et al., 2010). Ainda não existe consenso sobre a predisposição por sexo ou raça quanto ao desenvolvimento de cistite polipoide. Entretanto, Takiguchi e Inaba (2005) relataram maior predisposição em machos (70%), já Martinez et al. (2003) relataram 88% de ocorrência de cistite polipoide em fêmeas. No que se refere às raças, Martinez et al. (2003) verificaram a ocorrência de 29% dos casos em cães da raça Labrador, 29% em cães sem raça definida e os outros 42% que incluíam diversas raças de cães. Além da infecção bacteriana, a bexiga dos cães também pode ser colonizada por fungos e leveduras. Estas infecções são raras e os casos primários correspondem a menos de 1%. Em estudo de 1557 uroculturas, foram isolados microrganismos em 473 amostras, das quais apenas duas apresentaram espécies fúngicas (BALL et al., 2008). 8 A levedura Candida spp. é habitante normal da mucosa genital e dos tratos respiratório superior e gastrointestinal de cães, gatos e humanos; com predileção pela superfície das mucosas e pelas áreas de junção mucocutâneas (PRESSLER et al., 2003; BRITO et al., 2009). Por conseguinte, o microrganismo mais comumente isolado é a Candida albicans (PRESSLER et al., 2003; BARTGES, 2004; JIN; LIN, 2005; BARSANTI, 2006; BALL et al., 2008; BRITO et al., 2009; PRESSLER, 2011; SENIOR, 2011; OLIN; BARTGES, 2015). Em 2165 culturas de urina de cães com infecção, isolados de Candida spp. foram obtidos em apenas quatro casos (NORRIS et al., 2000). Pressler et al. (2003) relataram a ocorrência de C. albicans em 62% dos cães e gatos acometidos por cistite fúngica, e Jin e Lin (2005) observaram em 48% dos cães com candidúria. Outros tipos de fungos como Cryptococcus spp., Aspergillos spp., Torulopsis spp., Blastomyces spp., Trichosporon spp., Rhodotorula spp. e Histoplasma spp. podem ser encontrados na urina de cães (PRESSLER et al., 2003; JIN; LIN, 2005; PRESSLER, 2011; OLIN; BARTGES, 2015). As cistites fúngicas, na maioria das vezes estão associadas com instrumentação da bexiga, alteração na composição da urina, antibioticoterapia, corticoterapia, quimioterapia, imunossupressão e doenças como o diabetes mellitus, neoplasias (VIDIGAL; SVIDZINSKI, 2009; PRESSLER, 2011). Aproximadamente 17% dos casos de candidúria relatados em cães, são diagnosticados prévia ou simultaneamente com o diagnóstico de diabetes mellitus (PRESSLER, 2011). Infecções bacterianas diagnosticadas juntamente com infecções fúngicas podem ocorrer, Pressler et al. (2003) descrevem 45% dos casos com infecções concomitantes no diagnóstico inicial. Embora a CB seja a doença mais frequente, a bexiga pode ser acometida por diversos outros tipos de afecções. Em estudo retrospectivo de avaliações post- mortem, Inkelmann et al. (2012) relataram que a CB ocorreu em 34% dos casos de afecções vesicais, seguido de urolitíase (22,6%), inclusões virais (16,14%), variações anatômicas adquiridas (14,5%), neoplasias (9,5%), distúrbios circulatórios (2,2%) e anomalias do desenvolvimento em menos de 1% dos casos. As neoplasias vesicais correspondem a cerca de 2% das neoplasias que acometem os caninos domésticos (MORRIS; DOBSON, 2007; CARVALHO et al.; 9 2016; FOALE; DEMETRIOU, 2011). Aproximadamente 95% das neoplasias vesicais são malignas. O carcinoma de células de transição (CCT) é o tumor mais comumente diagnosticado (90%), seguindo-se casos raros de carcinoma de células escamosas, adenocarcinomas e outros tumores mesenquimais (CARVALHO et al., 2016; INKELMANN et al., 2011; PHILLIPS, 2011). Os tumores de bexiga são, em sua maioria, primários e acometem principalmente o trígono vesical (MUTSAERS et al., 2003; MORRIS; DOBSON, 2007; CARVALHO et al., 2016; DEMETRIOU, 2011; BUDRECKIS et al., 2015; CANNON; ALLSTADT, 2015). Em estudo realizado em cães por Budreckis et al. (2015), de 85 diagnósticos de CCT, 45% dos pacientes apresentavam CB concomitantemente. O microrganismo isolado com maior frequência foi o Staphylococcus spp. (23,9%), seguido da E. coli (19,8%). Estes tumores são mais comuns em cães de meia idade ou idosos e as fêmeas parecem ser mais acometidas do que os machos (CARVALHO et al., 2016; PHILLIPS, 2011). Os cães das raças Terrier e Beagle, parecem ser mais predispostos, o que faz levantar a hipótese de componente genético. Outros fatores como obesidade, uso prolongado de ciclofosfamida, exposição a herbicidas e pesticidas e a condição de fumante passivo também são relatados como fatores predisponentes para o carcinoma vesical em cães (CARVALHO et al., 2016; PHILLIPS, 2011; CANNON; ALLSTADT, 2015). Além dos diversos tipos de doenças, a bexiga dos cães pode ser afetada por lesões traumáticas. Tais transtornos são a causa mais frequente de uroperitônio (SURA, 2011). As lesões comumente são induzidas por trauma abdominal rombo ou perfurante, palpação abdominal exagerada, inserção demasiada de sondas urinárias rígidas e técnica inapropriada de cistocentese (LULICH et al., 2008). Independentemente da causa, as doenças vesicais se manifestam de modo restrito e semelhante. Os sinais clínicos que localizam as afecções do trato urinário inferior são hematúria, disúria, polaquiúria, estrangúria e incontinência urinária, que podem se manifestar de forma isolada ou combinada (FORRESTER et al., 1999; BARTGES, 2004; BARSANTI, 2006; LULICH et al., 2008; LITTMAN, 2011; PRESSLER, 2011; SENIOR, 2011; SURA, 2011; CANNON; ALLSTADT, 2015; 10 OLIN; BARTGES, 2015). Além da dificuldade para distinguir as doenças vesicais, em função da similaridade das manifestações, outros fatores, relativos aos sinais, podem constituir obstáculos. Alguns dos sinais relacionados podem ser manifestações de doenças renais, ureterais, uretrais ou genitais. Destacam-se como sinais ambíguos a hematúria e incontinência urinária (CARVALHO, 2014). Em função da natureza dos sinais clínicos e do fato de que as cistites bacterianas atingem a maioria dos cães com doença vesical, são comuns as conclusões precipitadas que resultam em erro de diagnóstico e de tratamento. Parte das falhas deve-se à avaliação insuficiente, muitas vezes resumida à consideração dos sinais clínicos (LULICH; OSBORNE, 1995; BARTGES, 2004; BARSANTI, 2006). Thompson et al. (2011) descrevem o diagnóstico inadequado de CB, como a principal causa de resistência antimicrobiana. Os recursos diagnósticos recomendados para a rotina urológica incluem anamnese, exame físico, urinálise, urocultura e diagnóstico por imagem (LULICH; OSBORNE, 1995; BARTGES, 2004; BARSANTI, 2006; SENIOR, 2011; CARVALHO, 2014; OLIN; BARTGES, 2015). Mesmo que seja realizada a avaliação completa, o insucesso diagnóstico pode sobrevir em função das próprias limitações dos recursos dos exames de rotina disponíveis (VASCONCELLOS et al., 2016). Como recurso adicional aos exames de rotina, as técnicas de citopatologia complementam a avaliação em muitas situações quando a biópsia do tecido não é viável (KOSS; MALAMED, 2006a). A citologia vesical pode ser de grande auxílio no diagnóstico de neoplasias, hiperplasias, pólipos e processos inflamatórios, além de permitir a identificação de microrganismos livres ou fagocitados (MEINKOTH; COWELL, 2002; ALVES et al., 2004; BORJESSON; DEJONG, 2012; SHANTHI et al., 2015). A obtenção de material para avaliação citológica da bexiga é extremamente simples e não invasiva, uma vez que as células uroteliais naturalmente esfoliadas são encontradas no sedimento urinário (KOSS; MALAMED, 2006b; BAKER, 2014; SHANTRI et al., 2015). Vilém Dušan Lambl, no ano de 1856, publicou um artigo sobre o uso do microscópio para a avaliação do sedimento urinário. O documento histórico apresentado pelo médico checo foi o marco inicial da citologia urinária contemporânea (KOSS; MALAMED, 2006b; DIAMANTIS; MAGIORKINIS, 2013). 11 Contudo, a citologia de sedimento urinário, até os dias atuais, é muito limitada, principalmente para diagnóstico de neoplasias de baixo grau (SHANTHI et al., 2015). Mesmo em lâminas com sedimento urinário corado, não é possível analisar apropriadamente a morfologia celular, talvez devido à escassez dos elementos celulares esfoliados (KOSS; MALAMED, 2006b; ZINKL, 2009; SHANTHI et al., 2015). A possibilidade de diagnóstico citopatológico de material obtido diretamente dos pacientes despertou o interesse médico. Diversos métodos para obtenção de amostras foram desenvolvidos e estão disponíveis nos dias atuais. O material para a citopatologia pode ser obtido por meio de (1) coleta de células esfoliadas, (2) remoção de células por técnica abrasiva, (3) biópsia aspirativa e (4) citologia intraoperatória. O método menos invasivo é o de coleta de células esfoliadas presentes em líquidos e secreções naturais ou obtidas por meio de lavagem (barbotagem) (BIBOO, 2006; KOSS; MELAMED, 2006a). A citopatologia esfoliativa avalia as células superficiais naturalmente descamadas (BIBOO, 2006). No caso de avaliação urotelial, as células se desprendem e são incorporadas à urina ou à solução empregada para barbotagem (KOSS; MELAMED, 2006a). O método de lavagem permite recuperar células superficiais em quantidade e qualidade apropriadas para a avaliação dos detalhes citoplasmáticos e nucleares, que refletem a condição das camadas subjacentes (BIBOO, 2005; KOSS; MELAMED, 2006a; LULICH et al., 2008, BAUER, 2014). Para pacientes humanos, a citologia de lavado vesical para o diagnóstico de neoplasias, oferece resultados satisfatórios (BASTACKY, 1999). Matzkin; Moinuddin e Soloway (1992) realizaram estudo comparativo, empregando, simultaneamente, a citologia de lavado vesical e a citologia do sedimento urinário para diagnóstico de neoplasias em 220 pacientes. A técnica de lavado vesical diagnosticou 100% dos casos de neoplasias, enquanto o sedimento urinário foi efetivo somente em 82,6% dos casos. Em outro estudo comparativo de 615 pacientes humanos com carcinoma de células de transição (CCT), Maier, Simak e Neuhold (1995) comprovaram que a acurácia da técnica de lavado vesical foi notadamente maior do que a acurácia obtida com a técnica de citologia esfoliativa do sedimento urinário. Diferentemente dos demais autores, Gregoire et al. (1997), em estudo de 114 casos de tumores de 12 bexiga e 52 controles negativos, observaram que a citologia de lavado vesical, assim como a análise de DNA por citometria de fluxo, acrescentou pouca informação àquela obtida pela citologia de sedimento urinário. García et al. (2008) comparam a citologia do sedimento urinário com a histopatologia em 109 pacientes e concluíram que o método continua sendo de eleição para identificação e controle de neoplasias vesicais. O lavado vesical é obtido de forma simples e pouco invasivo, por meio da cateterização transuretral do paciente, instilação e recuperação de solução salina na bexiga (KOSS; MELAMED, 2006a; ARCHER, 2014). Assim como ocorre com lavados broncoalveolares e líquido cerebroespinhal, o material obtido de lavados vesicais apresenta celularidade baixa devido ao seu grande componente fluídico e, portanto, não se presta à preparação de esfregaço citológico direto. As células devem ser concentradas previamente por processos de filtragem, centrifugação ou citocentrifugação (KOSS; MALAMED, 2006a; GARCÍA et al., 2008; ARCHER, 2014; BAUER, 2014). Bauer (2014) recomenda que o material seja previamente centrifugado por cinco minutos a 1.000g e citocentrifugado após remoção do sobrenadante. A citocentrifugação, que surgiu no final da década de 80, é um procedimento simples, de rotina em laboratórios de citologia e hematologia. As preparações feitas pelo método de citocentrifugação resultam na recuperação celular, em uma monocamada rica em células com excelente qualidade morfológica, ideal para líquidos com baixa celularidade (GROVER; BLEE; STOKES, 1995; BALES, 2006; ZINKL, 2009). Grover, Blee e Stokes (1995) padronizaram o volume de 200µL para recuperação celular satisfatória na citocentrifugação. A padronização foi feita para lavado bucal, pleural, pericárdico e amostras de urina de humanos, com volumes variando de 25µL a 500µL. Contudo, ressaltaram que no caso de amostra muito concentrada, 25µL de solução salina devem ser adicionados, para evitar sobreposição celular. As técnicas de coloração para avaliação celular surgiram no século 19. Os primeiros corantes eram extraídos de plantas (garança, açafrão e índigo), mas no mesmo século surgiram corantes produzidos industrialmente. O interesse por 13 citopatologia floresceu juntamente com o desenvolvimento de várias técnicas de coloração úteis até os dias atuais (DIAMANTIS; MAGIORKINIS, 2013). Para preparações citológicas de rotina, as colorações mais utilizadas incluem Papanicolaou (George Nicholas Papanicolaou, 1941), corantes de Romanowsky (Dmitry Leonidovich Romanowsky, 1891) e Gram (Hans Christian Gram, 1884), cada qual, com suas indicações e limitações (BARTGES, 2004; BALES, 2006; GARCÍA et al., 2008; MEINKOTH et al., 2009; MEYER; CONNOLLY; HENG, 2011; ARCHER, 2014; BAUER, 2014). A coloração de Papanicolaou é a mais citada para avaliação de características de malignidade em preparações citológicas (MATZKIN; MOINUDDIN e SOLOWAY, 1992; GRÉGOIRE et al., 1997; BASTACKY et al., 1999; GARCÍA et al., 2008; MEINKOTH et al., 2009; FLEZAR, 2010; HATTORI et al, 2011; BOLENZ et al., 2013; KIM; KIM, 2014; PRATHER et al., 2014). Também são comuns colorações modificadas, de acordo com a preferência de cada patologista, tais como Eosina Azure (MALIK; MURPHY, 1999), Wright Giemsa (BORJESSON, 2001; BORJESSON; DEJONG, 2012) e May-Grünwald Giemsa (NIKOUSEFAT; HASHEMNIA; JAVDANI, 2015; KILIÇARSLAN et al., 2015). Wiener et al. (1999) compararam o uso de corantes rápidos (do tipo Romanowsky e seus derivados) e da coloração de Papanicolaou em amostras de urina fresca e lavados vesicais de 124 pacientes humanos com histórico de CCT. Os resultados indicaram que, para avaliação de recidiva, ambas as colorações foram eficazes para caracterização de malignidade de células uroteliais. Considerando amostras adequadamente coletadas, preparadas e coradas para citologia ou citopatologia, destaca-se como requisito final para a conclusão diagnóstica, o conhecimento dos tecidos e seus tipos celulares. Assim, o perfeito entendimento da morfologia celular, bem como das possíveis alterações e respectivas implicações clínicas, constituem o elo entre a indicação do exame e o conhecimento das causas de afecções vesicais (KOSS; MELAMED, 2006a). O urotélio da bexiga dos mamíferos é altamente especializado para atender duas necessidades básicas: as variações extremas do volume luminal e o contato permanente com a urina que é hipertônica e tem grande variação de pH, além de concentrações altas de substâncias potencialmente tóxicas (KOSS, 1977). Para 14 comportar a grande variação de volume de urina, o urotélio pode apresentar variações extremas do número de camadas celulares, fato que justifica sua classificação como epitélio de transição (KOSS; MELAMED, 2006b). Em artigo apresentado por Koss (1977), verifica-se que o número de camadas celulares varia, também, com a espécie. Em ratos o urotélio vesical dilatado é composto por três camadas celulares e, quando contraído tem quatro a cinco camadas, enquanto no camundongo as camadas celulares variam entre duas e três. Em seres humanos, o urotélio se apresenta com aproximadamente sete camadas de células, quando a bexiga está moderadamente dilatada. Nos cães, assim como em coelhos, a bexiga contraída tem cerca de sete a oito camadas de células epiteliais. O urotélio é composto por três segmentos distintos que compreendem uma camada superficial (células guarda-chuva), uma porção intermediária com número variável de camadas celulares e uma camada de células basais que repousam sobre a membrana basal ilustrado na Figura 1. As células guarda-chuva são maiores que as células epiteliais da camada intermediária e cada uma delas recobre várias células das camadas intermediária e basal. Para que a bexiga possa ser distendida pela urina, cada célula guarda-chuva se alonga e, simultaneamente, ocorre deslizamento lateral das células da camada intermediária. Este mecanismo é o que torna o urotélio um epitélio altamente especializado, e só é possível devido à existência da unidade de membrana assimétrica, das tight junctions que mantêm as células guarda-chuva unidas umas às outras e dos desmossomos que mantêm as células da camada intermediária conectadas à célula guarda-chuva correspondente (KOSS, 1977; KOSS; MELAMED, 2006b). As células uroteliais variam de forma e tamanho em função da camada à qual pertencem e também em função dos estados de contração ou distensão da bexiga, quando são analisados cortes histológicos. Contudo, diversas outras variações de forma e tamanho são observadas em preparações para citologia. Nestes casos, o método de coleta e processamento também contribuem para a determinação dos formatos e características celulares e, consequentemente, são fatores decisivos para a interpretação das imagens celulares, no caso de amostras obtidas por lavado vesical (KOSS; MELAMED, 2006b). 15 Figura 1. Representação do urotélio humano com três camadas celulares. A. Bexiga contraída. Cada célula guarda-chuva recobre várias células epiteliais da camada intermediária e basal. B. Bexiga distendida. Adaptado de Koss, 1977. O urotélio descama com facilidade, principalmente em coleta por instrumentação, como é o caso da lavagem vesical. Células de camadas uroteliais mais profundas, isoladas ou em grupo (clusters), são vistas raramente em sedimento de urina eliminada por micção espontânea, mas são comuns em lavados vesicais. Caracteristicamente, nos espécimes obtidos por barbotagem vesical, as células isoladas de camadas profundas apresentam-se pequenas e arredondadas. Entretanto, quando apresentadas em grupo, são alongadas (caudadas) em decorrência da manutenção das ligações desmossomais entre elas (KOSS; MELAMED, 2006b). Considerando todos os tipos de células epiteliais normais que podem estar presentes, os formatos variam de redondo até colunar. Os limites citoplasmáticos são bem definidos e os núcleos, geralmente pequenos, são redondos ou discretamente ovalados; nucléolo é ocasional (BAKER, 1999; MEINKOTH; COWELL; TYLER, 2009; ZINKL, 2009). Além das células uroteliais provenientes da mucosa vesical, também podem ser encontradas células, isoladas ou agrupadas, de outras regiões do trato geniturinário. As células epiteliais escamosas, oriundas da uretra distal, vagina, vulva ou do prepúcio, são as maiores encontradas na citologia do trato urinário. O formato é geralmente achatado com bordas retas e cantos angulosos, com núcleo A B 16 pequeno e redondo. Também são encontradas células provenientes dos ureteres e da pelve renal, que são arredondadas ou caudadas e menores do que as demais (ZINKL, 2009; FRY, 2011). Eventualmente, podem ser vistas células do epitélio dos túbulos renais, que são pequenas, redondas ou cuboides, com núcleo redondo e nítido. As células tubulares são ligeiramente maiores que os leucócitos e, geralmente são distinguidas destes, pelo núcleo redondo (ZINKL, 2009). A citologia é muito utilizada na medicina para identificação de neoplasias malignas ou benignas, o que exige conhecimento sobre as alterações esperadas. Resultados positivos levam ao diagnóstico “suspeita de neoplasia”, mas a falta de identificação de alterações celulares características de malignidade, não exclui a possibilidade de haver processo neoplásico (HOLT, 2011). No caso de neoplasia, as características celulares de malignidade compreendem alterações nucleares e citoplasmáticas. As alterações nucleares incluem alteração da relação citoplasma:núcleo, anormalidades de cromatina, núcleos múltiplos, grandes e irregulares, amoldamento nuclear, presença de mitoses atípicas e nucléolo evidente. As alterações citoplasmáticas são menos importantes do que as nucleares e se resumem a vacuolização e aumento da basofilia. Afora as características nucleares e citoplasmáticas, o pleomorfismo celular pode ser marcante. Quando três ou mais critérios de malignidade celular forem verificados, considera-se a possibilidade de haver processo neoplásico (BAKER, 1999; MEINKOTH; COWELL; TYLER, 2009; RASKIN, 2011; BAUER, 2014; TENNANT, 2014; SANCHES; TORRES; GUERRA, 2015). Especialmente em cães com CCT, as células neoplásicas esfoliam em grande quantidade, principalmente em grupo, e apresentam características proeminentes de malignidade (ZINKL, 2009; FRY, 2011; SANCHES; TORRES; GUERRA, 2015). As neoplasias vesicais comumente cursam com inflamação que culmina com a esperada hiperplasia celular. Consequentemente, pode haver dúvida a ser dirimida por uma segunda citologia, após controle da inflamação, ou por exame histopatológico (BAKER, 1999; ZINKL, 2009; RASKIN, 2011). A hiperplasia, frequentemente uma resposta às agressões teciduais, é caracterizada principalmente por tipos celulares maduros e uniformes, cujos volumes citoplasmáticos são maiores do que os nucleares (BAKER, 1999; RASKIN, 2011). 17 Em cães com CCT, a coexistência de infecção bacteriana é comum (BUDRECKIS et al., 2015), fato que também deve exigir investigação diagnóstica minuciosa. A citologia esfoliativa pode ser de grande valia não só para identificação de neoplasias e hiperplasia, como também de displasia, de inflamações. Embora tanto a urina fresca de cães quanto o lavado vesical possam apresentar neutrófilos ocasionalmente, a presença de muitas destas células, juntamente com hemácias e intensa descamação epitelial, indica inflamação (BAKER, 1999; ZINKL, 2009; TENNANT, 2014). As condições inflamatórias são classificadas citologicamente pelos tipos de células envolvidas e pelas características dos neutrófilos presentes na amostra. Neutrófilos não degenerados, semelhantes aos encontrados no sangue periférico, predominam em afecções imunomediadas, neoplasias e lesões assépticas. Por outro lado, nos processos inflamatórios desencadeados por infecção bacteriana, predominam os neutrófilos degenerados, caracterizados por figuras de cariopicnose, cariorrexe ou cariólise (ZINKL, 2009; FRY, 2011; RASKIN, 2011; TENNANT, 2014). Nas inflamações crônicas pode haver predomínio de macrófagos inflamatórios sobre os leucócitos. Inflamação piogranulomatosa ou mista, que contém macrófagos, neutrófilos, linfócitos e plasmócitos, comumente está associada a infecção fúngica (FRY, 2011; RASKIN, 2011; TENNANT, 2014). Alterações com mais de 10% de eosinófilos, classificadas como eosinofílicas, podem ter outras células inflamatórias envolvidas, e caracterizam reações de hipersensibilidade, infecções parasitárias ou fúngicas e também condições neoplásicas. Infiltrações linfocíticas ou plasmocitárias, podem estar associadas a reações alérgicas ou imunes, infecção viral e inflamação crônica (RASKIN, 2011; TENNANT, 2014). Outros possíveis achados citológicos incluem hemácias e sinais de necrose e fibrose. As hemácias podem aparecer não só em caso de inflamação, mas também em neoplasias, pólipos, traumas e como resultado de quimioterapia (ZINKL, 2009). Nos casos de hemorragia, evidências de eritrofagocitose indicam hemorragia aguda, enquanto a constatação de macrófagos ativos que contêm pigmentos sanguíneos em seu citoplasma – grânulos de hemosiderina e hematoidina, indica hemorragia crônica (FRY, 2011; RASKIN, 2011). Os sinais de necrose e fibrose, que podem se 18 apresentar juntos ou separadamente, estão associados com inflamação grave. Em amostras citológicas, a morte celular é representada por contorno celular indistinto e flocoso, acompanhada de atividade fibroblástica intensa (RASKIN, 2011). Os dados disponíveis na literatura consultada, indicam que a citologia de lavado vesical é mais empregada na medicina, principalmente para acompanhamento de pacientes que possam apresentar recidiva de neoplasia vesical. Existem estudos feitos em cães, como modelo experimental para mamíferos, mas informações sobre o tema são escassas na literatura veterinária. Contudo, o conjunto de dados disponíveis nas duas áreas parece satisfatório para impulsionar a indicação da citologia de lavado vesical na veterinária, como revelado em pequenas passagens de livros-texto publicados recentemente. 19 Referências ALM, P.; COLLEEN, S. A histochemical and ultrastructural study of human urethral uroepithelium. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section A, Copenhagen, v. 90, n. 2, p. 103-111, 1982. Disponível em: . ALLEN, T. A.; JONES, R. L.; PURVANCE, J. Microbiologic evaluation of canine urine: Direct microscopic examination and preservation of specimen quality of urine for culture. Journal of the American Veterinary Medical Association, Schaumburg, v. 190, n. 10, p. 1289-1291, 1987. ALVES, A.; GONTIJO, A. M. M. C.; SALVADORI, D. M. F.; ROCHA, N. S. Acute bacterial cystitis does not cause Deoxyribonucleic Acid demage detectable by the alcaline comet assay in urothelial cells of dogs. 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Além dos exames de rotina (hemograma, bioquímica sérica e urinária, urinálise, urocultura e exames de imagem), com destaque para sedimentoscopia de urina, urocultura e exame ultrassonográfico da bexiga, foram realizadas citologia de lavado vesical preparada pelo método de citocentrifugação e coradas com as colorações de Papanicolaou, Giemsa, Rosenfeld modificado e Gram. Os resultados obtidos indicaram que a técnica empregada no estudo para recuperação celular realizada com barbotagens de três ciclos utilizando 1mL/kg de solução salina, se mostrou eficaz para avaliação de células uroteliais de cães saudáveis, assim como o uso das colorações de Papanicolaou, Giemsa e Rosenfeld modificado. Palavras-chave - Barbotagem, células uroteliais, citologia, coloração, morfologia celular Introdução O uso da citologia de lavado vesical é bastante difundido para a avalição das células uroteliais em humanos, principalmente para diagnósticos e acompanhamento da evolução de casos de carcinoma de células de transição (CCT). A técnica de citologia de lavado vesical (CLV), já padronizada na medicina, oferece resultado superior ao obtido por sedimentoscopia de amostras de urina (esfregaço a fresco ou corado) para avaliação de células epiteliais de transição (CET). A avaliação das CET em cães, comumente é feita por sedimentoscopia de esfregaço não corado, que oferece material celular de baixa qualidade (ZINKL, 33 2009). Também são realizados exames citológicos de material coletados por biópsia aspirativa que são mais invasivos que a CLV e não oferecem garantia de obtenção de material apropriado para a análise. A coleta de material por lavagem vesical permite a recuperação de células superficiais da mucosa vesical, com a necessária preservação dos detalhes citoplasmáticos e nucleares, em humanos (BIBOO, 2006; KOSS; MELAMED, 2006a). O protocolo para lavado vesical requer solução salina em volume apropriado, manobras de barbotagem e número específico de ciclos para recuperação celular adequada, com o mínimo de agressão e desconforto para o paciente. O perfeito entendimento da composição da população celular e de suas alterações morfológicas, em várias circunstâncias clínicas, é o primeiro passo para propiciar a utilização da citologia no diagnóstico das alterações causadas pelas afecções vesicais (KOSS; MELAMED, 2006b). As CET obtidas por lavagem vesical, em função da grande capacidade de aderência, se apresentam sob a forma de lençóis ou agrupamentos, de células de tamanhos variados, formato arredondado ou colunar. Contudo, também podem se apresentar de forma isolada. Os limites citoplasmáticos são bem definidos; os núcleos, um ou dois, geralmente são pequenos com formato redondo ou levemente oval, e podem conter um nucléolo. (BAKER, 1999; MEINKOTH; COWELL; TYLER, 2009; ZINKL, 2009). Em princípio, as CET podem ser reconhecidas facilmente em esfregaços adequadamente corados. Contudo, artefatos tais como sobreposição, dobras, aglomerados de diversos elementos figurados, dentre outros, podem dificultar ou mesmo impedir a avaliação morfológica conclusiva (MEINKOTH;COWELL; TYLER, 2009). Até o presente, na medicina veterinária, não há relatos de protocolo para CLV padronizado para cães. Assim, o presente estudo teve por finalidade estabelecer um protocolo apropriado para obtenção das CET, preparação e coloração adequadas das lâminas, e definição do padrão celular, à citologia, de amostras provenientes de cães clinicamente normais. 34 Material e Métodos O estudo foi realizado nas dependências do Serviço de Nefrologia e Urologia Veterinária (SNUV) do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Unesp – campus de Jaboticabal-SP; no Laboratório de Nefrologia e Urologia do Grupo de Pesquisa em Nefrologia e Urologia Veterinária (GPNUV), no Laboratório de Patologia Clínica Veterinária, ambos localizados no Hospital Veterinário da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Unesp – campus de Jaboticabal-SP, e no Serviço de Patologia Veterinária do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Unesp campus de Botucatu-SP. Animais. A utilização dos animais para o presente estudo foi aprovada pela CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais da mesma instituição, protocolo nº 008830/13. A inclusão dos pacientes foi feita sob consentimento livre e esclarecido, de cada proprietário (Formulário: Apêndice B). Foram estudados cães encaminhados ao SNUV para exame do trato urinário como parte de check-up em andamento. Constituição do grupo. Foram avaliados cães adultos, sem restrições em relação ao gênero ou à raça. Não foram incluídos na fase inicial de recrutamento de pacientes, aqueles com histórico de eventos ou intervenções, nos últimos 60 dias, que pudessem modificar a condição original, tais como (1) intervenção cirúrgica ou medicamentosa no trato urinário ou genital; (2) coito, gestação, parto, lactação ou cio e (3) histórico de cateterização vesical transuretral ou cistocentese nos últimos dez dias. Num segundo momento, foram excluídos os pacientes nos quais, após avaliação clínica e laboratorial, constatou-se anormalidade ou doença vesical. A inclusão de pacientes prosseguiu até que fossem obtidos números iguais de machos e fêmeas. Assim, de 55 pacientes avaliados, 34 foram incluídos neste estudo. Avaliação dos pacientes. De acordo com a abordagem semiológica descrita por Carvalho (2014), as avaliações clínicas e laboratoriais específicas para o estudo compreenderam (1) resenha, histórico e exame físico geral e (2) avaliação clínica e laboratorial do trato urinário. Resultados documentados de exames já realizados por outras áreas de especialidades, como parte do check-up, foram considerados. Como 35 requisitos específicos do estudo, destacaram-se (1) ultrassonografia vesical, (2) urinálise e urocultura, e (3) citologia de lavado vesical. Ultrassonografia vesical. Após tricotomia pré-púbica, procedeu-se a caracterização ultrassonográfica da bexiga. Utilizaram-se transdutores linear e convexo, com as frequências de 5,0 e 7,5MHz1, respectivamente, para a avaliação dos planos longitudinal e transversal. Para a conclusão geral sobre a condição ultrassonográfica da bexiga, foram considerados os aspectos da parede vesical (ecogenicidade, espessura e presença irregularidades ou de massas) e do conteúdo luminal (presença e quantidade de sedimento, presença de massas ou urólitos). Após a avaliação procedeu-se coleta de 20mL de urina, por cistocentese guiada, para realização de urinálise e urocultura. Lavado vesical. Após higienização da genitália, procedeu-se a cateterização transuretral da bexiga com auxílio de sonda uretral com calibre variando de acordo com o porte do animal (sondas gástricas foram utilizadas em cães com mais de 40kg), e esvaziamento vesical. Após retirar todal urina da bexiga, cerca de 5mL de ar era instilado e recuperado para confirmar o total esvaziamento vesical e então, realizou-se o lavado. O procedimento consistiu de duas barbotagens (ato de instilar e recuperar solução na bexiga) consecutivas, cada uma com três ciclos, ou seja, a mesma solução era instilada e recuperada da bexiga três vezes seguidas. Para cada barbotagem utilizou-se 1mL/kg, até o volume máximo de 20mL, de solução fisiológica estéril. A solução fisiológica era instilada na bexiga, com pressão, utilizando seringa de 20mL. O material foi recuperado por meio de seringa acoplada à sonda uretral, ambas estéreis, e quando necessário, 5mL de ar era instilado para facilitar a recuperação da solução. O volume total obtido, cerca de 90% da solução instilada, foi processado imediatamente para a preparação das lâminas para exame citológico. Após as coletas de material, os animais foram acompanhados para detecção de eventual complicação. Exame citológico de lavado vesical. Dentro de no máximo 30 minutos da obtenção do lavado vesical, o material foi processado no Laboratório de Nefrologia e Urologia do GPNUV. Todo o volume recuperado foi homogeneizado, dividido em dois tubos e centrifugado durante cinco minutos, a 1.800g, para aumentar a 1 Ultrassonógrafo EUB – 405 Hitachi Medical Corporation e transdutor linear 7,5/5,0MHz. 36 concentração celular. Descartados parcialmente os sobrenadantes, os precipitados foram ressuspendidos em 1,0mL (cada tubo). Seguiu-se o processamento em citocentrífuga2, com capacidade para seis lâminas, a 1.000g por cinco minutos. Para transferência das células para as lâminas foram utilizadas alíquotas de 200µL conforme recomendação de Grover, Blee e Stokes (1995). Em seguida, quatro lâminas foram preparadas por coloração de (1) Papanicolaou3, (2) Gram4, (3) Giemsa5 e (4) Rosenfeld modificado pela adição de uma imersão final em solução alcoólica de fenotiazinas a 0,1%6, durante 20 segundos. Duas lâminas restantes foram fixadas por imersão, de dois minutos, em Metanol PA7 e reservadas. As colorações de Papanicolaou e Gram foram realizadas conforme as orientações do fabricante (Apêndice C e D, respectivamente). Na coloração de Giemsa, uma solução 1:4 de corante de Giemsa e água destilada, era preparada no dia da utilização. As lâminas, secadas ao ar imediatamente após a citocentrifugação, ficavam recobertas pela solução por 20 minutos; lavadas em água corrente e secadas ao ar novamente. Para a coloração de Rosenfeld modificado, inicialmente as lâminas ficaram recobertas pela solução de Rosenfeld (preparada com 1,5g de Giemsa, 1g de May- Grüwald, 0,5g de Wright e 1L de Metanol PA9), por cinco minutos. Eram, então, adicionados 2mL de água destilada sobre a solução corante. Decorridos três minutos, as lâminas eram lavadas em água corrente e secadas ao ar. Em seguida eram mergulhadas em solução alcoólica de fenotiazinas a 0,1% por 20 segundos, lavadas em água corrente e secadas ao ar. As lâminas coradas pela coloração de Papanicolau eram imediatamente preparadas com resina8 e recobertas com lamínula, e as demais, após lavagem para remoção do excesso dos corantes, eram secadas ao ar, preparadas com resina e recobertas com lamínula. 2 Citocentrífuga Fanen – Modelo 218. 3 Kit Papanicolau New Prov 4 Conjunto para Coloração de Gram New Prov 5 Giemsa corante 1.000mL Merck 6 Instant Prov – New Prov 7 Metanol PA - Merck 8 Pemount® - Fisher Chemical Permount Mounting Medium 37 As lâminas prontas foram estocadas para posterior avaliação citológica em microscópio de luz óptico9. As avaliações das lâminas foram feitas em objetivas de 10x e 40x, sem que o examinador tivesse conhecimento sobre a idade dos cães. As células de padrão epitelial foram classificadas em três séries de acordo com os tamanhos, dados em micrômetros de diâmetro (células grandes, médias e pequenas). A obtenção de imagens foi realizada com auxílio do programa computacional Axiovision Software Rel. Versão 4.3 (Zeiss Vision, Alemanha), no Serviço de Patologia Veterinária da FMZV/Unesp campus de Botucatu. Análise estatística dos resultados. Os dados relativos à caracterização dos pacientes e da amostra de urina coletada imediatamente antes da obtenção do lavado vesical foram submetidos aos cálculos de estatística descritiva feita por meio do GraphPad Prism version 7.00 for Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com). Os resultados das citologias de lavado vesical foram descritos em função do tipo de coloração empregada, das categorias de células observadas e do gênero dos pacientes avaliados. Resultados De um total de 55 pacientes avaliados, 34 foram considerados sadios (sem anormalidade ou doença vesical detectadas por meio de urinálise, urocultura e ultrassonografia vesical) e compuseram o grupo estudado. Desses, havia 17 machos (oito intactos e nove castrados) e 17 fêmeas (duas intactas e 15 castradas). Dos 34 cães, 21 não tinham raça definida e 13 eram de raça pura (Poodle, Rottweiler, Teckel, Boxer, Lhasa Apso, Beagle, Labrador, Boston Terrier ou Dogue Alemão). Os dados para caracterização dos pacientes (idade e peso corporal) e os dados físico-químicos das amostras de urina estão apresentados na Tabela 1. As avaliações das lâminas permitiram concluir que as colorações de Papanicolaou, Giemsa e Rosenfeld modificado foram consideradas adequadas para a avaliação da morfologia celular de lavado vesical, entretanto, nas lâminas coradas com a coloração de Gram, não foi possível avaliar as CET (Figura 2.) 9 Microscópio óptico Carl Zeiss, Alemanha 38 Considerando-se o total das avaliações citológicas de bexiga das 17 fêmeas e dos 17 machos, no tocante à apresentação geral das preparações, não foi observada diferença que pudesse ser atribuída ao gênero. As preparações foram caracterizadas pelas presenças de grande quantidade de hemácias (7-9µm de diâmetro) ao fundo, e de células com padrão epitelial dispostas em aglomerados ou grupos (em média de 18 células pequenas à médias), assim como outras isoladas, dispostas ao fundo da lâmina. 39 Tabela 1. Características dos 34 cães sem sinais clínicos ou laboratoriais de doença vesical, avaliados para determinação de padrões citológicos normais de lavado vesical. Estatística descritiva Pacientes Aspectos físico-químicos da urina Idade (anos) Massa corporal (kg) Densidade pH UP/C Mínimo 1,00 6,00 1,007 5,0 0,03 Percentil 25% 5,00 8,30 1,021 6,0 0,05 Mediana 7,00 14,70 1,031 7,0 0,08 Percentil 75% 9,25 24,73 1,044 8,0 0,17 Máximo 13,00 63,00 1,051 9,0 0,66 IC da mediana (95%) 5,00 a 9,00 10,00 a 21,80 1,025 a 1,041 6,5 a 8,0 0,05 a 0,13 Média (EPM) 6,79 (0,54) 19,8 (2,53) 1,032 (0,003) 7,11(0,22) 0,15 (0,03) IC: intervalo de confiança; EPM: erro padrão da media; UP/C: razão proteína/creatinina urinária. 40 Figura 2. Fotomicrografias de citologia de lavado vesical preparado pelo método de citocentrifugação (400x): A. Citologia de lavado vesical de cão macho sadio, SRD, 1 ano de idade, evidenciando a presença de células epiteliais de transição (CET) de tamanhos variados, isoladas ou dispostas em aglomerados (seta), espermatozoides e hemácias ao fundo (seta vazia) - Papanicolaou. B. Citologia de lavado vesical de cão macho sadio, Beagle, 8 anos de idade, mostrando CET, de tamanhos variados, isoladas ou dispostas em aglomerados (seta) e hemácias ao fundo (seta vazia) - Giemsa. C. Citologia de lavado vesical de cadela sadia, Rottweiler, 4 anos de idade, evidenciando a presença de CET de tamanho pequeno a médio, isoladas ou dispostas em aglomerados (seta) e hemácias ao fundo (seta vazia) - Rosenfeld modificado. D. Citolog